DE3855265T2

DE3855265T2 - Liposomen-Formulierungen mit hohem antineoplastischem Wirkstoff/Lipid-Verhältnis

Info

Publication number: DE3855265T2
Application number: DE3855265T
Authority: DE
Inventors: Marcel B Bally; Pieter R Culis; Richard S Ginsberg; Lawrence D Mayer; George N Mitilenes
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1987-03-05
Filing date: 1988-03-04
Publication date: 1996-12-12
Anticipated expiration: 2008-03-05
Also published as: IE75713B1; CA1338702C; DK98189D0; EP0290296A3; DE10199004I1; IE960340L; IL85608A; ES2088385T3; DK98189A; JPH02502458A; JP2882607B2; IE880599L; LU90717I2; DE3856550T2; AU645332B2; IL85608A0; EP0290296B1; DE3855265D1; KR890700340A; BR1100687A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Formulierungen und Verfahren zur Herstellung von Antikrebsmittel-enthaltenden Liposomen mit einem hohen Wirkstoff:Lipid-Gewichtsverhältnis. Solche Formulierungen besitzen im allgemeinen eine größere Wirkung oder im wesentlichen äquivalent in ihrer Wirkung, verglichen mit dem gleichen Wirkstoff in seiner freien Form. Sie besitzen jedoch im allgemeinen eine niedrigere Toxizität. Zusätzlich werden Verfahren zur Bildung solcher Liposome mit einheitlichen Freisetzungseigenschaften offenbart, ebenso wie ein Testverfahren zur Bestimmung von freien und eingeschlossenen Antikrebsmitteln wie Doxorubicin in einem Liposomenpräparat. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Arzneimittel:Lipid-Hochverhältnis-Liposome mit toxischen ionisierbaren Antikrebsmitteln wie Doxorubicin, Vinblastin, Vincristin, 5-Fluoruracil (5-FU), Daunorubicin, Epirubicin, Nitoxanthron und Cyclophosphamid.
Doxorubicin ist ein weit verwendetes Antikrebsmittel, das zur Anthracyclinklasse der Antibiotika gehört, die durch den Pilz Streptomyces peucetius produziert werden. Doxorubicin wird gegen eine Vielzahl von Tumpren, Leukämien, Sarkomen, und Brustkrebs verwendet. Die Toxizitäten schließen bei den gewöhnlich verabreichten Dosen von Doxorubicin (ebenso wie bei anderen antineoplastische Substanzen) die Knochenmarksdepression, Haarausfall, Schleimhautentzündungen und gastromtestinale Toxizitäten, einschließlich Übelkeit, Erbrechen und Appetitlosigkeit, ein. Die schwerwiegendste Doxorubicin-Toxizität ist die kumulative dosisabhängige irreversible Cardiomyopathie, die zur dekompensierten Herzinsuffizienz bei 1 bis 10 % der Patienten führt, die Dosierungen erhalten, die größer als 550 mg pro Quadratmeter Körperfläche sind. Diese Toxizitäten schränken die klinische Nützlichkeit antineoplastischer Mittel wie Doxorubicin erheblich ein.
Liposome sind vollständig geschlossene Lipid-Doppelschichtmembranen, die ein eingeschlossenes wäßriges Volumen enthalten. Liposome können unilamellare Vesikel sein (die eine einfache Menbrandoppelschicht besitzen) oder multilamellare Vesikel (zwiebelartige Strukturen, die durch mehrere Membrandoppelschichten gekennzeichnet sind, die jeweils von der nächsten durch eine wäßrige Schicht getrennt sind). Die Doppelschicht setzt sich aus zwei Lipid-Nonoschichten zusammen, die eine hydrophobe "Schwanz"-Region und eine hydrophile "Kopf"-Region aufweisen. Die Struktur der Membrandoppelschicht ist so, daß die hydrophoben (unpolaren) "schwänze" der Lipid- Monoschichten sich zum Zentrum der Doppelschichten hin orientieren, während sich die hydrophilen "Köpfe" zur wäßrigen Phase hin orientieren.
Die ursprüngliche Liposomen-Herstellung von Bangham et al. (J. Mol. Biol., 1965, 13:238-252) beinhaltet das Suspendieren von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel, das dann zur Trockene eingedampft wird, wobei ein Phospholipidfilm auf dem Reaktionsgefäß zurückbleibt. Als nächstes wird eine geeignete Menge der wäßrigen Phase hinzugegeben, die Mischung wird "quellen" gelassen, und die resultierenden Liposome, die aus multilamellaren Vesikeln (MLVs) bestehen, werden mit mechanischen Hilfsmitteln dispergiert. Diese Herstellung stellt die Basis für die Entwicklung kleiner beschallter unilamellarer Vesikel, die durch Papahadjopoulos et al., (Biochim. Biophys, Acta., 1967, 135:624-638) beschrieben wurde, und für große unilamellare Vesikel bereit.
Techniken für die Herstellung großer unilamellarer Vesikel (LUVs) wie das Umkehrphasenverdampfen, Infusionsverfahren und die Detergens-Verdünnung können zur Herstellung von Liposomen verwendet werden. Eine Rezension dieser und anderer Verfahren für die Herstellung von Liposomen kann in dem Text Liposomes, Marc Ostro, Hrsg., Narcel Dekker, Inc., New York, 1983, Kapitel 1 gefunden werden, dessen entsprechende Teile hier auch als Referenz enthalten sind. Eine besonders bevorzugte Methode zur Bildung von LDVs ist beschrieben in Cullis et al., PCT-Publikation Nr. 86/00238, 16. Januar 1986, mit dem Titel "Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesides", die hier als Referenz enthalten ist. Vesikel, die durch diese Technik hergestellt werden, und die man LUVETs nennt, werden unter Druck durch einen Membranfilter extrudiert. Vesikel können auch durch einen 200 rim-Filter extrudiert werden; solche Vesikel sind als VET&sub2;&sub0;&sub0;s bekannt. LUVETs können mindestens einem Gefrier- und Tauzyklus vor der Extrusionstechnik ausgesetzt werden; dieses Verfahren ist beschrieben in Mayer, et al., (Biochim. Biophys. Acta., 1985, 817:193-196) mit dem Titel "Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesides"; solche Vesikel sind als FATMLVs bekannt.
Weitere Techniken, die zur Herstellung von Vesikeln verwendet werden, schließen diejenigen ein, die Umkehrphasen- Verdampfungs-Vesikel (REV) bilden, Papahadjopoulos et al., U.S. Patent Nr. 4.235.871. Eine andere Klasse von Liposomen, die verwendet werden kann, sind diejenigen, die gekennzeichnet sind durch eine im wesentlichen gleiche lamellare Verteilung des Gelösten. Diese Klasse von Liposomen wird als stabile plurilamellare Vesikel (SPLV) benannt, wie in dem U.S. Patent Nr. 4.522.803 von Lenk, et al. definiert, und schließt monophasische Vesikel, wie im U. S. Patent Nr. 4.588.578 von Fountain, et al. beschrieben, und die oben beschriebenen gefrorenen und aufgetauten multilamellaren Vesikel (FATMLV) ein.
Eine Vielfalt von Sterolen und deren wasserlösliche Derivate wie Cholesterinhemisuccinat wurde verwendet, um Liposome zu bilden; siehe speziell Janoff et al., U.S. Patent Nr. 4.721.612, erteilt am 26. Januar 1988, mit dem Titel "Steroidal Liposomes". Mayhew et al., PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 85/00968, veröffentlicht am 14. März 1985, beschrieb ein Verfahren zur Verringerung der Toxizität von Arzneimitteln durch Einschließen derselben in Liposomen, die α-Tocopherol und bestimmte Derivate davon umfaßten. Auch eine Vielzahl von Tocopherolen und deren wasserlösliche Derivate wurde verwendet, um Liposome zu bilden, siehe Janoff et al., PCT-Veröffentlichungs-Nr. 87/02219, veröffentlicht am 23. April 1987, mit dem Titel "Alpha Tocopherol-Based Vesicles".
In einem Liposomen-Arzneimittel-Abgabesystem wird ein biologisch aktives Mittel wie ein Arzneimittel in dem Liposom eingeschlossen und dann dem zu behandelnden Patienten verabreicht. Z.B. siehe Rahman et al., U.S. Patent Nr. 3.993.754; Sears, U.S. Patent Nr. 4.145.410; Papahadjopoulos et al., U.S. Patent Nr. 4.235.871; Schneider, U.S. Patent Nr. 4.224.179; Lenk et al., U.S. Patent Nr. 4.522.803; und Fountain et al., U.S. Patent Nr. 4.588.578. Alternativ kann, falls das biologisch wirksame Mittel lipophil ist, es mit der Lipid-Doppelschicht assoziiert werden. In der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "Einschluß" (entrapment) so verstanden werden, daß er beides, das Arzneimittel in dem wäßrigen Volumen der Liposome ebenso wie das Arzneimittel, das mit der Lipid-Doppelschicht assoziiert ist, einschließt.
Es wurde durch verschiedene Forscher nachgewiesen, daß die Krebstherapie unter Verwendung von antineoplastischen Mitteln in vielen Fällen deutlich verbessert werden kann durch Einschließen des antineoplastischen Mittels in Liposome unter Verwendung traditioneller Verfahren gegenüber der direkten Verabreichung des freien Mittels in den Körper. Siehe z.B. Forssen, et al., (1983), Cancer Res., 43:546; und Gabizon et al., (1982), Cancer Res., 42:4734. Das passive Einschließen solcher Mittel in Liposome kann deren Antitumorwirkungen, Clearance-Geschwindigkeit, Gewebsverteilungen und Toxizitäten, verglichen mit der direkten Verabreichung, verändern. Siehe z.B. Rahman et al., (1982), Cancer Res., 42:1817; Rosa et al., (1982) in Transport in Biomembranes; Model Systems and Reconstitution, R. Antoline et al., ed. Raven Press, New York 243-256; Rosa, et al., (1983), Pharmacology, 26:221; Gabizon et al., (1983), Cancer Res., 43:4730; Forssen et al., supra; Gabizon et al., supra; und Olson, et al., (1982), Br. J. Cancer Clin. Oncol., 18:167. Unter Verwendung von Liposomen mit verschiedenen Zusammensetzungen und Größen wurden Beweise gesammelt, die zeigen, daß die akuten und chronischen Toxizitäten von Docorubicin abgeschwächt werden können, durch Wegdirigieren des Arzneimittels von Zielorganen. Z.B. ist es bekannt, daß die Cardiotoxizität der Anthracyclin-Antibiotika Daunorubicin und Doxorubicin und deren pharmazeutisch verträglicher Derivate und Salze deutlich verringert werden kann durch eine passive Liposomen-Einkapselung. Siehe z.B. Forssen et al., supra; Olson et al., supra; und Rahman et al., supra. Diese Pufferung der Toxizität scheint hauptsächlich auf einer verringerten Akkumulation im Herzen zu beruhen, die mit einer Verringerung der Cardiotoxizität verbunden ist (Rahman et al., 1980 Cancer Res., 40:1532; Olson et al., supra.; Herman et al., 1983, Cancer Res., 43:5427; und Rahman et al., 1985, Cancer Res., 45:796). Eine solche Toxizität schränkt normalerweise die Dosierung des freien Doxorubicins ein (Minow et al., 1975, Cancer Chemother, Rep. 6:195). Durch Einschluß hochtoxischer antineoplastischer Mittel in Liposome kann auch das Risiko verringern werden, wenn Personen, die in deren Verabreichung involviert sind, solchen Mitteln ausgesetzt werden.
Obwohl die oben erwähnten Untersuchungen deutlich das Potential für die Verwendung von liposomal eingekapseltem Doxorubicin zeigen, war ein kommerziell annehmbares liposomales Präparat nicht erhältlich. Z.B. besitzen viele dieser Formulierungen ein zweifelhaftes pharmazeutisches Potential in Folge der Probleme, die mit der Stabilität, der Einschlußeffizienz bzw. -ausbeute, dem Maßstabsvergrößerungspotential und den Kosten der verwendeten Lipide verbunden sind. Zusätzlich trifft man auf Probleme, die mit der Effizienz mit der die Arzneimittel eingeschlossen werden zusammenhängen. Solche Probleme begleiteten die passiven Einschlußverfahren, die bis jetzt verwendet wurden.
Große multilamellare Vesikel (MLVs) (Gabizon et al., 1982, supra.), große unilamellare Vesikel (LUVs) und kleine (beschallte) unilamellare Vesikel (SUVs) (Gabizon et al., 1983, supra., Shinozawa et al., 1981, Acta. Med. Okayama, 35:395) wurden verwendet mit Lipid-zusammensetzungen, die variable Mengen von positiv geladenen und negativ geladenen Lipiden zusätzlich zu Phosphatidylcholin (PC) und Cholesterin enthalten. Diese Veränderungen in der Lipid-Zusammensetzung stammt (stem from) zum größten Teil von den Erfordernissen für den Doxorubicineinschluß, da Systeme, die nur positive oder neutrale Lipide enthalten, geringe Einschlußeffizienzen und Arzneimittel zu Lipid-Verhältnisse zeigen (Gabizon et al., 1983, supra.; und Shinozawa et al., supra.). In Liposomen, die negativ geladene Lipide enthalten wie Cardiolipin, sind höhere Arzneimittel zu Lipidverhältnisse erreichbar in Folge der Assoziation des positiv geladenen Doxorubicins mit dem negativ geladenen Lipid. Die resultierenden Präparate sind jedoch unstetig, zeigen eine Veränderlichkeit in der Vesikelgröße und der Oberflächenladung. Auch ist der Typ und die Menge des erforderlichen Lipids unter Kostengesichtspunkten unerschwinglich.
Noch ein weiteres Problem mit den bekannten antineoplastisches Mittel-enthaltenden Liposomen besteht darin, daß keine der vorherigen liposomalen Formulierungen von Doxorubicin vollständig fundamentale Stabilitätserfordernisse erfüllt. Die Retention des Doxorubicins in liposomalen Präparaten wird im allgemeinen in Stunden gemessen, während pharmazeutische Anwendungen im allgemeinen Stabilitäten von einem Jahr oder mehr erfordern. Ferner ist die chemische Stabilität der Lipid-Komponenten infolge des hohen Anteils von sehr ungesättigten Lipiden wie Cardiolipin fraglich. Weitere Probleme schließen die hohen Kosten der negativgeladenen Lipide und Maßstabsvergrößerungsprobleme ein. Aufgrund der Tatsache, daß Doxorubicin eine amphipathische Natur besitzt, ist es für Doppelschichtmembranen durchlässig, was zur Instabilität der Liposomenpräparate führt, infolge des Austretens der Arzneimittel aus den Vesikeln (Gabizon et al., 1982, supra.; Rahman et al., 1985, supra.; und Ganapathi et al., 1984, Biochem. Pharmacol., 33:698).
In den oben erwähnten bekannten Untersuchungen wurde das Lipid verwendet, um die Toxizität des eingeschlossenen Arzneimittels durch Vergrößerung des Lipid-Gehalts in den Formulierungen zu verbessern, um die Arzneimitteltoxizität zu puffern. Die Anmelder fanden überraschend heraus, daß in der Tat ein niedriger Lipidgehalt (verringerte Arzneimittel zu Lipid- Gewichtsverhältnisse) die Toxizität am wirksamsten verringert. Diese Beziehung wurde bis heute nicht offenbart, als Folge der Beschränkungen der Menge des Doxorubicins, die durch die Verwendung passiver Einschlußverfahren eingeschlossen werden konnte (Verfahren, die nicht von dem Transmembran-pH- Gradienten-Beladungsmechanismus Gebrauch machen), was zum Anstieg der Menge des zum Einschluß der gleichen Menge des Arzneimittels erforderlichen Lipids führte.
Mayer et al., fanden, daß die Probleme, die mit dem wirksamen liposomalen Einschluß antineoplastischer Mittel verbunden sind, verringert werden können durch Anwenden von Transmembranlonengradienten (siehe PCT-Anlrleldung 86/01102, veröffentlicht am 27. Februar 1986). Abgesehen von der Induktion der Doxorubicinaufnahme, können solche Transmembran-Gradienten auch wirksam bei der Erhöhung der Arzneimittelretention in den Liposomen sein. Die vorliegende Erfindung offenbart verbesserte Pufferzusammensetzungen, die für den Zweck der effizienten Beladung von Liposomen durch Anwendung von Transmembran-Ionengradienten, genauer von Transmembran-pH-Gradienten, verwendet werden, und die das eingeschlossene bzw. eingekapselte Mittel festhalten.
Über die Liposome selbst wurde in vorherigen klinischen Versuchen an Menschen, bei denen sie intravenös verabreicht wurden, berichtet, daß sie keine signifikanten Toxizitäten aufweisen. Richardson et al., (1979), Br. J. Cancer 40:35; Ryman et al., (1983) in "Targeting of Drugs" G. Gregoriadis, et al., Hrsg. Seiten 235-248, Plenum, N.Y.; Gregoriadis G., (1981), Lancet 2:241 und Lopez-Berestein et al., (1985) J. Infect. Dis., 151:704. Es wurde über Liposome berichtet, das sie sich hauptsächlich in den retikubendothelialen Organen konzentrieren, die durch Sinosuidgefäße ausgekleidet sind, d.h., in Leber, Milz und Knochenmark, und durch phagozytäre Zellen, die in diesen Organen vorhanden sind, phagozytiert werden.
Die Verwendung von Liposomen, um antineoplastische Mittel zu verabreichen, hat Probleme aufgeworfen im Hinblick sowohl auf den Arzneimitteleinschluß und die Einschlußeffizienzen als auch auf die Arzneimittelfreisetzung bzw. -abgabe während der Therapie. Im Hinblick auf den Einschluß bestand ein kontinuierlicher Wunsch die Einschlußeffizienzen bzw. -ausbeuten zu vergrößern, um die Lipid-Belastung des Patienten während der Therapie zu verringern. Zusätzlich bedeuten hohe Einschlußausbeuten, daß nur eine kleine Menge des Arzneimittels während des Einschlußprozesses verlorengeht, ein wichtiger Vorteil wenn teure Arzneimittel, die gegenwärtig in der Krebstherapie verwendet werden, verarbeitet werden. Hinsichtlich der Arzneimittelfreisetzung fand man heraus, daß viele antineoplastische Mittel wie Doxorubicin aus traditionellen Liposomen nach dem Einschluß rasch abgegeben werden. Eine solche rasche Freisetzung verringert die nutzbringende Wirkung des Liposomeneinschlusses und beschleunigt die Freisetzung des Arzneimittels in den Kreislauf, wodurch Toxizitäten verursacht werden, was folglich im allgemeinen unerwünscht ist. Es wurden daher durch die Fachleute große Anstrengungen unternommen, um Wege zu finden, die Geschwindigkeit der Freisetzung der antineoplastischen Mittel und anderer Arzneimittel aus den Liposomen zu verringern.
Zusätzlich zu diesen Problemen des Einschlusses und der Freisetzung ist das Problem, einen kommerziell annehmbaren Weg für die Bereitstellung von Liposomen, die antineoplastische Mittel enthalten, zu finden, für den Kliniker ausschlaggebend. Obwohl die Herstellung und Beladung von Liposomen auf einer "wie gewünscht"-Basis ein annehmbares Verfahren bei einer experimentellen Einstellung ist, ist sie bei einer klinischen Einstellung im allgemeinen unbefriedigend. Es besteht daher ein signifikanter und kontinuierlicher Bedarf für Verfahren, wodurch Liposome mit oder ohne eingeschlossene Arzneimittel verschickt, gelagert und ganz allgemein durch die konventionellen kommerziellen Verteilungskanäle ohne wesentliche Beschädigung bewegt werden können.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Einschlußverfahren, das Transmembran-pH-Gradienten verwendet, das die Forderungen sowohl hinsichtlich der Optimierung der Wirkung und der pharmazeutischen Probleme als auch nach einer Formulierung mit einem Arzneimittel zu Lipid-Gewichtsverhältnis erfüllt, die die Toxizität des Arzneimittels verringert. Die resultierende Liposomen-antineoplastisches Mittel-Formulierung ist sehr wandlungsfähig, da der Beladungsprozeß nicht beschränkt ist auf irgendeine besondere Lipid-Zusammensetzung, Liposomengröße oder Ladung. Billige Lipide können verwendet werden, Einschlußausbeuten von ungefähr 100 % über einen weiten Bereich von Lipid Zusammensetzungen und Vesikelgrößen werden leicht erreicht, Arzneimittel zu Lipid-Gewichtsverhältnisse von größer als ungefähr 0,1 : 1 bis ungefähr 3,0 : 1, die höher als für bekannte Formulierungen liegen, werden erreicht (wodurch die Lipidbelastung verringert wird) und eine Maßstabsvergrößerung wird vereinfacht. Ein weiterer einzigartiger Vorteil dieses pH- getriebenen Aufnahmeprozesses ist es, daß eine Verringerung der Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel aus den Liposomen freigesetzt wird, eintritt, verglichen mit Liposomen mit passiv-eingeschlossenen Mitteln. Diese verringerte Geschwindigkeit der Freisetzung von eingeschlossenen, biologisch wirksamen Mitteln wird durch das in den Präparaten verwendete Puffersystem vermittelt. Folglich hält der freisetzungsinhibierende Puffer oder das Puffersystem das Mittel in den Liposomen zurück.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zur Bestimmung von freien und Liposomenassoziierten antineoplastischen Mitteln (z.B. Doxorubicin, Daunorubicin und Epirubicin) in liposomalen Präparaten. Infolge der hohen Toxizitäten dieser Arzneimittel ist es hilfreich, die Niveaus des freien Arzneimittels, falls im Präparat vorhanden, mengenmäßig zu bestimmen. Z.B. erlaubt das Verfahren den Nachweis des freien Arzneimittels von weniger als ungefähr 55 bis ungefähr 95 % des gesamten Arzneimittels in dem Liposomensystem. Der Test erfordert nicht die Verwendung von Materialien oder Ausrüstungen, die in einem Standardlabor oder in der klinischen Praxis unüblich sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung offenbart eine Liposomenzusammensetzung, die umfaßt: ein antineoplastisches Mittel bzw. Antikrebsmittel und ein Lipid, bevorzugt ein Phospholipid, wie EPC und Cholesterin, worin die Liposome einen Transmembran-pH- Gradienten aufweisen. Die Liposome besitzen ein Arzneimittel (antineoplastisches Mittel) zu Lipid-Verhältnis von 0,1 : 1 bis 3 : 1, am meisten bevorzugt 0,3 : 1 bis 3 : 1. Die Liposome enthalten eine freisetzungsinhibierende Pufferkombination wie Zitronensäure/Natriumcarbonat, Zitronensäure/Natriumbiphosphat, oder Natriumcarbonat/Kaliumsulfat-HEPES. Das antineoplastische Mittel kann z.B. ein Anthracyclin sein, wie Doxorubicin, Daunorubicin oder Epirubicin, ein Vinca-Rosea-Alkaloid bzw. Vinca- Alkaloid wie Vinblastin oder Vincristin, ein Purin- oder Pyrimidin-Derivat wie 5-Fluoruracil, ein alkylierendes Mittel wie Mitoxanthron, Stickstoff-Lost-Hydrochlorid oder Cyclophosphamid, oder ein antineoplastisches Antibiotikum wie Mitomycin oder Bleomycin. Die Liposome können ein Phospholipid umfassen wie Ei-Phosphatidylcholin ("EPC"), hydriertes Sojaphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin oder Diarachidonoylphosphatidylcholin und können zusätzlich Cholesterin umfassen, z.B. in einem 55:45 Phospholipid:Cholesterin-Molverhältnis. Die Liposome können zusätzlich α-Tocopherol umfassen. Die Liposome können 30 nm bis 2 Mikron groß sein, bevorzugt 100 bis 300 nm im Durchmesser, und große unilamellare Vesikel sein. Sie können 50 bis 200 mg/ml Lipid, bevorzugter 90 bis 110 mg/ml Lipid enthalten. Der Einschluß des antineoplastischen Mittels in den Liposomen beträgt 50 % bis 100 %, bevorzugt 90 bis 100 %, noch bevorzugter 98 bis 100 %. Diese Liposome können große unilamellare Vesikel sein und sie können im Hinblick auf die Größenverteilung homogen oder unimodal sein. Die Liposome können intravenös an den Patienten verabreicht werden. Pharmazeutische Präparate, die antineoplastische Mittel, eingeschlossen in den Liposomen, und pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel enthalten, sind eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die Liposomenzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden zur Behandlung oder Stabilisierung von Tumorleiden oder zur prophylaktischen Verhinderung des Einsetzens des Wiederauftretens von Tumorleiden. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird z.B. als Dreikomponentensystem bereitgestellt. Wenn das antineoplastische Mittel Doxorubicin ist, umfaßt das Dreikomponentensystem die leeren Liposome in einer sauren Lösung mit einem ungefähren pH von 4,0, eine basische Lösung und das antineoplastische Mittel. Die saure Lösung ist ein wäßriger Zitronensäurepuffer. Die basische Lösung ist Natriumcarbonat. Das Arzneimittel zu Lipid-Gewichtsverhältnis ist ungefähr 0,1 : 1 bis 3 : 1.
Die Liposomenzusammensetzung kann hergestellt werden, indem zunächst die Liposome in einem ersten wäßrigen Medium, bevorzugt einem Puffer gebildet werden und anschließendem Ansäuern oder Alkalischmachen des Mediums, wodurch der pH- Gradient erzeugt wird. Die resultierenden angesäuerten oder alkalischgemachten Liposome werden dann mit den antineoplastischen Mitteln, wie Doxorubicin, vermischt.
Die Liposome der Erfindung können entweder vor oder nach der Einrichtung des Transmembran-pH-Gradienten dehydratisiert werden. Die Liposome können große unilamellare Vesikel sein und sich aus langkettigen gesättigten Lipiden zusammensetzen. Als weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung des freien antineoplastischen Mittels in dem Liposomenpräparat (ein Testverfahren) offenbart. Z.B. beinhaltet dieses Verfahren für Doxorubicin das Messen des Extinktionsunterschieds bevorzugt bei ungefähr 600 nm vor und nach dem Alkalischmachen und Löslichmachen der Liposome des Präparates. Genauer wird die Extinktion der Doxorubicin-enthaltenden Liposome bei ungefähr 600 nm bestimmt. Das Liposomenpräparat wird dann alkalisch gemacht und die Extinktion wird erneut bei 600 nm gemessen. Die Liposome werden dann löslich gemacht, und die Extinktion wird erneut bei 600 nm gemessen. Die alkalisierten Liposome werden dann mit einer Farbtafel verglichen, aus der der Prozentsatz des eingeschlossenen Mittels bestimmt werden kann.

