Im
Bereich der Antiinfektiva-Forschung wurden viele anti-mikrobielle
Agenzien mittels eines Sensitivitätstestes identifiziert, beidem
potentiell aktive Verbindungen auf Wachstumsinhibition gegenüber Pathogenen getestet
werden (Principles and Practice of Infectious Diseases, GL Mandall,
RG Douglas, JE Bennett ed., Churchill Livingstone Inc., 1995). Historisch
betrachtet waren Naturstoffe häufig
die Basis für
zahlreiche Entwicklungen auf dem Gebiet der anti-mikrobiellen Agenzien.
Die identifizierten Verbindungen werden in der Regel chemisch optimiert
und in sekundären
Testsystemen im Hinblick auf Verträglichkeit, den sogenannten
Selektivitätsindex
in vitro, geprüft.
Die Verbindungen werden dann in Tiermodellen getestet und wirksame
Substanzen mit geeigneten pharmakokinetischen und pharmakodynamischen
Profil, die darüber
hinaus noch über einen
entsprechenden therapeutischen Index verfügen, werden für klinische
Studien am Menschen ausgewählt,
sofern in toxikologischen Studien keine prohibitiven Ergebnisse
festgestellt werden.
Mit
der Veröffentlichung
zahlreicher bakterieller Genomsequenzen wurden neue Wege zur Entdeckung
anti-mikrobieller Medikamente beschritten, es begann die sogenannte Ära der Genomforschung.
(Novel approaches to the discovery of anti-microbial agents, Schmid MB, Current
Opinion In Chemical Biology, 2, 4, 529–534, 1998). Es wurden Strategien
zur effizienten Nutzung der genomischen Information entwickelt,
um Targets zu identifizieren und charakterisieren, Testsysteme zu
entwickeln und Substanzen zu bewerten. Theoretisch ist die Zahl
antibakterieller Targets zur Wirkstofffindung sprunghaft angestiegen,
aber auch wenn diese Targets und Assaysysteme gut charakterisiert
sind, müssen
die identifizierten Verbindungen auch weiterhin die oben aufgeführten, für erfolgreiche
Medikamente essentiellen Kriterien erfüllen.
Das
NCCLS Komitee (National Committee for Clinical Laboratory Standards,
USA) veröffentlicht
standardisierte Richtlinien für
den MHK-Test (Minimale Hemmkonzentration, bzw. MIC-Test, minimum
inhibitory concentration), der auf Fest- oder Flüssigmedien basiert.
Dieser
Standardsensitivitätstest
ist genau in „NCCLS,
Villanova, PA, 1997. Methods for dilution anti-microbial susceptibility
tests for bacteria that grow aerobically 5th ed.
Approved standard. NCCLS Document M7-A5 (Vol. 20 No.2), M11-A4 (Vol
17 No 22)" beschrieben.
Im Prinzip wird die Vermehrung des Pathogens, in diesem Falle handelt
es sich hierbei um Bakterien, auf Festmedien (Wachstum der Kultur)
oder in Flüssigmedien
(Trübung
im Medium) in Gegenwart oder Abwesenheit von potentiellen Wirkstoffen
nach einer definierten Zeit untersucht und die Empfindlichkeit der
Erregers gegenüber
potentiellen Wirkstoffen bestimmt. Der MHK Wert ist die Wirkstoffkonzentration,
bei der keine Bakterienvermehrung mehr nachweisbar ist. Man muss an
dieser Stelle jedoch feststellen, dass nur ein Bruchteil der so
identifizierten Verbindungen den gewünschten Selektivitätsindex
bzw. die notwendige Verträglichkeit
in nachgeschalteten, zusätzlichen
Testsystemen aufweisen.
