ES2198429T3 - Vesiculas unilaminares grandes que comprenden fosfolipidos saturados y metodo para su preparacion. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA LA ENCAPSULACION DE AGENTES ANTINEOPLASTICOS EN LIPOSOMAS, QUE TIENE PREFERIBLEMENTE UNA ALTA PROPORCION DE DROGA:LIPIDO. LOS LIPOSOMAS PUEDEN HACERSE MEDIANTE UN PROCESO QUE CARGUE LA DROGA MEDIANTE UN MECANISMO ACTIVO USANDO UN GRADIENTE DE IONES DE TRANSMEMBRANA, PREFERIBLEMENTE UN GRADIENTE DE PH DE LA TRANSMEMBRANA. USANDO ESTA TECNICA, LA EFICIENCIA DEL ATRAPAMIENTO SE APROXIMA AL 100% Y LOS LIPOSOMAS PUEDEN CARGARSE CON DROGA INMEDIATAMENTE ANTES DE SU USO, ELIMINANDO LOS PROBLEMAS DE ESTABILIDAD RELACIONADOS CON LA RETENCION DE LA DROGA EN LOS LIPOSOMAS. LAS PROPORCIONES DROGA:LIPIDO EMPLEADAS SON DE ENTRE 3-80 VECES MAYORES QUE LAS PREPARACIONES DE LIPOSOMAS TRADICIONALES, Y LA VELOCIDAD DE LIBERACION DE LA DROGA DE LOS LIPOSOMAS SE REDUCE. TAMBIEN SE PRESENTA UN METODO PARA DETERMINAR LOS AGENTES ANTINEOPLASTICOS LIBRES EN UNA PREPARACION DE LIPOSOMAS.

Description

Vesículas unilaminares grandes que comprenden fosfolípidos saturados y método para su preparación.

La presente invención se dirige a formulaciones y métodos para hacer liposomas que contengan agentes antineoplásicos con elevadas relaciones en peso de medicamento : lípido. Tales formulaciones son por lo general más elevadas o sustancialmente equivalentes en eficacia que mismo medicamento en su forma libre, pero generalmente tienen menor toxicidad.

En particular, la invención se refiere a liposomas grandes unilaminares, que tienen una bicapa que comprende colesterol y un fosfolípido, en la que el fosfolípido consiste esencialmente en dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina o diaraquidonoilfosfatidilcolina, y en la que los lípidos se calientan durante la formación del liposoma para conseguir que los lípidos hagan la transición del estado de gel al estado cristalino-líquido. Además, se describen los métodos para la formación de tales liposomas que tienen características específicas de liberación, así como un ensayo para determinar agentes antineoplásicos libres y atrapados, tales como doxorrubicina, en una preparación liposómica. Más particularmente, se refiere la invención al uso de estos liposomas de elevada relación medicamento : lípido con agentes neoplásicos ionizables tóxicos, tales como doxorrubicina, vinblastina, vincristina, 5-fluorouracilo (5-FU), daunorrubicina, epirrubicina, mitoxantrona, y ciclofosfamida.

La doxorrubicina es un medicamento antineoplásico ampliamente utilizado, que pertenece a la clase de la antraciclina de los antibióticos producidos por los hongos Streptomyces peucetius. Se ha utilizado la doxorrubicina contra una gran variedad de tumores, leucemias, sarcomas, y cánceres de mama. Las toxicidades vistas con dosis de doxorrubicina normalmente administradas (así como otros agentes neoplásicos) comprenden supresión de mielina, alopecia, mucositis, y toxicidades gastrointestinales que incluyen náuseas, vómitos, y anorexia. La toxicidad más grave debida a la doxirrubicina es la cardiomiopatía cumulativa dependiente de la dosis e irreversible, que lleva al fallo cardíaco congestivo en 1-10 por ciento de los pacientes que reciben dosis mayores de 550 mg por metro cuadrado de área corporal. Estas toxicidades limitan gravemente la utilidad clínica de los agentes antineoplásicos, tales como doxorrubicina.

Los liposomas son membranas de capa bilípidica completamente cerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los liposomas pueden ser vesículas unilaminares (poseyendo una bicapa de una sola membrana), o vesículas multilaminares (estructuras con tipo de cebolla, caracterizadas por bicapas de membranas múltiples, cada una separada de la siguiente por una capa acuosa). La bicapa se compone de dos monocapas lipídicas que tienen una región hidrofóbica ``de cola'' y una región hidrofílica ``de cabeza''. La estructura de la bicapa de membrana es tal, que las ``colas'' hidrofóbicas (no polares) se orientan hacia el centro de la bicapa, mientras que las ``cabezas'' hidrofílicas se orientan hacia la fase acuosa.

La preparación original de liposomas de Bangham et al. J. Mol. Biol., 1965, 13: 238-252 (1965) implica suspender fosfolípidos en un disolvente orgánico que se evapora a continuación hasta la sequedad, dejando una lámina de fosfolípido en el recipiente de reacción. A continuación, se añade una cantidad apropiada de fase acuosa, se deja que la mezcla ``se hinche'', y se dispersan por medios mecánicos los liposomas resultantes, que consisten en vesículas multilaminares (MLVs, por sus siglas en inglés). Esta preparación proporciona la base para el desarrollo de las pequeñas vesículas unilaminares sonicadas descritas por Papahadjopoulos et al. (Biochim. Biophys. Acta., 1967, 135: 624 - 638), y vesículas unilaminares grandes.

Se pueden utilizar para producir liposomas las técnicas para producir vesículas unilaminares grandes (LUVs, por sus siglas en inglés), tales como evaporación en fase inversa, procedimientos de infusión y dilución con detergentes. Se puede encontrar una revisión de éstos y otros métodos para producir liposomas en el texto Liposomes, Marc Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1983, capítulo 1, siendo incorporada aquí como referencia la parte pertinente de éste. Véase también Szoka, Jr. et al., (1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467), que también se incorporan aquí como referencia las partes pertinentes de ello. Se describe un método particularmente preferido para formar LUVs en Cullis et al., publicación PCT Nº 86/00238, 16 de enero, 1986, titulada ``Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles'' incorporada aquí como referencia. Las vesículas hechas mediante esta técnica, llamadas LUVETs, se extrusionan a presión a través de un filtro de membrana. Se pueden extrusionar a través de un filtro de 200 nm; tales vesículas se conocen como VET_{200}s. Se puede exponer las LUVETs a al menos un ciclo de congelación y descongelación antes de las técnicas de extrusión; se describe este procedimiento en Mayer et al., (Biochim. Biophys. Acta., 1985, 817: 193 - 196), titulada ``Solute distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles''; se conocen tales vesículas como FATMLVs, por sus siglas en inglés.

Otras técnicas que se han utilizado para preparar vesículas comprenden las que forman vesículas de evaporación en fase inversa (REV, por sus siglas en inglés), Papahadjopoulos et al., documento de patente de EE.UU. Nº 4.235.671. Otra clase de liposomas que se pueden utilizar son los caracterizados porque tienen distribución laminar del soluto sustancialmente igual. Esta clase de liposomas se denomina vesículas plurilaminares estables (SPLV, por sus siglas en inglés) tal como se define en el documento de patente de EE.UU. Nº 4.522.803 de Lenk et al., e incluye vesículas monofásicas, tal como se describe en el documento de patente de EE.UU. Nº 4.588.578 de Fountain et al. y vesículas multilaminares congeladas y descongeladas (FATMLV ), tal como se describen anteriormente.

Se ha utilizando una variedad de esteroles y sus derivados hidrosolubles, tales como hemisuccinato de colesterol, para formar liposomas; véase específicamente Janoff et al., documento de patente de EE.UU. Nº 4.721.612, publicada el 26 de enero, 1988, titulada ``Steroidal Liposomes''. Mayhew et al., publicación PCT Nº WO 85/00968, publicada el 14 de marzo, 1985, describieron un método para reducir la toxicidad de los medicamentos mediante su encapsulación en liposomas que comprenden alfa-tocoferol y algunos de sus derivados. Se ha utilizado también una diversidad de tocoferoles y sus derivados hidrosolubles para formar liposomas, véase Janoff et al., publicación PCT Nº 87/02219, publicado el 23 de abril, 1987, titulada ``Alpha Tocopherol-Based Vesicles''.

En un sistema de suministro liposoma-medicamento, un agente bioactivo, tal como un medicamento, se encierra en el liposoma y se administra a continuación al paciente que se va a tratar. Por ejemplo, véase Rahman et al., documento de patente de EE.UU. Nº 3.993.754; Sears, documento de patente de EE.UU. Nº 4.145.410; Paphadjopoulos et al., documento de patente de EE.UU. Nº 4.235.871; Schneider, documento de patente de EE.UU. Nº 4.224.179; Lenk et al., documento de patente de EE.UU. Nº 4.522.803; y Fountain et al., documento de patente de EE.UU. Nº 4.588.578. De manera alternativa, si el agente bioactivo es lipófilo, se puede asociar con la bicapa lipídica. En la presente invención, el término ``atrapado'' se tomará para que comprenda tanto el medicamento en el volumen acuoso del liposoma, como el medicamento asociado con la bicapa lipídica.

Tal como se ha establecido por diferentes investigadores, la terapia del cáncer utilizando agentes antineoplásicos se puede mejorar de forma significativa en muchos casos mediante la encapsulación del agente antineoplásico en liposomas utilizando métodos tradicionales, mejor que administrando el agente libre directamente en el cuerpo. Véase, por ejemplo, Forssen et al, (1983), Cancer Res., 43: 546; y Gabizon et al., (1982), Cancer Res., 42: 4734. La incorporación pasiva de tales agentes en liposomas puede cambiar sus actividades antitumorales, tasas de aclarado, distribuciones tisulares, y toxicidades, en comparación con la administración directa. Véase, por ejemplo, Arman et al., (1982) Cancer Res., 42: 1817; Rosa et al., (1982) en Transport in Biomembranes: Model Systems and Reconstitution, R. Antoline et al. ed. Raven Press, Nueva York, 243-256; Rosa et al., (1983), Pharmacology, 26: 221; Gabizon et al., (1983), Cancer Res., 43: 4730; Forssen et al., op. cit.; Gabizon et al., op. cit.; y Olson et al., (1982), Br. J. Cancer Clin. Oncol., 18: 167. Utilizando liposomas de diferente composición y tamaño, se ha acumulado la evidencia que demuestra que se puede atenuar las toxicidades aguda y crónicas de doxorrubicina mediante el alejamiento del medicamento de los órganos diana. Por ejemplo, se sabe que se puede reducir de forma significativa la cardiotoxicidad de los antibióticos de antraciclina daunorrubicina y doxorrubicina y de sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables mediante la encapsulación pasiva del liposoma. Véase, por ejemplo, Forssen et al., op. cit; Olson et al., op. cit.; y Arman et al., op. cit. Esta amortiguación de la toxicidad parece que se produce principalmente por la acumulación reducida dentro del corazón, con reducción asociada en su cardiotoxicidad (Rahman et al., 1980 Cancer Res., 40: 1532; Olson et al., op. cit.; Herman et al., 1983, Cancer Res., 43: 5427; y Rahman et al., 1985, Cancer Res., 45:796). Normalmente, tal toxicidad limita la dosis para doxorrubicina libre (Minow et al., 1975, Cancer Chemother. Rep. 6: 195). La incorporación de agentes neoplásicos muy tóxicos en liposomas puede también reducir el riesgo de exposición a tales agentes por personas implicadas en su administración.

Aunque los estudios antes mencionados establecen claramente el potencial para uso de doxorrubicina encapsulada en el liposoma, no se ha hecho disponible una preparación liposómica comercialmente aceptable. Por ejemplo, muchas de estas preparaciones tienen un potencial farmacéutico dudoso, debido a problemas asociados con la estabilidad, eficacia de atrapado, potencial en mayor escala, y coste de los lípidos utilizados. Además, se han encontrado problemas relacionados con la eficacia de los medicamentos que se han encapsulado. Tales problemas han acompañado hasta ahora los métodos utilizado de atrapado pasivo.

