DE3412669A1

DE3412669A1 - Verfahren zur isolierung von carboxypeptidase b aus dem pankreas von saeugetieren und zur immobilisierung derselben

Info

Publication number: DE3412669A1
Application number: DE19843412669
Authority: DE
Inventors: László Dr. Boross; geb. Rezneki Erzsébet Budapest Dala; geb. Deér Aranka Dr. Szeged Kiss; Béla Dr. Szajáni; Arpád Budapest Tetzli
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar Rt
Current assignee: Reanal Finomvegyszergyar Rt
Priority date: 1983-07-11
Filing date: 1984-04-04
Publication date: 1985-01-24
Also published as: HU190129B; SU1487817A3; DD220334A5; RO88619A; CS236184A2; RU1769763C; CS252472B2; US4650762A; CU21674A3; DD222632A5; HUT34234A

Description

REANAL FINOMVEGYSZERGYAR Budapest / Ungarn

VERFAHREN ZUR ISOLIERUNG VON CAREOIiYFEPTIDASE B

AUS DEM PANKREAS VON SAUGETIEREN UND ZUR IMMOBILISIERUNG

DERSELBEN

Di^:,e Erfindung betrifft ein neues Verfahren zu Isolierung von Carboxypeptidase B . aus dem Pankreas von Säugetieren - insbesondere aus Schweinepankreas und zur Immobilisierung des so isolierten Enzyms. Die als Handelsprodukt zugängliche Carboxy-' peptidase B wird aus Schweinebauchspeicheldrüse isoliert. Nach der Fachliteratur kann jedoch dieses Enzym auch aus dem Pankreas von anderen Säugetieren (z. B. Rind, Ziege) isoliert werden.

Nach dem in J. Biol. Chem. _25£, 2272 (i960) publizierten Artikel wird das Schweinepankreas aufgeschnitten und bei Raumtemperatur autolysiert. Der Fettgehalt des Organs wird mit Aceton, einem Aceton-Ather

Gemisch und schliesslich Äther entf ernt,.'das entfettete ■15 Organ wird.getrocknet und zerpulvert. Das acetonische Pulver wird mit Wasser extrahiert und das Extrakt mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Das Produkt wird nacheinander einer Entsalzung, einem Ionenaustausch (auf DEAE-CelIuIöse, durch Säulenchromatographie) ur.d einer Ausfällung mit Ammoniumsulfat unterworfen. Der Niederschlag wird durch Dialyse oder Gelfiltrieren entsalzt. Das Enzym wird in gefrorenem Zustand gelagert, weil die L.yophylisierung die Aktivität um 25-4-5 % herabsetzt.

Die specifische Aktivität des Produktes beträgt 184-,2 Einheiten/mg (bei 25 C⁰ mit einem Hippuryl-L- -arginin Substrat gemessen), was im Vergleich zum aus dem autolysierten Gewebe erhaltenen Extrakt einer 16-17-fachen Reinigung entspricht.

In der Praxis wird die obige Methode allgemein verbreitet verwendet.

Gernäss Biochemistry _1, 1069 (1962) kann Carboxy-'peptidase B aus Rinderpankreas in kristalliner Form durch

Aktivierung des gereinigten Zymogens - d.h. der Procarboxypeptidase B - hergestellt werden. Nach diesem Verfahren wird als Ausgangsstoff ebenfalls das wässrige Extrakt des acetonischen Pankreaspulvers verwendet. Das wässrige Extrakt enthält Procarbo'xypeptidase B, welche einer chromatographischen Reinigung zuerst an DEAE-Cellulose .und darauffolgend an DEAE- -Sephadex unterworfen wird. Die Procarboxypeptidase B wird mit Tripsin in das aktive Carboxypeptidase B überführt, welche schliesslich kristallisiert wird.

Nach dem in Biochem. 16$, 255 (1977) publizierten Artikel wird die Isolierung der Carboxypeptidase B aus humanem Pankreas beschrieben. Die Herstellung des acetonischen Pulvers, die Ausfällung mit Ammoniumsulfat und die DEAE-Cellulose-Chromatographie werden wesentlich wie in J. Biol. Chem. 255, 2272 (I960) offenbart, durchgeführt. Das für die Aufarbeitung von hur.anem Pankreas beschriebene Verfahren unterscheidet sich von der obigen Methode nur in den bei der DEAE-Cellulose-Chromatographie verwendeten Pufferkonzentrationen und Eluentengradienten. Die so erhaltene Carboxypeptidase B wird durch an Whatman CM-Cellulose Ionenaustauscher durchgeführte Chromatographie auf zwei Fraktionen - undzwar B-, und Bp aufgetrennt. Die spezifische Aktivität der B-,- und B2- -Fraktionen beträgt 1192 Einheiten/mg bzw. 862-Einheiten/mg (bei 57 C und an einem Hippuryl-L-Arginin Substrat . gemessen), was zum wässrigen Extrakt verglichen einer 108-fachen bzw. 78-fachen Reinigung entspricht. Carboxypeptidase B kann auch aus Ziegenpankreas isoliert werden. /"Indian J. Biochem. Bicphys. _12, 24-(1975) bzw. 15, 106 (1976)_7.
Die wesentlicher. F.erkr.ale dieses Verfahrens sind die

Folgenden:

Das Ziegenpankreas wird bei -20 C gefroren, in gefrorenem Sustand aufgeschnitten und die bei +4 C ausfliessende Zellflüssigkeit gesammelt. Die gesammelte Flüssigkeit wird einer Autolyse unterworfen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 4,6 eingestellt, die Lösung mit destilliertem Wasser auf das zehnfache Volumen verdünnt und die entstandene Suspension bei +4 C° 2-3 Stunden lang stehengelassen. Der überwiegende Teil der aktiven Carboxypeptidase fällt aus. Der Niederschlag wird mit Bariumhydroxyd bei einem pH-V/ert zwischen 10,0 und 10,4 extrahiert. Aus dem Extrakt wird das Enzym bei pH 6,5 kristallisiert und viermal* umkristallisiert. Die weitere Reinigung des so erhaltenen Präparats wird in Indian J.

Biochem. Biophys. JLJ5, 106 (1976) beschrieben. Nach dieser Methode wird das bei pH 6,5 ausgefällte Produkt in einer 0,2 molaren Bariumhydroxridl-ösung gelöst, der pH-Wert mit Essigsäure auf 7,0 eingestellt und die Substanz durch mit Ammoniumsulfat durchgeführte Fraktionierung und wiederholten Ionenaustausch (auf DEAS-Celiulose).weitergereinigt. Die entsalzte Enzymlösung wird bei -20 C° gelagert. ·

Die spezifische Aktivität des Produktes beträgt 102,66 Einheiten/mg (an einem Hippuryl-L-arginin-Substrat

25 gemessen) , was einer 44-fachen Reinigung entspricht.

Nach dem. in J. Mol. Catal. JLO, 255 (1981) publizierten Artikel-wird das wässrige Extrakt des acetonischen Pulvers von Ziegenpankreas mit Ammoniumsulfat fraktioniert und die bei einer 0,3-0,7-fachen Sättigung

JO erhaltene Fraktion einer Chromatographie auf CM-Sephadex C-50 und DEAE-Cellulose unterworfen. Die spezifische Aktivität des so hergestellter. Produktes beträgt

82,9 Einheiten/mg (an einem Hippuryl-L-Arginin Substrat gemessen), was einer 18,2-fachen Reinigung entspricht.

Der gemeinsame Nachteil der obigen Methoden besteht darin, dass als Ausgangsstoff die Zellflüssigkeit von Pankreas oder das acetonische Pulver des Organs eingesetzt wird. Die Sammlung der Zellfiüssigkeit ist schwierig und im Falle von Schweinepankreas wegen des hohen Fett- und Schleimgehaltes des Organs praktisch undurchführbar. Die Herstellung des acetonischen Pulvers fordert die Anwendung von kostspieligen, feuer- und explosionsgefährlichen Lösungsmitteln (Äther, Aceton) an, die lokalen Erwärmungen können das Enzym schädigen, die Ausbeute und die spezifische Aktivität herabsetzen. Ein weiterer Nachteil ist, dass ein Produkt: befriedigender Reinheit nur mit Hilfe eines komplizierten, aus viel Schritten bestehenden Arbeitsvorganges herstellbar ist.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Beseitigung der obigen Nachteile der bekannten Methoden und die Schaffung eines Verfahrens, nach welchem Carboxypeptidase B mit einer geeigneter spezifischen Aktivität einfach, unter Beseitigung der Sammlung der Organflüssigkeit und der Herstellung des acetonischen Pulvers hergestellt werden kann.

Es wurde gefunden, dass wenn man das homogenisierte Schweinepankreas einer Autolyse und darauffolgenden Wärmebehandlung unterwirft, danach zentrifugiert oder filtriert, die supernatierende Flüssigkeit mit einem aus einem einwertigen Kation und einer anorganischen Säure gebildeten Salz in zwei Stufen sä~tigt, danach aus der bei der zweiten Sättigung=stufe erhaltenen Suspension den Niederschlag abtrennt ur.i die Leerung des Niederschlages gegen Wasser dialysiert, eine Enrym—

lösung erhalten wird, welche bei 25 C an einem Hippuryl- -L-Arginin Substrat gemessen eine spezifische Aktivität von mindestens 7° Einheiten/mg aufweist und zur Herstellung von immobilisierter Carboxypeptidase B 5 ohne v/eitere Reinigung unmittelbar verwendet werden kann.

