JP2005225857A - インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 インドリシジンアナログであって、8〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:RXZXXZXB(ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;そしてBは塩基性アミノ酸である)、アナログ。
【選択図】 なし
Description
他の局面において、本発明は、単離された核酸分子(その配列は、1つ以上のインドリシジンアナログのコード配列を含む)、発現ベクター、および発現ベクターでトランスフェクトされているかまたは形質転換された宿主細胞を提供する。
を含む。修飾化合物は、逆相HPLCおよび/または有機溶媒からの沈降により単離され得る。
上記のように、本発明はインドリシジンアナログを提供する。これらのアナログは、化学的方法、特に自動化ペプチド合成器を用いる方法により合成され、または組換え法により産生され得る。アミノ酸配列の選択は、本明細書に呈示される一般式により案内される。
本発明はインドリシジンアナログを提供する。このアナログは、長さが少なくとも5または7アミノ酸であり、そして好ましくは15、20、25、27、30、または35アミノ酸を超えない。9〜14残基のアナログが好ましい。
RXZXXZXB (1)
BXZXXZXB (2)
BBBXZXXZXB (3)
BXZXXZXBBBn(AA)nMILBBAGS (4)
BXZXXZXBB(AA)nM (5)
LBBnXZnXXZnXRK (6)
LKnXZXXZXRRK (7)
BBXZXXZXBBB (8)
BBXZXXZXBBB (9)
ペプチドアナログは、自動化手順による合成を含む標準的な化学的方法により合成され得る。一般に、ペプチドアナログは、カップリング試薬としてのHATUを用いる標準の固相Fmoc保護戦略を基に合成される。ペプチドは、これもまた側鎖官能基を脱保護する適切なスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸を用いて固相樹脂から切断される。粗製ペプチドは、調製用逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製される。分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動、またはイオン交換クロマトグラフィーのようなその他の精製方法が使用され得る。
あるいは、ペプチドアナログは組換え産生により合成され得る(例えば米国特許第5,593,866号を参照のこと)。ペプチドアナログの産生には種々の宿主系が好適であり、細菌(例えばE.coli)、酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae)、昆虫(例えばSf9)、および哺乳動物細胞(例えばCHO、COS-7)を含む。多くの発現ベクターが開発され、そしてこれらの宿主の各々について利用可能である。一般に、細菌細胞および細菌で機能的であるベクターが本発明で用いられる。しかし、しばしば他の宿主で機能的であるベクターを有することが好ましい。E.coli中のクロ−ニングおよび発現のためのベクターおよび手順は、本明細書中、そして、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1987)およびAusubelら(Current Protocols in Molecular Biology,Greene Puslishing Co.,1995)で論議される。
インドリシジンアナログは、プライマーが、コードされた親ペプチド、例えばインドリシジンの5'および3'末端の標的配列に設計される増幅(例えばPCR)を基礎にする手順を用いて生成され得る。増幅条件は、合成の間に熱安定性ポリメラーゼによるヌクレオチドの誤取り込みを促進するよう選択される。従って、ランダム変異が元の配列中に導入され、そのいくつかはアミノ酸改変を生じる。増幅産物は、受容可能な宿主中でパッケージ化されかつ増幅され提示ライブラリーを生成する、ファージミドベクターのようなファージベクターのコートタンパク質中にクローン化され得る。
代表的には、小さな非免疫原性ペプチジルコアに連結されたペプチドの約8コピーを含み、免疫原を形成する多重抗原性ペプチド(MAP)を用いて、特定のペプチドアナログに対する抗体が生成される。(一般に、HarlowおよびLane、前述、を参照のこと)MAPは、ウサギまたはマウスまたはその他の齧歯類中に皮下注射され、そこで、それらは、抗体産生を容易にするに十分長い半減期を有し得る。12週間後、血液サンプルを採取し、血清を分離し、そして元のペプチドに対してELISAアッセイ中で試験され、陽性の結果は、標的ペプチドに対して特異的な抗体の存在を示す。次いで、この血清を貯蔵し、そしてELISAアッセイ中で使用し得、特定のアナログの量を特異的に測定する。あるいは、抗体産生の他の標準的方法、例えばモノクローナル抗体の生成を使用し得る。
本発明のインドリシジンアナログは、単独または抗生物質もしくは別のアナログとの組合せで、抗生物質治療薬剤としての可能性について、一連のアッセイを使用して評価される。好ましくは、すべてのペプチドは、最初に、インビトロで評価され、最も見込みのある候補がインビボでのさらなる評価のために選択され、そしてこれらアッセイの結果を使用して、前臨床試験のための候補が選択される。インビトロアッセイには、抗生物質活性、毒性、溶解性、薬理学、二次構造、リポソーム透過などの測定が含まれる。インビボアッセイには、動物モデルにおける効力、抗原性、毒性などの評価が含まれる。一般に、インビトロアッセイがまず実施され、続いてインビボアッセイが実施される。
インドリシジンアナログは、抗生物質活性について、アガロース希釈MICアッセイまたはブロス希釈もしくはタイムキル(time-kill)アッセイのようなアッセイによって評価される。抗生物質活性は、微生物(例えば、細菌、真菌)の増殖の阻害または死滅として測定される。簡単に述べると、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMueller Hintonブロス中の候補アナログを、溶融アガロースと混合する。ブロスと寒天との他の処方物は、ペプチドアナログが培地全体を自由に拡散し得る限り、使用され得る。アガロースをペトリ皿またはウェルに注ぎ、凝固させ、そして試験株をアガロースプレートに塗布する。試験株は、アナログの意図される適用に一部基づいて選択される。したがって、例として、S.aureusに対する活性を有するアナログが所望される場合、S.aureus株が使用される。試験種のいくつかの株および/または臨床単離株について、アナログをアッセイすることが所望され得る。プレートを一晩インキュベートし、そして翌日、細菌増殖について視覚的に検査する。アナログの最小阻害濃度(MIC)は、生物の増殖を完全に阻害する、アナログの最低濃度である。試験株または株の群に対して良好な活性を示す(代表的には、16μg/ml以下のMICを有する)アナログを、さらなる試験のために選択する。
インビトロアッセイの結果に基づいて選択されたアナログは、効力、毒性などについてインビボで試験され得る。
抗生物質または別のアナログとの組合せでアナログを評価するために、組合せが上記の一連のアッセイにかけられ得る。抗生物質には、生命を妨げるか、阻害するか、または破壊する傾向があるいずれの化学物質などが含まれ、抗生物質には、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および駆虫剤が含まれる。単に例として、抗菌性抗生物質が議論される。成分を混合および投与する方法は、組合せの意図される臨床的使用に依存して変化する。
本明細書中に明記したように、本発明は、遊離アミン基を有する化合物(例えば、ペプチド、タンパク質、特定の抗生物質など)を、活性化されたポリソルベートエステルおよび誘導体で修飾するための方法および組成物を提供する。化合物がペプチドまたはタンパク質である場合、修飾されたかまたは誘導体化された形態は、本明細書中で「APS修飾ペプチド」または「APS修飾タンパク質」と呼ばれる。同様に、修飾された形態の抗生物質は、「APS修飾抗生物質」と呼ばれる。APS修飾化合物(例えば、APSカチオン性ペプチド)は、改善された薬理学的特性を有する。
本明細書に記載のように、APS修飾化合物(例えば、ペプチドおよびタンパク質)の生成に適切な試薬は、疎水性領域および親水性領域、ならびに随意にリンカーを含む。疎水性領域は、親水性領域またはリンカーとの結合に適切な官能基を有する脂肪親和性化合物である。親水性領域はポリアルキレングリコールである。本明細書で使用する場合、「ポリアルキレングリコール」とは、2炭素ポリマーまたは3炭素ポリマーのグリコールをいう。2炭素ポリアルキレンには、種々の分子量のポリエチレングリコール(PEG)およびその誘導体(例えば、ポリソルベート)が含まれる。3炭素ポリアルキレンには、ポリプロピレングリコールおよびその誘導体が含まれる。
試薬(一般には、ポリソルベート)は、空気を自由に交換しながらUV光に曝露することによって活性化される。254nmまたは302mnで照射するランプを使用して活性化が達成される。好ましくは、出力は254nmが中心である。より長い波長は、より長い活性化時間を必要とし得る。蛍光室内灯がポリソルベートを活性化し得るという、いくつかの証拠が存在するが、実験は、室内灯が検出可能なレベルの活性化を生じる前に、254nmのUV光の使用は最大の活性化を生じることを示している。