Se han utilizado vesículas multilaminares grandes (MLVs) (Gabizon et al., 1982, op. cit.), vesículas unilaminares grandes (LUVs) y vesículas unilaminares (sonicadas) pequeñas (SUVs.) (Gabizon et al., 1983, op. cit., Shinozawa et al., 1981, Acata Med. Okayama, 35: 395) con composiciones lipídicas que incorporan cantidades variables de lípidos cargados positivamente y cargados negativamente, además de la fosfatidilcolina (PC, por sus siglas en inglés) y colesterol. Las variaciones en la composición lipídica proceden en su mayor parte de las necesidades para atrapar doxorrubicina, como sistemas que solamente contienen lípidos neutros o positivos que exhiben bajas eficacias de atrapado y bajas relaciones del medicamento con respecto al lípido (Gabizon et al., 1983, op. cit. y Shinozawa et al., op. cit.). En liposomas que contienen lípidos cargados negativamente, tales como cardiolipina, se consiguen mayores relaciones de medicamento con respecto al lípido, debido a la asociación de la doxorrubicina cargada positivamente con el lípido cargado negativamente. Sin embargo, las preparaciones resultantes son inconsistentes, exhiben variabilidad en el tamaño de las vesículas y en la carga superficial. También son prohibitivos el tipo y cantidad del lípido necesario, debido a las consideraciones de costo.

Otro problema con los liposomas anteriores que contienen agentes antineoplásicos, es que ninguna de las formulaciones liposómicas anteriores de doxorrubicina satisfacen completamente las demandas fundamentales de estabilidad. Normalmente se mide en horas la retención de doxorrubicina dentro de la preparación liposómica, mientras las aplicaciones farmacéuticas necesitan por lo general estabilidades de un año o más. Además, la estabilidad química de los componentes lipídicos es cuestionable, debido a la elevada proporción de lípidos muy insaturados, tales como cardiolipina. Otros problemas incluyen en elevado costo de lípidos cargados negativamente y problemas en gran escala. Debido al hecho de que la doxorrubicina tiene una naturaleza anfipática, es permeable en las bicapas lipídicas, originando que las preparaciones liposómicas se hagan inestables, debido al escape del medicamento de las vesículas (Gabizon et al., 1982, op. cit; Rahman et al., 1985, op. cit.; y Ganapathi et al., 1984, Biochem. Pharmacol., 33: 698).

En los estudios previos antes mencionados, se utilizó lípido para mejorar la toxicidad del medicamento atrapado mediante el aumento del contenido de lípido en las formulaciones para amortiguar la toxicidad del medicamento. Los solicitantes han hallado sorprendentemente que de hecho un bajo contenido en lípido (aumentando las relaciones en peso del medicamento con respecto al lípido) disminuía más efectivamente la toxicidad. No se había descrito esta relación hasta ahora, debido a las limitaciones en la cantidad de doxorrubicina que podía ser atrapada utilizando método de atrapado pasivo (métodos que no utilizan un mecanismo de carga mediante un gradiente de pH a través de la membrana), aumentando de esta manera el lípido necesario para atrapar la misma cantidad de medicamento.

Mayer et al. hallaron que se pueden mejorar los problemas asociados con el atrapado liposómico eficaz del agente antineoplásico utilizando gradientes iónicos a través de la membrana (véase documento de solicitud de PCT 86/01102, publicada el 27 de febrero, 1986). Aparte de inducir la toma de doxorrubicina, tales gradientes a través de la membrana actúan también aumentando la retención del medicamento en los liposomas. La presente invención describe composiciones de tampón mejoradas utilizadas con el objeto de cargar eficazmente liposomas utilizando ión transmembranal, específicamente gradientes de pH transmembranal, y reteniendo el agente atrapado.

Se ha informado en anteriores ensayos clínicos en humanos, que los mismos liposomas no tienen toxicidades significativas, si se han administrado por vía intravenosa. Richardson et al., (1979), Br. J. Cancer 40: 35; Ryman et al., (1983) en ``Targeting of drugs'' G. Gregoriadis et al., eds páginas 235-248, Plenum, N. Y.; Gregoriadis, G., (1981), Lancet 2: 241 y Lopez-Berestein et al., (1985) J. Infect. Dis., 151: 704. Se ha descrito que los liposomas se concentran predominantemente en los órganos reticuloendoteliales llenos de capilares sinusoidales, es decir, hígado, bazo, y médula ósea, y fagocitados por las células fagocíticas presentes en estos órganos.

El uso de liposomas para administrar agentes antineoplásicos ha levantado problemas con respecto a la encapsulación del medicamento y a las eficacias de atrapado, y a la liberación de medicamento durante la terapia. Con respecto a la encapsulación, ha habido una necesidad continua de aumentar las eficacias de atrapado para minimizar la carga de lípidos administrada al paciente durante la terapia. Además, elevadas eficacias de atrapado significan que solamente se pierde una pequeña cantidad de medicamento durante el proceso de encapsulación, una ventaja importante cuando se trata de los caros medicamentos que se utilizan normalmente en la terapia del cáncer. Con respecto a la liberación del medicamento, se ha encontrado que muchos agentes neoplásicos, tal como doxorrubicina, se liberan rápidamente de los liposomas tradicionales después de la encapsulación. Tal liberación rápida disminuye los efectos beneficiosos de la encapsulación de liposomas y acelera la liberación del medicamento en la circulación, causando toxicidad, y por tanto, en general no es deseable. Por ello, se ha estado continuamente realizando esfuerzos por los investigadores de la técnica para hallar maneras de reducir la tasa de liberación de agentes antineoplásicos y otros medicamentos de liposomas.

Además de estos problemas con la encapsulación y liberación, existe el problema primordial de hallar una forma comercialmente aceptable de proporcionar al clínico liposomas que contengan agentes antineoplásicos. Aunque la producción y carga de liposomas sobre la base de ``lo que se necesite'' es un procedimiento aceptable en un marco experimental, no es por lo general satisfactorio en un marco clínico. Por ello, hay una necesidad significativa y continua de métodos, en los que los liposomas, con o sin medicamentos encapsulados, se puedan transportar, almacenar y, en general, moverse a través de los canales de distribución comerciales convencionales, sin daño sustancial.

La presente invención describe un procedimiento de encapsulación que utiliza gradientes de pH transmembranales, que colma las demandas relacionadas tanto con la optimización del efecto, como con los problemas farmacéuticos, y una formulación con una relación en peso del medicamento con respecto al lípido que reduce la toxicidad del medicamento. La formulación resultante liposoma-agente antineoplásico es muy versátil en que el proceso de carga no está limitado a ninguna composición lipídica en particular, al tamaño del liposoma o a la carga. Se pueden utilizar lípidos que no sean caros, se consiguen fácilmente eficacias de atrapado de aproximadamente 100% para un amplio especto de composiciones lipídicas y tamaños de vesículas, relaciones en peso del medicamento con respecto al lípido mayores que aproximadamente 0,1 : 1 a aproximadamente 3,0 : 1, que son más elevadas que las que se han conseguido para formulaciones anteriores (disminuyendo por tanto la carga lipídica), y se simplifica el aumento en escala. Otra ventaja exclusiva de este proceso de toma conducido por el pH es que hay una reducción en la tasa a la cual se libera el medicamento de los liposomas en comparación con liposomas con el agente pasivamente atrapado. Esta tasa reducida de liberación de agente bioactivo atrapado está mediada por el sistema de tamponado utilizado en las preparaciones. Por tanto, el tampón o sistema de tamponado inhibidor de la liberación retiene el agente en los liposomas.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de ensayo para determinar los agentes antineoplásicos libres y asociados a los liposomas (p. ej., doxorrubicina, daunorrubicina, y epirrubicina) en preparaciones liposómicas. Debido a las elevadas toxicidades de estos medicamentos, es de gran ayudar cuantificar los niveles de medicamento libre, si es que hay, en la preparación. Por ejemplo, el procedimiento permite la detección de medicamento libre desde menos de aproximadamente 55 a aproximadamente 95% del medicamento total en los sistemas liposómicos. El ensayo no requiere la utilización de materiales o equipos raros en un laboratorio o práctica clínica estándar.

Sumario de la invención

La presente invención describe una composición liposómica que comprende un agente antineoplásico y un lípido, preferiblemente un fosfolípido, tal como EPC y colesterol, y en la que el liposoma tiene un gradiente de pH transmembranal. Los liposomas tienen una relación del medicamento (agente antineoplásico) con respecto al lípido de aproximadamente 0,1 : 1 a aproximadamente 3 : 1, más preferiblemente 0,3 : 1 a 3 : 1. Los liposomas contienen una composición tamponadora inhibidora de la liberación, tal como ácido cítrico/carbonato sódico, ácido cítrico/bisfosfato sódico, o carbonato sódico/sulfato potásico- HEPES. El agente antineoplásico puede ser, por ejemplo, una antraciclina, tal como doxorrubicina, daunorrubicina, o eprrubicina, un alcaloide de la vinca, tal como vinblastina, o vincristina, un derivado púrico o pirimidínico, tal como 5-fluorouracilo, un agente alquilante, tal como mitoxantrona, hidrocloruro de mecloroetamina o ciclofosfamida, o un antibiótico antineoplásico, tal como mitomicina o bleomicina. Los liposomas pueden comprender como fosfolípido dipalmitoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, o diaraquidonoilfosfatidilcolina, y pueden comprender adicionalmente colesterol, por ejemplo en una relación en moles 55 : 45 fosfolípido : colesterol. Los liposomas pueden comprender adicionalmente alfa-tocoferol. Los liposomas pueden ser en tamaño de 30 nm a 2 micras, preferiblemente 100 a 300 nm de diámetro, vesículas unilaminares grandes. Pueden contener 50 a 200 mg/ml de lípido, más preferiblemente 90 a 110 mg/ml de lípido. El atrapado del agente antineoplásico en los liposomas es desde 50% a 100%, preferiblemente 90% a 100%,más preferiblemente 98% a 100%. Estos liposomas pueden ser vesículas unilaminares grandes, y pueden ser homogéneos o unimodales con respecto a la distribución de tamaño. Se pueden administrar los liposomas de forma intravenosa a un paciente. Son otra realización de la presente invención las preparaciones farmacéuticas que contengan los agentes antineoplásicos atrapados en los liposomas y excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Se pueden utilizar las composiciones liposómicas de la invención para tratar o estabilizar una enfermedad neoplásica, o de manera profiláctica para prevenir la aparición o recurrencia de una enfermedad neoplásica. La composición de la presente invención se proporciona, por ejemplo, como un sistema de tres componentes. Cuando el agente antineoplásico es doxorrubicina, el sistema de tres componentes comprende liposomas vacíos en una solución ácida de pH aproximado de 4,0, una solución básica, y el agente antineoplásico. La solución ácida es tampón de ácido cítrico acuoso. La solución básica es carbonato sódico. La relación en peso del medicamento con respecto al lípido es de 0,1 : 1 a 3 : 1.

Las composiciones liposómicas se pueden preparar formando primero el liposoma en un primer medio acuoso, preferiblemente un tampón, acidificando o alcalinizando a continuación el medio, estableciendo por tanto un gradiente de pH. Los liposomas resultantes acidificados o alcalinizados se mezclan seguidamente con el agente antineoplásico, tal como doxorrubicina.

