DK174203B1 - Stabiliserede human-vævsplasminogenaktivator-præparater - Google Patents

Description

i DK 174203 B1

Denne opfindelse angår stabiliserede farmaceutiske præparater Indeholdende humant vævsplasminogenaktivator-(t-PA) protein, hvilke præparater har forbedrede stabilitet* og opløsellghedsegenskaber for t-PA-komponenten og er let lyophiliserbare, således at der 5 kan frembringes stabile lyophiliserede former deraf til sikker og effektiv terapeutisk Indglvning hos mennesker.

Præparaterne Ifølge opfindelsen er ejendommelige ved det i krav l’s kendetegnende del angivne.

10

Ustabiliteten af vaskulær plasminogenaktlvator ekstraheret fra de vaskulære forgreninger af humane lig er beskrevet af Aokl, J. Blol. Chem. (Tokyo), 25, 731 (1974). Aoki fandt, at aktivatoren kun blev stabiliseret af høje natrlumchlorldkoncentratloner på over ca. 0,5 M.

15 Binder et al. 3. Blol. Chem. 254. 1998 (1979) beskriver anvendelsen af puffere med højt salt- og arglnlnlndhold under en flertrlnsrensnlngsprocedure som nødvendig for at bevare aktiviteten af vaskulær plasminogenaktlvator afledt fra perfusater af humane lig. Rensningstrinnene blev udført i nærvær af 0,3-1,0 M NaCl og 0,1 M arglnln.

20 Radcllffe et al., Arch, og Biochem. & Blophy. 189, 185 (1978) beskriver separationen af plasminogenaktlvator fra humant plasma ved chromatografl på lysln-nSepharosen®. Ved et forsøg blev rå plasminogenaktlvator fra stabiliseret plasma elueret fra lysln"Sepharose"· under anvendelse af en gradient af 0-0,5 M arglnln I 0,6 M NaCI-opløsnlng.

25 Human vævsplasmlnogenaktlvator afledt fra naturlig vævskilde er beskrevet af Collen et al. I EP offentliggørelsesskrift nr. 041766, offentliggjort den 16. december 1981, baseret på en første Indlevering den 11. juni 1980. Forfatterne anvendte en rensningsforskrift, som giver vævsplasmlnogenaktlvator I relativt høje renhedsniveauer. Collen et al. undersøgte stabiliteten af præparater af deres rensede vævsplasmlnogenaktlvator både I flydende og 30 lyophiliseret tilstand og fandt, at de lyophiliserede former hurtigt blev ustabile, selv når de var fremstillet ud fra opløsninger Indeholdende 0,3 M NaCl.

For at materialer som vævsplasmlnogenaktlvator kan stilles til rådighed for sundhedspersonale og patienter, må disse materialer fremstilles som farmaceutiske 35 præparater. Sådanne præparater må være stabile I passende tidsrum, må I sig selv være acceptable til Indglvning hos mennesker og må være lette at fremstille. Et eksempel på et sådant præparat ville være en opløsning beregnet til parenteral Indglvning. Selv om farmaceutiske opløsningspræparater ofte tilvejebringes I flydende form passende til umiddelbar anvendelse, kan sådanne parenterale sammensætninger også tilvejebringes i 2 DK 174203 B1 frossen eller lyophlllseret form. I det førstnævnte tilfælde må præparatet optøs før brug.

Den sidstnævnte form anvendes ofte til at forhøje stabiliteten af det I præparatet Indeholdte lægemiddel under en bredere variation af opbevaringsbetingelser, da det er anerkendt af fagfolk, at lyophiliserede præparater almindeligvis er mere stabile end deres 5 flydende modstykker. Sådanne lyophiliserede præparater rekonstitueres før brugen ved tilsætning af egnede farmaceutisk acceptable fortyndingsmidler, såsom sterilt vand til injektion eller steril fysiologisk saltopløsning og lignende.

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe stabile præparater af human 10 vævsplasmlnogenaktlvator, Især præparater I stabil lyophlllseret form.