Kurze Beschreibung der Abbildung

Fig. 1 zeigt die Wirkung der Inkubationstemperatur auf die fembeladene (remote loaded) Doxorubicin-Aufnahme in EPC/Cholesterin (55:45 Molverhältnis)-Liposome. Liposome wurden in 300 inm Zitronensäure (pH 4,0) hergestellt und durch 200 nm Porengröße-Polycarbonatfilter extrudiert. Vor der Doxorubicin- Zugabe wurde die äußere Liposomenlösung auf pH 7,8 mit Natriumhydroxid gebracht. Doxorubicin (3,0 mg/ml) wurde zu den bei 21ºC (geschlossenes Quadrat), 37ºC (offener Kreis), und 60ºC (geschlossener Kreis) äquilibrierten Liposomen (11,0 mg/Lipid/ml) gegeben.
Fig. 2 ist eine Darstellung der Freisetzungseigenschaften von Liposomal-Doxorubicin (EPC:Cholesterin, 55:45 mol:mol, 29 ± 2/100 Arzneimittel/Lipid Gew./Gew.), das 300 mm Citrat enthält, dialysiert gegen einen Puffer bei 37ºC von pH 4,0 (offene Kreise) und pH 7,5 (geschlossene Kreise) bei 37ºC.
Fig. 3 ist ein Diagramm der Citrat-Doxorubicin-Wechselwirkung, das aus Mischungsexperimenten bei verschiedenen Citrat- pH-Werten resultiert. Die mM Doxorubicin, die in der Lösung nach der Zentrifugation verblieben, sind als Funktion des Citrat-pH aufgetragen: 4 mM Doxorubicin, gemischt bei 60ºC, dann auf 25ºC abgekühlt (geschlossene Quadrate); 4 mM Doxorubicin, gemischt bei 25ºC (offene Quadrate); 20 mM Doxorubicin, gemischt bei 60ºC, dann auf 25ºC abgekühlt (geschlossene Kreise); und 4 mM Doxorubicin, gemischt in 20 mM/HEPES, 150 mM NaCl bei 25ºC als Vergleich (offene Kreise).
Fig. 4 zeigt das Extinktionsspektrum zwischen 400 und 700 nm für Doxorubicin bei pH 7,5 (a) und pH 10,5 (b).
Fig. 5 zeigt einen Vergleich von frei/gesamt-Doxorubicin- Verhältnissen mit dem Extinktionsverhältnis bei 600 nm vor und nach der Zugabe von Triton X-100 zum Alkalischmachen des liposomalen Doxorubicins. Aktiv eingeschlossenes Doxorubicin (geschlossene Kreise); passiv Eingeschlossenes (offene Kreise).
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Freisetzung von Vincristin aus HSPC/Cholesterin- (offene Kreise), DSPC/Cholesterin(geschlossene Quadrate) und EPC/Cholesterin- (geschlossene Kreise) Liposomen-Systemen unter Dialysebedingungen bei 37ºC zeigt.
Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Wirkung der Temperatur auf die Aufnahme von 5-Fluoruracil ("FU") zeigt. Delta T bedeutet einen Temperaturanstieg von 21ºC auf 60ºC.
Fig. 8 ist ein Diagramm, das die Wirkung des äußeren Puffers auf die FU-Freisetzung bei 37ºC demonstriert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung zeigt den effizienten Einschluß von antineoplastischen Mitteln in Liposomen, die einen Transmembran-pH-Gradienten zeigen, was zu einem Arzneimittel zu Lipid-Verhältnis führen kann, das signifikant höher liegt als bei bekannten liposomalen Systemen. Auch zeigen Liposome der offenbarten Formulierungen eine verringerte Geschwindigkeit der Arzneimittelabgabe. Die Erfindung beinhaltet liposomale Formulierungen für die Verwendung als Arzneimittelträgersystemen, die Arzneimittel, wie die antineoplastischen Mittel Doxorubicm, Vincristin und 5-Fluoruracil einkapseln Diese Systeme können verwendet werden, um die toxischen Wirkungen der verwendeten antineoplastischen Mittel zu verringern.