Los liposomas de la invención se pueden deshidratar, o bien antes, o a continuación del establecimiento del gradiente de pH transmembranal. Los liposomas pueden ser vesículas unilaminares grandes, y pueden estar formados de lípidos saturados de cadena larga. En otro aspecto de la invención, se describe un método para determinar agente antineoplásico libre en una preparación liposómica (un método de ensayo). Por ejemplo, para doxorrubicina, este método implica medir un diferencial de absorbancia, preferiblemente a aproximadamente 600 nm, antes y después de la alcalinización, y solubilizar los liposomas de la preparación. Más específicamente, se mide la absorbancia de los liposomas que contienen la doxorrubicina a aproximadamente 600 nm. Seguidamente se alcaliniza la preparación liposómica y se mide la absorbancia de nuevo a 600 nm. A continuación se solubilizan los liposomas y se mide la absorbancia de nuevo a 600 nm. Seguidamente se comparan los liposomas alcalinizados con una carta de colores, a partir de la cual se puede determinar el porcentaje de agente encapsulado.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el efecto de la temperatura de incubación sobre la toma remota de doxorrubicina cargada en liposomas de EPC/colesterol (relación en moles 55 : 45). Se prepararon los liposomas en ácido cítrico 300 mM (pH 4,0) y se extrusionaron a través de filtros de policarbonato de 200 nm de tamaño de poro. Antes de la adición de doxorrubicina, se llevó la solución liposómica externa a pH 7,8 con hidróxido sódico. Se añadió doxorrubicina (3,0 mg/ml) a los liposomas (11,0 mg de lípido/ml), equilibrada a 21ºC (cuadrados cerrados), 37ºC (círculos abiertos), y 60ºC (círculos cerrados).

La Figura 2 es un gráfico de características de liberación de doxorrubicina liposómica (EPC :colesterol 55 : 45 mol : mol, 29 \pm 2/100 medicamento/lípido en peso/en peso) conteniendo 300 mm de citrato, dializado con tampón a 37ºC de pH 4,0 (círculos abiertos) y pH 7,5 (círculos cerrados) a 37ºC.

La Figura 3 es un gráfico de una interacción citrato-doxorrubicina que resulta de mezclar experimentos con diferentes valores de pH del citrato. Se representa la doxorrubicina mM restante en solución después de la centrifugación como una función del pH del citrato: doxorrubicina 4 mM mezclada a 60ºC, enfriada seguidamente hasta 25ºC (cuadrados cerrados); doxorrubicina 4 mM mezclada a 25ºC (cuadrados abiertos); doxorrubicina 20 mM mezclada a 60ºC, enfriada a continuación hasta 25ºC (círculos cerrados); y doxorrubicina 4 mM mezclada con HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, a 25ºC para comparar (círculo abierto).

La Figura 4 muestra los espectros de absorbancia entre 400 y 700 nm para doxorrubicina a pH 7,5 (a) y pH 10,5 (b).

La Figura 5 muestra una comparación de relaciones de doxorrubicina libre/total con la tasa de absorbancia a 600 nm antes y después de la adición de Triton X- 100 con respecto a doxorrubicina liposómica alcalinizada. Doxorrubicina activamente atrapada (círculos cerrados); pasivamente atrapada (círculo abierto).

La Figura 6 es un gráfico demostrando la liberación de vincristina de sistemas liposómicos de HSPC/colesterol (círculos abiertos), de DSPC/colesterol (cuadrados cerrados), y de EPC/colesterol (círculos cerrados) en condiciones de diálisis a 37ºC.

La Figura 7 es un gráfico demostrando el efecto de la temperatura en la toma de 5-fluorouracilo (``FU''). La delta T refleja un aumento de temperatura de 21ºC hasta 60ºC.

La Figura 8 es un gráfico que representa el efecto del tampón externo sobre la liberación de FU a 37ºC.

La presente invención demuestra el atrapado eficaz de agentes antineoplásicos en liposomas que exhiben un gradiente de pH transmembranal, que puede dar como resultado una relación de medicamento con respecto a lípido significativamente más elevada que en los sistemas liposómicos anteriores. Los liposomas de las formulaciones descritas también muestran una tasa reducida de liberación de medicamento. La invención trata de formulaciones liposómicas para su uso como sistemas portadores de medicamentos que atrapan medicamentos, tales como los agentes antineoplásicos doxorrubicina, vincristina, y 5-fluorouracilo. Se pueden utilizar estos sistemas para disminuir los efectos tóxicos de los agentes antineoplásicos utilizados.

Tal como se ha discutido anteriormente, se pueden formar los liposomas de la invención por cualquiera de los métodos conocidos, pero preferiblemente se forman según los procedimientos descritos en Bally et al., solicitud PCT Nº 86/01102, publicada el 27 de febrero, 1986. Esta técnica permite la carga de los liposomas con agentes antineoplásicos ionizables para conseguir concentraciones internas considerablemente mayores que la solubilidad de los medicamentos en solución acuosa a pH neutro y/o concentraciones mayores que se pueden obtener mediante técnicas de atrapado pasivo. En esta técnica, se crea un gradiente iónico (pH) transmembranal a través de la membrana de los liposomas y se carga el agente antineoplásico en los liposomas por medio del gradiente de pH. Se genera el gradiente de pH transmembranal mediante la creación de un gradiente de concentración para uno o más tipos cargados (p. ej., Na^{+}, Cl^{-}, K^{+}, Li^{+}, OH^{-}, y preferiblemente H^{+}) a través de las membranas liposómicas, y estos gradiente iónicos dirigen la toma de agentes bioactivos ionizables (medicamentos) a través de las membranas. En la presente invención se utilizan gradientes de H^{+} (pH) transmembranales.

Típicamente, se hidrata una lámina seca del lípido que se va a usar utilizando una solución acuosa. Esta hidratación emplea un primer medio acuoso, tal como agua destilada (p. ej. agua ultrapura para inyecciones) o tampón acuoso. Cuando se van a cargar medicamentos catiónicos, por ejemplo, este tampón acuoso es tampón de ácido cítrico. Se usa mejor a pH 3,5 a 4,5. En el caso de carga de medicamentos, por ejemplo doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, y vincristina, se ha hallado que lo más aconsejable es emplear ácido cítrico 300 mM a aproximadamente pH 4,0 como el medio inicial de hidratación, que hace ácido el interior de los liposomas. Se ha identificado el ácido cítrico como la solución tamponadora que produce la mejor toma de estos medicamentos en los liposomas.

De manera similar, se pueden cargar agentes antineoplásicos aniónicos en liposomas que tienen un interior básico en forma de tampón de carbonato sódico. Tal carga es la respuesta del gradiente de pH básico impuesto por el cambio del medio original a un medio más ácido. En el caso de tomar por ejemplo 5- fluorouracilo, preferiblemente el primer medio es relativamente básico, por ejemplo una solución acuosa tal como un tampón a pH 6,8 a 11,0, y más preferiblemente pH 9,6 aproximadamente. Por ejemplo, se puede utilizar carbonato sódico 300 mM a pH aproximado de 9,6.

Por tanto, los liposomas que encapsulan el primer medio acuoso tienen una primera concentración de uno o de más compuestos. Estos liposomas se hacen mediante una técnica que favorece la formación de MLVs, y son de aproximadamente 400 nm y mayores en diámetro. A continuación los liposomas se pueden extruir a través de filtros según los procedimientos de LUVET de Cullis et al., tal como se describe anteriormente. En esta técnica, se pasan los liposomas a presión a través de uno o más filtros apilados de policarbonato de paso recto o sinuoso. Se pueden pasar los liposomas una o más veces a través de los filtros, extruyéndolos por tanto y dando como resultado una población de liposomas con una distribución homogénea de tamaño, tal como se describe en Cullis et al., publicación PCT nº 86/00238, 16 de enero, 1986.

Una vez que los liposomas se han conformado a la distribución apropiada de tamaño, se puede reemplazar el medio externo cambiando este medio externo original en un nuevo medio externo que tiene una concentración diferente de uno o más de los compuestos cargados (p. ej. iones H^{+}), por ejemplo, un medio relativamente básico o relativamente ácido. El reemplazado del medio externo se puede conseguir cambiando el pH externo, por ejemplo, en el caso de doxorrubicina, daunorrubicina, o epirrubicina, mediante la adición de una solución básica, tal como preferiblemente carbonato sódico, a aproximadamente pH 11,0, o un pH suficiente para que dé como resultado un pH final de 7,5-8,3, más preferiblemente pH 7,8. En el caso de vincristina, se emplea preferiblemente bisfosfato sódico, a pH 6,8 a 7,2, preferiblemente a pH 7,0, o a un pH suficiente para dar como resultado un pH final de aproximadamente 7,1. Otras soluciones básicas que se pueden emplear incluyen, pero no están limitadas, a bicarbonato sódico, bisfosfato sódico, hidróxido sódico, o fosfato potásico. Este procedimiento crea el gradiente de concentración. En el caso de 5- fluorouracilo, se cambia el medio externo por ejemplo a un medio relativamente ácido, con tampón, tal como preferiblemente sulfato potásico/HEPES 150 mM, o H_{2}SO_{4}, a pH 6,5 a 8,5, añadido en cantidad suficiente para hacer a la preparación relativamente ácida, preferiblemente pH 7,0 aproximadamente. Otras soluciones relativamente ácidas que se pueden utilizar para FU comprenden, pero no se limitan a, HCl, H_{3}PO_{4}, a un pH deseado de aproximadamente 7,0. Otros métodos que se pueden utilizar para cambiar el medio externo son la filtración con gel (p. ej. utilizando una columna de Sephadex que se ha equilibrado con el nuevo medio), centrifugación, diálisis, o técnicas relacionadas. Este gradiente de pH transmembranal cargará el medicamento dentro de los liposomas, de tal manera que las relaciones de medicamento libre y asociado a las vesículas reflejan o son mayores que los predichos por las relaciones [H^{+}]_{dentro} / [H^{+}]_{fuera}. Un gradiente iónico permanece a través de las membranas liposómicas, incluso después de que la carga se ha finalizado.

Además de cargar un único agente antineoplásico, se puede utilizar el método de carga mediante gradiente de pH para cargar múltiples agentes antineoplásicos, ya sea simultáneamente o secuencialmente. También los liposomas en los cuales se han cargado los agentes antineoplásicos ionizables, pueden estar ellos mismos cargados inicialmente con otros agentes antineoplásicos u otros medicamentos utilizando técnicas convencionales de encapsulación pasiva (p. ej., mediante la incorporación del medicamento en el tampón del cual se hacen los liposomas). Puesto que los materiales convencionalmente cargados no necesitan ser ionizables, este procedimiento proporciona una gran flexibilidad para preparar ``cócteles de medicamentos'' encapsulados en liposomas para utilizarse en las terapias contra el cáncer. Estos ``cócteles de medicamentos'' pueden comprender también dos o más poblaciones de liposomas (que atrapan el mismo o diferentes agentes antineoplásicos), que comprenden diferentes formulaciones lipídicas, o comprenden diferentes tamaños de vesículas. Se pueden administrar tales cócteles para conseguir mayor eficacia terapéutica, seguridad, liberación prolongada del medicamento o puntería.

Volviendo ahora a los aspectos de la invención que tienen que ver con la reducción de la tasa de liberación de un agente antineoplásico ionizable o con otros agentes biológicamente activos ionizables de los liposomas, se ha hallado sorprendentemente, que el gradiente de pH transmembranal puede reducir también de forma marcada la tasa de liberación a través de las membranas liposómicas. Por tanto, los liposomas son extremadamente estables con respecto a la liberación de sus contenidos. La tasa reducida del liberación del medicamento se crea por la capacidad tamponadora del interior del liposoma; esto es, las concentraciones en la parte interna y en la parte externa de los liposomas de iones H^{+}, un gradiente de pH. Por ejemplo, elevadas capacidades tamponadores interiores, que necesitan un mayor flujo hacia dentro de cationes (tal como el agente antineoplásico) para disminuir el gradiente de pH, llevará a mayores tiempos de retención. Además, una vez que se ha agotado la capacidad tamponadora interior, aumentará la tasa de liberación del agente antineoplásico (p. ej. doxorrubicina). El cargar los liposomas con el medicamento necesita ajustar la concentración iónica del medio externo de los liposomas para formar un potencial químico a través de la membrana liposómica. Cuando el ión es el catión hidrógeno, se puede hacer tal ajuste mediante el cambio de pH con la adición de una solución de pH relativamente ácido o básico. Tal como se ha declarado anteriormente, la tasa de liberación del agente bioactivo está mediada por el tampón. Se ha hallado que ciertas combinaciones de tampones (medio acuoso interno/medio acuoso externo) aumentan la toma y reducen la liberación de los contenidos liposómicos. Por ejemplo, para los medicamentos doxorrubicina, epirrubicina, y daunorrubicina, las combinaciones de tampones más apropiadas que se han hallado para la retención de los contenidos liposómicos son ácido cítrico/carbonato sódico. En el caso de vincristina, la combinación de tampones más apropiada es ácido cítrico/bisfosfato sódico. En el caso de 5-FU, la combinación tamponadora preferida es carbonato sódico/hidróxido sódico o carbonato sódico/sulfato potásico-HEPES.