Opfindelsen bygger på den erkendelse, at Inklusionen af arglnln (som arglnlnlumlon) I et farmaceutisk acceptabelt præparat af vævsplasmlnogenaktlvator (t*PA) I væsentlig grad forøger stabiliteten og opløseligheden af t-PA og endvidere, sammen med valget af egnede 15 modioner, gør det muligt at fremstille stabile lyophiliserede former deraf. Opfindelsen er således rettet mod sådanne præparater.

I almindelighed kan præparaterne Indeholde andre komponenter I mængder, som fortrinsvis Ikke forringer fremstillingen af stabile lyophiliserbare former og I mængder, som 20 er egnede til effektiv sikker farmaceutisk indgivnlng.

Egnede pH-områder for præparaterne Ifølge opfindelsen er fra omkring 4 til omkring 9, da disse præparater er beregnet til farmaceutlka, fortrinsvis I det fysiologiske pH-område, dvs. omkring neutralt. I dette pH-område eksisterer arglnln hovedsageligt som en 25 protoneret kation med nettoladning +1, som kan betegnes "arglnlnlumlon". Betegnelsen "arglnln" anvendes I denne beskrivelse vekselvis med "arglnlnlumlon", fordi "arglnlnlumlon” p.g.a. systemets pH-værdl er en ækvivalent beskrivelse. For at bevare elektrisk neutralitet må arglninlumlonen afbalanceres af en ækvivalent mængde modsat ladede (dvs. negativt ladede) lonarter, som kan betegnes "modioner". Kombinationen af 30 arglnlnlumlon, andre kationarter og de forskellige modioner kan betegnes som et "arglnlnlumlonholdlgt puffersystem". Acceptable modioner inkluderer dem, der er farmaceutisk acceptable, og desuden dem, der er I stand til at indstille præparatets tilsyneladende eutektiske eller kollapstemperatur således, at præparatet er særlig egnet til let lyophlliserlng. Eksempler på sådanne modioner er acetat, phosphat, citrat, succlnat, 35 sulfat, tartrat, malat, maleat, carbonat og lignende såvel som funktionelle ækvivalenter dertil. Et eksempel på en modion, som ikke er velegnet, erchlorldionen.

3 DK 174203 B1

Som anført ovenfor har opfinderne fundet, at Inklusionen af arglnln (som arglninlumlon) i farmaceutiske præparater af t-PA udpræget forøger t-PA'ens opløselighed og stabilitet I disse præparater. Arglnlnkoncentratloneme kan ligge I området fra omkring 0,02 til omkring 1 M, fortrinsvis fra omkring 0,05 til omkring 1,0 M, og mere fortrinsvis fra 5 omkring 0,1 til omkring 0,5 Μ I den Indgivne opløsning og/eller, I tilfælde af etlyophlllseret præparat, I opløsningen før lyophilisering.

Desuden kan de forbedrede præparater eventuelt Inkludere et eller flere Ikke-ionlske detergenser, såsom polysorbat 20 og polysorbat 80 og lignende, I mængder på fra 10 omkring 0,001 til omkring 1% for yderligere at forhøje stabiliteten af t-PA. Desuden kan andre farmaceutisk acceptable exclplenter, som er velkendte for fagfolk, også udgøre en del af sådanne præparater. Disse kan f. eks. inkludere forskellige fyldemldler, yderligere puffermidler, chelateringsmldler, antloxldanter, konserveringsmidler, hjælpeopløsningsmidler og lignende; specifikke eksempler på disse Inkluderer mannitol, 15 tromethamlnsalte ("Trls-puffer"), dlnatriumedetat, gelatine, humant serumalbumin eller andre polypeptlder, forskellige små peptider, sådom glycylglydn, osv.

t-PA-præparaterne ifølge opfindelsen kræver overraskende ikke anvendelse af høje koncentrationer af natriumchlo- 20 rid, dvs. 0,3 M eller derover. Faktisk er høje koncentrationer af chloridion skadelige for lyophiliser-barheden af disse forbedrede præparater. Selv om nogen mængde af chloridion tolereres, foretrækkes lave koncen- trationer, dvs. mindre end 0,3 M og fortrinsvis 25 ikke større end normale fysiologiske niveauer, dvs. omkring 0,12 M NaCl. Mest foretrukkent udelukkes chloridion fra præparatet.

