DE69424680T2

DE69424680T2 - Liposomale defensine

Info

Publication number: DE69424680T2
Application number: DE69424680T
Authority: DE
Inventors: Imran Ahmad; Andrew S. Janoff; Walter Perkins
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1993-10-25
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 2000-09-28
Anticipated expiration: 2014-10-26
Also published as: KR960704524A; JP4076026B2; AU680702B2; AU8088894A; GR3034259T3; EP0725629B1; DK0725629T3; ES2146668T3; US5766624A; ATE193203T1; PT725629E; CA2172955C; CA2172955A1; WO1995011670A1; EP0725629A1; DE69424680D1; JPH09504298A

Description

Diese Arbeit wurde teilweise unter der Förderungsnummer AI31696-01 der National Institutes of Health durchgeführt. Demgemäß besitzt die Regierung der Vereinigten Staaten bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Diese Anmeldung richtet sich auf liposomale Defensinformulierungen und ihre therapeutische Anwendung. Defensine sind Proteinkomponenten eines Wirtslebewesenabwehrsystems. Sie werden in den spezialisierten Zellen gefunden, die dafür verantwortlich sind, eindringende Mikroben und Parasiten als auch anomale oder alternde Zellen in einem Lebewesen zu zerstören. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien, Pilze und Parasiten werden einer Defensinwirkung ausgesetzt (siehe z. B. T. Ganz et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 99 (1992)). Defensine aktivieren auch Viren. In dieser Hinsicht gaben Daher et al. (J. Virol. 60(3): 1068 (1986)) an, daß Humandefensine Viren mit Hülle, wie etwa Herpes Simplex Viren Typen 1 und 2, Cytomegalo-Virus, Vesikular Stomatitis-Virus und einen Influenza-Virus inaktivieren. Ganz et al. berichten (Eur. J. Haemotol. 44: 1 (1990)), daß verschiedene Defensine Säugerzellen in einer Kultur abtöteten. Lichtenstein et al. (Blood 68(6): 1407 (1986)) berichteten, daß Humandefensine Maus- und Humanlymphomzellen lysieren konnten. Kaninchendefensine waren für Mauslymphoma ebenfalls cytotoxisch. Darüber hinaus berichteten Charp et al. (Biochem. Pharmacol. 37(5): 951 (1988)), daß die Humandefensine (HNP-1, HNP-2 und HNP-3) Proteinkinase-C-Aktivität inhibierten.
Defensine werden in solchen Säugern, wie etwa Menschen, Kühen, Kaninchen, Meerschweinchen und Ratten gefunden. Die typischen Säugerdefensine sind kationische amphiphile Proteine mit etwa 29-34 Aminosäuren, die ein konserviertes Muster von sechs Cysteinresten aufweisen. Jedoch erfüllen nicht alle in cytoplasmatischen Säugergranulen gefundenen Defensine dieses prototypische Muster. Indolicidin z. B. ist ein cytotoxisches, tryptophanreiches Defensin mit 13 Aminosäuren, das aus Rinderneutrophilen (siehe M. Selsted et al., J. Biol. Chem. 267(7): 4292 (1992)) stammt. Die gleiche Gruppe (siehe Selsted et al., J. Biol. Chem. 268(9): 6641 (1993)) berichtete von der Isolierung von beta-Defensinen, einer Familie kationischer, amphiphiler Proteine mit sechs konservierten Cysteinresten mit cytotoxischen Aktivitäten ähnlich denjenigen der prototypischen Säugerdefensine, wenngleich ihre Größen und Strukturen etwas verschieden sind. Magainine, Proteine, die ursprünglich aus Fröschen erhalten wurden, sind ebenfalls ähnlich den Säugerdefensinen (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,962,277; U.S.-Patent Nr. 5,045,531). Defensine wurden auch in Insekten gefunden (siehe für eine Übersicht J. Hoffman und C. Hetru, Immunology Today 13(10): 411 (1992)).
Phagocyten, wie etwa Neutrophile, Eosinophile, Makrophagen und Killer-Lymphozyten haben defensinenthaltende cytoplasmatische Granulen, wobei die Neutrophile eine besonders reichhaltige Quelle von Defensinen sind. Die cytoplasmatischen Granulen verschmelzen mit endocytischen Vesikeln, wodurch es den Defensinen erlaubt wird, in Kontakt mit durch Endocytose aufgenommenem Material, wie etwa eindringenden Mikroben, zu kommen (siehe J. Gabay et al., J. Exp. Med. 164: 1407 (1986); W. Rice et al., Blood 70(3): 757 (1987)).
Defensine können an externe Phospholipidmembranen ihrer Ziele binden und hindurch permeabilisieren, wobei das osmotische Gleichgewicht der Zelle gestört wird (siehe z. B. Ganz et al., Med. Microbiol. Immunol. 181: 99 (1992); Ganz et al., Eur. J. Haematol. 44: 1 (1990); Kagan et al., PNAS 87: 210 (1990);
Lichtenstein et al., J. Immunol. 140: 2686 (1988), Lichtenstein et al., Blood 68(6); 1407 (1986)). Diese Permeabilisierung kann gegebenenfalls ausreichend sein, um den Zelltod zu induzieren; Zielzellmetabolitenaktivität und weitere Defensinwirkung können ebenfalls erforderlich sein.
Das Erreichen des vollen therapeutischen Potentials von Defensinen in Lebewesen erfordert, daß die Proteine auf eine solche Art verabreicht werden müssen, daß sie ihre Ziele in einer aktiven Form erreichen, jedoch eine kollaterale Schädigung der normalen Lebewesenzellen vermeiden. Dies kann durch Einbinden der Defensine in Liposomen verwirklicht werden.
Liposomen sind selbstaufbauende Strukturen, umfassend eine oder mehrere Doppelschichten amphipathischer Lipidmoleküle, die ein internes wäßriges Volumen einschließen. Die amphipathischen Lipidmoleküle, welche Lipiddoppelschichten aufbauen, umfassen einen polaren (hydrophilen) Kopfgruppenbereich, der kovalent an eine oder zwei nicht polare (hydrophobe) Acylketten gebunden ist. Der energetisch unvorteilhafte Kontakt zwischen den hydrophoben Acylketten und dem wäßrigen Medium bewirkt, daß sich die Lipidmoleküle neu anordnen, so daß die polaren Kopfgruppen in Richtung des wäßrigen Mediums orientiert sind, während die Acylketten sich in Richtung des Inneren der Doppelschicht reorientieren. Das Gesamtergebnis ist eine energetisch stabile Struktur, worin die Acylketten effektiv davon abgeschirmt sind in Kontakt mit dem wäßrigen Medium zu kommen.
Liposomen können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden (siehe für eine Übersicht z. B. Cullis et al., in: Liposomes, From Biophysics to Therapeutics M. J. Ostro, Hrsg.), Marcel Dekker, Seiten 39-72 (1987)). Banghams Verfahren (J. Mol. Biol. 13: 238-252 (1965)) erzeugt gewöhnliche multilamellare Vesikel (MLV). Lenk et al. (U. S. Patent Nr. 4,522,803 (PCT Veröffentlichungsnr. WO 83/03383 (13.10.83), 5,030,453 und 5,169,637), Fountain et al. (U. S. Patent Nr. 4,588,578 (PCT Veröffentlichungnr. WO 85/00751 (28.02.85)) und Cullis et al. (U. S. Patent Nr. 4,975,282 (PCT Veröffentlichungsnr. WO 87/00043 (15.01.87)) offenbaren Verfahren zum Herstellen multilamellarer Liposomen mit im wesentlichen gleicher interlamellarer Solutverteilung.
Unilamellare Vesikel können aus MLV erzeugt werden durch Beschallung (siehe Paphadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta. 135: 624 (1968)) oder durch Extrusion (Cullis et al., (U. S. Patent Nr. 5,008,050 (PCT Veröffentlichungsnr. WO 86/00238 (61.01.86)) und Loughrey et al., U. S. Patent Nr. 5,059,421 (PCT Veröffentlichungsnr. WO 91/00289 (10.01.89)). Janoff et al. (U. S. Patent Nr. 4,721,612 (PCT Veröffentlichungsnr. 85/04578 (24.10.85)) und Bolcsak et al. (U. S. Patent Nr. 5,100,662) beschreiben die Verwendung von Styrolen für die Herstellung von Liposomen mit verbesserter Stabilität. Diese Veröffentlichungen werden hier durch Bezugnahme eingeführt, um damit den Stand der Technik bezüglich der Liposomenherstellung anzugeben.
Liposomen können mit bioaktiven Mitteln passiv beladen werden, d. h. im Falle von wasserlöslichen Mitteln durch Solubilisieren des Moleküls in dem Medium, in welchem die Liposomen gebildet werden, oder durch Zugeben von lipidlöslichen Mitteln zu den Lipidlösungen, aus welchen die Liposomen hergestellt werden. Ionisierbare bioaktive Mittel können ebenfalls aktiv in Liposomen eingebracht werden, d. h. durch Aufbau eines elektrochemischen Potentialgradienten über die liposomale Membran und dann Zugeben des Mittels zu dem Medium, das außerhalb der Liposomen ist (siehe Bally et al., U. S. Patent Nr. 5,077,056, dessen Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden).
Arzneimittel, die in Liposomen eingeschlossen sind, können einen verbesserten therapeutischen Index aufweisen durch Verringerung der Toxizität, Erhöhung der Effizienz oder beides. Darüber hinaus werden Liposomen wie anderes teilchenförmiges Material in dem Kreislauf durch phagocytische Zellen des Reticuloendothelialsystems in Geweben aufgenommen, die sinusoidale Kapillaren aufweisen und werden dadurch häufig zu den Stellen intrazellulärer Infektionen geführt.
Die Anmelder liefern hier ein Liposom, das ein Defensin und ein freisetzungsinhibierendes Lipid enthält, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist, d. h. ein Defensin dessen Freisetzung aus dem Liposom inhibiert ist. Das U. S. Patent Nr. 5,032,574 offenbart Liposomen, die ein antimikrobielles Protein enthalten, dessen Sequenz, wenn auch abgeändert, auf der konservierten Säugerdefensinsequenz basiert. Jedoch offenbart diese Referenz nicht Liposomen, die gestaltet sind, um die Freisetzung von darin eingeschlossenen Defensinen zu inhibieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Anmeldung liefert ein Liposom, umfassend eine Lipiddoppelschicht, ein wäßriges Kompartiment und ein Defensin, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist. Das Liposom kann unilamellar oder multilamellar sein, ist jedoch vorzugsweise multilamellar. Bevorzugter ist das Liposom ein multilamellares Liposom mit einem Solut, das in seinen wäßrigen Kompartimenten eingeschlossen ist, worin die Konzentration des Soluts in jedem der wäßrigen Kompartimente im wesentlichen gleich ist, d. h. das Liposom ist ein multilamellares Vesikel mit im wesentlichen gleicher interlamellarer Solutverteilung. Das Defensin kann in einer Lipiddoppelschicht des Liposoms und/oder in einem wäßrigen Kompartiment des Liposoms enthalten sein. Das Defensin kann ein beliebiges mikrobizides und/oder tumorizides Abwehrsystemprotein des Wirtslebewesens sein, d. h. ein prototypisches Säugerdefensin, beta-Defensin, Indolicidin, Magainin oder Insektendefensin. Derzeit ist Indolicidin das bevorzugte Defensin.
Das Liposom dieser Erfindung kann ein freisetzungsinhibierendes Lipid umfassen. Derzeit bevorzugte freisetzungsinhibierende Lipide sind 1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholin (POPC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) und Distearylphosphatidylcholin (DSPC) plus Cholesterol, vorzugsweise bei einem DSPC zu Cholesterolverhältnis (Mol/Mol) von etwa 3 : 2. Demgemäß ist in derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung das Defensin Indolicidin und das Liposom umfaßt ein freisetzungsinhibierendes Lipid, umfassend POPC, DOPC oder DSPC und Cholesterol. Indolicidin/POPC-Liposomen umfassen typischerweise mindestens etwa 0,5 Mol-% Indolicidin und meistens etwa 99,5 Mol-% POPO, vorzugsweise etwa 5 Mol-% Indolicidin und etwa 95 Mol-% POPC. Indolicidin/(DSPC plus Cholesterol)-Liposomen umfassen typischerweise mindestens etwa 0,5 Mol-% Indolicidin und meist etwa 99,5 Mol-% DSPC plus Cholesterol, vorzugsweise etwa 20 Mol-% Indolicidin und etwa 80 Mol-% DSPC plus Cholesterol. Indolicidin/DOPC-Liposomen umfassen typischerweies mindestens etwa 5 Mol-% Indolicidin und meistens etwa 95 Mol-% DOPC.
Hier bereitgestellte Liposomen können weiterhin einen freisetzungsinhibierenden wäßrigen Puffer, ein kopfgruppenmodifiziertes Lipid und ein zusätzliches bioaktives Mittel umfassen. Die Liposomen können weiterhin eine Lipiddoppelschicht umfassen, die ein ionisierbares Lipid umfaßt. Vorzugsweise liegen mehr als 50% des ionisierbaren Lipids in der äußersten Lipiddoppelschicht des Liposoms in der inneren Monoschicht der äußersten Lipiddoppelschicht vor. Typischerweise umfaßt das ionisierbare Lipid mindestens etwa 5 Mol-% des Lipids in der Lipiddoppelschicht, wünschenswerterweise etwa 10 Mol-%. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das ionisierbare Lipid DPDAP (1,2-Dipalmitoyl-3-(N,N- dimethylamino)propan.
Diese Erfindung liefert auch ein dehydratisiertes Liposom, umfassend ein Defensin, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist. Weiterhin wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und ein Liposom, umfassend eine Lipiddoppelschicht, ein wäßriges Kompartiment und ein Defensin, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist.
Gegen eine Infektion wirksame Mengen der pharmazeutischen Zusammensetzung können an Lebewesen für die Behandlung oder Verhinderung von Infektionen durch Organismen, die gegenüber einem Defensin, z. B. Indolicidin, empfindlich sind, verabreicht werden. Bevorzugte therapeutische Subjekte sind Säuger, im besonderen Menschen, z. B. diejenigen Menschen, deren Immunsysteme beeinträchtigt wurden, z. B. durch Viren, wie etwa HIV, durch Chemotherapie oder für Organtransplantationen. Infektionen, die durch Pilze bewirkt werden, die gegenüber einem Defensin empfindlich sind, wie etwa diejenigen Infektionen, die durch Cryptococcus- oder Aspergillus-Pilz bewirkt werden, können mit den Liposomen dieser Erfindung behandelt werden. Demgemäß ist in einer derzeit bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das behandelte Lebewesen ein Mensch dessen Immunsystem beeinträchtigt ist und die Infektion umfaßt eine Pilzinfektion durch einen Cryptococcus oder einen Aspergillus.
Gegen Krebs wirksame Mengen der pharmazeutischen Zusammensetzung, die hier bereitgestellt wird, können an Lebewesen zur Behandlung von Krebs, der auf ein Defensin anspricht, z. B. eine Leukämie oder ein Lymphom, verabreicht werden.