Bedard
J et al. (Antiviral Research; 41; 1; 35–43; 1999 Feb; 9910) beschreibt
einen colorimetrischen Zellproliferationstest zur Identifizierung
von Verbindungen mit Aktivität
gegen das humane Cytomegalievirus (HCMV), bei dem Zelle, Virus und
Verbindung gleichzeitig inkubiert werden. Dieses Verfahren ist nicht
ohne weiteres auf nicht virale Systeme übertragbar, weil andere Mikroben
gegebenenfalls Mitochondrien oder Enzymkomplexe aufweisen, durch
die der verwendete Farbstoff WST (Tetrazoliumsalz WST-1) umgesetzt
werden kann.
Die
WO 99/29318 A1 beschreibt in Beispiel 3 auf Seite 59, Zeile 6 bis
Seite 61, Zeile 8 die Bestimmung der antiviralen Wirkung erfindungsgemäßer Substanzen.
Die Ermittlung von EC50- und CC50-Werten, sowie des Selektivitätsindex
wird beschrieben. Als Vitalitätsindikator
wird Neutralrot verwendet. Wirkungen gegen nicht-virale Mikroben
werden nicht untersucht.
Die
WO 00/61190 A2 beschreibt in Tabelle 1, Seite 16 die Inkubation
von Eukaryonten (U937-Zellen), die mit intrazellulären Prokaryonten
(Mycobacterium phlei) infiziert sind, mit einem antibakteriellen
Wirkstoff. Nach Seite 15, Zeilen 13 bis 14 werden die infizierten
U937-Zellen nach
der Inkubation lysiert und die Lysate ausplattiert, um die Anzahl
lebensfähiger
Mycobacterium-Zellen („viable
cells" in Tabelle
1) zu bestimmen. Die Vitalität
der U937-Wirtszellen
wird nach Tabelle 1 der WO 00/61190 A2 nicht untersucht.
In
RABENBERG, V.S. u.a.: The Bactericidal And Cytotoxic Effects Of
Antimicrobial Wound Cleansers. J. Athl. Train. (März 2002)
37 (1 ), 51–54
werden nach Seite 52, rechte Spalte die Tests auf antibakterielle
Wirkung und auf Cytotoxizität
unabhängig
voneinander durchgeführt;
sie stehen auf Seite 53 auch in den Tabellen 1 und 2 unabhängig nebeneinander.
Dasselbe
gilt für
SANCHEZ, M.S. u.a.: Evaluation of antibacterial agents in a high-volume
bovine polymorphonuclear neutrophil Staphylococcus aureus intracellular
killing assay. Antimicrob. Agents Chemother. (1986) 29 (4), 634-8:
Der Test auf intrazelluläre
Abtötung
von Staphylococcus aureus verläuft
nach Seite 635 getrennt und unabhängig vom Cytotoxizitätstest.
Die
US 2002/0025514 A1 beschreibt auf Seite 4, Absatz [0028] Mischkulturen
aus mehreren Zellkultur-Populationen in einem Anzuchtsystem. Ein
Screening auf Wirkstoffe gegen nicht-virale, intrazelluläre Pathogene (Listeria) ist
aus Seite 2, Absatz [0016] zu ersehen, nicht aber die Kombination
des Tests auf antibakterielle Wirkung mit einem Vitalitätstest der
Wirtszellen.
Ziel
dieser Erfindung ist es, eine Methode bereitzustellen, die es erlaubt,
alternative oder aktivere nicht virale, anti-mikrobielle Verbindungen,
die einen besseren Selektivitätsindex
und/oder Verträglichkeit
und/oder protektive Effekte auf die infizierte eukaryontische Zellkultur
aufweisen, aufzufinden.
Ein
weiteres Ziel dieser Erfindung ist es weiterhin; eine robuste, kostengünstige,
empfindliche und effiziente Methode zur Verfügung zu stellen, mit der alternative,
neue oder stärker
wirksame anti-mikrobielle Substanzen identifiziert werden können.