Transmembran-Gradienten-Aufnahme von Arzneimitteln

Wie oben diskutiert, können die Liposome der Erfindung durch irgendeines der bekannten Verfahren gebildet werden. Sie werden aber bevorzugt entsprechend der Verfahren gebildet, die in Bally et al., PCT-Anmeldungsnr. 86/01102, veröffentlicht am 27. Februar 1986, offenbart wurden. Diese Technik erlaubt die Beladung von Liposomen mit ionisierbaren antineoplastischen Mitteln, um innere Konzentrationen zu erreichen, die beträchtlich höher liegen, als die Arzneimittellöslichkeit in wäßrigen Lösungen bei neutralem pH und/oder Konzentrationen, die durch passive Einschlußtechniken erhalten werden können. In dieser Technik wird ein Transmembran-Ionen(pH)-Gradient über die Membranen der Liposome gebildet, und das antineoplastische Mittel wird in die Liposome mit Hilfe des pH-Gradienten geladen. Der Transmembran-pH-Gradient wird erzeugt durch Bilden eines Konzentrationsgradienten für eine oder mehrere geladene Spezies (z.B. Na&spplus;, Cl&supmin;, K&spplus;, Li&spplus;, &supmin;OH und bevorzugt H&spplus;) durch die Liposomenmembranen, und diese Jonengradienten treiben die Aufnahme der ionisierbaren biologisch wirksamen Mittel (Arzneimittel) durch die Membran an. In der vorliegenden Erfindung werden Transmembran-H&spplus; (pH)-Gradienten verwendet.
Typisch wird der zu verwendende getrocknete Film des Lipids unter Verwendung einer wäßrigen Lösung hydratisiert. Diese Hydratisierung verwendet ein erstes wäßriges Medium wie destilliertes Wasser (z.B. USP-Wasser zur Injektion) oder einen wäßrigen Puffer. Z.B. ist ein solcher Puffer, wenn kationische Arzneimittel zu laden sind, ein Zitronensäurepuffer. Er wird am besten verwendet bei einem pH von 3,5 bis 4,5. Im Falle des Ladens der Arzneimittel Doxorubicin, Daunorubicin, Epirubicin und Vincristin wurde z.B. gefunden, daß es am besten ist 300 mM Zitronensäure bei ungefähr pH 4,0 als anfängliches Hydratisierungsmedium zu verwenden, daß das Innere der Liposome sauer macht. Zitronensäure wurde als die Pufferlösung identifiziert, die die Aufnahme dieser Amzeimittel in die Liposome am besten bewirkt.
Ahnlich können anionische antineoplastische Mittel in die Liposome mit einem basischen Inneren in der Form eines Natriumcarbonatpuffers geladen werden. Eine solche Beladung ist die Reaktion auf den basischen pH-Gradienten, der durch Austauschen des ursprünglichen Mediums gegen ein saures Medium aufgezwungen wird. Im Falle des Ladens von 5-Fluoruracil ist z.B. das erste Medium bevorzugt relativ basisch z.B. eine wäßrige Lösung, wie ein Puffer bei pH 6,8 bis 11,0, und am meisten bevorzugt ungefähr pH 9,6. Z.B. können 300 mM Natriumcarbonat bei einem pH von ungefähr 9,6 verwendet werden.
Liposome, die das erste wäßrige Medium einschließen, besitzen folglich eine erste Konzentration einer oder mehrerer geladener Spezies. Diese Liposome werden durch eine Technik hergestellt, die die Bildung von MLVs bevorzugt und die ungefähr 400 nm und größer im Durchmesser sind. Die Liposome werden dann durch Filter entsprechend der LUVET-Verfahren von Cullis et al., wie oben beschrieben, extrudiert. In dieser Technik werden die Liposome unter Druck durch einen oder mehrere (gestapelte) Polycarbonatendurchlauf- oder -windungsweg(tortuous path)filter gegeben. Die Liposome werden einmal oder mehrmals über die Filter gegeben, wodurch sie extrudiert werden und in einer Population von Liposomen mit homogener Größenverteilung resultieren, wie es in Cullis et al., PCT- Veröffentlichungsnr. 86/00236, 16. Januar 1986, beschrieben wurde.
Sind die Liposome einmal auf eine geeignete Größenverteilung eingestellt worden, kann das äußere Medium ersetzt werden durch Austausch des ursprünglichen äußeren Mediums durch ein neues äußeres Medium, das eine unterschiedliche Konzentrationen einer oder mehrerer geladenen Spezies z.B. H&spplus;-Ionen aufweist, z.B. ein relativ basisches oder ein relativ saures Medium. Der Austausch des äußeren Mediums kann durchgeführt werden durch Anderung des äußeren pH, z.B. im Falle von Doxorubicin, Daunorubicin oder Epirubicin durch Zugeben einer basischen Lösung, wie bevorzugt Natriumcarbonat bei ungefähr pH 11,0 oder einem pH, der ausreichend ist, um zu einem endgültigen pH von 7,5 - 8,3, am meisten bevorzugt pH 7,8 zu führen. Im Falle von Vincristin wird bevorzugt Natriumbiphosphat bei pH 6,8 bis pH 7,2, bevorzugt bei pH 7,0 angewendet, oder bei einem pH, der ausreicht, um zu einem endgültigen pH von ungefähr 7,1 zu führen. Weitere basische Lösungen, die verwendet werden können, schließen ein ohne darauf beschränkt zu sein: Natriumcarbonat, Natriumbiphosphat, Natriumhydroxid oder Kaliumphosphat. Ein solches Verfahren erzeugt den Konzentrationsgradienten. Im Falle von 5-Fluoruracil wird das äußere Medium durch ein relativ saures Medium, z.B. einen Puffer, wie bevorzugt Kaliumsulfat/150 mM HEPES oder H&sub2;SO&sub4; bei pH 6,5 bis 8,5 ausgetauscht, der in einer Menge zugegeben werden, die ausreichend ist, um das Präparat relativ sauer, bevorzugt auf ungefähr pH 7,0 einzustellen. Weitere relativ saure Lösungen, die für FU verwendet werden können, schließen ein ohne darauf beschränkt zu sein: HCL, H&sub3;PO&sub4;, Zu einem gewünschten pH von ungefähr 7,0. Andere Verfahren, die verwendet werden können, um das äußere Medium auszutauschen, sind die Gelfiltration; (z.B. unter Verwendung einer Sephadex Kolonne, die mit dem neuen Medium äquilibriert wurde), Zentrifugation, Dialyse oder verwandte Techniken. Dieser Transmembran-pH-Gradient führt zum Laden des Arzneimittels in die Liposome in der Weise, daß die Verhältnisse von freiem Vesikel zu assozuertem Arzneimittel, die aus den [H&spplus;]in/[H&spplus;]außen Verhältnisse vorhergesagten, reflektieren oder größer als diese sind. Ein lonengradient verbleibt durch die Liposomenmembranen selbst nachdem das Laden vervollständigt wurde.
Zusätzlich zum Laden eines einzelnen antineoplastischen Mittels kann das pH-Gradienten-Beladungsverfahren verwendet werden, um mehrere antineoplastische Mittel entweder simultan oder aufeinanderfolgend zu beladen. Auch können die Liposome, in die das ionisierbare antineoplastische Mittel geladen wird, selbst mit anderen antineoplastischen Mitteln oder anderen Arzneimitteln unter Verwendung konventioneller passiver Einschlußtechniken vorgeladen sein (z.B. durch Einschluß des Arzneimittels in den Puffer, aus dem die Liposome hergestellt werden). Da die konventionell geladenen Materialien nicht ionisierbar zu sein brauchen, stellt dieser Ansatz eine große Flexibilität in der Herstellung von Liposomen-eingeschlossenen "Arzneimittelcocktails" für die Verwendung in Krebstherapien bereit. Diese "Arzneimittelcocktails" können zwei oder mehrere Populationen von Liposomen (die das gleiche oder ver-schiedene antineoplastische Mittel einschließen), verschiedene Lipid- Formulierungen oder verschiedene Vesikelgrößen umfassen. Solche Cocktails können verabreicht werden, um eine größere therapeutische Wirksamkeit, Sicherheit, eine verlängerte Arzneimittelabgabe oder das Zielen (targeting) zu erreichen.

Transmembran-Gradient - Arzneimittelabgabe

Kommt man nun zu den Aspekten der Erfindung, die sich mit der Verringerung der Freisetzungsgeschwindigkeit des ionisierbaren antineoplastischen Mittels oder anderer ionisierbarer biologisch aktiver Mittel aus den Liposomen befassen, so wurde überraschend gefunden, daß der Transmembran-pH-Gradient auch die Geschwindigkeit der Abgabe durch die Liposomenmembranen deutlich verringern kann. Folglich sind die Liposome extrem stabil hinsichtlich der Abgabe ihrer Inhalte. Die verringerte Geschwindigkeit der Arzneimittelabgabe wird erzeugt durch die Pufferkapazität des Liposomeninneren; d.h., die Konzentrationen am Inneren und am Äußeren der Liposome der H&spplus;-Ionen (der pH- Gradient). Z.B. führen hohe innere Pufferkapazitäten, die ein größeres Einfließen von Kationen (wie des antineoplastischen Mittels) erfordern, um den pH-Gradienten zu verringern, zu längeren Retensionszeiten. Weiter wird sich, wenn die innere Pufferkapazität einmal erschöpft ist, die Abgabegeschwindigkeit des antineoplastischen Mittels (z.B. Doxorubicin) erhöhen. Die Beladung der Liposome mit dem Arzneimittel erfordert die Einstellung der Ionenkonzentration des äußeren Mediums der Liposome, um ein chemisches Potential durch die Liposomenmembran zu bilden. Wenn das Ion ein Wasserstoffkation ist, kann diese Einstellung durch Anderung des pH durch Zugeben einer Lösung mit relativ saurem oder basischern pH durchgeführt werden. Wie zuvor beschrieben, wird die Abgabegeschwindigkeit des biologisch aktiven Mittels durch den Puffer vermittelt. Für bestimmte Pufferkombinationen (inneres wäßriges Medium/äußeres wäßriges Medium) wurde gefunden, daß sie die Aufnahme verbessern und die Abgabe der Liposomeninhalte verringern. Z.B. ist die für die Retention der liposomalen Inhalte am meisten geeignete Pufferkombination bei den Arzneimitteln Doxorubicin, Epirubicin und Daunorubicin Zitronensäure/Natriumcarbonat. Im Falle von Vincristin ist die am meisten geeignete Pufferkombination Zitronensäure/Natriumbiphosphat. Im Falle von 5-FU ist die bevorzugte Pufferkombination Natriumcarbonat/Natriumhydroxid oder Natriumcarbonat/Kaliumsulfat-HEPES.
Die Doxorubicinretention in EPC/Cholesterin (55:45)- Vesikeln, die einen pH-Gradienten aufweisen, kann erhöht werden durch Anwenden von Citrat/Carbonat-Puffersystemen auf weniger als ungefähr 5% Arzneimittelabgabe, die über 24 Stunden bei 37ºC beobachtet wird. Dieses Vesikel-eingeschlossene Doxorubicin scheint auch gegenüber Serum-Komponenten stabil zu sein; weniger als 5% Doxorubicin wird über 24 Stunden freigesetzt bei Vesikeln, die bei 37ºC in 95 %igem frischen Humanserum inkubiert werden. In Assoziierungstests, bei denen Doxorubicin mit HEPES-Puffer bei pH 7,5 und Citratpuffern (Natriumcitrat) bei einem pH im Bereich von 4,0 bis 7,5 inkubiert wurde, treten Wechselwirkungen zwischen Doxorubicin und Citrat und Fällungen auf, während dies beim HEPES-Puffer nicht eintritt. Ein solche Pufferkombination, d.h. Citrat/Carbonat bewirkt die Verringerung der Abgabegeschwindigkeit des Arzneimittels von den Liposomen. Andere abgabeverringernde Pufferkombinationen können verwendet werden wie Oxalsäure/Kaliumphosphat oder Succinsäure/Natriumbicarbonat mit Zitronensäure/Natriumcarbonat oder Zitronensäure/Natriumbisphosphat als den Bevorzugten.
Die Liposome werden dann inkubiert, um ihren Einschluß zu erleichtern (über 37ºC, bevorzugt über 60ºC für Doxorubicin und FU). Die Länge der Inkubation kann von der Temperatur abhängen. Daunorubicin, Epirubicin und Mitoxanthron können bei 25ºC inkubiert werden. Das ionisierbare antineoplastische Mitteln kann ebenso auf die gleiche Temperatur erhitzt und die beiden Komponenten vermischt werden. Die Liposomen-Arzneimittelsuspension wird weiter inkubiert, und die resultierende Lösung weist schließlich einen pH von ungefähr 6,9-8,3, bevorzugt 7,5-7,8 auf. Eine solche Inkubation bei erhöhten Temperaturen ist bevorzugt zur wirksamen Ladung des Doxorubicins in Liposome, die Cholesterin enthalten. Die Lösung wird dann nach Bedarf z.B. in physiologischer Salzlösung verdünnt und verabreicht.
Weitere Verfahren sind geeignet zum Mischen des Arzneimittels, des Puffers und der Liposome. Z.B. kann zunächst die Salzlösung zum Suspendieren des Arzneimittels verwendet werden und dann die Liposome mit dem Transmembran-pH-Gradienten hinzugegeben werden. Zusätzlich kann das Arzneimittel gleichzeitig mit dem Einstellen des pH zum Erzeugen des Gradienten zu den Liposomen gegeben werden. Weitere Verfahren des Mischens können erforderlich sein, abhängig von dem antineoplastischen Mittel und den anderen vorhandenen pharmazeutischen Komponenten.
Das Transmembran-pH-Gradienten-Beladungsverfahren kann im wesentlichen mit irgendeinem antineoplastischen Mittel verwendet werden, das im ionisierbaren Zustand vorliegen kann, wenn es in einem geeigneten wäßrigen Medium gelöst wird (z.B. organische Verbindungen, die eine Aminogruppe enthalten, die protoniert werden kann). Diese Mittel können primäre, sekundäre, tertiäre oder quaternäre Amingruppen und eine lipophile Gruppe enthalten und sollten nicht zur Dissipation des pH-Gradienten führen. Das Mittel sollte relativ lipophil sein, so daß es sich in den Liposomenmembranen verteilt. Beispiele einiger antineoplastischer Mittel, die in Liposome durch dieses Verfahren geladen werden können und daher in dieser Erfindung verwendet werden können, schließen ein ohne darauf beschränkt zu sein: Anthracycline wie Doxorubicin, Daunorubicin, Mitoxanthron und Epirubicin, antineoplastische Antibiotika wie Mitomycin und Bleomycin, Vinca-Rosea-Alkaloide wie Vinblastin und Vincristin, alkylierende Mittel wie Cyclophosphamid und Stickstoff-Lost- Hydrochlond und Purin- und Pyrimidin-Derivate wie 5-Fluoruracil (siehe Goodman und Gilman, Hrsg., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6te Auflage, Macmillan & Co., 1980, Seiten 1249-1314.
Um zu bestimmen, ob sich ein ionisierbares antineoplastisches Mittel in die Liposome aufgrund des Transmembran-pH- Gradienten lädt, werden EPC-enthaltende Liposome (ungefähr 1,0 mM EPC) mit einem &sub3;H-DPPC-Tracer und einem relativ sauren oder basischen internen Medium wie 300 mM Zitronensäure bei ungefähr pH 4,0 hergestellt. Diese Liposome werden ungefähr 10 mal entsprechend dem LUVET-Verfahren durch zwei 100 nm Filter extrudiert, gefolgt von der Einstellung des äußeren pH auf einen relativ basischen oder sauren pH, z.B., Natriumcarbonat bei ungefähr pH 11,0. Nach der Bildung des pH-Gradienten wird das zu ladende Mittel, das mit einem radioaktiven Isotop des Mittels versehen ist, mit den Liposomen auf ungefähr 200 uM (pro 1,0 mM verwendetes Lipid) vermischt. Die Liposome werden von dem freien nichteingeschlossenen Mittel auf G50-M Sephadex- Minikolonnen bei 500 x g für 3 Minuten in 13 x 100 mm Röhrchen getrennt, und die Radioaktivität wird mit einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Aufnahme des Arzneimittels in nmol pro umol des Lipids wird dann über die Inkubationszeit aufgetragen. 100 % des verfügbaren Doxorubicins wird unter diesen Bedingungen in die Liposome aufgenommen.
Im Falle des Doxorubicins, können kommerziell erhältliche Formen wie gepulverte, feste und Methylparaben-enthaltende Formen (Adriamycin R.D.F., Adria Laboratories, Inc., Columbus, Ohio) in der Erfindung verwendet werden. Wenn die Methylparaben-enthaltenden Formen angewendet werden, kann eine wäßrige Lösung wie eine Salzlösung zu dieser Form gegeben werden, wodurch sie gelöst wird, gefolgt vom Mischen dieser Suspension mit den Liposomen, die einen Transmembran-pH-Gradienten durch ihre Doppelschichten aufweisen. Ein solches Mischen bei 60ºC für ungefähr 10 Minuten führt zu einem 98 %igen Einschluß des Doxorubicins.
Lipide, die in den Liposomenformulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Phospholipide, wie Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI), Sphingomyelin (SPM) und ähnliche allein oder in Kombination ein. Die Phospholipide können synthetisch sein, oder sich aus natürlichen Quellen wie Ei oder Soja ableiten. Die Phospholipide Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) können auch verwendet werden. In den bevorzugten Ausführungsformen wird Ei-Phosphatidylcholin (EPC) und Cholesterin bevorzugt in einem 55:45 molaren Verhältnis verwendet. In anderen Ausführungsformen können Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) oder hydriertes Soja- Phosphatidylcholin (HSPC) in einem molaren Verhältnis von 55:45 mit Cholesterin verwendet werden. Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Diarachidonoylphosphatidylcholin (DAPC) können gleichzeitig verwendet werden. In Folge der erhöhten Übergangstemperaturen (Tc) der Lipide wie DSPC (Tc von ungefähr 65ºC), DPPC (Tc von ungefähr 45ºC) und DAPC (Tc von ungefähr 85ºC) werden solche Lipide bevorzugt auf ungefähr ihren Tc oder Temperaturen die etwas höher (z.B. bis zu 5ºC höher) als deren Tc liegen, erhitzt, um diese Liposome herzustellen.
Die Liposome können auch andere Steroidkomponenten enthalten wie Polyethylenglykolderivate des Cholesterins (PEG- Cholesterin), Koprostanol, Cholestanol, Cholestan oder alpha- Tocopherol. Sie können auch organische Säurederivate von Sterolen enthalten, wie Cholesterinhemisuccinat (CHS) und ähnliche. Organische Säurederivate des Tocopherols können auch als Liposomen-bildende Bestandteile verwendet werden wie alpha- Tocopherolhemisuccinat (THS). Beide CHS- und THS-enthaltende Liposome und deren Tris-Salzformen können im allgemeinen durch irgendein bekanntes Verfahren zur Herstellung von Liposonen, die diese Sterole enthalten, hergestellt werden Insbesondere siehe die Verfahren von Janoff, et al., U.S. Patent Nr. 4.721.612, erteilt am 26. Januar 1988 mit dem Titel "Steroidal Liposomes" und Janoff, et al., PCT-Publikationsnr. 87/02219, veröffentlicht am 23. April 1987 mit dem Titel "Alpha Tocopherol-Based Vesicles", deren bedeutsame Teile hier als Referenz enthalten sind. Die Liposome können auch Glycolipide enthalten.
In der vorliegenden Erfindung beträgt die verwendete Lipid-Konzentration bevorzugt 50 mg/ml bis 200 mg/ml, bevorzugter 90 mg/ml bis 110 mg/ml. Sie kann jedoch irgendeine Lipid- Konzentration, die aus dem Stand der Technik als kritische Micellkonzentration bekannt ist, bis ungefähr 40 % wäßrig (bezogen auf das Gewicht) einschließen. Das Arzneimittel zu Lipid-Gewichtsverhältnis, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann so hoch wie 3 : 1 sein. Für diejenigen Arzneimittel, die durch den Transmembran-pH-Gradienten geladen werden, speziell für Doxorubicin, reichen sie bevorzugt von 0,1 : 1 bis 3 : 1, am meisten bevorzugt beträgt es ungefähr 0,3 : 1. Dieses Verhältnis kann entsprechend der Lipid-Formulierung und der Vesikelgröße wie im folgenden beschrieben, variieren. Für Vincristin ist das Arzneimittel : Lipid-Gewichtsverhältnis 0,1 : 1 bis 1 : 1, bevorzugt 0,1 : 1 bis 0,29 : 1.

