JPS5985292A - ヒト−レラキシン遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、分子クローニング及びヒトーレラキンンを
コードする遺伝子配列の特徴↑けに関する。この発明は
さらに、ヒトーレラキ／ン、プロレラキシン及びプレグ
ロレラキ／ンを製造するための組換ＤＮＡ技法に関する
。

さらに詳しくは、この発明は、分離されそして精製され
た（クローン化された）、グロレラヤシン、グレグロレ
ラキシン、及びヒトーレラキシンのＡ及び／又はＢ及び
／又はＣぺぷチド鎖をコードするヒト−遺伝子、該遺伝
子の分離及び精製方法、並びに該遺伝子を宿主＋胞て移
入しそして該宿主細胞中で複製せしめる方法に関する。

クローン化された遺伝子は、宿主−発現性の原核性又は
真核性遺伝子と融合した場合、宿主細胞により発現され
る。従って、この遺伝子は、治療用ヒト−レラギシンの
製造に有用である。

この発明はさらに、ペプチドたるヒトーレラキシン、グ
ロレラキシン及びプレグロレラキシン、これらの配列を
構成する個々のペプチド鎖、並びにこれらのペプチドの
変形に関する。

この発明はさらに、個々のレラキシン鎖及び上記のその
変形をコードする変形された遺伝子に関する。

この明細書において（番号）により引用した文献は後て
まとめて記載しである。

（従来技術） ヒザウ（Ｈｉｓａｗ）（１）の先駆的な研究こより、哺
乳動物のペプチドホルモンであるレラキシンの重要な投
射が、その恥骨結合弛緩作用及びこの作用に基く分娩促
進作用により示唆された。レラキシンは、妊娠中に卵巣
の黄体中で合成されここに貯蔵され、そして分娩に先立
って血流中に放出される。卵巣を得ることにより、豚（
２，３）、ラット（４）、及びサメ（５）のレラキンン
の分離及びアミノ酸配列の決定が可能となった。生物学
的に活性なホルモンは、ジスルフィド結合により結合さ
れた２つのペプチド鎖（Ａ鎖及びＢ釦）から成り、この
ジスルフィド結合よ、２つの鎖間結合と１つの鎖内結合
から成る。従って、この構造はジスルフィドの配置にお
いてインスリンに非常に類似しており、このことからこ
れらのホルモンの遺伝子は先祖を共通にすると推定され
る。

ラットレラキシン及び豚しラギシンのいずれについても
ｅＤＮＡクローンの分〜に組換ＤＮＡ技法が適用された
（６）。なお、オーストリリア特許出願第１１８３４／
８３（ＰＦ２６９６／８２）を参照のこと。アミノ酸配
列情報を基礎にして調製された合成１１連ヌクレオチド
が、卵巣組織から誘導された試料集団（ライブラリー）
中のレラキシンｃＤＮＡクローンを同定するためのｃＤ
ＮＡプローブを合成するためのブライマーとして使用さ
れた。

該プローブはレラキシンｅＤＮＡ配列て関し非常に濃縮
されたものである。レラキシン構造遺伝子は、全体構造
においてプレゾロインスリンに類似する単鎖前厄体、す
なわちシグナルペグチド／Ｂ鎖／Ｃペプチド／Ａ鎖をコ
ードすることが見出された。

豚及びラットのグレグロレラキシンは、約３０残基のＣ
ペプチドを有するラットのインスリンと比較して、それ
ぞれ１０５残基及び１０４残基の予想外に大きな連結ペ
プチドを含有する。ラット及び豚のレラキンンのＣ−ペ
プチドにおける配列の高度な相同性により、単にＡ鎖及
びＢ鎖の正しいノスルフィド結合の形成を確保するのみ
ならず他の機能が存在することが示唆される。発明者等
よ、進化の過程における配列構造の変化に対して制約が
加えられた結果、ヒトのレラキシン遺伝子においても同
様に、Ｃ−ペプチド領域が高度な配列の相同性を有する
と予想した。後記のでとぐ、発明者等は、ヒトのレラキ
シン遺伝子の選択においてはラットのレラキシンのＣ−
ペプチド領域ではなく豚のレラキシンのＣ−ペプチド領
域を基礎にしたグローブを使用した。これは、蓄積され
た蛋白質の配列データにより、一般にヒト蛋白質はラッ
トの蛋白質よりも豚のそれに近いことが示されている（
８）からでおる。

幾つかのグループが、ヒトーレラキシンの構造を決定し
、そしてこれを難産の症例において臨床的に使用する途
を確立することを長期目標としてきたが、妊娠中のヒト
の卵巣を入手するのに限界がちるためアミノ酸配列を直
接決定することができなかった。発明者等の研究方法は
、グローブとして豚のレラキンンｃＤＮＡの領域を用い
て遺伝子試料集団から直接的でヒトーレラキンン遺伝子
を社択することであった。この方法によシ遺伝子クロー
ンの同定に成功し、このクローンからグレグロレラキン
ン全コード領域の構造が決定された。

発明者等が「Ｈ１」と称してこの明細書に記載する遺伝
子及び発明者等の係属中の出願第ＰＦ７２４７／８２号
に記載されている「Ｈ２」遺伝子はいずれもレラキシン
様活性を有するペプチドを発現するから、これらの一方
又は両者はヒトの生殖組織、例えば卵巣及び胎盤、及び
／又は腸、脳及び皮膚を含む他の組織（これらに限定さ
れない）中で発現されると信じられる。

卵巣の黄体、並びに脱落膜組織及び胎盤組織が、レラキ
シン関連遺伝子が発現する可能性が最も高い部位である
。しかしながら、多くのベプチドホルモンが広い範囲に
分布していることから考えて、レラキシン遺伝子が脳及
び胃腸管を含む非生殖組織においても発現する可能性が
強い。レラキシンは生長因子としての一般的性質を有し
、そして結合組織の性質を変え、平滑筋の収縮に影響を
与えることができる。発明者等は、この明細書に記載す
る遺伝子構造及び係属中の特許出願第ＰＦ７２４７／８
２号に記載されている遺伝子構造の両者又は一方が体内
て広く分布しているものと信する。発明者等よ、これら
の遺伝子により発現されるレラキンンーノテドが、生殖
中のよく知られているホルモン機能のほかに重要な生理
的役割を演することを示唆する。

（発明の具体的な説明） この明細書においては次の略号を用いる。

Ｈ１：この明細書に記載するレラキンン遺伝子であって
、遺伝子クローンに由来す る。

Ｈ２：係属中の出願第ＰＦ７２４７／８２号に記載され
ているレラキシン遺伝子でる って、ｃＤＮＡに由来する。

ＤＮＡ：デオキシリボヌクレオチド ＲＮＡ：リゾヌクレオチド ｃＤＮＡ：相補的（コンプレメンタリー）ＤＮＡ（ｍＲ
ＮＡ配列から醇累的に合成される。）ｍＲＮＡ：メツセ
ンジャーＲＮＡ Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトノン Ｕ：ウラシル ＤＮＡ中のヌクレオチド配列と蛋白質中のアミノ酸配列
とのコード関係は遺伝子コードとして全面的に知られて
おり、次にこれを示す。

以下余白 上の表身て使用するアミノ酸の略−は次の意味を有する
。

フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　　ヒスチジン　　　
　（Ｈｉｓ）ロイシン　　　　　　（Ｌｅｕ）　　　グ
ルタミン　　　　（Ｇｉｎ）インロイシン　　　（Ｉｌ
ｅ）　　　　　アスパラギン酸（Ａｓｎ）メチオニン　
　　　（Ｍｅｔ）　　　　　リノン　　　　　（Ｌｙｓ
）バリン　　　　　　　（Ｖａｌ）　　　　アスパラギ
ン酸（Ａｓｐ）セリン　　　　　　　（Ｓｅｒ）　　　
　グルタミン酸　　（Ｇｌｕ）プローリン　　　　（Ｐ
ｒｏ）　　　　システイン　　　　（Ｃｙｓ）スレオニ
ン　　　　（Ｔｈｒ）　　　　トリブトファン　　（Ｔ
ｒｙ）アラニン　　　　　（Ａｌａ）　　　　　アルギ
ニン　　　（Ａｒｇ）チロシン　　　　　（Ｔｙｒ）　
　　　　グリシノ　　　　（Ｇｌｙ）表中に示した各３
文字コードン、例えばＡＵＧ、ＣＡＵ（デオキシヌクレ
オテドトリプレット又はヌクレオナトトリプレットとし
ても知られている）は、ｍＲＮＡのトリヌクレオチドに
対応し、左側に５′末端を有し、右側に３′末端を有す
る。文字は、ヌクレオチド配列を形成するグリン塩基又
はピリミノン塩基を示す。この明細魯に記載するすべて
のＤＮＡ配列は鎖状を成しており、その配列はｍＲＮＡ
配列に対応し、但し、ウラシル（Ｕ）の代りにチミン（
Ｔ）を含んでいる。