Weiterhin wird hier ein Verfahren zum Behandeln einer Krankheit eines Lebewesens bereitgestellt, z. B. des Specific Granule Deficiency Syndrome, das durch einen Mangel proteinvermittelter mikrobizider und/oder tumorizider cytotoxischer Aktivität in cytoplasmatischen Granulen gekennzeichnet ist, umfassend, daß an das Lebewesen eine cytotoxisch wirksame Menge der hier bereitgestellten pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht wird. Das Verfahren kann besonders geeignet zur Behandlung von Lebewesen sein, die unter einem Syndrom leiden, das auch eine mikrobielle Infektion aufweist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1. Rechtwinkellichtstreuung von wäßrigem Indolicidin. Indolicidin wurde mit verschiedenen Konzentrationen in Pufferlösungen gelöst, enthaltend 10 mM HEPES und 150 mM NaCl, pH 7,5. Die Proben wurden in Fluoreszenzküvetten angeordnet und die Streuung von Licht bei einer Wellenlänge von 500 nm(Anregungswellenlänge) wurde in dem Fluorimeter bei einem Winkel von 90 Grad gemessen. Puffer alleine (kein Indolicidin) hatte eine relative Lichtstreuung von 0,4 · 10&sup6;. Die vertikale Achse ist ein Maß der relativen Streuungsintensität; die horizontale Achse gibt die Indolicidinkonzentration (ug/ml) an.
Fig. 2. Fluoreszenz von wäßrigem Indolicidin. Indolicidin wurde in 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, enthaltend 150 mM NaCl, gelöst. Die Anregungswellenlänge wurde auf 285 nm eingestellt und die Emissionswellenlängen wurden von 325 nm bis 450 nm gescannt. Die Fläche unter der Emissionskurve (vertikale Achse) wurde gegen die Indolicidinkonzentration (ug/ml) (horizontale Achse) dargestellt. Das Nebenbild in der Figur zeigt den Trend unterhalb von Indolicidinkonzentrationen von etwa 5 ug/ml. Die gepunktete Linie zeigt die Steigung, die auch in dem größeren Profil gezeigt wird. Drei verschiedene Steigungen werden ersichtlich. Die Spaltweiten wurden zwischen geringen und hohen Konzentrationen geändert; Zwischenkonzentrationen wurden bei beiden Spaltweiten untersucht, um eine einwandfreie Normalisierung sicherzustellen.
Fig. 3. Retention von Indolicidin in POPC- und DPPC- enthaltenden Liposomen. POPC (1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholin), POPC/Chol (Cholesterol), DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin) und DPPC/Chol-Liposomen wurden wie nachstehend beschrieben gebildet und Indolicidin wurde darin eingeschlossen. Der Prozentanteil des ursprünglich in den Liposomen eingeschlossenen Indolicidins, der darin nach 48 Stunden verblieb wurde bestimmt (gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren) und ist für jede der Liposomenformulierungen angegeben.
Fig. 4. Retention von Indolicidin in DOPE-enthaltenden Liposomen. Indolicidin enthaltende Liposomen wurden mit Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) wie nachstehend beschrieben gebildet. Die Konzentration von Indolicidin in Liposomen sowohl zu Beginn als auch nach sukzessiven Waschungen ist angegeben.
Fig. 5. Indolicidinretetion in DSPC/Cholenthaltenden Liposomen. Indolicidin enthaltende Liposomen wurden mit Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) plus Cholesterol wie nachstehend beschrieben gebildet. Die Konzentration von Indolicidin in dem Überstand und somit der Anteil des ursprünglich eingeschlossenen Indolicidins, welches nachfolgend aus den Liposomen austritt, wurde gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Konzentration von Indolicidin in dem Überstand (mM) ist nach der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Waschung angegeben.
Fig. 6. Fluoreszenz von freiem und liposomalem Indolicidin. Popo, DOPC und DSPC/Chol (3 : 2) multilamellare Vesikel (MLV) wurden durch zwei gestapelte Polycarbonatfilter mit 0,1 Mikrometer Porengröße bei 50ºC gepresst. Aliquote der resultierenden Liposomenproben wurden auf eine Endlipidkonzentration von 0,1 mg/ml verdünnt und Fluoreszenzemissionsprofile wurden bei Vorliegen von 0,5 ug Indolicidin und ohne Indolicidin bestimmt. Die Emissionswellenlängen wurden von 325 nm bis 450 nm gescannt; die Anregungswellenlänge wurde auf 285 nm eingestellt. A: Indolicidin in Pufferlösung; B: Indolicidin/DPPC/Chol- Liposomen; C: Indolicidin/DOPC-Liposomen; D: Indolicidin/POPC/Chol-Liposomen; E: Indolicidin/POPC- Liposomen.
Fig. 7. Ordnungsparameter von liposomalen Indolicidinsystemen. Die vertikale Achse zeigt die Wirkung auf die Ordnungsparameter von verschiedenen liposomalen Systemen bei der Zugabe von Indolicidin bei ansteigenden Indolicidinkonzentrationen (Mol-%, horizontale Achse) unter Verwendung des spinmarkierten 1-Palmitoyl-2(12-doxylstearoyl)- phosphatidylcholin bei einer Konzentration von 1 Mol-%. Nicht ausgefüllte Quadrate: DPPC-Liposomen; nicht ausgefüllte Dreiecke: DSPC-Liposomen; nicht ausgefüllte Kreise: DSPC/Chol (3 : 2) Liposomen; Sternchen: DHPC-Liposomen; ausgefüllte Quadrate: POPC-Liposomen; ausgefüllte Dreiecke: POPC/Chol/DOTAP (Dioleoyltrimethylaminopropan), (5 : 4 : 1) Liposomen; ausgefüllte Kreise: POPC/DOTAP (9 : 1) Liposomen; und ausgefüllte Balken: DSPC/Chol/DDAB (Dimethylaminodioctadecylammoniumbromid)-Liposomen.
Fig. 8. Hämolytische Aktivität von Indolicidin in POPC- und DPPC-enthaltenden Liposomen. Indolicidin wurde sowohl in seiner freien (nicht eingeschlossenen) Form als auch als Teil von liposomalen Formulierungen mit roten Blutzellen (RBC) inkubiert. Der Prozentanteil der lysierten RBC wurde wie nachstehend beschrieben gemessen und ist als eine Funktion der Indolicidin-Konzentration (nicht ausgefüllte Quadrate: freies Indolicidin; nicht ausgefüllte Dreiecke: Indolicidin/POPC- Liposomen; nicht ausgefüllte Kreise: Indolicidin/DPPC- Liposomen, ausgefüllte Quadrate: Indolicidin/DPPC Interdigitationsfusionsliposomen) angegeben.
Fig. 9. Wirkung der Veränderung der Konzentration von Indolicidin in POPC-enthaltenden Liposomen auf die hämolytische Aktivität. Indolicidin/POPC-Liposomen wurden wie nachstehend beschrieben, hergestellt. Die Indolicidin enthaltenden Vesikel (zusammen mit freiem Indolicidin) wurden mit RBC inkubiert und die lysierte Anzahl wurde bestimmt (ebenfalls gemäß nachstehend beschriebenen Verfahren). Der Prozentanteil der RBC-Hämolyse, die durch Indolicidin induziert wird, ist als eine Funktion der Indolicidinkonzentration (mg/ml) in den RBC-Proben (ausgefüllte Quadrate: freies Indolicidin; ausgefüllte Dreiecke: 3,8 Mol-% Indolicidin in POPC-Liposomen; Sterne: 2,5 Mol-% Indolicidin; ausgefüllte Kreise: 1,8 Mol-% Indolicidin; ausgefüllte Quadrate: 1,0 Mol-% Indolicidin; ausgefüllte Dreiecke: 0,4 Mol-% Indolicidin) angegeben.
Fig. 10. Hämolytische Aktivität von Indolicidin in DSPC/Chol- Liposomen. Indolicidinenthaltende DSPC/Chol-Liposomen wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt, um 4,8 Mol-% Indolicidin aufzuweisen. Die Liposomen wurden mit RBC inkubiert. Die wie nachstehend beschrieben bestimmte lysierte Anzahl ist als das Prozent RBC-Hämolyse angegeben, die beobachtet wird bei Veränderung der Indolicidinkonzentration in den RBC-Proben (ausgefüllte Dreiecke: 4,8 Mol-% Indolicidin in DSPC/Chol-Liposomen; ausgefüllte Quadrate: freies Indolicidin).
Fig. 11. Wirkung von verschiedenen Lipiden auf die Hämolyse von roten Blutzellen. DSPC/Chol und DSPC/Chol/DDAB-Liposomen wurden hergestellt und in Hämolysetests verwendet, um die Wirkung der angegebenen Lipide auf die RBC-Hämolyse zu messen. Die Ergebnisse sind als Prozent Hämolyse (relativ zu null und einhundert Prozent Hämolysekontrollen) angegeben, die bei verschiedenen Lipidkonzentrationen in den RBC-Proben induziert wurden.
Fig. 12. Hämolytische Aktivität auf Indolicidin/DOPE- Liposomen. Indolicidin/DOPE-Liposomen wurden hergestellt und in Hämolysetests verwendet. Die Ergebnisse sind als die Prozent Hämolyse (relativ zu null und einhundert Prozent Hämolysekontrollen) angegeben, die bei verschiedenen Lipidkonzentrationen induziert werden.
Fig. 13. Cytoxizität von freiem gegenüber liposomalem Indolicidin. Die spezifische Inhibierung der in vitro Proliferation von CHO/K1-Zellen durch freies Indolicidin bei ansteigenden Konzentrationen (ug/ml), leeren Liposomen und liposomalem Indolicidin bei ansteigenden Indolicidinkonzentrationen (ug/ml) (Horizontalachse) wurde durch einen Standardthymidininkorporationstest (cpm · 10³, vertikale Achse) gemessen.
Fig. 14. Therapeutische Wirksamkeit von freiem und liposomalem Indolicidin gegen Aspergillus-Infektionen in Mäusen. Balb/c-Mäuse wurden jeweils mit 2 · 10&sup7; A. fumigatus Sporen infiziert und erhielten dann eine Injektion mit entweder PBS-Puffer, freiem Indolicidin oder liposomalem Indolicidin. Die Überlebensrate der Lebewesen wurde über eine Dauer von fünfzehn Tagen dargestellt. Die Prozent Überlebende (vertikale Achse) sind gegen die Zeit in Tagen (horizontale Achse) dargestellt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung liefert ein Liposom, umfassend eine Lipiddoppelschicht, ein wäßriges Kompartiment und ein Defensin, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist. Defensine sind Mikrobizide und/oder tumorizide cytotoxische Proteine, Polypeptide oder Peptide, die gefunden werden in oder sezerniert werden durch spezialisierte Abwehrsystemzellen des Wirtslebewesens. Die Proteine können cytotoxisch für infektiöse Organismen, z. B. Bakterien, Pilze und Parasiten als auch anomale, z. B. cancerogene oder alternde Wirtszellen sein, und es wurde gefunden, daß sie Viren mit Hülle inaktivieren. Die Proteine wurden gefunden in Säugern, wie etwa Menschen, Kühen, Meerschweinchen, Kaninchen und Ratten. Sie wurden ebenfalls von Nichtsäugern, wie etwa Fröschen, Insekten und Haifischen, erhalten.
"Prototypische Säugerdefensine" sind variable kationische Proteine, die in den cytoplasmatischen Granulen von Säugerphagozyten gefunden werden. Diese Defensine umfassen typischerweise zwischen etwa 29 und 34 Aminosäuren, haben ein konserviertes Muster von sechs Cysteinresten und sind amphiphil. Die prototypischen Säugerdefensine umfassen Humanneutrophilprotein 1, 2 und 3 (HNP-1, HNP-2 und HNP-3), als auch Kaninchen-, Ratten- und Meerschweinchen- Neutrophilproteine.
Zusätzliche Defensine, einschließlich anderer Säugerdefensine als auch diejenigen, die von Nichtsäugern erhalten werden, haben ähnliche cytotoxische Aktivitäten, wenngleich sie von der Sequenz und/oder Struktur dieser prototypischen Muster abweichen. Zum Beispiel können die beta-Defensine eine ähnliche Reihe cytotoxischer Aktivitäten wie diejenigen der prototypischen Säugerdefensine aufweisen und können auch aus Rinderneutrophilen erhalten werden, haben jedoch verschiedene Übereinstimmungsaminosäuresequenzen und dreidimensionale Strukturen. Indolicidin ist ein mikrobizides, tumorizides cytotoxisches Protein mit dreizehn Aminosäuren, das auch aus Rinderneutrophilen isoliert werden kann. Indolicidin hat eine mit prototypischen Säugerdefensinen vergleichbare cytotoxische Wirkung, ist jedoch kleiner und es fehlen deren sechs konservierte Cysteine. Insektendefensine sind ebenfalls kationisch, weisen ein Muster von sechs konservierten Cysteinen auf, sind stark amphiphil und sind cytotoxisch, wenngleich sie sich von den phytotoxischen Säugerdefensinen bezüglich Größe und dreidimensionaler Struktur unterscheiden. Magainine sind kationische, amphiphile mikrobizide Wirtsabwehrsystemproteine, die ursprünglich aus Fröschen erhalten wurden. Darüber hinaus wurden Defensine auch in Haien gefunden.
Demgemäß bedeutet der Ausdruck "Defensin" wie er hier verwendet wird, ein mikrobizides und/oder tumorizides Protein, Peptid oder Polypeptid, welches eine Komponente des Abwehrsystems eines Wirtslebewesens gegen infektiöse, anomale oder alternde Zellen ist, und welches gefunden werden kann in oder sezernierd wird von Zellen des Abwehrsystems des Wirtslebewesens. Defensine umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, "prototypische Säugerdefensine", beta-Defensine, Indolicidin, Magainine und Insekten-Defensine, als auch andere Wirtslebewesenabwehrsystemproteine, z. B. diejenigen, die aus Haien erhalten werden. Der Ausdruck "Defensine" umfaßt derartige Proteine, unabhängig davon, ob sie aus den Lebewesenzellen isoliert sind oder synthetisch erzeugt sind, und umfaßt ebenfalls Varianten, die im wesentlichen die cytotoxischen Aktivitäten ihrer Stammproteine erhalten, jedoch deren Sequenzen durch Insertion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren abgeändert worden ist. Derzeit ist das bevorzugte Defensin zur Verwendung in den liposomalen Formulierungen dieser Erfindung Indolicidin.
Ein "neutralisiertes" Defensin ist ein Defensin, das mit einem Liposom assoziiert ist und welches dahingehend inhibiert ist den Doppelschichtaufbau des Liposoms durch eine oder mehrere der Vesikelkomponenten nicht zu zerstören. Der Ausdruck "assoziiert" beschreibt Defensine, die in einem wäßrigen Kompartiment des Liposoms enthalten sind oder Defensine, die in einer Lipiddoppelschicht des Liposoms enthalten sind. Neutralisierte Defensine entweichen im allgemeinen im wesentlichen nicht aus Liposomen, erhalten jedoch ihre cytotoxischen Aktivitäten, d. h. sie können den Doppelschichtaufbau eines Ziels zerstören, wenn sie dem Ziel ausgesetzt werden. Defensine werden vorzugsweise neutralisiert durch Inhibieren ihrer Wechselwirkung mit Lipiddoppelschichten. Vesikelkomponenten, die die Defensin- Doppelschicht-Wechselwirkung inhibieren, z. B. durch Erhöhen der Doppelschichtsteifheit, um Defensininsertion zu inhibieren, oder durch Einführen von Defensinen zum Aggregieren in einem wäßrigen Kompartiment, so daß sie im allgemeinen dann nicht in die Doppelschicht insertieren, können Defensine neutralisieren. Alternativ können Defensine durch Induzieren ihrer stabilen Insertion in Lipiddoppelschichten neutralisiert werden. Vesikelkomponenten können eine stabile Defensininsertion induzieren, z. B. durch Bilden vorteilhafter Van der Waals-Typ-Wechselwirkungen mit den hydrophoben Anteilen der Proteine, indem für Proteine im Inneren der Doppelschicht Raum ermöglicht wird oder durch Bilden vorteilhafter elektrostatischer Wechselwirkungen mit den Defensinen. Bevorzugte Defensin-Doppelschicht- Wechselwirkungen führen zu der geringsten Störung des strukturellen Aufbaus der Doppelschicht. Veränderungen des Doppelschichtaufbaus können gemessen werden durch Messen der Veränderungen der Ordnungsparameter der Doppelschicht wenn sie gestört wird, z. B. durch die Zugabe eines Defensins zu der Doppelschicht. Ordnungsparameter, die durch in der Technik dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren gemessen werden können, messen den Grad, zu welchem die Orientierung der Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindungen der Lipide, die die Doppelschicht aufbauen, mit der normalen wäßrigen Umgebungsgrenzfläche der Doppelschicht korreliert ist (siehe z. B. S. Gruner, Nonlamellar Lipid Phases, in: The Structure of Biological Membranes (P. Yeagle, Hrsg.), CRC Press, Inc., Boca Raton (1992), Seiten 222-223, wobei deren Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden). Es kann erwartet werden, daß eine Störung der Doppelschichtorganisation die Korrelation verringert. Bevorzugte freisetzungsinhibierende Lipide, die vorteilhafte Wechselwirkungen mit Defensinen induzieren, sind diejenigen, die die geringste Änderung der Ordnungsparameter, die geringste Störung des Doppelschichtaufbaus induzieren.