Doxorubicin-Einschlußausbeute hängt vom Arzneimittel zu Lipid- Verhältnis ab.

Das Variieren des Arzneimittels zu Lipid (Gew./Gew.) Gewichtsverhältnis für Vesikel, die 300 mM Citrat (pH 4,0) enthalten, zwischen 1 : 10 und 1 : 3 hat keinen Einfluß auf die Doxorubicineinschlußausbeute. Werte von ungefähr 100 % Einschluß werden in diesem Bereich erreicht, und weniger als 5 % des Arzneimittels werden über 24 Stunden bei diesen Arzneimittel zu Lipid-Verhältnissen freigesetzt. Die Einschlußausbeuten verringern sich jedoch deutlich, wenn das anfängliche Arzneimittel zu Lipid-Verhältnis auf ungefähr 1 : 2 erhöht wird, und diese Vesikel zeigen auch eine erhöhte Doxorubicin- Freisetzungskinetik Die Einschlußeffizienz wird nicht wesentlich beeinflußt durch die Vesikelgröße, die Arzneimittel zu Lipid-Verhältnisse innerhalb des bevorzugten Bereichs dieser Erfindung oder die Lipid-Zusammensetzung, da Einschlußausbeuten von ungefähr 100 % für Vesikel erhalten werden können, deren Größe im Bereich von ungefähr 100 nm bis 1,4 nm liegt, für Arzneimittel zu Lipid-Verhältnisse (Gew./Gew.) von 0,1 : 1 bis 0,3 : 1 und für Lipid-Zusammensetzung, die neutrale, negativ geladene oder gesättigte Phospholipide ebenso wie verschiedene Mengen von Cholesterin enthalten.

Doxorubicin-Arzneimittelfreisetzung hängt von der Lipid Zusammensetzung ab.

Die in vitro Doxorubicin-Freisetzungseigenschaften zeigen eine Abhängigkeit von der Lipid-Zusammensetzung. Präparate, die Cholesterin enthalten, sind beständiger gegen die Arzneimittelfreisetzung und diejenigen, die Cholesterin und Ei-Phosphatidylglycerin enthalten, führen zu Arzneimittelabgaben, die zwischen denjenigen liegen, die nur EPC enthalten und denjenigen, die EPC/Cholesterin enthalten.

Doxorubicin-Toxizität

Das in den Liposomen der vorliegenden Erfindung verabreichte Doxorubicin zeigt eine geringere Toxizität, als das Doxorubicin, das in freier Form verabreicht wird. Die toxikologische Bewertung des liposomalen Doxorubicin in Mäusen zeigte einen 2,3-fachen Anstieg der akuten LD&sub5;&sub0;-Werten, mit deutlich geringerem Gewichtsverlust.
Offensichtlich waren die Mäuse-LD&sub5;&sub0;s abhängig von der Lipid-Zusammensetzung. Der LD&sub5;&sub0; von liposomalem Doxorubicin steigt mit dem Anstieg des Cholesteringehalts der Liposome von 0 bis 45 mol-%, oder wenn die Lipid-Formulierung DSPC beinhaltet.
Die akute Toxizität des liposomalen Doxorubicins war relativ unempfindlich gegenüber der Vesikelgröße in einem Durchmesserbereich von 0,15 bis 1,4 um (bzw. µm) und stieg langsam an unterhalb von ungefähr 150 nm.
Variablen wie die Liposomenoberflächenladung und die Größe ändern die akute Toxizität des liposomalen Doxorubicins nicht signifikant, wie es bei Änderungen in der Lipid-Zusammensetzung der Fall ist. Weiter erhöht die Verwendung von DSPC/Cholesterin dramatisch den LD&sub5;&sub0; (> 200 mg/kg) der 4- und 10-fach größer als der für EPC/Cholesterin eingeschlossenes bzw. freies Arzneimittel ist. Solche Formulierungen besitzen sehr niedrige Arzneimittelakkumulierungsniveaus in Herz-, Lungen- und Nierengeweben. Die Steigerung des Arzneimittel zu Lipid-Verhältnisses hat einen dramatischen Einfluß auf die Verbesserung der Doxorubicin-Toxizität Vorherige Untersuchungen zeigten diese Wirkung nicht in Folge der Beschränkung des Doxorubicineinschlusses durch die bekannten Einschlußtechniken. Obwohl ein solcher Einschluß des Arzneimittels zu seiner Aufnahme durch die Leber führt, wurden akute Leberschäden nicht beobachtet.

Wirksamkeit der Liposomal-Formulierung

Die Wirksamkeit der liposomalen antineoplastischen Formulierung der vorliegenden Erfindung mit veränderten Lipid- Zusammensetzungen, Liposomengrößen und Arzneimittel zu Lipid- Verhältnissen wurden in weiblichen DBA/2-Mäusen unter Verwendung des L1210 lymphozytischen Leukämie-Modells untersucht. Die Antitumorwirkungen des freien Arzneimittels und der liposomalen Formulierung wurden unter Verwendung dieses Modells analysiert. Die Tiere erhielten die maximal tolerierbare Dosis (MTD) der liposomalen Formulierung und der Anstieg ihrer Lebensdauer (ILS) wurde gegenüber unbehandelten Kontrollen gemessen und mit dem ILS von freiem Doxorubicin verglichen.

Vincristin-Toxizität und Wirksamkeit

Im Falle von Vincristin machte die Assozuerung des Arzneimittels mit den Liposomen das Arzneimittel weniger toxisch als das freie Arzneimittel, und wirksam gegen die Aszites-L1210-Tumorlinie, während das freie Arzneimittel in diesem Modell keine Wirkung besitzt.

Liposomen-Bildung

Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um die Liposome der Erfindung zu bilden. Z.B. können multilamellare Vesikel (MLVs), stabile plurilamellare Vesikel (SPLVs) oder Umkehrphasenverdampfungsvesikel (reverse phase evaporation veside) (REVs) verwendet werden. Bevorzugt werden MLVs durch Filter extrudiert, die LUVs abhängig von der Filterporengröße bilden. Polycarbonatfilter von 30, 50, 60, 100, 200 oder 800 nm Porengrößen werden verwendet. In diesem Verfahren, das in Cullis, et al., PCT-Publikationsnr. WO 86/000238, 16. Januar 1986, offenbart wurde, kann die Liposomensuspension wiederholt über die Extrusionsvorrichtunq gegeben werden, was zu einer Population von Liposomen mit homogener Größenverteilung führt. Z.B. kann die Filtration durchgeführt werden über einen Durchlaufmembranfilter (ein Nucleopore-Polycarbonatfilter) oder einen Windungswegfilter (z.B. ein Nucleopore-membrafil-Filter) (gemischter Celluloseester) von 0,1 um Größe), oder eine alternative Größenverringerungstechniken wie Homogenisierung durchgeführt werden. Die Liposome der vorliegenden Erfindung können von ungefähr 30 nm bis ungefähr 2 Mikron im Durchmesser sein; bevorzugt ungefähr 50 nm bis 300 nm, bevorzugt ungefähr 60 nm bis 300 nm und am meisten bevorzugt 100 bis 300 nm. Dieser Größenbereich schließt Liposome ein, die MLVs, SPLVs oder LUVs sein können. In der vorliegenden Erfindung sind unilamellare Liposome von 100 nm bis 300 nm bevorzugt; solche Liposome sind LUVs. Der Größenbereich der SUVs ist 25 - 50 nm.
Wenn Lipide mit einem Gel zu flüssigkristallinem Tc oberhalb der Raumtemperatur verwendet werden, kann ein Extruder mit einem beheizbaren Zylinder (Thermomantel) verwendet werden. Eine solche Vorrichtung dient dazu die Liposomensuspensionstemperatur zu erhöhen, was die Extrusion dieser LUVs erlaubt. Solche Lipide, die mit einem Thermomantel-Extruder verwendet werden, sind DSPC, DPPC, DMPC und DAPC z.B. Diese Lipide können z.B. mit Cholesterin in einem 55:45 molaren Verhältnis kombiniert werden. Liposome, die DSPC enthalten, würden bei ungefähr 65ºC, DPPC bei ungefähr 45ºC und DAPC bei ungefähr 85ºC; oder ungefähr 5ºC über dem Lipid-Tc extrudiert werden. In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung können LUVs, die diese Lipide mit einem Tc oberhalb von Raumtemperatur verwendet, gebildet werden. Bekannte Techniken unter Verwendung solcher Lipide zur Bildung kleiner Vesikel, beinhalten die Beschallung, die SUVs erzeugt (Größenbereich von 25 bis 50 nm).
Die großen unilamellaren Vesikel dieser Erfindung, die langkettige gesättigte Vesikel umfassen, sind 60 nm bis 300 nm groß. Diese LUVs können ein biologisch aktives Mittel einschließen wie z.B. ein antineoplastisches Mittel. Die Verwendung des LUVET-Systens mit langkettigen gesättigten Lipiden kann in LUVs mit homogener Größenverteilung führen; diese kann eine unimodale Verteilung der Vesikel sein. Wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist eine homogene Population der Vesikel diejenige, die sich im wesentlichen aus Liposomen gleicher Größe zusammensetzt, und die eine Gauss-Verteilung der Partikelgrößen besitzt. Bei einer solchen Population spricht man auch von einer gleichförmigen Größenverteilung, und sie kann im Hinblick auf ihre Größe unimodal sein. Der Ausdruck "unimodal" bedeutet eine Population mit einer engen Polydispersität der Partikelgrößen, und die Partikel besitzen eine einzelne Erscheinungsform ("Modus").
Eine liposomale Population ist unimodal wenn bei der Messung durch quasielastische Lichtstreuungsverfahren, die Population eine Gauss-Verteilung aufweist, und wenn ein Polynom zweiter Ordnung auf den natürlichen Logarithmus der Autokorrelationsfunktion der Probe paßt (Koppel, 1972, J Chem. Phys., 57:4814). Je besser dieser Anpassung ist, desto besser ist das Ausmaß der Unimodalität. Die Genauigkeit dieser Anpassung wird bestimmt, in dem man feststellt, wie nahe der chi-Quadrat (chi²) Wert der Probe an eins (1,0) liegt. Ein chi²-Wert von 2,0 und weniger stellt eine unimodale Population dar.
Andere Größenreduktionstechniken können bei der Ausübung der Erfindung angewendet werden. Z.B. können Homogenisierungs- oder Mahltechniken erfolgreich verwendet werden. Solche Techniken können Liposome ergeben, die homogen oder unimodal im Hinblick auf die Größenverteilung sind.
Während der Herstellung der Liposome können organische Lösungsmittel verwendet werden, um die Lipide zu lösen. Geeignete organische Lösungsmittel sind diejenigen mit verschiedenen Polaritäten und dielektrischen Eigenschaften, die Lipide lösen, und die, ohne darauf beschränkt zu sein, einschließen: Chloroform, Methanql, Dimethylsulfoxid (DMSO), Methylenchiond und Lösungsmittelmischungen wie Benzol:Methanol (70:30) Als Ergebnis werden Lösungen (Mischungen, in denen die Komponenten gleichförmig verteilt sind) gebildet, die Lipide enthalten. Die Lösungsmittel werden ausgewählt auf Basis ihrer biologischen Verträglichkeit, geringen Toxizität und Entzündbarkeit.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein 3- Komponenten-Liposomen-antineoplastisches Mittel-Behandlungssystem, das den Finschluß des Mittels am Ort der Klinik erlaubt. Wenn das Arzneimittel Doxorubicin oder Vincristin oder ein anderes antineoplastisches Mittel ist, das als Folge des Transmembran-pH-Gradienten geladen wird, wobei das Innere der Liposome sauer ist, ist die erste Komponente des Systems (Ampulle 1) Liposome in Zitronensäurepuffer (300 mmol, pH 3,8 - 4,2, bevorzugt pH 4,0). Die zweite Komponente (Ampulle 2) ist eine Base, bevorzugt Natriumcarbonat- oder Natriumbiphosphat-Lösung bei 0,5 M, pH 11,5. Die dritte Komponente (Ampulle 3) ist das antineoplastische Mittel. Das oben erwähnte Behandlungssystem kann als 3-Ampullen-System bereitgestellt werden, mit der ersten Ampulle, die die Liposome in einem sauren Medium enthält, der zweiten Ampulle, die die Base enthält und der dritten Ampulle, die das antineoplastische Mittel (z.B. Doxorubicin) enthält. Wenn das Arzneimittel ein solches ist, das sich als Folge des Transmembran-Gradienten, bei dem das Innere der Liposome relativ basisch ist, lädt, (wie z.B. 5-FU), ist die erste Komponente des Systems Liposome in Natriumcarbonatpuffer (wie z.B. pH 6,8 - 11,0, bevorzugt pH 9,6). Die zweite Komponente ist eine relativ saure Lösung, z.B. 150 mM Kaliumsulfat/150 mM HEPES-Puffer, pH 7,4. Die dritte Komponente umfaßt das antineoplastische Mittel. Nach der Bildung des pH-Gradienten durch die Liposome (durch Mischen der ersten und zweiten Ampullen) können die Liposome vor dem Mischen mit dem Arzneimittel erhitzt werden. Wenn Doxorubicin, Vincristin und FU geladen werden, wurde es als vorteilhaft gefunden, die Liposome auf ungefähr 60ºC zu erhitzen. Daunorubicin, Epirubicin, Mitoxanthron und Vincristin werden wirksam bei 25ºC geladen.
Wenn das oben beschriebene Ampullen-System im Falle des Ladens von Doxorubicin verwendet wird, können die Komponenten unmittelbar vor der Verwendung nach dem folgenden Verfahren gemischt werden. Die Natriumcarbonatlösung aus Ampulle 2 wird zu den Liposomen in Ampulle 1 gegeben. Die Mischung wird auf eine erhöhte Temperatur (z.B. 60ºC Wasserbad) für 5 bis 10 Minuten erhitzt. Die vereinten Carbonat- und Liposom-Lösungen werden dann zu Ampulle 3 gegeben, die das antineoplastische Mittel (Doxorubicin) und Lactose enthält. Diese Ampulle wird verwirbelnd gemischt, dann auf eine erhöhte Temperatur (z.B 60ºC) unter verwirbelndern Mischen alle 5 Minuten während des Erhitzens erhitzt. Die resultierende Liposomen-Arzneimittelsuspension wird dann mit normaler Salzlösung oder 5 %iger Dextrose verdünnt Die endgültige Lösung hat einen pH von 6,9 bis 8,0, bevorzugt pH 7,5.
Im Falle der Beladung mit Vincristin kann das obige Protokoll ähnlich verwendet werden, aber die Mischungssequenz kann geändert werden. Z.B. kann das Vincristin mit den Liposomen bei einem sauren pH (pH 4,0) vermischt werden, und dann der pH- Gradient durch Zugabe einer relativ basischen Lösung eingerichtet werden.

