ES2220451T3 - Tratamiento de una infeccion intracelular. - Google Patents
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Abstract
Un agente para producir la lisis de un microorganismo que reside en una célula diana, que comprende un resto dirigible a diana capaz de unirse a la célula diana, y un micobacteriófago asociado con el resto dirigible a diana, en el que después de la unión del resto dirigible a diana a la célula, el micobacteriófago penetra en la célula diana y efectúa la lisis de un microorganismo que reside dentro de la célula diana.
Description
Tratamiento de una infección intracelular.
La presente invención se refiere a un agente para
producir la lisis de un microorganismo que reside dentro de una
célula, a un método para preparar dicho agente, a composiciones que
contienen dicho agente, y a la utilización de dicho agente. En
particular, el agente de la presente invención es adecuado para el
tratamiento de una infección intracelular por un microorganismo.
Muchos microorganismos son capaces de producir
infecciones intracelulares. Estos incluyen: infecciones causadas por
las especies de Salmonella, Yersinia, Shigella,
Campylobacter y Chlamydia. La Salmonella y la
Yersinia pueden sobrevivir dentro de las células de la
mucosa del tracto gastrointestinal y en los fibrobalstos,
proporcionan continuamente material antigénico a la circulación
sanguínea, estimulan la inflamación crónica y producen artritis;
las infecciones causadas por la supervivencia de la Legionella
pneumophile dentro de los macrófagos alveolares y las células
epiteliales; infecciones causadas por la supervivencia de la
Listeria monocytogenes dentro del citosol de las células;
las infecciones causadas por el protozoo intracelular Toxoplasma
gondii; y las infecciones causadas por la supervivencia
intracelular de las especies de Bordetella (macrófagos),
Staphylococcus aureus (células epiteliales), y estreptococos
del Grupo B (macrófagos). Algunas de estas infecciones son
exclusivamente intracelulares, y otras contienen tanto componentes
intracelulares como extracelulares. Sin embargo, se sospecha que el
ciclo de supervivencia intracelular de la infección bacteriana es
el factor principal de apoyo para la progresión de la
enfermedad.
Generalmente, estos microorganismos no circulan
libremente en el organismo, por ejemplo, en el torrente sanguíneo.
Según esto, los microorganismos intracelulares frecuentemente no
son susceptibles a regímenes de tratamiento con fármacos. Aunque
los fármacos están disponibles, este problema se ha exacerbado por
el desarrollo de microorganismos resistentes a múltiples fármacos.
Por razones similares, las terapias con vacunas no son eficaces
contra dichos microroganismos intracelulares. También, el aumento
de concentración de antibióticos para mejorar su biodisponibilidad
dentro de las células, puede producir como resultado efectos
secundarios graves.
Como ejemplo de microorganismo que produce
enfermedad intracelular, se hace referencia al Mycobacterium
tuberculosis. Esta bacteria es responsable de causar la
enfermedad tuberculosis, que es responsable de más de tres millones
de muertes al año en todo el mundo. El M. tuberculosis
infecta las células macrofágicas en todo el organismo. Pronto
después de la infección de los macrófagos, la mayoría de las
bacterias M. tuberculosis entran, persisten y se replican
dentro de las vesículas fagosomas de las células, donde las
bacterias son secuestradas de las defensas del hospedante y de
factores extracelulares.
Se han propuesto un número de regímenes de
fármacos como terapia para combatir las infecciones por M.
tuberculosis, y el mejor resultado hasta el momento se ha
conseguido con el fármaco isoniazida. Como alternativa, la terapia
con bacteriófagos se sugirió al principio de los años 1980, basada
en los resultados del tratamiento de la tuberculosis experimental
en conejos infectados con BCG de M. Bovis y M.
microtri, y en cobayas infectados con la cepa patógena humana
H37Rv de M. tuberculosis. Sin embargo, el mayor efecto
terapéutico obtenido con bacteriófagos no era mayor que el obtenido
con isoniazida.
Los fagos, en particular los bacteriófagos, se
conocen desde hace muchos años, y se han empleado como vehículos de
liberación en regímenes de tratamiento convencionales, para aliviar
enfermedades asociadas con células defectuosas o aberrantes.