Ein
weiteres Ziel dieser Erfindung ist es weiterhin, eine Methode zur
Verfügung
zu stellen, die mit Hochdurchsatz-Testverfahren kompatibel ist.
Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, eine Methode
zur Verfügung
zu stellen, mit der Substanzen identifiziert werden können, die
eine Breitbandspektrum-Wirkung oder eine Aktivität gegen Therapie-resistente
Pathogene aufweisen.
Die
vorliegende Erfindung löst
die oben aufgeführten
Probleme, indem ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen gegen
nicht virale Mikroben zur Verfügung
gestellt wird, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Testansatz
gleichzeitig potentielle Wirkstoffe zusammen mit eukaryontischen
Zellen und mit nicht viralen Mikroben inkubiert werden, die Vitalität der eukaryontischen
Zellen bestimmt wird und anschließend solche Wirkstoffe ausgewählt werden,
bei denen das Signal des entsprechenden Testansatzes signifikant
größer ist als
der Mittelwert der Infektionskontrolle bei mindestens einer Konzentration
des Wirkstoffes.
Erstmalig
erlaubt diese Methode die kombinierte Beurteilung sowohl der antimikrobiellen
Aktivität
der Verbindung als auch gleichzeitig ihrer Verträglichkeit (Selektivitätsindex)
und ihrer zytoprotektiven Effekte auf eine infizierte Zellkultur.
Aus einer anderen Perspektive betrachtet ist es gerade diese in
vitro Assay Konfiguration, die das natürliche Infektionsgeschehen
sehr gut simuliert, während
der verbreitete MHK-Test ausschließlich die Sensitivität der Mikroben
gegenüber
Substanzen prüft.
Folglich erlaubt der erfindungsgemäße infektiologische Assay ein
effizientes Durchmustern von Substanzbibliotheken und die nachfolgende
Optimierung der identifizierten anti-mikrobiellen Wirkstoffe, weil
ein reproduzierbarer und Dosis-wirkungsabhängiger Test, der anti-mikrobielle
Aktivitäten
von Substanzen mit überwiegend
geeigneter Verträglichkeit
identifiziert, letztendlich in vitro die einfachste Stufe einer
vernünftigen
Bewertung von Substanzen mit Bezug zu ihrem antimikrobiellen Potential
darstellt.
Ein
weiterer Vorteil dieser Erfindung ist es, dass mit dieser infektiologischen
in vitro Methode nicht nur alle für das mikrobielle Wachstum
und Infektion essentiellen Targets des Pathogens, sondern darüber hinaus auch
die für
eine mögliche
therapeutische Intervention relevanten Targets der eukaryontischen
Wirtszellen im nahezu natürlichen
Infektionsgeschehen simultan geprüft werden, ohne dass z.B. wie
beim Genomansatz individuelle Targets basierend auf dem gegenwärtigen Wissensstand
nach mehr oder weniger wissenschaftlich korrekten Kriterien vorselektiert
werden. Der infektiologische Assay liefert demnach Antworten auf
die Frage, ob optimierbare, verträgliche und das Infektionsgeschehen
inhibierende anti-mikrobiell wirksame Strukturen vorliegen. Ist
erst einmal eine geeignete Substanz identifiziert, so kann der zugrundliegende
Wirkmechanismus bzw. das Target zügig mit den zur Verfügung stehenden
Methoden aufgeklärt
werden. Bei dieser Vorgehensweise kann die vorher notwendige Identifizierung,
Evaluierung und Testung zahlreicher individueller Targets sequenziell
oder parallel überflüssig werden.
