Die
Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen,
mit welchem die der Phagozytose nachgeschalteten Prozesse, also
insbesondere die Prozessierung und die Antigenpräsentation, untersucht werden
können.
Mit diesem Verfahren soll vor allem eine Diagnostizierbarkeit entsprechender
Krankheiten ermöglicht
werden, um dann den Defekt gegebenenfalls gezielt zu therapieren.
Insbesondere sollen mit dem neuen Verfahren Störungen der dendritischen Zellfunktionen
erfasst werden, die für
die Generierung einer primären
zytotoxischen T-Zellantwort
entscheidend sind. Mit dem neuen Verfahren sollen also zunächst die
zellulären Initiatoren
einer spezifischen Immunantwort detektiert werden können. Hierbei
handelt es sich insbesondere um Makrophagen, sowie um die verschiedenen
Vertreter der dendritischen Zellreihe, wie beispielsweise lymphoide
und myeloide dendritische Zellen, sowie deren im Blut zirkulierende
phänotypisch
definierbare Entwicklungsstadien. Diese verschiedenen Zellen sind
für die
Sensibilisierung und Rekrutierung von Gedächtniszellen der spezifischen Immunität verantwortlich
und sind daher wichtige Zielpunkte, um eventuelle Störungen zu
diagnostizieren bzw. zu therapieren.
Im
weiteren soll mit dem neuen Verfahren vor allem die Fähigkeit
zur Prozessierung dieser verschiedenen phagozytierenden Zellen sowie
deren Fähigkeit
zur Antigenpräsentation
untersucht werden können
bzw. sollen entsprechende Störungen
detektierbar sein. Mit dem neuen Verfahren soll daher die Diagnostik
von klinischen Krankheitsbildern, insbesondere von schweren Krankheitsbildern,
ermöglicht werden,
welche auf Defekten des molekularen „Traffickings" beruhen, wobei die
Phagozyto se von Fremdpartikeln, infektiösen Erregern oder Agenzien, toten
oder aberranten körpereigenen
Zellen, wie z. B. Tumorzellen, und die nachfolgende Prozessierung und
Präsentation
dieser Partikel gestört
oder beeinträchtigt
ist.
Im
weiteren soll mit dem neuen Verfahren ein Screening und/oder eine
Analyse von potentiellen therapeutisch wirksamen Substanzen, welche
die Immunantwort in gewünschter
Weise verändern,
ermöglicht
werden. Weiterhin sollen mit dem neuen Verfahren die Auswirkungen
von therapeutischen Eingriffen bei Störungen der Immunantwort untersucht
und analysiert werden können.
Darüber
hinaus soll mit dem neuen Verfahren ein Screening und/oder eine
Analyse von potentiellen pathogenen oder allergenen Substanzen ermöglicht werden,
welche Störungen
in den erwähnten
Prozessen der Immunantwort bewirken.
Diese
Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, wie es in Anspruch 1 beschrieben
ist. Bevorzugte Ausführungsformen
sind in den abhängigen
Ansprüchen
2 bis 26 dargestellt. Die Ansprüche
27 bis 30 betreffen verschiedene Verwendungen dieses Verfahrens.
Die Ansprüche
31 und 33 beanspruchen einen Reagenzien-Kit, welcher zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
geeignet ist. Der Wortlaut sämtlicher
Ansprüche
wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
dient der Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel
zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln
zu präsentieren.
Hierfür werden
zunächst
Partikel bereitgestellt, die durch Fluoreszenz markiert sind. Diese
Partikel enthalten mindestens ein pH-sensitives fluoreszierendes
Protein oder Peptid. Die markierten Partikel werden mit den Zellen
inkubiert, deren Aktivität
untersucht werden soll. Die Analyse der Zellen erfolgt durch fluoreszenzmikroskopische,
fluorimetrische und/oder fluoreszenzzytometrische Methoden. Entscheidend
für dieses
Verfahren ist, dass die Fluoreszenz zumindest teilweise über mindestens
12 Stunden detektierbar ist. Die zeitliche Persistenz der Fluoreszenz
ist von den jeweils gewählten
experimentellen Bedingungen abhängig.
Beispielsweise hat die Aktivität
der Zellen einen Einfluss auf die Detektierbarkeit der Fluoreszenz.
Von daher stellt die Zeitangabe von 12 Stunden einen Anhaltspunkt
dar, der gewissen Schwankungen unterliegen kann.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
beruht also auf der Aufnahme von phagozytierbaren Partikeln, die
beispielsweise einen Modellerreger repräsentieren. Diese Partikel sind
durch pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide und insbesondere
durch fluoreszierende Proteine markiert, so dass durch die Phagozytose
dieser fluoreszierenden Partikel eine Akkumulation der Fluoreszenz
im Zellinneren sichtbar und quantifizierbar wird. Im Verlauf der Prozessierung
der Partikel bzw. der Modellerreger nimmt die Fluoreszenz im Zellinneren
durch den zellspezifischen Abbau der pH-sensitiven fluoreszierenden
Proteine oder Peptide oder deren Inaktivierung ab. Liegt bei den
zu untersuchenden Zellen beispielsweise eine Störung der Prozessierungskapazität nach erfolgter
Phagozytose vor, findet im Vergleich zu geeigneten Kontrollzellen
keine Abnahme der Fluoreszenz im Zellinneren statt, so dass hierdurch Rückschlüsse auf
die Prozessierungsaktivität
bzw. die Prozessierungskapazität
gezogen werden können.
Daneben kann selbstverständlich
auch eine Störung
der Phagozytoseaktivität
festgestellt werden, bei welcher im Vergleich mit Kontrollen im
Zellinneren verminderte oder fehlende Fluoreszenz beobachtet wird.
Darüber
hinaus kann die Fähigkeit
der Zellen untersucht werden, die phagozytierten Partikel nach einer
Fragmentierung auf der Oberfläche
zu präsentieren,
welches die Voraussetzung für
die Ausbildung der spezifischen Immunität darstellt. Die für dieses
Verfahren eingesetzte Fluoreszenz ist zumindest teilweise über mindestens
12 Stunden detektierbar. Das heißt, dass die verwendete Fluoreszenz nach
12 Stunden in den Zellen noch nachweisbar ist, soweit nicht zelluläre Einflüsse einen
Abbau der Fluoreszenz bewirken.