Por ejemplo, el Documento WO 98/05344 enseña la
utilización de bacteriófagos para liberar un gen exógeno, tal como
un polinucleótido terapéutico, a una célula de un mamífero. El que
el bacteriófago haga diana en una célula
pre-seleccionada, se consigue mediante la
utilización de un resto de unión ligado al bacteriófago, dicho
resto de unión efectuando la unión e iniciando la internalización
del bacteriófago dentro de la célula
pre-seleccionada. Una vez liberada en la célula
diana de mamífero preseleccionada, el material genético exógeno
puede ser transcrito y traducido, aumentado así la concentración de
la molécula terapéutica codificada por el polinucleótido en la
célula diana.
Los regímenes de tratamiento de células
aberrantes tales como los descritos en el Documento WO 98/05344 se
conocen convencionalmente como métodos de terapia génica. Tales
regímenes, sin embargo, no resuelven el problema y/o la
persistencia de infecciones intracelulares por microorganismos.
El Documento WO 97/29185 enseña la preparación de
fagos recombinantes, y su utilización en el tratamiento o
profilaxis de las infecciones bacterianas. Según el Documento WO
97/29185, un anticuerpo anti-bacteriano es
presentado desde una superficie expuesta a un bacteriófago,
permitiendo así al bacteriófago ser capaz de unirse a, y de inhibir
el crecimiento de la célula bacteriana diana. El Documento WO
97/29185 sin embargo, no enseña como combatir las infecciones
intracelulares por microorganismos.
Antecedentes adicionales en la técnica
relacionada se proporcionan en:
Documento WO 99/10485, que enseña un sistema de
bacteriófago para identificar ligandos susceptibles para la
internalización celular. Dichos ligandos pueden proporcionar
dianas adecuadas como vehículos de liberación de genes por
bacteriófagos; y
Documento WO 94/24959, que enseña un método para
detectar compuestos, mediante la utilización de un bacteriófago
lambdoide modificado químicamente. En más detalle, un bacteriófago
se modifica para formar un complejo fago/molécula diana, siendo
dicho complejo no infectivo. Tras el estímulo con una molécula de
interés, la molécula diana se escinde y el bacteriófago se vuelve
infectivo. Así, la presencia de una molécula de interés puede
detectarse por la presencia de bacteriófagos infectivos.
Ni el Documento WO 99/10485 ni el 94/24959
resuelven los problemas asociados con las infecciones microbianas,
y todavía menos el problema de combatir las infecciones microbianas
intracelulares.
Por lo tanto hay una necesidad de combatir las
infecciones intracelulares por microorganismos. En particular, hay
una necesidad de un sistema para combatir las infecciones
intracelulares por micobacterias.
El problema anterior se alivia mediante la
presente invención, que, según su primer aspecto, proporciona un
agente para ocasionar la lisis de un microorganismo que reside
dentro de una célula diana, que comprende un resto de unión capaz
de unirse a una célula diana, y un bacteriófago asociado con el
resto de unión, donde después de la unión del resto de unión a la
célula diana, el bacteriófago penetra en la célula diana y provoca
la lisis del microorganismo que reside dentro de la célula
diana.
La expresión "resto de unión" significa
cualquier estructura que es capaz de unirse a la célula de interés.
Ejemplos incluyen un anticuerpo o uno de sus fragmentos, un
receptor capaz de unirse a un ligando sobre la célula de interés, y
un ligando capaz de unirse a un receptor sobre la célula de interés.
Preferiblemente, el resto de unión es un ligando para un receptor
de la superficie celular. Se han obtenido buenos resultados en una
realización específica de la invención utilizando una molécula de
transferrina como resto de unión. El resto de unión no necesita
demostrar el 100% de especificidad para la célula de interés,
aunque naturalmente es deseable un grado de especificidad para
obtener un sistema altamente eficiente. El resto de unión debe ser
capaz de unirse y de internalizarse, en cuyo caso el fago y el resto
de unión pueden ser liberados como un complejo (es decir,
asociados) en la célula diana. La identificación de restos de unión
potenciales susceptibles de internalización puede conseguirse
mediante, por ejemplo, métodos convencionales tales como los
descritos en el Documento WO 99/10485, o sobre la base de ensayo y
error. Alternativamente, el resto de unión puede ser capaz de unirse
pero no de internalizarse, en cuyo caso puede liberarse solo el
fago en el interior de la célula diana.
El término "unión" incluye cualquier
interacción entre el resto de unión y la célula de interés, que
permita al fago ser liberado en el interior de la célula. Esta
proceso de liberación es uno el que el fago completo penetra en la
célula de interés. El resto de unión puede llegar a separarse del
fago durante este proceso de liberación. Sin estar unido a ninguna
teoría, se cree que la unión incluye la formación de un complejo
entre el agente y un receptor presente sobre la célula diana. Se
cree que la formación de un complejo induce la internalización del
agente a través de un mecanismo de liberación mediado por el
receptor, tal como el utilizado por los virus eucarióticos naturales
(por ejemplo los adenovirus).