3Q En "farmaceutisk effektiv mængde" af t-PA henfører til den mængde, som giver terapeutisk virkning ved forskellige indgivningsskemaer. Præparaterne ifølge opfindelsen kan fremstilles indeholdende mængder af t-PA på mindst ca. 0,1 mg/ml til over ca. 50 mg/ml, fortrinsvis fra om-35 kring 0,4 til omkring 5 mg/ml. Til anvendelse ved ind-givning til humane patienter, som lider af f. eks. myo-cardiale infarkter, kan disse præparater indeholde frå omkring 0,4 til omkring 3 mg/ml t-PA svarende til den for tiden påtænkte dosering til sådan behandling.

4 DK 174203 B1

Prsparterne ifølge opfindelsen, herunder lyophiliserede former, fremstilles i almindelighed ved at sammensætte komponenterne under anvendelse af alment tilgængelig-5 farmaceutisk sammensstningsteknik, som er i og for sig kendt. Ligeledes anvendes standard lyophiliseringspro-cedurer og -udstyr, som er velkendt indenfor faget. En særlig fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat af t-PA ifølge opfindelsen omfatter anvendelse 10 af renset (ifølge enhver standard proteinrensningsforskrift) t-PA-ved enhver af flere kendte pufferudskift--ningsmetoder-, såsom gelfiltrering. Denn.e foretrukne fremgangsmåde blev anvendt til at isolere og rense den t-PA, der blev anvendt som udgangsmateriale ved de stabilitets- og opløselighedsundersøgelser, som følger. Den - t-PA, som blev anvendt ved den foretrukne fremgangsmåde, blev opnået fra rekombinant ændrede kinesisk-hamster-ovarie-celler (CHO-celler), som var i stand til at ud-2Q trykke t-PA som et udskift produkt i CHO-celle-kul-turmediet.

25 Opfinderne har fundet den påfaldende virkning, at farmaceutiske præparater af t-PA har væsentligt stabiliseret biologisk aktivitet, når arginiumionholdig puffer er en komponent, og at sådanne sammensætninger ikke kræver na-triumchlorid for stabilitet, selv om der kan anvendes 30 saltkoncentrationer lavere end 0,3 Η. I en foretrukken udførelsesform er chloridionkoncentrationen 0,1 H eller mindre. I det neutrale pH-område, f. eks. omkring pH 6 -8, forøges ODløseligheden af t-PA ved tilstedeværelsen af arglnlnlumlon; således at den kan indgå i sammensætnin-35 gen i relativt høje koncentrationer, selv liden tilstedeværelse af, hvad den kendte teknik har betragtet som nødvendigt, høje stabiliserende mængder salt.

5 DK 174203 B1 I denne beskrivelse angiver betegnelserne "human vævs-plasminogenaktivator"» "human t-PA" eller "t-PA" human ydre (vævstype) plasminogenaktivator produceret £. eks.

5 ud fra naturlig kilde ved ekstraktion og rensning (se

Collen et al., ovenfor) og af rekombinante cellekultursystemer som beskrevet heri. Dens sekvens og egenskaber er anført £. eks. i EP offentliggørelsesskrift nr. 93619 (offentliggjort den 9. november 1983) baseret på en før-10 ste indlevering den 5; maj 1982; se også EP offentliggørelsesskrift nr* 41766 (offentliggjort den 16. december 1981) baseret på en første indlevering den 11. juni 1980, og Rijken et al., Journal of Biol. Chem; 15 256, 7035 (1981),

Betegnelserne dækker ligeledes biologisk aktive human-vævsplasminogenaktiva-tor-ækvivalenter, som adskiller sig mht. en eller flere aminosyrer i den samlede sekvens eller mht. glycosyle- 20 ringsmønstre, som antages at være afhængige af de specifikke anvendte dyrkningsbetingelser og arten af den vært, hvorfra vævsplasminogenaktivatoren opnås.

A. Figurer

Fig. 1 afbilder stabiliteten af t-PA i forskellige sammensætninger.

Fig. 2 afbilder virkningen af argininkoncentration på opløseligheden af t-PA.