遺伝子祠料の採取源はヒトー遺伝子クローンの試料集団
である。豚のレラキシンｃＤＮＡゾロープを用いるこの
試料集団の選択によりヒトーレラキシンのコード配列を
含有する２つのクローンが得られた。

第２図及び第３図に示すｍＲＮＡ配列は後に記載する方
法により決足された。３．４ｋｂの１個のイントロンが
連結（Ｃ）ペプチドのコード領域を中断していることが
明らかであろう。ヒトーグレプロレラキシンの構造を、
豚及びラットのレラキシンの相同構造と比較することに
より遺伝子配列から推定した。Ａ及びＢペプチド鎖の構
造を、合成、及び子宮収縮試験において生物学的に活性
である物質を生成する鎖連結（試験管内）により確認し
た。

プレプロレラキシンの生体内プロセシングの態様は十分
には解明されていないが、豚しラキシンのシグナルペプ
チドの切断から類推して、Ａｌｍ−１−Ｌｙｓ１結合に
おいて生ずると予想される。同様に、Ｃペプチドの切り
離しはＬｅｕ３２−Ｓｅｒ３３、及びＡｒｇ１３６−Ａ
ｒｇ１３７において生じ、これてより、それぞれ３２残
基及び２４残基のＢ鎖及びＡ鎖が生ずると予想される。

豚しラキシンシてついての発明者等の研究によれば、豚
しラキシンＢ鎖及びＡ鎖中に、生物学的活性のために必
須のすべての要ζを含有するコアー配列が存在する。ヒ
トーレラキンン鎖についての発明者等の合成研究におい
ても同様の結果が得れた。これは、後に詳細に記載する
。

この発明の１つの観点に従えばヒトープレグロレラキシ
ン発現遺伝子が提供きれる。

さらに詳しくは、この発明のこの観点に従えば、第２図
て示す完全ｍＰＮＡ（コードン−２５〜１６０）配列に
対応するコード鎖及び相補鎖を含んで成る、ヒトープレ
グロレラキンンの発現のための二重鎖ＤＮＡ断片が提供
きれる。

この発りはさらに、この明細書に記載するグレプロレラ
キシン遺伝子配列の任意のサブユニット、又は該配列も
しくはそのサブユニットの同等物を含む。これらのサブ
ユニットの中ては、非コード領域を含まない遺伝子、例
えば第３図に示す遺伝子、シグナルベグチド、及びヒト
ープレゾロレラキシンのＡ、Ｂ、及びＣ鎖（第３図）を
コードする個々のζ造遺伝子を含む遺伝子、並びにこれ
らの鎖の任意の組合わせをコードする遺伝子、例えばＡ
及びＢペプチド鎖を別個に発現する遺伝子、又は（Ｃ−
と共に）プロレラキシンとして発現する遺伝子が含まれ
る。

この発明の他の観点に従えば、ヒトープロレラキノンを
発現する遺伝子が提供される。

さらに詳しくは、この発明の上記の観点に従えば、第２
図に示すｍＲＮＡ配列の１〜１６０のコードンに対応す
るコード鎖及び相補鎖を含んで成るとトーゾロレラキシ
ンを発現する二重鎖ＤＮＡ断片が提供される。

この発明の他の観点に従えば、ヒトーレラキシンのＡ、
Ｂ及びＣ鎖、又はこれらの鎖の２以上の任意の組合わせ
を個別に発現する遺伝子が提供される。

さらに詳しくは、この発明の上記の観点に従えば、第２
図に示すｍＲＮＡ配列の１〜３２．３３〜１３６、及び
１３７〜１６０のコードンに対応するコード配列及び相
補配列を含んで成り、ヒト−レラキシンのＡ鎖及び／又
はＢ鎖及び／又はＣ鎖を個別に発現する二重鎖ＤＮＡ断
片が提供される。

上記の遺伝子は、特定されたコードンのほかに適当な「
開始」コードン及び「停止」コードン、すなわち、それ
ぞれＡＵＧ及びＵＧＡ（第２図における−２６及び１６
１のコードン）を含むであろう。

当業者はこれらの遺伝子の多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉ
ｃｆｏｒｍｓ）が存在することを認めるであろう。この
ような多形もこの発明に含まれる。

この発明はさらに、前記の配列、サブユニット又は同等
物、及び対応するＲＮＡ配列、サブユニット又は同等物
の相補体をも包含する。

この発明の他の観点に従えば、前記の遺伝子に対応する
デオキンヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ移転ベク
ターが提供される。

前記のごとく、遺伝子コードは冗長性を有する。

すなわち、あるアミノ酸は複数のコードンによりコード
される。従って、この発明は、図に示したコードンが同
じアミノ酸をコードする他のコードンによって筺き換え
られているデオキノヌクレオチド配列を包含する。

さらに、すでに記載したごとく、天然レラキ／ンのＢ鎖
及び／又はＡ鎖と構造を異にし、レラギシン活性を有す
るイプチドを製造することができる。この構造の差異に
は、天然鎖中の１個又は複数個のアミノ酸の除去及び／
又は付加及び／又は＋換が含まれる。

従って、この発明はさらに、天然コードンが除去さｉｔ
ておりそして／又は天然コードンによってコードされる
アミノ酸と異るアミノ酸をコードするコードンにより置
き換えられておりそして／又は天然配列に追加のコード
ンが付加されている前記の遺伝子及びＤＮＡ移転ベクタ
ーをも包含する。

この発明の移転ベクターはさらに、特に、宿主細胞に移
入された場合に自己の複製を保障する遺伝＋報を含有す
る。この宿主細胞には、例えば原核微生物の細胞及び真
核細胞、例えば細菌、酵母、糸状菌の細胞、庸乳動物の
＋泡、及びセルラインが含まれる。

細菌遺伝学において一般て使用される移転ベクターの例
にまプラスミド及びある種のバクテリオファーノのＤＮ
Ａが含まれる。この発明においてはファージＤＮＡ及び
細菌シラスミドの両者を使用した。しかしながら他のタ
イプの移転ベクターを使用することができることが理解
できよう。このような移転ベクターを形成し、そしてこ
れを微生物に導入する一般的な方法はよく知られている
。

この発明はさらに前記の移転ベクターのいずれかにより
形質転換された原核細胞及び真核細胞を包含する。

非常に親しまれているエッセリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が好ましい微生物の１つであ
るが、他の任意の適当な微生物を使用することもできる
。

この発明の他の観点に従えば、ヒトーゾレプロレラキシ
ンをコードするデオキシヌクレオチド配列を、制限酵素
によって移転ベクターを切断することにより調製された
ＤＮＡ力子と連結することを特徴とする、ヒト−グレン
ロレラキンンをコードするデオキシヌクレオナト配列を
維持しそして複製するためこ使用するＤＮＡ拶転ベクタ
ーの製造方法が提供さ＋る。

同様にして、適当なプオキシヌクレオチドから、ヒト一
ノロレラキシンをコードするブオキンヌクレオヂド配列
、並びにヒトーレラキンンのＡ鎖及びＢ鎖をコードする
デオキンヌクレオチド己夕を維持し、そして複製するた
めに吏用するＤＮＡ移転ベクターを調製することができ
る。

Ａベゾナド鎖及びペプチド白、−びにプロレラーノン及
びグレプロレラキンンは、通常の遺伝子発現方法により
、すなわち適切に導入された移転ベクターを含有する細
胞を増殖せしめ、そして該細胞により生産された目的ペ
プチドを分＋し、そして精製することにより製造するこ
とができる。

この発明はさらに、上記の方法により調製された、ヒト
ープレゾロレンキシンをコードするプオヘノノクレメグ
ドを含んで成る発現移転ベクターにより形質転換されだ
細胞を培養することを特徴とする、Ｃ末舵配列としてヒ
ト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列を含みそしてＮ
末端配列として弓亥性又は麿核性蛋白質の一部分を含ん
で成る融合蛋白質の製造方法を包含する。

同様にして、ヒトーデロレンパキシン、並びにヒト−レ
ラキンンのＡ鎖及びＢ知を含んで成る融合蛋白質を製造
することがでびろ。

こうして得られた融合ペプチド生成ｌ吻は、方策のペプ
チドが宿主に持具的な原核性又は共俵住蛋白質の一部に
連結されだ融合房白質の形で存在するであろう。このよ
うな融合蛋白質も又この発明を構成する。

