NO171344B - Fremgangsmaate for fremstilling av farmasoeytiske preparater inneholdende vevsplasminogenaktivator - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater inneholdende vevsplasminogenaktivator.

Det antas at det er en dynamisk likevekt mellom det enzymsystem som kan danne klumper av levret blod - koagulering-systemet - og det enzymsystem som kan oppløse klumper av levret blod - det fibrinolytiske system - som opprettholder et intakt patentvaskulært sjikt. For å begrense tap av blod fra skade, dannes levret blod i de skadede blodkarene. Etter naturlig reparasjon av skaden oppløses overflødig levret blod gjennom innvirkning av det fibrinolytiske systemet. Av og til dannes levret blod uten sårskade og kan sette seg fast i blodkar, hvilket resulterer i en delvis eller endog total obstruksjon av blodstrømmen. Når dette forekommer i hjerte, lunge eller hjerne, kan resultatet være et myokardialt infarkt, pulmonar embolisme eller slag. Disse tilstander kombinert er den største årsaken til morbiditet og dødelighet i de industrialiserte nasjoner.

Klumper av levret blod består av et fibrøst nettverk som kan oppløses av det proteolytiske enzymet plasmin. Enzymet oppnås fra det inaktive proenzymplasminogen, en komponent i blodplasma, ved innvirkning av en plasminogen-aktivator. Det forekommer to immunologisk forskjellige pattedyr-plasminogen-aktivatorer. Intrinsik plasminogen-aktivator, også kjent som urokinase, er et enzym produsert av nyren, og kan isoleres fra urin. Den kan også fremstilles fra en rekke vevskultur-kilder. Ekstrinsik plasminogen-aktivator, også kjent som vaskulærplasminogen-aktivator og som vevsplasminogenaktivator (t-PA), kan isoleres fra mange vev-homogenater (spesielt human-uterus), den vaskulære cellevegg og fra noen celle-kulturer. I tillegg til disse to typer plasminogen-aktivator forekommer også et bakterieprodukt, streptokinase, fremstilt fra p<->hemolytiske streptokokker. En hovedulempe med både urokinase og streptokinase er at de er aktive gjennom hele kretsløpet og ikke bare ved stedet for en blodlevring. De kan f.eks. ødelegge andre blodproteiner slik som fibrinogen, protrombin, faktor V og faktor VIII og dermed redusere blodlevringsevnen og øke risikoen for blødning. I motsetning til dette er den biologiske aktiviteten til t-PA avhengig av tilstedeværelsen av fibrin hvortil den bindes, og hvor den aktiveres. Maksimum aktivitet utvikles således bare på stedet for en klump av levret blod, dvs. i nærvær av fibrin-nettverket som skal oppløses, og dette sørger i stor grad for at risikoen for blødning unngås.

Hovedveien for administrasjon av t-PA er ved intravaskulær infusjon, hvilket således nødvendiggjør preparatet av t-PA som en parenteral oppløsning. Det er vanligvis ønskelig at en parenteral oppløsning inneholder en høy konsentrasjon av legemiddel. Dette er fordi legen eller veterinæren da kan oppnå den nødvendige konsentrasjon i en gitt situasjon ganske enkelt ved fortynning av oppløsningen med ytterligere oppløsningsmiddel eller medium. I tillegg er det ikke tilrådelig å administrere en stor volumoppløsning til en pasient med en hjerte- eller nyreforstyrrelse, fordi dette ville sette hjertet eller nyrene under enda større belast-ning. Volumet bør derfor holdes ved et minimum ved anvendelse av et mer konsentrert preparat. Samtidig bør en slik parenteral oppløsning være stabil i den forstand at det ikke er noen tilbøyelighet for legemiddelet til å utfelles av oppløsningen enten ved lagring eller under en fortynnings-operasjon.