Vorteilhafterweise
handelt es sich bei den zu untersuchenden Zellen um Zellen, die
zur Phagozytose in der Lage sind. Besonders geeignet sind Säugerzellen,
insbesondere Zellen des Immunsystems. Vorteilhafterweise handelt
es sich um myeloische Zellen, also Zellen, deren Vorstufen im Knochenmark
generiert werden, sowie Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, Endothelzellen
und dendritische Zellen. Insbesondere die dendritischen Zellen sind
für das
erfindungsgemäße Verfahren
von besonderem Interesse, da dies äußerst potente antigenpräsentierende
Zellen sind, die im wesentlichen die primäre zytotoxische T-Zellantwort
induzieren und für
die Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg) verantwortlich
sind. Weiterhin können
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
von diesen Zellen abgeleitete Differenzierungsprodukte und/oder
Vorstufen bzw. Vorläufer
dieser Zellen untersucht werden. Andererseits können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
auch andere Zellen untersucht werden, soweit sie phagozytotisch
aktiv sind, beispielsweise Schleimpilze, einzellige niedere Organismen
oder ähnliches.
Die
Detektion der Fluoreszenz bzw. der pH-sensitiven fluoreszierenden
Proteine oder Peptide im Zuge der Analyse der Zellen kann sowohl
lichtmikroskopisch als auch fluoreszenzmikroskopisch und insbesondere
durch automatisierte Verfahren erfolgen. Besonders bevorzugt ist
hierbei die Durchflusszytometrie oder die Fluorimetrie, insbesondere in
Plattenmessgeräten.
Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden die markierten Partikel bzw. die Modellerreger mit Zellen
im Vollblut oder in isolierter Form vorteilhafterweise in einer
Weise inkubiert, die einen Ablauf normaler physiologischer Vorgänge ermöglicht.
Hierfür
werden beispielsweise geeignete Pufferlösungen eingesetzt, welche für ein physiologisches
Milieu sorgen. Während
dieser Inkubation werden die markier ten Partikel von den Zellen
entsprechend ihrer Phagozytoseaktivität aufgenommen, so dass die
Zellen nach erfolgter Phagozytose durch die Fluoreszenz der aufgenommenen
Partikel markiert sind. Bereits diese Phagozytoseaktivität der zu
untersuchenden Zellen kann durch entsprechende Analyse der Fluoreszenz
der Zellen, beispielsweise durch Verwendung eines Fluoreszenzzytometers
oder durch fluorimetrische Plattenmessgeräte, ausgewertet werden. Im
weiteren Verlauf des Verfahrens bzw. der Inkubation befinden sich
die phagozytierten Partikel innerhalb der zu untersuchenden Zellen
und treten hier mit dem Degradationsapparat der Zellen in Kontakt.
Der Abbau bzw. die Degradation oder Fragmentierung der aufgenommenen
Partikel hängt
von der Fusion der primären
Endosomen, innerhalb welcher die phagozytierten Partikel zunächst eingeschlossen
sind, mit Lysosomen in den phagozytierenden Zellen ab. Diese Lysosomen
sind mit unterschiedlichen Enzymen ausgerüstet, welche unter anderem
die Zerstörung
bzw. Fragmentierung der phagozytierten Partikel und der Bestandteile
der Partikel bewirken. Bei einem typischen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind zunächst
die Partikel bzw. die Modellerreger nach erfolgter Phagozytose unter
dem Fluoreszenzmikroskop noch als granuläre Strukturen erkennbar. Erfolgt
im weiteren Verlauf der Prozessierung ein weiterer Abbau des Partikels, so
verteilt sich das Fluoreszenzsignal scheinbar gleichmäßig im Zytoplasma
der phagozytierenden Zelle. Diese Analysierbarkeit des weiteren
Schicksals der phagozytierten Partikel stellt einen besonderen Vorteil
des erfindungsgemäßen Verfahrens
dar, da dies bei herkömmlichen
Verfahren nicht möglich ist.
Das
Schicksal eines Partikels nach erfolgter Phagozytose in der Zelle
hängt insbesondere
von der Stabilität
der zu prozessierenden Bestandteile bzw. der Proteine des Partikels
ab. Hierfür
spielen zunächst
vor allem die biochemische Beschaffenheit des Proteins und weiterhin
die Enzymaktivierung in der zu untersuchenden Zelle eine Rolle.
Die Kinetik des Proteinabbaus wird durch eine Denaturierung in Folge
der sauren pH-Bedingungen in den Lysosomen sowie durch eine Degradation
bzw. einen Abbau in Folge von Proteolyse und/oder Oxidation beeinflusst.
Obwohl
die im erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzte Fluoreszenz bzw. die entsprechenden pH-sensitiven fluoreszierenden
Proteine oder Peptide, wobei es sich hierbei im wesentlichen um fluoreszierende
Proteine handelt, aufgrund ihrer Tertiärstruktur im wesentlichen stabil
sind, kommt es bei funktionsfähigen
phagozytierenden Zellen mit der Zeit zu einem Abbau der fluoreszierenden
Proteine, insbesondere durch die Wirkung von saurem pH-Wert, reaktiven
Sauerstoffspezies und/oder Proteasen. Die damit verbundene Zerstörung der
Tertiärstruktur
der fluoreszierenden Proteine bzw. der pH-sensitiven fluoreszierenden
Proteine oder Peptide führt
zu einem Verlust der Fluoreszenz. Damit kann erfindungsgemäß die Kapazität der zur
Phagozytose fähigen
Zellen zum Abbau von Proteinen gezeigt und quantifiziert werden.
Durch die Analyse der Zellen im Durchflusszytometer oder in anderen
geeigneten Messgeräten
kann diese Kapazität
anhand des Fluoreszenzverlustes der zu untersuchenden Zellen quantifiziert
werden. Dies erfolgt bevorzugt nach einer ausreichenden Inkubationszeit,
innerhalb derer die entsprechenden Phagozytose- und Prozessierungsprozesse
in der Zelle abgelaufen sind. Bevorzugterweise werden diese Inkubationszeiten
standardisiert. Weiterhin können
vorteilhafterweise unterschiedliche Inkubationszeiten eingesetzt
werden, um so Rückschlüsse auf
zeitliche Verläufe
der entsprechenden Prozesse ziehen zu können.
Besondere
Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens
liegen in der Automatisierbarkeit des Verfahrens sowie in den kostengünstigen
und einfachen Bereitstellungsmöglichkeiten
für die
benötigten Nachweissubstanzen.
Bei
den Partikeln, die von den zu untersuchenden Zellen zu phagozytieren
sind, handelt es sich vorteilhafterweise um membranumhüllte Strukturen.