この発明はさらに、前記の方法により調製されり前己の
ヒトーデロレラキンンをコードするデオキシヌクレオチ
ド配列を含んで成る発現移転ベクターにより形成転換さ
れだ細胞を、ヒトーデロレラキンンをコードする前記の
配列の発現に通ずる条件下で培養し、そして前記細胞の
分解物又は培養液からヒト−プロレラキシンを精製する
ことを特徴トスる、Ｃ−プチドにより相互に分離された
Ａペプチド及びＢペプチドを含んでζるヒト−プロレラ
キシンの合成方法をも包含する。

任意の適当な公知の切断方法こより、融合生成物から目
的ペプチドを回収することができる。

すでに記載したごとく、コードンの除去／置換／付加に
より多云ベクターを変形することができ、このようなλ
形こより変形されだ融合ベプグドが生ずる。このように
しても町なえ変形を−うことこより、認合−々チドの切
断、例えばＢ／ＣもしくはＣ／Ａ類結合部における切断
を促進し、又は次に行う化学的もしくは生物学的処理の
間におけるペプチド類の挙動を変えることができる。

前己のごとく、この邑明−さらもヒトーレラキシン、プ
ロレラキシン及びグレゾロレラ−シンをう提供する。

レラキ／ンは、インスリンの製宵のだのに現在知られて
いる任意の方法により別々のＡ頭及びＢ頭を直接結合す
ることにより製餐することができる。

又、インスリンの場合と同様に、＋記のようにして製造
されたレラニンンのＡペプチド及びＢペググド上のスル
ヒドリル左を酸化し、すなわち核Ａペプチド及びＢペゾ
ナド間のノスルフィド架橋に転遍し、てして次にＣペプ
チドを除去することにより、例えはＣベゾチドとＡ及び
Ｂぺプチドとり間の結合に特異的な酵素的力水分解によ
り除去することにより、ゾロレジキシンからレラキシン
を製造することがでさる。

従って、この発明はさらに、／ラキシンのＡ知及びＢ鎖
（元金な長さこおいて、又は短起されたもしくま入形さ
れた形において）と、ヒトーインスリンのＡ霞及びＢ鎖
の結合のために知られている方法に上って結合せしめる
ことから−るヒトーレラキシンの合成方法を提供する。

この方法の１つは、Ｓ−スルホン化さしたＡ類及びＢ鎖
の混曾有を還元し、でして次にこの混合物を空気中で酸
化することから成る。

発明者等はさらに、Ａ鎖及びＢ鎖の一方又は両方がＳ−
スルホ形ではなくＳ−チオエチル−ｃｙｓ誘導体の形で
ある場合に上記方法の効率が改良さすることを見出した
。

発明者等は、オーストラリア特許出願第１５４１３／８
３号（ＰＦ４３８５／８２）において、生物学的活性の
有意な喪失を伴わないでレラキンンのＡ鎖及びＢ鎖の一
方又は両者のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を短
縮することができ、これにより結合収率を改良すること
ができることを示した。

この発明の他の観点に従えば、短縮されそして／又は変
形された天然Ｂペプチド鎖及びＡペプチド鎖により本質
上構成されるヒトーレラキシン類似体が提供される。

この発明の上記の観点に従えば、短縮されそして／又は
変形されたＢペプチド鎖及び／又はＡペプチド鎖を形成
し、そして次に上記の任意の方法によって前記のペプチ
ド鎖を結合せしめる段階を含んで成るヒトーレラキシン
類似体の製造方法が提供さする。

発明者等の研究により、レラキシン活性はＡ（１０〜２
４）から成る類いＡ鎖及びＢ（１０〜２２）からなる短
いＢ鎖により生ずることが示された。もっとも、期待さ
れる最小鎖はＡ（４〜２４）及びＢ（４〜２３）である
。

一般に、Ａ鎖はＡ（１〜２４）ないしＡ（１０〜２４）
の範囲で変化することができ、Ｂ鎖はＢ（１〜３２）な
いしＢ（１０〜２２）の範囲で変化することができる。

好ましい組合わせは、 から誘導される。

この発明におけるＢ鎖及び／又はＡ鎖の変形は、前記の
「遺伝的」変形、及びこの発明の結合に先立つＢ鎖及び
／又はＡ鎖の化学的変形（完全な長さにおける又は短縮
された形における）が含まれる。２つのタイプの変形を
単独で又は組合わせて用いることができる。

第１のタイプの変形は、天然の又は短縮されたＢ鎖及び
／又はＡ鎖における１個又は複数個のアミノ酸の変形に
関する。一般にこのような変形にはそれ目体公知の方法
による１個又は複数個のアミノ酸上の活性左：の保護が
含まれ、そして所望によυ、保護基は（変形された）Ａ
鎖及びＢ鎖の結合の後除去される。

このようなタイプの変形の例には、Ｎ末端アミノ基を含
む遊離アミン基のアセチル化、ホルミル化もしくはこれ
らと同様の保護、Ｃ末端基のアミ）’化、又４−１．ヒ
ドロキシル基もしくはカルボキシル基のエステル形成が
含まれる。

第２のタイプの変形には、Ｂ鎧及び／又はＡ鎖中の１個
又は複数個の天然アミノ酸の他のアミノ酸（Ｄ−型の天
然アミノ酸を含む）による置換が含まれる。

このような変形の目的は、生成物、すなわちレラキシン
もしくはその類似体の活性を維持しなからＡ鎖及びＢ鎖
の結合収率を上昇せしめること、又は所定の結合収率に
おいて生成物の活性を上昇せしめ又は変えることにある
。この上うな変化は、レラキシン遮断効果又はレラキシ
ン拮抗効果を有する合成類似体の製造にも適用すること
ができよう。

第１のタイプの変形の特定の例はポルミル基の付加によ
るＢ２のトリプトファン残基の変形である。

第２のタイプの変形の特定の例は、Ｂ２４のメチオニン
のノルロイシン（Ｎｔｅ）、バリン（Ｖａｔ）、アラニ
ン（Ａｌｍ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）
又はホモセリン（Ｈｏｍｏ　Ｓｅｒ）による置換である
。

上記の観点において、この発明は、この発明に従って上
記のごとく変形されだ天然の又は短縮されたＢ鎖及び／
又はＡ鎖から形成されるヒトーレラキクンを包含する。

Ａペプチド鎖及びＢ−プチド鎖、並びにさらにデロレラ
キンン及びプレプロレラギシンは通常の遺伝子発現法に
より、すなわち適当に形成された移転ベクターを含有す
る微生物を増殖せしめ、そして該微生物により生産され
た目的ぜプチドを分離しそして精製することにより製造
することができる。

こうして得られたペプチド生成物は、目的ペプチドが原
核性蛋白質の一部と連結されている融合蛋白質の形で存
在することができる。

次に、実験方法及びそれにより得られた結果を記載する
ことによりこの発明をさらに具体的に説明する。

Ａ．実験方法 （１）細菌及びツーニオの床 すでに記載されている（７）ように、豚−レラキシンｃ
ＤＮＡ挿入部を含有する組換プラスミド（ｐＢＲ３２２
）の細菌宿主としてＥ．コリＲＲ１を使用した。

ヒトー遺伝子クローンの試料集団はＴ、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）氏から入手した。ヒト−ＤＮＡのＩＩ
ａｅＩＩＩ／ＡｌｕＩ部分分解により得らルだ約１５〜
２０ｋｂの遺伝子ＤＮＡ断片（９）をリンカ−によりλ
ファージＣｈａｒｏｎ４Ａ（１０）にクローニングし、
そしてＥ、コリＬＥ３９２外胞中で増加せしめた。

ファージＤＮＡ　（クローン選択の後）は、１１の培養
液中Ｅ．コリＤＰ５０ｇｕｐＦの溶菌の後に調製した。

ＤＮＡ小断片（ファージＤＮＡの分解により得られたも
の）を、配列分析のためにＭ１３バクテリオファージベ
クターｍｐ７．１、ｍｐ　８及びｍｐ９（Ｊ．メッシン
グ（Ｍｅｓａｉｎｇ）Ｍ授から入手〕にサブクローニン
グし、そしてＥ．ヱフＪＭＩ０１細胞に形質転換した。

（ｉｉ）バイブリド形成プローブ（豚ＤＮＡ）の！先牛
胸腺ＤＮＡの変性されたランダムプライマー（３又は４
塩基）を用いて種々のＤＮＡ断片上でプライム合成を行
うことにより放射性標識プローブを調製した（１１）。