En rekke parenterale oppløsninger av t-PA har blitt beskrevet generelt i EP-A-41.766, EP-A-93.619, EP-A-121.122, EP-A-113.319, EP-A-123.304, JP-patentpublikasjon 57-120523 (søknad 56-6936) og JP-patentpublikasjon 58-65218 (søknad 56-163.145). Preparatene er vandige, saltholdige oppløsninger av t-PA hvori pH-verdien er omkring nøytral, og de er forbundet med den ulempe at oppløseligheten av t-PA i slike oppløsninger er lav i fravær av en økning i den ioniske konsentrasjon. Følgelig inneholder preparatene enten lave konsentrasjoner t-PA, hvilket i noen situasjoner nødvendig-gjør administrasjon av uønsket store oppløsningsvolumer til en pasient, eller de er hypertoniske, hvilket ved administrasjon kan være skadelig for røde blodceller.

Det er nå funnet at oppløseligheten av t-PA i en vandig parenteral oppløsning kan forbedres dersom oppløsningens pH-verdi befinner seg i et surt område, og at surheten for en slik oppløsning, ved administrasjon, ikke representerer noen betydelig fysiologiske problemer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en parenteral oppløsning av t-PA, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved

(i) tilveiebringelse av en renset oppløsning av t-PA og utveksling av mediet med et vandig medium som har en pH-verdi fra 2 til 5; eller (ii) oppløsning av t-PA i et vandig medium som har en pH- verdi fra 2 til 5; sterilisering av den resulterende oppløsning, som eventuelt (a) innbefatter et fysiologisk akseptabelt middel som gjør oppløsningen vesentlig isotonisk med human-blodserum,

(b) innbefatter et overflateaktivt middel,

(c) er vesentlig ubufret, og

(d) er vesentlig fri for lysin eller ornitin, eller et salt derav.

Som et resultat av den forbedrede oppløseligheten av t-PA kan den fremstilte parenterale oppløsning oppnå høye konsentrasjoner av t-PA uten noen vesentlig risiko for at t-PA-materialet utfelles fra oppløsning. I tillegg er det funnet at konsentrasjonen av t-PA i en slik oppløsning lett kan reduseres ved fortynning med vann av nøytral eller sur pH-verdi igjen uten noen vesentlig risiko for at t-PA-materialet utfelles. Ved foreliggende fremgangsmåte oppnås derfor en stabil, parenteral oppløsning som tillater større fleksibili-tet ved dens håndtering og bruk av leger og veterinærer.

t-PA-materialet for bruk i foreliggende oppfinnelse kan være et hvilket som helst bioaktivt protein som vesentlig tilsvarer pattedyr- og spesielt human-t-PA, og innbefatter former med og uten glykosylering. Det kan være en- eller tokjedet-PA, eller en blanding derav, som beskrevet i EP-A-112.122, og har, i tilfelle for fullstendig glykosylert human-t-PA, en tilsynelatende molekylvekt på polyakrylamid-geler på ca. 70.000 og et isoelektrisk punkt mellom 7,5 og 8,0. t-PA-materialet har fortrinnsvis en spesifikk aktivitet på ca. 500.000 ITJ/mg (internasjonale enheter/mg, hvor den internasjonale enheten er en enhet for aktivitet som definert av WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hamstead, London, NW3 6RB, U.K.).

Aminosyresekvensen for t-PA tilsvarer fortrinnsvis vesentlig den som er angitt i fig. 1. Sekvensen er således identisk med den i fig. 1, eller inneholder en eller flere aminosyre-utelatelser, substitusjoner, innskudd, inversjoner eller addisjoner, av allelisk opprinnelse, eller den resulterende sekvens har ellers minst 80 % og fortrinnsvis 90 # homologi med sekvensen i fig. 1, og bibeholder vesentlig de samme biologiske og immunologiske egenskaper til proteinet. t-PA-sekvensen er spesielt identisk med den i fig.l, eller har den samme sekvensen, men hvor aminosyren i stilling 245 fra serin N-terminusen er valin istedenfor metionin, idet hver sekvens eventuelt er uten noen av de første tre aminosyrene eller eventuelt har en ytterligere polypeptid N-terminal-presekvens av Gly-Ala-Arg.