Gegenstand -.der Erfindung ist eTnyverf ahren zur Herstellung von Carboxypeptidase B aus dem Pankreas von Säugetieren, indem man die Bauchspeicheldrüse in an sich bekannter Weise homogenisiert, das Homogenisat bei 37 C⁰ eine Stunde lang oder bei 25 C⁰ 15 Stunden lang autolysiert, danach mit einem Puffer von pH 5₅0-8,5 in einem Verhältnis von 1:1 verdünnt und 5-30 Minuten lang bei'50-75 C° einer Wärmebehandlung unterwirft, das so behandelte Gemisch zentrifugiert oder filtriert, der überstehenden FlüssigkeitVfo-50 g/l Ammoniumsulf at zugibt, die ausgefällte, die Carboxypeptidase B enthaltende aktive Fraktion .durch Zentrifugieren abtrennt, dieses Enzym im Wasser oder in einer Pufferlösung löst, gegen Wasser oder eine Pufferlösung dia-

20 lysiert und in gefrorenem Zustand lagert.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird das homogenisierte und autolysierte Pankreas mit einem Puffer, dessen pH-Wert'5₅0-8,5» zweckmässig 6,0 beträgt, in einem Verhältnis von 1:1 verdünnt und danach bei 50-75 C⁰ 5-30 Minuten lang - zweckmässig bei 60 C⁰ 20 Minuten lang - einer Wärmebehandlung unterworfen. Bei dieser Wärmebehandlung wird der überwiegende Teil der das zu isolierende Enzym begleitenden Proteine denaturiert. Das denaturierte Protein fällt aus der wässrigen Lösung in Form eines Niederschlages mit grosser Oberfläche aus und zieht in Folge seiner klärender Wirkung den grossen Teil der in der Lösung

χ 200-320 g/l Ammoniumsulfat zugibt, die erhaltene Suspension zentrifugiert, den niederschlag verwirft, der überstehenden Flüssigkeit

zurückgebliebenen Verunreinigungen mit. Dadurch wird die schwierige und kostspielige Herstellung des acetonischen Pankreaspulvers beseitigt.

Ein erheblicher Teil der Proteinverunreinigungen wird aus der nach Trennung der denaturierten Proteine erhaltenen Pufferlösung durch Zugabe von 200-520 g/l - vorteilhaft 310-320 g/l - Ammoniumsulfat ausgefällt. Der Niederschlag, welcher die Proteinverunreinigungen enthält, wird entfernt und aus der überstehenden Flüssigkeit wird das enzymhaltige Produkt durch Zugabe von 10-80 g/l - vorzugsweise 30 g/l - Ar.:noni um sulfat ausgefällt. Der Niederschlag wird im Wasser oder in einer Pulverlösung gelöst und die Lösung in an sich bekannter Weise gegen Wasser dialysiert. Die bei 25 C⁰ gemessene spezifische Aktivität des so erhaltenen enzymhaltigen Produktes beträgt mindestens 70 Einheiten/mg, was einer etwa 10-fachen Reinigung entspricht. Das so erhaltene Produkt kann zur Herstellung von immobilisierten Enzym- ■ Präparaten ohne weitere Reinigung unmittelbar eingesetzt

20 werden.- ,

Die immobilisierten Carboxypepticase B Präparate können zur Bestimmung der COOH-terminalen-Aminosäuren von Proteinen und Peptiden oder zur Trennung von DL-Arginin oder DL-Lysin im betrieblichen Masstaben verwendet werden. Die letztere praktische Anwendung stosst auf die komplizierte Herstellung des Enzyms und auf die hohen Kosten derselben. Das erfindungsgemässe Isolierungsverfahrens des Enzyms beseitigt die obigen Schwierigkeiten und ermöglicht die betriebliche Anwendung des Enzyms.

Dies fördert die Immobilisierung des Enzyms in aktiver Form und dadurch die Verbreitung des kontinuierlichen-Verfahrens.

-χ-

- J6 '

Ein weiteres Ziel der'Erfindung ist die Herstellung von den obigen Forderungen entsprechenden immobilisierten Carboxypeptidase B-Enzympräparaten. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden immobilisierte Carboxypeptidase B Enzympräparate hergestellt, welche das Enzym an einem chemisch inerten, der Wirkung von Mikroorganismen unbegrenzt widerstehenden, gute mechanische Eigenschaften aufweisenden, eine grosse Durchflussgeschwindigkeit ermöglichenden Träger gebunden enthalten.

Eine weitere Forderung besteht darin, dass das Enzym zum Träger unter milden Reaktionsbedingungen verknüpft werden soll.

Es wurde gefunden, dass aus Acrylsäure und/oder Methacrylsäure bzw. Acrylamid und/oder !Methacrylamid Monomeren mit Hilfe eines Vernetzungsmittels des Acryl- oder Allyltyps (z. B. Ν,Ν'-Methylen-bisacrylamid, Athylendiacrylat oder Ν,Ν-Diallylweinsäureamid) gebildete, mindestens 0,1 m-.Äquiv./g - .zweckmässig 2-8 m- Äquiv./g funktioneile Carboxygruppen aufweisende polymere Gele

20 den gegenüber von Trägern gestellten Forderungen

vollständig entsprechen. Die obigen Enzymträger können nach an sich bekannten'Methoden hergestellt werden.

Die funktioneilen Carboxygruppen der verwendeten Enzymträger können nach bekannten Methoden durch Behandlung mit Carbodiimiden aktiviert werden. Die so behandelten Enzymträger sind zur Bindung von Carboxypeptidase B geeignet. Die Umsetzung kann auch unter milden Bedingungen (0-4 C⁰,"pH 7jO) durchgeführt werden.

50 Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein

Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Carboxypeptidase B Enzympräparaten, indem ir.an ein aus Acrylsäure

und/oder Methacrylsäure bzw. Acrylamid und/oder Methacryl^v amid Teileinheiten mit Hilfe von Vernetzungsmitteln des Acryl- oder Allyltyps -aufgebautes, mindestens 0,1 m- Äquiv./g funktionelle Carboxy gruppen enthaltendes polymeres Gel mit einer wasserlöslichen oder in organischen Lösungsmitteln bei einer Temperatur unter 0 C lösbaren Carbodiimid-Verbindung behandelt, auf den so aktivierten Träger die Carboxypeptidase B in einer Lösung mit einem pH-Wert zwischen 4,5 und 8,5 aufbringt, das erhaltene Produkt wäscht und erwünschtenfalls trocknet.

Als Polymer können vorzugsweise die obenerwähnten Acrylex C Polymere eingesetzt werden. Als Enzym kann Carboxypeptidase B irgendwelchen Ursprungs und nach irgendwelcher bekannten Methode isoliert verwendet werden.

Zur. Aktivierung des Enzymträgerkopolymers können z. B. N-Cyclohexyl-N'-/~2-(4-morpholinyl)-äthyl_7-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat oder N-Athyi-N'-(3-dinethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid Verwendung finden. · Es werden vorzugsweise wasserlösliche Carbodiimidverbindungen eingesetzt. Sollte man nur in organischen Lösungsmitteln lösbare Carbodiimidverbir.dungen verwenden, kommen solche Derivate in Betracht, welche im angegebenen organischen Lösungsmittel in der Kälte (d. h. bei einer Temperatur unter 0 C⁰) ausreichend lösbar sind.

Das Carboxypeptidase wird auf den aktivierten Träger aus einer Lösung mit einem pH-Wert von 4,5-8,5 - vorteilhaft' zwischen 6,0 und 7₅O - aufgebracht. Als Reaktionsmedium können zweckmässig- 0,05-0,1 molare Kaliumphosphatpufferlösungen mit einem pH-Wert von 7,0 einge-

30 setzt werden.

Das nach der Verkupplungsreaktion_ hergestellte immobilisierte Enzympräparat wird in an sich bekannter

Weise gewaschen und erwünschtenfalls getrocknet. Das Enzympräparat kann ,jedoch auch in wässriger Suspension bei einer Temperatur von 0-4 C⁰ gelagert werden.

Die spezifische Aktivität der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Enzympräparate beträgt 600-900 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Xerogel und dieser Wert ist für die praktisch Anwendbarkeit sehr günstig.

Weitere Einzelheiten des erfindungsgemässen

Verfahrens sind den nachstehenden Beispielen zu entnehmen, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken.

Beispiel 1

0,25 ^g Schweinepankreas wird an einer Fleichsmühle gemahlen, worauf 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl- -Puffers (pH 7}0) zugegeben w-erden und das Gemisch über eine Nacht bei +4 C stehengelassen wird. Am nächsten Tag wird die Suspension auf 37 C⁰ erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Die Organsuspension wird zentrifugiert, die supernatierende Flüssigkeit auf 50 C⁰ erwärmt und. bei dieser Temperatur ■weitere 30 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltes Puffers wird das Gemisch zentrifugiert.