豚−ＤＮＡテングレート（１００〜２００ｎｇ）をラン
ダムグライーと共に２０μｌの水中で２分間煮沸するこ
とによシ震注しこ。５０ｍＭトリス−ＨＣｔ（ｐＨ８，
０）、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＭｇ
ｃｌ２、５−−−ト（Ｕ）のＥ、ニアＤＮＡポリメラー
ゼ１、それぞれ５００μＭずつのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ、及び０、３μＭα−〔３２Ｐ〕−ｄＡＴＰ〔
約３０００Ｃ１／ｍｍｏｌ。

アマ−ジャム（Ａｍａｒｓｈａｍ））を含有する反応混
合物３０μｌを加えることによシ合成を開始した。

３７℃にて３０分間インキ−ベートした後、０．３＋Ｎ
ａＣ４，１０ｍＭトリス−Ｈｃｔ（ｐＨ８，Ｑ）、１ｍ
ＭＥＤＴＡを含有する緩衝液３００μｌにより稀釈する
ことにより反応を停止し、そして同じ緩衝液中セファデ
ックス−Ｇ５０カラム（１ａｎ×５ｃｒｎ）を通過せし
める。放射性標識グローブをボイドポリウム（ｖｏｉｄ
　ｖｏｌｕｍｅ）におけるピーク分画から集め、セして
担体としてｔＲＮＡ（１０μｇ）を用いながら２容量の
エタノールにより、−２０℃にて２時間沈澱せしめた。

（ｉｉｉ）スクリーニング法 遺伝子ＤＮＡ断片を含有するλフアージをソフトアガー
上、直径１３ｍのプレート当り約１０５フアージの密度
で増殖せしめ、そしてベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）及びデ
ービス（Ｄａｖｌｇ）の方法（１２）によりニトロセル
ロース渕紙〔シュライカ−アンドシェル（５ｃｈｌｅｌ
ｅｈｅｒ＆５ｅｈｕｌｌ）ＢＡ８５］に移した（１２）
。濾紙を、５ＸＳＳＣ及び２５チポルムアミドを含有す
る改変されたテンハート（Ｄｅｎｈａｒｔ）の溶液中で
４０℃にて１８時間、放射性標識グローブと共にバイブ
リド形成せしめた（１３）。濾紙を、２ＸＳＳＣ中で３
０℃にて１時間洗浄し、その後で２４時間にわたりＸ−
碌フィルム（コダックＸ５−５）を露光せしめた。プレ
ートのバイブリド形成陽性の領域−培養し、そして単一
の陽性プラグが得られるまで再スクリーニングを行った
。１ｌの培養液中のＥ．コリＩＤＰ５０ｓｕｐＦ細胞が
溶菌した後にファージを回収し、そしてマニアチス（１
０）、及びヤマモト及びアルバート（Ａｌｂｅｒｔｓ）
（１４）の方法に従ってＤＮＡを調製した。

（ＩＶ）ＤＮＡ配列分析 選択さねた組月ファーノの制限断片を、ファージＭ１３
ｍｐ８のＥｃａＲ１、ＰａｔＩ又はＳｍａ１部位に直接
勺ブクローニングした。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
Ｂ、０）、１０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ
ＡＴＰ、１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ（１００ｎ
ｇ）及びＭ１３ファージベクター（５０ｎｇ）を含有す
る反応液２０μｌ中で連結を行った。４０℃にて一夜イ
ンキュペートシた後、組換ＤＮＡをＥ、コリＪＭ１０１
細胞に形質転換した（１５）。

遺伝子スクリーニングについて前記したのと同様にして
コード領域を含有するプラクを選択した。

但し、Ｍ１３ファージを低い密度（１０５フアージ／９
ｃｎ直径のグレート）でプレートした。陽性プラクを増
殖せしめ、単鎖テンプレート形又は筏製可能な二重鎖形
（ｒｆ）を調製した（１５）。単鎖テンプレートの配列
を、Ｍｌ３−特異的プライマー（コラボラティゾリザー
チ）又はコード領域の種種の配列に相補的な合成プライ
マーを用いてサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等の方法（１６
）に従って直接決定した。サブクローンの完全配列分析
は、種々の制限酵素を用いてｒｆ形を複莢の部位で切断
し、次に平滑末端連結によりＭｌ３にサブクローニング
し（１５）、あるいは断片を直接に末端標識し、そして
マクサム及びシルバードの方法（１７）によシ配列決定
することにより行った。ＤＮＡ配列を分析し、そしてコ
ンビーータを用いて豚及びラットのレラキシン配列と比
較した（１８）。

Ｂ、結果 次に、図面を用いて検討する。

第１図は遺伝子クローンの制限酵素地図の概略を示す。

大きさをキロ・塩基対（ｋｂ）で示し、そして切断部位
をＥｃｏＲＩ（Ｒ）、ＰｓｔＩ（Ｐ）、及びＨｐａＩＩ
（Ｈ）として示す。遺伝子クローンλＨ５はＣぺデチド
（エクソン■）中のＡｌｕ１部位に付加されたＥｃｏＲ
Ｉリンカ−に末端を有する。コード領域を含む最終的な
ヌクレオゲト配列は、遺伝子クローンλＨ７から次のよ
うにして編集した。すなわち、ＥｃｏＲＩ及びｐｓｔＩ
片をＭ１３ｍｐ８にサブクローニングし、そして次に （１）Ｍ１３テングレート上で直接配列決定する〔第１
図中破線（−−−−）で示されている〕、（２）合成ヌ
クレオチドプライマーを用いて直接配列決定する〔点線
（・・・・・・）で示されている〕、（３）ＤＮＡ断片
を末端標識し、そして化学的分解によシ配列決定する〔
実線（―）で示されている〕、 のいずれかを行う。配列決定に使用したプライマーは（
ａ）５’ＴＴＣＧＣＡＡＴＡＧＧＣＡ及び（ｂ）５’Ｇ
ＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＴである。

第２図はヒトーレラキシン遺伝子のコード領域を示す。

ヒトープレデロレラキシンのアミノ酸配列及びｍＲＮＡ
配列（上段）と豚−レラキシンの配列（下段）との比較
を第３図に示す。同一部分が最大になるように配列を配
置してあシ、ヌクレオチドが同一である部分がスター印
により示されておシ、そしてアミノ酸が同一である部分
が節で囲んである。アミノ酸にはＢ鎖の出発部位から番
号が付しである。エクソン／イントロン／エクソン境堺
におけるイントロン配列は小文字でＤＮＡ表記されてい
る。

（１）遺伝子クローンの分離及び特色性は第３図に示す
Ｃペプチド中のアミノ酸４５〜９５に対応する豚しラキ
シンｃＤＮＡクローンの短い（１５０ｂｐ）断片から作
られたプローブ（７）によシ試料集団をスクリーニング
することによυヒトー遺伝子クローンを同定した。この
断片を、Ｈｐａｌｌ及びＨｌｎｆＩによる分解によって
クローンから切り出し、そしてラット及び豚のレラキシ
ン配列の間で最大の相同性のある領域（ヌクレオチドレ
ベルにおいて７１チ）と対応した。遺伝子クローン試料
からλＨ５及びλＨ７と称する強い陽性を示すファージ
を分離した。これらの陽性クローンを、それぞれ５′及
び３′エクソン領域（エクソンＩ及びエクソン■と称す
る）に特異的な２つの別々の豚−レラキシンｃＤＮＡの
断片をプローグとして使用して制限酵素分析によりさら
に特徴付けを行った。２つの断片は、相同のう、トーレ
ラキシン遺伝子（６）におけるイントロン領域に文応す
る（砿塩基以内）単一のＨｐａＩＩ部位において啄しラ
キ／ンｃＤＮＡクローンを接断することにより生じた。

λＨ５及びλＨ７のサザン・プロット分析により、ヒト
ーレラキシン遺伝子のコード領域は３．４ｋｂの単一の
イントロンにより中断されていることが示された（第１
図参照）。

（ｉｉ）遺伝子クローンの配列分析 λＨ５及びλＨ７の完全制限分解物をＭ１３ベクターに
サブクローンし、そしてエクソン■及びエクソンＩＩに
特異的な豚−レラキシンプロープを用いてスクリーニン
グした。陽性のサブクローンの配列を、方法の部〔前記
Ａ（ｉｖ）］に記載した技法を組合わせて用いることに
より決定した。

λＨ７クローンのエクソン■部位は、Ｃ−プチドのＥｃ
ｏＲ１部位から始まりＡ鎖の全コード領域を通って停止
コードンに続＜２．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片に含まれてい
た（第１図参照）。Ａ鎖付近の領域に特異的なヌクレオ
チドプライマーを合成することによりこの断片の配列決
定は相当に容易になった。このプライマーは、全２．０
ｋｂ断片を含有するＭ１３テンプレート上に直接プライ
ムするのに使用した。エクソンＩＩ中の残すの５３ｂｐ
のＣＫペプチド含有するサブクローンされたＥｃｏＲＩ
断片はプローブとして豚ｃＤＮＡを用いて同定すること
ができなかった。この領域をきむ配列は、完全々エクソ
ンＩＩ領域を含むλＨ７からのサブクローンされたＰｓ
ｔＩ断片により決定した。