Aminosyreekvensen angitt i fig.l har 35 cysteinrester og har således potensiale for dannelse av 17 disulfidbroer. Basert på analogi med andre proteiner hvis struktur har blitt bestemt mer detaljert, er den postulerte struktur for sekvensen (som skriver seg fra disulfid-bindingsdannelse) mellom aminosyren i stilling 90 og prolin C-terminusen, angitt i fig. 2. Strukturen for det N-terminale området er mindre sikkert, skjønt noen forslag har vært fremsatt (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; og Proe. Nati. Acad. Sei.,1984, 81, 5355-5359). De viktigste trekkene i strukturen for t-PA er de to kringleområdene (mellom aminosyrene 92 og 173 og mellom aminosyrene 180 og 261), hvilke er ansvarlige for bindingen av proteinet til fibrin, og serin-proteaseområdet som omfatter størstedelen av B-kjeden og som er anvarlig for aktiveringen av plasminogen. Aminosyrene av spesiell betydning i serin-proteaser er den katalytiske triaden His/Asp/Ser. I t-PA forekommer disse ved stillingene 322, 371 og 463. Disulfidbroen mellom cystein-aminosyrerestene 264 og 395 er også viktig siden den holder sammen A-og B-kjedene i den tokjedede formen for t-PA.

I figurene 1 og 2 har de konvensjonelle koder med en bokstav og tre bokstaver blitt benyttet for aminosyrerestene som følger:

t-PA-materialet kan oppnås ved hvilken som helst av de metoder som er beskrevet eller kjente innen teknikken. F.eks. kan den oppnås fra en normal eller neoplastisk cellelinje av den type som er beskrevet i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-A-41.766 eller EP-A-113.319. Det er imidlertid foretrukket at t-PA-materialet oppnås fra en dyrket transformert eller transfisert cellelinje oppnådd ved bruk av rekombinant DNA-teknologi som beskrevet f.eks. i EP-A-93.619; EP-A-117.059 eller EP-A-117.060. Det er særlig foretrukket at eggstokkceller fra kinesisk hamster (CHO) anvendes for fremstilling av t-PA og er oppnådd på den måten som er beskrevet i Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759. På denne måten blir det klonede genet ko-transfisert med genet som koder dihydrofolat-reduktase (dhfr) inn i dhfr"CHO-celler. Transformanter som uttrykker dhfr, velges på media som mangler nukleosider og eksponeres for økende konsentrasjoner av metotrexat. dhfr- og t-PA-genene blir således ko-amplifisert, hvilket leder til en stabil cellelinje som kan uttrykke høye nivåer av t-PA.

t-PA materialet blir fortrinnsvis renset ved bruk av en hvilken som helst av de metoder som er beskrevet eller kjent innen teknikken, slik som metodene beskrevet i Biochimia et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 256(13), 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41.766; EP-A-113.319 eller GB-A-2.122.219.

Det synes ikke å være noen øvre grense for oppløseligheten for t-PA i den parenterale oppløsning. Ved meget høye konsentrasjoner, slik som større enn 150.000.000 IU/ml (internasjonale enheter/ml), blir oppløsningen bare viskøs uten noen betydelig utfelling av t-PA-materialet. Konsentrasjonen av t-PA-materialet i den parenterale oppløsning kan derfor variere innen vide grenser, f.eks. fra 50.000 til 50.000.000IU/ml. For å sikre den maksimale fordel fra foreliggende oppfinnelse er det foretrukket at konsentrasjonen av t-PA er større enn 100.000 ITJ/ml, mer spesielt større enn 500.000 IU/ml og mest spesielt større enn 1.000.000 IU/ml. Det er meget foretrukket at konsentrasjonen av t-PA er ca. 5.000.000 IU/ml.

Den øvre grense for pH-verdien til den parenterale oppløs-ningen er fortrinnsvis 4,5. pE-verdien er fortrinnsvis faktisk i området 2,5-4,0, mer foretrukket i området 2,8-3,5, og mest foretrukket ca. 3,0. Den ønskede pH-verdien for den parenterale oppløsning oppnås hensiktsmessig ved bruk av en fysiologisk akseptabel uorganisk eller organisk syre. Eksempler på en slik syre omfatter saltsyre, svovelsyre og salpetersyre, og sitronsyre, vinsyre og benzensulfonsyre. Av disse eksempler er saltsyre foretrukket.