Hierbei können
die Partikel beispielsweise eine Doppelmembran aufweisen, z.B. wie
bei Eukaryonten, bestimmten Viren, artifiziellen Vesikeln oder Exosomen,
oder eine Einzelmembran, wie z.B. bei Prokary onten. Besonders bevorzugt
ist es, wenn die Partikel Rezeptoren aufweisen, die durch eine sogenannte
Opsonisierung die Phagozytose erleichtern. In bevorzugten Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind die Partikel Bakterien, Cyanobakterien, Pilze und/oder eukaryontische
Zellen wie beispielsweise Tumorzellen, sowie von Tumorzellen abstammende
Partikel, wie beispielsweise Exosomen oder Organellen, welche durch
Fluoreszenz markiert sind. Weiterhin kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
auch die Phagozytose, Prozessierung und/oder Präsentation von Viren mit Vorteil
untersucht werden.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden synthetische Partikel, wie beispielsweise Lipidvesikel oder
auch Latexkügelchen,
eingesetzt. Diese Partikel dienen vor allem als Trägersubstanzen
für die
pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide bzw. Antigene,
deren weitere Prozessierung im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens
verfolgt wird.
Vorteilhafterweise
handelt es sich bei den Partikeln um infektiöse Partikel, welche bei Immunreaktionen
eine Rolle spielen. Um entsprechende Immunreaktionen zu untersuchen,
können
derartige infektiöse
Partikel im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt
werden. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, wenn von derartigen
Partikeln abgeleitete Partikel eingesetzt werden, die insbesondere
für den Menschen
nicht infektiös
sind. Dies hat den Vorteil, dass hierdurch das erfindungsgemäße Verfahren ohne
Sicherheitsrisiken durchgeführt
werden kann. Um die wichtigsten infektiösen Partikel bzw. Erreger abzudecken,
werden vorzugsweise folgende Modellerreger als Partikel im erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt: Escherichia coli als Gram-negativer Erreger, der beispielsweise
bei abdominalchirurgischen Eingriffen eine Rolle spielt, und/oder
Staphylokokken als Vertreter Gram-positiver Erreger, welche insbesondere
bei Pneumonien involviert sind. Andererseits können auch Viren verwendet werden, welche
akute, chronische und/oder latente In fektionen auslösen können. Insbesondere
für die
Untersuchung von infektiösen
Viren werden vorteilhafterweise rekombinante, nicht-infektiöse und/oder
transformationsdefekte Organismen eingesetzt, die auf der Oberfläche beispielsweise
Eigenschaften von häufigen
Viren wie CMV oder EBV oder von Tumorantigenen exprimieren. Bei
der Verwendung von eukaryontischen Zellen als Partikel kommen insbesondere
solche Zellen in Frage, die in Säugerorganismen
Tumore bilden können.
Hierbei kann es sich beispielsweise auch um autologe Tumorzellen
handeln, um durch das erfindungsgemäße Verfahren die Immunitätslage gegen
einen Tumor zu prüfen.
Neben den beispielhaft erwähnten
Partikeln kommen auch jeweils Fragmente dieser Partikel für das erfindungsgemäße Verfahren
in Frage.
Die
Partikel bzw. die Modellerreger können sowohl im lebendigen und/oder
funktionellen Zustand als auch im inaktivierten Zustand eingesetzt werden.
Eine Inaktivierung kann z. B. durch Fixierung der eingesetzten Mikroorganismen
erfolgen und hat den Vorteil, dass beispielsweise bei infektiösen Partikeln
Sicherheitsrisiken weitgehend vermieden werden.
Für die Bereitstellung
von mit Fluoreszenz markierten Partikeln können unterschiedliche pH-sensitive
fluoreszierende Proteine oder Peptide verwendet werden. Für den Einsatz
im erfindungsgemäßen Verfahren
eignen sich grundsätzlich
alle fluoreszierenden Proteine bzw. Peptide, die eine ausreichend
langfristige Detektierbarkeit bzw. eine entsprechende Stabilität aufweisen.
Neben natürlich
vorkommenden fluoreszierenden Proteinen und Peptiden können auch
solche Proteine und Peptide verwendet werden, die durch chemische
und/oder molekularbiologische Methoden verändert wurden. Sowohl natürlich vorkommende
als auch künstlich
veränderte
fluoreszierende Proteine oder Peptide können durch rekombinante Expression
hergestellt und mit den zu phagozytierenden Partikeln verknüpft werden
oder aber selbst innerhalb der Partikel durch rekombinante Expression
exprimiert werden. Im folgenden soll unter dem Ausdruck „Protein" auch ein Peptid
verstanden werden, selbst wenn dies nicht ausdrücklich erwähnt ist.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird als pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid das
grün fluoreszierende
Protein aus Aequorea victoria oder ein davon ableitbares Protein
oder Peptid eingesetzt. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise
auf die deutsche Offenlegungsschrift
DE
197 18 640 verwiesen, welche geeignete fluoreszierende
Proteine beschreibt. Bisher wurden diese fluoreszierenden Proteine üblicherweise
zum Nachweis der Lokalisation von Fusionsproteinen oder zur Messung
der Genaktivität
verwendet. Gemäß der vorliegenden
Erfindung können
diese pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide nun verwendet
werden, um phagozytierbare Partikel, beispielsweise Bakterien oder
andere Mikroorganismen, zu markieren. Weiterhin können mit
diesen pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden auch
eukaryontische Zellen, insbesondere Tumorzellen, markiert und für das erfindungsgemäße Verfahren
eingesetzt werden. Der besondere Vorteil bei der Verwendung dieses
grün fluoreszierenden Proteins
bzw. davon ableitbarer Proteine oder Peptide ist die außerordentliche
Stabilität
dieser Fluoreszenzfarbstoffe (Green Fluorescent Protein – Properties,
Applications and Protocols. Martin Chalfie and Steven Kain (eds.).
Wiley-Liss, New York, 1998). Das grün fluoreszierende Protein aus
Aequorea victoria und davon ableitbare Proteine und Peptide sind
daher aufgrund ihrer außerordentlichen
Stabilität
in besonderer Weise für
das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
handelt es sich bei dem pH-sensitiven fluoreszierenden Protein oder
Peptid um ein Protein oder Peptid mit einem Fluorophor, welches
aus mindestens drei Aminosäuren
besteht. Hierbei handelt es sich bevorzugterweise bei der zweiten
Aminosäure
dieser mindestens drei Aminosäuren
des Fluorophors um Tyrosin und/oder bei der dritten Aminosäure um Glycin.