λＨ５のエクソンＩＩ領域の配列決定により、この領域
がＣペプチド中のλＨ７の場合と同じＥｃｏＲＩ部位か
ら始まるが、遺伝子試料集団の形成の過程でもとの遺伝
子ＤＮＡ中のＡｌｕＩ部位に付加したＥｃｏＲＩリンカ
ーにおいて終るきわめて短い７０ｂｐの断片であること
が判明した。従ってλＨ５はレラキンン遺伝子の不完全
なりローンであることが明らかとなシ、以後分析を行つ
なめつた。

エクソンＩの配列分析は、シグナル−！！−中にＥｃｏ
ＲＩ部位が存在するためわずλに々住となシ、２つのＥ
ｃｏＲＩ断片のサブクローンの自己を別々に決定する必
要があった。ＥｃｏＲｉ音位の重複が、重複配列を含む
λＨ７からのＡｌｕＩ断片のサブクローンの同定によシ
支持された。

Ｃ．変性されたヒト−レラキシン（ｈＲＬＸ）Ａ（１〜
２４）−Ｂ（１〜２５）の合成 （ｉ）ヒト−レラキシンＡ鎖，ｈＲＬＸＡ（１〜２４）
の合成 前記の遺伝子クローンのヌクレオチド配列から推定さノ
だヒトーレラキシンＡ鎖の１〜２４の残基に対応するア
ミノ酸配列を、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｌｅｌｄ
）［例えば、パラ＝−（Ｈａｒａｎｙ）Ｇ、及びメリフ
ィールドＲ，Ｂ、、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ。

Ｅ、Ｇｒｏｓｓ及びＪ、Ｍｅｌｅｎｈｏｆｅｒ、アカデ
ミツク・プレス、ニューヨーク、１〜２８４頁、１９８
０年〕により記載されだ一般的原理による固相法により
合成した。

Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル＊−４−メ
チルペンツルーム−システィン（＊ＢＯＣト略す）を、
タム（Ｔａｍ）？の方法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１２．９
５５〜９５７．１９７９年）を用いて、フェニルアセト
アミドメチル（ＰＡＭ）結合を介して１％架橋ポリエチ
レン樹脂に、０．３０ミリモル／ｇ樹脂のレベルでカッ
プリングせしめた。ＢＱＣ−Ｌ−ＣＹＳ−ＰＡＭ樹脂（
８，０ｉ）を、ベックマンモデル９９０ベプチドシンセ
タイザーの反応容器に入れ、そしてそれぞれ適当な保護
アミノ酸を段階的に付加することによって残基２３から
１までのアミノ酸配列を組み立てた。各アミノ酸のアミ
ノ末端ＢＯＣ保護基は、塩化メチレン中３５％トリフル
オロ酢酸により３０分間樹脂を処理し、そして次に、塩
化メチレン中５％ジイソプロビルエチルアミンにより１
５分間中和することによシ除去した。それぞれの処理の
後、塩化メチレンによシ樹脂を十分に洗浄した。配列中
の次のアミノ酸（α−アミノ基がＢＯＣ基により適当に
保護さ！でおり、必要により側鎖官能基が適当に保護さ
れている、）を、ジノクロへキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣ）を使用しながら樹脂にカップリングせしめた。樹
脂を塩化メチレン中アミノ酸と共に１０分間攪拌し、そ
の後で塩化メチレンに溶解したＤＣＣを導入した。

各カップリングのために２．５モルの過剰量（６，０ミ
リモル）のアミノ酸及びＤＣＣを使用した。１＋間攪拌
した後、反応混合物から樹脂のサングルを取り出し、そ
してカイゼル（Ｋａｉｓｅｒ）等のニアヒドリン法（Ａ
ｒａ１．Ｂｉｏｅｈｅｍ、、３４，５９５〜５９８．１
９７０年）を用いて遊離アミン基の存在を試験した。ニ
ンヒドリン反応が陰性であってカップリングが完結した
ことが示されれば、ＢＯＣ脱保護、中和及び次のアミノ
酸のカップリングによって反応サイクルを継続した。ニ
ンヒドリン試験陽性の場合には追加のアミノ酸及びＤＣ
Ｃを用いてカップリング反応を反復した。

側鎖官能基を有するアミノ酸は次の保護誘導体として使
用した。すなわち、Ｎ−α−ＢＯＣ−２．６−シクロロ
ペンジルーし−チロシン、Ｎ−α−ＢＯＣ−ξ−クロロ
ペンシルオキシカルボニル−Ｌ−リノン、Ｎ−α−ＢＯ
Ｃ−Ｌ−セリン０−ベンシルエステル、Ｎ−α−アミル
オキシカルボニル−ＮＧ−トシル−Ｌ−アルギニン、Ｎ
−α−ＢＯＣ−Ｌ−スレオニンＯ−ベンジルエーテル、
Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｓ−エチルメルカプト−Ｌ−システィ
ン（Ａ−鑵配列位陥１５．１１及び１０のシスティン）
、Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンツルエ
ステルである。

１〜２４ペプチド配列の組立てに続き、アミノ末端アル
ギニン上の最後のＢＯＣ基を、脱保護中和サイクルを用
いて除去し、そして真空中でペプチド樹脂を乾燥した（
ペプチド−←脂の重量１７．０ｇ）。ペプチド−樹脂の
一部分（２ｇ）を、アニソール（２ｍｌ）や存在下で０
℃にて３０分間無水弗化水素（ＨＦ）により処理した。

オイルポンプ真空下で急速に除去することにより、樹脂
−ペプチドと弗化水素（ＨＦ）との合計接触時間を最小
（７０分以下）に保持した。次に、樹脂−ペプチドを酢
酸エチルにより数回洗浄することにより過剰のアニソー
ルを除去し、１Ｍ酢酸によりペプチドを抽出し、そして
溶液を凍結乾燥した。粗ペプチド（１０，１１及び１５
位のシスティンはなおＳ−チオエチル誘導体として保護
されている）の収量は４４０ｍ９であった。粗硬ゾチド
の最初の精製は０．１Ｍ酢酸中ぐイオダルＰ１０を用い
るグルろ過によシ行った。分子蓋約３０００に対応する
位置でカラムから浴出した最大ピークを示す分画をシめ
、そして諏結乾朦した。このペプチドのサンプルのアミ
ノ酸分析により、１〜２４配列のすべてのアミノ酸が正
しい比率で存在することが示された。

［Ｓ−チオニチルＣｙｓ１０、１１、１５〕−ｈＲＬＸ
Ａ（１〜２４）ペプチドの前記以後の精製は、ウォータ
ーズＣ−１８＋ンダノツクンラムを用いる調製用逆相Ｈ
ＰＬＣによシ、０．１％ＴＦＡ−水／アセトニトリル浴
剤禾を用いて行った。

ケルろ過より嗣製したープチドのサングル（１６０ｍｇ
）ｋ、ドウ（Ｄｕ）％（ＳｃｉｅｎｔｉａＳｉｎｉｃａ
、１０１、８４〜１０４　（１９６１年）〕に記載され
た方法に促って、亜値岐ナトリウム反ひナトリウムテト
シチオイ−トの混合物に用いて（合ば反応時間を３時間
として）Ｓ−スルポン化した。

Ｓ−スルホン化中に生成した沈澱をろ遍し、そして沈澱
及び上濯液の両者を４℃にて１８時間蒸留水に対して透
析した。透析説の内容物を凍結乾燥することにより、上
置＆から８１．４ｍｇ、Ｓ−スルホン化反応中に生じた
沈−から５３．２ｍｇのペプチドを得た・「可溶性」〔
８−スルホＣｙＳ１０・１１・１５・２４〕ｈＲＬＸＡ
（１〜２４）ペプチドのサンプルをトリス−ＨＣ１緩価
漱（ｐＨ８，３）中ＤＥＡＥ−セルロースを用いるイオ
ン交換クロマドグラフイーにより精製した。トリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝故中ＮａＣｌ直線勾配（導電率範囲３．ｏｍＳ
〜８５．０ｍｓ）によｐカラムからペプチドを浴出した
。導電率２０〜３０ｍｓにおいてイオン交換カラムから
浴出する大ピークを示す分画を透析し、そして凍結乾床
によりペプチドを回収した。