Ffg. 3 af bilder opløselighedsgrænserne for t-PA i forskellige koncentrationer af argininiumphosphatpuffere ved pH 6, 4 °C.

6 DK 174203 B1 B. Lyophlllsering

Lyophlllsering, eller frysetørring, af præparatet udfø-5 res under anvendelse af procedurer og udstyr, som er velkendt for fagfolk. Typisk fryses et præparat·først til en temperatur under dets tilsyneladende eutektiske eller kollaps-temperatur. Derpå påsættes vakuum, og lyo-10 philisatorribbeme påføres varme for at afdrive isen ved sublimering, idet ribbetemperatur og kammertryk indstilles således, at den frosne masses temperatur forbliver under den tilsyneladende eutektiske eller kollaps-temperatur, indtil i hovedsagen al isen er fjernet. Efter 15 denne "primær tørrings"-fase kan ribbetemperaturen hæves yderligere (med eller uden ændring i kammertryk) og resterende fugtighed i den frysetørrede kage afdrives.

20 25 C. S-2288 analyse

Et syntetisk peptidsubstrat, S-2288 (H-D-IIe-Pro-Arg-p-nltroanilld«2HCl) hydrolyseres med t-PA under dannelse af farvet p-nltroanllin og trlpeptld. Den maksimale differential absorbans mellem substrat og produkt (p-nitroanllin) forekommer ved 405 nm.

30 Produktionen af p-nltroanllin kontrolleres spektrofotometrlsk ved at følge absorbansen ved 405 nm som funktion af tiden. Den resulterende hældning af absorbans over for tid er proportional med t-PA-aktiviteten. Denne analyse gennemføres ved 37 ± 0,2 eC.

Til denne analyse sattes 20-100 μΙ af en given t-PA-prøve til 1,2 mL reaktionsblanding 35 Indeholdende 0,33 mM S-2288, 0,067 M Trls-puffer (pH 7,4), 0,07 M NaCI og Incuberes ved 37ftC I 10 minutter. Ændringen i absorbans blev kontrolleret I 1 minut, og aktiviteten blev udregnet fra absorbansen ved 405 nm under anvendelse af den følgende ligning, standardiseret af producenten: 7 DK 174203 B1

Aktivitet (IU; Internationale enheder) = ΔΟΡ x 793.65 ffortvndlnasfaktori

Inkubationstid x prøvevolumen

Opfindelsen illustreres nærmere ved følgende eksempler 5

Eksempel 1

Renset t-PA blev fortyndet til en endelig koncentration på 0,2 mg/ml, opdelt I allquoter og 10 dialyseret over for de puffere, som er anført l tabel 1.

IABEL-1

Dlalvsekoncentratlon

Dialysepuffer Indeholdende Arglnln 15 0,Q3t % polvsorbat SQ_ NaCI (som hvdrochtortdl 1. 0,01 M natrlumphosphat pH 6,

2. 0,01 M natrlumphosphat pH 6, 0,12 M 0,2 M

3. 0,01 M natrlumphosphat pH 6, - 0,2 M

4. 0,01 M natriumacetat pH 5,

20 5. 0,01 M natriumacetat pH 5, 0,12 M 0,2 M

6. 0,01 M natriumacetat pH 5, - 0,2 M

Efter dialysen blev prøverne centrifugeret, og supematanten lyophlllseret I 1 ml allquoter. Lyophlliserede prøver blev rekonstitueret med vand og prøvet for t-PA-aktivitet ved S-25 2288-analysen. Hver rekonstitueret prøve blev derefter anbragt ved 37°C og prøvet til forskellige tider.

Resultaterne af dette forsøg er vist i fig. 1. Som det kan ses, forhindrer de systemer, der Ikke Indeholder arglnln, Ikke tabet af t-PA-aktlvltet med tiden. t-PA-aktlviteten I de prøver, 30 der Indeholder 0,2 M arglnln, eller 0,2 M arglnln plus fysiologiske mængder af chlorid, bevarer næsten hele den oprindelige t-PA-aktivltet efter inkubation I 4 dage ved 37eC.

Disse resultater viser, at 0,2 M arglnln med eller uden NaCI I væsentlig grad stabiliserer t-PA.

35

Eksempel 2

Stabiliteten af t-PA som funktion af arglnlnkoncentratlonen blev bestemt ved måling af hastigheden for tab af t-PA-aktivitet ved forskellige temperaturer.

8 DK 174203 B1

Sammensætning: 1. 0,355 mg/ml t-PA

0,05 M Naphosphat pH 6,2 0,05 M arginln som iiydrochlorldet 5

2. 0,498 mg/ml t-PA

0,03 M Naphosphat pH 6,2 0,2 M arginln som hydrochlorldet 10 0,5 ml allquoter af opløsningerne med de ovenstående sammensætninger blev aseptisk fyldt i 2 ml glasampuller og forseglet. Ampullerne blev anbragt ved 25°, 37° og 45°C. To ampuller af hver opløsning blev prøvet ved 0, 20, 55 og 160 dage; og t-PA-aktlviteten blev målt under anvendelse af S2288-analysen, Den naturlige logaritme af den procentvise resterende aktivitet blev afsat over for tiden (dage) for hver temperatur, hvorfra 15 hastighedskonstanten blev udregnet under anvendelse af lineær-regressionsanalyse.

Hastighedskonstanterne (k) for tab af t-PA-stabllltet ved to forskellige argininkoncentratloner og ved forskellige temperaturer er vist i tabel 2.

20 TABEL 2

Virkning af arginln på t-PA-stabilitet 25 k (dag'1)

Sammensætning_Arginln_25 °C_37 °C_45 °C

0,05 M

Na-phosphat, pH 6,2 0,05 M 0,00137 0,0102 0,0167

0,03 M

30 Na-phosphat, pH 6,2 0,20 M 0,00043 0,00569 0,01272

Som det kan ses, frembringer 0,2 M arginln hastighedskonstanter, som er mindre end dem, der opnås 10,05 M arginln ved hver af de angivne temperaturer, hvilket viser, at en 35 forøgelse i arglnlnkoncentratlon forøger stabiliteten af t-PA.

Eksempel 3 9 DK 174203 B1

Stabiliteten af t-PA er også afhængig af koncentrationen af ikke-ionlske overfladeaktive midler. Dataene er angivet i tabel 3.

5 t-PA blev udfældet ved dialyse over for 0,01 M Na-sucdnat-puffer ved pH 6,0. t-PA-bundfaldet blev opsamlet fra den dialyserede prøve ved centrifugering. Dette bundfald blev genopløst i sammensætningen nedenfor Indeholdende forskellige koncentrationer af polysorbat 80.

10

Sammensætning: 0,2 M argin in som hydrochlorldet 0,02 M Na-phosphat pH 7,2 polysorbat 80 (0,0005-0,10%) 15 Opløsningerne blev aseptisk fyldt I ampuller og anbragt ved 35°C og 40°C. To ampuller blev prøvet ved hvert tidspunkt, og enzymatisk aktivitet blev afprøvet under anvendelse af S2288-analysen.

Hastighedskonstanterne blev udregnet ved llneær-regresslons-analyser af log (t-PA-20 aktlvltet)/tidskurven for hver temperatur og er vist i tabel 3.

TABEL 3 25 Virkning af polysorbat 80 på t-PA-stabllltet

Polysorbat 80 k (dag1)

% 35 °C 40 °C

30 0,0005 0,0055 0,0106 0,005 0,0049 0,0091 0,01 0,0043 0,0088 0,025 0,0040 0,0081 0,05 0,0041 0,0077 35 0,10 0,0037 0,0075

Denne tabel viser, at efterhånden som koncentrationen af polysorbat 80 forøges, formindskes hastighedskonstanten (k). Dette viser, at der opnås mere stabilitet med mere polysorbat 80.

EkSfiTDRfiL4 DK 174203 B1 10

Der fremstilledes t-PA-opløsnlnger ved dialyse af renset t-PA over for den nedenstående S argininlumphosphat-sammensætnlngspuffer efterfulgt af fortynding med yderligere puffere til den ønskede· siutkoncentration af t-PA.