Der
Assay unterscheidet sich klar von allen bis heute veröffentlichten
Publikationen. Zahlreiche Assays wurden in diversen Modifikationen
beschrieben, um bakteriostatische oder bakterizide Verbindungen
zu identifizieren, aber diese Testsysteme basieren im Grunde alle
auf der Wachstumsinhibition des Erregers in Gegenwart des Wirkstoffs
oder der Testsubstanz. Andere Tests prüfen die Inhibition oder Aktivierung
eines einzelnen Targets des betreffenden Erregers, das gegebenenfalls
aufgrund theoretischer Überlegungen
der Genomforschung ausgewählt,
kloniert und exprimiert, eventuell im Falle eines Proteins aufgereinigt
und in einem Enzymtest oder Bindungstest analysiert wird. Aber diese
Strategien liefern nicht simultan den Selektivitätsindex bzw. bewerten nicht
die Verträglichkeit
der Wirkstoffe in vitro. Gerade weil diese Tests nur die Reduktion des
Bakterienwachstums oder die Veränderung
des Bindungsverhaltens bzw. der enzymatischen Aktivität eines
einzelnen Targets im Assaysystem überprüfen, identifizieren diese Tests
nicht nur gewünschte
anti-mikrobiell wirksame Verbindungen mit Bezug zur Entwicklung
eines Medikamentes, sondern zum überwiegenden Teil
zytotoxische und zytostatische Wirkstoffe, die zahlreiche nachgeschaltete
Testsysteme erfordern, um dann verträgliche Wirkstoffe aus den unerwünschten
zelltoxischen Substanzen herauszufiltern.
Der
Begriff Mikrobe ist ein kollektiver Begriff und steht für eine große Vielfalt
von Mikroorganismen inklusive der Bakterien, Viren, Protozoen und
Pilze etc.
Der
Begriff Signal beschreibt jegliche Form des Abgreifens von Information
aus dem Testansatz, die zur Bewertung der anti-mikrobiellen Aktivität und Verträglichkeit
der potentiellen Wirkstoffe geeignet ist, z.B. kann als Signal ein
Messwert bezeichnet werden, der der Vitalität der Zellen entspricht und
damit die anti-mikrobielle Aktivität der Testsubstanz und dessen
Verträglichkeit
anzeigt.
Der
Begriff Prokaryont beschreibt einen Organismus, der im Gegensatz
zu eukaryontischen Zellen keinen Nucleus besitzt. In diesem Kontext
schließt
er darüber
hinaus auch gentechnologisch manipulierte Prokaryonten ein, z.B.
solche, die ein Reportergenprodukt produzieren.
Der
Begriff eukaryontische Zelle beschreibt einen Organismus, der im
Gegensatz zu Prokaryonten einen Nucleus besitzt. In diesem Kontext
schließt
er darüber
hinaus auch gentechnologisch manipulierte Eukaryonten ein, z.B solche,
die ein Reportergenprodukt produzieren.
Die
Abkürzung
MIC ist ein Synonym für
die deutsche Bezeichnung MHK (Minimale Hemmkonzentration) steht
für „Minimum
Inhibition Concentration" und
beschreibt die niedrigste Konzentration einer Verbindung, die noch
in der Lage ist z.B. bakterielles Wachstum vollständig zu
inhibieren mit Bezug auf eine visuelle Trübung der Inkubationsmedien
(described in National Committee for Clinical Laboratory Standards,
Villanova, PA, 1997. Methods for dilution anti-microbial susceptibility
tests for bacteria that grow aerobically 4th ed.
Approved standard. NCCLS Document M7-A4).
Die
Begriffe Gram-positiv und Gram-negativ beschreiben das Ergebnis
der sogenannten Gram-Färbung,
die nur eine von einer Vielzahl veröffentlichten Anfärbemethoden
für Mikroorganismen
ist, um Proben von Organismen zu untersuchen. (Principles and Practice
of Infectious Diseases, GL Mandall, RG Douglas, JE Bennett ed.,
Churchill Livingstone Inc., 1995)
Die
Abkürzung
moi steht für „multiplicity
of infection" und
ist der Quotient der Zellzahl des Pathogens dividiert durch die
Zellzahl der zu infizierenden Zellen. (MOI = Zellzahl des Erregers/Zahl
der Zellen, die infiziert werden).
Der
Begriff Selektivitätsindex
(SI) bezieht sich auf den Quotient der Konzentrationen, bei der
die Zellvitalität
auf 50 % gegenüber
der Zellkontrolle reduziert ist, dividiert durch die Konzentration,
bei der die anti-mikrobielle Wirkung mindestens 50 % einer maximal
möglichen
Inhibition der Erregervermehrung erreicht; d.h. SI = (CC50/IC50). Je größer diese
Zahl ist, um so größer ist
die Verträglichkeit
der Verbindung. Bevorzugt werden Verbindungen mit SI-Werten größer 10.
Die
Abk. "mM", "μM" und "nM" stehen
im Folgenden für
die Einheiten mmol/l, μmol/l
bzw. nmol/l
Der
Begriff IC50 oder EC50 beschreibt
die Konzentration oder die Menge an Wirkstoff, die benötigt wird um
eine 50%ige Inhibition in einem gegebenen Testsystem zu erreichen
oder die effektive Konzentration, die benötigt wird um ein halbmaximales
Signal in einem Assay zu erreichen.
Der
Begriff simultan mit Bezug zum infektiologischen Assay bezieht sich
auf eine Situation, bei der zu einem Zeitpunkt gleichzeitig Wirkstoff,
Mikrobe und eukaryontische Zellen in einer Lösung inkubiert werden; die
Sequenz der Zugabe der Komponenten ist jedoch variabel.
Der
Begriff therapeutischer Index (TI; Verträglichkeit) bezieht sich auf
einen Quotient der lethalen Dosis (LD; lethal dose) bei der 50 %
der Versuchstiere aufgrund der Substanzwirkungen sterben und der
effektiven Dosis (ED; effective dose) bei der 50 % der Versuchtiere
die Infektion überleben
TI = (LD50/ED50)
Der
Begriff inhibieren beschreibt, wenn er im Zusammenhang mit dem infektiologischen
Assay gebraucht wird, generell die Inhibition des Mikrobenwachstums
um ca. 50 % bei einer Konzentration von IC50 = 100 μM oder geringer
und bevorzugt eine Konzentration, die so niedrig ist wie möglich, um
den MHK-Wert zu erreichen.
Der
Begriff Vitalfarbstoffe bezeichnet Farbstoffe, die eine Unterscheidung
zwischen vitalen und nicht vitalen Zellen erlauben, indem sie z.B.
nur in nicht vitale Zellen eindringen (Trypanblau) oder nur von
intakten Zellen umgesetzt werden (z.B. Fluoresceindiacetat). Bevorzugt
sind Fluoreszenzfarbstoffe.
Der
Begriff Signifikanz drückt
die Wahrscheinlichkeit aus, mit der man sich sicher sein kann, dass
das positive Testergebnis nicht durch Zufall entstanden ist.
In
einer Ausführungsform
ist die Methode dadurch gekennzeichnet, dass solche Wirkstoffe ausgewählt werden,
bei denen das Signal des entsprechenden Testan satzes größer ist
als der 2-fache, besonders größer als
der 4-fache, ganz besonders größer als
der 10-fache Wert des Mittelwertes der Infektionskontrolle und insbesondere
größer als
50 % der Zellkontrolle.
In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Methode dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den nicht-viralen
Mikroben um prokaryontische Zellen handelt. Bevorzugt handelt es
sich bei den prokaryontischen Zellen um Bakterien, insbesondere
um intrazelluläre
und/oder therapieresistente Mikroben.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Vitalfarbstoffe eingesetzt
werden. Bevorzugt sind Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere Fluorescein-diacetat,
Fluorescein-dibutyrat, 5-Carboxyfluorescein-diacetat, Acetoxymethylester
(5-CFDA, AM) und 4,5,6,7-Tetrafluorofluorescein-diacetat (TFFDA).
Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass eukaryontische Zellen
benutzt werden, die zur Generierung des Testsignals ein sogenanntes
Reportergen aufweisen.
Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die nicht viralen
Mikroben, wie zum Beispiel gentechnisch manipulierte Organismen,
nicht natürlich
vorkommende Eigenschaften aufweisen. Z.B. können Mikroben verwendet werden,
die ein verändertes
Adhäsionsverhalten
an Zelloberflächen
aufweisen oder spezielle Toxine produzieren.
Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den eukaryontischen
Zellen um Vero (african green monkey kidney cells) oder CHO Zellen
(chinese hamster ovary cells) handelt.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung verschiedener
Mikrobenstämme
eingesetzt wird. So können Testsubstanzen
direkt auf eine mögliche anti-mikrobielle
Breitband-Aktivität
geprüft
werden.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung diverser
eukaryontischer Zelllinien eingesetzt wird. Hierdurch kann neben
der anti-mikrobiellen Aktivität
von Wirkstoffen deren Verträglichkeit
simultan gegen verschiedene eukaryontische Zellen geprüft werden.
Es ist darüber
hinaus möglich
verschiedene eukaryontische Zellen einzusetzen, die gleiche oder
verschiedene sogenannte Reportergene tragen, um neben dem Verträglichkeitsaspekt
noch gegebenenfalls Rückschlüsse auf
das getroffene Target selbst zu ziehen.
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung Verbindungen oder Wirkstoffe, die mittels
der oben aufgeführten
Methode identifiziert wurden, pharmazeutische Zusammensetzungen,
die eine derart aufgefundene Verbindung enthalten, die Verwendung
dieser Substanzen für
die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prävention
von mikrobiellen Infektionen sowie die Behandlung von mikrobiellen
Infektionen von Säugern,
indem man dem Säuger,
der eine derartige Therapie benötigt,
eine therapeutisch wirksame Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung
verabreicht.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Methode dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt werden,
die einen Selektivitätsindex
von größer gleich
10 aufweisen (Selektivitätsindex
= CC50/IC50 ≥ 10).
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird das Verfahren als Hochdurchsatzscreening (HTS) bei einer Konzentration
des Wirkstoffes im Konzentrationsbereich von 100 nM bis 100 μM durchgeführt.
In
einer weiteren Ausführungsform
sind Verbindungen bevorzugt, die eine sogenannte Breitbandspektrum
anti-mikrobielle Wirkung aufweisen. Besonders bevorzugt sind Wirkstoffe,
deren Wirkmechanismus auf einem Target des Pathogens oder Erregers
beruht.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Methode dadurch gekennzeichnet, dass diejenigen Wirkstoffe
ausgewählt
werden, die die Eigenschaft haben, mikrobielles Wachstum in Zellkultur
bei einer Konzentration von ca. 100 μM und weniger um mindestens
50% zu inhibieren.
Die
vorliegende Erfindung betrifft daher eine Methode zur Identifizierung
von Wirkstoffen, dadurch gekennzeichnet, dass
- a)
Testsubstanzen oder Kontrollantibiotika bei einer geeigneten Substanzkonzentration
vorgelegt werden;
- b) geeignete eukaryontische Zellen hinzugefügt werden;
- c) Mikroben hinzugefügt
werden;
- d) der Assay inkubiert wird;
- e) ein read out oder ein sogenanntes Testsignal generiert wird.
Dies
soll im folgenden genauer erläutert
werden, ohne die Erfindung dadurch einzuschränken:
Schritt a)
Wird
nur eine Konzentration der Testsubstanz bei der Assaydurchführung eingesetzt
wie z.B. bei einem Hochdurchsatztest, ist jede Konzentration geeignet,
bei der eine anti-mikrobielle Aktivität und eine gewisse Verträglichkeit
gegenüber
den eukaryotischen Zellen vorliegt. Eine Konzentration von etwa
100 μM oder
weniger oder zumindest im Bereich der MHK Konzentration kann eingesetzt
werden, bevorzugt ist eine Konzentration von etwa 10 μM.
Wird
ein Konzentrationsgradient eingesetzt um eine Dosisabhängigkeit
der antimikrobiellen Wirkung und eine Verträglichkeit gegenüber eukaryontischen
Zellen über
einen breiten Konzentrationsbereich zu zeigen, werden gewöhnlich Konzentrationen
von 250 μM
bis weniger als 1/10 (ein zehntel) der MHK Konzentration oder weniger
eingesetzt.
Schritt b)
Eukaryontische
Zellen, die optional ein Reportergen tragen, oder Mischungen der
entsprechenden Zellen oder Zellinien können eingesetzt werden. Eine
beliebige Zellzahl pro Fläche
kann eingesät
werden, sofern ein vernünftiger
Quotient der Signale der Zellkontrolle und der Infektionskontrolle
erreicht wird. Die eingesäte
Zellzahl sollte nicht eine Menge überschreiten, bei der es während der
Inkubationszeit zur sogenannten Kontaktinhibition der Zellen kommt;
weiterhin sollte die Zellvitalität
nicht durch entstehende Zellstoffwechselprodukte oder Nährstoffmangel
beeinträchtigt
werden. Geeignete Zellzahlen erlauben eine klare Unterscheidung
zwischen möglichen
zytostatischen oder zytotoxischen Effekten der Testsubstanzen und
der Kontaktinhibition bzw. Nährstoffmangel
wie oben beschrieben.
Bespielsweise
sind 20 000 eukaryontische Zellen je Vertiefung einer 96 well MTP
bevorzugt.
Schritt c)
Mikroben,
die gegebenenfalls gentechnologisch manipuliert wurden, als auch
intra- oder extra-zellulär wachsende
mikrobielle Zellen oder Mischungen derselben werden dem Test in
der gewünschten
Infektionsdosis (multiplicity of infection (Mol)) zugefügt. Notwendig
ist eine mikrobielle Zellzahl, die direkt oder indirekt während der
Inkubationsdauer einen zytopathischen Effekt auf die eukaryontischen
Zellen ausübt,
so dass ein geeignetes Messsignal nach der entsprechenden Inkubationsdauer
generiert wird. Eine Mol von 10 bis 0,001 ist bevorzugt.
Schritt d)
Eine
Mikrotiterplatte, die mit einer Mischung der Assaykomponenten, nämlich der
Testsubstanz, den eukaryontischen Zellen und den Mikroben besteht,
wird unter den für
das Wachstum eukaryontischer Zellen optimalen Bedingungen für einen
entsprechenden Zeitraum inkubiert, um ein geeignetes Meßsignal
zu generieren.
Schritt e)
Der
Zellkulturüberstand
wird optional entfernt, die verbleibenden eukaryontischen Zellen
werden gegebenenfalls gewaschen und ein geeigneter Farbstoff oder
das entsprechende Reagenz zum Generieren des Signals im Falle der
reportergenexprimierenden eukaryontischen Zellen wird hinzugefügt, um das
Messsignal zu generieren, das mit Hilfe eines geeigneten Messgerätes oder
Kamerasystems bei den entsprechenden Wellenlängen aufgezeichnet wird.
Es
muss betont werden, dass die Arbeitsschritte a) b) und c) austauschbar
sind und gegebenenfalls sogar simultan ausgeführt werden können. Idealerweise
werden geeignete Farbstoffe beim Schritt e) zugesetzt, ohne vorher
den Zellkulturüberstand
zu entfernen und oder zusätzliche
Waschschritte durchzuführen, zum
Beispiel ist dieses möglich,
sofern definierte Zellkulturmedien eingesetzt werden, die nicht
mit dem Generieren des Messsignals interferieren. Dies kann auch
in einer Ausführungsform
dadurch erreicht werden, dass beim Test reportergenexprimierende,
eukaryontische Zellen eingesetzt werden, die es erlauben, nach der
entsprechenden Inkubationszeit ein geeignetes Messsignal aufzunehmen.
Die Vitalität
der Zellen kann prinzipiell vom Zeitpunkt des Inkubierens an kontinuierlich
(on-line) gemessen werden, indem die Zellen mit einem geeigneten
Reportersystem (z.B. GFP) versehen werden.
Der infektiologische
Assay
Im
Prinzip kann jede eukaryontische Zelle (inklusive derjenigen, die
ein sogenanntes Reportergen exprimieren) oder eine Mischung der
genannten eukaryontischen Zellen, die in der Lage sind ein geeignetes Testsignal
zu generieren und die Messung des entsprechenden Selektivitätsindex
erlauben, in diesem Assay eingesetzt werden. Die eukaryontischen
Zellen können
lange vor der Testinkubation eingesät werden; bevorzugt ist die
Zugabe der eukaryontischen Zellen zu einer für Zellkultur geeigneten Mikrotiterplatte,
die bereits einen Wirkstoff bzw. Testsubstanz geeigneter Konzentration
enthält.
Anschließend
infiziert man diese eukaryontischen Zellen dann mit dem entsprechendem
Inoculum (es handelt sich hierbei um Mikroben, inklusive derjenigen
die ein sogenanntes Reportergen tragen, oder Mischungen der Mikroben
die einen zytophatischen Effekt auf die infizierten eukaryontischen
Zellen ausüben)
wobei ein geeignetes Verhältnis
der multiplicity of infection (moi) einen signifikanten Unterschied
des Testsignals (read out) zwischen der eukaryontischen Zellkontrolle
oder auch der Therapiekontrolle (Antibiotikakontrolle) im Vergleich
zur Infektionskontrolle erlaubt. Es ist klar, dass alle drei Komponenten
gemischt und auf Mikrotiterplatten dispensiert werden können, aber
eine kurze Vorinkubationszeit der eukaryontischen Zellen vor der
Infektion kann ggf. das Identifizieren von Verbindungen erlauben,
die die Adhäsion
oder die Kolonisation der Mikroben an der Oberfläche der eukaryontischen Zellen
und oder die Invasion der Mikroben in die eukaryontischen Zellen
unterbinden.
Die
Testsubstanzen können
in jeder Konzentration vorliegen, idealerweise in einem Bereich,
der für die
eukaryontischen Zellen nicht toxisch ist, so dass eine antimikrobielle
Wirkung als Folge ein positives Testsignal generiert. Die Mikroben,
mag es sich um Gram-positive oder Gram-negative Bakterien oder intra-
or extrazellulär
wachsende Mikroben handeln, werden in einer Infektionsdosis von
(moi etwa 0,001 bis 10) hinzugefügt.
Es ist möglich
die moi über
einen weiten Bereich zu variieren und doch kann ein vernünftiges
Testsignal generiert werden, aber eine Veränderung der Infektionsdosis
oder der moi kann auch den IC50 und oder
das maximale Test signal entsprechend erhöhen oder zu niedrigeren Werten
verschieben. Der Assay wird dann für einen geeigneten Zeitraum
unter den für
die Zellkultur notwendigen Bedingungen wie Temperatur, Atmosphäre etc.
inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation werden die Mikrotiterplatten
gewaschen und das Testsignal oder das read out wird generiert. Eine
Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen kann für diverse Zelllinien eingesetzt werden,
während
Zelllinien mit Reportergen wie z.B. Luciferase, Green Fluorescent
Protein (GFP), Alkalische Phosphatase etc. im individuellen Fall
erst generiert oder erworben werden müssen; derartige Ausführungsformen
können
jedoch bessere Testsignal/Hintergrund-Verhältnisse liefern bzw. diverse
Schritte wie z.B. Waschschritte überflüssig machen.