Liposomen sind selbstaufbauende Strukturen, umfassend eine oder mehrere Lipiddoppelschichten, die ein inneres wäßriges Volumen umgeben. Lipiddoppelschichten umfassen zwei entgegengesetzte Monoschichten amphipatischer Lipidmoleküle, wobei jedes dieser eine polare (hydrophile) Kopfgruppe, die einer internen oder externen wäßrigen Phase benachbart ist, und hydrophobe Acylketten, die in dem Inneren der Doppelschicht angeordnet sind, umfaßt. Die Kopfgruppe können Phosphat-, Sulfat-, Amino- oder andere geeignete polare Reste sein, sind jedoch vorzugsweise Phosphatgruppen; die Acylketten weisen typischerweise 14 bis 24 Kohlenstoffatome in der Länge auf und können eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten, d. h. die Acylketten können gesättigt oder ungesättigt sein. Die Bildung stabiler Lipiddoppelschichten spiegelt ein Energiegleichgewicht von hydrophoben Effekten der Wechselwirkung von Acylketten und der umgebenden wäßrigen Umgebung, sterischen Packungsspannungen auf den Acylketten, Anziehungs- und Abstoßungswechselwirkungen an der Grenzfläche der Doppelschicht mit der wäßrigen Umgebung, Biegeelastizität der Doppelschicht u. dgl. wider.
Liposomen können eine Lipiddoppelschicht aufweisen, d. h. sie können unilamellar sein, oder mehrere Doppelschichten aufweisen, d. h. sie können multilamellar sein (MLV). Unilamellare Vesikel können kleine (SUV) oder große unilamellare Vesikel (LUV), Liposomen mit mittleren Durchmessern von größer als etwa 50 nm sein.
MLV können hergestellt werden durch Lösen von Lipiden in einem organischen Lösungsmittel, Verdampfen des Lösungsmittels und dann Zugeben eines wäßrigen Mediums zu dem resultierenden Lipidfilm (siehe z. B. Bangham, J. Mol. Bio. 13: 238 (1965)). Cullis et al. (U. S. Patent Nr. 4,975,282), Lenk et al. (U. S. Patent Nr. 4,522,803, 5,030,453 und 5,169,637) und Fountain et al. (U. S. Patent Nr. 4,588,578) offenbaren Verfahren zum Herstellen multilamellarer Liposomen, worin die Liposomen ein Solut enthalten, das in ihren wäßrigen Kompartimenten eingeschlossen ist, und worin die Konzentration des Soluts in jedem der Kompartimente im wesentlichen gleich ist, d. h. die Liposomen haben im wesentlichen gleiche interlamellare Solutverteilung.
Unilamellare Vesikel können hergestellt werden aus MLV durch Beschallung (siehe Pahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta. 135: 624 (1968)) oder durch Extrusion unter Druck durch Filter (siehe Cullis et al., U. S. Patent Nr. 5,008,050 und Loughrey et al., U. S. Patent Nr. 5,059,421). Die Offenbarungen werden hier durch Bezugnahme eingeführt, um den Stand der Technik in Bezug auf die Liposomenherstellung zu beschreiben.
Das Liposom dieser Erfindung kann unilamellar oder multilamellar sein, ist jedoch vorzugsweise multilamellar. Mehrfache Lipiddoppelschichten stellen eine größere Anzahl von Barrieren für die Defensinfreisetzung von Liposomen dar. Das multilamellare Liposom kann ein gewöhnliches MLV sein, d. h. ein MLV, das durch ein Verfahren ähnlich demjenigen von Bangham et al. (J. Mol. Biol. 13: 238 - Lösen von einem oder mehreren amphipathischen Lipiden in einem organischen Lösungsmittel, Verdampfen des Lösungsmittels und dann Rehydratisieren der getrockneten Lipide mit einem wäßrigen Medium). Derartige MLV können weiterverarbeitet werden. Zum Beispiel POPC, indolicidinenthaltende Liposomen, können durch Herstellen eines Gemisches von Indolicidin und POPC in einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln (z. B. Ethanol, Methanol und Chloroform), Verdampfen des organischen Lösungsmittels und Hydratisieren der getrockneten Lipide mit einem wäßrigen Puffer hergestellt werden. Die resultierenden Liposomen sind gewöhnliche MLV und können durch Filter mit einer definierten Porengröße (z. B. 5 um) gepreßt bzw. extrudiert werden, um ihre Lamellarität zu verringern und ihre Größe zu homogenisieren, gemäß den Verfahren von Cullis et al. (U. S. Patent Nr. 5,008,050) und Loughrey et al. (U. S. Patent Nr. 5,059,421). Jedoch enthält das multilamellare Liposom dieser Erfindung vorzugsweise ein Solut, das in seinen wäßrigem Kompartimenten eingeschlossen ist, worin die Konzentration des Soluts in jedem der wäßrigen Kompartimente im wesentlichen gleich ist, d. h. das multilamellare Liposom hat im wesentlichen gleiche interlamellare Solutverteilung. Das Liposom kann z. B. mit DSPC und Cholesterol hergestellt werden und kann osmotisch stabiler sein als ein gewöhnliches MLV.
Das Liposom dieser Erfindung kann weiterhin ein freisetzungsinhibierendes Lipid umfassen, d. h. ein Lipid, das die Freisetzung von Defensinen aus Liposomen inhibiert. Ein "Freisetzungsinhibierendes Lipid" kann ein Lipid sein, welches Defensin-Doppelschicht-Wechselwirkungen inhibiert, so daß die Proteine im allgemeinen nicht sich selbst in Lipiddoppelschichten insertieren können und dabei stören sie im allgemeinen den Doppelschichtaufbau nicht. Derartige Lipide können Defensin-Doppelschicht-Wechselwirkungen inhibieren, z. B. durch Ladungen der Kopfgruppen, welche elektrostatische Abstoßungen mit geladenen Gruppen auf Defensinen aufbauen und durch Erhöhen der Membransteifheit oder eine andere Begrenzung der Fähigkeit hydrophober Defensindomänen zum vorteilhaften Wechselwirken mit hydrophoben Acylketten in Doppelschichtinnenräumen. Vorzugsweise ist das freisetzungsinhibierende Lipid dieser Erfindung ein Lipid, welches Defensin-Doppelschicht-Wechselwirkungen inhibiert. Das derzeit bevorzugte derartige freisetzungsinhibierende Lipid umfaßt DSPC plus Cholesterol, wünschenswerterweise in einem molaren Verhältnis von 3 : 2 von DSPC zu Cholesterol. Alternativ kann ein freisetzungsinhibierendes Lipid ein Lipid sein, welches vorteilhaft mit einem Defensin in einer Lipiddoppelschicht wechselwirken kann. Freisetzungsinhibierende Lipide können mit Defensinen durch vorteilhafte Van der Waals-Typ- Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Acylketten und hydrophoben Domänen der Defensine wechselwirken; Freisetzungsinhibierende Lipide können auch kovalente Bindungen mit Defensinen bilden. Elektrostatische Wechselwirkungen können zwischen geladenen Lipidkopfgruppen und geladenen Defensinen aufgebaut werden, wobei der hydrophobe Anteil des Defensine in dem Inneren der Doppelschicht verbleibt. Derartige "vorteilhafte Wechselwirkungen" würden zur geringsten Zerstörung des Aufbaus der Doppelschicht führen, was das Potential für die Defensinfreisetzung minimiert. Freisetzungsinhibierende Lipide können ebenfalls vorteilhafte sterische Bedingungen zur Insertion der hydrophoben Domänen von Defensinen in das Doppelschichtinnere aufbauen. Darüber hinaus können freisetzungsinhibierende Lipide induzieren, daß ein Defensin seine hydrophobe Domäne in eine Lipiddoppelschicht insertiert, so daß das Defensin keine Poren in der Doppelschicht bildet. Derzeit bevorzugte freisetzungsinhibierende Lipide, welche vorteilhaft mit Defensinen wechselwirken können, sind 1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholin (POPC) oder Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC).
Demgemäß umfaßt in eine Ausführungsform der Erfindung das Defensin Indolicidin und das freisetzungsinhibierende Lipid umfaßt POPC. Typischerweise umfassen die Indolicidin/POPC- Liposomen mindestens etwa 0,5 Mol-% Indolicidin und höchstens etwa 99,5 Mol-% POPC; wünschenswerterweise umfassen die Liposomen etwa 5 Mol-% Indolicidin und etwa 95 Mol-% POPC. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Defensin Indolicidin und das freisetzungsinhibierende Lipid umfaßt DOPC. Typischerweise umfaßt das Liposom mindestens etwa 0,5 Mol-% Indolicidin und höchstens etwa 99,5 Mol-% DOPC. Wie hier verwendet, bedeutet "Mol-%" eines Lipids oder Proteins die Anzahl von Molen des Lipids oder des Proteins, geteilt durch die gesamte Anzahl vorliegender Mole (d. h. Mol-% von A = (A)/(A + B)).
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Defensin Indolicidin und das freisetzungsinhibierende Lipid umfaßt DSPC plus Cholesterol, wobei das DSPC und Cholesterol vorzugsweise in einem molaren Verhältnis von etwa 3 zu 2 DSPC: Cholesterol vorliegen. Typischerweise umfaßt das Liposom mindestens etwa 0,5 Mol-% Indolicidin und höchstens etwa 99,5 Mol-% DSPC und Cholesterol, wünschenswerterweise etwa 20 Mol-% Indolicidin und etwa 80 Mol-% DSPC plus Cholesterol.
Das hier bereitgestellte Liposom kann weiterhin einen freisetzungsinhibierenden Puffer umfassen. Wie hier verwendet, ist ein "freisetzungsinhibierender Puffer" eine wäßrige Lösung, welche die Freisetzung eines Defensins, das in einem Liposom eingeschlossen ist, inhibiert oder verhindert. Derartige Puffer inhibieren die Defensinfreisetzung dadurch, daß sie die Proteine vor einer Zerstörung der Lipiddoppelschichten inhibieren, vorzugsweise durch Inhibieren der Defensinwechselwirkung mit den Doppelschichten. Die Defensindoppelschichtwechselwirkung kann inhibiert werden indem Defensinmolekülwechselwirkung oder -quervernetzung untereinander induziert wird, so daß die resultierenden Aggregate im allgemeinen sich nicht selbst in Lipiddoppelschichten insertieren. Defensine können induziert werden, um Komplexe zu bilden, dadurch daß sie in anionischen, vorzugsweise polyanionischen, wäßrigen Lösungen, angeordnet werden, so daß verschiedene Defensinmoleküle und Anionen elektrostatische Wechselwirkungen aufbauen. Zum Beispiel kann Indolicidin als ein Komplex präzipitiert werden indem es in einer 50 mM Citratlösung angeordnet wird. Die Präzipitation wird erleichtert durch elektrostatische Paarung zwischen positiven Ladungen auf dem Indolicidin (fünf insgesamt pro Molekül) und negative Ladungen auf dem Citrat (drei insgesamt pro Molekül bei pH 7) und ist kennzeichnend für die Quervernetzung von Proteinmolekülen. Quervernetzte, präzipitierte Defensinkomplexe können in Liposomen durch Zugabe einer wäßrigen Suspension des Komplexes zu den Flüssigkeiten, mit welcher die Vesikel hergestellt werden, eingeschlossen werden. Defensinkomplexe können ebenfalls in Liposomen durch Bildung von Vesikeln eingeschlossen werden, so daß sie das Defensin oder Polyanion, aber nicht beide, enthalten, und sie sind impermeabel für die eingeschlossenen Spezies, während sie permeabel für andere nicht eingeschlossene Spezies sind. Wenn die nicht eingeschlossenen, permeablen Spezies in die externe Umgebung eingebracht werden, welche das Liposom umgibt, bildet sich ein Präzipitat in dem Vesikel, wenn die permeable Spezies in das Innere wandert und elektrostatische Wechselwirkungen induzieren Defensinaggregation.
Hier bereitgestellte liposomale Defensine können weiterhin ein zweites bioaktives Mittel umfassen, d. h. ein bioaktives Mittel zusätzlich zu dem Defensin. Wie hier verwendet, bezeichnet "bioaktives Mittel" jede Verbindung oder Zusammensetzung, die biologische Aktivität in Lebewesen, z. B. Menschen, aufweist. Bioaktive Mittel umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: antivirale, antibakterielle, fungizide, antiparasitäre, antimetabolische, antiglaukome, entzündungshemmende oder antineoplastische Verbindungen, Styrole, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Immunoglobuline, Immunomodulatoren, Farbstoffe, Toxine, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter, Glycoproteine, Radiomarkierungsmittel, strahlenundurchlässige Verbindungen, fluoreszente Verbindungen, Zellrezeptorproteine, Zellrezeptorliganden, mydriatische Verbindungen, Bronchodilatoren, Lokalanästhetika, wachstumsfördernde Mittel, regenerative Mittel u. dgl. Dieses zweite bioaktive Mittel kann ein zusätzliches Defensin sein.
Das hier bereitgestellte Liposom kann weiterhin ein kopfgruppenmodifiziertes Lipid umfassen. Liposomen werden von dem Körper eines Lebewesens durch sein Reticuloendothelialsystem (RES) gecleart, welches aus fixierten und zirkulierenden Makrophagen besteht. Das Vermeiden einer RES-Clearance erlaubt es Liposomen in dem Kreislauf länger zu verbleiben, was bedeutet, daß weniger des Arzneimittels verabreicht werden muß, um gewünschte Serumgehalte zu erreichen. Erhöhte Zirkulationszeiten erlauben auch das Richten von Liposomen auf nicht RES-enthaltende Gewebe. Liposomenoberflächen werden mit Serumproteinen beschichtet wenn sie an Lebewesen verabreicht werden. Clearanceraten durch das RES können mit der Rate und dem Gehalt einer derartigen Proteinbeschichtung in Beziehung gebracht werden; demgemäß kann die Clearance inhibiert werden durch Modifizieren der äußeren Oberfläche von Liposomen, so daß die Bindung von Serumproteinen im allgemeinen inhibiert wird. Dies kann verwirklicht werden durch Minimieren oder Abschirmen von negativen Oberflächenladungen, was Proteinbindung fördern kann, oder durch die Darbietung einer sterischen Hinderung anderer Art für die Bindung von Serumproteinen.