Sammensætning: 0,20 M arglnin 0,18 M phosphorsyre 10 0,01 % polysorbat 80 pH 6

Allquoter af hvert præparat blev aseptisk fyldt i 5 eder 10 ml ampuller, lyophlliseret og forseglet. Ampuller blev anbragt ved flere temperaturer. To ampuller pr. sammensætning 15 blev prøvet ved hvert tidspunkt, og t-PA-aktlviteten bestemt ved S2288-analysen.

Resultaterne er anført i tabel 4.

TABEL 4 20

Stabiliteten af t-PA I lyophlliseret formulering 25 % resterende (gennemsnit af 2 prøvninger ± standardafvigelse) t-PA Tid

•mg/mli1 pH fad) 5 1C_2S »C 30 »C 35 »C 40 »C

1.0 6,0 2,0 102,5±0,0 103,3±2,5 - 102,613,0 -- .

30 2.0 6,0 2,0 111,310,7 111,110,1 -- 114,612,2 - 1.0 6,0 3,5 98,211,3 -- 96,011,7 -- 97,7100,1

Koncentration af t-PA 1 opløsning før lyophiliserlng 35

Disse data viser, at t-PA er stabil i den lyophillserede form.

11 DK 174203 B1

Eksempel 5

En opløsning indeholdende t-PA i en koncentration på omkring 0,3-0,5 mg/ml blev dialyseret over for 10 mM natriumphosphat, pH 7,5, 0,01% poiysorbat 80 Indeholdende 5 forskellige koncentrationer af arglnin som hydrochlorldet. Uopløseligt materiale blev fjernet ved centrifugering I 2 minutter I en "Eppendorf mlcrofuge". Mængden af t-PA, som forblev I opløsning, blev afprøvet ved S-2288-analysen. Resultaterne er vist I flg. 2.

Så Ildt som 50 mM arglnin forøger væsentligt opløseligheden af t-PA. (Den mindre 10 forøgelse I tilsyneladende opløselighed ved højere arglnlnkoncentratloner er et skinfænomen, som skyldes, at den oprindelige koncentration af t-PA I udgangsmaterialet kun var 0,3-0,5 mg/ml, og der således aldrig blev nået en begrænsende opløselighed.

15 Eksempel S

t-PA blev udfældet ved dialyse over for 0,001 M natrlum-succlnat-puffer ved pH 6. Det resulterende bundfald blev Isoleret ved centrifugering, og derpå blev en udmålt mængde af dette materiale ækvllibreret I 1 ml af det ønskede puffersystem I 20 timer ved 5°C under 20 omrøring. De undersøgte puffersystemer blev fremstillet ved udrivning af arglnin med phosphorsyre til dannelse af et arglnlnlumphosphatsystem ved pH 6,0. Lageropløsninger blev fortyndet med vand til opnåelse af endelige pufferopløsninger Indeholdende 0,10-0,20 M arglnin (som arglninlumion). Efter ækvilibrerlng med det ønskede puffersystem blev det resulterende t-PA-præparat centrifugeret for at fjerne alt ikke-opløsellgt 25 materiale, og derefter blev supematanteme prøvet for opløselig t-PA ved S2288-analysen.

Resultaterne er vist i flg. 3. Hvis t-PA'en er fuldt opløselig ved den oprindeligt tilsatte koncentration af t-PA, skulle koncentrationen af opløselig t-PA være den samme som den tilsatte. Hvis omvendt t-PA'en ikke er fuldt opløselig ved den oprindeligt tilsatte 30 koncentration, så vil koncentrationen af opløselig t-PA være mindre end den tilsatte. Fig. 3 viser, at t-PA er opløselig i 100 mM arglnlnphosphat, pH 6,0, op til omkring 2 mg/ml, og at opløsellgheden forhøjes udpræget ved højere arglninphosphat-koncentratlon. Især er t-PA'en ved 200 mM arglnlnphosphat, pH 6,0, stadig fuldstændigt opløselig, selv ved omkring 54 mg/ml, og den begrænsende opløselighed er klart betydeligt højere end dette.