Spektrophotometrischer Test (Assay)

Bei dem Aspekt des antineoplastischen Mittel-Tests der vorliegenden Erfindung, wird ein Test zur Bestimmung der Anteile von freiem und Liposomen-eingeschlossenen antineoplastischen Arzneimittel in liposomalen Präparaten offenbart, der auf der pH-abhängigen spektralen Antwort (z.B. infrarot, ultraviolett oder sichtbar) basiert. Z.B. zeigt Doxorubicin bei einem pH von ungefähr 7,0 eine maximale Extinktion bei 489 nm, während bei alkalischem pH (ungefähr 10,0) die Extinktionspeaks bei 550 und 592 nm (Fig. 4} beobachtet werden. Freie Doxorubicin-Konzentrationen in liposomalen Systemen können somit bestimmt werden durch Aufzeichnung der Extinktion bei 600 nm nach dem Alkalischmachen des extravesikulären Mediums (Liposomalbadlösung) mit einer Base wie Natriumhydroxid (Extinktionsdifferenz). Solche Verfahren induzieren einen Spektral-Shift des freien Dqxorubicins und nichtliposomal eingeschlossenen Doxorubicins, da die Lipid-Doppelschicht fähig ist, das eingeschlossene Doxorubicin von dem alkalischen äußeren Medium zu isolieren. Der resultierende O.D.&sub6;&sub0;&sub0; reflektiert daher die Menge des nichteingeschlossenen Doxorubicins im Präparat. Die gesamten Doxorubicin-Konzentrationen werden dann quantitativ bestimmt durch Wiederholung der Messung nach Löslichmachen der Liposome (Aufbrechen der Liposome) durch irgendein bekanntes Verfahren, z.B. mit Triton X-100 (wobei das gesamte Doxorubicin der alkalischen Umgebung ausgesetzt wird). Das Extinktionsverhältnis bei 600 nm ist direkt proportional zu dem Prozentsatz des freien Doxorubicins in den Vesikeipräparaten, bestimmt durch Standard-Säulenchromatographietechniken Die Anteile des nichteingeschlossenen Arzneimittels werden bestimmt als das Verhältnis der Extinktion, die erhalten wird nach Alkalischmachen mit NaOH, dividiert durch diejenige, die in Gegenwart von Triton X-100 beobachtet wird (Messung der Extinktionsdifferenz).
Die spektroskopische Analyse der liposomalen Doxorubicin- Präparate wurde verglichen mitder von Säulenchromatographieverfahren, die direkt das freie und das Vesikel-assozuerte Arzneimittel messen, um die Extinktionsverhältnis-Werte mit den tatsächlichen freien DOX/Gesamt-DOX-Verhältnissen über einen weiten Bereich von Einschlußausbeuten zu korrelieren. Da die pH-Gradienten die Aufnahme des Doxorubicins in die Liposome so induzieren, daß die [DOX]innen/[DOX]außen-Verhältnisse die [H&spplus;]innen/[H&spplus;]außen-Verhältnisse reflektieren, werden EPC/Cholesterin-Liposome, die pH-Gradienten (saures Inneres) verschiedener Größenordnungen zeigen, verwendet, um Liposomsysteme mit Einschlußausbeuten von 10 bis 99 % zu konstruieren. Fig. 5 zeigt, daß das hier beschriebene Extinktionsverhältnis bei 600 nm exakt das Verhältnis von freiem/gesamtem Doxorubicin in den Vesikelpräparaten über den gesamten Bereich der untersuchten Einschlußausbeuten darstellt. Das spektroskopische Analysenverfahren wurde auch an EPC-Liposomen durchgeführt, in denen das Doxorubicin passiv während der Vesikelbildung eingeschlossen worden war, um sicherzustellen, daß diese Ergebnisse nicht spezifisch für das liposomale Doxorubicin waren, das durch den aktiven Einschluß erhalten wurde. Fig. 5 (offenes Symbol) zeigt, daß das Extinktionsverhältnis bei 600 nm für diese Probe mit dem freien/gesamten Doxorubicin-Wert korreliert, der durch Säulenchromatographie erhalten wurde.
Die Extinktionseigenschaften der Spektral-Shifts erlauben auch die visuelle Bewertung der relativen Menge des freien Doxorubicins in den Liposompräparaten. Obwohl eine solche Analyse qualitativ ist, kann das Auftreten von 5 % freiem Arzneimittel nachgewiesen werden, und eine Farbänderung wird für Systeme beobachtet, die mehr als 15 % freies Arzneimittel aufweisen.
Da das liposomale Doxorubicin visuell durch dieses Verfahren ohne die Verwendung irgendeiner wissenschaftlichen Ausrüstung bewertet werden kann, können die Proben unmittelbar vor der in vivo-Verwendung überprüft werden, um zu bestimmen, ob gefährliche Niveaus des freien Arzneimittels vorhanden sind oder nicht.
Die Nützlichkeit des spektrophotometrischen Testverfahrens mit einem antineoplastischen Arzneimittel kann bestimmt werden durch Aufzeichnung der Spektral-Shifts der Peaks als Funktion des pH der Bad-Flüssigkeit.
Die Liposome, die das Arzneimittel enthalten, können dann aufgebrochen werden, und das freigesetzte Arzneimittel im gleichen Bereich gemessen werden, z.B., im sichtbaren, ultravioletten oder infraroten Bereich. Die Extinktionsdifferenz kann quantitativ, wie für die Doxorubicinprobe oben bestimmt und der Prozentsatz des freien Arzneimittels in der Probe berechnet werden.
Zusammen mit dem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das 3-Ampullensystem auch eine vierte Testampulle einschließen, die eine Einschlußindikatorlösung enthält, die in der spektrophotometrischen Test-Ausführung der Erfindung verwendet wird, z.B., als ein alkalisierende Mittel wie 0,1 N- Natriumhydroxid (NaOH), das den Einschluß von Doxorubicin testet. Ein Aliquot (0,5 ml) des verdünnten liposomalen Doxorubicinpräparates, das in der Ampulle 3 enthalten ist, wird zu der NaOH-Lösung gegeben, und die resultierende Farbe mit einer bereitgestellten Farbtafel verglichen. Alternativ kann die Extinktion der resultierenden Lösung spektrophotometrisch abgelesen werden. Abhängig vom Grad des Einschlusses wird die Reaktion des Doxorubicins mit dem Natriumhydroxid zu einer roten bis blauen Farbe führen. Der Grad der roten oder blauen Farbe ist abhängig vom Einschluß.
Es ist darauf hinzuweisen, daß die vorliegende Erfindung durch die vorgeschlagenen Verpackungssysteme nicht beschränkt wird, sondern, andere Systeme, die irgendeine Mehrkammerverpackung, Mischungsvorrichtungen und Techniken, die bekannt sind, können mit ähnlichen Resultaten angewendet werden.

Liposomale Dehydratisierung und Lagerung

Die Liposome, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung gebildet werden, können lyophilisiert oder dehydratisiert werden an verschiedenen Stufen ihrer Bildung. Z.B. kann der Lipid-Film nach der Entfernung des Lösungsmittels und vor der Zugabe des Arzneimittels lyophilisiert werden. Alternativ kann der Lipid-Arzneimittelfilm vor der Dehydratisierung der Liposome gefriergetrocknet werden. Eine solche Dehydratisierung kann durchgeführt werden, indem man das Lipid oder Liposom einem verringerten Druck aussetzt, wodurch das gesamte suspendierende Lösungsmittel entfernt wird. Die Liposome können in Gegenwart eines hydrophilen Mittels entsprechend der Verfahren von Bally et al., PCT-Veröffentlichungsnr. 86/01102, veröffentlicht am 27. Februar 1986 mit dem Titel "Encapsulation of Antineoplastic Agents in Liposomes", und Janoff et al., PCT- Veröffentlichungsnr. 86/01103, veröffentlicht am 27. Februar 1986, mit dem Titel "Dehydrated Liposomes", oder Schneider et al., in U.S. Patent Nr. 4.229.360, erteilt am 29. Oktober 1980 dehydratisiert werden. Alternativ oder zusätzlich können die hydratisierten Liposomenpräparate auch dehydratisiert werden durch Anordnen in einem Umgebungsmedium von flüssigem Stickstoff und Ausfrieren vor dem Dehydratisierungsschritt. Die Dehydratisierung mit vorherigem Einfrieren kann durchgeführt werden in Gegenwart einer oder mehrerer Schutzmittel wie Zucker in dem Präparat, entsprechend der Techniken von Bally, et al., PCT-Anmeldungsnr. 86/01103, veröffentlicht am 27. Februar 1986. Solche Techniken verbessern die Langzeitlagerung und Stabilität der Präparate. Z.B. kann das liposomale antineoplastische Mittel mit einer Zuckerlösung in einem Zucker:Lipid Gew./Gew.- Verhältnis von 0,5 : 1 bis 50 : 1, bevorzugt ungefähr 20 : 1 vermischt werden. Nach der Rehydratisierung behalten solche Liposome im wesentlichen das gesamte vorher geladene antineoplastische Mittel, für solche Liposome, die über 100 und 200 nm Porengrößen-Filter klassiert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zucker Manitol oder Manitol : Glucose : Lactose in einem 2 : 1 : 1 Gew./Gew./Gew.-Verhältnis. Nach der Rehydratisierung in destilliertem Wasser wird das Präparat bevorzugt für 10 Minuten auf eine erhöhte Temperatur, z.B. 60ºC erhitzt. Andere geeignete Verfahren können verwendet werden in der Dehydratisierung der oben offenbarten Liposomenpräparate. Die Liposomen können auch ohne vorheriges Gefrieren dehydratisiert werden.
Sind die Liposome einmal dehydratisiert, können sie für ausgedehnte Zeiträume bis zu ihrer Verwendung gelagert werden. Eine geeignete Temperatur zur Lagerung wird abhängen von der Lipid-Formulierung der Liposome und der Temperaturempfindlichkeit der eingeschlossenen Materialien. Z.B. sind verschiedene antineoplastische Mittel wärmelabil und die so dehydratisierten Liposome, die solche Mittel enthalten, sollten unter Kühlbedingungen, z.B. bei ungefähr 4ºC gelagert werden, so daß die Wirksamkeit des Mittels nicht verlorengeht. Auch wird für solche Mittel das Dehydratisierungsverfahren bevorzugt bei einer verringerten Temperatur, eher als bei Raumtemperatur, durchgeführt.
Wenn die dehydratisierten Liposome zu verwenden sind, wird die Rehydratisierung durch einfaches Zugeben einer wäßrigen Lösung, z.B. destilliertes Wasser oder ein geeigneter Puffer, zu den Liposomen erreicht, und diese werden dann rehydratisieren gelassen. Die Liposome können erneut in der wäßrigen Lösung durch mildes Rühren der Lösung suspendiert werden. Die Rehydratisierung kann durchgeführt werden bei Raumtemperatur oder bei anderen Temperaturen, die für die Zusammensetzung der Liposome und deren innere Bestandteile geeignet sind. Wenn das antineoplastische Mittel, das zu verabreichen ist, in die Liposome mit hohem Arzneimittel zu Lipid-Verhältnis- vor der Dehydratisierung eingeführt wurde, und keine weitere Zusammensetzungsveränderung gewünscht wird, können die rehydratisierten Liposome direkt in der Krebstherapie nach bekannten Verfahren zur Verabreichung von Liposomen-eingehüllten Arzneimitteln verabreicht werden. Alternativ können unter Verwendung des oben beschriebenen Transmembran-pH-Gradienten-Verfahrens ionisierbare antineoplastische Mittel in die rehydratisierten Liposome unmittelbar vor der Verabreichung eingeführt werden. Im Zusammenhang mit diesem Ansatz kann der Konzentrationsgradient, der zur Erzeugung des Transmembran-pH-Gradienten verwendet wird, entweder vor der Dehydratisierung oder nach der Rehydratisierung unter Verwendung der oben beschriebenen äußeres Medium-Austauschtechniken gebildet werden. Z.B. können die Arzneimittel zu Lipid-Hochverhältnis-Liposome vor Einrichten des Transmembran-pH-Gradienten dehydratisiert werden, z.B. von ihrem ersten äußeren Medium dehydratisiert werden. Nach der Rehydratisierung kann der pH-Gradient durch Mischen der Liposome mit dem zweiten äußeren Medium mit relativ saurem oder basischen pH eingerichtet werden. Das antineoplastische Mittel kann mit den Liposomen gleichzeitig oder nach der Einrichtung des pH-Gradienten vermischt werden.
In dem Fall, worin die Liposome nach Vorliegen eines Transmembran-pH-Gradienten dehydratisiert werden, können die Liposome rehydratisiert werden durch Mischen derselben mit einer wäßrigen Lösung von neutralem pH.
Z.B. würde in dem oben erwähnten Fall, bei dem Liposome, die Zitronensäurepuffer als erstes äußeres Medium enthalten, verwendet werden, der Rehydratisierungsschritt durch Zugeben von Natriumcarbonat und dem antineoplastischen Mittel, wie Doxorubicin, erfolgen. Wenn Liposome, die bereits die Base (z.B. Natriumcarbonat) enthalten, und daher bereits den Transmembran-pH-Gradienten aufweisen, rehydratisiert werden, werden Wasser oder andere neutrale wäßrige Lösungen und Doxorubicin hinzugegeben. Schließlich läuft in Fällen, wo Liposome mit einem Transmembran-pH-Gradienten, die Doxorubicin enthalten, dehydratisiert wurden, die Rehydratisierung unter Verwendung von Wasser oder einer anderen wäßrigen Lösung ab. Alternativ kann ein anderes antineoplastisches Mittel, falls gewünscht, hinzugesetzt werden.
Die die antineoplastischen Mittel enthaltenden Liposome und deren pharmazeutische Formulierungen der vorliegenden Erfindung und diejenigen, die durch ihre Verfahren hergestellt wurden, können therapeutisch an Tieren (einschließlich Menschen) in der Behandlung von Infektionen oder Erkrankungen verwendet werden, die erfordert: (1) wiederholte Verabreichungen, (2) verzögerte Freisetzung des Arzneimittels in seiner biologisch wirksamen Form oder (3) verringerte Toxizität mit geeigneter Wirksamkeit verglichen mit dem fraglichen freien Arzneimittel. Solche Erkrankungen schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Tumore, wie diejenigen die mit antineoplastischen Mitteln behandelt werden können. Die Verabreichungsart der die antineoplastischen Mittel enthaltenden Liposome und die pharmazeutischen Formulierungen davon kann die Orte und Zellen in dem Organismus, an den die Verbindung abgegeben wird, bestimmen. Die Liposome der vorliegenden Erfindung können allein verabreicht werden, werden aber im allgemeinen in Mischung mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, der im Hinblick auf die beabsichtigte Route der Verabreichung und der üblichen pharmazeutischen Praxis ausgewählt wird. Die Präparate können parenteral injiziert werden z.B. intravenös. Für die parenterale Verabreichung können sie z.B. in Form steriler wäßriger Lösungen verwendet werden, die andere gelöste Stoffe enthalten, z.B. genügend Salze oder Glucose, um die Lösung isotonisch zu machen. Die Doxorubicinliposome können z.B. als 60 Minuten intravenöse Infusion mit einer Dosis von mindestens ungefähr 20 mg/m² gegeben werden. Sie können auch als Peritoneallavage oder als Intrathekalverabreichung via Injektion angewendet werden. Sie können auch subkutan z.B. am Ort der Lymphknotenmetastasen verabreicht werden. Weitere Verwendungen können abhängig von den besonderen Eigenschaften der Präparate durch die Fachleute in Betracht gezogen werden.
Für die orale Verabreichung können die liposomalen antineoplastischen Arzneimittelformulierungen dieser Erfindung in Form von Tabletten, Kapseln, Losenges, Pastillen, Pulver, Sirups, Elixiere, wäßrige Lösungen und Suspensionen und ähnliches verwendet werden. Im Fall von Tabletten schließen Träger, die verwendet werden können, Lactose, Natriumcitrat und Salze der Phosphorsäure ein. Verschiedene Abbaumittel wie Stärke und Gleitmittel wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk werden gewöhnlich in Tabletten verwendet. Für die orale Verabreichung in Kapselform sind nützliche Verdünnungsmittel Lactose und hochmolekulargewichtige Polyethylenglykole. Wenn wäßrige Suspensionen für die orale Verwendung erforderlich sind, wird das aktive Mittel mit emulgierenden und suspendierenden Mitteln kombiniert. Falls gewünscht, können bestimmte Süß- und/oder Aromastoffe hinzugegeben werden.
Für die topische Verabreichung kann die liposomale antineoplastische Arzneimittelformulierung der vorliegenden Erfindung in solchen Dosierungsformen enthalten sein, wie Gelen, Ölen, Emulsionen und ähnliches. Solche Präparate können durch direkte Anwendung als Creme, Paste, Salbe, Gel, Lotion oder ähnliches verabreicht werden.
Für die Verabreichung an Menschen in der heilenden, remissiven, retardierenden oder prophylaktischen Behandlung von Tumorerkrankungen wird der verschreibende Arzt endgültig die geeignete Dosis des antineoplastischen Arzneimittels für ein gegebenes menschliches Subjekt bestimmen, und es kann erwartet werden, daß diese entsprechend dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des Individuums ebenso wie der Natur und Schwere der Erkrankung des Patienten variieren wird. Die Dosierung des Arzneimittels in der liposomalen Form wird im allgemeinen ungefähr derjenigen entsprechen, die für das freie Arzneimittel verwendet wird. In einigen Fällen kann es jedoch notwendig sein, Dosierungen außerhalb dieser Grenzen zu verabreichen.
Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Veranschaulichung gegeben und sollen keine Beschränkung des Umfangs der Erfindung darstellen.