Die erste Position ist variabel.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist das pH-sensitive fluoreszierende Protein oder Peptid ein Photosynthesepigment,
z. B. Chlorophyll, oder akzessorische Photosynthesepigmente, wie
beispielsweise Phycobiliproteine. Ganz besonders bevorzugt ist die
Verwendung von Phycoerythrin als pH-sensitives fluoreszierendes
Protein oder Peptid.
Erfindungsgemäß handelt
es sich bei dem eingesetzten Fluoreszenzfarbstoff um ein pH-sensitives
fluoreszierendes Protein oder Peptid. Bestimmte Immundefekte gehen
mit einem abnormalen pH-Milieu in den Lysosomen der phagozytierenden
Zellen einher. Um solche Defekte nachweisen zu können, ist es besonders vorteilhaft,
Partikel bzw. Modellerreger im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen,
welche mit pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden
markiert sind. Vorzugsweise zeigen solche fluoreszierenden Proteine
oder Peptide bei saurem pH-Wert eine Abnahme der Fluoreszenz. Der Inhalt
von Lysosomen zeigt im Normalfall einen sauren pH-Wert von etwa
pH 4-5. Bei der Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
unter Verwendung von pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder
Peptiden erfolgt daher bei normalem, sauren pH-Milieu in den Lysosomen
eine unmittelbare Abnahme der Fluoreszenz nach Verschmelzung des primärem Endosoms
mit den Lysosomen. Fehlt diese unmittelbare Abnahme der Fluoreszenz,
kann auf ein abnormales pH-Milieu in den Lysosomen und einen entsprechenden
Immundefekt geschlossen werden. Als besonders geeignetes pH-sensitives
fluoreszierendes Protein kann das fluoreszierende Protein IhFP516/581
eingesetzt werden (Schmitt, F. (2003) Ein neuartiges von grün nach rot
photokonvertierendes Fluoreszenzprotein aus der indopazifischen Steinkoralle
Lobophyllia hemprichii, Ehrenberg, 1834 (Cnidaria, Anthozoa) Diplomarbeit,
Universitätsbibliothek
Ulm).
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
weisen die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens ein natürlicherweise
exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid
auf. Besonders bevorzugt werden als Partikel autofluoreszierende Mikroorganismen
eingesetzt, insbesondere Bakterien, Cyanobakterien (Blaualgen) und/oder
Algen. Vorteilhaft sind hierbei insbesondere die Dinoflagellaten, vorzugsweise
endosymbiontische Dinoflagellaten. Weiterhin können auch Fragmente dieser
Partikel eingesetzt werden. Diese Auto- bzw. Eigenfluoreszenz der
Mikroorganismen hat den Vorteil, dass diese Partikel ohne weitere
Markierungsreaktionen eingesetzt werden können, da sie aus sich heraus
die für
das erfindungsgemäße Verfahren
erforderliche Fluoreszenz aufweisen.
Weiterhin
ist es bevorzugt, wenn die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens
ein rekombinant exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein
oder Peptid aufweisen. Dies wird insbesondere durch eine autokatalysierte
Bildung des Fluorophors in fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden ermöglicht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird hierbei mindestens ein fluoreszierendes Protein oder Peptid
innerhalb der Partikel exprimiert. Es kann sich um Partikel handeln,
die ein oder mehrere fluoreszierende Proteine oder Peptide natürlicherweise
exprimieren oder aber auch um Partikel, bei welchen eine entsprechende
Expression aufgrund von gentechnischer Manipulation erfolgt. Für eine geeignete
rekombinante Expression der fluoreszierenden Proteine oder Peptide
innerhalb der Partikel, insbesondere innerhalb der Modellerreger,
wird die entsprechende kodierende DNA in der Weise in den Modellerreger eingebracht,
dass ein Expression des Proteins oder Peptids im Organismus selbst
möglich
ist. Hierfür wird
die entsprechende kodierende DNA beispielsweise unter die Kontrolle
eines geeigneten Promotors gestellt und insbesondere in Form eines
geeigneten Vektors in den Organismus, der als Partikel eingesetzt
wird, eingebracht. Vorzugsweise werden entsprechende Proteine oder
Peptide stabil und über einen
längeren
Zeitraum exprimiert, so dass die Partikel ohne weitere Vorbereitung
für das
erfindungsgemäße Verfahren
eingesetzt werden können.
Andererseits kann es auch vorteilhaft sein, wenn die Partikel das
oder die entsprechenden Proteine und/oder Peptide transient, also
vorübergehend,
exprimieren. In diesem Fall müssen
die entsprechenden Partikel bzw. Modellerreger in der Regel vor
der Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit molekularbiologischen Methoden behandelt werden. Entsprechende
Vorgehensweisen erschließen
sich dem Fachmann.
In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
werden ein oder mehrere pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder
Peptide an die Partikel gebunden, indem sie beispielsweise an die
Oberfläche des
Partikels angekoppelt werden. Hierfür können z. B. natürlich vorkommende
fluoreszierende Proteine und/oder Peptide gereinigt bzw. angereichert
werden, um sie sodann an die zu phagozytierenden Partikel mit herkömmlichen
Methoden zu binden. Andererseits können auch rekombinant hergestellte
fluoreszierende Proteine und/oder Peptide für diesen Zweck eingesetzt werden.
Durch die Bindung an vergleichsweise große Partikel, die beispielsweise
einen Durchmesser von 1-2 μm
aufweisen, kann die Aufreinigung der fluoreszierenden Proteine und/oder
Peptide und die Markierung der Partikel z. B. durch Filtrations-
und/oder Zentrifugationstechniken vorteilhafterweise in einem Schritt
erfolgen. Ein bevorzugtes Beispiel für eine Kopplung der fluoreszierenden
Proteine oder Peptide ist eine Kopplung über Biotin-Streptavidin-Bindungen.
Besonders
bevorzugt ist es, wenn fluoreszierende Proteine und/oder Peptide,
insbesondere rekombinante Proteine und/oder Peptide, spezifisch
an die Partikel gebunden werden. Beispielsweise erfolgt eine Bin dung
bzw. Immobilisierung der fluoreszierenden Proteine über metallaffine
Peptidanhängsel,
die insbesondere durch molekularbiologische Methoden an das fluoreszierende
Protein angefügt
sind. Derartige Peptidanhängsel
(tags) werden üblicherweise
in der Affinitätschromatographie
verwendet. Ein Beispiel hierfür
ist das sogenannte 6x-Histidin-Tag.