Se puede aumentar la retención de doxorrubicina en vesículas de EPC/colesterol (55 : 45) que exhiben un gradiente de pH utilizando sistemas tamponadores citrato/carbonato, de tal manera que se observa menos de aproximadamente 5% de liberación durante 24 h a 37ºC. Esta doxorrubicina atrapada en las vesículas es también estable a los componentes séricos; se libera menos del 5% de doxorrubicina durante 24 h en vesículas incubadas a 37ºC en suero reciente humano al 95%. En ensayos de asociación, cuando se incubó la doxorrubicina con tampón de HEPES a pH 7,5, y tampones de citrato (citrato sódico) a pH desde aproximadamente 4,0-7,5, el citrato interactúa con la doxorrubicina y precipita, mientras que el tampón de HEPES no. Una combinación tamponadora como ésa, es decir citrato/carbonato, actúa reduciendo la tasa de liberación del medicamento de los liposomas. Se pueden utilizar otras combinaciones tamponadoras reductoras de la liberación, tales como ácido oxálico/fosfato sódico o ácido succínico/bicarbonato sódico, prefiriendo ácido cítrico/carbonato sódico o ácido cítrico/bisfosfato sódico.

A continuación se incuban los liposomas para facilitar la encapsulación, (por encima de 37ºC, preferiblemente a aproximadamente 60ºC para doxorrubicina y FU), el tiempo de incubación puede depender de la temperatura. Se pueden incubar la daunorrubicina, epirrubicina, y mitoxantrona a 25ºC. Igualmente se puede calentar a la misma temperatura el agente antineoplásico ionizable y se mezclan los dos componentes. Se sigue incubando la suspensión liposoma-medicamento, y la solución resultante es de un pH final de aproximadamente 6,9-8,3, preferiblemente 7,5-7,8 aproximadamente. Se prefiere una incubación así a elevadas temperaturas por su eficaz carga de doxorrubicina en los liposomas que contienen colesterol. Seguidamente se diluye la solución tanto como se necesite con solución salina fisiológica, por ejemplo, y se administra.

Existen otros métodos apropiados para mezclar el medicamento, los tampones y liposomas. Por ejemplo, se puede utilizar primero la solución salina para suspender el medicamento, a continuación se añade a los liposomas que tienen el gradiente de pH transmembranal. Adicionalmente, se puede añadir el medicamento a los liposomas al mismo tiempo que el ajuste de pH, creando por tanto el gradiente. Se pueden necesitar otros métodos de mezcla dependiendo del agente antineoplásico y de otros componentes farmacéuticos.

Se puede utilizar esencialmente con cualquier agente antineoplásico el método de carga mediante el gradiente de pH transmembranal, siempre que exista en un estado ionizable cuando se disuelva en un medio acuoso apropiado (p. ej., compuestos orgánicos que tienen un grupo amino que se pueda protonar). Esos agentes pueden contener grupos amino primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios, y un grupo lipófilo, y no deben disipar el gradiente de pH. El agente debe ser relativamente lipofilo, de tal manera que se repartirá en las membranas liposómicas. Ejemplos de algunos de los agentes antineoplásicos que se pueden cargar en los liposomas mediante este método y, por tanto, se pueden utilizar en esta invención comprenden, pero no se limitan a, doxorrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, y epirrubicina, antibióticos antineoplásicos, tales como mitomicina y bleomicina, alcaloides de la vinca, tales como vinblastina y vincristina, agentes alquilantes, tal como ciclofosfamida e hidrocloruro de mecloroetamina, y derivados púricos y pirimidínicos, tales como 5-fluorouracilo (véase Goodman y Gilman, eds., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6ª edición, MacMillan & Co., 1980, páginas 1249-1314).

Para determinar si un agente antineoplásico ionizable se cargará en los liposomas en respuesta a un gradiente de pH transmembranal, se forman los liposomas que contienen EPC (EPC 1 mM aproximadamente) con un marcador ^{3}H- DPPC y con un medio interno relativamente ácido o básico, tal como ácido cítrico 300 mM a aproximadamente pH 4,0. Estos liposomas se extruyen aproximadamente 10 veces, según el procedimiento de LUVET, a través de 2 filtros de 100 nm, seguido por el ajuste del pH externo a un pH relativamente ácido o básico, por ejemplo, carbonato sódico, a aproximadamente pH 11,0. Después de la formación del gradiente de pH, se mezcla el agente que se va a cargar, marcado con un isótopo radiactivo del agente, con los liposomas hasta aproximadamente 200 \muM (por 1,0 mM de lípido usado). Se separan los liposomas del agente libre no atrapado en minicolumnas de Sephadex G50-M a 500 x g durante 3 minutos en tubos de 13 x 100 mm, y se cuenta la radiactividad en un contador de centelleo. A continuación se representa la toma de medicamento en nmoles por \mumol de lípido con respecto al tiempo de incubación. En estas condiciones ciento por ciento de la doxorrubicina disponible se toma por los liposomas.

En el caso de doxorrubicina, se pueden utilizar en la invención formas comercialmente disponibles, tales como formas en polvo, sólidas, y conteniendo metilparabeno (adriamicina, R. D. F., Adries Laboatories, Inc., Columbus, Ohio). Cuando se utiliza la forma que contiene metilparabeno, se puede añadir a esa forma una solución acuosa, tal como solución salina, por lo que se disuelve, seguido de la mezcla de esta suspensión con los liposomas que tienen el gradiente de pH transmembranal a través de sus bicapas. Tal mezcla a 60ºC durante unos 10 minutos da como resultado más de aproximadamente 98% de encapsulación de la doxorrubicina.

Los fosfolípidos que se pueden utilizar en las formulaciones liposómicas de la presente invención comprenden dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC, por sus siglas en inglés), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC, por sus siglas en inglés), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC, por sus siglas en inglés) o diaraquidonoilfosfatidilcolina (DAPC, por sus siglas en inglés).

Los fosfolípidos pueden ser sintéticos o derivados de fuentes naturales.

En las realizaciones preferidas, se utilizan fosfolípidos y colesterol preferiblemente en una relación en moles 55 : 45. Se pueden utilizar diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) y dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) en una relación en moles de 55 : 45 con colesterol. Similarmente, se pueden utilizar dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) o diaraquidonoilfosfatidilcolina (DAPC). Debido a las elevadas temperaturas de transición (T_{C}) de los lípidos, tales como DSPC (T_{C} de aproximadamente 65ºC), DPPC (T_{C} de aproximadamente 45ºC), y DAPC (T_{C} de aproximadamente 85ºC), se calientan preferiblemente tales lípidos aproximadamente a su T_{C} o temperaturas ligeramente más elevadas (p. ej., hasta aproximadamente 5ºC más) que la T_{C} para hacer estos liposomas.

También pueden contener los liposomas otros componentes esteroideos, tales como derivados de polietilenglicol de colesterol (PEG-colesteroles), coprostanol, colestanol, o colestano, o alfa-tocoferol. Pueden contener también derivados de ácidos orgánicos de esteroles, tales como hemisuccinato de colesterol (CHS, por sus siglas en inglés), y similares. Se pueden utilizar también derivados de ácidos orgánicos de tocoferoles como ingredientes formadores de liposomas, como hemisuccinato de alfa-tocoferol (THS, por sus siglas en inglés). Se pueden preparar liposomas que contienen CHS y THS o sus formas de sales tris por cualquier método conocido en la técnica para preparar liposomas que contengan estos esteroles. En particular véanse los procedimientos de Janoff et al., documento de patente de EE.UU. Nº 4.721.612, publicado el 26 de enero,1988, titulado ``Steroidal Liposomes'', y Janoff et al., publicación PCT N1 87/02219, publicada el 23 de abril, 1987, titulada ``Alpha tocopherol-Based Vesicles'', incorporándose aquí como referencia partes relevantes de éstas. Los liposomas pueden contener también glicolípidos.

En la presente invención, la concentración de lípidos utilizada es preferiblemente 50 mg/ml a 200 mg/ml, más preferiblemente 90 mg/ml a 100 mg/ml, pero puede ser cualquier concentración lipídica de la que se conoce en la técnica, como la concentración crítica micelar, a aproximadamente 40% acuosa (en peso). Las relaciones en peso utilizadas en la presente invención del medicamento con respecto al lípido pueden ser tan altas como 3 : 1. Para los medicamentos cargados mediante un gradiente de pH transmembranal, específicamente para doxorrubicina, van preferiblemente de 0,1 : 1 a 3 : 1, más preferiblemente 0,3 : 1 aproximadamente. Esta relación puede variar según la formulación lipídica y el tamaño de vesícula, tal como se describe más adelante. Para vincristina, la relación medicamento : peso del lípido es 0,1 : 1 a 1 : 1, preferiblemente 0,1 : 1 a 0,29 : 1.

La eficacia de atrapado de doxorrubicina depende de la relación del medicamento con respecto al lípido

Variando la relación del medicamento con respecto al lípido (peso/peso) para vesículas que contengan citrato 300 mM (pH 4,0) entre 1 : 10 y 1 : 3 no tiene efecto en la eficacia de atrapado de doxorrubicina. Se consiguen valores de aproximadamente 100% de atrapado en este intervalo, y se libera menos de aproximadamente 5% del medicamento durante 24 horas en estas relaciones de medicamento con respecto a lípido. Sin embargo, las eficacias de atrapado disminuyen significativamente a medida que se aumenta la relación inicial de medicamento con respecto a lípido por encima de aproximadamente 1 : 2, y estas vesículas muestran también cinética elevada de liberación de doxorrubicina. No se afecta esencialmente la eficacia de atrapado por el tamaño de vesícula, las relaciones de medicamento con respecto a lípido dentro del intervalo preferido de esta invención, o la composición lipídica, puesto que se pueden obtener eficacias de atrapado de aproximadamente 100% para vesículas que van en tamaño desde aproximadamente 100 nm a 1,4 mm, para relaciones de medicamento con respecto a lípido (peso/peso) de 0,1 : 1 a 0,3 : 1 y para composiciones lipídicas que contengan fosfolípidos neutros, cargados negativamente o saturados, así como cantidades variables de colesterol.

Liberación del medicamento de doxorrubicina depende de la composición lipídica

La propiedades de liberación de doxorrubicina in vitro demuestran la dependencia de la composición lipídica. Las preparaciones conteniendo colesterol eran más resistentes a la liberación de medicamento, y las que contenían colesterol y fosfatidilglicerol de huevo daban una liberación de medicamento intermedia entre las que contenían solamente EPC y las que contenían EPC/colesterol.

Toxicidad de doxorrubicina

Se ve que la doxorrubicina administrada en los liposomas de la presente invención es de menor toxicidad que la doxorrubicina administrada de forma libre. Se ha visto en la evaluación toxicológica de la dexorrubicina liposómica en ratones un aumento de 2,3 veces en valores agudos de la LD_{50}, con una pérdida de peso significativamente menor.

Las LD_{50}s de ratón aparentes eran dependientes de la composición lipídica. La LD_{50 }de la doxorrubicina liposómica aumenta a medida que aumenta el contenido en colesterol de los liposomas de 0 a 45% en moles, o cuando la formulación lipídica incluye DSPC.

La toxicidad aguda de la doxorrubicina liposómica era relativamente insensible al tamaño de vesícula en el intervalo de diámetro de 0,15 a 1, 4 \`{\i}m, y aumentaba ligeramente más allá de 150 nm.