35 DK 174203 B1

Eksemæt 7 12

Det nedenstående arglnlnlumphosphatsystem blev fremstillet som en prælyophiliserings-opløsning.

5

Prælyophlllseringsopløsnlng mg/ml t-PA 2,5 10 L-arglnin 87,1 phosphorsyre 26,8 polysorbat 80 0,1 pH 7,2 15

Efter sterilfiltrering blev ca. 20 ml aliquoter fyldt 150 cm3 ampuller. Derpå udførtes lyophilisering som følger: a) Ampullerne blev anbragt i en lyophllisator og frosset ved -50°C (ribbetemperatur) 20 under omgivende tryk 110 timer.

b) Der påsattes vakuum (kammertryk 100 umHg), og rtbbetemperaturen blev hævet med 10°C/h til +7°C og derpå holdt ved den temperatur I 41 timer.

25 c) Ribbetemperaturen blev derpå hævet til +35°C, og kammertrykket sænket til 50 pmHg, og systemet holdt i denne tilstand I 14 timer.

Ampullerne blev derpå tllproppet, trykket fik iov at vende tilbage til det omgivende, og ampullerne blev udtaget fra lyophillsatoren.

30

EksempeLS

Virkningen af natriumchlorid på kvaliteten af lyophillserede arglnlnphosphatkager blev 35 undersøgt. Prøver med 0,8 M arglnln (pH 7) og 0,2 M arglnln (pH 6) som phosphatsaltene blev fremstillet til at Inkludere koncentrationer af natriumchlorid I området fra 0,01 til 500 mM. To ml aliquoter af hver opløsning blev anbragt 110 cm3 ampuller og lyophiliseret under anvendelse af den følgende cyclus: 13 DK 174203 B1

Lyophiliserings- Ribbetemperatur Kanunertryk Tid trin_|_^CJ_(umHq) (h)

Frysning -45 omgivende 10

Primær tørring Forøgelse med 20eC/h til -35eC, 50 24 5 derpå 3®C/h til

+35eC

Sekundær tørring +35' 40 26

Kvaliteten af de resulterende kager er angivet i tabel 5. Dataene viser, at der kun dannes 10 farmaceutisk acceptable kager med de sammensætninger, som Indeholder lave niveauer af natriumchlorid, og at det tolererede lave niveau af natrlumchlorld af afhængigt af arginlnkoncentratlonen.

14 DK 174203 B1 tt) 0) g gi n H C H A) rlHj W O' 3 -Η -Η I _S£ -*-l ft *H O' 3

U -P CH G WC P C C 3 Η H

0) «3 *H ® p C ® ® « UV tMI rlfi c nas« o*A tt> ο» a Ό a u ft u ft h ft O 0) Π o Η -ΗίΗ θ' -H W c CT C 0) S Φ 6 016 η a ·<ηα) p 3 β p ra o g β) o* 3 O' 3 op

p Β Ό O' ft-H θ' Β Λ BH HH -Η μ >|M

TO tt) S tt> C «8 <0 H H HJtt HJtt J* u p 6 > ara··* mop *03 V4 ίο u tn σι»

p 0) CM B O* TO C ιί·Η ft -H ft tt) Ό tt) Ό nJO

O 3 * TO ® H<4V H > g >6 Ό 3 O« >3 c p o to λ o Ad o .3 to w ra x h x -h w h

O U

Jtt Ό Ό •H tt) H >

O

iH Hil I I I I I

χ; Q)<Dtt) tt) 0)0)0)0)

O Ό C Λ jQ X) Λ A X» JQ

6 0) Ή P c C Ή *H Ή -Η Η Ή *ri u E VBfi Bfi 6 h B3 836383 p Η O V O ® O 0) OO) 04) OO) O 0>.

ra cm ><Mtt an ω a aa aa aa ua

C

i« £0)0) 0) fl) tt) tt) 0)0) 0)0) 0)0) 0)0) 0) 0) β Ό 6*0 Β Ό B Ό 6Ό ΕΌ B Ό

P P 00 H 3 S C § C ICBpBCBC

o» «»-) » ra x ίο x to X to x ax rax to X

ι-l W O W O' W 0» W O' MtJ) Wtj) MG' MDI

TO > Ό

** p I I

tt) a a a

m ό Pi 0) a) TO

C CBOI Η «Η P P P P

μΐα> *h 3 ra ο» ® O' 0) a) 0) at o> θ Ό CXX Ό Ό O' O' O' O' cq rH h a Ό c ό c o a; a) β) 3 op συ fi u v 2® 6 _ B _ B _ 6 w