Effektive Oberflächenmodifikation, d. h. Veränderungen an der äußeren Oberfläche von Liposomen, welche zur Inhibierung einer RES-Aufnahme führen, kann verwirklicht werden durch Einbau von kopfgruppenmodifizierten Lipiden in liposomale Doppelschichten. "kopfgruppenmodifizierte Lipide" sind, wie hier verwendet, amphipathische Lipide, deren polare Kopfgruppen derivatisiert worden sind durch die Bindung eines chemischen Restes daran, z. B. Polyethylenglykol, ein Polyalkylether, ein Gangliosid, eine organische Dicarbonsäure o. dgl., welche die Bindung von Serumproteinen an Liposomen inhibieren können, so daß das pharmacokinetische Verhalten der Vesikel in den Kreislaufsystemen der Lebewesen verändert wird (siehe z. B. Blume et al., Biochim. Biophys. Acta. 1149: 180 (1993); Gabizon et al., Pharm. Res. 10(5): 703 (1993); Park et al. Biochim. Biophys. Acta. 1108: 257 (1992); Woodle et al., U. S. Patent Nr. 5,013,556; Allen et al., U. S. Patent Nr. 4,837,028 und 4,920,016 (PCT Veröffentlichungsnr. WO 88/04924 (14.07.88)); wobei die Inhalte dieser Offenbarungen hier durch Bezugnahme eingeführt werden). Das durch diese Erfindung bereitgestellte Liposom kann weiterhin ein solches kopfgruppenmodifiziertes Lipid umfassen. Die Menge des kopfgruppenmodifizierten Lipids, das in das Liposom eingebracht wird, hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, oder innerhalb seines Wissensbereiches ohne unverhältnismäßige Versuche bestimmbar sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: den Lipidtyp und den Kopfgruppenmodifikationstyp; den Typ und die Größe des Liposoms; und die vorgesehene therapeutische Anwendung der liposomalen Defensinformulierung. Typischerweise ist die Konzentration des kopfgruppenmodifizierten Lipids in dem Liposom mindestens etwa 5 Mol-%, wünschenswerterweise etwa 10 Mol-%.
Die Lipiddoppelschicht des Liposoms dieser Erfindung kann ein ionisierbares Lipid umfassen. Ionisierbare Lipide, die in einer Umgebung mit dem geeigneten pH angeordnet werden, werden eine oder mehrere positive oder negative Ladungen tragen. Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die in Liposomen eingeschlossen sind und Lipidkomponenten der Liposomen, die den gleichen Ladungstyp tragen, können zu elektrostatischen Abstoßungen zwischen dem Protein und dem Lipid führen; derartige elektrostatische Abstoßungen können die Freisetzung des Proteins aus den Liposomen inhibieren.
Defensine sind im allgemeinen kationische Proteine. Demgemäß kann das Einbringen von einem ionisierbaren, kationischen Lipid in eine liposomale Doppelschicht elektrostatische Abstoßung mit einem Defensin induzieren und dabei eine Freisetzung des Defensins aus dem Liposom inhibieren. Die Menge eines ionisierbaren Lipids, das in eine Lipiddoppelschicht einzuführen ist, ist jede Menge, die eine Defensindoppelschichtwechselwirkung verhindern kann und dabei die Defensinfreisetzung inhibieren kann und welche ansonsten mit der Liposomenherstellung, Stabilität und Verwendung kompatibel ist. Die Menge wird von einer Vielzahl von Faktoren, die dem Fachmann, dem diese Erfindung vorliegt, bekannt sind, oder die innerhalb seines Wissensbereiches ohne unverhältnismäßige Versuche liegen, abhängen. Diese Faktoren umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: den Lipidtyp und die Ladungsmenge pro Molekül, das Defensin und den verwendeten Liposomtyp. Typischerweise ist die Menge des ionisierbaren Lipids, die in eine Lipiddoppelschicht eingebracht wird, etwa 5 Mol-% des Lipids in der Doppelschicht, wünschenswerterweise etwa 10 Mol-%.
Vorzugsweise liegen mehr als etwa 50% des ionisierbaren Lipids, das in der äußersten Lipiddoppelschicht des Liposoms vorliegt, in der inneren Monoschicht der äußersten Lipiddoppelschicht vor. Lipiddoppelschichten umfassen zwei entgegengesetzte Monoschichten amphipathischer Lipidmoleküle, ein innere und eine äußere Monoschicht. Die äußerste Lipiddoppelschicht eines Liposoms ist die Lipiddoppelschicht der äußeren Monoschicht, welche benachbart der externen Umgebung ist, die das Liposom umgibt. Eine Akkumulierung des ionisierbaren Lipids in der inneren Monoschicht einer Lipiddoppelschicht wird elektrostatische abstoßende Kräfte mit ionisierbaren Proteinen maximieren, die in dem wäßrigen Kompartiment, das die Doppelschicht umgibt, eingeschlossen sind, während die Aussetzung der geladenen Lipide der externen Umgebung minimiert wird. Ionisierbare Lipide können in der inneren Monoschicht einer Lipiddoppelschicht durch Aufbauen eines elektrochemischen Potentialgradienten akkumuliert werden, z. B. durch einen Protonengradienten über die Doppelschicht gemäß den Verfahren von Hope et al. (U. S. Patent Nr. 5,204,112 (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/07530 (17.12.87)) und U. S. Patent Nr. 5,252,263). Derzeit ist es bevorzugt, daß das ionisierbare Lipid, das in das Liposom dieser Erfindung eingebaut wird DPDAP (1,2-Dipalmitoyl-3-(N,N- Dimethylamino)propan ist.
Diese Erfindung liefert weiterhin ein dehydratisiertes Liposom, umfassend ein Defensin, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist. Liposomale Dehydratisierung ermöglicht es, daß Vesikel für ausgedehnte Zeitdauern aufbewahrt werden; sie können bedarfsmäßig rekonstituiert werden. Liposomen können werden durch Gefrieren, unter Verwendung einer Standardgefriertrocknungsausstattung oder äquivalente Vorgehensweisen dehydratisiert werden. Lyophilisierung wird vorzugsweise durchgeführt nach dem Einbringen von einem oder mehreren Schutzzuckern in Liposomenpräparationen gemäß den Verfahren, die in Schneider et al. beschrieben sind (U. S. Patent Nr. 4,229,360) und Janoff et al. (U. S. Patent Nr. 4,880,635 (PCT Veröffentlichung Nr. WO 86/01103 (27.02.86)), wobei deren Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden). Schutzzucker können vermieden werden wenn die Dehydratisierung ohne Gefriertrocknung durchgeführt wird und ausreichend Wasser in der liposomalen Präparation belassen wird, um die Integrität eines wesentlichen Teils der Liposomendoppelschichten über das Dehydratisierungs-Rehydratisierungs-Verfahren aufrechtzuerhalten.
Diese Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und ein Liposom, umfassend eine Lipiddoppelschicht, ein wäßriges Kompartiment und ein Defensin, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist. Wie hier verwendet bedeutet "pharmazeutisch verträglicher Träger" jeden Standardträger, Verdünnungsmittel, Excipienten u. dgl., welche im allgemeinen vorgesehen sind für die Verwendung in Verbindung mit der Verabreichung von biologisch aktiven Mitteln an Lebewesen. Derartige Träger sind in der Technik allgemein bekannt und werden im allgemeinen ausgewählt im Hinblick auf eine Vielzahl von Faktoren, wie etwa das spezielle zu verwendende Arzneimittel und den vorgesehenen Verabreichungsweg, welche dem Fachmann allgemein bekannt sind oder innerhalb seines Wissensbereiches bestimmbar sind. Geeignete Träger umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Salzlösungen, wie etwa physiologische Salzlösung, wäßrig-gepufferte Lösungen u. dgl. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin Hilfsmittel umfassen, wie etwa Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel u. dgl., in Mengen und aus Gründen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als eine Einheitsdosisform bereitgestellt werden, welche eine gegen Infektion wirksame oder gegen Krebs wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung enthält.
Die hier bereitgestellten pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Infektion in einem Lebewesen verwendet werden, z. B. einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen und am bevorzugtesten bei Menschen, deren Immunsysteme beeinträchtigt sind, z. B. durch Viren, wie etwa HIV, durch Chemotherapie oder für eine Organtransplantation. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer gegen eine Infektion wirksamen Menge der verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzung an das Lebewesen. Die Infektion kann durch Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten oder einen anderen Typ mikrobieller Infektion geschehen, welche empfindlich gegenüber einem Defensin ist. Das Ansprechen von infektiösen Organismen auf verschiedene gegen eine Infektion gerichtete Mittel kann bestimmt werden durch leicht verfügbare Verfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, z. B. durch mikrobielle Empfindlichkeitstests. Pilzinfektionen, die gegenüber einem Defensin empfindlich sind, wie etwa Cryptococcus- und Aspergillus-Infektionen in Lebewesen, sind derzeit bevorzugte Gegenstände der Behandlung mit den Verfahren dieser Erfindung. Demgemäß werden in derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Menschen deren Immunsystembeeinträchtigt ist, gegen eine Cryptococcus- Infektion oder eine Aspergillus-Infektion mit einem hier bereitgestellten liposomalen Defensin behandelt.
Die Defensinwirkung ist im allgemeinen weder spezies- noch zelltypspezifisch. Das heißt Defensine von einem Lebewesen können in einem anderen Lebewesen wirksam sein und können eine Zytolyse der Zellen des anderen Lebewesens induzieren. Ein besonderes Defensin kann auch wirksam gegen eine Vielzahl von Mikroben und Zelltypen sein und ist im allgemeinen nicht auf die Wirkung gegen bestimmte Zellen begrenzt. Demgemäß sieht die Praxis dieser Erfindung die Verabreichung einer gegen eine Infektion wirksamen Menge eines Defensins, das ursprünglich aus einem Lebewesentyp erhalten wurde, an einen anderen Lebewesentyp für eine Vielzahl von mikrobiellen Infektionen oder Krebse vor. Zum Beispiel kann aus Rinderneutrophilen gewonnenes Indolicidin zur Behandlung von Menschen verwendet werden.
Verfahren zur Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen an Lebewesen umfassen intravenöse, intraarterielle, intraokulare, intraperitoneale, intramuskuläre, intranasale, intravaginale, subkutane, rektale und topische Verabreichung. Die Art der Verabreichung die für eine spezielle pharmazeutische Zusammensetzung ausgewählt wird, wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, oder im Rahmen seines Wissensgebiets ohne unverhältnismäßige Versuche bestimmbar sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: das zu behandelnde Individium und sein Alter, seine Größe und den Allgemeinzustand. Das zu verabreichende aktive Mittel; und die Krankheit, die Störung oder den zu behandelnden Zustand.
Derzeit umfaßt der bevorzugte Verabreichungsweg die intravenöse Verabreichung.
"Eine gegen eine Infektion gerichtete wirksame Menge" einer pharmazeutischen Zusammensetzung bedeutet jede Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die wirksam ist, um die Entwicklung, das Wachstum oder Ausbreitung einer Infektion, die gegenüber einem Defensin empfindlich ist, zu inhibieren oder zu verhindern. Typischerweise ist die gegen eine Infektion wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, die hier bereitgestellt wird, eine Menge, die zwischen 1 mg eines liposomalen Defensins pro kg des Körpergewichts des Lebewesens an welches die Zusammensetzung verabreicht wird, bis etwa 1000 mg pro kg Körpergewicht enthält; wünschenswerterweise enthält die gegen eine Infektion wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung etwa 10 mg eines liposomalen Defensins pro kg Körpergewicht bis etwa 200 mg pro kg. Innerhalb dieses Bereichs wird die Menge oder Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung, die einem speziellen Lebewesen verabreicht wird, von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind oder innerhalb des Wissensbereiches ohne unverhältnismäßige Versuche bestimmbar sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: den Typ der mikrobiellen Infektion und das Stadium seiner Ausbreitung; das Individuum und sein Alter, seine Größe und sein Allgemeinzustand; den bevorzugte Verabreichungsweg der pharmazeutischen Zusammensetzung. Die spezielle Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die bestimmte Erkrankung, Störung oder den angegebenen Zustand verabreicht wird, kann bestimmt werden durch Verfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, z. B. durch Dosisbereichsversuche.
Weiterhin wird hier ein Verfahren bereitgestellt zur Behandlung eines Lebewesens, z. B. eines Säugers und vorzugsweise eines Menschen, das mit einem Krebs befallen ist, der auf ein Defensin anspricht, z. B. eine Leukämie oder ein Lymphom. Dieses Verfahren umfaßt die Verabreichung einer gegen Krebs wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, die hier bereitgestellt wird, an das Lebewesen. Für die Zwecke dieser Erfindung ist eine "gegen Krebs wirksame Menge" einer pharmazeutischen Zusammensetzung jede Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, die wirksam ist, um die Entwicklung, das Wachstum oder die Metastase eines Tumors in einem Lebewesen zu inhibieren. Typischerweise ist die gegen Krebs wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung eine Menge, enthaltend zwischen 1 mg des liposomalen Defesins pro kg des Körpergewichts des Lebewesens, an welches die Zusammensetzung verabreicht wird, bis etwa 1000 mg pro kg Körpergewicht; wünschenswerterweise enthält die gegen Krebs wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung etwa 10 mg eines liposomalen Defensins pro kg Körpergewicht bis etwa 200 mg pro kg. Innerhalb dieses Bereichs wird die Menge oder Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung, die einem speziellen Lebewesen verabreicht wird, von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind oder innerhalb seines Wissensbereichs ohne unverhältnismäßige Versuche bestimmbar sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: den Typ der mikrobiellen Infektion und sein Fortschreitungsstadium; das Individuum und sein Alter, seine Größe und seinen Allgemeinzustand; und den bevorzugten Verabreichungsweg. Die besondere Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die spezielle Erkrankung, Störung oder den Zustand angezeigt sind, können durch Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, z. B. durch Dosisbereichsversuche.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Jedoch weiß der Fachmann in der Technik, daß diese Beispiele nur beschreibend für die Erfindung sind, die durch die Ansprüche definiert wird, welche hiernach folgen.