El término "asociado" significa cualquier
interacción entre el resto de unión y el fago, de tal forma que el
resto de unión es capaz de dirigir el fago a la célula de interés,
y cuando es así dirigido, el fago puede ser liberado dentro de la
célula. Cualquier otro fago puede asociarse con uno o más restos de
unión. Cuando un fago determinado se asocia con más de un resto de
unión, cada uno de esos restos puede unirse a un tipo celular
diferente. Alternativamente, cada resto de unión preferiblemente se
une al mismo tipo de células, aunque cada uno puede reconocer un
lugar diferente sobre el mismo tipo de célula.
El término "lisis" se utiliza en esta
especificación para incluir la destrucción del microorganismo a
través del daño o de la ruptura de la pared de la célula del
microorganismo. Sin embargo, también se pretende incluir cualquier
acción del fago que produzca detención del crecimiento y/o
multiplicación del microorganismo intracelular. En contraste con
los fagos de la presente invención, que se emplean para combatir
infecciones microbianas intracelulares, produciendo la lisis del
microorganismo en cuestión, los vectores bacteriófagos empleados
por la técnica anterior en los regímenes de terapia génica no son
líticos frente a los microorganismos. Los vectores bacteriófagos
convencionales en terapia génica, son no-líticos
frente a los microorganismos, para asegurar que la flora bacteriana
natural de un hospedante mamífero no se afecta por el bacteriófago
durante los regímenes de tratamiento de transferencia genética. A
este respecto, los bacteriófagos de la terapia génica convencional
se convierten frecuentemente en abortadores del crecimiento lítico,
antes de su utilización en regímenes de terapia génica. Esto puede
conseguirse, por ejemplo, modificando proteínas de la cola del
bacteriófago que se requieren para la transducción natural del
fago, de tal forma que el fago no es funcional en un hospedante
procariótico, o haciendo incapaz al bacteriófago, de otra forma, de
mediar la inyección de material genético en una célula hospedante
eucariótica. En contraste, los fagos de la presente invención son
capaces de realizar transducción natural de fago, y de efectuar la
lisis de un microorganismo.
La referencia a los fagos a lo largo de esta
especificación incluye fagos recombinantes y sus derivados, que son
capaces de producir lisis de un microorganismo.
En relación a una realización específica de la
invención, descrita más adelante en mayor detalle, el resto
dirigible a diana es un ligando para un receptor de superficie
celular y está físicamente o químicamente asociado con el fago.
Esta combinación resto dirigible a diana-fago se
administra a células infectadas por un microorganismo intracelular,
y el fago penetra en las células y lisa el microorganismo dentro de
esas células. En el caso de que el microorganismo esté localizado
dentro de un compartimiento intracelular o una vesícula, el fago
puede también penetrar en el compartimiento interno o en la
vesícula. Se prefiere además que el resto dirigible a diana se una a
un compartimiento interno o una vesícula en la célula, donde le
microorganismo pueda residir. Así, el resto dirigible a diana puede
ser un ligando para un receptor sobre la superficie de un
compartimiento interno o una vesícula. Después de la
internalización del fago dentro de una célula diana, la presencia
de un resto dirigible a diana para un receptor sobre la superficie
de un compartimiento interno o una vesícula, facilita la entrada
del fago en el compartimiento interno o una vesícula donde, una vez
dentro, puede ejercer un efecto lítico sobre el microorganismo que
reside dentro del compartimiento interno o la vesícula.
El resto dirigible a diana para un receptor de
superficie celular y el resto dirigible a diana para un receptor
sobre la superficie de un compartimiento interno o una vesícula
puede ser el mismo o diferente. En la última realización, los
agentes de la presente invención pueden ser modificados de tal
forma que el resto dirigible a diana para el receptor del
compartimiento interno o la vesícula, sea solo funcional después de
la entrada del fago en la célula diana. Esto puede conseguirse, por
ejemplo, empleando un promotor específico de célula, para asegurar
que el resto dirigible a diana para el receptor sobre la
superficie celular del compartimiento interno o la vesícula se
exprese solo después de que el fago se ha liberado al tipo celular
específico. Alternativamente, el resto dirigible a diana para el
receptor sobre la superficie del compartimiento interno o la
vesícula puede anularse (por ejemplo, mediante impedimento
estérico) sobre la superficie del fago, antes de su utilización
según la presente invención. Sin embargo, el resto dirigible a diana
para el receptor sobre la superficie del compartimiento interno o
la vesícula, puede hacerse accesible (por ejemplo mediante escisión
u otra modificación del resto dirigible a diana para el receptor de
superficie celular), durante el proceso de internalización, después
de la unión del agente a la célula diana.
En una realización de la presente invención, una
vez que el fago de la presente invención se ha liberado a la célula
diana de interés, permanece como una entidad separada y no se
integra (ni ninguna de sus partes) en el genoma de la célula
diana.
En otra realización, el fago no contiene
sustancialmente ácido nucleico exógeno (es decir, no de fago). En
una realización más, el fago no contiene sustancialmente ácido
nucleico exógeno excepto que el que codifica el resto dirigible a
diana.
En una realización, el fago no contiene
sustancialmente polinucleótidos terapéuticos exógenos capaces de
mediar un beneficio terapéutico, en un recipiente del
polinucleótido o sus productos. Un "producto polinucleótido
terapéutico" se refiere a una molécula producida como resultado
de la trascripción o la traducción del polinucleótido terapéutico.
Los productos polinucleótidos terapéuticos incluyen productos de
trascripción (por ejemplo, mRNA anti-sentido o RNA
catalítico), y productos de traducción (por ejemplo proteínas o
péptidos) del polinucleótido terapéutico.
El resto dirigible a diana puede estar
químicamente ligado al fago. Esto puede conseguirse, por ejemplo, a
través de una molécula de unión (por ejemplo un péptido corto), o
mediante otros medios covalentes, por ejemplo a través de un puente
disulfuro. El resto dirigible a diana puede unirse a cualquier parte
del fago. La fusión entre un resto dirigible a diana y un fago no
debería impedir la unión del resto dirigible a diana al receptor de
membrana celular, ni la unión del fago a su receptor bacteriano. En
relación al resto dirigible a diana, el procedimiento de unión
química no debería alterar el lugar de unión al receptor de la
célula, por ejemplo, alterando su conformación o imponiendo una
rigidez estructural. La unión química de la transferrina ilustrada
en la presente solicitud no previene su unión a su receptor. El
resto dirigible a diana seleccionado preferiblemente demuestra
estabilidad conformacional. La construcción de unión química
preferiblemente coloca al resto dirigible a diana a una distancia
del cuerpo del fago suficiente para proporcionar al resto dirigible
a diana un grado de flexibilidad de rotación, de tal forma que se
preserve la interacción máxima del resto dirigible a diana con su
receptor. El medio preferido de unión química es el entrecruzamiento
heterofuncional a través de un puente disulfuro.
Alternativamente, el resto dirigible a diana
puede mezclarse físicamente con el fago. En este caso, el resto
dirigible a diana puede absorberse físicamente en el fago mediante,
por ejemplo, puentes de hidrógeno, puentes hidrófobos/hidrófilos,
fuerzas de van der Waal, fuerzas electrostáticas y otras
asociaciones cargadas. Por ejemplo, el fago puede llevar una carga
de superficie negativa, y el resto dirigible a diana, y entonces el
resto dirigible a diana debería llevar preferiblemente una carga de
superficie positiva. Alternativamente, al pH seleccionado (por
ejemplo pH 7-8, preferiblemente pH aproximado de
7,5), el fago lleva una carga positiva suficiente para unirse a un
resto dirigible a diana cargado más negativamente.
Hay varias formas de unión química del resto
dirigible a diana al fago a través de un puente disulfuro, ejemplos
de las cuales se exponen más adelante. Mientras que la transferrina
(Tf) se ilustra más adelante como el resto dirigible a diana, los
mismos medios de unión son igualmente aplicables a otros tipos de
restos diana.
Una realización es primero introducir grupos
sulfidrilos libres (-SH) en la molécula de transferrina, que no
tiene tales grupos en su estado nativo. Esto puede hacerse, por
ejemplo, mediante tiolación de uno o más grupos amino libres de la
molécula de transferrina con un reactivo (por ejemplo,
2-iminotiolano), que modifica estos grupos e
introduce grupos -SH en estas posiciones (esto lleva a
Tf-SH). Cambiando la relación de transferrina a
2-iminotiolano, la temperatura y el pH de la
reacción, pueden conseguirse modificaciones que no impedirán la
unión de la transferrina a su receptor. Preferiblemente se modifican
así 5-10 grupos SH por molécula de Tf. Después, la
transferrina modificada se purifica del reactivo de bajo peso
molecular mediante filtración en gel, por ejemplo, con una columna
de Sephadex G-50, y se concentra hasta alrededor de
1-3 mg/ml sobre una membrana de microfiltración con
una precisión d 30 kDa.
El fago se trata primero mezclándolo con un
agente de entrecruzamiento hetero-bifuncional (por
ejemplo Sulfo-SMCC, carboxilato de
sulfosuccinilmidil
4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1),
que se une covalentemente a grupos NH_{2} libres sobre el fago,
dejando en la solución fagos que tienen grupos maleimido activos
que son capaces de reaccionar con un grupo -SH de la transferrina
tiolada. El grado de modificación del fago puede controlarse
mediante la razón entre el agente de entrecruzamiento y el fago.
Esta reacción debería tener lugar preferiblemente a una temperatura
en el intervalo entre 4 y 15ºC, para preservar la estabilidad del
fago, y para proporcionar una buena tasa de modificación. Al final
de la reacción, el fago modificado se aísla de la mezcla de reacción
mediante filtración en gel sobre una columna de Sepharose 6B y se
concentra mediante filtración de membrana.
En la siguiente etapa, la Tf-SH
se mezcla con un fago activado y el producto
(Tf-S-S-ligador-Fago)
se aísla de nuevo de la Tf-SH mediante filtración
en gel en la misma columna. Puede conseguirse presencia de fago que
no ha reaccionado, ya que éste solo puede aumentar la actividad
biológica de la preparación final.
Otra estrategia de desarrollo de producto
Tf-S-S-ligador-Fago,
puede incluir la activación de grupos NH_{2} libres de Tf, y
entrecruzar la trasnferrina activada con grupos SH sobre la
superficie del fago. El resultado de este proceso depende de la
disponibilidad y la accesibilidad de los grupos -SH sobre la
superficie del fago.
La formación de agregados físicos
Tf-fago, depende principalmente de la carga
electrostática al pH de la mezcla (este se toma preferiblemente como
el pH fisiológico).
La presente invención tiene aplicación en el
tratamiento de cualquier microorganismo dentro de una célula. Al
utilizar la invención, un fago capaz de lisar el microorganismo es
identificado y asociado con un resto dirigible a diana capaz de
dirigir al fago a la célula infectada, preferiblemente al
compartimiento específico de la célula infectada que contiene un
agente infeccioso. Así, el agente de la presente invención puede
emplearse para tratar una infección intracelular por un virus o por
una bacteria. En una realización, esto puede conseguirse mediante
selección de un resto dirigible a diana que es el mismo que el
receptor empleado por el agente infeccioso de interés. El agente de
la presente invención seguiría por lo tanto la misma ruta
intracelular que el agente infeccioso. Como ejemplo, los receptores
de complemento CR1 y CR3 son conocidos por ser la puerta de entrada
de la infección por M. tuberculosis, y de esta forma,
componentes de complemento tales como C2a y C3b son candidatos a
ser restos diana para modificación de fagos. Otro candidato que
puede ser internalizado a través de CR3 es la hemaglutinina de
Bordetella pertussis. Otro grupo de restos diana comprende
los utilizados por agentes infecciosos durante su persistencia
intracelular y/o que se requieren para su replicación. La
transferrina es un ejemplo de dicho resto dirigible a diana. Esta
proteína se requiere para proporcionar hierro a la M.
tuberculosis, que es crítico para la supervivencia bacteriana
intracelular.
La presente invención es adecuada para tratar un
número de infecciones intracelulares. Estos incluyen infecciones
causadas por Salmonella, Yersinia, Shigella, Campylobacter y
Chlamidia. La Salmonella y la Yersinia pueden
sobrevivir dentro de las células de la mucosa del tracto
gastrointestinal y en los fibroblastos, proporcionando material
antigénico continuamente a la circulación sanguínea, y estimulando
la inflamación crónica, lo que lleva al desarrollo de artritis.
También las infecciones causadas por la supervivencia de la
Legionella pneumophila dentro de los macrófagos alveolares y
las células epiteliales; las infecciones causadas por la
supervivencia de la Listeria monocytogenes dentro del
citosol celular; las infecciones causadas por un protozoo
intracelular como Toxoplasma gondii; y las infecciones
causadas por la supervivencia intracelular de las especies de
Bordetella (macrófagos), Staphylococcus aureus (células
epiteliales), y los estreptococos del grupo B (macrófagos). Algunas
de estas infecciones son exclusivamente intracelulares, y otras
tienen componente tanto intracelular como extracelular. Sin embargo,
es el ciclo de supervivencia intracelular de la infección
bacteriana lo que se sospecha que es el principal factor de apoyo
para la progresión de la enfermedad.
La presente invención también es aplicable para
la supresión de la persistencia intracelular, por ejemplo, dentro
de los macrófagos de otras bacterias tales como Leishmania
donovani, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis y otras
especies de bordetellas, estreptococos del grupo B, especies de
Salmonella, Chlamydia y Borrelia burdogferi. Esto
puede conseguirse mediante la utilización del resto de liberación
específico de macrófagos y un bacteriófago específico para el
microorganismo.
La presente invención puede utilizarse contra
virus intracelulares. Puede haber una ventaja en la utilización de
un resto dirigible a diana ligado, por ejemplo a un anticuerpo
contra una proteína viral específica o contra un fragmento corto de
DNA anti-sentido. Dicha construcción de fusión puede
liberarse en el interior de una célula diana como se ha descrito
previamente.
Cuando el microorganismo es una bacteria, el fago
para utilizar en el agente de la presente invención es un
bacteriófago. Los bacteriófagos son fagos que parasitan bacterias.
Típicamente comprenden una cabeza que contiene material genético
(generalmente DNA, aunque ocasionalmente es RNA), encerrado por una
pared de proteínas que generalmente se prolonga en el hueco de la
cola. Un bacteriófago inicia la infección pegándose a sí mismo por
su cola a la pared de la célula bacteriana. A través de una acción
enzimática, la pared es perforada y el material genético del
bacteriófago penetra a través de la pared en el interior de la
célula bacteriana. El material genético del bacteriófago entonces
organiza a la bacteria para producir más material genético de
bacteriófagos, que se ensambla con la cabeza y la cola del
bacteriófago para formar partículas ensambladas. Estas partículas
ensambladas se liberan después por lisis de la célula bacteriana
hospedante. Los bacteriófagos son típicamente altamente
específicos, e infectan solo una cepa o especie bacteriana.
En una realización, el bacteriófago es
preferiblemente un bacteriófago lítico.
El bacteriófago es preferiblemente un
micobacteriófago. El micobacteriófago es preferiblemente específico
para una especie particular de micobacteria. Más preferiblemente,
el micobacteriófago se selecciona de un grupo que consiste en los
micobacteriófagos líticos L29, D34, DS-6A.
Durante la infección por micobacterias, las
bacterias penetran en los macrófagos a través de la fagocitosis
mediada por receptor, que puede incluir varios receptores
específicos de micobacterias sobre la membrana del macrófago.
Después de la interacción inicial con los receptores, las
micobacterias entran en el fagosoma precoz, detienen su maduración
y lo secuestran de las organelas fagocítica terminales, por
ejemplo, los lisosomas. Esto previene la fusión del fagosoma
infectado con el lisosoma y la lisis posterior de la micobacteria
dirigida por el lisosoma. A través de este mecanismo es como la
micobacteria produce una infección intracelular dentro de una
vesícula del macrófago y evita el sistema inmune del
hospedante.
Las micobacterias infectan monolitos y
macrófagos. Así, cuando se selecciona un resto dirigible a diana
para utilizar en un agente para tratar una infección celular por
micobacterias, el resto dirigible a diana se unirá a un monolito
y/o a un macrófago.
Restos diana adecuados incluyen hemaglutinina
filamentosa de Bordetella pertussis, que se une al receptor
de complemento CR3, y puede internalizarse a través de un mecanismo
de endocitosis mediado por receptor; componente C3 del complemento;
anticuerpo anti C3 que puede formar un agente capaz de unirse a C3
en sueros humanos, y de dirigir la internalización del fago a través
del receptor CR3; y ligandos de receptores de macrófagos
específicos para micobacterias (por ejemplo, receptor de manosa,
receptor de proteína surfactante, CD14 etc), que pueden unirse a
receptores y ser internalizados. Una molécula de transferrina o una
de sus partes o uno de sus mutantes o derivados es un resto
dirigible a diana preferido. Para detalles de la secuencia de la
transferrina, se hace referencia a Uzan, G., Frain, M., Park, I.,
Besmond, C., Maessen, G., Trepat, G.S., Zakin, M.M., y Kahn, A.
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species, Comp. Biochem. Physiol. -B 97(3);
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Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para preparar el agente según
las definiciones anteriores, que comprende poner en contacto el
resto dirigible a diana y el fago, de tal forma que el resto
dirigible a diana se convierte en asociado al fago.
Puede fácilmente producirse una gran cantidad de
fago. Ahora se hace referencia a la producción de
micobacteriófagos, aunque serían aplicables procedimientos de
escala similares igualmente para otros fagos.
El stock de fago puede producirse mediante la
infección de un cultivo líquido de M. tuberculosis u otra
cepa auxiliar de micobacteria, eliminando los detritus celulares
mediante centrifugación, concentración de fago (por ejemplo
mediante filtración de membrana, precipitación con PEG,
centrifugación etc.,) seguido de purificación del fago (por
ejemplo, proteínas, polipéptidos, sales, etc.,), que pueden
interferir con su modificación química. Este proceso puede
escalarse fácilmente, utilizando instrumentos de filtración y
cromatografía, con los apoyos requeridos.
El stock del fago puede después mezclarse con el
resto dirigible a diana de interés.
La transferrina se ilustra ahora simplemente como
un ejemplo de resto dirigible a diana. La formación de puentes
mediante absorción física requiere solamente una mezcla de fago y
resto dirigible a diana que tengan puntos isoeléctricos
suficientemente diferentes (por ejemplo transferrina, cuya molécula
tiene un pI = 5,5, y un fago con pI superior a 7). El complejo
Tf-fago aparece estable bajo condiciones
fisiológicas y puede separarse fácilmente de la Tf libre. La
presencia de fago libre puede conseguirse ya que solo aumentará la
actividad biológica de la preparación.
Según un tercer aspecto de la presente invención,
el agente se prepara mediante formación de puentes desde un resto
dirigible a diana hasta un fago. Los ejemplos de procedimientos
preferidos para la formación de puentes se ha discutido
previamente.
Según un cuarto aspecto de la presente invención,
se proporciona un micobacteriófago quimérico capaz de producir lisis
de un microorganismo dentro de una célula, que comprende un resto
dirigible a diana capaz de unirse a la célula como parte de una
proteína de cola o de cubierta del fago.
Según un quinto aspecto de la presente invención,
se proporciona un método para preparar el fago quimérico descrito
anteriormente. Los micobacteriófagos se ilustran como un ejemplo de
este aspecto de la presente invención. Utilizando micobacteriófagos
cuyos genomas han sido completamente secuenciados y caracterizados
(por ejemplo los fagos L5 o d29), pueden generarse cebadores para
identificar dominios de DNA que codifican proteínas de superficie de
membrana "funcionalmente silentes", dentro del fago de
interés. Estas pueden escindirse y reemplazarse con un dominio de
DNA que codifica el resto de unión al receptor (por ejemplo el
dominio de unión a la transferrina). Según esto, pueden producirse
fagos quiméricos nuevos "diseñados", que combinan la función de
replicación y la función de unión al receptor. Los fagos pueden
acumularse como se discutió anteriormente, y utilizados como
agentes terapéuticos contra patógenos intracelulares.
Según un sexto aspecto de la presente invención,
se proporciona una composición que comprende un agente de la
presente invención o un fago quimérico de la presente invención, y
un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición es
preferiblemente una mezcla líquida de agente o fago quimérico y un
estabilizador, que estabilizará el fago durante el almacenamiento en
un nebulizador. La mezcla también puede contener otro agente que
prevendrá la agregación del fago.
Muchas infecciones intracelulares causadas por
microorganismos se contraen por inhalación. Muchas de tales
infecciones intracelulares están concentradas por lo tanto en el
tejido pulmonar y alrededores. En particular, la tuberculosis
(causada por el M. tuberculosis) se contrae de esta forma.
Según una realización preferida, la composición según la presente
invención se proporciona en forma de aerosol.
A continuación se hace referencia al siguiente
ejemplo.
Este ejemplo describe la preparación de un fago
lítico anti-M. tuberculosis (fago D34), que ha sido
modificado mediante absorción o químicamente, para llevar un
polipéptido de superficie que proporciona unión del fago,
internalización y liberación en el fagosoma en el interior de los
monocitos/macrófagos infectados. Una vez dentro del fagosoma, el
fago muestra sus características líticas y daña o lisa las
micobacterias, intrafagosómicas.
Cuando células humanas monocito/macrofágicas U937
infectadas con M. phlei se trataron con una muestra de fago
modificado (columnas 3 y 4 en la Tabla 1), el número de
micobacterias intracelulares vivas recogidas de lisados de
macrófagos, era menor comparado con el de lisados no tratados con
fago, o tratados con un fago no modificado (columnas 5 y 2 en la
Tabla 1). El mayor efecto se consiguió cuando el resto dirigible a
diana (transferrina) se añadió al fago mediante absorción física.
Como resultado de una modificación física, el fago era dos veces
más efectivo, comparado con el fago no modificado. El último nivel
se sabe que es al menos igual al mejor resultado conseguido con
antibióticos, por ejemplo, isoniazida.
Estos datos in vitro demuestran que la
modificación del fago con un resto dirigible a diana específico de
liberación, aumenta la capacidad del fago para reducir la carga
bacteriana dentro de los macrófagos infectados. La terapia con
fagos modificados puede ser eficaz contra la infección por M.
tuberculosis, y ayudará al sistema inmune a neutralizar y
controlar la infección y, eventualmente, la tuberculosis.
Se utilizaron células U937 diferenciadas (4,8 x
10^{5} células/ml, 98% vivas).
Los monocitos/macrófagos infectados con M.
phlei anteriores en el ejemplo 1, se suspendieron durante 1
hora en medio RPMI, que contenía 4 mg/ml de gentamicina, se lavaron
3 veces con PBS y se resuspendieron en RPMI antes del tratamiento
con el fago modificado. Esto se hizo para asegurar que las bacterias
M. phlei unidas a la superficie o libres (es decir, las
micobacteria no localizadas intracelularmente), no enmascararan los
resultados de del ejemplo.
Claims (16)
1. Un agente para producir la lisis de un
microorganismo que reside en una célula diana, que comprende un
resto dirigible a diana capaz de unirse a la célula diana, y un
micobacteriófago asociado con el resto dirigible a diana, en el que
después de la unión del resto dirigible a diana a la célula, el
micobacteriófago penetra en la célula diana y efectúa la lisis de un
microorganismo que reside dentro de la célula diana.
2. Un agente según la reivindicación 1, en el que
el resto dirigible a diana es un ligando para un receptor situado
sobre la superficie de la célula.
3. Un agente según la reivindicación 2, en el que
el resto dirigible a diana es una molécula de transferrina, o una
de sus partes o uno de sus mutantes o de sus derivados, capaz de
unirse al receptor de la transferrina sobre la célula.
4. Un agente según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 3, en el que el microorganismo es una
bacteria.
5. Un agente según la reivindicación 4, en el que
la bacteria es Mycobacterium tuberculosis.
6. Un agente según la reivindicación 1, en el que
el micobacteriófago se selecciona de un grupo que consiste en L29,
D34 y DS-6A.
7. Un método para preparar un agente según una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende poner
en contacto un resto dirigible a diana y un micobacteriófago de tal
forma que el resto dirigible a diana se asocie con el
micobacteriófago.
8. Un método para preparar un agente según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que
comprende formar un puente entre el resto dirigible a diana y el
micobacteriófago.
9. Un agente según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que el agente es un
micobacteriófago quimérico, y el resto dirigible a diana es parte
de una proteína de cola o de cubierta de dicho micobacteriófago.
10. Un método para preparar un agente según la
reivindicación 9, que comprende la expresión de una secuencia de
ácido nucleico del micobacteriófago, ligada operativamente a una
secuencia de ácido nucleico que codifica el resto dirigible a
diana, y el ensamblaje del agente.
11. Una construcción de ácido nucleico, que
comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de
la reivindicación 9.
12. Una composición que comprende el agente según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la
reivindicación 9, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición según la reivindicación 12,
para administración por aerosol.
14. La utilización de un agente en la fabricación
de un medicamento para tratar una infección intracelular por un
microorganismo, en la que dicho agente comprende un resto dirigible
a diana capaz de unirse a la célula diana, y un fago asociado con
el resto dirigible a diana, y en la que después de la unión del
resto dirigible a diana a la célula, el fago penetra en la célula
diana y efectúa la lisis de un microorganismo que reside dentro de
la célula diana.
15. La utilización de un resto dirigible a diana
capaz de unirse a una célula, en la fabricación de un medicamento
para liberar un fago lítico contra un microorganismo en el interior
de la célula.
16. La utilización de un fago lítico en la
fabricación de un medicamento para tratamiento y/o alivio de una
infección intracelular, en la que dicho medicamento incluye un
resto dirigible a diana capaz de unirse a una célula, y que está
asociado con dicho fago lítico.
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