DE3015699A1

DE3015699A1 - Verfahren zur herstellung von plasminogen-aktivator

Info

Publication number: DE3015699A1
Application number: DE19803015699
Authority: DE
Inventors: Shizuoka Fuji; Akio Hasagawa; Sadayuki Horiguchi; Mitsuru Shibukawa
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1979-04-26
Filing date: 1980-04-24
Publication date: 1980-10-30
Also published as: FR2454809A1; FR2454809B1; GB2051075A; DE3015699C2; US4317882A; GB2051075B

Description

Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 6 8.000 in hoher Ausbeute unter Verwendung von Zellen, die von Tieren stammen.

Plasminogen-Aktivatoren mit einem Molekulargewicht von

45.000 bis 68.000 sind als wertvolle Substanzen bekannt. Die Isolierung dieser Aktivatoren in reiner Form aus menschlichem Urin ist als kommerzielles Verfahren bekannt, das in der japanischen Patentveröffentlichung 10232/1973 und in der US-PS 4 028 187 beschrieben wird. Dieses von

menschlichem Urin ausgehende übliche Verfahren hat jedoch mehrere Nachteile: 1) Die Qualität des Ausgangsmaterials ist ungleichmäßig. 2) Das Verfahren wirft ernste hygienische Probleme auf. 3) Große Urinmengen von gesunden Personen sind schwierig zu gewinnen.

Als Ergebnis von Untersuchungen mit dem Ziel, eine neue Methode zur Ausschaltung dieser Nachteile zu finden, wurde festgestellt, daß Zellen, die von Tieren stammen, Plasminogen-Aktivatoren bilden, wie von E. Barnett und

S. Baron in Proc. Soc. Exper. Biol. & Med. 102 (1959) 308 beschrieben. Diese Methode ermöglicht die Lieferung von Ausgangsmaterialien von gleichbleibender Qualität in großen Mengen ohne die Gefahr einer Verunreinigung, und es bestand das Bedürfnis, dieses Verfahren in den großtechnischen Maßstab zu überführen. Plasminogen-Aktivatoren, die von Zellen, die von ee stammen, gebildet werden, haben jedoch ein Molekulargewicht von etwa 30.000, und Aktivatoren mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 können nur innerhalb einer sehr kurzen Anfangsperiode nach dem Inberährungbringen der Zellen mit einer Plasminogen-Aktivator bildenden Lösung erzeugt werden,

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wie beispielsweise von G.H. Barlow in "Thrombosis Research", Band 1 (1972) 201 und Band 11 (1977) 149 berichtet.

Über ein Verfahren, das die Herstellung von Plasminogen-Aktivatoren mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000 in großen Mengen mit gutem Wirkungsgrad über einen langen Zeitraum unter Verwendung von Zellen, die von stammen, ermöglicht, wurde bisher nicht berichtet.

Eingehende Untersuchungen mit dem Ziel, ein Verfahren zur Großherstellung von Plasminogen-Aktivatoren mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000 unter Verwendung von Zellen, die von - stammen, zu entwickeln, en das hatten das Verfahren gemäß der Erfindung zum Ergebnis.

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von Plasminogen-Aktivator nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung, die eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und, falls erforderlich, anorganische Salze und organische Zusatzstoffe oder beide enthält, mit Zellen in Berührung bringt, die von menschlichen Nieren oder Lungen stammen und die Fähigkeit haben, Plasminogen-Aktivator zu bilden, und den gebildeten Plasminogen-Aktivator dann von der Lösung abtrennt. Diese Behandlung wird durchgeführt, während der pH-Wert der Lösung bei etwa 6 bis 9 und die Konzentration von gelöstem Sauerstoff in der Lösung bei wenigstens 30% der Sättigungkonzentration des gelösten Sauerstoffs gehalten wird, und die erhaltene Lösung wird anschließend bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 12 einer Behandlung unterworfen, durch die ein Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 60.000 abgeschieden und isoliert wird.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildungen erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Gelfiltrationsverteilungskurve eines gemäß der Erfindung unter Verwendung von Nierenzellen

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gebildeten Plasminogen-Aktivators.

Fig. 2 veranschaulicht die Beziehung zwischen den Molekulargewichten des erfindungsgemäß unter Verwendung von Nierenzellen und Standardproteinen gebildeten Plasminogen-Aktivators für die eluierten Fraktionszahlen der in Fig. 1 dargestellten Gelfiltration.

Fig. 3 zeigt eine GeIfiltrationsverteilungskurve, die der in Fig. 1 dargestellten Kurve analog ist, wobei jedoch Lungenzellen verwendet worden sind.

Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die der Darstellung in Fig. 2 analog ist und die Beziehung zwischen den Molekulargewichten des erfindungsgemäß unter Verwendung von Lungenzellen und Standardproteinen gebildeten Plasminogen-Aktivators veranschaulicht.

Fig. 5 zeigt eine unter Verwendung des Produkts "Sephadex G100" erhaltene GeIfiltrationsverteilungskurve für den gemäß Beispiel 1 hergestellten Plasminogen-Aktivator.