Selv om et eller annet fysiologisk akseptabelt ko-opp-løsningsmiddel eventuelt kan være til stede i tillegg til vann, er det foretrukket at mediet for den parenterale oppløsningen fullstendig eller vesentlig er vandig.

Den parenterale oppløsningen kan være hypertonisk, hypotonisk eller isotonisk med pasientens blodserum. For å unngå uønskede bivirkninger er imidlertid den parenterale oppløs-ningen fortrinnsvis isotonisk, selv om mindre avvik ikke er av stor fysiologisk betydning. En vesentlig isotonisk parenteral oppløsning kan oppnås ved innbefatning av et fysiologisk akseptabelt middel som kan heve oppløsningens tonisitet til det nødvendige nivå. Eksempler på et slikt middel er velkjent innen teknikken og omfatter dekstrose (i vannfri eller monohydratform) og natriumklorid og blandinger derav. Konsentrasjonen av middelet i den parenterale oppløsningen vil naturligvis variere fra middel til middel. I tilfellet for natriumklorid er konsentrasjonen fortrinnsvis fra 7 til 10 mg/ml, og mest foretrukket ca. 8,5 mg/ml, hvor konsentrasjonen ofte betegnes som fysiologisk saltholdig oppløsning eller bare fysiologisk saltoppløsning. I tilfellet for vannfri dekstrose er konsentrasjonen fortrinnsvis 30-70 mg/ml og mest foretrukket ca. 50 mg/ml. I det tilfelle konsentrasjonen av t-PA i en vesentlig isotonisk parenteral oppløsning må reduseres, er det foretrukket å utføre fortynningen med en vandig oppløsning av det samme middelet ved den samme konsentrasjonen for derved å opprettholde en vesentlig isotonisk oppløsning.

Den parenterale oppløsningen kan eventuelt inneholde additiver som normalt er forbundet med preparater av denne typen. Eksempler er humanserumalbumin. I tillegg har t-PA en tilbøyelighet til å adsorberes til glass- og plastflater, og det kan derfor være ønskelig å innbefatte et overflateaktivt middel i den parenterale oppløsningen for å hindre eller minimalisere en slik adsorpsjon. Eksempler på et slikt middel er polyoksyetylenderivater av fettsyrepartialestere av sorbitolanhydrider slik som det som markedsføres under varebetegnelsen "Tween 80".

En av de overraskende fordeler med foreliggende oppfinnelse, bortsett fra den vesentlig forøkede oppløseligheten av t-PA, er at bruken av en sur, parenteral oppløsning med en pE-verdi innen de heri definerte grenser, ikke synes å representere noen betydelige uheldige fysiologiske effekter ved administrasjon til pasienten. Det synes som blodstrømmen generelt er i stand til å heve oppløsningens pE-verdi til nøytral nesten så snart kontakt foreligger, idet t-PA-materialet hurtig fordeles i blodstrømmen. Det er imidlertid foretrukket at denne prosess ikke vesentlig hemmes på noen måte, og at den parenterale oppløsningen ikke inneholder et sterkt buffermiddel. Et svakt buffermiddel som ikke i vesentlig grad hemmer denne prosessen, kan imidlertid innbefattes, og ved sur pH virker i virkeligheten t-PA-materialet selv som sitt eget svake buffermiddel. I tillegg kan humanserumalbumin virke som svakt buffermiddel.

P.g.a. den vesentlige forøkede oppløselighet av t-PA i den fremstilte parenterale oppløsning, er det intet behov for å inkludere noe ytterligere materiale slik som lysin eller ornitin eller et salt derav, for å forøke oppløseligheten av t-PA.