Beispiele

Beispiel 1

Lichtstreuung von Indolicidin

Indolicidin wurde mit verschiedenen Konzentrationen in 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,5), der 150 mM NaCl enthielt, gelöst. Proben wurden in Fluoreszenzküvetten angeordnet und die Lichtstreuung bei 500 nm (Anregungswellenlänge) wurde in einem Fluorimeter bei einem 90 Grad Winkel gemessen.
Die Ergebnisse (siehe Fig. 1) zeigen, daß Indolicidin sich selbst in Lösung bei Konzentrationen von etwa 30 ug/ml und größer assoziierte. Eine derartige Selbstassoziation ist vorteilhaft, da sie die Aussetzung von nicht polaren Regionen von Indolicidin gegen Wassermoleküle minimiert.

Beispiel 2

Fluoreszenz von wäßrigem Indolicidin

Indolicidin wurde in einem pH 7,5 HEPES-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl) gelöst; die resultierenden Lösungen wurden in Fluoreszenzküvetten angeordnet. Die Anregungswellenlänge wurde auf 285 nm eingestellt; die Emissionswellenlängen wurden von 325 nm bis 450 nm gescannt. Die Fläche der Emissionskurve wurde gegen die Indolicidinkonzentration geplottet (siehe Fig. 2). Die Spaltweiten wurden zwischen höheren und geringeren Konzentrationen verändert; Zwischenkonzentrationen wurden bei beiden Spaltweiten untersucht, um eine einwandfreie Normalisierung sicherzustellen.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Fluoreszenz von Indolicidin in wäßriger Lösung linear mit der Indolicidinkonzentration bis zu 0,5 ug/ml anstiegt, jedoch dann eine steilere Steigung zwischen Konzentrationen von 0,5 ug/ml und 50 ug/ml abwich. Über 50 ug/ml nahm die Steigung ab. Diese Abweichungen spiegeln Veränderungen der intramolekularen Selbstassoziation von Indolicidinmolekülen bei verschiedenen Indolicidinkonzentrationen wieder.

Beispiel 3

Herstellung von Indolicidin/POPC unilamellaren Liposomen

Eine Indolicidin/POPC-Lösung (1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholin; 0,085 : 1 (Gew./Gew.) Indolicidin/POPC) wurde auf einem Rotationsverdampfer getrocknet und dann mit Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) rehydratisiert, um eine Suspension multilamellarer Liposomen zu bilden. Die Liposomen wurden dann durch ein Filter mit 100 nm Poren extrudiert, um große unilamellare Vesikel (LUV; siehe Cullis et al., U. S. Patent Nr. 5,008,050 und Loughrey et al., U. S. Patent Nr. 5,059,421, deren Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden) zu bilden.

Beispiel 4

Herstellung von DSPC/Chol multilamellaren Liposomen

Indolicidin (66 mg in Ethanol), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC; 56 mg in Chloroform) und Cholesterol (Chol; 19 mg in Chloroform) wurden gemischt und 3 ml Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) wurden dann zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde nahezu bis zur Trockene in einem Rundkolben gebracht und die getrockneten Lipide wurden dann mit Methanol und 1 ml Wasser rehydratisiert, um eine Suspension multilamellarer Liposomen (MLV) zu bilden. Die MLV-Suspension wurde auf einem Vakuumrotationsverdampfer angeordnet und bei 45ºC bei vollem Vakuum zu einer Paste getrocknet. Die Probe wurde dann gekühlt und 10 ml HEPES-Puffer zugegeben. Die resultierende Lösung wurde in ein 30 ml Röhrchen übergeführt und augewirbelt. Diese Präparation wurde zentrifugiert und bei 12000 g für 10 Minuten rotiert. Die Liposomen pelletierten; der Überstand über dem Pellet wurde entfernt und mit einer frischen Pufferlösung angesetzt. Diese Waschung durch Zentrifugation wurde vier zusätzliche Male wiederholt, für insgesamt fünf Waschungen, wobei das fertige Pellet multilamellare Liposomen umfaßt mit im wesentlichen gleicher interlamellaler Solutverteilung, welche auf ein Gesamtvolumen von 1,7 ml resuspendiert werden.

Beispiel 5

Retention von Indolicidin in phosphatidylcholinenthaltenden Liposomen

Liposomen, enthaltend Indolicidin und entweder POPC, POPC/Chol, DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin) oder DPPC/Chol wurden hergestellt unter Verwendung von Indolicidin/Puffer- Lösungen mit 13 bis 28 Mikrogramm pro ml in Indolicidin und Lipidlösungen mit Konzentrationen von 1,5 bis 2,5 mM. Die Lipidlösungen wurden durch Rotationsverdampfen getrocknet; die Indolicidinlösungen wurden zu den getrockneten Lipiden gegeben, um eine Dispersion multilamellarer Vesikel (MLV) zu bilden. Diese MLV wurden sieben Gefrier-Tau-Zyklen (siehe Cullis et al., U. S. Patent Nr. 4,975,282, dessen Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden), unterzogen, um multilamellare Liposomen mit im wesentlichen gleicher interlamellarer Solutverteilung zu erzeugen. Nicht eingeschlossenes Indolicidin wurde von den Liposomenpräparationen entfernt; Anfangs- und Endindolicidinkonzentrationen wurden durch Lösen der Proben in Ethanol und Ablesen der Absorption bei 280 nm in einem UV- Spektrophotometer bestimmt.
Die Daten (siehe Fig. 3) zeigen, daß POPC-enthaltende Liposomen den höchsten Prozentanteil Indolicidin nach 48 Stunden (etwa 95% der ursprünglich eingebundenen Menge) zurückhielten, dass DPPC-enthaltende Liposomen weniger (etwa 75%) zurückhielten, POPC-Chol-Liposomen etwa 55% zurückhielten und die DPPC-Chol-Liposomen etwa 20 bis 30% zurückhielten.