（ｉｉ）短縮されたヒト−レラキシンＢ−鎖、ｈＲＬＸ
（１〜２５）の合成 ヒトーレラキシンＢ−鎖の１〜２５の配列に対応するア
ミノ酸配列を前＝の方法に矢って合成した。この合成は
、０．１ミリモルＳｅｒ／ｇの貝荷量のＮ−α−ｔｅｒ
ｔ−ブチルオキシ力ルボニルー０−ベンツルーし一セリ
ンーフェニルアセトアミドーメチルポリスチレン仙脂７
．０ｇを用いて開始した。

Ａ鎖の合成において便用した！鎖保護基を、保護の合成
にも使用した。これには１０及び２２位の両ンステイン
のＳ−エチル誘導体が含まれる。４及び５位のアスパラ
ギン酸はＮ−α−ＢＯＣξ−ベンジルエステル訪導体と
して加えた。１８位のグルタミンはＤＭＦ中のＮ−α−
ＢＯＣ−Ｌ−グルタミンーｐ−ニトロフェニルエステル
ヲ用いル活性エステル法によシカツブリングせしめた。

２位のトリプトファンのカップリングの後、トリフルオ
ロ酢酸脱保映剤及びこれに次いて用いる塩化メチレン抗
浄液に０．１％インドールを加えた。

アミノ末端リジン残基からＢＯＣ基を除去しそして真空
乾燥した後のペプチド−樹旨の最終重量は１２．２ｐで
あった。ペプチド−樹脂の一部（５ｇ）を、アニソール
（２ｍｌ）の存在下、０℃にて３０分間無水弗化水素で
処理し、そしてＡ鎖について前記した方法番用いてＢ鎖
ペゾチドを分離した。

粗〔Ｓ−チオエチルＣｙｍ１０”２２］ｈＲＬＸＢ（１
〜２５）（１，４０ｇ）を、０．１Ｍ酢酸中バイオダル
Ｐ１０によシグル濾過することによシ精製し、次に試製
用ＨＰＬＣにより処理した。

グル一過により精製したペプチドのサングル（１５０ｍ
ｇ）を、ｐＨ８．３において３時間３−スフホン化し、
反応混合物を一過し、そして沈澱及び上澄准を蒸貿水に
対して透析した。凍結乾燥後、９２ｍｇの「町浴性」ペ
プチド及び５５ｍｇの「不耐性」ペプチドが回収された
。Ｓ−スルホン化Ｂ鎖ベグチドを、Ｃ−１８逆相カラム
及び０．１％ＴＦＡ−水−アセトニトリル溶剤系を用い
る調製用ＨＰＬＣによシさらに精製した。

（ｌｌｉ）鎖の結合 合成ｈＲＬＸＡ（１〜２４）及びｈＲＬＸＢ（１〜２５
）ペプチドを、チャンス（Ｃｈａｎｃｅ）及びホフマン
（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）によジインスリンについて記載さ
れた方法（オーストシリア特＋出願第６８８４４／８１
号）を用いて結合せしめた。この方法においては、Ｓ−
スルホン化ペプチドを、Ａ：Ｂ＝２：１の比率で、ペプ
チドの濃度？グリシン緩衝液（Ｆ＃１０，５）中１０ｍ
ｙ／ｍｌとしテ混合シタ。次ニ、グリシン緩衝液中ジチ
オスレイトールを、各Ｓ−スルホ基について合計１．０
のスルヒドリル基が生ずるふにおいて加えた。次に、反
応混合物−開放容器中で２４時間攪拌した。

発明者等は、この方法の前記以外の変法として、ペプチ
ド鎖の一方又は好ましくは両方を、インスリンの場合に
ついてチャンス及びホフマンにより己載烙れたＳ−スル
ホ形（前記）ではなくＳ−チオエチル−Ｓｙａ誘導体し
て使用することにより、生物学的に占性なレラキシンを
生成ぜしめるだめの鎖結合反応を効果的に行うことがで
きることを見出した。Ｓ−チオエチルＣｙｓペゾチドの
使用により、ペプチドをＳ−スルホ誘導体に転換するの
に必戟な反応及び絹製段階が必要でなくなる。発明者等
の経験によれば、レラキシンペプチドのＳ−スルホン化
反応にはＳ−スルホペプチドの和製を困ムにする傾向を
有する副反応カ伴い、これにより収％が低下する。

上記の条件を使用すれば、ウィックピスト（Ｗｌｑｖｌ
ｉｔ）及びパウル（Ｐａｕｌ）（Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏ−
ｅｒｉｎｏｌ、、２８、１３５〜１３６、１９５８）の
ラット子宮収縮測定における生物学的活性により測定し
た場合０．２４〜３．１％の鎖結合収率が達成された。

鎮結合反応の例 ヒトーレラキシン［Ｓ−チオエチルＣｙｓ１０、１１、
１５］Ａ（１〜２４）（乾鍼重量３．６ｍｇ、アミノ酸
分析によるペプチド重量２．０ｈ、０．６８μモル）を
、３ｍｌのプラスチック製蓋伺き遠心チューブ中で２０
０μｌの０．１Ｍグリシン緩＠液（ｐＨ１０．５）ニ溶
解した。ヒトーレラキシン〔Ｓ−スルホｃｙｓ１０．１
１）Ｂ（１〜２ｓ）（１，８６ｍｇ、アミノ酸分析によ
るベグチド量Ａ１．０ｍｇ、０．３３μもる）を１００
μｌの０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０，５）中に溶
解し、ぞしてこれを前記の俗故に加え、そして混合物を
攪拌した。０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０，５）中
に調製したジチオスレイトール（ＤＴＴ）のス）ツク溶
液（１０ｍｌ中１．１５μモルＤＴＴ）のアリコート（
１５，２μｌ、１．７３μモルＤＴＴ）をペプチド溶液
に加え、そして短時間攪拌した後、反応混合物を空気に
開放して４℃にて２４時聞靜置シた。

明細！の篤−（内容に変更なし） 次に混合物を遠心分離し、そして上澄液のアリコートの
レラキノン生物学的活性をラット子宮収縮測定により＋
定した。反応混合物のアリコートは、投与−Ｋ依存して
ラットの子宮の自発収縮を阻害した。７５μｔのアリコ
ートにより子宮収縮が完全に哨害され、これは、天然豚
−レラキシンＡ２２Ｂ３１標準と比較した場合０．７０
％の鋲結合収率に相当する。

ＨＩ−遺伝子配列に基づく他の合成ヒトレラキノンペグ
チド 次表中に掲げた合成シラキシン４プチドを、第２図に示
したＨＩヒトレラキシン遺伝子配列から誘導されるＡ鎖
およびＢ鎖に対するアミノ酸配列から調製した。別々の
ペプチド鎖を調製し次いでＡ（１−２４）およびＢ（１
−２５）ペプチドに対し先に説明した手順に従って精製
した。Ｂ（３−２５）アミドおよびＢ（１−２５）アミ
ドペプチドに対し、これらの手順の変法を用いたが、こ
の際ＰＡＭ樹脂結合をベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）
ポリスチレン樹脂に置き代えた。ＢＨＡ樹脂を用いると
、遊離カルボキン形よシもむしろアミド形のＣ−末端を
有するペプチドが形成する。

的に言及しない限シ、鎖結合反応はＳ−チオエチルＣｙ
ｓ誘導体としてのＡ−鎖及びＳ−スルホＣｙａ誘導体と
してのＢ−鎖を用いて先に説明した如く行った。

次表中の全ての合成同族体は、ラットの子宮収縮測定に
おいてレラキシン一様生物学的作用を示しだ。別々のペ
プチド鎖の結合収率は、基準として天然の豚しラキシン
Ａ（１−２２）−Ｂ（１−３１）を用いるバイオアッセ
イの結果から計算した。

合成ＨＩヒトレラキシン同族体　　　　　　　　　　　
　　　結合収率　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　（Ｂ−鎖量基準）Ａ（１−２４
）＋Ｂ（１−２３）　　　　　　　　　　　　　　　　
０．２４＆Ａ（１−２４）＋Ｂ（１−２５）　　　　　
　　　　　　　　　　　０．７０％Ａ（１−２４）＋〔
Ａｌ２４ａ〕Ｂ（１−２６）　　　　　　　　　　０．
９２％Ａ（１−２４）＋Ｂ（１−３２）　　　　　　　
　　　　　　　　　２．００＆Ａ（１−２４）＋Ｂ（１
−２５）アミド　　　　　　　　　　　　　０．８０＆
鎖結合反応のために両鎖がＳ−チオ エチル形を有するＡ（１−２４）　　　　　　　　　　
　　　　３．１０％＋Ｂ（１−２５）アミド Ａ（１−２４）＋Ｂ（３−２５）アミド　　　　　　　
　　　　　　０．６８＄Ａ（１−２４）＋（Ｎ−ホルミ
ルＴＲＰ２）Ｂ（２−２５）　　　０．４３％文献 １、Ｈｉｓａｗ、Ｆ、Ｌ、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、
Ｂｌｏｌ、Ｍｅｄ。