Las variables como carga y tamaño de la superficie del liposoma no cambian significativamente la toxicidad aguda de la doxorrubicina liposómica, tal como lo hacen los cambios en la composición lipídica. Además, el uso de DSPC/colesterol aumenta dramáticamente la LD_{50} (< 200 mg/kg), que es 4 y 10 veces mayor que la observada para medicamento atrapado en EPC/colesterol y libre respectivamente. Tales formulaciones tienen también unos niveles de acumulación de medicamento muy bajos en tejidos cardiacos, pulmonares y renales. La elevación de las relaciones de medicamento con respecto a lípido tiene un efecto dramático en la mejora de la toxicidad de la doxorrubicina. Los estudios anteriores no han mostrado este efecto, debido a las limitaciones en atrapado de doxorrubicina mediante técnicas de atrapado del estado anterior de la técnica. Aunque tal atrapado del medicamento conduce a su toma por el hígado, no se observa una lesión aguda hepática.

Eficacia de la formulación liposómica

Se ensayó la eficacia de las formulaciones liposómicas antineoplásicas de la presente invención teniendo composiciones lipídicas, tamaños liposómicos, y relaciones del medicamento con respecto al lípido variables en ratones hembra DBA/2, utilizando el modelo de leucemia linfoide L1210. Se analizaron los efectos antitumorales del medicamento libre y de las formulaciones liposómicas utilizando este modelo. Los animales recibieron la dosis máxima tolerada (MTD, por sus siglas en inglés) de las formulaciones liposómicas y se midió su aumento del tiempo de vida (ILS, por sus siglas en inglés) con respecto a controles sin tratar y se comparó con los ILS de la doxorrubicina libre.

Vincristina - Toxicidad y eficacia

En el caso de la vincristina, la asociación del medicamento con el liposoma hace al medicamento menos tóxico que el medicamento libre, y eficaz contra la línea tumoral L1210 ascítica, en la que el medicamento libre no tiene eficacia en este modelo.

Se pueden utilizar diferentes métodos para formar los liposomas de la invención. Se pueden utilizar, por ejemplo, vesículas multilaminares (MLVs), vesículas plurilaminares estables (SPLVs) o vesículas de evaporación mediante fase inversa (REVs). Preferiblemente, se extrusionan MLVs a través de filtros formando LUVs de tamaños dependientes según el tamaño del poro del filtro. Se utilizan filtros de policarbonato de tamaños de poro de 30, 50, 60, 100, 200 ó 800 nm. En este método, descrito por Cullis et al., publicación PCT nº 86/000238, 16 de enero, 1986, se puede pasar repetidamente la suspensión liposómica a través del dispositivo de extrusión dando como resultado una población de liposomas de distribución homogénea de tamaño. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la filtración a través de un filtro de membrana de paso recto (un filtro de policarbonato Nucleopore) o de un filtro de paso sinuoso (p. ej. un filtro membrafil Nucleopore (ésteres compuestos de celulosa) de tamaño de 0,1 \mum), o mediante técnicas alternativas de reducción de tamaño, tal como homogenización. Los liposomas de la presente invención pueden ser des aproximadamente 30 nm a aproximadamente 2 micras de diámetro, preferiblemente de 50 nm a 300 nm aproximadamente, preferiblemente de 60 nm a 300 nm aproximadamente, y lo más preferido 100 a 300 nm aproximadamente. Este intervalo de tamaño comprende liposomas que pueden ser MLVs, SPLVs, o LUVs. En la presente invención, se prefieren liposomas que son liposomas unilaminares de 100 nm a 300 nm; tales liposomas son LUVs. El intervalo de tamaño de SUVs. es 25-50 nm.

Cuando se utilizan lípidos que tienen una T_{C} de gel a cristalino-líquido por encima de la temperatura ambiental, se puede emplear un extrusor que tiene un tambor calentado (termocubierta). Tal dispositivo sirve para aumentar la temperatura de la suspensión liposómica permitiendo la extrusión de estos LUVs. Tales lípidos utilizados con el extrusor con termocubierta son, por ejemplo, DSPC, DPPC, DMPC y DAPC. Se pueden combinar estos lípidos con colesterol en una relación 55 : 45 en moles, por ejemplo. Los liposomas conteniendo DSPC se extruirían a aproximadamente 65ºC, DPPC a aproximadamente 45ºC y DAPC a aproximadamente 85ºC o aproximadamente 5ºC por encima de la T_{C} del lípido. Es otra realización de esta invención que se puedan formar LUVs empleando estos lípidos que tienen una T_{C} por encima de temperaturas ambientales. Las técnicas previas utilizadas con tales lípidos para formar pequeñas vesículas empleaban la sonicación, que crea SUVs. (intervalo de tamaño de 25-50 nm).

Las vesículas unilaminares grandes de esta invención comprendiendo los lípidos de cadena larga saturada son de 60 nm a 300 nm de tamaño. Estas LUVs pueden atrapar un agente bioactivo, tal como por ejemplo un agente antineoplásico. El uso del sistema LUVET con lípidos de cadena larga saturada puede dar como resultado LUVs teniendo una distribución homogénea de tamaño; ésta puede ser una distribución unimodal de las vesículas. Tal como se define en la presente invención, una población homogénea de vesículas es una compuesta sustancialmente de liposomas del mismo tamaño, y puede tener una distribución de Gauss en el tamaño de las partículas. También se dice que una población de este tipo es de una distribución uniforme de tamaño, y puede ser unimodal con respecto al tamaño. El término ``unimodal'' se refiere a una población que tiene una polidispersión estrecha de los tamaños de partículas, y las partículas son de una sola ``moda''.

Una población liposómica es unimodal, si cuando se mide mediante métodos de dispersión de luz casi elástica, la población tiene una distribución de Gauss, y si un polinomio de segundo orden se ajusta al logaritmo natural de la función de autocorrelación de una muestra (Koppel, 1972, J. Chem. Phys., 57: 4814). Cuanto mejor sea este ajuste, mejor será la medida de la unimodalidad. Se puede determinar la fineza de este ajuste mirando la cercanía del valor de chi cuadrado (chi^{2}) a la unidad (1,0). Un valor de 2,0 y menor es indicativo de una población unimodal.

Se pueden emplear en la técnica de la invención otras técnicas de reducción de tamaño. Por ejemplo, se pueden emplear con éxito técnicas de homogenización o molido. Con tales técnicas se pueden conseguir liposomas que son homogéneos o unimodales con respecto a la distribución de tamaño.

Durante la preparación de los liposomas, se pueden utilizar disolventes orgánicos para disolver los lípidos. Disolventes orgánicos apropiados son aquellos con una variedad de polaridades y propiedades dieléctricas, que solubilizan lípidos, y que comprenden, pero no se limitan a, cloroformo, metanol, sulfóxido de dimetilo (DMSO, por sus siglas en inglés), cloruro de metileno, y mezclas de disolventes, tales como benceno : metanol (70 : 30). Como resultado, se forman soluciones (mezclas en las cuales los componentes están uniformemente distribuidos) conteniendo los lípidos. Se eligen los disolventes en base a su biocompatibilidad, baja toxicidad e inflamabilidad.

Una realización de la presente invención es un sistema de tratamiento de agente antineoplásico liposómico de 3 componentes, que permite el atrapado del agente en el lugar clínico. Cuando el medicamento es doxorrubicina o vincristina u otro agente antineoplásico que se cargará en respuesta a un gradiente de pH transmembranal, en donde el interior de los liposomas es ácido, el primer componente del sistema (vial 1) son liposomas en tampón de ácido cítrico (300 mmolar, pH 3,8 - 4,2, preferiblemente pH 4,0). El segundo componente (vial 2) es una base, preferiblemente solución de carbonato sódico o de bisfosfato sódico a 0,5 M, pH 11,5. El tercer componente (vial 3) es el agente antineoplásico. El sistema de tratamiento antes mencionado se puede proporcionar como un sistema de 3 viales, con un primer vial conteniendo los liposomas en medio ácido, el segundo vial conteniendo la base, y un tercer vial conteniendo el agente antineoplásico (p. ej. doxorrubicina). Cuando el medicamento sea uno que se carga en respuesta a un gradiente transmembranal, en el que el interior de los liposomas es relativamente básico (tal como, por ejemplo, 5-FU), el primer componente del sistema son liposomas en tampón de carbonato sódico (tal como, por ejemplo pH 6,8-11,0, preferiblemente 9,6). El segundo componente es una solución relativamente ácida, por ejemplo, sulfato potásico 150 mM/tampón de HEPES 150 mM, pH 7,4. El tercer componente comprende el agente antineoplásico. Después de la formación del gradiente de pH a través de los liposomas (mediante la mezcla de los primeros y segundos viales), se pueden calentar los liposomas antes de mezclarlos con el medicamento. Se ha hallado que es ventajoso cuando se carga doxorrubicina, vincristina, y FU, el calentar los liposomas a aproximadamente 60ºC. Daunorrubicina, epirrubicina, mitoxantrona, y vincristina se cargan eficazmente a 25ºC.

Cuando se utiliza el sistema de viales antes descrito en el caso de cargar doxorrubicina, se pueden mezclar los componentes justo antes de usarlos, según el siguiente método. Se añade solución de carbonato sódico del vial 2 a los liposomas del vial 1. Se calienta la mezcla a una temperatura elevada (p. ej. al baño María de 60ºC) de 5 a 10 minutos. Seguidamente se añaden las soluciones combinadas de carbonato y liposomas al vial 3 que contiene el agente antineoplásico (doxorrubicina) y lactosa. Se mezcla este vial en el vórtex, seguidamente se calienta a una temperatura elevada (p. ej. 60ºC), con mezcla en el vórtex cada 5 minutos durante el calentamiento. A continuación se diluye la suspensión resultante liposomas-medicamento con solución salina normal o dextrosa al 5%. Se ajusta la solución final a pH 6,9-8,0, preferiblemente pH 7,5.

En el caso de cargar vincristina, se puede emplear de forma similar el protocolo anterior, pero se puede alterar la secuencia de mezclado. Por ejemplo, se puede mezclar la vincristina con los liposomas a pH ácido (pH 4,0), a continuación se establece el gradiente de pH mediante la adición de una solución relativamente básica.

En el aspecto del ensayo antineoplásico de la invención, se describe un ensayo para determinar las proporciones de medicamento antineoplásico libre y atrapado por los liposomas en las preparaciones liposómicas, basado en la respuesta espectral dependiente del pH (p. ej., infrarrojo, ultravioleta, o visible). Por ejemplo, a pH de aproximadamente 7,9, la doxorrubicina exhibe una absorbancia máxima a 489 nm, mientras que a pH alcalino (aproximadamente 10,0), se observan picos de absorbancia a 550 y 592 nm (Figura 15). De esta manera, se pueden determinar las concentraciones de doxorrubicina libre en los sistemas liposómicos mediante el control de la absorbancia a 600 nm después de alcalinizar los medios extravesiculares (solución de lavado liposómico) con una base, tal como hidróxido sódico (absorbancia diferencial). Tal procedimiento induce la desviación espectral de la doxorrubicina libre y de la doxorrubicina no atrapada en los liposomas, puesto que la bicapa lipídica es capaz de aislar la doxorrubicina atrapada de los medios externos alcalinos. Por tanto, la O.D._{600} resultante refleja la cantidad de doxorrubicina no atrapada en la preparación. A continuación se cuantifican las concentraciones resultantes de doxorrubicina mediante la repetición de la medida después de solubilizar los liposomas rompiendo los liposomas mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo con Triton X-100 (exponiendo por tanto toda la doxorrubicina al ambiente alcalino). La tasa de absorbancia a 600 nm es directamente proporcional a la doxorrubicina libre en tanto por ciento en preparaciones de vesículas, tal como se detecta por técnicas normalizadas de cromatografía en columna. Se determinan las proporciones de medicamento no atrapado como la relación de la absorbancia obtenida después de la alcalinización con NaOH dividida por la que se observa en presencia de Triton X- 100 (midiendo un diferencial de absorbancia).