Beispiel 6

Retention von Indolicidin in DOPE-enthaltenden Liposomen

Indolicidin (6 mg) wurde in 1 ml Ethanol gelöst. Dieses wurde vereinigt mit einer 20 mg/ml DOPE-Stammlösung, um vier Proben zu bilden: I: 2 mg DOPE/1 mg Indolicidin; II: 2 mg DOPE/3 mg Indolicidin; III: 2 mg DOPE/6 mg Indolicidin; und IV: 2 mg DOPE/0 mg Indolicidin. Die Proben wurden durch Vakuumverdampfen bei 30ºC getrocknet und dann mit 1 ml HEPES- Puffer rehydratisiert, um multilamellare Liposomen zu bilden. Aliquote (25 ul) wurden mit 25 ul HEPES-Puffer und 950 ul Ethanol in einer Quarzküvette vereinigt. Die Anfangsindolicidinkonzentration und die in den Vesikeln nach schrittweisen Waschungen verbleibende Konzentration wurde gemessen durch Lösen von liposomalen Proben in Ethanol und Ablesen der Absorption bei 280 nm. Lipidkonzentrationen wurden durch einen Standardphosphattest bestimmt (siehe Chen et al., Anal. Chem. 28: 1956 (1956)).
Die Daten (siehe Fig. 4) zeigen, daß der Molprozentanteil von Indolicidin in den DOPE-enthaltenden Liposomen durch Waschen erhöht wurde und etwa 50 Mol-% in der fertigen Präparation erreicht wurden.

Beispiel 7

Einfluß von Indolicidin auf das Austreten von DSPC/Chol- Liposomen

Eine Lösung von DSPC (60 mg) und Cholesterol (20 mg) wurde durch Rotationsverdampfen getrocknet; die getrockneten Lipide wurden dann mit 2 ml Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl), enthaltend 0,5 mM der Sonde CAT1 (4-Trimethylammonium-2,2,6,6- tetramethylpiperidin-1-oxyljodid) rehydratisiert, um eine Suspension multilamellarer Liposomen, die die Sonde enthalten, zu bilden. Eine Suspension dieser Vesikel wurde dann für 10 min bei 65ºC erhitzt. Die Probe wurde viermal mit HEPES- Puffer gewaschen und in einem Puffer auf ein Endvolumen von 2 ml resuspendiert. Eine Stammlösung von Indolicidin (20 mg/ml) wurde ebenfalls in HEPES-Puffer hergestellt. Verschiedene Mengen dieser Lösung (siehe nachstehende Tabelle 1) wurden mit einem Aliquot (100 ul) der Liposomenpräparation vereinigt, wobei Puffer dann zugegeben wurde, um das Endvolumen auf 0,2 ml zu bringen. Proben wurden mikrozentrifugiert und die Überstände in ESR-Röhrchen übergeführt. Spektren wurden bei Raumtemperatur (23ºC) aufgenommen, um die Konzentration der Sonde in den überstehenden Proben (siehe Perkins et al., Biochim. Biophys. Acta. 943: 103 (1988)) zu bestimmen.
Die Daten (siehe nachstehende Tabelle 1) zeigen die Prozent der Sonde, die in dem Überstand gefunden wurden, und damit den Prozentaustritt aus den DSPC/Chol-Liposomen. Die Ergebnisse zeigen, daß eine Erhöhung der Konzentration von Indolicidin in den DSPC/Chol-Liposomen den Sondenaustritt nicht deutlich erhöht. TABELLE 1 WIRKUNG VON INDOLICIDIN AUF DEN SONDENAUSTRITT AUS DSPC/CHOL-LIPSOMEN
N/A: Daten nicht verfügbar

Beispiel 8

Einfluß von Indolicidin auf den Austritt aus DSPC/Chol/DDAB- Liposomen

Eine Lösung von DSPC (51,6 mg), Cholesterol (20,2 mg) und Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB; 8,23 mg) wurde in einem Rundkolben getrocknet. Die Lipide wurden mit Puffer rehydratisiert (10 mM HEPES, 150 mM NaCl), enthaltend 0,5 mM der Sonde CAT1, um eine Suspension multilamellarer Liposomen zu bilden. Die Suspension wurde bei 65ºC für 10 min erhitzt und dann zweimal in 10 ml HEPES-Puffer gewaschen, wobei das fertige Pellet multilamellare DSPC/Chol/DDAB-Liposomen umfaßt, die CAT1 enthalten, die in HEPES-Puffer auf ein Endvolumen von 2 ml resuspendiert werden. Ein Standardphosphattest (siehe Chen et al., Anal. Chem. 28: 1956 (1956)) wurde durchgeführt, um die verbleibende Lipidmenge (34,12 mg) zu bestimmen. Eine 20 mg/ml Indolicidinstammlösung in HEPES-Puffer wurde ebenfalls hergestellt.
Verschiedene Mengen dieser Lösung (siehe nachstehende Tabelle 2) wurden mit einem Aliquot (100 ul) der Liposomensuspension vereinigt, wobei das Endvolumen der Proben auf 0,2 ml mit HEPES-Puffer gebracht wurde. Diese Proben wurden zentrifugiert und Aliquote der Überstände wurden für ESR-Spektrenbestimmung (23ºC) entnommen, um den Sondenaustritt zu bestimmen. Eine kleine Menge Verbreiterungsmittel wurde zu den beiden Proben mit den höchsten Indolicidinkonzentrationen gegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2 WIRKUNG VON INDOLICIDIN AUF DEN AUSTRITT EINER CAT1-SONDE AUS DSPC/CHOL/DDAB-LIPOSOMEN
* Korrigiert für Liposomen, die in dem Überstand hätten sein können.

Beispiel 9

Einschluß von Indolicidin in DSPC/Chol- oder POPC/Chol- enthaltenden Liposomen

Liposomen wurden gebildet durch Mischen von entweder DSPC und Cholesterol oder POPC und Cholesterol und Indolicidin, mit Indolicidin : Lipid (Gew./Gew.)-Verhältnissen von 0,1, 0,2, 0,4 und 0,6, Lösen des Gemisches in einem organischen Lösungsmittel, Verdampfen des Lösungsmittels und dann Hydratisieren der getrockneten Präparation mit 10 mM HEPES- Puffer, um multilamellare Liposomen zu bilden. Nicht eingeschlossens Indolicidin wurde durch Durchleiten der Liposomenpräparationen durch eine Säule entfernt. Die Indolicidinkonzentrationen wurden bestimmt durch Lösen liposomaler Präparationen in Ethanol und Ablesen der Absorption bei 280 nm. Die Lipidkonzentrationen wurden bestimmt durch einen Standardphosphattest (siehe Chen et al., Anal. Chem. 28: 1956 (1956)). Die Daten sind in nachstehender Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3 EINSCHLUSS VON INDOLICIDIN IN DSPC/CHOL-LIPOSOMEN

Beispiel 10

Fluoreszenz von freiem und liposomalem Indolicidin

Liposomen wurden hergestellt durch Hydratisieren von getrockneten Präparationen von POPO, POPC/Cholesterol (3 : 2), DPPC und DPPC/Chol (3 : 2) (40 mg Lipid jeweils) mit 8 ml HEPES- Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5), um multilamellare Vesikel zu bilden. Diese MLV wurden dann durch zwei gestapelte Polycarbonatfilter mit 0,1 um Poren bei 50ºC extrudiert. Aliquote jeder Probe wurden auf eine Lipidkonzentration von 0,1 mg/ml verdünnt und Fluoreszenzspektren wurden aufgenommen. Fluoreszenzprofile wurden ebenfalls aufgenommen nachdem Indolicidin zu den liposomalen Proben bis zu einer Endindolicidinkonzentration von 0,5 ug/ml gegeben wurde. Die Spektralwerte, die für die Liposomen ohne zugegebenes Indolicidin erhalten wurden, wurden von den Spektren abgezogen, die erhalten wurden, nachdem Indolicidin zugegeben wurde, um die Streuung zu korrigieren. Das Fluoreszenzprofil von freiem Indolicidin in dem Puffer wurde ebenfalls erhalten. Die Anregungswellenlänge wurde auf 285 nm eingestellt; Emissionsprofile wurden von 325 nm bis 450 nm gescannt.
Die Ergebnisse (siehe Fig. 6) zeigen, daß Indolicidin eine größere Affinität für POPC (ungesättigt) Doppelschichten (E) als für DPPC (gesättigte) Doppelschichten (C) zeigte (es besteht ein größerer Unterschied der relativen Fluoreszenz von freiem (A) und POPC-assoziiertem Indolicidin als zwischen der relativen Fluoreszenz von freiem und DPPC-assoziiertem Indolicidin). Die Zugabe von Cholesterol (Membranversteifung) zu sowohl POPC (D) als auch DPPC (B) verringerte die Affinität von Indolicidin für diese Systeme. Die Erhöhung der Fluoreszenz und die Blauverschiebung in den Emissionsprofilen zeigen, daß Indolicidin tiefer in POPC-Doppelschichten ist, als dies der Fall für die anderen untersuchten Systeme ist.

Beispiel 11

Ordnungsparameter

Ordnungsparameterstudien wurden durchgeführt, um den Einfluß von Indolicidin auf die Ordnung von Lipiddoppelschichten zu untersuchen. Indolicidin enthaltendes DPPC, DSPC, DSPC/Chol (3 : 2), DHPC (Dihexadecylphosphatidylcholin), POPC, POPC/Chol/DOTAP (Dioleoyltrimethylaminopropan) (5 : 4 : 1), POPC/DOTAP und DSCP/Chol/DDAB- (Dimethyldioctadecylammoniumbromid) Liposomen wurden hergestellt, welche verschiedene Mol-%-Anteile Indolicidin und 1 Mol-% des spinmarkierten 1-Palmitoyl-2(12 doxylstearoyl)- phosphatidylcholin enthielten. Eine Stammlösung von Indolicidin (20 mg/ml) wurde in HEPES-Puffer hergestellt. Das Indolicidin und die Liposomen wurden mit verschiedenen Molverhältnissen von Lipid zu Indolicidin vereinigt. DPPC (99 mg), DSPC (99 mg), DSPC/Chol (74 mg/24 mg), POPC, DOTAP (90 mg/10 mg), POPC (99 mg), POPC/DOTAP/Chol (62 mg/11 mg/25 mg) und DHPC (99 mg) wurden mit 1 mg der Spinmarkierung in organischem Lösungsmittel vereinigt, um Lösungen zu bilden. Die resultierenden Lösungen wurden in Rundkolben getrocknet und die getrockneten Lipide wurden mit 2,5 ml HEPES-Puffer rehydratisiert, um Liposomen (MLV) zu bilden. Die resultierenden Liposomproben wurden in Kryoröhrchen für fünf Gefriert-Tau-Zyklen übergeführt (siehe Cullis et al., U. S. Patent Nr. 4,975,282). Die Liposomen wurden mit Aliquoten der Indolicidin-Stammlösung vereinigt, um Liposomen mit verschiedenen Mol-%-Anteilen Indolicidin zu ergeben. Die resultierenden liposomalen Indolicidin-Formulierungen wurden dann über ihre Phasenübergangstemperaturen erhitzt. ESR- Spektren wurden bei 23ºC (Raumtemperatur) aufgenommen. Die Daten wurden verwendet, um die Ordnungsparameter der verschiedenen liposomalen Indolicidinsysteme zu bestimmen (siehe Fig. 7).