２３．６６１−６６３（１９２６）。

２、Ｓｃｈｗａｂｅ、Ｃ，、ＭｃＤｏｎａｌｄ、Ｊ、Ｋ
、及びＳｔｅｉｎｅｔｚ、Ｂ、Ｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、７５，５０３−５１０（１９７
７）ｃ３、Ｊａｍｅｓ、Ｒ．、Ｎ１ａｌｌ、Ｈ．、Ｋｗ
ｏｋ、Ｓ−及びＢｒｙａｎｔ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｇ
、Ｎａｔｕｒｅ、２６７、５４４−５４６（１９７７）
。

４、Ｊｏｈｎ、Ｍ、Ｊ、Ｗａｌｓｈ、Ｊ、Ｒ、、Ｂｏｒ
ｊｅｓｓｏｎ、Ｂ、Ｗ、及びＮ１ａｌｌ＋Ｈ，Ｄ、Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１０８．７２６−７２９（１９
８１）。

５、Ｓｃｈｗａｂｅ、ｃ、、Ｇｏｗａｎ、Ｌ、Ｋ、及び
Ｒｅｌｎｉｇ、Ｊ、Ｖ、＋Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、３８０、６−１２（１１８２）。

６、Ｈｕｄｇｏｎ＋Ｐ、＊ａｌｅｙ、Ｊ、、Ｃｒｏｎｋ
、Ｍ．、Ｓｈｉｎｅ、Ｊ、及びＮ１ａｌｌ、Ｈ、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２９１、１２７−１３１（１９８１）。

７、Ｈａｌｅｙ、Ｊ、、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｐ、、Ｓｃａｎ
ｌｏｎ、Ｂ、ＩＪｏｈｎ、Ｍ、、Ｃｒｏｎｋ、Ｍ、、ｓ
ｈ１ｎｅ、Ｊ、、Ｔｒｅｇｅａｒ、Ｇ、及びＮｉａｌｌ
、Ｈ，ＤＮＡ１。

１５５−１６２（１９８２）。

８、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ、Ｏ，、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｒ
，Ｍ、、Ｃｈｅｈ、Ｈ、Ｒ．、Ｈｕｎｔ、Ｌ、Ｔ、Ｂａ
ｒｋｅｒ、Ｗ、Ｃ，及びＯｒｃｕｔｔ、Ｂ、Ｃ，ＤＮＡ
１．５１−５８（１９８１）。

９、Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｍ．、Ｆｒｉｔｓｅｈ、Ｅ、Ｆ、、
Ｐａｒｋｅｒ、Ｒ，Ｃ，Ｂｌａｋｅ、Ｇ、及びＭａｎｉ
ａｔｉｓ、Ｔ、Ｃｅｌｌ、１５、１１５７−１１７４　
（１９７８）。

１０、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、。Ｈａｒｄｌｓｏｎ、Ｒ
，Ｅ．、Ｌａｅｙ。

Ｅ、、Ｌａｕｅｒ、Ｊ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、Ｃ．、
及びＱｕｏｎ、Ｄ、Ｃｅ１ｌ１５．６８７−７０１（１
９７８）。

１１、Ｔａｙｌｏｒ、Ｊ、Ｍ．、Ｉｌｌｍｅｒｇｅｅ、
Ｒ，、及びＳｕｍｍｅｒｓ＋Ｊ、Ｂｉｏｃｈｌｎ．Ｂｉ
ｏｐｈｙａ、Ａｃｔａ４４２、３２４−３３０（１９７
６）。

１２、Ｂｅｎｔｏｎ、Ｗ、Ｄ、及びＤａｖｉｓ、Ｒ，５
ｃｉｅｎｃｅ１９６、１８０−１８３（１９７７）。

１３、Ｄｅｎｈａｒｄｔ、Ｄ、Ｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、２３．６４１−
６４６（１９６６）。

１４、Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｋ、Ｒ，及びＡｌｂｅｒｔｓ
＋Ｂ、Ｍ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４０．７３４−７４４（１
９７０）。

１５、Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．、Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ．Ｒ．
、Ｂａｒｒｅｌｌ、Ｂ、Ｇ、、Ｓｍｉｔｈ、Ａ、Ｊ、Ａ
、及びＲｏｅ、Ｂ．Ａ。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１４３．１６１−１７８（１９
８０）。

１６、Ｓａｎｇｅｒ。Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、及び
Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｎ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃ１．７４、５４６３−５４６７（１９７７）。

１７、Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ．及びＧ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、
Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｎ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、７４．５６０−５６４（
１９７７）。

１８、Ｓｔａｄｅｎ、Ｒ，Ｎｕｃｌ、Ａｅｌｄｓ、Ｒｅ
ｓ、６、２６０１−２６１０（１９７９）。

４、図川の司耳な兄明 ↓１凶は２つの遺伝子クローンの制限酵累地図を示し、
第２図はヒトーレラキシン遺伝子のコード領域すｍＲＮ
Ａ配列及びヒト−プレプロレラキシンのアミン倣己列合
示し、そして第３図はヒト−プレプロレラキシン及びｍ
ＲＮＡと豚−プレプロレラキシンの対応する配列との比
較を示す。