Se comparó el análisis espectroscópico de las preparaciones de doxorrubicina liposómica con métodos de cromatografía de columna, que miden directamente el medicamento libre y asociado a las vesículas para correlacionar los valores de tasas de absorbancia con las relaciones DOX libre real/DOX total, en un intervalo amplio de eficacias de atrapado. Puesto que los gradientes de pH inducen la toma de doxorrubicina en los liposomas, de tal manera que las relaciones

\hbox{[DOX] _{dentro} }

/[DOX]_{fuera} reflejan las relaciones [H^{+}]_{dentro}/[H^{+}]_{fuera}, se utilizaron liposomas de EPC/colesterol exhibiendo gradientes de pH (interior ácido) de magnitud variada para construir sistemas liposómicos con eficacias de atrapado de 10 a 99%. La Figura 5 demuestra que la tasa de absorbancia a 600 nm, aquí descrita de manera precisa, representa la relación de doxorrubicina libre/total en las preparaciones vesiculares en todo el intervalo de eficacias de atrapado estudiadas. Se completó también el método de análisis espectroscópico en liposomas de EPC, en los cuales la doxorrubicina se había atrapado pasivamente durante la formación de las vesículas, para asegurar que estos resultados no eran específicos de la doxorrubicina liposómica obtenida por atrapado activo. La Figura 5 (símbolos abiertos) muestra que la tasa de absorbancia a 600 nm para esta muestra, se correlaciona con el valor de doxorrubicina libre/total obtenido por cromatografía de columna.

Las características de absorbancia del desvío espectral también permiten que se pueda apreciar visualmente la cantidad relativa de doxorrubicina libre en las preparaciones liposómicas. Aunque este tipo de análisis en cualitativo, se puede detectar la presencia de 5% de medicamento libre y se observa un cambio de color para sistemas que exhiben más del 15% de medicamento libre.

A causa de que la doxorrubicina liposómica se puede confirmar visualmente mediante este proceso sin el uso de ningún equipo científico, se pueden reconocer las muestras inmediatamente antes del uso in vivo para determinar si están presentes o no niveles peligrosos de medicamento libre.

Se puede determinar la utilidad del ensayo espectrofotómetrico con un medicamento antineoplásico mediante el control del cambio espectral de picos como una función del pH de la solución de lavado.

A continuación se pueden romper los liposomas que contienen el medicamento, y medir el medicamento liberado en el mismo intervalo, por ejemplo, en el intervalo de visible, ultravioleta, o infrarrojo. Se puede cuantificar la diferencia en absorción como para la muestra anterior de doxorrubicina, y calcular el porcentaje de medicamento libre en la muestra.

Considerando otro aspecto de la presente invención, el sistema de 3 viales incluye también un cuarto vial de ensayo, que contiene una solución indicadora de atrapado, que se utiliza en la realización de ensayo espectrofotométrico de la invención, por ejemplo, como agentes alcalinizadores, tal como hidróxido sódico 0,1 N (NaOH) que ensaya el atrapado de doxorrubicina. Se añade una parte alícuota (0,5 ml) de la preparación diluida liposoma-doxorrubicina contenida en el vial 3 a la solución de NaOH, y se compara el color resultante con la carta de colores que se da. De manera alternativa, se puede leer espectrofotométricamente la absorbancia de la solución resultante. Dependiendo del grado de atrapado, la reacción de la doxorrubicina con el hidróxido sódico dará como resultado un color de rojo a azul. El grado del color rojo o azul es dependiente del atrapado.

Se debe entender que la presente invención no estará limitada por el sistema sugerido de empaquetado, sino que se pueden emplear sistemas alternativos, tales como cualquier empaquetado en cámara múltiple y dispositivos y técnicas de mezclado conocidos en la técnica, con resultados similares.

Deshidratación liposómica y almacenado

Se pueden liofilizar o deshidratar en las diferentes etapas de formación los liposomas formados por los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, se puede liofilizar la lámina lipídica después de eliminar el disolvente y antes de añadir el medicamento. De manera alternativa, se puede liofilizar la lámina lípido-medicamento antes de hidratar los liposomas. Se puede llevar a cabo esta hidratación mediante la exposición del lípido o liposoma a presión reducida, eliminando por tanto todo disolvente en suspensión. Se pueden deshidratar los liposomas en presencia de un agente hidrófilo, según los procedimientos de Bally et al., publicación PCT nº 86/01102, publicada el 27 de febrero, 1986, titulada ``Encapsulation of Antineoplastic Agents in Liposomes'', y Janoff et al., publicación PCT nº 86/001103, publicada el 27 de febrero, 1986, titulada ``Dehydrated Liposomes'', o Schneider et al., en documento de patente de EE.UU. nº 4.229.360 publicada el 29 de octubre, 1980. De manera alternativa o adicionalmente, se puede deshidratar también la preparación liposómica hidratada colocándola en medio circundante en nitrógeno líquido y congelándola antes de la etapa de deshidratación. Se puede realizar la deshidratación con congelado previo en presencia de uno o más agentes protectores, tales como azúcares, en la preparación, según las técnicas de Bally et al., publicación PCT nº 86/01103, publicada el 27 de febrero, 1986,. Tales técnicas favorecen el almacenamiento y estabilidad a largo plazo de las preparaciones. Por ejemplo, se puede mezclar el agente neoplásico liposómico con una solución de azúcar en una relación azúcar : lípido de 0,5 : 1 a 50 : 1, y preferiblemente 20 : 1 aproximadamente. Después de la rehidratación, tales liposomas retienen esencialmente todo el agente antineoplásico antes cargado, para tales liposomas clasificados por tamaño a través de filtros de tamaño de poro de 100 y 200 nm. En una realización preferida, el azúcar es manitol, o manitol : glucosa : lactosa en una relación 2 :1 : 1 p/p/p. Después de la rehidratación en agua destilada, se calienta preferiblemente la preparación durante diez minutos a una temperatura elevada, por ejemplo 60ºC. Se pueden utilizar otros métodos apropiados en la deshidratación de las preparaciones liposómicas antes descritas. También se pueden deshidratar los liposomas sin congelado previo.

Una vez que los liposomas se han deshidratado, se pueden almacenar durante periodos extensos de tiempo hasta que se utilicen. La temperatura apropiada de almacenamiento dependerá de la formulación lipídica de los liposomas y de la sensibilidad a la temperatura de los materiales encapsulados. Por ejemplo, varios agentes antineoplásicos son lábiles al calor, y por tanto los liposomas deshidratados que contienen tales agentes se deberían almacenar en condiciones de refrigeración, p. ej. a aproximadamente 4ºC, de tal manera que no se pierda la potencia del agente. También para tales agentes, es preferible llevar a cabo el proceso de deshidratación a temperaturas reducidas, mejor que a temperatura ambiental.

Cuando los liposomas deshidratados se vayan a usar, se realiza la rehidratación añadiendo simplemente una solución acuosa, p. ej., agua destilada o un tampón apropiado, a los liposomas y dejándoles que se rehidraten. Los liposomas se pueden volver a suspender en la solución acuosa mediante ligero agitado de la solución. Se puede realizar la rehidratación a temperatura ambiente o a otras temperaturas apropiadas para la composición de los liposomas y sus contenidos internos. Si el agente antineoplásico que se va a administrar se incorporó en los liposomas con elevada relación de medicamento con respecto a lípido antes de la deshidratación, y no se desean más cambios en la composición, se pueden utilizar directamente los liposomas rehidratados en la terapia contra el cáncer siguiendo procedimientos conocidos para administrar medicamentos encapsulados en liposomas. De manera alternativa, utilizando los procedimientos de gradiente de pH transmembranal antes descritos, se pueden incorporar agentes antineoplásicos ionizables en los liposomas rehidratados justo antes de su administración. En relación con este trabajo, se puede crear el gradiente de concentración utilizado para generar el gradiente de pH transmembranal o antes de la deshidratación o después de la rehidratación, utilizando las técnicas anteriormente descritas de cambio de medio externo. Por ejemplo, se pueden deshidratar los liposomas con elevada relación de medicamento con respecto al lípido antes de estableces el gradiente de pH transmembranal, por ejemplo deshidratados a partir de su primer medio externo. Después de la rehidratación, se puede establecer el gradiente de pH mediante la mezcla de los liposomas con el segundo medio externo de pH relativamente ácido o básico. Se puede mezclar el agente antineoplásico con los liposomas al mismo tiempo que se establece el pH, o después.

En el caso en que los liposomas se deshidratan después de tener un gradiente de pH transmembranal, se pueden rehidratar los liposomas mediante su mezcla con una solución acuosa de pH neutro.

Por ejemplo, en el caso antes mencionado, en el que se utilizan liposomas que contienen tampón de ácido cítrico como el primer medio externo, se realizaría la etapa de rehidratación mediante la adición de carbonato sódico y del agente antineoplásico, tal como doxorrubicina. En el caso de que se rehidraten liposomas que ya contienen la base (p. ej. carbonato sódico), y tienen por tanto el gradiente de pH transmembranal, se añade agua u otra solución acuosa neutra, y la doxorrubicina. Finalmente, en el caso de que se hayan deshidratado liposomas que tienen un gradiente de pH transmembranal y que contienen doxorrubicina, se realiza la rehidratación utilizando agua u otra solución acuosa. De manera alternativa, se puede añadir, si se quiere, otro agente antineoplásico.

Los liposomas conteniendo agentes antineoplásicos y sus formulaciones farmacéuticas de la presente invención y los que se producen por sus procesos se pueden utilizar terapéuticamente en animales (incluyendo el hombre) en el tratamiento de infecciones o de estados que necesitan: (1) administraciones repetidas, (2) suministro sostenido del medicamento en su forma bioactiva, o (3) la toxicidad disminuida con eficacia apropiada en comparación con el medicamento libre en cuestión. Tales condiciones comprenden, pero no se limitan a, neoplasmas, tales como los que se pueden tratar con agentes antineoplásicos.

El modo de administración de los liposomas que contienen agentes antineoplásicos y sus formulaciones farmacéuticas pueden determinar los lugares y células en el organismo a los cuales se suministrará el compuesto. Se pueden administrar solos los liposomas de la presente invención, pero generalmente se administrarán mezclados con un excipiente farmacéutico seleccionado según la vía de administración que se desea y la práctica farmacéutica generalizada. Se puede inyectar las preparaciones de forma parenteral, por ejemplo de forma intravenosa. Para la administración parenteral se pueden utilizar por ejemplo en forma de una solución acuosa estéril, que puede contener otros solutos, por ejemplo suficientes sales o glucosa para hacer la solución isotónica. Se pueden dar los liposomas de doxorrubicina, por ejemplo, como una infusión intravenosa durante 60 minutos en una dosis de al menos 20 mg/m^{2} aproximadamente. Se puede emplear también para lavado peritoneal o administración intratecal por inyección. Se pueden también administrar de manera subcutánea, por ejemplo en el lugar de la metástasis de los nódulos linfáticos. Se pueden considerar otros usos por los expertos de la técnica, dependiendo de las propiedades particulares de la preparación.

Para el modo oral de administración, se pueden utilizar las formulaciones de agente antineoplásico liposómico de esta invención en la forma de comprimidos, cápsulas, grageas, pastillas, polvos, jarabes, elixires, soluciones acuosas y suspensiones y similares. En el caso de comprimidos, se pueden utilizar excipientes que comprendan lactosa, citrato sódico, y sales de ácido fosfórico. Se utilizan normalmente en los comprimidos diferentes agentes desintegradores, tales como almidón, y agentes lubricantes, tal como estearato magnésico, laurilsulfato sódico y talco. Para la administración oral en forma de cápsula, son diluyentes útiles lactosa y polietilenglicoles de elevado peso molecular. Si son necesarias suspensiones acuosas para el uso oral, se combina el ingrediente activo con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, se pueden añadir ciertos edulcorantes y/o aromatizantes.

Para la manera tópica de administración, se pueden incorporar las formulaciones de medicamento antineoplásico de la presente invención en formas de dosificación, como geles, aceites, emulsiones, y similares. Se pueden administrar tales preparaciones por aplicación directa, como una crema, pasta, pomada, gel, loción o similar.