Neben rekombinant hergestellten fluoreszierenden Proteinen und/oder
Peptiden, die insbesondere noch weitere Funktionalitäten wie
beispielsweise die genannten Peptidanhängsel tragen können, welche
für eine
Bindung an die Partikel bzw. eine Immobilisierung vorteilhaft sind,
können
auch natürlicherweise vorkommende
fluoreszierende Proteine oder Peptide an entsprechende Partikel
gebunden werden. Ein Beispiel hierfür ist das Phycobiliprotein
Phycoerythrin.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden die pH-sensitiven
fluoreszierenden Proteine oder Peptide mit weiteren Peptiden und/oder Proteinen
gekoppelt. Diese Kopplung erfolgt vorzugsweise durch eine Fusion
der Peptide bzw. Proteine, so dass das pH-sensitive fluoreszierende
Protein oder Peptid als Fusionsprotein exprimiert wird. Sollen beispielsweise
Viren als Partikel bzw. Modellerreger verwendet werden, erfolgt
deren Fluoreszenzmarkierung bevorzugterweise durch einen geeigneten Wirtsorganismus.
Hierfür
wird die genetische Information des Virus insoweit verändert, dass
ein oder mehrere virale Proteine in Fusion mit fluoreszierenden
Proteinen oder Peptiden exprimiert werden. Auch die bereits erwähnte Kombination
der fluoreszierenden Proteine oder Peptide mit Peptidanhängseln oder ähnlichem,
welche eine Bindung der fluoreszierenden Proteine oder Peptide an
die Partikel ermöglicht
oder erleichtert, kann durch eine Fusion der fluoreszierenden Proteine
oder Peptide mit entsprechenden Peptiden oder Proteinen erreicht
werden, welche entsprechende Funktionalitäten bereits tragen.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
weisen die mit Fluoreszenz markierten Partikel minde stens zwei verschiedene
pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide auf. Hierbei
können
entweder verschiedenartige Partikel jeweils unterschiedliche pH-sensitive
fluoreszierende Proteine oder Peptide tragen, oder aber eine Art
von Partikeln weist verschiedene pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder
Peptide auf. Besonders bevorzugt ist es, wenn eine Art von Partikeln,
beispielsweise Bakterien, Cyanobakterien und/oder Algen, ein natürlicherweise exprimiertes
pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid sowie mindestens
ein rekombinant exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein
oder Peptid aufweisen. Selbstverständlich werden von der Erfindung
auch Partikel umfasst, die zwei oder mehr rekombinant exprimierte
verschiedene pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide
aufweisen.
Besonders
vorteilhaft ist es, wenn die verschiedenen pH-sensitiven fluoreszierenden
Proteine oder Peptide insbesondere in Folge unterschiedlicher Emissionsspektren
unterscheidbare Fluoreszenzen bewirken. Dies kann für verschiedene
Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens
in vorteilhafter Weise ausgenutzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
dieses erfindungsgemäßen Aspektes reagieren
die verschiedenen pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide,
welche die unterscheidbaren Fluoreszenzen bewirken, unterschiedlich
auf die intrazellulären
Aktivitäten
der zu untersuchenden Zellen. Beispielsweise wird eines dieser pH-sensitiven
fluoreszierenden Proteine oder Peptide, insbesondere eines der fluoreszierenden
Proteine, schneller durch die intrazellulären Enzyme abgebaut als das
andere fluoreszierende Protein. Dies kann dadurch verursacht sein,
dass beispielsweise eines der fluoreszierenden Proteine bestimmte Schnittstellen
für intrazelluläre Proteasen
aufweist, wohingegen das andere Protein diese Schnittstellen nicht
enthält.
Weiterhin kann es sich beispielsweise bei einem der fluoreszierenden
Proteine um ein pH-sensitives fluoreszierendes Protein handeln und bei
dem anderen um ein Protein, welches von dem pH-Wert innerhalb der
Zelle im wesentlichen unbeeinflusst ist. Darüber hinaus kann es sich bei
einem der fluoreszierenden Proteine um ein Protein handeln, dessen
Fluoreszenz bei Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies schneller
abnimmt als bei dem anderen Protein, dessen Fluoreszenz unter diesen
Bedingungen weitgehend stabil bleibt.
Besonders
bevorzugt ist es, dass die pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine
oder Peptide bzw. insbesondere die fluoreszierenden Proteine, welche
die unterscheidbaren Fluoreszenzen bewirken, unterschiedliche Stabilitäten aufweisen.
Hierbei kann es sich beispielsweise um kompartimentspezifische Stabilitäten handeln.
Die Bedingungen (z.B. pH-Wert, Proteaseaussstattung) in den verschiedenen
Kompatimenten (z.B. Exosomen, Lysosomen) können sehr unterschiedlich sein.
Durch die Verwendung von pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder
Peptiden, die jeweils auf bestimmte dieser Bedingungen reagieren,
können
Aussagen zu kompartimentspezifischen Abläufen gemacht werden.
Ein
besonderer Vorteil bei der Verwendung von verschiedenen und unterscheidbaren
pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden liegt weiterhin
darin, dass beispielsweise durch die Verwendung fluoreszierender
Proteine mit unterschiedlicher Farbe und Stabilität die Quantifizierung
der Prozessierungskapazität
der zu untersuchenden Zellen verbessert werden kann. Hierbei wird
durch die Verwendung zweier unterschiedlich fluoreszierender Proteine,
die sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber zellulären Abbausystemen unterscheiden,
die Prozessierungskapazität
phagozytierender Zellen messbar, wie sie beispielsweise durch die
Proteaseaktivität
der beteiligten Enzyme bewirkt wird. Das stabilere Protein dient
als interner Standard zur Quantifizierung der inkorporierten Proteinmenge,
wohingegen das instabilere Protein als Zeiger für beispielsweise den proteasebedingten
Abbau dient. Diese Form des Tests ermöglicht zum Beispiel die Diagnose
von Immundefekten, die durch eine abnormale oder fehlende Proteaseaktivität ausgelöst werden.
Hierfür
können
beispielsweise Unterschiede zwischen natürlich vorkommenden fluoreszierenden
Proteinen oder Peptiden ausgenutzt werden. Darüber hinaus können fluoreszierende
Proteine eingesetzt werden, bei denen solche Unterschiede künstlich,
insbesondere durch molekularbiologische Methoden, erzeugt wurden.
Dies geschieht beispielsweise durch eine gezielte Stabilisierung
durch Entfernung von geeigneten Proteaseschnittstellen und/oder
durch eine gezielte Destabilisierung durch Hinzufügung von
geeigneten Proteaseschnittstellen.