ペプチドまたはタンパク質は、液相または固相のいずれかでAPS試薬とともに反応され、そしてAPS誘導体の結合によって修飾される。結合のための本明細書中に記載される方法は、ペプチドまたはタンパク質上の電荷を維持する利点を提供する。ペプチドの電荷がその機能(例えば、本明細書中に記載されるカチオン性ペプチドの抗生物質活性)にとって重要である場合、これらの結合方法は、更なる利点を提供する。基をアシル化を介して結合する方法は、アミノからアミド基への変換を介して正電荷の損失を生じる。さらに、いかなるかさばったリンカーまたは潜在的に抗原性のリンカー(例えば、トリアジン基)も、本明細書中に記載される方法によって導入されることは知られていない。
APS修飾ペプチドが精製され得る。遊離のペプチドが毒性である状況では、未修飾ペプチドおよび/または未反応ポリソルベートを除去するための精製が必要であり得る。任意の種々の精製法が使用され得る。このような方法には、逆相HPLC、ポリソルベートを除去するための有機溶媒による沈澱、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過などが含まれる。RP-HPLCが好ましい。これらの分離方法についての手順は、周知である。
上記のように、本発明は、本明細書中に記載されるインドリシジンのペプチドアナログの治療有効量を患者に投与することによって、感染を処置および防止するための方法を提供する。このような処置のために適切な患者は、十分に確立された感染の特徴(例えば、発熱、膿、生物の培養物など)によって同定され得る。ペプチドアナログで処置され得る感染には、微生物によって引き起こされるものが含まれる。微生物の例には、細菌(例えば、グラム陽性、グラム陰性)、真菌(例えば、酵母およびカビ)、寄生虫(例えば、原生動物、線虫、条虫、および吸虫)、ウイルス、ならびにプリオンが挙げられる。これらのクラスの特定の生物は、周知である(例えば、Davisら、Microbiology、第3版、HarperおよびRow、1980を参照のこと)。感染には、毒素ショック症候群、ジフテリア、コレラ、チフス、髄膜炎、百日咳、ボツリヌス中毒症、破傷風、化膿性感染、赤痢、胃腸炎、炭痘、ライム病、梅毒、風疹、敗血症、および伝染病が含まれるが、これらに限定されない。
以下の実施例は、限定のためではなく例示のために提供される。
ペプチドアナログの合成精製および特徴付け
ペプチド合成は、標準的な固相Fmoc保護ストラテジーに基づいている。使用された装置は、9050 Plus PepSythesiser(PerSeptive BioSystems Inc.)である。ポリエチレングリコールポリスチレン(PEG-PS)移植片樹脂を、固相として使用し、C末端アミド合成のためにFmoc保護アミノ酸リンカーで誘導体化した。HATU(0-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)をカップリング試薬として使用する。合成の間、カップリング工程を連続的にモニターし、各アミノ酸が高収量で組み込まれることを確実にする。ペプチドを、トリフルオロ酢酸および適切なスカベンジャーを用いて固相樹脂から切断し、そして粗ペプチドを調製用逆相クロマトグラフィーを用いて精製する。
H接尾辞=C末端のホモセリン
R接尾辞=レトロ-合成されたペプチド
修飾されたペプチドの合成
インドリジンアナログを、元のペプチドの物理特性を変更するために修飾する。このような修飾には:N末端でのアセチル化、Fmoc誘導体化N末端、ポリメチル化、ペルアセチル化(peracetylation)、および分枝誘導体が含まれる。
上記の手順を用いて修飾したペプチドを表3に列挙する。
ペプチドアナログの組換え生成
あるいは、ペプチドアナログを細菌性宿主細胞において組換えDNA技術によって生成する。このペプチドを融合タンパク質として生成し、封入体、周辺質、外膜、または細胞外環境への融合タンパク質の移行に役立つように選択する。
ポリメラーゼ連鎖反応による増幅を使用して、一本鎖鋳型からMBIペプチド遺伝子をコードする二本鎖DNAを合成する。MBI-11については、供給者の緩衝液中に50〜100ngの鋳型、25ピコモルの各プライマー、1.5mM MgCl2、200μMの各dNTP、2UのTaqポリメラーゼを含む100μlの反応混合物を調製する。反応を、30秒間94℃、30秒間55℃、30秒間74℃の25サイクル、続いて1分間74℃を用いて行った。増幅生成物を、BamHIおよびHindIIIで消化し、そして融合パートナーおよび適切な選択マーカーをコードするプラスミド発現ベクター中にクローン化した。
T7プロモーター、高コピー複製起点、Aprマーカーを用い、そして融合タンパク質の遺伝子を含む、プラスミドpR2h-11を、E.coli株XL1-BlueにpGP1-2と共に同時エレクトロポレーションする。プラスミドpGP1-2は、λプロモーターおよびcI857リプレッサー遺伝子の制御下のT7ポリメラーゼ遺伝子を含む。融合タンパク質発現を30℃から42℃への温度移行によって誘導する。封入体を可溶化剤含有溶液で洗浄し、そして有機抽出溶媒で抽出する。サンプルのプロフィールをSDS-PAGEによって分析する。図1は、SDS-PAGE分析および全細胞由来の封入体の抽出プロフィールを示す。有機溶媒抽出物質中の主な夾雑物は、β-ラクタマーゼである(図1)。これらの細胞における発現レベルを表4に示す。