Die für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Zellen werden von menschlichen Nieren oder Lungen entnommen und haben die Fähigkeit, Plasminogen-Aktivatoren zu bilden. Diese Zellen können nach den üblicherweise für die Kultivierung von tierischen Zellen angewandten Methoden gezüchtet werden, beispielsweise nach dem Verfahren, das in der japanischen Veröffentlichung "Tissue Culture", S. 3-33 (von Jyunnosuke Nakai et al, herausgegeben 1976 von Asakura Shoten), beschrieben wird.

Beliebige Lösungen, die üblicherweise für die Bildung von Plasminogen-Aktivatoren unter Verwendung von Zellen, die von Tieren stammen, verwendet werden, können als Lösungen, die mit den Zellen zur Bildung von Plasminogen-Aktivatoren nach dem Verfahren gemäß der Erfindung in Berührung gebracht werden, verwendet werden. Solche

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Lösungen werden beispielsweise in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: Proc. Soc. Exper. Biol. & Med. 102 (1959) 308; J. Lab. & Clin. Med. 70 (1967) 650; J. Clin. Inv. 47 (1968) 1238 und J. Clin.Inv. 48 (1969) 1740.

Als Kohlenstoffquellen können in diesen Lösungen Zucker, z.B. Saccharose, Maltose und Glucose, verwendet werden.

Als Stickstofquellen eignen sich organische Stickstoffquellen, wobei Aminosäuregemische und Hydrolysate von Proteinen bevorzugt werden. Die Proteine können tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein. Hydrolysate von Casein, Sojabohnenprotein, Milcheiweiß und Eiweiß von tierischem Fleisch ergeben gute Resultate und werden im allgemeinen bevorzugt.

Außer Stickstoff- und Kohlenstoffquellen können, falls erforderlich, anorganische Salze, organische Zusatzstoffe oder beide zugesetzt werden, um gleichbleibende Ergebnisse zu erhalten. Besonders bevorzugt wird der Zusatz dieser Materialien, wenn Aminosäuregemische als Stickstoffquellen verwendet werden. Beispiele geeigneter anorganischer Salze sind NaCl, KCl, MgCl₃₇ MgSO₄, NaH₃PO₄, Na₃HPO₄, KH₃PO₄, CuSO₄, Fe<NO₃)₃, FeSO₄, MnCl₃, (NH₄J₃MoO₄ und ZnSO₄. Beispiele geeigneter organischer Zusatzstoffe sind p-Aminobenzoesäure, Ascorbinsäure, D-Biotin, Calciferol, Calcium-D-pantothenat, Cholesterin, Cholinchlorid, Folsäure, i-Inosit, Menadion, Nicotinamid, Nicontinsäure, Pyridoxal, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin, DL-iX-Tocopherol, das Tensid der Handelsbezeichnung "Tween 80", Vitamin A, Adenin, AMP, ATP, Desoxyribose, Ribose, Glutathion, Guanin, Hypoxanthin, Thymin, üracil, Xanthin und Natriumacetat.

Organische Säuren sind ebenfalls als Beispiele von Zusatzstoffen zu nennen, die dem Nährmedium vorzugsweise zugesetzt werden. Bevorzugt werden Bernsteinsäure, Apfelsäure, Fumarsäure und Glykolsäure. Besonders bevorzugt wird 3 G

Fumarsäure. Anstelle dieser organischen Säuren oder zusätzlich zu ihnen können Serin, Threonin und Glycin zugegeben werden.

Dadurch, daß die Lösung mit den Zellen in Berührung gebracht wird, während der pH-Wert der Lösung bei etwa 6 bis 9 (vorzugsweise bei 7 bis 8), ihre Temperatur bei etwa 15 bis 45°C (vorzugsweise bei 25 bis 40⁰C) und die Konzentration von gelöstem Sauerstoff bei wenigstens 30% der Sättigungskonzentration des Sauerstoffs gehalten wird/ kann Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000 (gemessen nach einer Gelfiltrationsmethode) gebildet werden. Insbesondere können durch Beschränkung der Verweilzeit der Zellen in der Lösung auf nicht mehr als 30 Tage (d.h. durch Auswechseln der Lösung innerhalb von 30 Tagen) Plasminogen-Aktivatoren, die wenigstens 95% der Fraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 6 8.000 enthalten, während einer Zeit von mehr als 60 Tagen gebildet werden. Vorzugsweise kann durch Beschränkung der Verweilzeit auf nicht mehr als 10 Tage (d.h. durch Auswechseln der Lösung innerhalb von 10 Tagen) ein Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 6 8,000 als Einzelfraktion in großen Mengen über einen Zeitraum von mehr als 40 Tagen hergestellt werden. Der hier gebrauchte Ausdruck "Verweilzeit" bezeichnet den Zeitraum, nach dem die Lösung periodisch gewechselt wird. Das Auswechseln der Lösung kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen.

Die erhaltene Lösung enthält den Plasminogen-Aktivator in geringer Konzentration und zahlreiche Verunreinigungen.