Beispiel 1

Zitronensäure (1,0 ml, 150 mM, pH 4,0) wurde zu 200 mg EPC/Cholesterin (Molverhältnis 1 : 1) in ein Teströhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde verwirbelnd gemischt für 5 Minuten, um die Lösung homogen zu dispergieren und MLVs zu bilden. Die Probe wurde in eine Tieftemperaturampulle mit 2,0 ml Kapazität überführt, in flüssigen Stickstoff für 2 Minuten eingetaucht und dann bei 40ºC in einem Wasserbad erhitzt, bis die Probe vollständig geschmolzen war. Dieser Gefrier-Tau-Zyklus wurde 7- mal mit kurzem verwirbelnden Mischen der Probe unmittelbar vor dem Gefrierschritt wiederholt, um FATMLVs zu bilden. Die Probe wurde dann 7-mal durch 2 übereinandergestapelte 0,2 um-Polycarbonatfilter entsprechend dem LUVET-Verfahren extrudiert. Diese Probe wurde 2-fach mit ungepufferter 0,85 %iger Salzlösung verdünnt. Die Liposomenlösung wurde auf 60ºC für 5 Minuten vorerhitzt und zu einer Ampulle gegeben, die gepulvertes Doxorubicin (22,2 mg dox/100 mg Lipid) und gepulvertes Natriumcarbonat (3,75 mg/22,2 mg dox) enthielt. Die Probe wurde auf 60ºC für 5 Minuten erhitzt und mit Unterbrechungen verwirbelnd gemischt.

Beispiel 2

Den Verfahren von Beispiel 1 wurde gefolgt unter Verwendung von 300 mM Zitronensäure (pH 4,0) und einer Lipid-Konzentration von 100 mg/ml. Die Liposome wurden nicht mit Salzlösung verdünnt, und Natriumbicarbonat wurde als Verdünnungsmittel hinzugegeben, wodurch der äußere pH auf ungefähr pH 8,0 vor der Doxorubicinzugabe gebracht wurde.

Beispiel 3

Liposome, deren aktiv eingeschlossenes Doxorubicin hergestellt wurde durch Hydratisieren eines EPC-Films (aus CHCl&sub3; getrocknet, und für 12 h in ein Hochvakuum gegeben) in 300 mM Zitronensäurepuffer (pH 4,0), um eine endgültige Lipid-Konzentration von 100 mg/ml zu erreichen. Diese MLVs wurden 5-mal gefroren und getaut und 5-mal durch Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 0,2 um (bzw. um) entsprechend der LUVET- Technik extrudiert. Die Liposome wurden dann auf pH 7,5 mit 1, M Na&sub2;CO&sub3; eingestellt und mit Doxorubicin bei 60ºC für 5 Minuten inkubiert.
Liposome, die Doxorubicin passiv eingeschlossen, unter Verwendung der obigen Materialien hergestellt wurde, durch Suspendieren von Doxorubicin in einem Puffer (20 inm HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5) auf 2,0 mM Doxorubicin vor dem Lipid-Hydratisierungsschritt. Die Liposome wurden gefroren und getaut und wie oben extrudiert. Der aktive Einschluß des Doxorubicins wurde vervollständigt durch Herstellen von Vesikeln in einem Puffer bei pH 4,0, Erhöhen des äußeren pH auf 7,5 mit 1,0 M Na&sub2;CO&sub3; und Inkubieren der Vesikel (20 mM Lipid) mit Doxorubicin (10 mg Lipid/ml) bei 60ºC für 5 Minuten.
Um die Einschlußausbeute der Liposomenpräparate zu bestimmen, wurden freies und Liposomen-eingeschlossenes Doxorubicin spektrophotometrisch unter Verwendung eines Shimadzu UV-160- Spektrophotometers in der folgenden Weise bestimmt: die liposomalen Doxorubicinproben wurden mit 20 mM HEPES, 250 mM NaCl (pH 7,5) verdünnt, um eine ungefähr Doxorubicinkonzentration zwischen 0,05 bis 0,10 mM zu erhalten. Die folgende Meßsequenz wurde durchgeführt; (1) die Extinktion bei 600 nm der verdünnten Probe wurde auf 0 eingestellt; (2) die Probe wurde mit 1,0 N NaOH (0,02 ml/1,0 ml der Probe) auf pH 10,5 alkalisch gemacht, und dann wurde die Extinktion bei 600 nm innerhalb von 2 Minuten aufgezeichnet; (3) das Spektrophotometer wurde gegen eine 0,2 %ige Triton X-100 Lösung auf 0 gestellt und (4) die Extinktion bei 600 nm der liposomalen Doxorubicinprobe, zu der Triton X-100 hinzugegeben worden war, (0,02 ml, 20 % Triton X- 100 Gew./Gew./1,0 ml der Probe) wurde bestimmt. Die frei: gesamt-Doxorubicin-Verhältnisse wurden als Extinktion bei 600 nm nach NaOH-Zugabe, dividiert durch die Extinktion nach Triton X-100-Zugabe, berechnet.
Um die pH-abhängige spektrale Reaktionstechnik mit den tatsächlichen freien und eingeschlossenen Arzneimitteln in Beziehung zu setzen, wurde das Vesikel-eingeschlossene Doxorubicin wie folgt bestimmt: ein kleines Aliquot der liposomalen Doxorubicinlösung wurde über Sephadex G-50 Gel-Kolonnen, äquilibriert in 20 mM HEPES, 150 mM NaCl (pH 7,5) gegeben, um freies von Liposomen-assozuertes Arzneimittel zu trennen.
Der Liposomen-enthaltende Eluent, ebenso wie Aliqote der ursprünglichen Lösungen, wurden auf Phospholipid und Doxorubicin durch Phosphoranalyse bzw. optische Dichte bei 480 mM wie zuvor in Mayer et al., (1986), Biochim Biophys. Acta., 857 : 123 beschrieben, bestimmt.
Das obige Verfahren wurde unter Verwendung von EPC/Cholesterin (55 : 45, mol : mol) 10 mg pro ml Gesamtlipid wiederholt.

Beispiel 4

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 3 wurden angewendet, unter verwendung von Zitronensäurepuffer bei pH 4,2, 5,2, 5,7, 5,6 und 7,2. Fig. 5 zeigt, daß das Extinktionsverhältnis (Ex. 600 NaOH/Ex.&sub6;&sub0;&sub0; nach Triton X-100) exakt das Verhältnis von freiem/gesamt-Doxorubicin in den Vesikelpräparaten uber den vollen Bereich der Einschlußausbeuten darstellt.

Beispiel 5

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 3 wurden angewendet, aber die Einschlußausbeute der Doxorubicin-einhüllenden Liposome wurde aufgezeichnet durch Vergleich der Farbe, die aus der Zugabe eines Aliquots (0,2 ml) der Liposome zu 1,0 N NaOH resultierte. mit einer Farbtafel.

Beispiel 6

EPC/Cholesterin (55/45 mol/mol-Verhältnis) (200 mg) wurde zu einem dünnen Film von Chloroform unter vermindertem Druck bei 37ºC für 12 Stunden getrocknet. Zitronensäure (1,0 ml von 150 mM bei pH 4,0) wurde hinzugegeben, und der Film suspendiert. Die resultierenden MLVs wurden wie in Beispiel 1 7-mal gefroren und getaut und 5-mal durch einen 200 nm Polycarbonatfilter unter Verwendung der LUVET-Prozedur extrudiert. Die Größenverteilung der resultierenden Liposome wurden durch quasielastische Lichtstreuung (QELS) bestimmt, und die allgemeine Morphologie wurde beobachtet unter Verwendung der Gefrierbruchelektronenmikroskopie. Sterile Salzlösung (1,0 ml) wurde zu der extrudierten Vesikellösung gegeben, was eine Gesamtlipidkonzentration von 100 mg/ml ergab. Der äußere pH der Liposome wurde unter Verwendung von 1,0 N NaOH auf 7,5 titriert. Diese Liposomenlösung (1,0 ml) und gepulvertes Doxorubicin (22 mg) (die Na&sub2;CO&sub3; bei einem Gewichtsverhältnis von 1 mg/6 mg Doxorubicin enthielt) wurde dann auf 60ºC für 3 Minuten unter verwirbelndern Mischen mit Unterbrechungen erhitzt.

Beispiel 7

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 6 wurden angewendet, um die in vitro-Stabilität der Liposomen-Doxorubicin- Präparate zu bestimmen. Abgabeexperimente wurden wie folgt durchgeführt: 10-fach verdünnte Liposomenproben wurden für 24 Stunden gegen 1000 Volumen von 20 mM HEPES, 150 mM NaCl (pH 7,5) bei 37ºC dialysiert. Bei 1, 2, 4, 8, 10 und 24 Stunden nach der Herstellung wurden 150 ul Aliquote entfernt und das eingeschlossene Doxorubicin bestimmt.

Beispiel 8

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 3 wurden angewendet, ausgenommen, daß die Vesikel durch 1,0 Mikron- Porengröße-Filter eingestellt wurden, und die Serumstabilität der Proben bestimmt wurde. Die verdünnte liposomale Doxorubicinprobe wurde mit 20 Volumen frischem Humanserum verdünnt und bei 37ºC inkubiert. Bei 1, 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden wurden die Vesikel durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 Minuten pelletisiert, zweimal mit 20 mM HEPES, 150 mM NaCl bei pH 7,5 gewaschen und auf Phospholipid und Doxorubicin wie zuvor beschrieben getestet.

Beispiel 9

Die Einschlußausbeute der Doxorubicin-Liposome wurde wie folgt analysiert:
Nach Vervollständigung des Einschlußverfahrens nach Beispiel 6 wurden 20 ul der Doxorubicin-Liposome auf 200 ul mit 20 mM HEPES, 150 mM NaCl (pH 7,5) verdünnt. Ein Aliquot dieser verdünnten Probe (20 ul) wurde auf Lipid-Phosphat durch das Verfahren von Bartlett, J. Biol. Chem. 1959, 234:466-468 untersucht. Eine zweite 20 ul Probe des verdünnten Präparates wurde entfernt und in eine Glasteströhre gegeben, zu der Triton X-100 (1,0 ml, 1 % Gew./Gew.) hinzugegeben wurde. Die Probe wurde in einem Wasserbad bei 40ºC für 2 Minuten erhitzt und verwirbelnd gemischt. Die Extinktion der Probe wurde bei 480 nm mit einem Spektrophotometer abgelesen. Die Probenablesungen wurden verglichen mit der Standardkurve von Doxorubicinproben, die bekannte Mengen des Mittels enthielten, die mit 1,0 ml Triton X-100 verdünnt worden waren.
Sephadex G-50-(Mediumgrad)-Kolonnen wurden hergestellt bei 1,0 ml Kapazität, die mit Gel in 20 mM HEPES, 150 mM NaCl (pH 7,5) vorgequollen waren. Die Kolonnen wurden bei 500 x g für 3 Minuten zentrifugiert, gefolgt wiederholtem Verwirbeln, um die Kolonnen zu packen. Doxorubicin-Liposomenproben (150 ul der 10 x verdünnten Proben) wurden an den Kolonnen angewendet, gefolgt von der Anwendung von 50 ul Puffer und bei 3000 upm für 5 Minuten zentrifugiert. Das Eluierungsmittel wurde verwirbelnd bis zur Homogenität gemischt. Aliquote (25 ul) wurden entfernt und auf Phosphat und Doxorubicin wie oben beschrieben analysiert.

Beispiel 10

Den Materalien und Verfahren von Beispiel 2 wurde gefolgt, und die resultierenden Liposome wurden für die Injektion hergestellt durch Mischen derselben in steriler physiologischer Salzlösung, so daß eine 5 mg Dosis in 0,2 ml verabreicht werden konnte.
DBA/2 Mäuse, die 18-20 g wogen, wurden erhalten und in Gruppen von 6 bis 10 geteilt. Diesen Mäusen wurden i.p. Injektionen (0,5 ml) von 1,5 x 10&sup6; L1210-Tumorzellen gegeben. Die Behandlung wurde 24 Stunden nach der Tumorinjektion gestartet und via die laterale Schwanzvene verabreicht. Die Tiere wurden mit liposomalem Doxorubicin basierend auf einem durchschnittlichen Körpergewicht behandelt. Die Mäuse wurden täglich gewogen. Die Überlebenszeit wurde in Tagen aufgezeichnet und die Durchschnitts- und die Median-Überlebenszeiten wurden berechnet.
Das obige Verfahren wurde wiederholt mit der Behandlung, bei der EPC/Cholesterol und DSPC/Cholesterin, beide im 55:45 Molverhältnis, liposomales Doxorubicin verabreicht wurde, mit der Kontrollbehandlung mit steriler Salzlösung und der Kontrollbehandlung mit leeren (Doxorubicin-freien) Liposomen.

Beispiel 11

LD&sub5;&sub0;-Untersuchungen, die freies und liposomales Doxorubicin verglichen, wurden wie folgt durchgeführt:
CD-1 Mäuse mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 bis 25 g wurden in Gruppen von 6 bis 10 eingeteilt. Doxorubicin wurde in steriler injizierbarer Salzlösung gelöst, um eine 200 ul Volumen-Dosis zu ergeben. Die Dosierungen wurden via Schwanzveneninjektion mit 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Nach der Injektion wurde das Körpergewicht und die Sterblichkeiten über 7 und 14 Tage aufgezeichnet.
Den Mäusen wurde ähnlich liposomales Doxorubicin hergestellt nach Beispiel 5 unter Verwendung von EPC : Cholesterin in einem 55 : 45 Molverhältnis unter Verwendung von USP-Grad- Reagentien injiziert. Die Verdünnungen der Liposome wurden durchgeführt, um die geeignete Dosis des Doxorubicins wie oben mit steriler Salzlösung zu verabreichen. Wie oben wurde den Mäusen ein Gesamtvolumen von 200 ul in die Schwanzvene injiziert, um eine Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht zu ergeben. Nach der Injektion wurde das Körpergewicht und die Sterblichkeiten über 7 bzw. 14 Tage aufgezeichnet.
Das obige wurde unter Verabreichung von freiem Doxorubicin in 15, 20, 25, 30 und 40 mg/kg Körpergewichtsdosen von Doxorubicin wiederholt.
Das obige wurde mit liposomalem Doxorubicin für 20, 30, 40, 50, 60 und 80 mg/kg wiederholt.

Beispiel 12

EPC/Cholesterin (2,1 : 1 Gew.-Verhältnis) wurde in 150 mM Zitronensäure (pH 4,0) dispergiert, um 200 mg Gesamtlipid/ml Puffer zu ergeben. Die resultierenden MLVs wurden 7-mal unter verwirbelndem Mischen vor jedem Gefrierschritt gefroren und getaut. Die resultierenden FATMLVs wurden 5-mal durch zwei übereinanderliegende 0,2 um Porengröße-Filter extrudiert, um VET&sub2;&sub0;&sub0;s herzustellen. Die Liposome wurden dann 2-fach mit ungepufferter Salzlösung verdünnt, und der pH mit 1 N NaOH auf 7,5 gebracht. Das Äquivalent von 1,0 ml der Liposome vor der pH-Einstellung wurde zu 133 mg Doxorubicin/Lactose und 3,7 mg Na&sub2;CO&sub3;, die in einer versiegelten Ampulle (20 ml Kapazität) enthalten waren, gegeben. Beide, die Liposome und die Doxorubicin-enthaltende Ampulle wurden auf 60ºC für 5 Minuten vor dem Vermischen erhitzt. Nach dem Vermischen wurden die Liposome auf 60ºC für 5 Minuten unter verwirbelndem Mischen jede Minute erhitzt. Die Probe wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt. Ein Aliquot der Probe (50 ul) wurde entfernt und auf 0,5 ml mit 20 mM HEPES, 150 mM NaCl (pH 7,5) verdünnt. Ein Aliquot dieser Probe (150 ul) wurde einer 1,0 ml Sephadex G-50 Kolonne wie vorher beschrieben zugeführt. Phosphat und Doxorubicin wurden quantitativ wie zuvor beschrieben in dem Eluierungsmittel und den ursprünglichen Proben bestimmt.