ペプチドアナログ活性を測定するためのインビトロアッセイ
アガロース希釈アッセイ
アガロース希釈アッセイは、ペプチドおよびペプチドアナログの抗菌活性を測定する。これはペプチドの最少阻害濃度(MIC)として表される。
このアッセイはまた、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMueller Hintonブロスを増殖培地として使用する。代表的には、100μlのブロスを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウエルに分配し、そしてペプチドアナログの100μl容量の2倍連続希釈物を、プレート上に作製する。ウエルの1つの列にはペプチドを与えず、そして増殖コントロールとして使用する。各ウェルを約5×105CFUの細菌で接種し、そしてプレートを35〜37℃で16〜20時間インキュベートする。MICを、再び、目視検査によって決定した生物の増殖を完全に阻害するペプチドの最少濃度として記録する。
時間殺傷曲線を使用して、ある時間間隔に渡るカチオン性ペプチドの抗菌活性を決定する。簡略には、このアッセイにおいて、0.5McFarland Standardに等しい微生物の懸濁液を、0.9%生理食塩水中で調製する。次いで、この懸濁物を、カチオン調整Mueller Hintonブロスの9mlの総容量まで添加する場合、接種物サイズが1×106CFU/mlであるように希釈する。0.1mlのアリコートを、24時間まで予め決定した間隔で各チューブから取り出し、0.9%生理食塩水中に希釈し、そして3連でプレートし、生存コロニー数を決定する。各サンプル中に残っている細菌の数を経時的にプロットし、カチオン性ペプチド殺傷の割合を決定する。概して、増殖コントロールと比較して抗菌懸濁物中の細菌数における3以上のlog10減少は、適切な殺菌性応答を示す。
ペプチドアナログと従来の抗生物質の組み合わせでの処置は、相乗効果を有し得る。相乗効果を、アガロース希釈技術を使用してアッセイする。ここで配列したプレート(各々は特有の濃度混合物中にペプチドと抗生物質の組み合わせを含む)を、細菌の単離物で接種する。相乗効果を多くの従来の抗生物質と組み合わせたペプチドアナログについて調べる。これにはペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、マクロライド、フルオロキノロンが挙げられるが、これらに限定されない。
ペプチドアナログの生化学的特徴
処方物緩衝液中における可溶性
ペプチドの可溶性に影響を与える主な因子は、そのアミノ酸配列である。ポリカチオン性ペプチドは、好ましくは、水性溶液に、特に低pH条件下で自由に可溶性である。しかし、特定の処方物においてポリカチオン性ペプチドは濾過工程によって除去される凝集を形成し得る。インビボアッセイのためのペプチド溶液は、投与される前に濾過されるので、濾過後の用量レベルの正確性および再現性を試験する。
ペプチドアナログの可溶性を、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMueller Hintonブロス中で目視検査によって評価する。用いた手順は、細菌をウェルに添加しないことを除いてブロス希釈アッセイについて使用した手順である。各ウェル中の溶液の外観を以下の尺度によって評価する:(a)清澄、沈澱なし、(b)軽い拡散性の沈澱、および(c)濁り、重い沈澱。結果は、例えば、MBI-10CNが、これらの条件下でMBI 11CNより可溶性ではないこと、およびMBI 11BCNアナログがMBI 11ACNアナログより可溶性ではないことを示す。
逆相HPLC(これは、ペプチド定量化のための分析的方法を提供する)を使用して、2つの異なる処方物中のペプチドを調べる。処方物C1およびDにおいて調製したMBI 11CNの400μg/ml溶液を、他の種からの遊離ペプチドを分離させる段階的勾配を使用して分析する。以下のような標準的クロマトグラフィー条件を使用する:
・溶媒A:水中の0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)
・溶媒B:水中の0.1% TFA/95%アセトニトリル
・培地:POROS(登録商標)R2-20(ポリスチレンジビニルベンゼン)
円二色性分光法を使用する、インドリシジン修飾体の構造分析
円二色性(CD)は、溶液中のペプチドおよびタンパク質の二次構造を調べる分光学的技術である。例えば、R.W.Woody,(Methods in Enzymology,246:34,1995)を参照のこと。α-ヘリックスペプチドのCDスペクトルは、208nmおよび222nmでの特徴的な二重の最小値に起因して最も容易に解釈可能である。しかし、他の二次構造を有するペプチドについては、CDスペクトルの解釈は、より複雑であり、そしてより信頼性がない。ペプチドについてのCDデータを使用して、溶液構造をインビトロ活性に関連づける。
膜透過性アッセイ
リポソーム色素放出
リン脂質二重層を透過するペプチドの能力を調べるための方法は記載されている(Parenteら、Biochemistry,29,8720,1990)。簡略には、規定されたリン脂質組成のリポソームを蛍光色素分子の存在下で調製する。本実施例において、蛍光性分子8-アミノナフタレン-1,3,6-トリスルホン酸(ANTS)およびその消光剤分子p-キシレン-ビス-ピリジニウムブロミド(DPX)からなる色素対を使用する。遊離色素分子、無色素リポソーム、およびカプセル化されたANTS-DPXを含むリポソームの混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによって分離する。アッセイにおいて、試験ペプチドをANTS-DPX含有リポソームとインキュベートし、そしてリポソームの外側へのANTS放出に起因する蛍光を経時的に測定する。
ペプチド−膜相互作用を測定するための別の方法は、E.coli ML-35株を使用する(Lehrerら、J.Clin.Invest.,84:553,1989)。この株は、β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子の染色体性コピーを含み、そしてパーミアーゼを欠失している。この株を、周辺質へのβ-ガラクトシダーゼの放出を通じて、内膜上でのペプチドの効果を測定するために使用する。β-ガラクトシダーゼの放出を、その基質0-ニトロフェノールβ-D-ガラクトピラノシド(ONPG)の加水分解を分光光度的にモニターすることによって測定する。加水分解の最大速度(Vmax)を、種々の増殖時点で採取した細胞のアリコートについて決定する。
インドリシジンアナログによる赤血球溶解
赤血球(RBC)溶解アッセイを、MBI 11CNおよびグラミシジン-Sと比較して、標準的な条件下でRBCを溶解するペプチドの能力にしたがってペプチドを分類するために使用する。ペプチドサンプルおよび洗浄したヒツジRBCを、6と7の間に調整した最終pHを有する等張性の生理食塩水中で調製する。ペプチドサンプルとRBC懸濁物とを共に混合して、1%(v/v)RBCおよび5、50、または500μg/mlペプチドの溶液を得る。アッセイ混合物を、絶えず振盪しながら37℃にて1時間インキュベートし、遠心分離し、そして上清を540nmの吸光度について測定する。これによって放出されたヘモグロビンを検出する。放出されたヘモグロビンの割合を、水中に溶解した一連の既知の標準物との比較によって決定する。アッセイの各セットはまた、それぞれ「低溶解」コントロールおよび「高溶解」コントロールとしてMBI 11CN(500μg/ml)およびグラミシジン-S(5μg/ml)を含む。
ペプチドアナログに対する抗体の産生
小さい非免疫原性ペプチジルコアに連結した標的ペプチドの4または8つのコピーを含む多抗原性ペプチド(MAP)を、免疫原として調製する。あるいは、標的ペプチドを、ウシ血清アルブミン(BSA)またはオボアルブミンに結合する。例えば、MBI 11CN、ならびにその7アミノ酸のN末端フラグメントおよびC末端フラグメントを、標的ペプチド配列として使用する。免疫原を、標準的なプロトコールを使用してウサギに皮下注射する(HarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988を参照のこと)。追加免疫を繰り返した(通常は1ケ月ごと)後、血液サンプルに由来する血清を、標的ペプチドに対するELISAで試験する。陽性の結果は抗体の存在を示し、そしてさらなる試験によって標的ペプチドに結合する抗体の特異性を決定する。次いで、精製した抗体をこの血清から単離し、そして研究および臨床サンプル中の標的ペプチドを選択的に同定し、そしてその量を測定するために、ELISAで使用する。
血漿および血液中のペプチドアナログの薬理学
血漿および血液中の遊離のペプチドアナログのインビトロの寿命を、一連のインキュベーション時間後に存在するペプチドの量を測定することによって決定する。血液を、抗凝固剤(ヘパリン以外)で処置したヒツジから回収し、そして血漿の調製のために、遠心分離して細胞を除去する。調剤したペプチドを、血漿画分または全血のいずれかに添加し、そしてインキュベートする。インキュベーション後、ペプチドを同定し、そして逆相HPLCによって直接定量する。遊離のペプチドのピークが血液または血漿由来のいずれのピークよりも上にない場合は、抽出は必要ではない。
インビボでのペプチドアナログの毒性
種々のインドリシジンアナログの激しい単回用量の毒性を、種々の投与経路を使用してSwiss CD1マウスで試験する。任意の処方物/送達ビヒクルの効果の非存在下でのペプチドアナログの固有の毒性を決定するために、ペプチドを、6〜7の間の最終pHを有する等張性の生理食塩水中で全て投与する。
処方物D中でのMBI 10CNの静脈内注射(10匹のマウスの群)は、5.6mg/kgの最大寛容用量(MTD)を示す(表16)。11mg/kgの注射は40%の毒性を生じ、そして22mg/kgの注射は100%の毒性を生じる。処方物C(凍結乾燥した)中でのMBI 11CNの静脈内注射は、3.0mg/kgのMTDを示す。6.1mg/kgでの注射は10%の毒性を生じ、そして12mg/kgでは100%の毒性を生じる。
ペプチドアナログのインビボでの効果
アナログを、致死的な細菌感染からマウスを救出(rescue)するそれらの能力について試験する。使用する動物モデルは、106〜108のグラム陽性細菌でのマウスの腹腔内(ip)接種、続くペプチドの投与である。試験する3つの病原体(メチシリン感受性S.aureus(MSSA)、メチシリン耐性S.aureus(MRSA)、またはS.epidermidis)をマウスにip注射する。未処置のマウスについては、MSSAおよびS.epidermisでは12〜18時間以内に死亡し、そしてMRSAでは6〜10時間以内に死亡する。
・0mg/kg 処方Dのみ(ネガティブコントロール)、0分で注射
・5mg/kg 3回5.5mg/kg注射(−5分、+55分、および+115分)
・1mg/kg(2時間) 5回1.1mg/kg注射
(−5分、+55分、+115分、+175分、および+235分)
・1mg/kg(20分) 5回1.1mg/kg注射
(−10分、−5分、0分、+5分、および+10分)
・バンコマイシン (ポジティブコントロール)、0分で注射
紫外光によるポリソルベート80の活性化
2%(w/w)ポリソルベート80の溶液を水中で調製し、そして適切な反応容器(例えば、水晶セル)中に入れる。準備が透明光路または長期の反応時間についてなされれば、UV半透過性であるかまたは褐色でさえある他のコンテナが用いられ得る。さらに、容器は、空気の交換を可能にするが、蒸発を最小に抑えなければならない。
APS修飾ペプチドの形成
APS修飾ペプチドを固相または液相のいずれかで調製する。固相調製について、0.25mlの4mg/mlのMBI 11CNを0.5mlの0.4M酢酸NaOH(pH4.6)に添加し、その後0.25mlのUV光UV活性化を添加する。反応混合物を−80℃冷凍庫中に置くことにより凍結する。凍結後、反応混合物を一晩凍結乾燥する。
APS修飾ペプチドは、イオン性または疎水性の複合体の解離を促進する条件下で高度の安定性を示す。処方D中のAPS修飾ペプチドを、水、0.9%生理食塩水、8M尿素、8Mグアニジン-HCl、67%1-プロパノール、1M HClおよび1M NaOH中の800μg/ml溶液として調製し、室温で1時間インキュベートする。サンプルを逆相HPLCおよび以下のクロマトグラフィー条件を用いて遊離ペプチドの存在について分析する:
溶媒A:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)(水中)
溶媒B:0.1%TFA/95%アセトニトリル(水中)
媒体:POROS R2-20(ポリスチレンジビニルベンゼン)
溶出:0%B(5カラム容量)
0−25%B(3カラム容量)
25%B(10カラム容量)
25−95%B(3カラム容量)
95%B(10カラム容量)
APS修飾MBI 11CNの精製
APS修飾MBI 11CNの大規模調製物を精製する。約400mgのMBI 11CNをAPS修飾し、そして20ml水中に溶解する。未反応MBI 11CNをRP-HPLCにより除去する。次いで、溶媒をAPS修飾MBI 11CNプールからエバポレートし、そして残渣をl0ml塩化メチレンに溶解する。次いで、修飾ペプチドを10mlジエチルエーテルで沈澱させる。室温で5分後、沈殿物を5000×gで10分間遠心分離することにより収集する。ペレットを、5mlのジエチルエーテルで洗浄し、そして再度、5000×gで10分間遠心分離することにより収集する。上清を、未反応ポリソルベート副産物の分析のためにプールする。沈殿物を6mlの水中に溶解し、次いで30分間バブリングすることにより窒素でフラッシュし、残余エーテルを除去する。出発MBI 11CNからの総収量は43%であった。
APS修飾ペプチドを用いる生物学的アッセイ
APS修飾ペプチドと未修飾ペプチドとを比較する全ての生物学的アッセイを、等モル比で実施する。APS修飾ペプチドの濃度は、分光光度測定(これは、生物学的アッセイのために濃度を標準化するために用いる)により決定され得る。例えば、1mg/ml APS修飾MBI 11CN溶液は、1mg/ml MBI 11CN溶液と同じ量のペプチドを含有し、従って毒性および効力データの直接比較を可能にする。
Claims (14)
- インドリシジンアナログであって、8〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
RXZXXZXB
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;そしてBは塩基性アミノ酸である、アナログ。 - インドリシジンアナログであって、8〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
BXZXXZXB
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;Bは塩基性アミノ酸であり;そして少なくとも1つのZがバリンである、アナログ。 - インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
BBBXZXXZXB
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;そしてBは塩基性アミノ酸である、アナログ。 - インドリシジンアナログであって、17〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
BXZXXZXBBBn(AA)nMILBBAGS
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;Bは塩基性アミノ酸であり;AAは任意のアミノ酸であり;そしてnは0または1である、アナログ。 - インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
BXZXXZXBB(AA)nM
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;Bは塩基性アミノ酸であり;AAは任意のアミノ酸であり;そしてnは0または1である、アナログ。 - インドリシジンアナログであって、8〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
LBBnXZnXXZnXRK
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;Bは塩基性アミノ酸であり;そしてnは0または1である、アナログ。 - インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
LKnXZXXZXRRK
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;そしてnは0または1である、アナログ。 - インドリシジンアナログであって、11〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
BBXZXXZXBBB
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;Bは塩基性アミノ酸であり;そして少なくとも2つのX残基はフェニルアラニンである、アナログ。 - インドリシジンアナログであって、11〜25アミノ酸を含み、そして以下の式を含み:
BBXZXXZXBBB
ここで、Zはプロリンまたはバリンであり;Xは疎水性残基であり;Bは塩基性アミノ酸であり;そして少なくとも2つのX残基はチロシンである、アナログ。 - Zがプロリンであり、Xがトリプトファンであり、そしてBがアルギニンまたはリジンである、請求項1、および3〜7のいずれかに記載のアナログ。
- 以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ:
Lys Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Lys Leu Ile;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Lys Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Leu Ile;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Ile Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
lle Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Asp Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Trp Arg Ile Trp Lys Pro Lys Trp Arg Leu Pro Lys Trp;
Ile Leu Lys Lys Trp Val Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Val Trp Trp Val Trp Arg Arg Lys; 及び
Lys Arg Arg Trp Val Trp Trp Val Trp Arg Leu Ile. - 以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ:
Ile Leu Lys Lys Ile Pro Ile Ile Pro Ile Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Tyr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Tyr Pro Trp Tyr Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Phe Pro Trp Phe Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Phe Pro Phe Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Tyr Val Tyr Tyr Val Tyr Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Ile Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Met;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Ile Met;
Ile Leu Lys Lys Trp Trp Trp Pro Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Trp Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Val Trp Trp Val Trp Arg Arg Lys; 及び
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Arg Arg Lys. - 以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ:
Ile Leu Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Met Ile Leu Lys Lys Ala Gly Ser;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Met;
Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp;
Ile Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Arg Arg Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys;
Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg; 及び
Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys. - 以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ:
Ala Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Ala Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Ala Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Ala Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Ala Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Ala Trp Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Ala Pro Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Ala Trp Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Ala Arg Arg Lys;
Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Ala Arg Lys;
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Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Ala.
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