Para su administración a humanos en el tratamiento curativo, de remisión, retardante, o preventivo de enfermedades neoplásicas, el médico que lo prescriba, determinará en última instancia la dosis apropiada del medicamento antineoplásico para un determinado sujeto humano, y esto se espera que varíe según la edad, peso, y respuesta del individuo, así como la naturaleza y gravedad de la enfermedad del paciente. La dosis del medicamento en forma liposómicas será por lo general y aproximadamente la misma que se emplea para el medicamento libre. Sin embargo, en algunos casos puede ser necesario administrar dosis fuera de estos límites.

Se dan los siguientes ejemplos solamente con el objeto de ilustrar y no para limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Se añadió ácido cítrico (1,0 ml de una solución 150 mM, pH 4,0) a 200 mg de EPC/colesterol (relación en moles de 1 : 1) en un tubo de ensayo. Se mezcló el tubo en el vórtex durante 5 minutos para dispersar homogéneamente la solución y crear MLVs. Se transfirió la muestra a un vial criogénico de 2, 0 ml de capacidad, se sumergió en nitrógeno líquido durante 2 minutos, seguidamente se calentó a 40ºC al baño María hasta que la muestra estuvo completamente fundida. Se ciclo de congelación-descongelación se repitió 7 veces con un corto mezclado de la muestra en el vórtex justo antes de la etapa de congelación, creando FATMLVs. Seguidamente se extrusionó la muestra 7 veces a través de 2 filtros apilados de policarbonato de 0,2 \mum según el procedimiento de LUVET. Se diluyó esta muestra 2 veces con solución salina no tamponada al 0,85%. Se calentó inicialmente la solución liposómica a 60ºC durante 5 minutos y se añadió a un vial que contenía doxorrubicina en polvo (22,2 mg de dox/100 mg de lípido) y carbonato sódico en polvo (3,75 mg/22,2 mg de dox). Se calentó la muestra a 60ºC durante 5 minutos y se mezcló intermitentemente en el vórtex.

Ejemplo 2

Se siguieron los procedimientos del Ejemplo 1, utilizando ácido cítrico 300 mM (pH 4,0) y una concentración lipídica de 100 mg/ml. No se diluyeron los liposomas con solución salina, y se añadió bicarbonato sódico como diluyente, ajustando el pH exterior a aproximadamente pH 8,0 antes de la adición de doxorrubicina.

Ejemplo 3

Se prepararon liposomas que encapsularon activamente doxorrubicina mediante la hidratación de una lámina de EPC (depositada a partir de CHCl_{3} y colocada a elevado vacío durante 12 h) en tampón de ácido cítrico 300 mM (pH 4,0) para conseguir una concentración final de lípidos de 100 mg/ml. Se congelaron y descongelaron estas MLVs 5 veces y se extrusionaron 5 veces a través de filtros de policarbonato con un tamaño de poro de 0,2 \mum según la técnica de LUVET. A continuación se ajustaron los liposomas a pH 7,5 con Na_{2}CO_{3} 1,0 M, y se incubaron con doxorrubicina a 60ºC durante 5 minutos.

Se hicieron los liposomas que atraparon pasivamente doxorrubicina utilizando los materiales anteriores, mediante la suspensión de doxorrubicina en tampón (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) hasta doxorrubicina 2,0 mM, antes de la etapa de hidratación del lípido. Se congelaron los liposomas y se descongelaron y se extruyeron, tal como se describe anteriormente. Se consiguió el atrapado activo de doxorrubicina mediante la preparación de vesículas en tampón a pH 4,0, aumentando el pH exterior a 7,5 con Na_{2}CO_{3} 1,0 M, e incubando las vesículas (lípido 20 mM) con doxorrubicina (10 mg de lípido/ml) a 60ºC durante 5 minutos.

Para determinar la eficacia de atrapado de las preparaciones liposómicas, se controló espectrofotométricamente la doxorrubicina libre y encapsulada en los liposomas empleando un espectrofotómetro Shimadzu UV-160, tal como sigue: se diluyeron las muestras de doxorrubicina liposómica con Hepes 20 mM, NaCl 250 mM (pH 7,5) para conseguir concentraciones apropiadas de doxorrubicina entre 0,05- 0,10 mM. Se realizó la siguiente secuencia de medidas: (1) se ajustó a cero la absorbancia a 600 nm de la muestra diluida; (2) se alcalinizó la muestra hasta pH 10,5 con NaOH 1,0 N (0,02 ml/1,0 ml de la muestra) y se registró la absorbancia a 600 nm en dos minutos; (3) se colocó el espectrofotómetro a cero contra una solución de Triton X-100 al 0,2%, y (4) se determinó la absorbancia a 600 nm de la muestra de doxorrubicina liposómica a la cual se había añadido Triton X-100 (0,02 ml de Triton X-100 al 20% en peso/en peso/1,0 ml de la muestra). Se calcularon las relaciones de doxorrubicina libre : total como la absorbancia a 600 nm después de la adición de NaOH dividida por la absorbancia después de la adición de Triton X-100.

Para relacionar la técnica de respuesta espectral dependiente del pH con los niveles reales de medicamento libre y atrapado, se determinó como sigue la doxorrubicina atrapada en las vesículas: Se hizo pasar una pequeña parte alícuota de la solución de doxorrubicina liposómica por columnas de gel de Sephadex G-50 equilibradas con Hepes 20 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) para separar el medicamento libre del asociado a los liposomas. Se ensayaron el eluyente conteniendo liposomas, así como partes alícuotas de las soluciones originales, para detectar fosfolípido y doxorrubicina mediante análisis de fósforo y densidad óptica a 480 nm respectivamente, tal como se ha descrito previamente en Mayer et al., (1986), Biochim. Biophys. Acta., 857: 123.

Se repitió el procedimiento anterior utilizando EPC/colesterol (55 : 45, mol : mol), 10 mg por ml de lípido total.

Ejemplo 4

Se emplearon los materiales y procedimientos del Ejemplo 3, utilizando tampón de ácido cítrico a pH 4,2, 5,2, 5,7, 6,7, y 7,2. La Figura 5 demuestra que la relación de absorbancia (Abs._{600} - NaOH/ Abs._{600} después de Triton X-100) representa exactamente la relación de doxorrubicina libre/total en las preparaciones vesiculares en todo el intervalo de las eficacias de atrapado.

Ejemplo 5

Se emplearon los materiales y procedimientos del Ejemplo 3, pero la eficacia de atrapado de la doxorrubicina encapsulada en liposomas se controló mediante la comparación con una carta de colores del color resultante de la adición de una parte alícuota (0,2 ml) de los liposomas a NaOH 1,0 N.

Ejemplo 6

Se secó a partir de cloroformo EPC/colesterol (relación 55/45 mol/mol) (200 mg) para dar una lámina fina, a presión reducida a 37ºC durante 12 horas. Se añadió ácido cítrico (1,0 ml de 150 mM a pH 4,0) y se suspendió la lámina. Se congelaron y descongelaron 7 veces las MLVs resultantes, como en el Ejemplo 1, y se extruyeron 5 veces a través de un filtro de policarbonato de 200 nm utilizando el procedimiento de LUVET. Se determinaron las distribuciones de tamaño de los liposomas resultantes por dispersión de luz casi elástica (QELS, por sus siglas en inglés) y se observó la morfología general utilizando microscopía electrónica de congelación y fractura. Se añadió solución salina estéril (1,0 ml) a la solución vesicular extrusionada, consiguiendo una concentración lipídica total de 100 mg/ml. Se tituló el pH exterior de los liposomas a 7,5 utilizando NaOH 1,0 N. Seguidamente se calentó a 60ºC durante 3 minutos esta solución liposómica (1,0 ml), y doxorrubicina en polvo (22 mg) (conteniendo Na_{2}CO_{3} con un relación en peso de 1 mg/6 mg de doxorrubicina) con mezclado intermitente en vórtex.

Ejemplo 7

Se emplearon los materiales y procedimientos del Ejemplo 6 para determinar la estabilidad in vitro de las preparaciones de liposoma-doxorrubicina. Se realizaron los experimentos de liberación tal como sigue: se dializaron muestras liposómicas diluidas 10 veces durante 24 horas contra 1000 volúmenes de HEPES 20 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) a 37ºC. A las1, 2, 4, 8, 10 y 24 horas después de la preparación, se eliminó una parte alícuota de 150 \mul y se determinó la doxorrubicina atrapada.

Ejemplo 8

Se emplearon los materiales y procedimientos del Ejemplo 3, sólo que las vesículas se clasificaron por tamaños a través de filtros de tamaño de poro de 1,0 micras y se determinó la estabilidad del suero para las mezclas. Se diluyó la muestra diluida de doxorrubina liposómica con 20 volúmenes de suero humano reciente y se incubó a 37ºC. A las 1, 2, 4, 8, 12 y 24 horas, se peletizaron las vesículas por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos y se lavaron dos veces con HEPES 20 mM, NaCl 150 mM a pH 7,5 y se ensayaron sobre fosfolípido y doxorrubicina, tal como se describe anteriormente.

Ejemplo 9

Se analizó la eficacia de atrapado de liposomas de doxorrubicina tal como sigue:

Después de completar el procedimiento de atrapado según el Ejemplo 6, se diluyeron 20 \mul de liposomas con doxorrubicina hasta 200 \mul con HEPES 20 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5). Se ensayó una parte alícuota de esta dilución para determinar fosfato lipídico por el procedimiento de Bartlett, J. Biol.. Chem. 1959, 234: 465-468. Se eliminó una segunda muestra de 20 \mul de la preparación diluida y se colocó en un tubo de ensayo de vidrio, al cual se añadió Triton X-100 (1,0 ml al 1% p/p). Se calentó la muestra al baño María a 40ºC durante 2 minutos y se mezcló en el vórtex. Se leyó la absorbancia de la muestra a 480 nm en un espectrofotómetro. Se compararon las lecturas de la muestra con una curva normalizada de muestras de doxorrubicina conteniendo cantidades conocidas del agente que se diluyen con 1,0 ml de Triton X-100.

Se prepararon columnas de Sephadex G-50 (grado medio) con una capacidad de 1,0 ml que se habían hinchado inicialmente con gel en HEPES 20 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5). Se centrifugaron las columnas a 500 x g durante 3 minutos, seguido de un giro repetido, para empaquetar columnas. Se aplicaron las muestras de doxorrubicina-liposoma (150 \mul de las muestras diluidas 10 x) a las columnas, seguido de la aplicación de 50 \mul de tampón, y se centrífugo a 3000 rpm durante 5 minutos. Se mezcló el eluyente en el vórtex hasta que se hizo homogéneo. Se eliminaron partes alícuotas (25 \mul) y se analizaron para detectar fosfato y doxorrubicina, tal como se describe anteriormente.

Ejemplo 10

Se siguieron los materiales y procedimientos del Ejemplo 2 y se prepararon los liposomas resultantes para inyectarse mediante su mezcla en solución salina fisiológica estéril, de tal manera que una dosis de 5 mg se pudiera suministrar en 0,2 ml.

Se obtuvieron ratones DBA/2 que pesaban 18-20 gms y se dividieron en grupos de 6 a 10. Se les puso a estos ratones inyecciones intraperitonealmente (0,5 ml) de 1,5 X 10^{6} células tumorales L1210. Se inició el tratamiento 24 horas después de la inyección tumoral y fue por la vena lateral del rabo. Se trataron los animales con doxorrubicina liposómica según el peso corporal medio. Se pesaron diariamente los ratones. Se registró el tiempo de supervivencia en días y se calcularon los tiempos de supervivencia medio y mediano.

Se repitió el procedimiento anterior con el tratamiento administrado siendo EPC/colesterol y DSPC/colesterol, ambos 55 : 45 de relación en moles, doxorrubicina liposómica, tratamiento control son solución salina estéril, y tratamiento control con liposomas vacíos (sin doxorrubicina).

Ejemplo 11

Se realizaron como sigue estudios de LD_{50} comparando doxorrubicina libre y liposómica:

Se dividieron ratones CD-1 de peso corporal medio de 20-25 gm en grupos de 6-10. Se solubilizó doxorrubicina en solución salina estéril inyectable para dar una dosis de 200 \mul de volumen. Se administraron las dosis mediante inyección en la vena del rabo para obtener 10 mg/kg de peso corporal. Después de la inyección, se registraron el peso corporal y las mortalidades a los 7 y 14 días respectivamente.