Beispiel 13

VET&sub2;&sub0;&sub0; Proben wurden entsprechend von Beispiel 12 unter Verwendung von EPC/EPG/Cholesterin (0,95/0,05/1,0 Molverhältnis) bei 200 mg Gesamtlipid in 150 mM Zitronensäure (pH 4,0) hergestellt. Die Proben wurden 2-fach mit ungepufferter Salzlösung verdünnt, und der äußere pH der Liposome wurde mit 1,0 N NaOH auf 7,5 eingestellt. Nach der Inkubation dieses Präparates für 5 Minuten bei 60ºC wurde ein Aliquot (3,5 ml) zu 70 mg Doxorubicin gegeben, das 11,7 mg Na&sub2;CO&sub3; enthielt. Die Probe wurde mit Unterbrechungen aufgewirbelt, während sie bei 60ºC für 5 Minuten inkubiert wurde.

Beispiel 14

Ein Film aus hydriertem Soja-PC (HSPC) und Cholesterin (HSPC/Cholesterin 2,4 : 1 Gewichtsverhältnis, 400 mg Gesamtlipid) wurde mit 4,0 ml 300 mM Zitronensäure bei pH 4,0 unter Bildung von MLVs hydratisiert. Diese Lösung wurde 5-mal durch einen 0,2 um Porengrößen-Filter extrudiert. Ein Aliquot von Natriumbicarbonat wurde zu den extrudierten Liposomen gegeben, um den pH auf 8,5 +/- 0,2 einzustellen. Eine Ampulle, die 10 mg Doxorubicin und die Liposome enthielt, wurde bei 60ºC für 3 Minuten vorerhitzt. Ein Aliquot (0,5 ml) der Liposome wurde zu der Doxorubicin-Ampulle gegeben, verwirbelnd gemischt und für 15 Minuten bei 60ºC inkubiert. Der Farbtest, der in Beispiel 5 beschrieben wurde, ergab eine Einschlußausbeute von mehr als 95 %.

Beispiel 15

MLVs wurden hergestellt aus EPC : Cholesterin (2,4 : 1 Gew.-Verhältnis) und 300 mM Zitronensäure/250 mM Lactose, pH 4,0, um 100 mg Gesamtlipid pro ml zu ergeben. Diese MLVs wurden 5-mal durch einen Gelman 0,2 um-Ausschlußgrößen-Tuffryn (Windungsweg)-Filter extrudiert. Ein Aliquot (1,0 ml) dieser Liposome wurde in eine 9 ml Kimax-Test-Röhre gegeben und im Vakuum für 48 Stunden getrocknet. Um das Präparat zu rehydratisieren, wurden 950 ul Wasser zu dem Präparat gegeben.

Beispiel 16

Freisetzungseigenschaften von Liposomaldoxorubicin wurden wie folgt bestimmt:
EPC/Cholesterin (55/45 Molverhältnis) wurde aus Chloroform zu einem dünnen Film auf einem 500 ml-Rundkolben (400 mg Gesamtlipid) getrocknet. Der Film wurde mit 4,0 ml 300 mM Zitronensäure bei pH 4,0 unter Bildung von MLVs hydratisiert. Diese MLVs wurden über zwei übereinandergelagerte 0,22 um Nucleopore-Membrafil-Filter, gefolgt von der 10-maligen Extrusion durch einen 0,1 um Nucleopore-Membrafil (Windungsweg)- Filter extrudiert. Auf 1,0 ml der resultierenden Filtratprobe wurden 275 ul 1M Na&sub2;CO&sub3; gegeben, was den äußeren pH auf 8,3 erhöhte. Ein Aliquot (0,6 ml) wurde für 3 Minuten auf 60ºC erhitzt, ebenso wie eine 10 mg Probe von Doxorubicin. Das Liposomenaliguot wurde zu den 10 mg Doxorubicin gegeben und bei 60ºC für 5 Minuten erhitzt. Die Probe wurde in zwei Teile geteilt. Teil 1 wurde 10-fach mit 30 mM HEPES, 150 mM NaCl bei pH 7,5 verdünnt. Teil 2 wurde 10-fach mit 300 mM Zitronensäure bei pH 4,0 verdünnt. Beide Proben wurden in Dialysetaschen gegeben und bei 37ºC gegen 1000 Volumen ihrer jeweiligen Puffer dialysiert. Nach einer Stunde wurden 150 ul Aliquot entfernt und auf Doxorubicin und Lipid-Phosphat, wie zuvor beschrieben, nach Passieren über eine 1,0 ml Sephadex-Kolonne, die mit dem jeweiligen Puffer äquilibriert worden war, analysiert.
Das obige Verfahren wurde wiederholt mit der Entfernung der Probe aus den Dialysetaschen bei 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden.
Das obige Verfahren wurde unter Verwendung von Liposomen aus EPC/Cholesterin/alpha-Tocopherol (55/45/1) wiederholt.

Beispiel 17

Die Wechselwirkung von Doxorubicin mit Citrat wurde wie folgt bewertet:
Doxorubicin wurde bei 25ºC zu 0,5 ml 20 mM HEPES, 15 mM NaCl Puffer, pH 7,5 gegeben, um eine 4 mM Doxorubicinlösung zu ergeben. Die Probe wurde zentrifugiert, um irgendeine Fällung zu pelletisieren, und die überstehende Lösung wurde auf Doxorubicin durch die zuvor beschriebenen spektrophotometrischen Verfahren untersucht
Das obige Verfahren wurde unter Verwendung der folgenden Puffer wiederholt: 300 mM Na-Citrat, pH 4,0; 300 mM Na-Citrat, pH 5,0; 300 mM-Na Citrat, pH 6,0; und 300 mM Na-Citrat, pH 7,5.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 aufgezeichnet, eine Darstellung der Citrat-Doxorubicin-Wechselwirkung, die aus Mischungsexperimenten bei verschiedenen Citrat-pH-Werten resultiert. Das mM Doxorubicin, das in der Lösung nach der Zentrifugation verbleibt, ist aufgezeichnet als Funktion des Citrat-pH: 4 mM Doxorubicin, gemischt bei 60ºC, dann auf 25ºC abgekühlt (geschlossene Quadrate); 4 mM Doxorubicin, gemischt bei 25ºC (offene Quadrate); 20 mM Doxorubicin, gemischt bei 60ºC, dann auf 25ºC abgekühlt (geschlossene Kreise); und 4 mM Doxorubicin, gemischt in 20 mM/HEPES, 150 mM NaCl bei 25ºC zum Vergleich (offene Kreise).

Beispiel 18

Den Verfahren von Beispiel 17 wurde bei den folgenden Temperaturbedingungen des Mischens gefolgt: 60ºC für 5 Minuten, dann auf 25ºC abgekühlt; und 60ºC für 5 Minuten, dann auf 25ºC abgekühlt unter Verwendung von 20 mM Doxorubicin.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 aufgezeichnet, eine Darstellung der Citrat-Doxorubicin-Wechselwirkung, die aus Mischungsexperimenten mit variierenden Citrat-pH-Werten resultiert. Das mM Doxorubicin, das in der Lösung nach Zentrifugation verbleibt, ist aufgezeichnet als Funktion des Citrat-pH: 4 mM Doxorubicin, gemischt bei 60ºC, dann abgekühlt auf 25ºC (geschlossene Quadrate); 4 mM Doxorubicin, gemischt bei 25ºC (offene Quadrate); 20 mM Doxorubicin, gemischt bei 60ºC, dann auf 25ºC abgekühlt (geschlossene Kreise); und 4 mM Doxorubicin, gemischt in 20 mM/HEPES, 150 mM NaCl, bei 25ºC zum Vergleich (offene Kreise).

Beispiel 19

EPC und Cholesterin (55 : 45 Molverhältnis), Gesamtlipid 100 mg Lipid pro ml Puffeüwurden zu einem dünnen Film auf den Wänden eines Reaktionsgefäßes getrocknet und mit 300 mM Citrat pH 4,0 hydratisiert. Die resultierenden MLVs wurden in ihrer Größe verringert, in dem sie 10-mal über einen 0,22 um Nucleopore-Membrafil-Filter gegeben wurden. Ein Aliqout von Natriumcarbonat (1,0 ml) wurde zu den resultierenden Liposomen gegeben, um den äußeren pH auf 8,3 einzustellen. Die Suspension wurde bei 60ºC für 10 Minuten inkubiert. Doxorubicin wurde zu diesen Liposomen gegeben, um 29 ± 2 mg Doxorubicin pro 100 mg Gesamtlipid zu ergeben, und die Suspension wurde bei 60ºC für 10 Minuten inkubiert. Die liposomale Doxorubicinsuspension wurde an Mäuse entsprechend den Verfahren von Beispiel 10 verabreicht

Beispiel 20

Den Verfahren und Materialien von Beispiel 19 wurde gefolgt, wobei nach der Größenreduktion zusätzliche Schritte durchgeführt wurden. Die Liposomensuspension wurde 10-mal über einen 0,1 um Nucleopore-Membrafil-Filter und dann 10-mal über 2 übereinander gelagerte 0,1 um Nucleopoer-Membrafil-Filter gegeben. Der LD&sub5;&sub0; für die resultierende liposomale Doxorübicin- Suspension wurde entsprechend Beispiel 10 bestimmt.

Beispiel 21

Liposome, die DSPC enthielten, wurden hergestellt durch Dehydratisieren eines Lipid-Films (aus Methylenchlond für 12 Stunden unter Hochvakuum getrocknet) in 300 mM Zitronensäure pH 4,0, um 100 mg Gesamtlipid pro ml Zitronensäurelösung zu erhalten. Die resultierenden MLVs wurden 7-mal in flüssigem Stickstoff gefroren und getaut und für mehrere Minuten bei 60ºC erhitzt, dann 5-mal über Polycarbonatfilter mit 0,2 um Porengröße unter Verwendung einer Thermomantel-LUVET-Extrusionsvorrichtung extrudiert. Der äußere pH dieser extrudierten Liposome wurde dann auf pH 7,8 mit Natriumhydroxid titriert. Diese Liposomenlösung wurde dann auf 60ºC für 3 Minuten erhitzt, dann mit Doxorubicin kombiniert zu einem Arzneimittel zu Lipid- Verhältnis von 0,25 : 1 und bei 60ºC für 5 Minuten unter verwirbelndem Mischen erhitzt. Nichteingeschlossenes Doxorubicin wurde aus dem Präparat entfernt, indem 150 ul der Probe über 1 ml Sephadex G-50-Kolonne, äquilibriert in gepufferter Salzlösung, gegeben wurden. Dieses Verfahren führte zu einer Einschlußausbeute von mehr als 95 %.

Beispiel 22

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 21 wurden verwendet, worin der pH der resultierenden Liposome mit Natriumcarbonat (1,0 M) auf pH 8,0 eingestellt wurde, und bei 60ºC gehalten wurde.

Beispiel 23

Die Verfahren und Materialien von Beispiel 22 wurden wiederholt unter Verwendung von 100 mg/ml DPPC/Cholesterin (55 : 45 Molverhältnis in einem endgültigen Arzneimittel zu Lipid- Verhältnis (Gew./Gew.) von 0,20).

Beispiel 24

Weibliche DBA/2-Mäuse, die 18-22 g wogen, wurden in Gruppen von 6 bis 10 via i.p. Injektionen von 1,5 x 10&sup6; L1210- Tumorzellen, suspendiert in 0,5 ml RPMI 1640, inokuliert. Die L1210-Zellinie wurde durch Aufrechterhalten durch aufeinanderfolgenden Durchlauf von Ascitesflüssigkeit oder als gefrorene (Flüssig N&sub2;)-Kultur erhalten. Ohne Behandlung entwickelten die Mäuse einen 2 bis 5 g-Ascitis-Tumor innerhalb von 7 bis 8 Tagen und hatten eine durchschnittliche Überlebenszeit von 8 bis 10 Tagen. Liposome, die nach Beispiel 22 hergestellt worden waren, wurden verwendet; die Behandlung wurde einen Tag nach der Tumorinjektion gestartet und als einfache i.v.-Dosis via die laterale Schwanzvene verabreicht. Die Tiere wurden mit freiem oder liposomalem Doxorubicin bei 5 mg/kg Doxorubicin behandelt. Kontrollgruppen wurden entweder mit steriler Salzlösung oder leeren Liposomen mit einer Lipid-Dosis, die äquivalent zu der war, die der höchsten Dosis des liposomalen Doxorubicins entsprach. Die Mäuse wurden einen Tag vor der Tumor-Injektion gewogen und die Gewichte wurden täglich aufgezeichnet, bis der erste Tod in der Gruppe eintrat. Die Überlebenszeiten wurden in Tagen nach der Tumor-Injektion aufgezeichnet. Die Durchschnitts- und Median-Überlebenszeiten und statistische Signifikanz der Ergebnisse wurde bestimmt unter Verwendung eines Zweienden-Wilcoxon-Einstufungstest (randomisierter Zwei-Gruppen- Aufbau) [two-tailed Wilcoxon's ranking test (randomized twogroup design)].
Das obige wurde mit 10, 20, 30 und 40 mg/kg freiem und liposomalem Doxorubicin wiederholt.

Beispiel 25

Liposome wurden entsprechend dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt. Wenn das P388-Leukämiemodell angewendet wurde, wurden Tumorzellen (1 x 10&sup5; in 0,1 ml i.p. in weibliche CDF-1- Mäuse injiziert. Einen Tag nach der Tumor-Inokulation wurden die Mäuse mit liposomalem Doxorubicin via Schwanzveneninjektion (5 mg/kg Dosis) behandelt. Die Dosis wurde entsprechend dem Durchschnittsgewicht jeder Gruppe berechnet, und die Gewichte wurden bestimmt am Tag 0 (Tag der Tumorinjektion) und Tag 5. Die Todesfälle wurden täglich aufgezeichnet.
Das obige wurde bei 10 und 20 mg/kg wiederholt.
Das obige Verfahren wurde mit Mäusen durchgeführt, denen man entweder Salzlösung, leere Liposome oder Doxorubicin durch Schwanzinj ektion injizierte.

Beispiel 26

Liposome wurden entsprechend der Verfahren von Beispiel 2 unter Verwendung von EPC/Cholesterin (55 : 45 Molverhältnis) hergestellt. Mehr als 98 % des Arzneimittels wurde in den Liposomen eingeschlossen.
Männlichen Shinogimäusen (25 - 40 g, 9 pro Gruppe) wurden subkutan 1 x 10&sup5; SC-115 Zellen injiziert, die aus einem Primärtumor in zuvor inokulierten Mäusen erhalten worden waren. Das Tumorwachstum wurde aufgezeichnet durch Abtasten und Tumormessungen mit einem Vernier-Tastzirkel. Nach dem Wachstum des Tumors auf 0,5 bis 2,0 g (Tumorgewicht = [Breite x Länge]/2, Messungen in mm) wurde den Mäusen liposomales Doxorubicin in einer Dosis von 13 mg/kg i.v. in 7 Tagen-Intervallen (3 Injektionen der bezeichneten Dosis) verabreicht. Das Tumorwachstum wurde 3-mal wöchentlich für 50 Tage nach der ersten Behandlung oder bis das Tumorgewicht 9 g überschritt aufgezeichnet, bei dem man das Tier tötete. Die Behandlungsdosierungen basierten auf den anfänglichen Tiergewichten vor der Tumorinokulation.
Das obige Verfahren wurde wiederholt, und den Mäusen wurde Salzlösung, leere Liposome (verabreicht in einer Dosis, die äquivalent zu der war, die für eine liposomale Doxorubicindosis von 13 mg/kg gegeben wurde).
Das obige Verfahren wurde bei einer 3,25 mg/kg Dosis und 6,5 mg/kg Dosis für freies und liposomales Doxorubicin wiederholt.
Die Resultate zeigen eine dosisabhängige Tumorwachstumsinhibierung, die durch freies und liposomales Doxorubicin induziert wurde.