Der Aktivator muß daher von der Lösung abgetrennt und auf hohe Konzentration und hohe Reinheit gebracht werden. Zahlreiche Methoden, nach denen eine solche Abtrennung erreicht werden kann, sind bekannt und werden z.B. in Biochemistry 5 (1966) 2160, J.Biol. Chem. 249 (1974) 4295 und Methods in Enzymology 35 (1974) 451 beschrieben. Im

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einzelnen können beispielsweise angewandt werden: eine Aussalzmethode unter Verwendung von Ammoniumsulfa-t, Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumchlorid usw.; eine Dialysenmethode; eine Adsorptionsmethode unter Verwendung von Kieselgel, Hydroxyapatit, Bariumsulfat, Acrylnitril-Methylacrylat-Copolymerisaten usw.; die Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Carboxymethyldextran, Phosphorcellulose usw.; eine GeI-filtrationsmethode unter Verwendung von Acrylamidgel, Agarose, vernetztem Dextrangel usw.; die Affinitätschromatographie unter Verwendung von Lysin-Agarose, Benzamidin-Agarose, p-Aminobenzamidin-Agarose, Argininester-Agarose usw.; die präparative Scheiben-Elektrophorese unter Verwendung von Polyacrylamidgel und die isoelektrische Elektrophorese unter Verwendung eines amphoteren Trägers. Diese Methoden können allein oder in Kombination miteinander angewandt werden.

Im Rahmen der Erfindung wird die Abtrennung des Plasminogen- Aktivators aus der Lösung vorzugsweise durchgeführt, während der pH-Wert der Lösung bei 4 bis 12 gehalten wird.

Es wurde ferner gefunden, daß bei der Maßnahme der Abtrennung des gebildeten Plasminogen-Aktivators nach diesen allein oder in Kombination angewandten Methoden die Anwesenheit eines Chelatbildners für Metalle in der Lösung es ermöglicht, die Zersetzung oder Denaturierung während der Abtrennung zu vermindern, wobei hochreiner Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000 in hoher Ausbeute erhalten wird, wie durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiele von Chelatbildnern, die für diesen Zweck verwendet werden können, sind Ammonium-N-nitrosophenylhydroxylamin, Ammoniumpurpurat, -λ,-Benzoinoxim, 2,3-Butandiondioxim, trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure, 4,5-Dihydroxybenzol-1,3-disulfonsäure, 2,3-Dimercapto-1-propanol, Diphenylthiocarbazon, 2,2'-Dipyridyl, 3,6-Disul-

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fo-1,8-dihydroxynaphthalin, Dithiooxamid, Eriochromschwarz T, Äthylenglykol(2-aminoäthyläther)-N',N'-tetraessigsäure, Äthylendiamin, Athylendiamintetraessigsäure, o-Hydroxybenzaldehydoxini, Salicylsäure, 8-Hydroxychinolin, 8-Hydroxychinolinsulfonsäure, 4-Methyl-1,2-dimercaptobenzol, 5-Nitro-1,10-phenanthrolin, o-Phenanthrolin, Kaliumäthylxanthat, Diäthyldithiocarbamyl-natriumsalz, 2-Thenoyl-2-furoylmethan, Thenoyltrifluoraceton und Thioharnstoff.

Diese Metallchelatbildner können allein oder als Gemische von zwei oder mehreren verwendet werden. Besonders gute Ergebnisse werden mit Athylendiamintetraessigsäure, trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure und o-Phenanthrolin erhalten. Die geeignete Konzentration des Metallchelatbildners in der Lösung beträgt wenigstens 0,1 mMol, vorzugsweise wenigstens 0,3 mMol pro Liter Lösung. Die Konzentration des Chelatbildners ist an sich nach oben nicht begrenzt, jedoch können in der Praxis bis zu 5 mMol Chelatbildner zugesetzt werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung weist nicht die Nachteile der bekannten Verfahren, d.h. niedrige Konzentration des eingesetzten Urins, Schwierigkeit der Beschaffung großer Mengen Urin von gleichbleibender Qualität von gesunden Personen, hygienische Probleme bei der Handhabung des Urins und niedriges Molekulargewicht der gewonnenen Plasminogen-Aktivatoren, auf. Es eignet sich zur Großherstellung von Plasminogen-Aktivatoren mit Molekulargewichten von 45.000 bis 68.000 in gleichbleibender Qualität, hoher Reinheit und in hohen Konzentrationen mit hohen Ausbeuten.

Wie in OLS Nr. 2 815 853 und in Medicine & Drug Journal 14 (1978) 233-237 festgestellt wird, haben Plasminogen-Aktivatoren mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000, wie sie nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhalten werden, eine höhere Aktivität als

Plasminogen-Aktivatoren mit Molekulargewichten außerhalb dieses Bereichs. Ferner haben die nach diesem Verfahren hergestellten Plasminogen-Aktivatoren ein gleichmäßiges Molekulargewicht, so daß sie als Substanz standardisiert oder eingesellt werden können. Es ist daher leicht, ihre Wirksamkeit als Medikamente einzustellen und ihre Wirkung nach der Verabreichung genau vorauszusagen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die Abbildungen ausführlicher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Gelfiltrationsverteilungskurve für einen unter Verwendung von Nierenzellen gebildeten Plasminogen-Aktivator, wobei die Fraktionsnummern als Abszisse und die Aktivität des Enzyms als Ordinate aufgetragen sind.

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen den Molekulargewichten von Standardproteinen und den bei der Gelfiltration eluierten Fraktionszahlen veranschaulicht, wobei der Pfeil die Stelle maximaler Elution eines unter Verwendung von Nierenzellen gebildeten Plasminogen-Aktivators, wie in Fig. 1 dargestellt, andeutet.