Der supernatierenden Flüssigkeit werden 42,2 g Ammoniumsulfat zugegeben. Das Gemisch wird eine liacht stehengelassen, die Suspension zentrifugiert, der Niederschlag verworfen. Der pH-Wert der supernatierenden Flüssigkeit wird auf 7,0-7,2 eingestellt. Nach Zugabe von 36,1 g Ammonium sulfat wird die Suspension eine !lacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein . wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und

-/li mit destilliertem Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute: 3^-3 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität : 17,5 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 2

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen, worauf 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HC1-Puffers (pH 7,0) zugegeben werden und das Gemisch eine Nacht bei +4 C⁰ stehengelassen wird. Am nächsten Morgen wird die Suspension auf +37 C⁰ erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Die Organsuspension wird zentrifugiert, die'supernatierende Flüssigkeit auf 60 C⁰ erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 10 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eines eiskalten Puffers wird das Semisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 92 g Ammoniumsulfat zugegeben. Weil nach Stehenlassen über eine Nacht kein Niederschlag ausschied, werden der Lösung nach Einstellung des pH-Wertes auf '7,0-7,2 weitere 78,7 S Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4- C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7₅O) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lesung filtriert und gefroren. Ausbeute 295 ng C^rboxypep-idase. Spezifische Aktivität : 53,1 /uifole hydrolysiertes Hippuryl-L-arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 3

0,25 kg Schweinebauchspeicheldr'Jse werden an

- AH-

einer Fleischmühle gemahlen j worauf 250 ml eines C,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 7,0) zugegeben werden und das Gemisch eine Nacht bei +4 C⁰ stehengelassen wird. Am nächsten Morgen wird die Suspension auf +37 C erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur ' stehengelassen. Die Organsuspension wird zentrifugiert_} die supernatierende Flüssigkeit auf 60 C⁰ erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 20 Minuten lang'inkubiert. Nach Zugabe von 2 Vol.Teilen eines eiskalten Puffers wird

10 das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden

Flüssigkeit werden 98,2 g Ammoniumsulfat zugegeben. Weil nach Stehenlassen über eine Nacht kein Niederschlag ausschied, werden der Lösung nach Einstellung des pH- -Wertes auf 7j0-7,2 weitere 86,9 g Ammoniumsulfat zugegeben,. Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puff er (pH 7,0) gelöst und- gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

20 Ausbeute 266 mg Carboxypeptidase. Spezifische Aktivität : 63,2 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L- -arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 4-

· 0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen, worauf 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 7₅O) zugegeben werden und das Gemisch eine Nacht bei +4- C stehengelassen wird. Am nächsten Morgen wird die Suspension auf +37 C erwärmt und eine Stunde Lang bei dieser Temperatur stehengelassen Die Organsuspension wird zentrifugiert, die supernatierende Flüssigkeit auf 75 O erwärmt und bei

dieser Temperatur weitere 5 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eines eiskalten Puffers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 66,9 g Ammoniumsulfat zugegeben. Weil nach Stehenlassen über eine Nacht kein Niederschlag ausschied, werden der Lösung nach Einstellung des pH- -Wertes auf 7_}0-7,2 weitere 55»8 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4- C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 34- mg Carboxypeptidase. Spezifische Aktivität : 21,6 ^uMoIe hydrolysiertes Hippuryl-L-arginin/Minute/mg Protein.

	TABELLE 1	Zeit	GesamtaktivitKit	Carboxypeptidase	B	Specifische
		(Min.)	(Einheit/kg "			Aktivität
Einfluss der Temperatur			Pankreas)	Gesamtprotein	(Einheit/mg)
¹ und Zeitdauer der Wärmebehandlung; eines Schweine-	30	23968	(mg/kg Pankreas)	17,5
pankreashomogenisats auf die Aktivität von	10	62660		53,1
	20	67260	1372	63,2
Temperatur	5	2932	1180	21,6
(c°)		1064
	136
50
60

75

^x = 1 Einheit entspricht einer Enzymmenge, welche die Hydrolyse von

1,0 AiMoI Hippuryl-L-Arginin per Minute katalysiert (bei 25 C und
pH 7,65 gemessen)

INJ CD CD CD

-/IT-·

Beispiel 5

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen-und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Acetatpuffers. (pH 5,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenien Flüssigkeit werden 27^,8 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung .des pH-Wertes auf 7,0-7,2 232,9 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die

15 Suspension wird über eine Nacht stehengelassen und

zentrifugiert. Der Rückstand wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute

20 360 mg-Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität

14,8 AiMoIe hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 6

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 25O ml eines 0,05 molaren Acetatpüffers (pH 5»5) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit

werden 261,2 g Amrnoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der supernatierenden · Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7j0-7}2 228 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in ein wenig kaltem (+4- C ) Tris-HCl- -Puffer (pH 7jO) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 317 nig Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 20,5 AiMoIe hydrolisiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 7

0,3 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht .bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit • werden 301 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert und

25 der Niederschlag verworfen. Der supernatierenden

Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes" auf 7,0-7,2 252,6 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen-und zentrifugiert. Der Rückstand wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute 517 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 57 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L- -Arginin/Minute/mg Protein.

5 Beispiel 8

0,3 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,5) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. 'Teilen eiskaltem Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 326 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über .eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7j0-7,2 275}5 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert.

Der Rückstand wird in ein wenig kaltem (+4- C⁰) Tris-HCl- -Puffer (pH 7jO) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 361 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 43,8 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-

25 -L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 9.