Ein ähnlicher
Parallelansatz kann mit einem pH-sensitiven fluoreszierenden Protein
und einem andersfarbigen stabileren fluoreszierenden Protein, welches
als interner Standard dient, durchgeführt werden. Hierdurch können in
besonders vorteilhafter Weise Aussagen über Störungen im pH-Milieu der Lysosomen
getroffen werden, wie es weiter oben schon beschrieben ist. In diesem
Fall darf das Protein oder Peptid, welches als interner Standard
dient, keine oder nur wenig pH-Abhängigkeit der Fluoreszenz aufweisen.
Ein Beispiel für
ein stabiles Protein, welches im wesentlichen pH-unabhängig ist,
ist das rot fluoreszierende Protein egFP611 (Wiedenmann et al. (2002)
Proc Natl Acad Sci 99:11646-11651).
Als pH-sensitives fluoreszierendes Protein kann das Protein IhFP516/581
eingesetzt werden.
In
einem vergleichbaren Parallelansatz werden fluoreszierende Proteine
oder Peptide verwendet, welche sich sowohl insbesondere in der Farbigkeit
der Fluoreszenz als auch hinsichtlich der Stabilität gegenüber reaktiven
Sauerstoffspezies unterscheiden. Hierdurch können in besonders vorteilhafter
Weise Aussagen über
die Beteiligung reaktiver Sauerstoffspezies an Abbauprozessen getroffen
werden.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
bei welchem die Partikel mindestens zwei unterscheidbare Fluoreszenzen
aufweisen, werden diese Fluoreszenzen durch mindestens zwei verschiedene
pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide bewirkt. Andererseits
kann es auch sehr vorteilhaft sein, wenn die unterscheidbaren Fluores zenzen
durch mindestens zwei unterscheidbare fluoreszierende Zustände eines
Proteins bewirkt werden. Diese verschiedenen fluoreszierenden Zustände eines
Proteins unterschieden sich vorzugsweise hinsichtlich ihrer Stabilität. Ein Beispiel
hierfür
ist das fluoreszierende Protein IhFP516/681 aus Lobophyllia hemprichii.
Dieses Protein kann durch Bestrahlung mit kurzwelligem Licht gezielt
und irreversibel von einer grün
fluoreszierenden in eine rot fluoreszierende Form überführt werden.
Der Grad der Photokonversion und damit das Mengenverhältnis zwischen
grün und
rot fluoreszierender Form ist beispielsweise durch die Intensität und Dauer
der Bestrahlung steuerbar und kann auch innerhalb eines Partikels,
insbesondere innerhalb eines Modellerregers, durchgeführt werden.
Beide Zustände
sind pH-sensitiv. Die rot fluoreszierende Form zeigt eine geringere
Widerstandsfähigkeit
gegenüber reaktiven
Sauerstoffspezies. Wird sowohl die Grün- als auch die Rotfluoreszenz
quantifiziert, beispielsweise in einem Fluoreszenzzytometer, kann
aus deren Verhältnis
die Abbaukapazität
und damit die Prozessierungsaktivität der zu untersuchenden Zellen berechnet
werden.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Präsentation
von Fragmenten der phagozytierten Partikel durch die zu untersuchenden
Zellen untersucht. Diese Untersuchung der sogenannten Antigenpräsentation
erfolgt entweder zusätzlich
zur Analyse der Prozessierungskapazität bzw. der Prozessierungsaktivität der Zellen
oder wird davon unabhängig
durchgeführt.
Zur Untersuchung der Antigenpräsentation
werden Fragmente der fluoreszierenden Proteine oder Peptide und/oder
Fragmente der mit diesen Proteinen oder Peptiden fusionierten Peptide
und/oder Proteine analysiert, welche auf der Oberfläche der
zu untersuchenden Zellen im Zuge der Antigenpräsentation erscheinen. Die prozessierten
Bestandteile bzw. Fragmente werden als Peptide einer relativ konstanten Länge von
bestimmten Immunzellen, insbesondere von dendritischen Zellen, an
deren Oberfläche
präsentiert.
Das Verständnis
dieser Zusammenhänge
ist vor allen Dingen im Zu sammenhang mit Überlegungen zu Vakzinierungsstrategien
diskutiert worden (Hung and Wu (2003) Curr Opin Mol Ther 5 (1):
20-4). Die Antigenpräsentation
ist die Voraussetzung für den
Ablauf der weitergehenden Immunreaktionen eines Säugerorganismus.
Das erfindungsgemäße Verfahren
ist in ganz besonders vorteilhafter Weise dazu geeignet, diese Vorgänge und
insbesondere die Kapazität
der phagozytierenden Zellen, Antigene zu präsentieren, zu untersuchen.
Durch die im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten fluoreszierenden Proteine oder Peptide werden definierte
Antigene in die phagozytierenden Zellen eingebracht.
Da
diese Proteine oder Peptide im Säugerorganismus
in der Regel natürlicherweise
nicht vorkommen, können
daraus abgeleitete Antigene mit großer Sicherheit nachgewiesen
werden.
Bevorzugterweise
werden hierfür
die präsentierten
Fragmente mit Antikörpern
nachgewiesen, die Fragmente der fluoreszierenden Proteine oder Peptide
erkennen. Hierfür
kommen grundsätzlich
polyklonale und monoklonale Antikörper in Frage. Besonders bevorzugt
sind monoklonale Antikörper,
da diese eine besonders große
Spezifität
für die
zu erkennenden Antigene zeigen. In einer besonders vorteilhaften
Ausführungs
form werden diese Antikörper markiert,
wodurch der Nachweis der Bindung der Antikörper an die jeweiligen Antigene
erleichtert werden kann. Beispielsweise können hierfür die Antikörper mit unterscheidbaren Fluoreszenzfarbstoffen
markiert sein. Es können
auch andere Methoden zum Nachweis der Antikörper eingesetzt werden. Mit
Vorteil können
die Antikörper
durch geeignete zweite Antikörper,
die z. B. eine nachweisbare enzymatische Funktion tragen, detektiert
werden. Einzelheiten hierzu erschließen sich dem Fachmann.
Weiterhin
können
die präsentierten
Fragmente auch mit zellulären
Rezeptoren nachgewiesen werden. Als zelluläre Rezeptoren sind vor allem
solche Rezeptoren bevorzugt, die als physiologische Strukturen das
jeweilige präsentierte
Fragment erkennen und binden. Diese Rezeptoren können als sehr spezifische und
wirksame Werkzeuge zum Nachweis und zur Detektion der Antigenpräsentation eingesetzt
werden.