Rensingen av t-PA kan innebære som sluttlig trinn eluering av proteinet fra en kromatografisk kolonne som en oppløsning inneholdende et sterkt buffermiddel. Som nevnt tidligere er det foretrukket at den parenterale oppløsningen ikke inneholder et sterkt buffermiddel, og derfor er en hensiktsmessig metode for å bevirke dets fjerning mens mediet utveksles, anvendelse av dialyse. Dette kan utføres ved bruk av dialyserør eller en kunstig nyre hvori den rensede oppløsning dialyseres mot et vandig medium, hvori pH-verdien er fra 2 til 5. Det kan være ønskelig, spesielt dersom konsentrasjonen av t-PA i den rensede oppløsning er høy, først å justere oppløsningens pH slik at den er fra 2 til 5. En annen metode for å bevirke fjerning av et sterkt buffermiddel mens mediet utveksles, er å utsette den rensede oppløsning for gelfiltrering og å utvikle kolonnen med et vandig medium hvori pH-verdien er fra 2 til 5.

t-PA i form av et utfelt fast stoff kan fortrinnsvis oppnås fra en renset oppløsning ved å justere pH-verdien til ca. 5,5, avkjøle oppløsningen til like over dens frysepunkt, og utvinne proteinet ved f.eks. sentrifugering. Det utfelte faste stoffet kan deretter oppløses i et vandig medium som har en pE-verdi fra 2 til 5 på konvensjonell måte.

Steriliseringen av den resulterende oppløsning kan utføres konvensjonelt, f.eks. ved filtersterilisering.

Den parenterale oppløsningen presenteres normalt i for-seglede, sterile beholdere av plast eller glass. Den kan således presenteres i enhetsdoseringsformer slik som ampuller, små flasker eller engangs-injeksjonsanordninger, eller i flerdoseringsformer slik som infusjonsposer eller

—flasker. Volumet av oppløsningen som skal presenteres i

slike beholdere kan variere meget, men er hensiktsmessig fra 0,5 til 20 ml.

For å stabilisere t-PA-materialet blir den parenterale oppløsningen fortrinnsvis frosset og holdt ved fra -10 til -30°C.

Den biologiske aktiviteten til t-PA med henblikk på oppløs-ning av fibrin-nettverket i klumper av levret blod, har ledet til dens nyttevirkning i behandling av trombotiske for-styrrelser (The Lancet, 7. november 1981, 1018-1020; ibid., 13. april 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984 310(10), 609-613; ogibid., 1985, 312(14), 932-936). Ved behandling av en trombotisk forstyrrelse i pattedyr foretas administrasjon til pattedyret av en vandig parenteral oppløsning av t-PA, som definert heri.

Spesielle eksempler på en trombotisk forstyrrelse er kjent innen teknikken, men innbefatter myokardialt infarkt, dypåretrombose, pulmonar embolisme og slag.

Hovedveien for administrasjon av den parenterale oppløsning er ved intravaskulær, spesielt intravenøs, infusjon, selv om andre administrasjonsveier slik som intramuskulær administrasjon, kan benyttes, Intravaskulære infusjoner utføres normalt med den parenterale oppløsning inneholdt i en infusjonspose eller —flaske eller i en elektrisk drevet infusjonssprøyte. Oppløsningen kan leveres fra infusjons-bagen eller -flasken til pasienten ved gravitasjonstilførsel eller ved bruk av en infusjonspumpe. Bruken av infusjons-systemer basert på gravitasjonstilførsel gir ikke tilstrekkelig kontroll over aministrasjonshastigheten av den parenterale oppløsning, og derfor er bruken av en infusjonspumpe særlig foretrukket med oppløsninger inneholdende relativt høye konsentrasjoner av t-PA. Mer foretrukket er imidlertid bruken av en elektrisk drevet infusjonsprøyte som gir enda større kontroll over administrasjonshastigheten.

En effektiv mengde t-PA for behandling av et pattedyr med en trombotisk forstyrrelse vil naturligvis avhenge av en rekke faktorer inkludert f.eks. alderen og vekten til pattedyret, den nøyaktige tilstand som krever behandling og dens alvorlighet, administrasjonsveien, og vil til syvende og sist være den aktuelle leges eller veterinærs avgjørelse. Det er imidlertid sannsynlig at en effektiv mengde for lysering av en kranspulsåre-trombe f.eks., vanligvis vil være i området 150.000-450.000 IU/kg legemsvekt av pasienten pr. time. Således vil en effektiv mengde pr. time for et voksent menneske på 70 kg vanligvis være 10.000.000-30.000.000 IU, spesielt ca. 20.000 IU, og denne mengden kan administreres uten eller med en priming-dose. Det er også sannsynlig at dosen vil være mindre for noen trombiotiske tilstander, slik som dypåretrombose og akutt slag, eller for ganske enkelt å opprettholde åpenhet for en allerede reperfusert kranspulsåre. I disse situasjoner vil den effektive mengde vanligvis være 7.000-36.000 IU/legemsvekt av pasienten pr. time.

Følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 1

Et klaret, innhøstet t-PA-materiale oppnådd fra en dyrket transformert CHO-cellelinje ble oppnådd ved bruk av metoden ifølge Molecular and Cellular Biology, 1985 5(7), 1750-1759, ble renset promatografisk og t-PA-materialet oppsamlet som en vandig oppløsning inneholdende 0,17 M natriumcitrat og 0,01 #

(vekt/vol) Tween 80 ved pH 5,5. Oppløsningens pH-verdi ble justert til 3,0 med saltsyre, og den resulterende oppløsning konsentrert ved ultrafiltrering ved bruk av en H-10 patron (Amicon Ltd., Upper Mill, Stonehouse, Gloucestershire, England). En konsentrert, renset vandig oppløsning av t-PA (2.500.000 IU/ml) inneholdende 0,1 M natriumcitrat, 0,23 M natriumklorid (som skrev seg fra tilsetningen av saltsyre) og

0,01 % (vekt/vol) Tween 80 og med en pH-verdi på 3,2, ble således oppnådd. Denne oppløsning ble anbragt i et dialyse-rør som hadde et molekylvekt-kutt på ca. 14.000 og dialysert ved 4°C mot fire endringer av volumer av filter-sterilisert fysiologisk saltoppløsning (0,85 # (vekt/vol) natriumklorid) inneholdende 0,01 # (vekt/vol) Tween 80 og justert til pH 3,0 med konsentrert saltsyre. Hvert dialysetrinn fikk forløpe i 12 timer. Etter utvinning av den vandige oppløsning fra dialyseposen, ble den filter-sterilisert og fortynnet med fysiologisk saltvann for oppnåelse av 500.000 IU/ml t-PA. Den resulterende parenterale oppløsning ble deretter fylt i små glassflasker som ble forseglet og frosset og lagret ved -20°C.

EKSEMPEL 2

Et klaret innhøstingsmateriale av t-PA oppnådd fra en dyrket transformert CHO-cellelinje som var tilveiebragt ved bruk av metoden i Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, ble renset kromatografisk og t-PA-materialet oppsamlet som en vandig oppløsning inneholdende 0,17 M natriumcitrat, og 0,01 Sé (vekt/vol) Tween 80 ved en pH på 5,5. Opp-løsningens pH-verdi ble justert til 3,0 med saltsyre, og den resulterende oppløsning konsentrert ved ultrafiltrering ved bruk av en H-10 patron (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). Den konsentrerte vandige oppløs-ning ble ytterligere renset ved å anbringe den på en gelfiltreringskolonne (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechno-logy, Uppsala, Sverige), og eluering med 0,85 % saltopp-løsning inneholdende 0,01 # (vekt/vol) Tween 80 ved en pH på 3,0. En høyt renset vandig oppløsning av t-PA ble således oppnådd, som ble konsentrert en gang til ved bruk av en kunstig engangsnyre. t-PA-materialet ble utfelt fra oppløs-ning ved å øke pH-verdien til 5,5 med natriumhydroksyd og opprettholdelse av suspensjonen ved 4°C i 2 timer. t-PA-materialet ble utvunnet ved sentrifugering ved 4000 x g i 30 min. ved 4°C. Pelleten av t-PA ble gjenoppløst i en vandig oppløsning av natriumklorid (0,85 # (vekt/vol)) inneholdende 0,01 1o (vekt/vol) Tween 80 og justert til pH 3,0 med saltsyre. Volumet av den benyttede saltholdige oppløsning var den som skulle til for å gi en konsentrasjon av t-PA mellom 7.000.500 og 10.000.000 IU/ml. Denne oppløsning av t-PA ble fortynnet med ytterligere vandig oppløsning av natriumklorid (0,85 % (vekt/vol)) inneholdende 0,01 % (vekt/- vol) Tween 80 og justert til pH 3,0 med saltsyre, og også med tilstrekkelig av en oppløsning av 10 # (vekt/vol) mannitol i den samme sure saltholdige oppløsning for oppnåelse av sluttlige konsentrasjoner på .5.000.000 IU/ml av t-PA og 25 mg/ml mannitol. Den resulterende oppløsning ble filtersterilisert og fordelt i volumer på 1 ml i glassflasker som ble frosset og lagret ved —20°C.

EKSEMPEL 3

Den trombolytiske effektiviteten til den parenterale oppløsningen i eksempel 1 ble bedømt i en in vivo modell av halsåretrombose.

(a) Metode:

Den eksperimentelle metoden fulgte i det vesentlige den som er beskrevet av Coilen et al. (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368-376).

Den parenterale oppløsningen i eksempel 1 fikk tine og ble fortynnet med steril isotonisk saltoppløsning justert til pH 3,0 inneholdende 0,01 % Tween 80 for tilveiebringelse av tilstrekkelig oppløsning for en to timers infusjon av 500.000 IU/kg av t-PA. Infusjon ble foretatt via en kanyle i den høyre låråren. Tre hvite New Zealand kaniner ble benyttet i studiet. Etter infusjon ble graden av trombolyse anslått.

(b) Resultater:

Den prosentvise trombolyse var 22,3 ± 4,2, hvilket således demonstrerer den trombolytiske effekten til den parenterale oppløsningen i eksempel 1. I tillegg ble det ikke observert noen uheldige reaksjoner ved infusjonen av denne oppløs-ningen.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en parenteral oppløsning av t-PA, karakterisert ved(i) tilveiebringelse av en renset oppløsning av t-PA og utveksling av mediet med et vandig medium som har en pH-verdi fra 2 til 5; eller (ii) oppløsning av t-PA i et vandig medium som har en pH- verdi fra 2 til 5; sterilisering av den resulterende oppløsning, som eventuelt (a) innbefatter et fysiologisk akseptabelt middel som gjør oppløsningen vesentlig isotonisk med human-blodserum, (b) innbefatter et overflateaktivt middel, (c) er vesentlig ubufret, og (d) er vesentlig fri for lysin eller ornitin, eller et salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at t-PA-materialet enten er i den enkjedede form eller i den tokjedede form.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at t-PA-materialet har den aminosyresekvens som er angitt på fig. 1 eller har den samme aminosyresekvensen, men hvor aminosyren i stilling 245 fra serin N-terminusen er valin istedenfor metionin, idet hver sekvens eventuelt er uten noen av de første tre aminosyrene eller eventuelt har en ytterligere polypeptid N-terminal-presekvens av Gly-Ala-Arg.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at t-PA-materialet er oppnådd fra en dyrket transformert eller transfisert cellelinje oppnådd ved bruk av rekombinant DNA-teknologi.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at konsentrasjonen av t-PA er større enn 100.000 IU/ml, fortrinnsvis større enn 500.000 IU/ml.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at konsentrasjonen av t-PA er større enn 1.000.000 IU/ml, fortrinnsvis ca. 5.000.000 IU/ml.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at pH-verdien er fra 2 til 4,5, fortrinnsvis fra 2,5 til 4,0.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at pH-verdien er fra 2,8 til 3,5, fortrinnsvis ca.

3,0.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at mediet er helt eller vesentlig vandig.

10. Fremgangsmåte Ifølge krav 1, karakterisert ved at det fysiologisk akseptable middelet er natriumklorid.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fysiologisk akseptable middel er dekstrose.