特許出願人 ハワード　フローレイ　インスティテユト　オブイクス
ミリメンタル　フィジオロノー　アントメディシン 特許出願代理人 弁理士　青木朗 弁理士　西舘和之 弁理士　幅木槓 弁理士　山口昭之 弁理士　西山雅也 第１頁の続き ＠発　明　者　ヒユー・ティヒツト・ナイアルオースト
ラリア国ヒクトリア・ エルウッド・ベンデイゴ・アベ ニュ３ ０発　間者　　ジエフリー・ウィリアム・トリーガー オーストラリア国ビクトリア・ オースオールン・オースオール ン・グローブ６２ 手続補正書ｃ方式） ％式％ ２、発明の名イ４． １′１・−しう１シンた）″を伝７ ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　　ノツード　フローレイ　・ｆン２ティｉニド　
刊プイクヌベリメンタル　フィシ７１ｒｚジー　アン］
メライシン ４、代理人 氏名４１埋士（６５７９）青水　　　朗１！　ｉｉ、＋
、１’、　ｊ（外　４　名） ５７山正６古令の８４寸 ＨＩ＋　ｉｌｌ　５８年１１月２９日Ｃ発送１３）６、
　　ｔｉｎ正の対象 （３１明細′ｆｔｊ　５　Ｆｉ頁］へ５）（２）　ＩＱ
面 ７、　補正の［〕容 （１１明９１１１判の浄ｙｒ　＋内容Ｖｔ、匹現なし）
＋２１　’　ＩＷ而の汀すＩ＋　１自著にト：用なＥ、
１８、添イ１ｌｌｒ４〆１のｒ＋ｔ’＋ （１）　　浄ｔｌ　Ｑ’ｌ絆ｌ、Ｌｊ　（ルー１〜４）
　　　　　　　１曲（２）浄書図面　　　　　　　　　
　　　　ｌフ１１’Ｊ”−１ｊ’＝：　ンｉ１ｉ　、ｉ
ｌ王Ｔ’１’　　（自’２）昭和５８年１１月Ｃｉｕ 特Ｒ’ｒ庁貝１°−’　ｆ’ｒ杉ｆｌｌ　人ＦＪ１、　
１（＋’ｌの表示 昭和５）（シ「１冒°１願第１４６７６　ｔｉ号２、　
発明の名称 ヒ１−【・ラキー／ン逍伝了 ３、　　ｒ＋Ｉｉ　＋ＩＸを′４るスｆ′ｌτ件との関
係　　　特許出願人 名（！ド　・＼ソー１　ソ１１−レ−Ｖ（ンステイテη
、１：４°］　　Ｃりニア、ペリメン′タノ１　　ソイ
−；」ＩＩノ′°ｊン１　メーアぜノニ／ ４．１（、理Ｊ ｆｌ’、　ＦＪｉ　　ｒ　ｌ　ｆ＋５東京都汲ｌ’、　
虎／閂　１’　Ｌｌ　ｌ＋　７１１　Ｉｆｆ　号（−３
′１４名） ５．１市１１　　の９１３− 明２１１１　ｉ’ｉ　ｔｈ　ｌ　ｆＱ　門１”　ｎ’（
’　ｆｌｉｔ　’＋　５１＋’、　’、！ＩＩ　ｌ　”
　間１’ｉ、　　？ｌＴｉ正の内容 （１）　　明ｔｌｌｌ　ｔ’、ｉ第４３０７ｆ５Ｈｉｔ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトープレプロレラキシンを発現する遺伝子もしく
   はそのサブユニット、又はこの配列もしくは該サブユニ
   ットの同等物。 ２、次の完全ｍＲＮＡ配列、すなわち に対応するコード鎖及び相補鎖を含んで成ることを特徴
   とするヒトープレゾロレラキシンを発現する二重鎖ＤＮ
   ＡＵＴ片もしくはそのサブユニット、又はこの配列もし
   くは該サグユニットの同等物。 ３、　ヒトーグロレラキノンを発現する遺伝子又は該遺
   伝子の同等物である特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
   のサブユニット。 ４、次のｍＲＮＡ配列、すなわち、 に対応するコード鎖及び相補鎖を含んで成ることを特徴
   とするヒトーゾロレラキシンを発現する二重鎖ＤＮＡ断
   片又はこの配列の同等物である特許請求の範囲第２項記
   載の二重鎖ＤＮＡ断片のサブユニット。 ５、シグナルベグチド鎖、Ａペプチド鎖、Ｂペプチド鎖
   もしくはＣペプチド鎖、又はこれらの鎖の２以上の任意
   の組合わせを個別に発現する遺伝子である特許請求の範
   囲第１項；；ピ栽の遺伝子のサブユニット。 ６、次のｍＲＮＡ配列、すなわち のいずれかのｍＲＮＡ配列、又は複数のｍＲＮＡ配列の
   組合わせに対応するコード鎖及び相補鎖を含んで成るこ
   とを特徴とし、ヒトープレプロレラキシンのシグナルペ
   グチド鎖、Ａペプチド鎖、Ｂペプチド鎖もしくはＣペプ
   チド鎖、又はこれらの鎖の２以上の任意の組合わせを発
   現する二重鎖ＤＮＡ断片、又はこの配列の同等物である
   特許請求の範囲第２項記載の二重鎖ＤＮＡ断片のサグユ
   ニット。 ７、グローブとして、豚しラキシン遺伝子もしくはその
   サブユニット、又はヒトーレラヤシン遺伝子のサラユニ
   ットを使用することを特徴とするヒトもしくは他の霊長
   類又は類縁種の染色体レラキンン遺伝子の分離方法。 ８、グローブとして、Ｃ−ξグチドのアミノ酸４５〜９
   ５に対応する次のヌクレオチド配列、すなわち を有する豚しラキシンｅＤＮＡ断片を使用シテヒトー遺
   伝子クローンを選択することを特徴とするヒトープレプ
   ロレラキシン発現遺伝子もしくはその同等吻の製造方法
   。 ９、ヒトールゾロレラキンン発現遺伝子もしくはそのサ
   ブユニット又は該遺伝子もしく＋該サブユニットの同等
   物て対しするｃＤＮＡデオギシヌクレオチド配列を含有
   するＤＮＡ移転ベクター。 １０、１もしくは複数の天然コードン又はこれらと同等
   のｃＤＮＡが同じアミノ酸をコードする他のコードンに
   よって置き換えられている特許請求の範囲第１項−第６
   項のいずれか１項又は第９項記！の遺伝子又はＤＮＡ移
   転ベクター。 １１．１又は複数の天然コードンが欠落しておりそして
   ／父は天然コードンによりコードされるアミノ酸以外の
   アミノ酸をコードするコードンにより置き換えられてお
   り、そして／又は天然コードンに他のコードンが付加さ
   れていることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第６
   項のいずれか１項又は第９項に記載の遺伝子又はＤＮＡ
   移転ベクター。 １２、細菌ノラスミドであることを特徴とする特許請求
   の範囲第９項〜第１１項記載のＤＮＡ移転ベクター。 １３、バタテリオファージＤＮＡであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第９項〜第１１項記載のＤＮＡ移転ベ
   クター。 １４、特許請求の範囲第９項〜第１３項のいずれか１項
   に記載の移転ベクターにより形質転換された細胞。 １５、ヒトープレグロレラキシンの適当なデオキシヌク
   レオチド配列又はそのザグユニットヲ、制限酵素により
   移転ベクターを切断することにより調製したＤＮＡ分子
   と反応ぜしめることを特徴とするヒトーゾレプロレラキ
   ンンをコードするデオキシヌクレオチド配列又はそのサ
   ブユニットを維持し又は複製するために使用するＤＮＡ
   移転ベクターの製造方法。 １６、適当なアオキシヌクレオチド配列ヲ含んで成る発
   現移転ベクターにより形質転換された微生物を培養する
   ことを特徴とする、Ｃ−末端配列としてヒトーゾレグロ
   レラキシンのアミノ酸配列の全部又は一部分からなるア
   ミノ酸配列を含み、そしてＮ−末端配列として原核生！
   蛋白質の一部分を含んで成る融合蛋白質の製造方法。 １７、ヒトーグロレラキンンをコードするデオキシヌク
   レオチド配列を含んで成る発現移転ベクターにより形質
   転換された微生物をヒトーグロレラキシンをコードする
   前記の配列の発現に適する条件下で培養し、そして前記
   の微生物の分解物又は培養液からヒトーグロレラキシン
   を籾製すること。 を特徴とする、Ｃ−ペプチドにより相互に分離されたＡ
   −ペゾチド及びＢペプチドを含んで成るヒトープロレラ
   ギシンの合成方法。 １８、Ｃ−末端配列としてヒトープレゾロレラキシンの
   アミノ酸配列の全部又は一部分を含み、そしてＮ−末端
   配列として原核生物蛋白質の一部分を含んで成る融合蛋
   白質。 １９、合成ヒトーフレグロレラキシン ２０、合成ヒトーグロレラキシン ２１、ヒトープロレラキシンの合成シグナル、Ａ、Ｂ又
   はＣペプチド鎖。 ２２、短縮されそして／又は変性された形の天然Ｂペプ
   チド鎖及び／又はＡペプチド鎖により本質上構成される
   ことを特徴とするヒトーレラキンン類似体。 ２３、完全な長さを有し又は短縮された形のＡ鎖及びＢ
   鎖の一方又は両者が遊離アミノ基に付加された保護基に
   より変性されていることを特徴とするヒトーレラキシン
   類似体。 ２４、Ａ鎖及びＢ鎖の一方又は両方に存在する天然アミ
   ノ酸の１つ以上が他のアミノ酸により置き換えられてい
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２２項記載の類似
   体。 ２５、Ａ鎖及びＢ鎖の一方又は両方から天然アミノ酸の
   １つ以上が除去されており、そして／又はＡ鎖及びＢ鎖
   の一方又は両方に１つ以上の他のアミン省が付加きれて
   いることを特徴とする特許請求の範囲第２２項記載の類
   似体。 ２６、Ａ鎖がアミノ末端の９個以下のアミノ酸の除去に
   より短鎖されており、そして／又はＢ鎖がアミノ末端の
   ９個以下のアミノ酸及びカルボキン末端の９個以下のア
   ミノ酸の除去により短縮されていることを特徴とする特
   許請求の範囲第２２項記載の類似体。 ２７、Ａ（１〜２４）、Ａ（２〜２４）、Ａ（３〜２４
   ）の内の任意の１つから成るＡ鎖とＢ（１〜２３）ない
   しＢ（１〜３２）の内の任意の１つからなるＢ鎖を組合
   わせて成ることを特徴とする特許請求の範囲第２６項記
   載の類似体。 ２８、完全な長さ、変形された形又は短縮された形で存
   在するレラキンンＡ鎖及びＢ鎖を、インスリンのＡ　６
   １及びＢ鎖を連結するために知られている方法によυ連
   結することを特徴とするヒト−レラキシン又はその類似
   体の製造方法。 ２９．８−スルホン化されそして／又はＳ−チオアルキ
   ル化されたＡ鎖及びＢ鎖の混合吻を還元し、該混合物を
   空気酸化することしてよシ完全な長さ、変形された形又
   は短縮された形で存在するレラキシンＡ鎖及びＢ鎖を連
   結し、そしてこうして生成したレラ千シン又はレラキシ
   ン類似体を回収することを特徴とするヒトーレラキンン
   又はその類似体の製造方法。 ３０、Ａ及びＢ−ペプテド鎖上のスルヒドリル基をＡ及
   びＢペプチド間の架橋ジスルフィドに転換し、そして次
   にＣベゾチドを除去することを特徴とするヒトープロレ
   ラキシン又はその類似体からのヒトーレラキシン又はそ
   の類似体の製造方法。