In
dem Fall, dass die fluoreszierenden Proteine bzw. fluoreszierenden
Peptide mit anderen Peptiden oder Proteinen fusioniert sind, können Fragmente
dieser Fusionspartner mit geeigneten Antikörpern nachgewiesen werden.
Weiterhin können
auch andere spezifische Antigene, die sich aus Bestandteilen der
Partikel, insbesondere der Modellerreger, herleiten, mit geeigneten
Antikörpern
nachgewiesen werden. Diese Antigene, wie z. B. Tumorantigene, können natürlicherweise
oder durch künstliche
Veränderung
in den Partikeln bzw. Modellerregern vorkommen.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
bei welchem die Antigenpräsentationskapazität der Zellen
untersucht wird, sind die fluoreszierenden Proteine oder Peptide
oder die mit diesen fusionierten Peptide oder Proteine in der Weise
mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, dass sie auch nach der Prozessierung
ihre Fluoreszenz beibehalten. Dies bewirkt, dass das prozessierte
Frag ment, welches an der Oberfläche
der Zellen präsentiert
wird, selbst weiterhin fluoresziert und somit direkt an der Zelloberfläche detektiert
werden kann. Unter Fluoreszenzfarbstoff ist hierbei die fluoreszierende
Komponente eines Proteins oder Peptids zu verstehen, welches dem
jeweiligen Protein oder Peptid die fluoreszierenden Eigenschaften
verleiht. Die Detektion dieser Fluoreszenzen an der Oberfläche kann
mit üblichen
Methoden erfolgen, insbesondere mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie
und/oder der Durchflusszytometrie. Daneben kann die spezifische
Lokalisation an der Zelloberfläche
beispielsweise nach Zugabe von geeigneten zellimpermeablen Quenching-Substanzen geprüft werden.
Ein
besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin,
dass dieses Verfahren sowohl mit isolierten phagozytierenden Zellen
als auch mit Vollblut oder im kompletten Knochenmark durchgeführt werden
kann. Bei der Vollblutanwendung ist es im allgemeinen vorteilhaft,
vor der Fluoreszenzmessung die nicht-phagozytierenden Zellen, insbesondere
Erythrozyten, zu entfernen. Dies kann durch physikalische Metho
den und/oder beispielsweise durch Lyse erfolgen. Die Lyse kann mit
Hilfe einer nicht-isotonischen Lösung,
also einer hypotonen Lösung,
vorgenommen werden, wobei die Bedingungen vorteilhafterweise so
gewählt
werden, dass vor allem die Erythrozyten und nicht die phagozytierenden
Zellen zerstört
werden. Dies kann beispielsweise durch geeignete Puf fer- und/oder
Temperaturbedingungen erreicht werden.
Weiterhin
ist es sowohl bei isolierten Zellen als auch bei Vollblut bzw. Knochenmark
vorteilhaft, dass die phagozytierenden Zellen vor der Fluoreszenzmessung
fixiert werden. Die Fixierung erfolgt in der Lösung und gewährleistet,
dass die phagozytotischen und die nachfolgenden Vorgänge in den
Zellen gestoppt oder zumindest beeinträchtigt bzw. verlangsamt werden.
Eine solche Fixierung bzw. Arretierung kann insbesondere durch Zugabe
von Formaldehyd, beispielsweise etwa 1 % Paraformaldehyd, erreicht werden.
Durch eine Arretierung der Zellen mit nachfolgender Fluoreszenzanalyse
können
zeitgenaue Aussagen zu den Abläufen
in der Zelle gemacht werden, die mit der Phagozytose in Zusammenhang
stehen.
In
besonders vorteilhafter Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren
zur Klärung
der Frage genutzt werden, welche Zellen des Vollblutes (z.B. Makrophagen,
dendritische Zellen, andere myeloische Zellen, Endothelzellen) oder
des Knochenmarks in Bezug auf die Phagozytose und die nachgeschalteten
Prozesse aktiv sind. Hierfür
erfolgt die Inkubation des Vollbluts, des Knochenmarks oder bestimmter
isolierter Zellen mit den fluoreszenzmarkierten Partikeln in Gegenwart
von lineagespezifischen Antikörpern,
die die jeweiligen Zelltypen erkennen. Vorzugsweise werden hierfür wegen
ihrer besonderen Spezifität
monoklonale Anti körper
eingesetzt. Diese Antikörper
sind ebenfalls fluoreszenzmarkiert, wobei sich die Fluoreszenz vorteilhafterweise
von derjenigen Fluoreszenz unterscheidet, mit welcher die Partikel
markiert sind. Durch nachfolgende Lokalisation beider Fluoreszenzen
können
Rückschlüsse auf
die phagozytotische, Prozessierungs- und/oder Antigenpräsentationsfunktion
bestimmter Zelltypen gezogen werden.
Besondere
Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind die große
Sensitivität
des Nachweises der Fluoreszenzmarkierung, die kostengünstige Herstellung,
Lagerung und Versand der zu verwendenden Partikel bzw. der Modellerreger
und die automatisierbare Quantifizierung, die beispielsweise mit Hilfe
der Durchflusszytometrie und/oder mit geeigneten Plattenmessgeräten durchgeführt werden
kann. Dies ermöglicht
vor allem die Auswertung großer Probenmengen.
Neben dem Einsatz in der Diagnostik kann das erfindungsgemäße Verfahren
daher auch mit großem
Vorteil bei der Wirkstoffsuche und -evaluation eingesetzt werden.
Die
Erfindung umfaßt
daher auch die Verwendung eines Verfahrens gemäß der obigen Beschreibung zum
Screening und/oder zur Charakterisierung von immunstimulierenden
oder immunsuppressiven Substanzen. Hierbei kann beispielsweise die
Effizienz und/oder der Wirkmechanismus von Immunstimulanzien und
Immunsuppressiva in vivo als auch in vitro untersucht werden. Hierzu
können
die phagozytierenden Zellen mit potentiellen immunstimulierenden
oder immunsuppressiven Substanzen versetzt werden. Die Auswirkung
auf die Phagozytoseaktivität
und die Prozessierungsaktivität
und/oder die Antigenpräsentationskapazität wird vorteilhafterweise
jeweils im Vergleich mit Kontrollzellen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
analysiert. Im Fall einer immunstimulierenden Substanz kann also beispielsweise
eine Erhöhung
der Phagozytoseaktivität,
eine Erhöhung
der Prozessierungsaktivität und/oder
eine Verstärkung
der Antigenpräsentation nachgewiesen
wer den. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist daher in besonderer Weise dafür geeignet, therapeutisch wirksame
Substanzen zu finden und zu evaluieren, welche z. B. die Phagozytose
und Prozessierung von Bakterien, Viren und/oder Tumorzellen bzw.
deren Fragmenten stimulieren.