0,3 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 7₅O) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰

-JLB"

erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 326 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen', zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes, auf 7,0-7,2 272 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 488 mg Carboxypeptidase B. Spezifische

15 Aktivität·39 j 9 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L- -Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 10

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsteh Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 7j5) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C° erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 247 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung ' des pH-Wertes auf'7,0-7,2 202 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehen-

gelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 695 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 17,4- yuMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 11

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 255 S Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 198 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird, in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 552 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität IA-, 3 AiMoIe hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

3 A 1 2 6 6

Beispiel 12

0,25"kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 8,5) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur srehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 24-7 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung' des pH-Wertes auf 7,0-7,2 197 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über 'eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in ein wenig kaltem (+4-. C⁰) Tris-HCl- -Puffer (pH 7₅O) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 1209 mg Carboxy-

20 peptidase B. Spezifische Aktivität 6,4 /uMole ■

hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

TABELLE 2

Wirkung des pH-Wertes des bei der Wärmebehandlung (60 C°, 20 Minuten) von homogenisiertem Schweinepankreas verwendeten Puffers auf die Aktivität von

Carboxypeptidase B

pH Gesamtaktivität Gesamtprotein Spezifische Aktivität

(Einheit/kg ' (mg/kg Pankreas) (Einheit/mg) Pankreas)

5,0 21348 1440 14,8'

5,5 25808 1268 ' 20,3

6,0 98333 . 1724 57,0

6,5 52767 ' 1204 43,8

7,0 _f 64882 1625 39,9

7,5 48400 2780 17,4

8,0 31632 2210 14,3

8,5 30753 4836 6,4

NJ CD CD CD

Seispiel 13

0,25 kg Schweinepankreas werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugaben von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 3^-0 g/l gesättigt (4-08 g) . Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert, der Niederschlag verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l

15 gesättigt. (4-1,1 g) . Die Suspension wird eine Nacht

stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4- C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert

20 und gefroren. Ausbeute 95 ^mS Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 56,2 liMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 14-

0,2 kg Schweinepankreas werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 200 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. -Tach Zugaben von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit

Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 330 g/l gesättigt £330 g). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert, der Niederschlag verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (44-,8 g). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird" in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 62 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 89,0 AiMoIe hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

15 Beispiel 1-5

0,25 kg Schweinepankreas werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. !lach Zugaben von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386 g). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert, der Niederschlag verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit. Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (65 g). Die Suspension wird sine Macht stehengelassen und zentrifugiert. Der niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7jO) gelöst und gegen destilliertes. Wasser salzfrei

- .25 -

dialysiert. Nach der- Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 106,5 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 95,5 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minure/mg Protein.

Beispiel 16

0,2 kg Schweinepankreas werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 200 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugaben von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis.zu einer Konzentration von 310 g/l gesättigt (JiO'g). Die Suspension wird eine Nacht "stehengelassen, zentrifugiert, der Niederschlag verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (57,2 g). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 135 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 44,3 /uMole hydrolysiertes Eippuryl-L- -Arginin/Minute/mg Protein.

30 Beispiel 17

0,25 kg Schweinepankreas werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raum-

temperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 25O ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugaben von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386,4- g) . Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert, der Niederschlag verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 360 g/l gesättigt (52 g). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4- C°) Tris-ECl-Puffer (pH 7,0)

15 gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei

dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 76 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 123,8. AiMoIe hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 18

0,25 kg Schweinepankreas werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 25O ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugaben von 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Anmoniuir.sulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (366,4- g). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert,

der Niederschlag verworfen'und die supernatierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 350 g/l gesättigt (39 g)· Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) Tris-HCl- ' -Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysierfe. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 4-5 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 286,7 ^uMcIe hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 19

0,25 kg Schweinepankreas werden an einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei·Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugaben von " 2 Vol. Teilen eiskaltem Wasser wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386,4 g). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert, der Niederschlag verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit

25. Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 340 g/l gesättigt (26 g). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4 C⁰) "Tris-HCl-Puffer (pH 7}0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute 25,5 mg Carboxypeptidase B. Spezifische Aktivität 195,8 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

TABELLE 3 Wirkung der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat auf die Aktivität von Carboxypeptidase B

Ammoniumsulfatkonzentration

(s/i)

1. Sättigung 2. Sättigung

Gesamtaktivität

(Einheit/kg
Pankreas)

Gesamtprotein

(mg/kg
Pankreas)

Spezifische Aktivität

(Einheit/mg)

340	370	21373	380	56,2
330	370	27670	310	89,0
320	370	40697	426	95,5 ^
310	370	29914	675	44,3 &
320	360	37629	304	123,8
320	350	51610	180	286,7
320	340	19977	102	195,8

CD CO CD

Beispiel 20

1 kg Rinderpankreas wird an einer Fleischmühle gemahlen und eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen wird 1 Liter eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben, worauf die Suspension auf 60 C⁰ erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen wird. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen (3,8 l) eiskaltem Wasser wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (1,6 kg). Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen, zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 350 g/l

15 (165 s) gesättigt. Die Suspension wird eine Nacht

stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+ 4- C°) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und mit destilliertem Wasser salzfrei dialysiert.' Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert. Es werden 4-06 mg -Natriumchlorid zugegeben und die Lösung wird gefroren. Ausbeute 238,7 mg Carboxypeptidäse B. Spezifische Aktivität : 15,4- /uNole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

25 Beispiel 21

1 g Akrilex C-IOO Xerogel (Carboxygehalt : 6,2 i 0,3 m-Aequiv./g) werden in 50 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7?O) suspendiert, wonach der Suspension auf einem eiskaltem Wasserbad unter ständigem Rühren eine Lösung von 2 g N-Cyclohexyl-N'- -/~2-(4-morpholinyl)-äthyl_7-carbodiimidmethyl-p-toluolsulfonat in 20 ml einer kalten (+4 C⁰) Pufferlösung

zugegeben wird. Nach 10-minutigem Rühren werden der Lösung 31 ml einer wässrigen Carboxypeptidase B Lösung zugefügt /"Konzentration : 16,4-5 mg/ml; spezifische Aktivität des Enzyms : 17 AiMoIe hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg Protein_7· Die Reaktionszeit ' beträgt 4-8 Stunden, während deren das Gemisch zweimal je 6 Stunden lang gerührt wird. Das Gel wird entfernt, dreimal mit je IOC ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0), dreimal mit je 100 einer 0,1 molaren, 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7jO) und dreimal mit je 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen. Das Gel wird schliesslic-h fünfmal mit je 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und liophylisiert.

Ausbeute 1,6 g. Aktivität : 630 uMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/g Trockensubstanz.

Beispiel 22

1 g Akrilex C-IOO Xerogel (Carboxygehalt : 6,2 6",2 i 0,3 m-Aequiv./g) werden in 50 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert, wonach der Suspension auf einem eiskaltem Wasserbad unter ständigem Rühren eine Lösung von 1 g N-Cyclohexyl-N'- -/~2-(4~morpholinyl)-äthyl_7-carbodiimidmethyl-p-toluolsulfonat in 20 ml einer kalten (+4 C⁰) Pufferlösung zugegeben wird. Nach 10-minutigem Rühren werden der Lösung 31 ml einer wässrigen Carboxypeptidase B Lösung zugefügt /"Konzentration : 16,4-5 mg/ml5 spezifische Aktivität des Enzyms : 17 /uMole hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg Protein_7· Die Reaktionszeit beträgt 4-8 Stunden, während deren das Gemisch zweimal je 6 Stunden lang gerührt wird. Das Gel wird entfernt,

dreimal mit je 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung- (pH 7,0), dreimal mit Je 100 einer 0,1 molaren, 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) und dreimal mit je 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffer (pH 7»O) gewaschen. Das Gel wird schliesslich fünfmal mit je 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und liophylisiert. Ausbeute 1,43 g. Aktivität : 690 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/g Trockensubstanz. 10

Beispiel 23

1 g Akrilex C-IOO Xerogel (Carboxygehalt : 6,2 - 0,3 m-Aequiv./g) werden in 50 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7jO) suspendiert, wonach

15 der Suspension auf einem eiskaltem Wasserbad unter

ständigem Rühren eine Lösung von 2 g N-Cyclohexyl-N'- -/~2-(4-morpholinyl)-äthyl_7-carbodiimicjiethyl-p-toluolsulfonat in 20 ml einer kalten (+4 C⁰) Pufferlösung zugegeben wird. Nach 10-minutigem Rühren werden der Lösung 15'j5 ml einer wässrigen Carboxypeptidase B Lösung zugefügt /"Konzentration : 16,4-5 mg/ml; spezifische Aktivität des Enzyms : 17 xiMole hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg Protein "J. Die Reaktionszeit beträgt 48 Stunden, während deren das Gemisch zweimal je 6 Stunden lang gerührt wird. Das Gel wird entfernt, dreimal mit je 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7jO), dreimal mit je 100 einer 0,1 molaren, 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7jO) und dreimal mit je 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7₅O) gewaschen. Das Gel wird schliesslich fünfmal mit je 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und liophylisiert. Ausbeute 1,6 g.

Aktivität : 880 AiMoIe hydrolysiertes Hippuryl-L- -Arginin/Minute/ g Trockensubstanz.