Beispiel 12

Einführung von positiv geladenen Lipiden in die inneren Monoschichten von liposomalen Doppelschichten

HEPES-Puffer (500 mM HEPES, pH 7,4) und ein 500 mM Citratpuffer wurden hergestellt; diese Puffer wurden verwendet, um 290 mOsM HEPES (pH 7,4) und 290 mOsM Citrat (pH 5,3) Puffer herzustellen.
Sechs Lipidsysteme wurden mit den folgenden Lipiden hergestellt: I: POPO - 90 Mol-%/Stearylamin (SA) - 10 Mol-% (pH 5,3): 96,23 mg POPC und 3,79 mg SA; II: POPC - 90 Mol-%/SA - 10 Mol-% (pH 7,3); III: DSPC - 50 Mol-%/Chol - 40 Mol-%/SA - 10 Mol-% (pH 5,3): 68,55 mg DSPC, 26,84 mg Chol, 4,68 mg SA; IV: DSPC - 50 Mol-%/Chol - 40 Mol-%/SA - 10 Mol-% (pH 7,3); V: DSPC - 60 Mol-%/Cholesterol - 40 Mol-% (pH 7,3); und VI: POPC (pH 7,3). Lösungen, die diese Lipide enthalten, werden getrocknet und die getrockneten Lipide werden wie angegeben resuspendiert in einen der 290 mOsM Puffer, um multilamellare Liposomen zu bilden. Diese Liposomen werden durch Filter extrudiert (siehe Cullis et al., U. S. Patent Nr. 5,008,050 und Loughrey et al., U. S. Patent Nr. 5,059,421, deren Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden) wie folgt: POPO: fünfmal bei Raumtemperatur, Filterporengröße = 200 nm; DSPC/Chol: dreimal durch 800 nm Filter (65ºC) und dann fünfmal durch 200 nm Filter (65ºC).
Gleiche Volumina (250 ul) von Präparationen der pH 5,3 Liposomen (Liposomen, gebildet durch Hydratisierung getrockneter Lipide in dem pH 5,3 Citratpuffer) und ein pH 11,92 HEPES-Puffer wurden vereinigt, so daß der End-pH etwa 7,3 war. Die Liposomen, umfassend innere wäßrige Kompartimente, die relativ zu der externen wäßrigen Umgebung sauer sind, haben einen pH-Gradienten über ihre Doppelschichten. Präparationen von Liposomen, die in dem pH 7,3 Puffer gebildet wurden, wurden mit einem gleichen Volumen (250 ul) des gleichen pH 7,3-Puffers gemischt und zeigten keine Transmembran-pH-Gradienten.
Geladene Lipide können im allgemeinen in einer der Monoschichten einer Lipiddoppelschicht in Reaktion auf einen pH-Gradienten, der über die Doppelschicht angelegt wird, akkumulieren. Das geladene Lipid kann daher ungleichmäßig zwischen den inneren und äußeren Monoschichten verteilt sein, d. h. es kann eine asymmetrische Verteilung in der Doppelschicht vorliegen (siehe Hope et al., U. S. Patent Nr. 5,204,112 und 5,252,263, deren Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden). Lipide, wie etwa Stearylamin (SA), können im allgemeinen in der inneren Monoschicht einer Lipiddoppelschicht in Reaktion auf einen pH-Gradienten, der über die Doppelschicht angelegt wird, akkumulieren, worin das innere wäßrige Kompartiment relativ zu der externen Umgebung sauer ist und einen pH von weniger als den pKa des Lipids in der Doppelschicht aufweist.
Die pH 5,3- und die pH 7,3-Liposomenproben wurden aufgewirbelt und dann bei Raumtemperatur inkubiert (POPC-enthaltende Liposomen: 10 Minuten; DSPC/Chol-enthaltende Liposomen: 1 Stunde). Ein kleines Aliquot jeder Probe wurde entfernt und bei Seite gestellt zur Verwendung in einem Standardphosphattest (siehe Chen et al., Anal. Chem. 28: 1956 (1956)), um die Lipidkonzentration zu messen. Anschließend wurden 200 ul einer 1% Polyaspartamsäurelösung in jedes Röhrchen gegeben, welche man dann für 10 Minuten stehen ließ, bevor die Absorption bei 550 nm aufgezeichnet wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 (siehe nachstehend) angegeben. Eine Abnahme der Absorption relativ zu Kontrollwerten zeigt, daß das geladene Lipid (Stearylamin) in der inneren Monoschicht der Lipidschicht akkumuliert. Die Ergebnisse zeigen, daß für POPC-Liposomen Stearylamin in der inneren Monoschicht in Reaktion auf einen pH-Gradienten für die Doppelschicht, in welcher das Innere des Liposoms relativ zu dem Äußeren sauer ist, akkumuliert. Eine Stearylamintranslokation über DSPC/Chol-Doppelschichten von der äußeren Monoschicht zu der inneren Monoschicht erfordert mehr Zeit, aufgrund der Steifheit der DSPC/Chol- Doppelschichten. TABELLE 4 ABSORPTION VON LIPOSOMALEN STEARYLAMINFORMULIERUNGEN IN REAKTION AUF TRANSMEMBRAN-pH-GRADIENTEN

Beispiel 13

Einschluß von Indolicidin in positiv geladenen Liposomen

DSPC/Chol/DDAP-Liposomen (50 Mol-% DSPC, 40 Mol-% Cholesterol, 10 Mol-% DDAB) werden durch Lösen von 3,59 mg DSPC, 1,54 mg Cholesterol und 0,631 mg DDAB in einem organischen Lösungsmittel in einem 100 ml Rundkolben hergestellt. HEPES- Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl) wird in den Kolben zugegeben und die Probe wird rotationsverdampft, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Zusätzliche 5 ml HEPES-Puffer werden in den Kolben gegeben, welcher dann auf 65ºC erhitzt wird. Weitere 4 ml HEPES-Puffer werden zugegeben und die Probe wird bei 20.000 UPM für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und aufbewahrt; Das Pellet wird erneut vier zusätzliche Male gewaschen. Das fertige Pellet wird in HEPES-Puffer bis zu einem Endvolumen von 1 ml resuspendiert. Lipidkonzentrationen werden durch einen Standardphosphattest bestimmt. Indolicidinkonzentrationen werden durch Absorptionsspektroskopie bei 280 nm bestimmt.

Beispiel 14

Hämolytische Aktivität von Indolicidin/Phosohatidylcholinenthaltenden Liposomen.

Indolicidin-enthaltende POPC- und DPPC-Liposomen wurden gemäß den oben beschriebenen Verfahren hergestellt, jedoch ohne die Gefriertrocknungszyklen, oder im Falle der Interdigitationsfusion (IF)-Vesikel mit dem Verfahren, das offenbart ist in (Janoff et al., U. S. Seriennr. 07/961,277 und 08/066,539, eingereicht am 14. Oktober 1992 bzw. 24. Mai 1993, deren Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden). Rote Blutzellproben (RBC) wurden mit diesem Liposom vereinigt und das Ausmaß der induzierten Hämolyse wurde gemessen.
Der verwendete Hämolysetest mißt den Gehalt von Hämoglobin in dem Überstand der RPC-Proben, die Menge von in den Überstand freigesetztem Hämoglobin, welche kennzeichnend für die Zerstörung der roten Blutzellmembranen, induziert durch liposomale Defensine, ist. Der Hämolysetest verwendete phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), menschliche rote Blutzellen, Polystyrolröhrchen und Einwegküvetten, die für die Verwendung in UV-Spektrometern ausgestaltet sind. Ungefähr 3 ml von gepackten RBC wurden in einem 15 ml Röhrchen angeordnet, in welches 10 ml PBS zugegeben wurden. Die RBC wurden suspendiert und die Suspension wurde für 10 min bei 4000 UPM zentrifugiert. Der Überstand über dem Pellet wurde verworfen und mehr PBS wurde zugegeben. Dieses Waschen wurde wiederholt bis der Überstand nahezu klar war. Zwei ml des fertigen RBC-Pellets wurden in 48 ml PBS suspendiert. Die resultierende RBC-Suspension wurde auf einen Satz von Teströhrchen (0,5 ml RBC Suspension pro Röhrchen) aufgeteilt, in welche zusätzlich Puffer und POPC/Indolicidin oder DPPC/Indolicidin-Liposomen gegeben wurden. Die Röhrchen wurden mit einem Deckel versehen, aufgewirbelt und dann für 20 Stunden auf einem Schüttler in einem 37ºC Inkubator inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Röhrchen bei geringer Geschwindigkeit (< 3000 UPM) für 10 Minuten zentrifugiert. Ein Aliquot (0,2 ml) des Überstands von jedem Röhrchen wurde in einer Küvette angeordnet, in welche 1,0 ml Wasser gegeben wurden. Hämoglobingehalte in den Überständen wurden bestimmt durch Messen der Absorption bei 550 nm und sind als Prozent Hämolyse relativ zu den Kontrollen angegeben. Die Nullprozenthämolysekontrolle umfaßte RPC und HEPES-Puffer (die gleiche Pufferzusammensetzung in welcher die indolicidinenthaltenden Liposomen suspendiert waren); die 100 % Hämolysekontrolle umfaßte RBC und destilliertes Wasser.
Fig. 8 zeigt die Prozent Hämolyse, induziert durch freies Indolicidin (nicht ausgefüllte Quadrate) als auch durch POPC/Indolicidin-Liposomen (nicht ausgefüllte Dreiecke), DPPC/Indolicidin-Liposomen (nicht ausgefüllte Kreise) und DPPC/Indolicidin-interdigitation-Fusion (IF)-Liposomen (ausgefüllte Kreise). Die Daten zeigen, daß der Einschluß in Liposomen die hämolytische Aktivität des Indolicidins verringert, d. h. es besteht eine Verringerung der prozentualen Hämolyse im Vergleich zu der freien Form des Defensins.

Beispiel 15

Hämolytische Aktivität von POPC/Indolicidin-Liposomen mit variierenden Indolicidin-Gehalten

POPC/Indolicidin-Liposomen, enthaltend verschiedene Indolicidinkonzentrationen (Mol-%-Anteile), wurden hergestellt durch Trocknen einer POPC/organisches Lösungsmittel-Lösung und Rehydratisierung der Lösung mit einem indolicidinenthaltenden Puffer, um multilamellare Liposomen zu bilden. Liposomenproben wurden dann in die Kryoröhrchen übergeführt und wurden fünfmal gefroren und aufgetaut (siehe Cullis et al., U. S. Patent Nr. 4,975,282, dessen Inhalte hier durch Bezugnahme eingeführt werden), um multilamellare Vesikel mit im wesentlichen gleicher interlamellarer Solutverteilung zu erzeugen.
Anfangs- und Endlipidkonzentrationen wurden mittels eines Standardphosphattests (siehe Chen et al., Anal. Chem. 28: 1956 (1956)) bestimmt. Anfangs- und Endindolicidinkonzentrationen wurden bestimmt durch Messen der Absorption bei 280 nm. Fig. 9 zeigt den Prozentanteil RBC- Hämolyse, welcher induziert wird durch freies Indolicidin (ausgefüllte Quadrate), als auch die verschiedenen Indolicidin/POPC-Liposomenformulierungen, die getestet wurden (3,8 Mol-% Indolicidin: ausgefüllte Dreiecke; 2,5 Mol-%: Sternchen; 1,8 Mol-%: ausgefüllte Kreise; 1,0 Mol-%: ausgefüllte Quadrate; und 0,4 Mol-%: ausgefüllte Dreiecke.

Beispiel 16

Hämolytische Aktivität von Indolicidin/DPPC-Liposomen (8,27 Mol-% Indolicidin)

Ethanol (361 ul) wurde zu 500 ul DPPC kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV) bei einer Lipidkonzentration von 60 mg/ml gegeben, um ein Gel zu bilden. Zusätzliche 1,2 ml der DPPC-SUV-Präparation wurden zusammen mit Indolicidin dann unter Aufwirbeln zugegeben. Das Gemisch wurde erhitzt und gekühlt und dann fünfmal gewaschen. Lipidkonzentrationen in den Ausgangs- und Endproben wurden nach einem Standardphosphattest (siehe oben) bestimmt. Indolicidinkonzentrationen in den Ausgangs- und Endproben wurden durch Absorption bei 280 nm bestimmt.
Hämolysetest wurden wie oben beschrieben durchgeführt (siehe Beispiel 14). Die Ergebnisse (siehe nachstehende Tabelle 5) zeigen, daß die Erhöhung des Indolicidingehalts (8,27 Mol-% in DPPC-enthaltenden Liposomen) (mg/ml) in den RBC-Proben zu einem erhöhten Hämolysegrad führten. TABELLE 5

Beispiel 17

Hämolytische Aktivität von DSPC/Chol/Indolicidin-Liposomen

DSPC/Chol-Indolicidin-Liposomen (Endindolicidinkonzentration = 4,8 Mol-% Indolicidin) wurden durch Lösen von 11,85 mg DSPC, 3,87 mg Cholesterol und 20 mg Indolicidin in einem organischem Lösungsmittel in einem Rundkolben und dann Trocknen der Lösung durch Rotationsverdampfen hergestellt. Die Lipide wurden mit 4 ml HEPES-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) rehydratisiert und die resultierende Liposomensuspension wurde in ein Zentrifugationsröhrchen übergeführt. Der Kolben wurde mit Puffer gewaschen und der Puffer wurde dann in das Zentrifugationsrohr gegeben. Diese Liposomen wurden mit HEPES- Puffer fünfmal gewaschen und das fertige Pellet wurde in 3 ml HEPES-Puffer resuspendiert. Eine freie (nicht eingeschlossen) Indolicidinkontrolle wurde durch Lösen von 2 mg Indolicidin in 1 ml HEPES hergestellt.
Anfangs- und Endindolicidin-Konzentrationen wurden durch Absorption bei 280 nm gemessen. Anfangs- und Endlipidkonzentrationen wurden durch einen Standardphosphattest (siehe Chen et al., Anal. Chem. 28: 1956 (1956)) bestimmt. Die Liposomen wurden in Hämolysetest verwendet, die gemäß vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt wurden (siehe Beispiel 14). Die Daten (siehe Fig. 10 und Tabelle 6) sind angegeben als der Prozentanteil Hämolyse, induziert durch freies Indolicidin (ausgefüllte Quadrate) als auch der Prozentanteile Hämolyse (ausgefüllte Kreise), induziert durch die DSPC/Chol/Indolicidin- Liposomenformulierung, bei verschiedenen Indolicidinkonzentrationen in RBC-Proben. TABELLE 6 DSPC/Cholesterol/Indolicidin-Hämolysetest
* 4,77 Mol-% Indolicidin

Beispiel 18

Hämolytische Aktivität von DSPC/Chol-Liposomen (kein Indolicidin)