Zum
anderen kann beispielsweise im Hinblick auf Autoimmunerkrankungen
oder auf Allergien das erfindungsgemäße Verfahren zur Findung und Evaluation
von therapeutisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, welche Überreaktionen
der Immunantwort dämpfen
oder verhindern. Ein Beispiel für
eine Überreaktion
ist eine verstärkte
Antigen präsentation.
Die Automatisierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dabei von
besonderem Vorteil, da dies den Einsatz im Hochdurchsatzverfahren
ermöglicht.
Da
das Immunsystem von Menschen und anderen Säugetieren in vieler Hinsicht
vergleichbar ist, kann das erfindungsgemäße Verfahren sowohl mit Zellen
humanen Ursprungs als auch mit Zellen aus anderen Tieren, insbesondere
aus anderen Säugetieren,
durchgeführt
werden. Dies ist vor allem für das
Screening und/oder die Charakterisierung von immunstimulierenden
oder immunsuppressiven Substanzen vorteilhaft, da entsprechende
Substanzen in einem Tiermodell durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
untersucht werden können. Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann auch bei Nicht-Säugerorganismen
bzw. deren Zellen eingesetzt werden, soweit diese Zellen in der
Lage sind, Phagozytose, Prozessierung und/oder Präsentation von
Fragmenten bzw. Antigenen durchzuführen.
In
besonders vorteilhafter Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren
zur Diagnose von Immundefekten verwendet werden, die angeboren oder erworben
sein können.
Wie eingangs erwähnt,
können
sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweisbaren
Defekte beispielsweise als Immuninsuffizienzen, Tumorbildung, Allergien
oder Autoimmunerkrankungen manifestieren. Diese Immundefekte können bei spielsweise
durch Funktionsdefekte definierbarer antigenpräsentierender Zellen verursacht
sein. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist besonders vorteilhaft für
die Erfassung genetischer Defekte des intrazellulären Traffickings
geeignet. Kongenitale Immundefekte können sich z. B. als Griscelli-Syndrom
(mutiertes Rab27a, Bahadoran et al. (2003) J Biol Chem 278 (13):
11386-92), als Herrmann Pudlack-Syndrom (mutiertes vsp33, Chiang
et al. (2003) J Biol Chem 278 (22): 20332-7) oder als Chediak Higashi-Syndrom
(mutiertes Lyst, Huizing et al. (2001) Thromb Haemost 86 (1): 233-45) äußern. Beispielsweise
bei diesen Syndromen kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren
eine sofortige Diagnose für
das Bestehen eines derartigen Defektes getroffen werden. Für die Auswertung
ist eine Standardisierung durch Untersuchung gesunder Kontrollen
und/oder die Austetung von gesunden Eltern oder Geschwistern vorteilhaft.
Weiterhin ist beispielsweise auch die Diagnose von chronischen Virusinfektionen mit
besonderem Vorteil möglich.
Chronische Virusinfektionen scheinen ebenfalls defekte Phagozytoseleistungen
sowie Defekte in den nachfolgenden Prozessen, insbesondere bei Makrophagen
und dendritischen Zellen, hervorzurufen. Auch können genetische Rezeptormutationen
des HIV zu Veränderungen
in der Immunantwort führen.
Patienten mit chronischen Virusinfektionen und daraus resultierenden Immundefekten
oder Autoimmunphänomenen
können
daher mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht und
die Defekte rasch diagnostiziert werden.
Weiterhin
ist das erfindungsgemäße Verfahren
mit großem
Vorteil zur Überwachung
einer Therapie von Immundefekten geeignet. Hierfür kommen insbesondere die Immundefekte
in Frage, die bereits oben erwähnt
wurden. Allgemein lassen sich sowohl angeborene als auch erworbene
Immundefekte mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens sowohl diagnostizieren
als auch in der Therapie überwachen. Eine
Therapie, die beispielsweise eine verminderte Immunantwort stimulieren
soll oder eine überreagierende
Immunantwort dämpfen
soll, kann mit Hilfe oder eine überreagierende
Immunantwort dämpfen soll,
kann mit Hilfe des Verfahrens in ihrer Wirkung kontrolliert werden.
Hierfür
werden vorteilhafterweise in einem in-vitro-Testverfahren Blutzellen
von Patienten und/oder Probanden eingesetzt, welche sich einer immunmodulatorischen
Therapie unterzogen haben. Der Therapieeffekt wird anhand der Phagozytoseaktivität und der
Prozessierungsaktivität
und/oder der Präsentationsaktivität mit Hilfe
des erfindungsgemäßen Verfahrens
in oben beschriebener Weise überprüft. Von
besonderem Interesse sind hierbei vor allem phagozytierende dendritische
Zellen sowie Makrophagen.
Die
Erfindung umfasst schließlich
einen Reagenzien-Kit zur Untersuchung der Aktivität von Zellen,
phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten
Partikeln zu präsentieren.
Dieser Kit umfasst mindestens mit Fluoreszenz markierte Partikel,
wobei es sich hier insbesondere um entsprechend markierte Bakterien,
Cyanobakterien, Pilze, Viren und/oder eukaryontische Zellen bzw.
Fragmente dieser verschiedenen Partikel handelt. Diese Partikel
sind dadurch charakterisiert, dass sie mindestens ein pH-sensitives
fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen. Dieses pH-sensitive
fluoreszierende Protein oder Peptid bewirkt eine insbesondere zytoplasmatische
Fluoreszenz, die mindestens über
12 Stunden detektierbar ist. Besonders bevorzugt ist es, wenn die
Partikel mindestens zwei unterscheidbare Fluoreszenzen aufweisen
bzw. zeigen. Weiterhin enthält
der Reagenzien-Kit vorteilhafterweise geeignete übliche Puffer. Bezüglich weiterer
Merkmale dieser mit Fluoreszenz markierten Partikel bzw. des Reagenzien-Kits
wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Weitere
Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und
den Beispielen in Verbindung mit den Figuren. Hierbei können die
verschiedenen Merkmale jeweils für
sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In
den Figuren ist gezeigt:
1 Fluoreszenzaktivität nach Phagozytose
durch intakte, aus Vollblut angereicherte und isolierte dendritische
Zellen;
2 Fluoreszenzaktivität nach Phagozytose
durch Leukozyten im Vollblutansatz.