Beispiel 27

Liposome wurden hergestellt durch Hydratisieren eines Films aus DSPC/Cholesterin (55 45 Molverhältnis) in 300 mM Zitronensäurepuffer (pH 4,0) unter verwirbelndern Mischen. Diese MLVs (100 mg Gesamtlipid/ml Puffer) wurden 10-mal durch einen 200 nm Porengrößen-Polycarbonatfilter in einem LUVET-Thermomantel auf 60ºC erhitzt, extrudiert. Die Liposomewurden zu einer Lösung von 1 mg/ml Vincristin-Sulfat (Oncovin, erhältlich von Eli Lilly und Co., Indianapolis, IN) gegeben, um ein Arzneimittel zu Gesamtlipid-Gewichtsverhältnis von ungefähr 0,17 1 zu ergeben. Dazu wurde eine ausreichende Menge von 1, M Na&sub2;HPO&sub4; gegeben, um den pH der Lösung auf ungefähr 7,0 zu bringen. Die Proben wurden dann bei 60ºC für 10 Minuten erhitzt. Zu dieser Zeit wurden das Arzneimittel in den Liposomen mit einer Einschlußausbeute von über 98 % eingeschlossen.
Das obige wurde unter Verwendung von EPC/Cholesterin und HSPC/Cholesterin wiederholt.
Die Arzneimittelretention wurde bei 21ºC und 37ºC unter Dialyse in 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5 (Dialysat) gemessen. Tabelle 1 zeigt die Vincristinaufnahmeeigenschaften für EPC/Cholesterin, HSPC/Cholesterin und DSPC/Cholesterin-Vesikel, unter Verwendung von Vincristin aus verschiedenen Quellen, speziell von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) und Oncovin, Eli Lilly & Co. (Indianapolis, IN) Handelsbezeichnungen für Vincristin.
Die Dialyse ergab, daß HSPC/Cholesterin- und DSPC/Cholesterinliposome weniger als 10 % des eingeschlossenen Vincristins verloren (Fig. 6).

Beispiel 28

Dosisreaktionsüberlebensstudien wurden vervollständigt durch Injektion von Mengen von Liposomen-eingeschlossenem Vincristin durch eine laterale Schwanzvene von weiblichen DBA/2J Mäusen (18 - 22 g, 10 Mäuse pro Gruppe) in 0,2 ml, und Aufzeichnen der Sterblichkeitsrate und des durchschnittlichen Körpergewichts über 30 Tage.
Die Antitumorwirkung des freien und liposomalen Vincristins wurde bewertet unter Verwendung eines L1210 lymphozytischen Leukämiemodells. DBA/2J Mäusen (6 Mäuse pro Gruppe) wurde i.p. 1 x 10&sup6; L1210 Zellen aus der Ascitesflüssigkeit von zuvor infizierten Mäusen injiziert. Liposomales Vincristin, hergestellt nach Beispiel 27, wurde i.v. zu verschiedenen Zeiten nach der Tumorinokulation verabreicht, und die Tiergewichte wurden ebenso wie die Sterblichkeitsraten aufgezeichnet.
Das obige Beispiel wurde wiederholt unter Verabreichung freien Vincristins und leerer Liposome.

Beispiel 29

DSCP/Cholesterin-Vesikel (55 : 45) wurden hergestellt durch 10-malige Extrusion bei 60ºC durch 2 0,2 um Nudeopore- Polycarbonat-Durchlauffilter in 300 mM Natriumcarbonat pH 9,6 (eingestellt mit 10 %igem H&sub2;SO&sub4;) bei einer Lipid-Konzentration von 100 mg/ml. Der äußere Puffer wurde entfernt, und der pH- Gradient wurde eingerichtet, indem die Vesikel über eine G-50 Sephadex-Kolonne gegeben wurden, die mit 150 mM K&sub2;SO&sub4;, 20 mM HEPES, pH 7,4 (eingestellt mit NaOH) äquilibriert worden war. Diese Vesikel würden mit 2 mM 5-Fluoruracil (FU) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) für 60 Minuten bei 21ºC inkubiert, und die Inkubationstemperatur wurde auf 60ºC für 60 Minuten erhöht. FU, das nicht eingeschlossen wurde, wurde entfernt, indem über eine G-50-Kolonne gegeben wurde, die mit dem externen Puffer äquilibriert worden war.
Fig. 7 zeigt die Aufnahme von FU als Funktion der Temperatur. Die Inkubation der Liposome bei 60ºC verbessert wesentlich die FU-Aufnahme. In Fig. 7 bedeutet delta T einen Temperaturanstieg von 21ºC auf 60ºC.
Die obigen FU-enthaltenden Liposome wurden über eine Sephadex G-50-Kolonne gegeben, die mit 150 mM NaCl bei 37ºC äquilibriert worden war. 5-FU re-äquilibrierte entsprechend dem pH-Gradient (Fig. 8). Fig. 8 ist eine Darstellung, die die Wirkung des externen Puffers auf die FU-Freisetzung bei 37ºC wiedergibt.
Die Liposome, die den ursprünglichen K&sub2;SO&sub4; Puffer enthielten, wurden wie oben gegen 250 mM Ammoniumacetat ausgetauscht. Eine vollständige Freisetzung des FU resultierte (Fig. 8).

Beispiel 30

Ei-Phosphatidylcholin (15 mg) wurde in 2 ml 300 mM Zitronensäure, pH 4,0, dispergiert, und die resultierenden MLVs wurden insgesamt 5-mal in flüssigem Stickstoff gefroren und in warmem Wasser aufgetaut (ungefähr 35ºC). Das Lipid wurde dann 10-mal über zwei übereinandergelagerte 100 nm Porengröße- Polycarbonatfilter unter Verwendung des LUVET-Verfahrens extrudiert. Ein Protonengradient wurde erzeugt, indem die Vesikel über eine Sephadex G-50-(fein)-Kolonne (1,5 cm x 10 cm) gegeben wurde, die mit 300 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,5 preäquilibriert war. Ein Aliguot der großen unilamellaren Vesikel, die von der Kolonne eluiert wurden, wurde in 300 mM NaCl, mM HEPES, pH 7,5 zu einer Lipid-Konzentration von 0,75 mgml&supmin;¹ in einem Gesamtvolumen von 2 ml verdünnt, und dann wurde Daunorubicin (113 ug) aus einer Vorratslösung (5,64 mgml&supmin;¹) in destilliertem Wasser hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur (25ºC) in den Intervallen 2, 10, 20, 30, 60 und 120 Minuten inkubiert, 100 ul Aliquote wurden durch 1 ml "Minikolonnen" von Sephadex G-50 (fein) zentrifugiert, um nichteingeschlossenes Daunorubicin von den Vesikeln zu entfernen. Die Konzentration des eingeschlossenen Daunorubicins wurde aus seiner Extinktion bei 500 nm in einem Shimadzu UV-265 Spektrophotometer bestimmt, gefolgt vom Lösen der Vesikel in 1 %igem Triton X-100. Das Lipid wurde quantitativ durch Flüssigszintillations-Auszählung unter Verwendung von Tracer-Niveaus von ³H- DPPC bestimmt. Im Überschuß von 98 % wurde das Daunorubicin durch die Vesikel eingeschlossen, woraus sich ein Arzneimittel zu Lipid molares Verhältnis von 1 : 5 ergab.

Beispiel 31

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 30 wurden angewendet, ausgenommen, daß Epirubicin (116 ug) zu der Vesikelsuspension (2 ml) aus einer Vorratslösung (5,8 mgml&supmin;¹) gegeben wurde. Die Epirubicinaufnahme wurde quantitativ aus der Extinktion bei 500 nm bestimmt, gefolgt vom Löslichmachen der Vesikel in 1 %igem Titon X-100 . Der Epirubicineinschluß durch die Vesikel war mehr als 98 %, was ein Arzneimittel zu Lipid molares Verhältnis von 1 : 5 ergab.

Beispiel 32

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 30 wurden angewendet, ausgenommen, daß Mitoxanthron (103 ug) zu der Vesikelsuspension (2 ml) aus einer Vorratslösung (2 mgml&supmin;¹) gegeben wurde. Die Mitoxanthronaufnahme wurde quantitativ auf seiner Extinktion bei 670 nm bestimmt, gefolgt vom Löslichmachen der Vesikel in 2 %igem Titon X-100. Der Mitoxanthroneinschluß durch die Vesikel war mehr als 98 %, was ein Arzneimittel zu Lipid molares Verhältnis von 1 : 5 ergab.

Beispiel 33

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 30 wurden angewendet, ausgenommen, daß Cisplatin (200 uM) mit der Liposomensuspension kombiniert wurde. Cisplatin wurde nicht in den Liposomen durch den Transmembran-pH-Gradienten akkumuliert.

Claims

1. Liposomzusammensetzung die umfaßt: eine Lipiddoppelschicht, ein jonisierbares Antikrebsmittel, worin das Verhältnis (Gew./Gew.) Antikrebsmittel:Lipid von 0,1:1 bis 3:1 ist; und eine Pufferkombination die umfaßt:

a) ein wäßriges Medium im Inneren der Liposome, das einen ersten pH aufweist, und

b) eine wäßrige Lösung außerhalb der Liposome, die einen zweiten pH aufweist, in der Weise, daß ein pH- Gradient durch die Doppelschicht der Liposome besteht,

worin, wenn das ionisierbare Antikrebsmittel kationisch ist, das innere wäßrige Medium ein Zitronensäurepuffer ist, und der erste pH im Hinblick auf den zweiten pH sauer ist, und worin, wenn das ionisierbare Antikrebsmittel anionisch ist, das innere wäßrige Medium ein Natriumcarbonatpuffer ist, und der erste pH im Hinblick auf den zweiten pH basisch ist.

2. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Antikrebsmittel ein Anthracyclin, ein Vincaalkaloid, ein Purin- oder Pyrimidin-Derivat, ein alkylierendes Mittel oder ein Antibiotikum ist.

3. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Anthracyclin Doxorubicin, Daunorubicin oder Epirubicin ist.

4. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Vincaalkaloid Vincristin oder Vinblastin ist.

5. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Purinoder Pyrimidin-Derivat 5-Fluoruracil ist.

6. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das alkylierende Mittel Mitoxanthron ist.

7. Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Pufferkombination Zitronensäure/Natriumcarbonat, Zitronensäure/Natriumbiphosphat oder Natriumcarbonat/Kaliumsulfat umfaßt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Zitronensäure/Alkali-Kombination verwendet wird, wenn das Antikrebsmittel ein Vincaalkaloid oder ein Anthracyclin ist, und die Natriumcarbonat/Kaliumsulfat-Kombination verwendet wird, wenn das Antikrebsmittel ein Purin oder Pyrimidin-Derivat ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin Zitronensäure! Natriumbiphosphat für Vincristin verwendet wird, und die Zitronensäure/Natriumcarbonat-Kombination für Doxorubicin, Daunorubicin und Epirubicin verwendet wird.

10. Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Lipid Phospholipid umfaßt.

11. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 10, worin das Phospholipid Ei-Phosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, hydriertes Soja-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin ist.

12. Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 10 und 111 worin das Lipid zusätzlich Cholesterin umfaßt.

13. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 12, worin das Phospholipid in einem molaren Verhältnis mit Cholesterin von 55 : 45 vorliegt.

14. Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Liposome einen Durchmesser von 30 nm bis 2 Mikron aufweisen.

15. Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 14, worin die Liposome große unilamellare Liposome sind.

16. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 15, worin die Liposome einen Durchmesser von 100 nm bis 300 nm aufweisen.

17. Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, worin die Liposome im Hinblick auf ihre Größenverteilung homogen sind.

18. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Lipidkonzentration zwischen 90 bis 110 mg/ml liegt.

19. Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, worin die Liposomzusammensetzung dehydratisiert ist.

20. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Lipid Ei-Phosphatidylcholin, Ei-Phosphatidylglycerin, Distearoylphosphatidylcholin, hydriertes Soja-Phosphatidylcholin oder Dipalmitoylphosphatidylcholin umfaßt, das Antikrebsmittel Doxorubicin umfaßt, das Antikrebsmittel Lipidverhältnis ungefähr 0,3 : 1 beträgt und die freisetzungsinhibierende Pufferzusammensetzung Zitronensäure/Natriumcarbonat umfaßt.

21. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Lipid Distearoylphosphatidylcholin umfaßt, das Antikrebsmittel 5-Fluoruracil umfaßt, das Antikrebsmittel : Lipidverhältnis 0,1:1 bis 3,0:1 ist und der freisetzungsinhibierende Puffer Natriumcarbonat/Kaliumsulfat umfaßt.

22. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Lipid Ei-Phosphatidylcholin umfaßt, das Antikrebsmittel Daunorubicin, Epirubicin oder Mitoxanthron umfaßt, das Antikrebsmittel : Lipidverhältnis 0,1:1 bis 3,0:1 ist, und der freisetzungsinhibierende Puffer Zitronensäure/Natriumcarbonat umfaßt.

23. Liposomzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Lipid Ei-Phosphatidylcholin, Distearylphosphatidylcholin oder hydriertes Soja-Phosphatidylcholin umfaßt, das Antikrebsmittel Vincristin umfaßt, das Antikrebsmittel Lipidverhältnis 0,1:1 bis 3,0:1 beträgt, und worin der freisetzungsinhibierende Puffer Zitronensäure/Natriumbiphosphat umfaßt.

24. Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 23, worin das Lipid zusätzlich Cholesterin umfaßt.

25. Ein Dreikomponenten-Liposom-Antikrebsmittel-Behandlungssystem, das umfaßt: eine erste wäßrige Lösung, die Liposome umfaßt, die mindestens ein Lipid umfassen, das in wäßriger Lösung suspendiert ist; eine zweite wäßrige Lösung, die eine relativ saure oder basische Lösung umfaßt; und mindestens ein Antikrebsmittel, worin die erste Lösung, die zweite Lösung und das Antikrebsmittel vermischt sind, um die Liposomzusammensetzung der Ansprüche 1 bis 24 zu bilden.

26. Liposom-Antikrebsmittel-Behandlungssystem nach Anspruch 25, worin der pH der ersten wäßrigen Lösung zwischen 3,5 und 4,5 liegt.

27. Liposom-Antikrebsmittel-Behandlungssystem nach Anspruch 25, worin der pH der wäßrigen Lösung 4,0 beträgt.

28. Liposom-Antikrebsmittel-Behandlungssystem nach Anspruch 25, worin die erste wäßrige Lösung Zitronensäure ist.

29. Liposom-Antikrebsmittel-Behandlungssystem nach irgendeinem der Ansprüche 25 bis 28, worin das Antikrebsmittel : Lipid-Verhältnis von größer als 0,10:1 bis 3:1 ist.

30. System nach irgendeinem der Ansprüche 25 bis 29, worin der pH der ersten wäßrigen Lösung zwischen 6,8 und 11,0 liegt.

31. System nach Anspruch 30, worin der pH 9,6 ist.

32. System nach irgendeinem der Ansprüche 25 bis 31, worin die erste wäßrige Lösung Natriumcarbonat umfaßt.

33. System nach irgendeinem der Ansprüche 25 bis 32, das zusätzlich eine vierte Komponente umfaßt, die eine Einschluß-Indikatorlösung umfaßt.

34. Verfahren zur Bestimmung von nichteingeschlossenem Antikrebsmittel in einem Liposompräparat nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 33, daß das Messen der Extinktionsdifferenz an einer pH-empfindlichen Wellenlänge vor und nach dem Alkalischmachen oder Ansäuern umfaßt.

35. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Extinktionsdifferenz durch Vergleich mit einer Farbtafel gemessen wird.

36. Verfahren zur Herstellung einer Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 33, worin die Liposome durch einen Transmembran-pH-Gradienten geladen werden, das die Schritte umfaßt:

a) Bilden von Liposomen in einer ersten wäßrigen Lösung;

b) Ändern des pH der ersten wäßrigen Lösung außerhalb der Liposomen; und

c) Mischen des Produktes des obigen Schritts b) mit einem ionisierbaren Antikrebsmittel.

37. Verfahren nach Anspruch 36, worin die Schritte b) und c) kombiniert werden.

38. Verfahren nach den Ansprüchen 36 oder 37, worin die erste wäßrige Lösung Zitronensäure ist.

39. Verfahren nach den Ansprüchen 36 oder 37, worin die zweite wäßrige Lösung relativ basisch ist.

40. Verfahren nach Anspruch 39, worin die basische wäßrige Lösung Natriumcarbonat oder Natriumbiphosphat ist.

41. Verfahren nach den Ansprüchen 36 oder 37, worin die erste wäßrige Lösung Natriumcarbonat ist.

42. Verfahren nach den Ansprüchen 36 oder 37, worin die zweite wäßrige Lösung relativ sauer ist.

43. Verfahren nach Anspruch 42, worin die relativ saure wäßrige Lösung Kahumsulfat-HEPES oder Schwefelsäure ist.

44. Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Liposomzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 32 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfaßt.