DE1916723A1 - Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase - Google Patents

Description

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Dr.-!f-r·. - ·■;:.; ^.J-CMKE K 892 - S/H DlplAig. hdl :Z AGULAR 1. April 1969

fi München 80, Pitiiuenauerstr. 2 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan

Verfahren zur Reinigung von !-Asparaginase

Zusammenfassung

Das Verfahren zur Reinigung von aus Zellen erhaltener !-Asparaginase unter Beibehaltung der Enzymaktivität besteht darin, daß ein Extrakt der Zellen auf einen pH-Wert von 4,5 oder weniger eingestellt wird, wodurch unnötige Proteine denaturiert, coaguliert und daraus ausgefällt werden. Ein oben schwimmender Anteil des Extraktes wird dann an einem Ionenaustauscher adsorbiert und die L-Asparaginase daraus eluiert. Andererseits kann auch der pH-Wert des oben schwimmenden Mediums auf 8 oder mehr eingestellt werden, an Ionenaustauscher adsorbiert werden und die L-Asparaginase eluiert werden. Im pH-Bereich von 4,5 bis 8,0 begegnet man einem Verlust an Enzymaktivität.

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase, insbesondere ein Verfahren zur Reinigung eines hochaktiven L-Asparaginase-haltigen Enzympräparats. Im speziellen betrifft die Erfindung die Reinigung von L-Asparaginasepräparaten, die aus L-Asparaginase-erzeugenden Zellen erhalten werden, welche in einem geeigneten Nährmediun kultiviert worden sind.

L-Asparaginase, d.h. L-Asparaginase-Amidhydrolase (mit einer Enzymzahl von 3,5,1,1) ist ein Enzym, welches L-Asparagin zu

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einer Ir-Asparaginsäure und Ammoniak hydrolysiert. L-Asparaginase ist relativ weit verbreitet, sowohl im tierischen als auch im pflanzlichen Bereich, obgleich viele Einzelheiten ihrer Eigenschaften noch unbekannt sind.

In letzter Zeit erwies man Ir-Asparaginase viel Aufmerksamkeit, da festgestellt wurde, daß eine spezielle Art des Enzyms, das beispielsweise durch das Serum eines Meerschweinchens oder eines gewissen Stamms von Bscherichia coli erzeugt wird, Antitumorwirksamkeit besitzt und insbesondere eine hohe Aktivität gegenüber leukämisohen Zellen aufweist, die L-Asparagin erfordern.

Bisher war die Massenproduktion des Enzyms !/-Asparaginase, insbesondere in technisch ausreichendem Maßstab, um einem Massenverbrauch als Arzneimittel gerecht zu werden, äußerst schwierig aufgrund der Probleme, die sich mit der Schwierigkeit der Kultivierung entspre^ohender Mikroorganismenzellen in technischem Maßstab, die als Ausgangsmaterial verwendet werden müssen_fund aufgrund der Schwierigkeit der Erhaltung der Aktivität des Enzyms während des Reinigungsprozesses ergaben. Bs bestand daher ein Bedarf für eine Kassenkultur- und ReinigungsmethQde, die in industriellem Maßstab durchgeführt werden kann, um ein reines antileukämisch wirkendes L-Asparaginasepräparat von höherem wirtschaftlichen und praktischen Wert aus L-Asparaginase-erzeugenden Mikroorganismen herzustellen.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht daher in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginasepräparaten, welche die bisherigen Nachteile und Unzulänglichkeiten beseitigt.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase.

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ferner ist Aufgabe der Erfindung, L-Asparaginaseenzympräparate von hoher Reinheit in wirtschaftlicher Weise in induntriellem Maßstab herzustellen. Eine derartige Industrielle Produktion an L-Asparaginase ist offensichtlich von speziel ler· Bedeutung, da beispielsweise L-Asparaginase,die durch einen zum Genus Serratia gehörenden Mikroorganismus erzeugt wird, antileakämische Wirksamkeit besitzt.

weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Herstellung enzymatischer L-Asparaginasepräparate von hoher Reinheit.

Ls mag zunächst angenommen werden, daß die erfindungsgemäß in Betracht kommenden Arten an Ir-Aaparaginaseenzymen, beispielsweise L-Asparaginase aus zum Genus Serratia gehörenden Stämmen sowie Serum L-Asparaginase, das aus Meerschweinchen erhalten wird, offensichtlich leicht gereinigt werden, da sxe hinsichtlich ihrer enzymetischen Eigenschaften in einer präparativen Ausgangsstufe, wie z.B. ihrer pH-Wert- oder Warmestabilitat, in einem stabilen Zustand zu sein eoheinen. Bis heute war jedoch eine Massenproduktion dieser L-Aspara- £liiaseenzyme in industriellem Maßstab "blockiert, teilweise, weil ein vollkommen unerwarteter Verlust an enzymatischer Aktivität, d.h. der spezifischen Aktivität, auftritt, wenn ei-e Reinheit der L-Asparaginase erhöht wird.

kürzlich wurde ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen entwickelt, die zum Genus Serratia gehören, die eine höhere L-Asparaginasewirksamkeit als bisher bekannt war, aufwiesen (29.1.1969 PatentanmeldungP¹9 04 330,2 j_# Es wurde nun ein Verfahren zur Reinigung von Enzymen mit L-Asparaginaseaktivität aus Bakterien, die zum Genus Serratia und anderen gehören, entwickelt, um Präparate von hoher Reinheit herzustellen.

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BAD ORIGfNAL

Gemäß der Erfindung werden die obigen Aufgaben gelöst, wenn folgendes Verfahren durchgeführt wird. In einer ersten Stufe wird der größte Teil der unnötigen Proteine aus einer rohen Enzymlösung, die'aus Bakterienzellen durch Bruch oder Aufspaltung erhalten wurde, mittels Coagulation durch eine Säurebehandlung und Zentrifugalabtrennung des Sediments entfernt und anschließend die L-Asparaginase löslich gemacht. In einer zweiten Stufe wird der pH-Wert auf 4,5 oder darunter oder auf 8,0 oder höher gehalten, so daß das L-Asparaginaseenzym gereinigt werden kann. Dies muß hinsichtlich des speziellen pH-Bereichs, in dem die Aktivität der Enzyme gemäß der Erfindung stabil bleiben, erfolgen. Die Erfindung liefert somit ein Verfahren, nach dem !»-Asparaginase gereinigt werden kann, wobei ein Präparat hoher Reinheit und eine günstige Ausbeute erhalten wird. Vorzugsweise kann die Reinigungswirkung durch Zugabe von Natriumchlorid, Glycerin, Albumin, L-Asparagin und dgl. als Enzymstabilisator weiter erhöht werden. Die Erfindung ist somit durch die Kombination dieser Methoden zur Reinigung einer hoch reinen L-Asparaginasβ mit hoher spezifischer Aktivität gekennzeichnet, wobei ein für pharmazeutische Zwecke anwendbares. Produkt erhalten wird.

Alis Ausgangematerial gemäß der Erfindung verwendbare Bakterienzellen werden durch deren Züchtung entweder durch eine bekannte Plattenkulturmethode oder durch eine Submerskultur erhalten ( 29.U1969 Patentanmeldung P19 04 330.2 ), Die Zellen werden dann durch Zentrifugalabtrennung oder andere geeignete Mittel gesammelt. Die so erhaltenen Zellen werden dann mit einer kleinen Menge Pufferlösung suspendiert, und anschließend wird die L-Aeparaginase durch Bearbeitung in einem Homogenisator, durch Mahlen, Zerstören mit Ultraschallwellen, Behandlung mit Lysozym,durch Autolyse oder durch andere Methoden leicht löslich gemacht. Danach wird

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die gewünschte L-Asparaginase vom Zellsediment durch Zentrifugieren abgetrennt« Die in diesem Vorstadium erhaltene rohe Enzymflüssigkeit ist gegenüber pH-Wert und Wärme relativ stabil. Jedoch enthält die rohe Enzymflüssigkeit eine große Menge Proteinverunreinigungen und Pigmente. Um diese Verunreinigungen zu entfernen, wird die flüssigkeit auf einen pH-Wert von 3,5 bis 4,5 eingestellt. Durch diese Einstellung des pH-Wertes werden die meisten Pigmente und unnötigen Proteine denaturiert, coaguliert und ausgefällt. Der auf diese Weise gebildete Niederschlag wird leicht durch Zentrifugalabtrennung oder andere Methoden entfernt. Andererseits wird in der oben schwimmenden flüssigkeit eine L-Asparaginaseaktivität beibehalten, ohne diese Aktivität in dem oben angegebenen pH-Bereich zu verlieren. Daher kann die Enzymreinheit um das 10- bis 20-fache hinsichtlich der spezifischen Wirksamkeit nach der Reinigung gesteigert werden.

Anschließend wird die oben schwimmende Flüssigkeit durch ein Ionenaustauschharz oder eine lonenaustauschercellulose so wie sie ist, nachdem sie verdünnt wurde oder nachdem sie zur entsprechenden Einstellung der lonenstärke der Dialyse unterworfen worden war, adsorbiert. Dann wird das adsorbierte Material eluiert, gereinigt und kondensiert. L-Asparaginase kann auch durch Zugabe von Ammoniomsulfat, Natriumsulfat, Aceton, Methanol und dgl. unlöslich gemacht werden. Danach wird der so gebildete Niederschlag gesammelt, gelöst und kondensiert.

Das teilweise gereinigte Präparat, das gemäß dem oben beschriebenen Säuredenaturierungsprosess erhalten wird, ist im Vergleich zu der Ir-Asparaginaae in der vorstehend beschriebenen rohen Extraktionsflüssigkeit instabil* Sine Erscheinung wird häufig beobachtet»bei der das teilweise gereinigte Präparat rasch sein· Aktivität, selbst bei einer niedrigen !Temperatur von 5 ⁰C oder geringer, verliert. Es

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wurde festgestellt, daß das teilweise gereinigte Enzympräparat äußerst instabil in einem pH-Bereich von 4,5 bis 8,0 iat. Es wurde gefunden, daß es notwendig ist, den pH-Wert einer behandelten flüssigkeit innerhalb eines Bereichs von entweder 3,0 bis 4,5 oder-8,0 bis 11,0 au halten und daß durch diese pH-Wert-Einstellung eine Inaktivierung der vorliegenden Enzyme in wirksamer Weise verhindert werden kann. Es ist dann möglich, die Reinheit des Präparats in weiteren Stufen, wie gewünscht, zu erhöhen.

Der oben erwähnte plätzliche Aktivitätaverlust kann aua einer Wertung der Tabelle entnommen werden, die bei einem pH-Wert von 7»0 durchgeführte Versuche wiedergibt. Bei diesen Versuchen wurde versucht, mittels Elektrodialyse Ammoniums ulf at aus Niederschlägen, die aus einer durch Säuredenaturierung erhaltenen oben schwimmenden flüssigkeit durch Zugabe von Ammoniumaulfat ausgesalzen wurden, zu entfernen. Das in der Tabelle wiedergegebene Ergebnis der Versuche vergleicht die Änderung der Aktivität mit der Entsalzungsgeschwindigkeit von Ammoniumsulfat in drei verschiedenen pH-Wert-Stufen ι 4,0, 7,0 bzw. 9,0 bei einer gleichmässlgen Temperatur von 5 *€· Wie oben erwähnt, ergibt sich ein scharfer Aktiv!tätsverluat bei einem pH-Wert von 7,0 während des Entsalzungsverfahrens unter Anwendung der Elektrodialyse. Des Ergebnis seigt, daß es wesentlich ist, eine Elektrodialyse und ähnliche Maßnahmen innerhalb eines pH-Bereichs von entweder 3_fO bis 4,5 oder 8,0 bis 11,0 durchzuführen.

^BAD

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Tabelle

pH-Wert der elek- "^^^^ trodialysierten ^"^^^FIüb s igkei t	4,	0	7,	0	9,	0
Dauer der "->^^ Elektrodialys e"""***. (Minuten ) ^""^--s.^	Aktivi tät	Ammonium— sulfat	Akti vi tät	AlIIIMt- nium— sul fat	Akti vi tät	jfanno- nium— sul fat
0	100	100	100	100	100	100
30	98	54	99	62	102	60
60	88	5,4	90	30	81	21
90	102	0,3	100	2,1	110	4,1
120	117	0,06	2	0,05	110	0,06

Die Zahlen sind in i» angegeben.

Bei einer Adsorptionsmethode wird L-Asparaginaae äußerst günstig durch Carboxymethylcellalose adsorbiert, wenn eine oben schwimmende Flüssigkeit einer durch Säure denaturierten flüssigkeit einer Adsorptionsbehandlung bei pH- 4,0 unterworfen wira. Auch bei einem pH-Wert von 9,0 wird die oben eafetrifimende Flüssigkeit gleich günstig von einer Diöthylamlnoätbylceilulose adsorbiert. Sie so adsorbierte Eneyawirksamkeit kann durch Eluierung unter Verwendung eines anorganischen Salze.-=, wie z.B. Natriumchlorid oder durch eine Änderung dee pH-Wertes entfernt werden. Um einen Terlust an Enzymaktivität zu vermeiden, ist es notwendig, den pH-Wert innerhalb des BereJ hs von 3,0 bis 4,5 oder 8,0 bis 11,0 zu halten, ähnlich wi< in Verbindung mit dem Elektrodialysevorgang angegeben wurde« ferner erwies es sich als sehr wirksam, als Stabilisator für die vorliegenden Enzyme eine geringe Menge L-Asparagin oder Glycerin, Albumin oder eine ziemlich hohe Konzentration an Natriumchlorid zuzusetzen. Durch Kombination der vorstehenden Maßnahmen wurde es nun ermöglicht, die Reinheit der vorliegenden Enzyme um das 100- bis 1500-fache derjenigen der

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BAD ORIGINAL

Enzyme im in-vivo-Zustand, wie sie in den Zellen enthalten sind, zu steigern.

• Die folgenden Beispiele dienen aur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu begrenzen. Die L-Asparaginase-Wirksamkeit

. wird in Einheiten gemessen, wobei eine Einheit eine Enzymaktivität angibt, die 1 /U Mol !-Asparagin pro Minute abbaut*

Beispiel 1

100 g durch Kultivierung von Serratia marcescens A(ECC 60 in einem flüssigen Nährkulturmedium unter aeroben Bedingungen unter Schütteln erhaltene Zellen wurden in 150 ml

^ 0,01 m Tris-HCl /iris(hydroxymethyl)aminomethan und Chlorwasserst off säure 7 Pufferlösung von pH 8,5 suspendiert. Die Suspension wurde mit einem 10 Kc Ultraschallgenerator behandelt, wodurch eine rohe Enzymextraktflüssigkeit erhalten wurde. Die Ii-Asparaginaseaktivität der rohen Enzymflüssigkeit betrug 0,1 Einheiten pro 1 mg Protein. Die Extraktflüssigkeit wurde mit einer Chlorwasserstoffsäurelösung langsam auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt. Unmittelbar danach wurde der Flüssigkeitsextrakt der Zentrifugalabtrennung unterworfen, wobei der Hauptteil der zerstörten Pilzzellen und der coagulierten Ausfällungen entfernt wurden. Die Aktivitätsreinheit der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde im Vergleich zu dem rohen Enzymextrakt

w um das 12-fache gesteigert. Die Aktivitätsausbeute lag bei 80 #.

Beispiel 2

Eine überstehende Flüssigkeit mit einem pH-Wert von 3»5* die gemäß Beispiel 1 erhalten worden war₉ wurde mit einer wäßrigen iTatriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt. Danach wurden 0,01 Gew.-# Ochsenblutalbumin zugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde viermal mit Wasser verdünnt. Unmittelbar danach wurde aktive Ir-Asparaginas©

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an Carboxymethylcellulose adsorbiert, wobei die Cellulose ,-vorher auf einen pH-Wert von 4,0 gepuffert worden war. Die L-Asparaginase wurde mit einer Pufferlösung von pH 4,0, die 0,25 Mol pro 1 Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die spezifische Aktivität der in dem Eluat enthaltenen L-Aaparaginase lag zweiundsiebzigmal höher als die des in Beispiel 1 beschriebenen rohen Enzymextrakts.

Die auf diese Weise erhaltene gereinigte enzymetische Flüssigkeit wurde durch Elektrodialyse entsalzt, wobei der pH-Wert bei 4,0 gehalten wurde. Dann wurde eine äußerst geringe Menge an Glycerin zugesetzt. Anschließend wurde der pH-Wert der gereinigten Enzymflüssigkeit rasch auf 9,0 geändert j und die Adsorption wurde mit Diäthylaminoäthyl (DEAE)-oellulose durchgeführt. Die Eluierung erfolgte dann durch langsames Steigern der Konzentration einer Natriumchloridlösung, wobei der pH-Wert bei 9,0 gehalten wurde. Die so erhaltene Enzymflüssigkeit, die ein Beispiel für die vorliegende Erfindung darstellt, wurde dann gefriergetrocknet· Die Reinheit des erhaltenen Präparats war 1300mal höher als die der rohen Extraktflüssigkeit, die aus den Zellen nach Beispiel 1 erhalten wurde.

Beispiel 5

Eine zu 90 # gesättigte Ammoniums,ulfatlösung wurde zu einer überstehenden Flüssigkeit mit einem pH-Wert von 3,5_r die gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, zugesetzt. Dadurch wurde ein Niederschlag ausgesalzen. Der Niederschlag wurde gewonnen und gelöst. Die erhaltene Lösung wurde unter Beibehaltung ihres pH-Werta von 9»0 der Dialyse in einer 0.01 m Tris-Pufferlösung von pH 9,0 in einem Celluloserohr unterworfen, wobei das Rohr in seiner äußeren flüssigkeit eine geringe Menge Glycerin enthielt. Während des Bialyseyorganga wurde die L-Asparaginaseaktivität praktisch quantitativ er-

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halten« Nach der Dialyse wurde die erhaltene Flüssigkeit mittels DEAE-cellulose ohne weitere Behandlung adsorbiert und mit einer 0,01 m iris-Pufferlösung vom pH-Wert 9,0 eluiert, wobei die Pufferlösung Natriumchlorid enthielt. Die Enzymreinheit der erhaltenen eluierten Flüssigkeit war 660bb1 höher als die des nach Beispiel 1 erhaltenen rohen Zellextraktes.

Selbstverständlich kann die vorstehend beschriebene Erfindung in vielfacher Weise variiert werden und auch zur Reinigung TOn !-Asparaginase aus Bakterienzellen anderer Mikroorganismen, wie beispielsweise Escherichia coil, Erwinia aroideae und Brwinia oarotovora, angewandt werden. Derartige Abwandlungen liegen im Rahmen der Erfindung.

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Claims (15)

Pa t entans prüche

1. Verfahren 3ur Reinigung von L-Asparaginase aus einem rohen Extrakt, der aus Zellen hergestellt wurde, die durch Kultivierung eines 1-Asparaginase-erzeugenden Mikroorganismus in einem Hährraedium erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Extraktes auf 4,5 oder weniger eingestellt wird und die in der Extraktflüssigkeit vorliegenden verunreinigenden Proteine denaturiert und ausgefällt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein überstehender Teil des säurebehandelten Extraktes mit einem Ionenaustauscher adsorbiert und die !«-Asparaginase daraus eluiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert eines überstehenden Teils des säurebehandelten Extraktes auf 8,0 oder höher eingestellt wird, das erhaltene überstehende Medium mit einem Ionenaustaueoher adsorbiert wird und die L-Asparaginase daraus eluiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennseichnet, daß ein oben schwimmender Teil des säurebehandelten Extraktes mit einem ersten Ionenaustauscher adsorbiert und eluiart wird, wobei der pH-Wert des Eluats auf 8,0 oder höher eingestellt wird, das erhaltene Eluat mit einem zweiten Ionenaustauscher adsorbiert wird und dann die !«-Asparaginase daraus eluiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ionenaustauscher Carboxymethylcellulose verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet_f daß als Ionenaustauscher Diäthylaminoäthylcellulose verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4? dadurch gekennzeichnet, daß als erster Ionenaustauscher Carboxymethylcellulose und als zweiter Ionenaustauscher Diäthylaminoäthylcellulose verwendet wird. 9 0 9 8 A 5 / 1 A 2 7

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'

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet', daß der Mikroorganismus zum Genus Serratia gehört.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Extraktes auf 3»5 his 4,5 eLngesteilt wird.

10· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Eluierungssubstanz Natriumchloridlösung verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzymstabilisator bestehend aus L-Asparagin, Glycerin, Albumin oder Natriumchlorid zu dem oben schwimmenden Medium zugesetzt wird.

12. Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase aus einem rohen Extrakt, der aus Zellen hergestellt wurde, die durch Kultivierung eines L-Asparaginase-erzeugenden zu Serratia marcescens gehörenden Mikroorganismus in einem Na>hrmedium erhalten wurde , dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Extraktes auf 3_t5 bis 4»5 eingestellt wird und die in dem Extrakt vorliegenden Proteinverunreinigungen denaturiert und ausgefällt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzymstabilisator, bestehend aus L-Asparagin, Glycerin, Albumin oder Natriumchlorid zu einem oben schwimmenden Teil der Extraktflüssigkeit zugesetzt wird, das oben schwimmende Medium an Carboxymethylcellulose adsorbiert wird und die L-Asparaginase daraus eluiert wird, wobei der pH-Wert des oben schwimmenden Mediums bei 3,0 bis 4,5 gehalten wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltene Bnzymlösung bei einem pH-Wert von 3,0 bis

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4j5 elektrodialysiert wird, der pH-Wert der Flüssigkeit auf 8,0 bis 11,0 eingestellt wird, die Flüssigkeit an Diäthylaminoäthylcellulose adsorbiert wird und die Ir-Asparaginase daraus eluiert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das oben schwimmende Medium des behandelten Extraktes bei einem pH-Wert von 8,0 bis 11,0 dialysiert wird, das oben schwimmende Medium an Diäthylaminoäthylcellulose adsorbiert wird und L-Asparaginase daraus eluiert wird.

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