Eh Λ 0) u 3 ® B ® a® C 3 C C

o) 4-) <xj -H o' a a ·* β ··· β ·· Φ »β Ό-H C ® Ό ΦΌ vft®ft®ft®ft

C H £u-h O* 3 O' 3 O' Β O' B O' e O' B

-H TO B To TO TOP rap TOP rap > cm η — .* p jxp λ! u λ: μ j<: η Jd η Β Ji C '3V O' O' JO JO Jtf Ji οι ® ® oca ό η ό *h «ο a ό a *a a ό a p o a pa -HP *h p ηό ηό η ό η ό a w η ura >ο> > θ' >3 >3 t> c > a X « ® OB WTO W« W-H Wh W Ή Wh a Ό u c

® X I I

ip ο ®p Φ S ppp m ® I O' HU O' 3 I Ό Ό Ό

3 Λ 6 TO ® Φ H U Ό *H H H

Pi 3 3 Λί Β Ό PJ< β Η Η H

C H HU »H O' W H

H OJiO O TOO .P P p c h a a O' a c p ® ® ® H O O O' TO a TO Η Ό O' O' O' O' H3C>3H H ® ® ® u «3-Η-Η a® O'P h a B 6 TO O' Ό 3 3 3 £ S «« ·«» flj ·κ*γ| *«* «ν φ ·% fl) Η φ -P t7»d) <U ^ CIH 4) φ Οι <U Do 4)04 ® CO-Η a O' O' 0>3 0»B O' B 0>a u *p a ra«ra to*> to® top top top

® O O' TO JC P« JttU JttP,Jci4JttUJttU

a ra B « •h a *o O' *o p Ό3 Ό a Ό a ό a Η «Ρ *H 3 Η 3 p Η H H*D Η·0 ΗΌ

3 O A W C W 5 ft W a W H w -5 W -H

·& X _

H S

P

tt) «ο <u u ra o

H

P J3 ® a p a

•Η P

H H

TO u H

> POO HO

& TOO · o o o »·> £ιη h in Η η ο o

Claims (9)

1. Farmaceutisk præparat indeholdende human vævsplasmlnogenaktivator (t-PA), om ønsket i frossen form eller omdannet til lyophiliseret form eller rekonstitueret fra 5 lyophiliseret form og, om ønsket, fortyndet med et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel, kend et egnet ved, at det indeholder en farmaceutisk effektiv mængde human vævsplasmlnogenaktivator (t-PA) og en farmaceutisk acceptabel arglnlniumlonholdig puffer, og at det har en chlorldlonkoncentratlon på mindre end 0,3 M.

2. Præparat Ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den arglnlnlumionholdige puffer er forskellig fra arginlnlumchlorld.

3. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pufferen er tilvejebragt af arglnlnlumlon og en modion, som er I stand til at Indstille præparatets kollapstemperatur 15 således at præparatet er let at lyophilisere.

4. Præparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at modionen er valgt blandt citrat, phosphat, tartrat, sulfat, malat, maleat og sucdnat.

5. Præparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at modionen er citrat eller phosphat.

6. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har en koncentration af human vævsplasmlnogenaktivator på mindst ca. 0,1 mg/ml og en koncentration af arglnlnlumlon på fra omkring 0,05 til omkring 1,0 M. 25

7. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at koncentrationen af human vævsplasmlnogenaktivator er fra omkring 0,4 til omkring 5,0 mg/ml og koncentrationen af arglnlnlumlon er fra omkring 0,1 til omkring 0,5 M.

8. Præparat Ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har en pH-værdl på fra omkring 4 til omkring 9.

9. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder et ikke-lonisk detergens I en mængde på fra omkring 0,001 til omkring 1 % af præparatet.