Fig. 3 zeigt eine Gelfiltrationsverteilungskurve eines unter Verwendung von Lungenzellen gebildeten Plasminogen-Aktivators, wobei Abszisse und Ordinate die gleiche Bedeutung wie in Fig. 1 haben.

Fig. 4 ist eine graphische Darstellung ähnlich Fig. 2, wobei der Pfeil die Stelle maximaler Elution eines unter Verwendung von Lungenzellen gebildeten Plasminogen-Aktivators wie in Fig. 3 andeutet.

Fig.-5 zeigt eine unter Verwendung des Produkts "Sephadex G100" erhaltene Gelfiltrationsverteilungskurve für den nach der in Beispiel 7 beschriebenen Methode erhaltenen Plasminogen-Aktivator, wobei die Fraktionsnummern als Abszisse und die relative Aktivität des Enzyms als Ordinate

aufgetragen sind und der Pfeil die Stellung der Elution von Standardproteinen andeutet.

Beispiel 1

Eine bei 37 C gehaltene Lösung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung wurde voll ausgewachsenen menschlichen Nierenzeller (von Flow Laboratories bezogen) aus einem Behälter in einer Menge von 20 ml pro 100.000 Zellen zugeführt. Die Lösung im Behälter wurde während der Reaktion mit Natriumhydroxid bei pH 7,5 gehalten. Die Konzentration von gelöstem Sauerstoff in der Lösung wurde bei wenigstens 50% der Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs gehalten. Nach 40 Tagen wurde die Lösung isoliert. Die Messung der Konzentration an Plasminogen-Aktivator ergab 70 ΙΕ/ml. Die Lösung wurde gegen Tris-HCl-Puffer bei pH 7,8 dialysiert und nach der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung eines perlförmigen vernetz-

Ph

ten Dextrangels "Sephadex G100" (Hersteller /armacia Co.) auf das Molekulargewicht untersucht. Als Standardproteine wurden Albumin (Molekulargewicht 68.000), Hühnereiweiß (Molekulargewicht 45.000), Chymotrypsin (Molekulargewicht 25.000) und Cytochrom (Molekulargewicht 12.500) verwendet. Wie Figg. 1 und 2 zeigen, hatten mehr als 95% des gebildeten Plasminogen-Aktivators die Spitze des Molekulargewichts im Bereich von 45.000 bis 6 0.000.

Tabelle 1

Aminosäuren	mg/Liter
L-Argininhydrochlorid	21,1
L-Cystin	12,0
L-Glutamin	292,0
L-Histidinhydrochloridmonohydrat	10,5
L-Isoleucin	26,2
L-Leucin	26,2
L-Lysinhydrochlorid	36,5
L-Methionin	7,5
L-Pheny!alanin	16,5

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Aminosäuren

L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin

Vitamine D-Biotin D-Ca-Pantothensäure Cholinchlorid Folsäure i-Inosit Nicotinamid Pyridoxalhydrochlorid Riboflavin Thiaitiinhydrochlorid

Anorganische Salze

NaCl	'4'2H₂O
KCl
Na₂HPO	7H₂O
KH₂PO₄	(wasserfrei)
MgSO₄·	6H₂O
CaCl₂	Zusatzstoffe
MgCl₂-
Andere

	,8
3015699	,0 _
mg/Liter	,1
23	,4
4	,0
18	,0
23	,0
1	,0
1	,8
1	,0
1	/0
1	,1
1	r0
1	,0
0	,0
1,	.0
8000,	0
400,	0
60,	0
60,	0
100,	0
140,	0
100,	0
1000,
5000,
5000,

Glucose Milcheiweißhydrolysat Dinatriumfumarat

Beispiel 2

Eine Lösung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise auf voll ausgewachsene menschliche Lungenzellen (bezogen von Flow Laboratories) bei pH 7,3 bis 7,7 aufgegeben und 30 Tage bei 37°C gehalten. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Lösung wurde bei wenigstens 50% der Sätti-

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gungskonzentration des gelösten Sauerstoffs gehalten. Nach 30 Tagen wurde die Lösung isoliert, gegen Tris-HCl-Puffer von pH 7,8 dialysiert und dann durch Gelfiltration an perlförmigem vernetzten! Dextrangel "Sephadex G-100" (Farmacia Co.) auf Molekulargewicht analysiert. Wie Figg. 3 und 4 zeigen, hatte der erhaltene Plasminogen-Aktivator ein Spitzenmolekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000.

Beispiel 3

Eine Lösung der in Tabelle 3 genannten Zusammensetzung wurde von einem Vorratsbehälter fünf Behältern, die voll ausgewachsene menschliche Nierenzellen (Flow Laboratories) enthielten, .in einer Menge von 20 ml pro 100.000 Zellen zugeführt. Die Zellen wurden bei 37°C gehalten, und der pH-Wert der Lösung wurde mit einer Salzsäure- oder Natriumhydroxidlösung bei 5, 6, 7, 8 bzw. 9 gehalten. Die Konzentration an gelösten Sauerstoff in jeder Lösung wurde bei 50% der Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs gehalten. Nach 40 Tagen wurden die Lösungen isoliert, gegen einen Phosphatpuffer von pH 7,4 dialysiert und an einer Säule des Produkts "CM Sephadex C-5C" (Farmacia Co.) unter Verwendung von 0,1-molarem Phosphatpuffer, der 0 bis 0,5 M Natriumchlorid enthielt, entwickelt. Plasminogen-Aktivator, in dem die einzelnen aktiven Fraktionen ein Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 6 8.000 hatten, wurde durch Gelfiltration nachgewiesen. Die Ergebnisse für die verschiedenen pH-Werte sind in Tabelle 2 genannt.