DSPC/Chol- und DSPC/Chol/DDAB-Liposomen wurden durch Lösen der Lipide in Chloroform dann Zugeben von Methanol hergestellt, unter Verwendung von zwei Volumina Methanol pro Volumen Chloroform, um eine Monophase zu bilden (siehe Fountain et al., U. S. Patent Nr. 4,588,578). Zwei 0,5 ml Portionen des HEPES-Puffers (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) wurden getrennt unter Aufwirbeln nach jeder Zugabe zugegeben. Die Proben wurden rotationsverdampft bei Raumtemperatur und dann bei 60ºC, um das Lösungsmittel zu entfernen. Die getrockneten Proben wurden rehydratisiert mit HEPES-Puffer auf ein Endvolumen von 4 ml, um multilamellare Liposomen mit im wesentlichen gleicher interlamellarer Solutverteilung zu bilden. Diese Liposomen wurden mit RBC-Suspensionen vereinigt und Hämolysetests wurden gemäß den oben beschriebenen Verfahren (siehe Beispiel 10) durchgeführt, um die hämolytischen Eigenschaften der Lipide zu messen. Die Daten (siehe Fig. 11 und Tabelle 7, nachstehend) zeigen die Prozent Hämolyse, induziert bei verschiedenen Lipidkonzentrationen mit keinem Indolicidin in den Präparationen. TABELLE 7 HÄMOLYTISCHE LIPIDAKTIVITÄT

Beispiel 19

Hämolytische Aktivität von Indolicidin/DOPE-Liposomen

DOPE/Indolicidin-Liposomen wurden hergestellt durch Trocknen einer Indolicidin/DOPE/organisches Lösungsmittel-Lösung in einem Rundkolben durch Rotationsverdampfen. Die getrockneten Lipide wurden in 2 ml HEPES-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl) resuspendiert. Eine Kontrolle mit freiem (nicht eingeschlossenem) Indolicidin wurde durch Lösen von 2 mg Indolicidin in 1 ml HEPES-Puffer hergestellt. Lipidkonzentrationen wurden bestimmt durch Phosphattest (siehe Chen et al., Anal. Chem. 28: 1956 (1956)); Indolicidinkonzentrationen wurden bestimmt durch Messen der Absorption bei 280 nm. Die Daten (siehe Fig. 12 und nachstehende Tabelle 8) zeigen, daß die Hämolyse im allgemeinen anstieg mit ansteigender Indolicidin- Konzentration, sowohl für die liposomalen als auch freien Formen von Indolicidin, und daß bei ungefähr den gleichen Konzentrationen in den RBC-Proben, Indolicidin, das in DOPE- Liposomen eingeschlossen ist, etwa den gleichen Prozentanteil Hämolyse induzierte wie nicht eingeschlossenes Indolicidin. HÄMOLYTISCHE AKTIVITÄT VON DOPE/INDOLICIDIN-LIPOSOMEN
* 39,55 Mol-% Indolicidin

Beispiel 20

In vitro Toxizität von liposomalem Indolicidin

Liposomen wurden hergestellt durch Lösen von 1 mg Indolicidin in Methanol und Mischen der resultierenden Lösung mit einer POPC (11,7 mg)-Chloroform-Lösung (Indolicidin : Lipid-Verhältnis (Gew./Gew.) von 0,85 : 1). Die organischen Lösungsmittel wurden unter Vakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers entfernt. Das getrocknete Lipid/Indolicidingemisch wurde mit HEPES-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) hydratisiert. Die resultierende Präparation wurde zehnmal durch doppelt gestapelte 0,1 um Nukleopore-Filter unter Verwendung einer Extrudervorrichtung (Lipex, Vancouver, CA) extrudiert.
Die spezifische Inhibierung der in vitro Proliferation von CHO/K1-Zellen durch freies Indolicidin, leere Liposomen (kein Indolicidin) oder liposomales Indolicidin wurde gemessen unter Verwendung eines Thymidininkorporationstests. CHO/K1-Zellen (20.000 Zellen pro Vertiefung) wurden auf Flachbodenmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in RPMI-1640 Medium, supplementiert mit 10% FBS, plattiert und bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5% CO&sub2;-Gehalten. Die Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen von entweder leeren Liposomen, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), freiem Indolicidin oder liposomalem Indolicidin ausgesetzt und für 4 Stunden bei 37ºC kultiviert. Mit verschiedenen Indolicidinformulierungen behandelte Zellen wurden für weitere 8 Stunden gepulst mit 0,5 uCi/Vertiefung [³H]Thymidin (spezifische Aktivität 50 Ci/Mmol) (ICN Biomedicals, USA). Die Zellen wurden auf einem 934AH-Filterpapier mit einem Brandel M-96 Harvester (Brandel, MD, USA) geerntet. Die Thymididin- [³H]-Inkorporation wurde durch Flüssigscintillationszählung bestimmt.
Die Ergebnisse (siehe Fig. 13) zeigen, daß bei allen verwendeten Indolicidinkonzentrationen liposomales Indolicidin einen größeren Grad von Zellwachstum erlaubte, d. h. weniger toxisch war als freies Indolicidin.

Beispiel 21

In vivo Toxizität

Vier Gruppen aus jeweils fünf männlichen Balb/c-Mäusen (20-22 g) wurden mit verschiedenen Dosen (0,75-12 mg/kg) freiem Indolicidin und verschiedenen Dosen (20-120 mg/kg) liposomalen Indolicidin in 0,2 ml pyrogenfreiem Kochsalz über die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden ebenfalls injiziert mit Kochsalzlösung und mit leeren Liposomen. Diese Mäuse wurden bezüglich akuter Toxizität beobachtet und die LD&sub5;&sub0;- Dosis von Indolicidin, diejenige Dosis, die lethal für 50% der Testpopulation ist, wurde bestimmt.
Die Ergebnisse (siehe nachstehende Tabelle 9) zeigen, daß die LD&sub5;&sub0; von freiem Indolicidin 3 mg/kg war, während diejenige für liposomales Indolicidin 80 mg/kg ist. TABELLE 9 TOXIZITÄT VON FREIEM GEGENÜBER LIPOSOMALEM INDOLICIDIN IN MÄUSEN

Beispiel 22

Behandlung von Aspergillus Fumigatus Infektionen in Mäusen

Männliche Balb/c-Mäuse wurden jeweils injiziert mit 2 · 10&sup7; Aspergillus fumigatus Sporen durch Injektion in die Schwanzvene. Nach 6 Stunden wurden die Mäuse statistisch in fünf Gruppen von jeweils 10 Mäusen aufgeteilt. Eine Gruppe wurde mit 2 mg/kg freiem Indolicidin behandelt, die zweite wurde mit 2 mg/kg liposomalem Indolicidin behandelt; der dritten Gruppen wurden 40 mg/kg liposomales Indolicidin verabreicht; die vierte Gruppe wurde mit leeren Liposomen behandelt; und die fünfte Gruppe wurde mit 0,2 ml 10 mM HEPES- Puffer behandelt. Die Überlebensrate der Tiere wurde über eine Dauer von 15 Tagen dargestellt.
Es zeigt sich (siehe Fig. 14), daß Mäuse, die mit A. fumigatus Sporen infiziert sind und entweder Puffer oder leere Liposomen verabreicht bekommen, etwa die gleichen Überlebensraten hatten. Die Verabreichung von freiem Indolicidin (2 mg/kg) führte zu einer leichten Erhöhung der Überlebenszeiten. Liposomales Indolicidin mit der gleichen Indolicidinkonzentration führte zu einer sogar größeren Erhöhung der Überlebenszeiten. 30% der Mäuse, die 40 mg/ml Indolicidin erhielten, waren am Ende der Behandlungsdauer am Leben.

Claims

1. Liposom, umfassend eine Lipiddoppelschicht, ein wäßriges Kompartiment und ein neutralisiertes Defensin, worin das neutralisierte Defensin ein Defensin ist, das mit einem Liposom assoziiert ist und welches dahingehend inhibiert ist den Doppelschichtaufbau des Liposoms durch eines oder mehrere Vesikelkomponenten zu nicht zu zerstören.

2. Liposom nach Anspruch 1, worin das Liposom multilamellar ist.

3. Multilamellares Liposom nach Anspruch 2 mit einem Solut, das in seinen wäßrigen Kompartimenten eingeschlossen ist, worin die Konzentration des Soluts in jedem der wäßrigen Kompartimente im wesentlichen gleich ist.

4. Liposom nach Anspruch 1, worin das Defensin in einer Lipiddoppelschicht des Liposoms enthalten ist.

5. Liposom nach Anspruch 1, worin das Defensin in einem wäßrigen Kompartiment des Liposoms enthalten ist.

6. Liposom nach Anspruch 1, worin das Defensin ein prototypisches Säugerdefensin, beta-Defensin, Indolicidin, Magainin oder ein Insektendefensin ist.

7. Liposom nach Anspruch 6, worin das Defensin Indolicidin ist.

8. Liposom nach Anspruch 1, worin das Liposom ein freisetzungsinhibierendes Lipid umfaßt.

9. Liposom nach Anspruch 8, worin das freisetzungsinhibierende Lipid 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin (POPC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) oder Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Cholesterol umfaßt.

10. Liposom nach Anspruch 1, worin das Defensin Indolicidin ist und worin das Liposom ein freisetzungsinhibierendes Lipid umfaßt, das POPC umfaßt.

11. Liposom nach Anspruch 10, umfassend mindestens etwa 0,5 Molprozent Indolicidin.

12. Liposom nach Anspruch 11, umfassend etwa 5 Molprozent Indolicidin.

13. Liposom nach Anspruch 1, worin das Defensin Indolicidin ist und worin das Liposom ein freisetzungsinhibierendes Lipid umfaßt, das DSPC und Cholesterol umfaßt.

14. Liposom nach Anspruch 13, umfassend mindestens etwa 0,5 Molprozent Indolicidin.

15. Liposom nach Anspruch 14, umfassend etwa 20 Molprozent Indolicidin.

16. Liposom nach Anspruch 1, worin das Defensin Indolicidin ist und worin das Liposom ein freisetzungsinhibierendes Lipid umfaßt, das DOPC umfaßt.

17. Liposom nach Anspruch 16, umfassend mindestens etwa 0,5 Molprozent Indolicidin.

18. Liposom nach Anspruch 1, worin das Liposom einen freisetzungsinhibierenden wäßrigen Puffer umfaßt.

19. Liposom nach Anspruch 1, worin das Liposom ein kopfgruppenmodifiziertes Lipid umfaßt.

20. Liposom nach Anspruch 1, worin die Lipiddoppelschicht ein ionisierbares Lipid umfaßt.

21. Liposom nach Anspruch 20, worin mehr als etwa fünfzig Prozent des in der äußersten Lipiddoppelschicht des Liposoms vorliegenden ionisierbaren Lipids in der inneren Monoschicht der äußersten Lipiddoppelschicht vorliegen.

22. Liposom nach Anspruch 20, worin die Konzentration des ionisierbaren Lipids in der äußersten Lipiddoppelschicht mindestens etwa 5 Molprozent ist.

23. Liposom nach Anspruch 20, worin das ionisierbare Lipid 1,2-Dipalmitoyl-3-(N,N-Dimethylamino)propan ist.

24. Liposom nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein zusätzliches bioaktives Mittel.

25. Dehydratisiertes Liposom, umfassend ein Defensin, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist, das mit einem Liposom assoziiert ist und welches dahingehend inhibiert ist den Doppelschichtaufbau des Liposoms durch eines oder mehrere Vesikelkomponenten nicht zu zerstören.

26. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und ein Liposom, umfassend eine Lipiddoppelschicht, ein wäßriges Kompartiment und Defensin, worin das Defensin ein neutralisiertes Defensin ist, das mit einem Liposom assoziiert ist und welches dahingehend inhibiert ist den Doppelschichtaufbau des Liposoms durch eines oder mehrere Vesikelkomponenten nicht zu zerstören.

27. Verfahren zum Herstellen der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 26 zum Behandeln oder Verhindern einer Infektion in einem Lebewesen durch formulieren des Liposoms in einer gegen die Infektion wirksamen Menge mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Infektion durch einen Pilz bewirkt wird, der gegenüber einem Defensin empfindlich ist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, worin der gegenüber einem Defensin empfindliche Pilz ein Cryptococcus oder ein Aspergillus ist.

30. Verfahren nach Anspruch 27, worin das Immunsystem des Lebewesens beeinträchtigt ist.

31. Verfahren nach Anspruch 27, worin das Lebewesen ein Mensch ist.

32. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Infektion eine Pilzinfektion umfaßt, die durch einen Cryptococcus bewirkt wird und das Lebewesen ein Mensch mit beeinträchtigtem Immunsystem ist.

33. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Infektion ein Pilzinfektion umfaßt, die durch einen Aspergillus bewirkt wird und das Lebewesen ein Mensch mit beeinträchtigtem Immunsystem ist.

34. Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 26 zur Behandlung eines Lebewesens, das von einem auf ein Defensin ansprechenden Krebs befallen ist, durch Formulieren des Liposoms in einer gegen Krebs wirksamen Menge mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

35. Verfahren nach Anspruch 34, worin der auf ein Defensin ansprechende Krebs eine Leukämie oder ein Lymphom ist.

36. Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 26 zur Behandlung eines Lebewesens, das von einer Störung befallen ist, die durch einen Mangel proteinvermittelter cytotoxischer Aktivität in cytoplasmatischen Granulen gekennzeichnet ist, durch formulieren des Liposoms in einer cytotoxisch wirksamen Menge mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

37. Verfahren nach Anspruch 36, worin die Störung das Specific Granule Deficiency Syndrome ist.

38. Verfahren nach Anspruch 36, worin das Lebewesen ebenfalls von einer mikrobiellen Infektion befallen ist.