DE10202710A1

DE10202710A1 - Verfahren zum Nachweis der Biokompatibilität von Polymeren

Info

Publication number: DE10202710A1
Application number: DE2002102710
Authority: DE
Inventors: Ulrich Zimmermann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-01-24
Filing date: 2002-01-24
Publication date: 2003-07-31
Also published as: EP1468285A1; WO2003062820A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Nachweis der Biokompatibilität von Polymeren beschrieben, wobei die Apoptoserate von Zellen und die Mitogenität der Zellen in Gegenwart der Polymere gemessen werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Biokompatibilität von Polymeren. Dieses Verfahren ist insbesondere anwendbar in der Transplantationsmedizin.
Polymere, insbesondere Biopolymere haben in den letzten Jahren in der Transplantationsmedizin zunehmend an Bedeutung gewonnen. So ist bekannt, Transplantate zu dessen Immunisolierung zu verkapseln. Für die Verkapselung allogenen oder xenogenen, endokrinen Gewebes haben sich sphärische Alginatkapseln als vorteilhaft erwiesen (siehe z. B. T. Zerkon et al. in "Acta Diabetol.", Bd. 29, 1992, S. 41-52, P. DE Vos et al. in "Biomaterials", Bd. 18, 1997, S. 273-278, C. Hasse et al. in "Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes", Bd. 105, 1997, S. 52-56 und in "J. Microencapsulation", Bd. 14, 1997, S. 617-626).
Dieses setzt allerdings voraus, dass das Alginat- Verkapselungsmaterial absolut bioverträglich ist, um Abstoßungsreaktionen zu vermeiden. Zu solchen Reaktionen zählen beispielsweise die typischen Immunabstoßungsreaktionen, die zu einem fibrotischen Überwachsen des Transplantates führen.
Die Verwendung von ungereinigten oder ungenügend aufgereinigten Alginatmaterialien in Form von Alginatkapseln führt im Tiermodell zu unterschiedlich starken fibrotischen Reaktionen. Die Ursache hierfür ist unter anderem eine Verunreinigung von Alginatchargen mit mitogenen Substanzen (Zimmermann et al. in "Electrophoresis", Bd. 13, 269-274). In der DE-OS 198 36 960 ist ein Verfahren zur Herstellung von hochgereinigten Alginaten beschrieben. Der Mitogenitätsnachweistest (Zimmermann et al. in "Biotechnology", Bd. 10, S. 547-571) ergab, dass sich keine nachweisbaren mitogenen Verunreinigungen in dem nach diesem Verfahren gereinigten Produkt mehr befinden. Das gereinigte Produkt wurde in Tierversuchen auf seine Gewebeverträglichkeit geprüft. Es hat sich gezeigt, dass mit diesen Alginaten eine wesentlich höhere Gewebeverträglichkeit gegenüber andersweitig aufgereinigten Alginaten erreicht werden kann, aber in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial durchaus unterschiedliche, wenn auch geringe Fibroseerscheinungen auftreten können. Daraus ergibt sich, dass ein Mitogenitätsnachweistest allein die Ergebnisse im Tierversuch nicht vorhersagen kann, sondern dass auch andere, nicht auf mitogene Eigenschaften zurückzuführende Effekte für diese Reaktion verantwortlich sind. Es ist daher wünschenswert, diesen Mitogenitätstest zu verbessern, gerade im Hinblick darauf, auf Tierversuche völlig verzichten zu können.
Bisher ist es unerlässlich, schließlich auch aufgrund gesetzlicher Bestimmungen, dass die für die Transplantation und Implantation bestimmten Materialien im Tierversuch auf ihre Biokompatibilität getestet werden. Es ist bekannt, das selbst geringfügige qualitative oder quantitative Änderungen der Alginatzusammensetzung bei der Anwendung in der Verkapselungstechnologie zu Unverträglichkeiten führen. Das hat zur Folge, dass praktisch jede Charge im Tierversuch getestet werden muss. Das bringt aber zwangsläufig eine große Anzahl von Tieren hervor, die bei den Tierversuchen geopfert werden muss. Hinzu kommt, dass sich nicht jedes Tiermodell für das Vorhersagen des Verhaltens im humanen Organismus eignet. Spezielle, teure und aufwendig zu pflegende Tiermodelle mit einem überzüchteten Immunsystem sind hierfür nötig. Außerdem weisen Tierversuche eine hohe Variabilität auf, was zur Folge hat, dass eine zu testende Charge in sehr vielen Tieren untersucht werden muss, um verlässliche Aussagen darüber zu erhalten.
Bis zum heutigen Tag gibt es keine Alternative zu Tierversuchen. Ziel der Wissenschaft und der Industrie ist es aber, zeitraubende und kostenintensive Tierversuche zu ersetzen. Das setzt aber voraus, dass spezielle empfindliche, möglichst mit geringem Aufwand durchzuführende Nachweisverfahren zur Verfügung stehen.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Weg anzugeben, auf einfache Weise Substanzen und Materialien auf ihre Biokompatibilität zu testen, um Tierversuche zu ersetzen und damit einen Beitrag zum Tierschutz zu leisten.
Diese Aufgabe wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Biokompatibilität von Polymeren durch Messen der Apoptoserate von Zellen und Nachweis der Mitogenität der Zellen in Gegenwart der Polymere.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere dafür geeignet, zwischen nicht immunologisch aktiven Polymeren (biokompatibel) und immunologisch aktiven Polymeren zu unterscheiden. Das bedeutet, dass mit einem einfachen kombinierten Nachweisverfahren ohne Tierversuch bestimmt werden kann, ob das auf Biokompatibilität zu prüfende Polymer zu Abstoßungsreaktionen führen würde oder nicht. Damit ist die Durchführung von Tierversuchen nicht mehr notwendig und es werden im Sinne des Tierschutzes keine Tiere mehr für biomedizinische Verträglichkeitsstudien im bisherigen Umfang getötet.
Die Figuren dienen zur Erläuterung der Erfindung. Es zeigen:
Fig. 1 eine grafische Darstellung zum Mitogenitätsnachweis und
Fig. 2A und 2B Aufnahmen von histologischen Schnitten durch den Randbereich einer Rattenniere
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt Biopolymere und synthetische Polymere, die für biologische Zwecke, wie Transplantationen, geeignet sind, vor ihrer Anwendung, z. B. in klinischen Studien, auf Biokompatibilität in vitro getestet. Zu den Biopolymeren zählen beispielsweise Polysaccharide, sowie deren Derivate. Ganz besonders bevorzugt sind Alginate.
Der Nachweis der Biokompatibilität der Polymere erfolgt erfindungsgemäß im Labormaßstab durch Messen der Apoptoserate von Zellen und Nachweis der Mitogenität der Zellen in Gegenwart der Polymere. Für den Nachweis können beispielsweise eukaryotische Zellen verwendet werden. Geeigneterweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren für die Messung der Apoptoserate Jurkat T- Lymphozyten eingesetzt.
Das Phänomen der Apoptose wird bereits seit vielen Jahren intensiv untersucht. Die Apoptose, der "programmierte Zelltod", ist ein natürlicher Mechanismus zur Selbstzerstörung von Zellen. Sie funktioniert bei Menschen, Tieren und Pflanzen gleichermaßen. Dieses Selbsttötungsprogramm ist bei den Organismen genetisch angelegt und lebensnotwendig. So ist beispielsweise die Apoptose auch sehr wichtig für die körpereigene Abwehr. Sie bewirkt, dass infizierte oder beschädigte Zellen Selbstmord begehen und so den Körper schützen. Die Zellen können dabei selbst erkennen, wenn sie nicht mehr richtig funktionieren.
Der Grundgedanke der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Apoptoserate von Zellen und den Mitogenitätsnachweis als Indiz dafür zu werten, ob das im Tierversuch auf Biokompatibilität zu prüfende Polymer immunogene Wirkungen aufweist. Die Apoptose und die Mitogenität werden in vitro bestimmt, d. h. Zellen werden in Gegenwart der Polymere kultiviert und die Apoptoserate durch Messen der apoptotischen Zellen und die Mitogenität durch die Stimulationsrate von bestimmten Zellen ermittelt. Sollten bei den zu untersuchenden Proben eine gegenüber einer Kontrollprobe (Kultivierung der Zellen ohne zu testendes Polymer) erhöhte Mitogenität und/oder eine erhöhte Apoptoserate nachweisbar sein, ist davon auszugehen, dass das zu testende Material nicht biokompatibel ist. Erst wenn beide Nachweisverfahren keine erhöhten Werte gegenüber der Kontrollgruppe aufweisen, ist davon auszugehen, dass das zu testende Polymer biokompatibel ist.
Die Bestimmung der Mitogenität kann mit folgendem Verfahren durchgeführt werden. Lebende Zellen, wie Human- Lymphozyten (Zelllinien) oder Mauslymphozyten werden für einige Tage mit den Polymeren in Kultur gehalten. Sollten Mauslymphozyten verwendet werden, ist es zwar notwendig, auch in diesem Fall Tiere zu opfern, aber ein Milzpräparat reicht aus, um mehrere hundert Mitogenitätstests durchzuführen. Dies steht in keinem Vergleich zu den Biokompatibilitätsstudien im Tiermodell, bei denen pro Charge mehrere Tiere benötigt werden. Weisen die Polymere eine immunogene Wirkung auf, so vergrößern sich die Zellen und die Anzahl der Zelen erhöht sich (um diesen Effekt zu verdeutlichen, können zusätzliche Stimulanzien, z. B. LPS oder PHA in die Kultur gegeben werden). Die Zellgröße und die Zellzahl können mit Hilfe des CASY1 Cell Analyser (Model TTC, Schärfe Technology, Reutlingen, Deutschland), der nach dem Coulter Prinzip arbeitet, ermittelt werden. Ein solches Gerät erlaubt die schnelle genaue Erfassung (Größe, Größenverteilung und Zellzahlk) mehrerer tausend Zellen pro Messung. Bei mitogenfreien Polymeren lässt sich keine signifikante Zellvergrößerung und Erhöhung der Zellzahl nach Inkubation messen, wohingegen bei mitogenen Polymeren eine deutliche Zellvergrößerung und eine erhöhte Zellzahl nachweisbar ist.
In Fig. 1 ist das Ergebnis dieses Verfahrens für verschiedene Alginatchargen zusammengestellt. Man erkennt, dass kommerziell erhältliche Alginate (oberste Peaks bei etwa 9,5 µm Durchmesser) im Gegensatz zur Kontrollgruppe (unterster Peak bei etwa 9,5 µm Durchmesser), die nicht mit dem zu testenden Alginat kultiviert wurde, eine deutliche Erhöhung der Zellzahl im Bereich der stimulierten Zellen bewirken. Dies bedeutet, dass sie einen hohen Anteil an mitogenen Substanzen beinhalten und daher nicht biokompatibel sind. Die Tatsache, dass kommerzielle Alginate im Tiermodell fibrotische Reaktionen hervorrufen, ist in zahlreichen Publikationen beschrieben (Klöck et al. in "Biomaterials", Bd. 18, 1997, S. 707-713; Klöck et al. in "Applied Microbiology and Biotechnology", Bd. 40, 1994, S. 638-643; Zimmermann et al. in "Bio Techniques", Bd. 29, 2000, S 564-581). Im Gegensatz zeigen die Alginate A und B, die stark aufgereinigte Produkte sind, keine signifikante erhöhte Mitogenität gegenüber der Kontrolle.
Die Messung der apoptotischen Zellrate erfolgt im Labormaßstab. Zunächst werden geeignete Zellen, z. B. humane Jurkat T- Lymphozyten wachsen gelassen. Anschließend werden die geernteten Zellen in Gegenwart der Polymere kultiviert. Gegebenenfalls kann dann eine Überprüfung auf Zellvitalität und Zellzyklus durchgeführt werden. Schließlich werden die in Gegenwart der Polymere inkubierten Zellen auf Apoptose nach einem bestimmten Zeitraum, normalerweise nach zehn und fünfzig Stunden, bevorzugt nach 16 und 40 Stunden, überprüft.
Die Messung der apoptotischen Zellen kann nach jedem bekannten Verfahren für die Ermittlung apoptotischer Zellen angewendet werden. Als besonders geeignet hat sich die Messung anhand einer Fluoreszenzfarbstoffreaktion erwiesen.
Die Fluoreszenznachweisreaktion macht sich das mitochondrale Transmembranpotential der Zellen zu Nutze. Die Zerstörung des mitochondralen Transmembranpotentials ist bekannterweise eines der frühesten intrazellulären Ereignisse, das nach der Apoptoseinduktion folgt. Das Fluoreszenznachweisverfahren beruht darauf, dass zwischen gesunden und apoptotischen Zellen unterschieden wird, indem die Veränderungen im mitochondrialen Transmembranpotential nachgewiesen werden. In gesunden Zellen akkumuliert und aggregiert der Fluoreszenzfarbstoff in den Mitochondrien, was eine breite rote Fluoreszenz ergibt. In apoptotischen Zellen dagegen kann der Fluoreszenzfarbstoff nicht in den Mitochondrien aggregieren, was auf das veränderte mitochondrale Transmembranpotential durchzuführen ist. Daher verbleibt er im Zytoplasma in seiner monomeren Form und fluoresziert grün.
Die Fluoreszenzsignale können einfach durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines entsprechenden Bandpassfilters nachgewiesen werden oder in einem Durchflusscytometer. Als Fluoreszenzfarbstoff kann praktisch jeder für den Nachweis geeignete Fluoreszenzfarbstoff verwendet werden. Ein Beispiel für einen solchen Farbstoff ist 5,5',6,6'-Tetrachlor-1,1', tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist aussagekräftig und indiziert bereits schon bei geringen Apoptoseraten die Unverträglichkeit des getesteten Materials. Die Apoptoserate der Zellen, die mit dem zu testenden Polymer kultiviert werden, wird verglichen mit der Apoptoserate der Kontrollzellen (gleiche Zellcharge), die nicht mit dem zu testenden Polymer kultiviert werden. Normalerweise ist davon auszugehen, dass eine um größer als 2% höhere Apoptoserate bei den mit dem Polymer kultivierten Zellen im Vergleich zu den ohne Polymer kultivierten Zellen ein kritischer Wert ist.
Die folgende Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse mit verschiedenen Alginatchargen, die sowohl mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgetestet wurden als auch später im Tierversuch untersucht wurden. Die Tierversuche wurden wie in der DE-OS 198 36 960 beschrieben durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde Camptothecin genommen, das ein apoptoseauslösendes Detergenz ist.
Daher bewirkt Camptothecin eine deutlich erhöhte Apoptoserate gegenüber der Kontrollgruppe. Dass mit diesem Verfahren keine mitogenen Verunreinigungen in den zu testenden Substanzen ermittelt werden, zeigen die Chargen aus kommerziellen Alginaten mit hoher Mitogenitätswirkung und geringer Bioverstäglichkeit (s. w. o.), hier liegen die Apoptoseraten sogar geringfügig unter denen der Kontrolle. Hierzu wird auf die folgende Tabelle 1 verwiesen. Tabelle 1
Bei den mitogenfreien Alginaten zeigt Charge A eine geringe Apoptoserate (weniger als 2% im Vergleich zur Kontrolle erhöht) im Bereich der Kontrolle und Charge B eine deutlich erhöhte Apoptoserate (mehr als 2% im Vergleich zur Kontrolle erhöht). Dies bedeutet, dass nur Charge A biokompatibel ist und im Tiermodell keine Fibrose verursachen würde.
Die Aussagen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wurden in einem sensitiven Tiermodell (spontandiabetische BB/OK-Ratte) überprüft. Die Tierversuche wurden wie in der DE-OS 198 36 960 beschsrieben durchgeführt. In der folgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Fibrosebildung zusammengefasst. Man erkennt bei dieser Darstellung die Variabilität von Tierversuchen. Mehrere Tiere sind zu untersuchen, um verlässliche, durchschnittliche Aussagen zu erhalten. Tabelle 2
Bei den Fibroseuntersuchungen erwiesen sich die Alginate der Charge B im Durchschnitt sehr immunogen, da bei den getesteten Tieren zum Teil starke Fibrosen auftraten. Im Gegensatz dazu trat bei den verwendeten Alginaten der Charge A nur eine leichte Fibrose auf.
Fig. 2 zeigt ein Beispiel der histologischen Schnitte, die diesen Daten zugrunde liegen. Mit Ba²⁺ vernetzte Alginatkapseln wurden unter die Nierenkapsel der spontandiabetischen, immunsensitiven BB/OK-Ratten implantiert. Nach drei Wochen wurden die Nieren explaniert und histologischen Untersuchungen unterzogen. In Fig. 2A ist ein histologischer Schnitt durch den Randbereich einer Rattenniere dargestellt, in dem die Kapseln aus dem Alginat der Charge A implantiert wurden. Da der Schnitt zum Fixieren entwässert wurde, ist das Alginat nur noch fragmentartig erkennbar. Deutlich sichtbar ist aber der Raum, den die Kapseln eingenommen haben. Um diesen Raum herum erkennt man keine oder nur eine sehr leichte Fibrosebildung. In Fig. 2B (gleiche Schnittpräparation wie in Fig. 2A) ist ein histologischer Schnitt durch den Randbereich einer Rattenniere dargestellt, in dem die Kapsel aus dem Alginat der Charge B implantiert wurden. Deutlich ist um die Kapsel herum eine starke Fibrose erkennbar. Ähnliche und zum Teil noch stärkere fibrotische Reaktionen sind zu beobachten, wenn man Implantate von Kapseln aus kommerziellen bzw. mitogenhaltigen Alginaten untersucht (Klöck et al. in "Biomaterials" Bd. 18, 1997, S. 707-713; Klöck et al. in "Applied Microbiology and Biotechnolgy", Bd. 40, 1994, S 638-643; Zimmermann et al. in BioTechniques", Bd. 29, 2000, S. 564-581).
Die dargestellten Untersuchungen belegen, dass das erfindungsgemäße Verfahren verlässlich die Tierexperimente vorausgesagt hat. Nur die Alginate der Charge A haben sowohl eine geringe Mitogenität als auch eine geringe Apoptoserate in den Testsystemen gezeigt. Daher ist eine hohe Biokompatibilität dieser Chargen als Schlussfolgerung festzustellen. Diese Behauptung wird durch die Tierexperimente belegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein ideales Ausschlussverfahren. Es dient dazu, Polymere und Biomaterialien ohne Tierversuche auf ihre Bioverträglichkeit zu überprüfen und diese Materialien für ihre Verwendung in der Transplantationsmedizin bereitzustellen oder auszuschließen. Dieses Verfahren ist schnell und kostengünstig im Labormessstab durchzuführen. Es lässt sich ohne weiteres standardisieren. Bei diesen Materialien kann es sich beispielsweise um Alginatmaterialien handeln, die in der Regel dazu verwendet werden, das Transplantat in eine Kapsel einzuhüllen. Des Weiteren können durchaus auch andere Polymermaterialien für diesen Zweck im Vorfeld ausgetestet werden.
Im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens gibt es keine Einschränkung im Hinblick auf die Reihenfolge der beiden Nachweise. Aus Kostengründen ist es sinnvoll, den Mitogenitätstest als erstes durchzuführen. Sollten hier bereits die Polymere eine erhöhte Mitogenität aufweisen, dann könnte von dem teureren Apoptosetest abgesehen werden.
Im Prinzip wäre es auch möglich, beide Tests mit den gleichen Zellen durchzuführen. Allerdings gibt es nachweisbar eindeutigere Ergebnisse im Mitogenitätstest, wenn Mauslymphozyten verwendet werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiele

Beispiel 1

Zellen- und Kulturbedingungen

Humane Jurkat T-Lymphozyten (ACC 282, DSMZ, Heidelberg) wurden in T25 bzw. T75 Kulturflaschen (TPP, Schweiz) in RPMI 1640 complete growth medium (CGM) mit Phenolrot (5 mg/ml) kultiviert. Das Medium wurde ergänzt mit fötalem Kälberserum (FCS, 10%), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin (alle PAA, Linz, Österreich). Die Kultivierung erfolgte bei 37°C, angereichert mit 5% CO₂. Die Suspensionszellen wurden regelmäßig alle 2 bis 3 Tage in neue T75 Kulturflaschen mit frischem CGM passagiert.

Beispiel 2

Zellstimulation

Jurkat-Zellen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und abzentrifugiert (10 Min, 180 × g). Danach wurde eine Lebendzellzahl von 0,17 × 10⁶/ml eingestellt (Lebendzellzahl zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase). Für die Alginatstimulation wurden für jeden Ansatz alginathaltige CGM-Lösungen (Endkonzentration 0,1%) angesetzt (Alginat-Stammlösungen: 0,5% in 0,9% NaCl-Lösung). Je Ansatz wurden 12 ml Zellsuspension angesetzt und auf drei Löcher á 4 ml auf einer 12 Loch- Testplatte (TPP) aufgeteilt (n = 3) Die Negativkontrolle wurde in normalem CGM aufgenommen. Der Positivkontrolle wurde Camptothecin (0,75 µg/ml Zellsuspension; Stammlösung 5 mg/ml in 1 N NaOH, gelagert bei 4°C), ein Topoisomerase I Inhibitor und damit Apoptose auslösendes Detergenz, zugesetzt (Amstad et al.; 2000; Bortner et al., 1995). Die so stimulierten Zellen wurden dann bei 37°C, angereichert mit 5% CO₂, inkubiert.

Beispiel 3

Zellvitalität und Zellzyklus

Vor Versuchsbeginn (Tag 0), nach 16 h (Tag 1) und 40 h (Tag 2) wurde die Zellzahl und Vitalität anhand der Trypanblau-Färbung (Biochrom, Berlin, Deutschland) mit einer Neubauerkammer bestimmt. Zusätzlich wurde jeweils vor Ansatz der Versuche (Tag 0) sowie bei der Negativkontrolle an Tag 1 und 2 eine Zellzyklusbestimmung durchgeführt. Dazu wurden 500 µl der nicht stimulierten Zellsuspension mit 0,2% Saponin (Stocklösung 5% in aqua dest) (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) zur Permeabilisierung der Membran und 25 µg/ml Propidium-Jodid zum Anfärben der DNA (PJ, Stocklösung 1 mg/ml in aqua dest., gelagert bei 4°C) (Sigma) versetzt. Nach einminütiger Inkubation erfolgte die Messung am Durchflusscytometer (488 nm Argonlaser, COULTER®EPICS®XL, Coulter, Krefeld, Deutschland). Der DNA-Gehalt wurde durch Messung der PJ-Emission ermittelt (10.000 events/Probe) (Djuzenova et al., 1994). Die Analyse der Daten erfolgte mit den Software- Programmen System II^TM Version 3.0 (Coulter) bzw. WinMDI (Windows Multiple Cocument Interface Version 2.8).
Durch die Anfärbemethoden wurde die Intaktheit und Vitalität der Zellen vor und während der Versuchsdurchführung überprüft.

Beispiel 4

Fluoreszenzmarkierung und Messung apoptotischer Zellen

Zellen, vorinkubiert mit Alginat (0,1% in CGM), die Positiv- (ohne Alginat in CGM mit Camptothecin) und Negativkontrolle (ohne Alginat in CGM) wurden an Tag 1 und 2 auf Apoptose untersucht. Je Probe wurden täglich 2 ml Zellsuspension abgenommen und abzentrifugiert (10 Min, 180 × g). Nach Verwerfen des Überstands wurden die Zellen mit einem lipophilen, kationischen Fluorochrom (5,5',6,6'-Tetrachlor-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid [JC-1]; (Färbelösung: 0,5 µl/ml in Inkubationspuffer) (Testkit MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit, BioCat, Heidelberg, Deutschland) für 20 Min. bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert (1 × 10⁶Zellen/ml Färbelösung). Nach der Inkubation wurde erneut abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellpellets in je 1 ml PBS (PAA) aufgenommen und resuspendiert. Die fluoreszenzmarkierten Zellen wurden unmittelbar danach am Durchflusscytometer (Coulter) gemessen (10.000 events/Probe). Bei apoptotischen Zellen trat dabei eine Fluoreszenzverschiebung von rot nach grün auf (Kroemer and Reed, 2000, Pigue et al., 2000; Samali et al., 1999). Dieser Effekt beruhte auf der Veränderung des (Trans)-Membranpoentials von Mitochondrien (ΔΨ_m, mitochondrial membran potential MMP) (Kroemer et al., 1998; Bernardi et al., 1999; Petit et al., 2001). Bei intakten Zellen trat durch Anhäufung und Aggregation des Fluorochroms in den Mitochondrien eine breite Rotfluoreszenz auf (Extinktion 488 nm, Emission 590 ± 42 nm, ähnlich PJ). Apoptotische Zellen besaßen aufgrund eines abnehmenden Δψ_m diese Eigenschaft nicht mehr, so dass Monomer nicht mehr aggregieren konnte und daher im Grünbereich emittierte (530 ± 30 nm, ähnlich FITC). Die Messung der Fluoreszenz für apoptotische Zellen erfolgte daher über den Grün-(FL1, wie FITC), für gesunde Zellen über den Rot-Fluoreszenz-Kanal (FL3, wie PJ). Eine Unterscheidung anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie wurde ebenfalls durchgeführt.

Beispiel 5

Mitogenitätsbestimmung

Eine Mauslymphozytensuspension (1 × 10⁶ Zellen/ml in complete growth medium, bei der Verwendung von humanen Lymphozyten wird die gleiche Konzentration gewählt) wurde in der zu testenden Alginatlösung (Endkonzentration: 0,05%) versetzt und 3 Tage bei 5% CO₂ und 37°C kultiviert. Danach wurde ein abzentrifugiertes und in Inosit (oder PBS) aufgenommenes Aliquot (100 µl) der gut resuspendierten Lymphozytensuspension zweimal in isoosmolarer Inositollösung (290 mOsm/kg) gewaschen und in 10 ml PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) aufgenommen und sofort im CASY 1 Cell Analyser (Model TTC, Schärfe Technology, Reutlingen, Deutschland) gemessen. Aus den entsprechenden Histogrammen kann der Anteil der großen, stimulierten Zellen an der Gesamtpopulation gemessen werden.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis der Biokompatibilität von Polymeren durch Messen der Apoptoserate von Zellen und Nachweis der Mitogenität der Zellen in Gegenwart der Polymere.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Biokompatibilität von Biopolymeren und synthetischen Polymeren nachgewiesen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zu den Biopolymeren Polysaccharide und deren Derivate zählen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Polysaccharide Alginate sind.

5. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Zellen eukaryotische Zellen verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eukaryotische Zellen humane Jurkat T-Lymphozyten sind.

7. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Apoptoserate durch Messen der apoptotischen Zellen ermittelt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung mit einer Fluoreszenzfarbstoffreaktion durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Fluoreszenzfarbstoff 5,5',6,6'-Tetrachlor-1,1',3,3'- tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid verwendet wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Apoptoserate der Zellen mindestens 2% höher ist als die der nicht mit dem zu testenden Polymer kultivierten Kontrollgruppe.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Mitogenität von Zellen durch Messen der Stimulationsrate durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulation der verwendeten Zellen durch mitogene Substanzen durch Nachweis der erhöhten Stoffwechselaktivität erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulation der verwendeten Zellen durch mitogene Substanzen durch Nachweis von Zellvergrößerung und Erhöhung der Zellzahl erfolgt.

14. Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche zum Biokompatibilitätnachweis von Polymermaterialien in der Transplantationsmedizin.