Tabelle 2
£H 5 6 7 8 9

Plasminogen-Aktivator - + +++ +++ +++

- : nicht vorhanden (nicht nachgewiesen)

+ : sehr geringe Menge

++ : geringe Menge

+++ : große Menge

030044/0383

Tabelle

Amino s äuren	mg/Liter
L-Alanin	25,0
L-Argininhydrochlorid	70,0
L-Asparaginsäure	30,0
L-Cysteinhydrochlorid	0,1
L-Cystin	20,0
L-Glutaminsäure	67,0
L-Glutamin	100,0
L-Glycin	50,0
L-Histidinhydrochloridmonohydrat	22,0
L-Hydroxyprolin	10,0
L-Isoleucin	20,0
L-Leucin	60,0
L-Lysinhydrochlorid	70,0
L-Methionin	15,0
L-Phenylalanin	25,0
L-Prolin	40,0
L-Tryptophan	10,0
L-Tyrosin	40,0
L-Valin	25,0
L-Serin	25,0
L-Threonin	30,0
Anorganische Salze
Fe (NO₃)₃*9H₂O	0,70
NaCl	8000,0
KCl	400,0
Na₂HPO₄-2H₂O	60,0
KH₂PO₄	60,0
MgSO₄'7H₂O	100,0
CaCIp (wasserfrei)	140,0
MgCl₂'6H₂O	100,0
Andere
Glucose	1000,0
Dinatriumfumarat	5000,0

Beispiel 4

Eine Lösung der in Tabelle 3 genannten Zusammensetzung wurde von einem Vorratsbehälter vier Gefäßen, die voll ausgewachsene menschliche Nierenzellen (Flow Laboratories) enthielten, in einer Menge von 20 ml pro 100.000 Zellen zugeführt. Die Zellen wurden bei 37 C gehalten. Die den einzelnen Gefäßen zugeführten Lösungen wurden unter Verwendung von Stickstoff, Sauerstoff und Luft auf eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 10, 15, 30, 60 bzw. 90% der Sättigungskonzentration sowie auf pH 7,3 eingestellt. Nach 40 Tagen wurde jede der Lösungen isoliert und gegen Tris-HCl-Puffer von pH 7,8 dialysiert. Ein Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000 wurde nachgewiesen. Wie in Tabelle 4 angegeben, wurde der gewünschte Aktivator nachgewiesen, indem die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei wenigstens 15% der Sättigungskonzentration gehalten wurde. Die starke Bildung des Aktivators wurde bei einer Konzentration von gelöstem Sauerstoff von wenigstens 30% der Sättigungskonzentration festgestellt.

Tabelle 4

Gelöster Sauerstoff (%) 10 15 30 60 90 Plasminogen-Aktivator + ++ +++ +++ +++

Beispiel 5

5 Eine Lösung der in Tabelle 3 genannten Zusammensetzung wurde auf voll ausgewachsene menschliche Nierenzellen (Flow Laboratories) in einer Menge von 20 ml pro 100.000 Zellen aufgegeben und bei 37 C gehalten. Die Lösung wurde bei pH 7,3 und einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von wenigstens 60% der Sättigungskonzentration gehalten. \Nach 40 Tagen wurde die Lösung isoliert und gegen einen iitratpuffer von pH 3 und 4 (Dat^fi für Biochemical Research, 2.Aufl. (1969) 486), einen Natriumacetatpuffer von pH 5 (ibid, S. 4 87), einen Phosphatpuffer von pH 6

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und 7 (ibid, S. 489), einen Tris-HCl-Puffer von pH 8 und 9 (ibid, S. 494) , einen Boratpuffer von pH 10 (ibid, S. 497) und einen Natriumphosphatpuffer von pH 11 und 12 (ibid, S. 498) dialysiert, worauf der Gehalt an Plasminogen-Aktivator vom Molekulargewicht 45.000 bis 68.000 gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.

pH-Wert bei der
Nachbehandlung
zur Abtrennung
des Aktivators 3. ± H §_ 1 8. 9 10 11 12

Plasminogen-

Der gewünschte Aktivator wurde festgestellt, wenn die Nachbehandlung bei einem pH-Wert von wenigstens 4 durchgeführt wurde.