Beispiel 24-

5 Ig Akrilex C-IOO Xerogel (Carboxygehalt :

6,2 i 0,3 m-Aequiv./g) werden in 50 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert, wonach der Suspension auf einem eiskaltem Wasserbad unter ständigem Rühren eine Lösung von 2 g N-Cyclohexyl-N^}- -/~2-(4— morpholinyl)-äthyl_7-carbodiimidmethyl-p-toluolsulfonat in 20 ml einer kalten (+4- C⁰) Pufferlösung zugegeben wird. Nach 10-minutigem Rühren werden der Lösung 62 ml einer wässrigen Carboxypeptidase B Lösung zugefügt /"Konzentration : 16,4-5 mg/ml; -spezifische Aktivität des Enzyms : 17 AiMoIe hydrolysiertes Hippuryl- -L-Arginin/Minute/mg Protein^· Die Reaktionszeit beträgt 46 Stunden, während deren das Gemisch zweimal je 6 Stunden lang gerührt wird. Das Gel wird entfernt, dreimal mit je 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7₅O), dreimal mit je 100 einer. 0,1 molaren, 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7jO) und dreimal mit je 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7?0) gewaschen. Das Gel wird schliesslich fünfmal mit je 200 ml

25 destilliertem Wasser gewaschen und liophylisiert.

Ausbeute 1,55 g· Aktivität : 74-0 /uMole hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/ g- Trockensubstanz.

TABELLE 4 Immobilisierung von Carboxypeptidase B

Zusammensetzung des Aktivität Immobilisierte Innbhilisißrtes In gelöster Eorm Aktivität- Spezifische Reaktionsgemisches des Produktes Aktivität Protein zurückgewonnene verlust- Aktivität (Einheit/g *— Aktivität

^lxAC-lOO ^2xCMC

Xerogel)

Einheit % Einheit %

Einheit

(s)

(g) Cg)

Einheit

1	2	510	630
1	1	510	690
1	2	255	880
1	2	1020	740

11,6 313,7 61,5 207 2,4

11,4 328 64,3 285 3,3

32,5 102 40 73,3 1,7

6,6 65.5,6 64,3 371,9 2,1

7444,1 86 3,21 19,51

7387,8 85,3 3,00 18,23

2848,3 6^8 13ßO 83,89

15799,1 93,3 1,75 10,63

Ix = AC-IOO,' Akrilex 10O;¹

2x = CMC, N-Cyclohexyl-N'-/" 2-(4-morpholinyl)-äthyl_7-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat

3x = CPB, Carboxypeptidase B

4x "= Die spezifische Aktivität des gelösten Enzyms wird als 100 % betrachtet.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Isolierung von Carboxypeptidase B

aus der Bauchspeicheldrüse von Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, 'dass man ein Pankreashomogenisat herstellt und dieses autolysiert, das Autolysat mit einem Puffer von einem pH-Wert zwischen 5?0 und 8,5 - vorzugsweise zwischen 6,0 und 7₅O - in einem Verhältnis von 1:1 verdünnt und

bei einer Temperatur von 50-75 C⁰ - vorteilhaft 50-65 C⁰ 5-30 Minuten lang - vorzugsweise 15-25 Minuten lang einer Wärmebehandlung unterwirft, danach das so erhaltene Gemisch zentrifugiert oder filtriert, der überstehenden Flüssigkeit 200-320 g/l - vorzugsweise 3OO-32O g/1 -

15 Ammoniumsulfat zugibt, die erhaltene Suspension

gegebenenfalls zentrifugiert, die Fraktion, welche das aktive Carboxypeptidase B Enzym enthält, aus der erhaltenen Flüssigkeit durch Zugabe von 10-80 g/l - vorteilhaft 25-35 g/l - Ammoniumsulfat ausfällt, den Niederschlag zentrifugiert und das so erhaltene Enzym im Wasser oder in einer Pufferlösung löst und gegen Wasser oder eine Pufferlösung dialysiert und das erhaltene Produkt in gefrorenem Zustand lagert.

2. Verfahren zur Immobilisierung des nach

25 Anspruch 1 hergestellten Carboxypeptidase B,

dadurch gekennzeichnet, dass man ein, aus Acrylsäure und/oder Methacrylsäure bzw. Acrylamid und/oder Methacrylamid- hergestelltes, mindestens 0,1 m- Äquiv./g funktionelle Carboxygruppen enthaltendes polymeres Gel mit einer wasserlöslichen oder in organischen Lösungsmitteln bei einer Temperatur unter 0 C° löslichen Carbodiimid-Verbindung behandelt,

auf den so aktivierten Träger das Carboxypeptidase B Enzym aus einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von ^-j5-8j5 - vorteilhaft' 6,0-7,0 - aufbringt, und danach das so erhaltene immobilisierte Enzym wäscht und in wässriger Suspension bei 0-4 C⁰ lagert und gegebenenfalls trocknet.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass man den Träger, das Carbodiimid und das Enzym in einem Verhältnis von 1:1 - 2:0,25 - 1 - insbesondere 1:2:0,25 - verwendet.