Beispiel 6

Eine Lösung der in Tabelle 3 genannten Zusammensetzung wurde auf voll ausgewachsene menschliche Nierenzellen (FlOw Laboratories) in einer Menge von 0,4 ml/100.000 Zellen aufgegeben und bei 37°C gehalten. Die Lösung wurde bei pH 7,3 und die Konzentration an gelösten Sauerstoff bei wenigstens 60% der Sättigungskonzentratibn gehalten. Die Lösung wurde alle 10, 20 bzw. 30 Tage in drei gesonderten Gefäßen vollständig ausgewechselt, und die Lösung wurde mit den Zellen insgesamt 60 Tage in jedem Gefäß in Berührung gebracht. Die nach dem Austausch gewonnenen Lösungen wurden gegen einen Tris-HCl-Puffer von pH 7,8 dialysiert und durch Gelfiltration zur Bestimmung des Molekulargewxchts analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 genannt. Wenn die Kontaktzeit der Lösung mit den Zellen 10 Tage betrug (d.h. wenn die Lösung alle 10 Tage ausgewechselt wurde), wurden 98 bis 100% Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000 nachgewiesen. Wenn die Verweilzeit 30 Tage betrug, wurden wenigstens 95% Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis

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6 8.000 nachgewiesen.

Tabelle 6

Verweilzeit	Häufigkeit des I	Beispiel 7	Molekulargewicht	Andere
Tage	Lösungswechsels 45,	.000-6 8.000	0%
	1	100%	0
	2	100	0
	3	100	0
10	4	100	1
	5	99	2
	6	98	0
	1	100	1
20	2	99	3
	3	97	3
	1	97	5
30	2	95

Eine Lösung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung wurde auf voll ausgewachsene menschliche Nierenzellen (Flow Laboratories) in einer Menge von 0,4 ml/100.000 Zellen aufgegeben und bei 37°C gehalten. Die Lösung wurde bei pH 7,3 und einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von wenigstens 50% der Sättigungskonzentration gehalten. Die Lösung wurde alle 7 Tage vollständig ausgewechselt, und die Zellen wurden während einer Gesamtzeit von 49 Tagen mit der Lösung in Berührung gehalten. Die Lösung wurde isoliert und ihr Gehalt an Plasminogen-Aktivator nach der Fibrinplattenmethode (Arch. Biochem. Biophys. 40 (1962) 346) bestimmt und mit 628 CTA-Einheiten/ml ermittelt. Der Aktivator bestand aus einer Einzelfraktion mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000. Zu 250 ml der Lösung wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 70% der Sättigungskonzentration gegeben. Die Fällung wurde durch Zentrifugalabscheidung isoliert und 48 Stunden bei 4°C gegen einen 10 rtiM-Phosphatpuffer, der einen pH-

Wert von 7,0 hatte und 1 mM Athylendiaraintetraessigsäure enthielt, dialysiert. Die Enzymlösung wurde anschließend an einer Säule des Produkts "CM Sephadex C50" (Farmacia Co.) adsorbiert, die mit 10 mM Phosphatpuffer von pH 7,0, der 1 mM Äthylendiaminotetraessigsäure enthält, ins Gleichgewicht gebracht worden war, und mit einem 10 mM-Phosphatpuffer von pH 7,0, der 0,3 M Natriumchlorid und 1 mM Äthylendiaminotetraessigsäure enthielt, eluiert Die Lösung v/urde weiter eingeengt und durch GeI-filtration unter Verwendung eines 50 mM-Phosphatpuffers, der einen pH-Wert von 7,0 hatte und 0,5 M Natriumchlorid und 1 mM Äthylendiamin enthielt, als Entwicklungslösungsmittel gereinigt. Die Menge des in der vorstehend beschriebenen Weise isolierten Plasminogen-Aktivators betrug 87.900 CTA-Einheiten und die Gewinnungsrate 56%. Das Molekulargewicht des Plasminogen-Aktivators wurde durch Gelfiltration an perlförmigem vernetztem Dextrangel "Sephadex G-100" unter Verwendung von Zytochrom C, Chymotripsinogen, Hühnereiweiß und Rinderalbumin als Molekulargewichts-Bezugssubstanzen ("markers") gemessen. Wie Fig. 5 zeigt, wurde Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000 als Einzelfraktion erhalten.

250 ml der Ausgangslösung, die den gleichen vorstehend genannten Plasminogen-Aktivator enthielt, wurde unter den gleichen Bedingungen gereinigt, wobei jedoch die für die Nachbehandlung verwendete Lösung keine Äthylendiamintetraessigsäure enthielt. Die gewonnene Menge des ·■· ,· Plasminogen-Aktivators betrug 36.100 CTA-Einheiten, und die Gewinnungsrate betrug 23%.

Beispiel 8

Eine Lösung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung wurde auf voll ausgewachsene menschliche Lungenzellen (Flow Laboratories) in einer Menge von 0,4 ml/100.000 Zellen aufgegeben und bei 37°C gehalten. Die Lösung wurde

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bei pH 7,3 und einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von wenigstens 52% der Sättigungskonzentration gehalten. Die Lösung wurde alle 7 Tage vollständig ausgewechselt, und die Zellen wurden insgesamt 42 Tage mit der Lösung in Berührung gebracht. Die Lösung wurde isoliert, und ihr Gehalt an Plasminogen-Aktivator wurde mit 158 TCA-Einheiten/ml ermittelt. Der Aktivator bestand aus einer Einzelfraktion mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000.

Auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise wurden 200 ml der erhaltenen rohen Enzymlösung mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die erhaltene Fällung wurde 48 Stunden bei 4 C gegen 10 mM Citratpuffer, der einen pH-Wert von 6,0 hatte und 1 mM trans-1 ,2-Diaininocyclohexantetraessigsäure enthielt, dialysiert, dann an Phosphocellulose, die mit dem gleichen vorstehend genannten Puffer äquilibriert worden war, adsorbiert und anschließend mit einer Lösung, die durch Zusatz von 0,3 M Natriumchlorid zu dem gleichen vorstehend genannten Puffer hergestellt worden war, eluiert.

Die Lösung wurde weiter eingeengt und durch Gelfiltration an perlförmigem vernetztem Dextrangel "Sephadex G100" unter Verwendung von 0,05 M Tris-HCl-Puffer, der einen pH-Wert von 8,0 hatte und 0,5 M Natriumchlorid und 1 mM trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure enthielt, gereinigt.

5 Die Menge des hierbei erhaltenen Plasminogen-Aktivators betrug 15.200 CTA-Einheiten und die Gewinnungsrate 48%. Die Molekulargewichtsbestimmung dieses Produkts nach der gleichen Gelfiltrationsmethode wie in Beispiel 7 ergab, daß ein Plasminogen-Aktivator als Einzelfraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 6 8.000 erhalten worden war.

Unter den vorstehend genannten Bedingungen wurden 200 ml der Ausgangslösung, die den gleichen vorstehend genannten Plasminogen-Aktivator enthielt, gereinigt, wobei jedoch die zur Nachbehandlung verwendete Lösung keine trans-1,2-

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Diaminocyclohexantetraessigsäure enthielt. Die Menge des gewonnenen Plasminogen-Aktivators betrug 5690 CTA-Einheiten und die Gewinnungsrate 18%.

Beispiel 9

Auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise wurde eine Lösung, die 680 CTA-Einheiten/ml eines Plasminogen-Aktivators enthielt, hergestellt. Zu 200 ml der Lösung wurden 3 g eines Acrylnitril-Methylacrylat-Copolymerisats gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt, um den Plasminogen-Aktivator am Copolymerisat zu adsorbieren. Es wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und bei niedriger Temperatur mit 50 ml 4%igem wäßrigem Ammoniak, das 1 mM o-Phenanthrolin enthielt, eluiert. Die Lösung wurde anschließend 48 Stunden gegen einen 10 mM-Phosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,0 hatte und T mM o-Phenanthrolin enthielt, dialysiert, an Hydroxyapatit, der mit dem gleichen vorstehend genannten Puffer äquilibriert worden war, adsorbiert und eluiert, während sie kontinuierlich durch einen 0,4-molaren Phosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,0 hatte und 1 mM o-Phenanthrolin enthielt, ersetzt wurde. Fraktionen mit Plasminogenaktivitat wurden aufgefangen und der Gelfiltration an perlförmigem vernetztem Dextrangel "Sephadex G100" unter Verwendung eines 0,05-molaren Phosphatpuffers, der einen pH-Wert von 7,0 hatte und 1 mM o-Phenanthrolin und 0,5 M Natriumchlorid enthielt, als Entwicklungslösungsmittel· unterworfen. Der Plasminogen-Aktivator wurde weiter an p-Aminobenzamidin-Agarose adsorbiert, das mit einem 0,05-moiaren Phosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,0 hatte und 1 mM o-Phenanthroiin und 0,5 M Natriumchlorid enthielt, äquilibriert war, und mit 0,1 M Acetatpuffer von pH 4,0, der 1 mM o-Phenanthrolin und 1 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die Gesamtaktivität des erhaltenen Plasminogen-Aktivators betrug 42.400 CTA-Einheiten und die Gewinnungsrate 31%. Dieses Produkt zeigte bei der Scheiben-Elektrophorese und

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bei der Elektrophorese an Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel eine einzelne Bande. Bei der Messung des Molekulargewichts durch Elektrophorese an Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel unter Verwendung von Rinderalbumin, Hühnereiweiß, Chymotrypsinogen und Zytochrom C als Bezugsproteine wurde nur ein einziges Protein mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 6 8.000 nachgewiesen.

Wenn die gleiche Nachbehandlung, die vorstehend beschrieben wurde, unter Verwendung von 200 ml der Ausgangslösung, die den gleichen Plasminogen-Aktivator enthielt, unter den gleichen vorstehend genannten Bedingungen durchgeführt wurde, wobei jedoch die für die Nachbehandlung verwendete Lösung kein o-Phenanthrolin enthielt, betrug die Gesamtaktivität der gewonnenen Plasminogen-Aktivatoren 19.000 CTA-Einheiten, und die Gewinnungsrate betrug 14%.

Vergleichsbeispiel 1

Voll ausgewachsene ganze menschliche Embryozellen (Flow Laboratories) wurden auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise behandelt, wobei eine Lösung, die 97 CTA-Einheiten/ ml Plasminogen-Aktivator enthielt, erhalten wurde. Dieser Plasminogen-Aktivator bestand aus einer Einzelfraktion mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000. Auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise wurden 100 ml dieser 5 Lösung mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Fällung wurde 48 Stunden bei 4 C gegen einen 10 mM-Phosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,0 hatte und 1 mM Äthylendiamintetraessigsäure enthielt, dialysiert. Nach der Dialyse betrug die Gesamtaktivität 4750 CTA-Einheiten und der Rückstand 49%.

Getrennt hiervon wurde eine Fällung aus 100 ml der gleichen vorstehend beschriebenen Lösung abgetrennt und gegen einen Puffer, der keine Äthylendiamintetraessigsäure enthielt, dialysiert. Die restliche Aktivität betrug 52%.

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Nach der Dialyse gemäß dem Vergleichsbeispiel 1 enthielt die Lösung 60 bis 62% einer Plasminogen-Aktivatorfraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 30.000. Die Gewinnung von Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000 als Einzelfraktion ohne Senkung ihres Molekulargewichts war nicht möglich.

Beispiel 10

Zum Vergleich wurde die gemäß Beispiel 7 hergestellte Lösung auf die in Vergleichsbeispiel 1 beschriebene Weise behandelt. Die restliche Aktivität betrug 99% bzw. 42%.

Die erhaltenen Plasminogen-Aktivatoren hatten sämtlich ein Molekulargewicht von 45.000 bis 68.000 und enthielten keine Fraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 30.000.

Speziell wurde gefunden, daß der Zusatz eines Chelatbildners die Wirkung hat, daß ein Plasminogen-Aktivator aus einer Lösung, die durch Zellen von Nieren oder Lungen gebildet worden ist, erhalten wird-. Bei den ganzen Embryozellen hemmte der Chelatbildner nicht die Zersetzung, Denaturierung und Deaktivierung des Plasminogen-Aktivators.

Beispiel 11

Eine Lösung, die einen nach der gleichen Methode wie in Beispiel 7 erhaltenen Plasminogen-Aktivator enthielt, wurde auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Fällung wurde. 48 Stunden gegen einen 10 mM-Phosphatpuffer, der einen pH-Wert von 7,0 hatte und o-Phenanthrolin> trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure bzw. Äthylendiaminotetraessigsäure in den in Tabelle 7 genannten verschiedenen Konzentrationen enthielt, dialysiert. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 7 genannt.

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Tabelle 7

	Restliche Aktivität (%)	trans-1,2-Diamino cyclohexantrate- essigsäure	Äthylendiamin- tetraessig- säure
Zugesetzte Menge mM	o-Phenan- throlin	40	45
0	50	63	68
0,05	61	82	85
0,1	81	95	96
0,3	97	97	99
0,5	98	97	97
1,0	95	92	92
3,0	92	93	91
5,0	90

Eine deutliche Wirkung wurde beobachtet, wenn die zugesetzte Menge wenigstens 0,1 mM betrug, und der Plasminogen- Aktivator wurde fast quantitativ gewonnen, wenn die zugesetzte Menge wenigstens 0,3 mM betrug.

Bei einer Menge von wenigstens 0,1 mM hatten wenigstens 95% des gewonnenen Plasminogen-Aktivators ein Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000. Insbesondere wurde bei einer Menge von wenigstens 0,3 mM die Fraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000 zu fast 100% erhalten.

Beispiel 12

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch Saccharose oder Maltose als Kohlenstoffquelle anstelle von Glucose in der mit den Zellen in Berührung zu bringenden Lösung verwendet wurde. Als Ergebnis hatten mehr als 95% des erhaltenen Plasminogen-Aktivators eine Spitze des Molekulargewichts im Bereich von 45.000 bis 6 8.000.

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Lee r s e i t e

Claims

VON KREISLER SCHÖNWALD EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler+ 1973 Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln Dr. H.-K. Werner, Köln W/Ax 23. April 1980 DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF D-5000 KÖLN 1 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha, No. 2-6, Dojima-hama 1-chome, Kita-ku, Osaka-shi, Osaka (Japan). Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator Pate η tansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 45.000 bis 68.000, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Lös"ung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthält, mit Zellen, die von menschlichen Nieren oder Lungen stammen und zur Bildung eines Plasminogen-Aktivators fähig sind, in Berührung bringt, während man den pH-Wert der Lösung im Bereich von etwa 6 bis 9 und die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Lösung bei wenigstens 30% der Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs hält,

b) und den hierbei gebildeten Plasminogen-Aktivator von der Lösung abtrennt, während man den pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 12 hält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verweilzeit der Lösung in Kontakt mit den Zellen auf nicht mehr als 30 Tage begrenzt, wodurch wenigstens

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95% des über einen Zeitraum von wenigstens 60 Tagen gebildeten Plasminogen-Aktivators ein Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000 haben.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verweilzeit der Lösung in Kontakt mit den Zellen auf nicht mehr als 10 Tage begrenzt, wodurch der über einen Zeitraum von wenigstens 40 Tagen gebildete Plasminogen-Aktivator ein Molekulargewicht im Bereich von 45.000 bis 68.000 als Einzelfraktion hat.

4. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (b) in Gegenwart wenigstens eines Chelatbildners durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Chelatbildners in der Lösung wenigstens 0,1 mMol pro Liter Lösung beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß . die Konzentration des Chelatbildners in.der Lösung wenigstens 0,3 mMol pro Liter Lösung beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chelatbildner wenigstens eine Verbindung aus der aus o-Phenanthrolin, trans-1,2-Diaininocyclohexantetraessigsäure und Äthylendiamintetraessigsäure bestehenden Gruppe verwendet*

8. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) bei einer Temperatur von etwa 15 bis 45 C durchführt.