Similarmente, se inyectaron los ratones con doxorrubicina liposómica preparada según el Ejemplo 5, utilizando EPC : colesterol en una relación en moles de 55 : 45, utilizando reactivos de grado farmacológico. Se hicieron las diluciones de los liposomas para administrar la dosis apropiada de doxorrubicina, tal como lo anterior, con solución salina estéril. Tal como lo anterior, se inyectó a los ratones un volumen total de 200 \mul en la vena de la cola para dar dosis de 10 mg/kg de peso corporal. Después de la inyección, se registraron el peso corporal y las mortalidades a los 7 y 14 días respectivamente.

Se repitió lo anterior administrando doxorrubicina libre en dosis de 15, 20, 25, 30 y 40 mg/kg de peso corporal de doxorrubicina.

Se repitió lo anterior con doxorrubicina liposómica para 20, 30, 40, 50, 60 y 80 mg/kg.

Ejemplo 12

Se dispersó EPC/colesterol (2,1 : 1 relación en peso) en ácido cítrico 150 mM (pH 4,0) para conseguir 200 mg de lípido total/ml de tampón. Se congelaron y descongelaron 7 veces las MLVs resultantes con mezclado en vórtex antes de cada etapa de congelación. Se extrusionaron las resultantes FATMLVs 5 veces a través de 2 filtros apilados de tamaño de poro de 0,2 \mum para hacer VET_{200}s. Seguidamente se diluyeron los liposomas 2 veces con solución salina no tamponada y se llevó el pH a 7,5 con NaOH 1 N. Se añadió el equivalente de 1,0 ml de liposomas antes del ajuste de pH a 133 mg de doxorrubicina/lactosa y 3,7 mg de Na_{2}CO_{3} contenidos en un vial sellado (20 ml de capacidad). Se calentaron los liposomas y el vial que contenía doxorrubicina a 60ºC durante 5 minutos antes de la mezcla. Después de la mezcla, se calentaron los liposomas a 60ºC durante 5 minutos con mezclado en el vórtex cada minuto. Seguidamente la muestra se enfrió hasta temperatura ambiente. Se eliminó una parte alícuota de la muestra (50 \mul) y se diluyó a 0,5 ml con HEPES 20 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5). Se aplicó una parte alícuota de esta muestra (150 \mul) a una columna de Sephadex G-50 de 1,0 ml, tal como se describe anteriormente. Se cuantificaron fosfato y doxorrubicina, tal como se describe anteriormente, en el eluyente y en las muestras originales

Ejemplo 13

Se prepararon muestras VET_{200} según el Ejemplo 12 utilizando EPC/EPG/colesterol (relación en moles 0,95/0,05/1,0) a 200 mg de lípido total en ácido cítrico 150 mM (pH 4,0). Se diluyeron 2 veces las muestras con solución salina no tamponada y se ajustó el pH exterior de los liposomas a 7,5 con NaOH 1,0 N. Después de la incubación de esta preparación durante 5 minutos a 60ºC, se añadió una parte alícuota (3,5 ml) a 70 mg de doxorrubicina conteniendo 11 mg de Na_{2}CO_{3}. Se mezcló la muestra intermitentemente en el vórtex mientras se incubaba a 60ºC durante 5 minutos.

Ejemplo 14

Se hidrató una lámina de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y colesterol (PSC/colesterol relación en peso 2,4 : 1, 400 mg de lípido total) con 4,0 ml de ácido cítrico 300 mM a pH 4,0, formando MLVs. Se extruyó esta solución 5 veces a través de un filtro de tamaño de poro de 2 \mum. Se añadió un parte alícuota de bicarbonato sódico a los liposomas extruidos para ajustar el pH a 8,5 +/- 0,2. Se calentó inicialmente a 60ºC durante 3 minutos un vial conteniendo 10 mg de doxorrubicina y los liposomas. Se añadió una parte alícuota (0,5 ml) de los liposomas al vial de doxorrubicina, se mezcló en el vórtex, y se incubó durante 15 minutos a 60ºC. El ensayo de color, tal como se describe en el ejemplo 5, indicaba una eficacia de atrapado de más de 95%.

Ejemplo 15

Se prepararon MLVs a partir de EPC : colesterol (relación en peso 2,4 : 1) y ácido cítrico 300 mM/lactosa 250 mM, pH 4,0 para conseguir 100 mg de lípido total por ml. Se extruyeron 5 veces estas MLVs a través de un filtro de tuffryn Gelman (paso sinuoso) de exclusión de tamaño de 0,2 \mum. Se colocó una parte alícuota (1,0 ml) de estos liposomas en un tubo de ensayo Kimax de 9 ml y se secó al vacío durante 48 horas. Para rehidratar la preparación, se añadieron 950 \mul de agua a la preparación.

Ejemplo 16

Se determinaron las características de liberación de la doxorrubicina liposómica tal como sigue:

Se secó EPC/colesterol (relación en moles 55/45) a partir de cloroformo para dar una lámina en un recipiente de fondo redondo de 500 ml de capacidad (400 mg de lípido total). Se hidrató la lámina con 4,0 ml de ácido cítrico 300 mM a pH 4,0, formando MLVs. Se extrusionaron estas MLVs a través de 2 filtros apilados membrafil Nucleopore de 0,22 \mum, seguido de extrusión 10 veces a través de un filtro (paso sinuoso) membrafil Nucleopore de 0,1 \mum. Se añadieron 275 \mul de Na_{2}CO_{3} 1 M a 1,0 ml de la muestra de filtrado resultante, que elevó el pH exterior a 8,3. Se calentó una parte alícuota (0,6 ml) durante 3 minutos a 60ºC, siendo una muestra de 10 mg de doxorrubicina. Se añadió la parte alícuota liposómica a los 10 mg de doxorrubicina y se calentó a 60ºC durante 5 minutos. Se dividió la muestra en 2 partes. Se diluyó 10 veces la parte 1 con HEPES 30 mM, NaCl 150 mM, a pH 7,5. Se diluyó 10 veces la parte 2 con ácido cítrico 300 mM a pH 4,0. Se colocaron ambas muestras en bolsas de diálisis y se dializaron a 37ºC contra 1000 volúmenes de sus tampones respectivos. Una hora después se eliminó una parte alícuota de 150 \mul y se analizó el contenido en doxorrubicina y fosfato lipídico, tal como se ha descrito anteriormente, después de su paso por una columna de Sephadex de 1 ml equilibrada con su tampón respectivo.

Se repitió el procedimiento anterior con eliminación de la muestra de las bolsas de diálisis después de 2, 4, 8, 12 y 24 horas.

Se repitió el procedimiento anterior utilizando liposomas de EPC/colesterol/alfa-tocoferol (55/45/1).

Ejemplo 17

Se determinó la interacción de doxorrubicina con citrato tal como sigue:

Se añadió doxorrubicina, a 25ºC, a 0,5 ml de HEPES 20 mM, tampón de NaCl 15 mM, pH 7,5, para dar una solución de doxorrubicina 4 mM. Se centrífugo la muestra para peletizar cualquier precipitado, y se investigó en el sobrenadante el contenido en doxorrubicina por métodos espectrofotométricos, tal como se ha descrito anteriormente.

Se repitió el procedimiento anterior utilizando los siguientes tampones: citrato de Na 300 mM, pH 4,0; citrato de Na 300 mM, pH 5,0; citrato de Na 300 mM, pH 6,0; y citrato de Na 300 mM, pH 7,5.

Se representan los resultados en la Figura 3, una gráfica de una interacción citrato-doxorrubicina resultante de experimentos de mezclado con valores variables del pH del citrato. Se representa la doxorrubicina mM remanente en la solución después de la centrifugación como una función del pH del citrato: : doxorrubicina 4 mM mezclada a 60ºC, enfriada a continuación hasta 25ºC (cuadrados cerrados); doxorrubicina 4 mM mezclada a 25ºC (cuadrados abiertos); doxorrubicina 4 mM mezclada a 60ºC enfriada a continuación a 25ºC (círculos cerrados); y doxorrubicina 4 mM mezclada en HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, a 25ºC para comparar (círculo abierto).

Ejemplo 18

Se siguieron los procedimientos del Ejemplo 17 a las siguientes condiciones de temperatura de mezclado: 60ºC durante 5 minutos, a continuación enfriamiento hasta 25ºC; y 60ºC durante 5 minutos, a continuación enfriamiento hasta 25ºC utilizando doxorrubicina 20 mM.

Se representan los resultados en la Figura 3, una gráfica de una interacción citrato-doxorrubicina resultante de experimentos de mezclado a valores variables del pH del citrato. Se representa la doxorrubicina mM remanente en la solución después de la centrifugación como una función del pH del citrato: doxorrubicina 4 mM, mezclada a 60ºC enfriada seguidamente hasta 25ºC (cuadrados cerrados); doxorrubicina 4 mM mezclada a 25ºC (cuadrados abiertos); doxorrubicina 4 mM mezclada a 60ºC enfriada a continuación a 25ºC (círculos cerrados); y doxorrubicina 4 mM mezclada en HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, a 25ºC para comparar (círculo abierto).

Ejemplo 19

Se secó EPC y colesterol (relación en moles 55 : 45), lípido total 100 mg de lípido por ml de tampón para dar una lámina delgada en las paredes de un recipiente de reacción, y se hidrató con citrato 300 mM pH 4,0. Se redujeron en tamaño las MLVs resultantes mediante su paso 10 veces a través de un filtro membrafil Nucleopore de 0,22 \mum. Se añadió una parte alícuota de carbonato sódico (1,0 ml) a los liposomas resultantes, para ajustar el pH externo a 8,3. Se incubó la suspensión a 60ºC durante 10 minutos. Se añadió doxorrubicina a estos liposomas para conseguir 29 \pm 2 mg de doxorrubicina por 100 mg de lípido total, y se incubó la suspensión a 60ºC durante 10 minutos. Se administró la suspensión de doxorrubicina liposómica a ratones según los procedimientos del Ejemplo 10.

Ejemplo 20

Se siguieron los procedimientos y materiales del Ejemplo 19, con las etapas adicionales después de la reducción de tamaño al pasar la suspensión liposómica 10 veces a través de un filtro membrafil Nucleopore de 0,1 \mum, seguidamente a través de 2 filtros apilados membrafil Nucleopore de 0,1 \mum. Se realizaron LD_{50} para la suspensión resultante de doxorrubicina liposómica según el Ejemplo 10.

Ejemplo 21

Se prepararon liposomas conteniendo DSPC por hidratación de una lámina lipídica (secada a partir de cloruro de metileno durante 12 horas bajo elevado vacío) en ácido cítrico 300 mM pH 4,0 para conseguir 100 mg de lípido total por ml de solución de ácido cítrico. Se congelaron y descongelaron 7 veces en nitrógeno líquido las MLVs resultantes, y se calentaron durantes varios minutos a 60ºC, seguidamente se extruyeron 5 veces a través de filtros de policarbonato de 0,2 \mum de tamaño de poro utilizando un dispositivo de extrusión LUVET con termocubierta. Se tituló a continuación el pH exterior de estos liposomas extruidos a pH 7,8 con hidróxido sódico. Seguidamente se calentó esta solución liposómica a 60ºC durante 3 minutos, a continuación se combinó con doxorrubicina con una relación de medicamento con respecto al lípido de 0,25 : 1 y se calentó a 60ºC durante 5 minutos con mezcla en el vórtex. Se eliminó la doxorrubicina no atrapada de la preparación mediante el paso de 150 \mul de la muestra por 1 ml de columna Sephadex G-50 equilibrada en solución salina tamponada. Este procedimiento daba como resultado una eficacia de atrapado mayor del 95%.

Ejemplo 22

Se emplearon los materiales y procedimientos del Ejemplo 21, en los que el pH de los liposomas resultantes se ajustaba con carbonato sódico (1,0 M) a pH 8,0 y se mantenía a 60ºC.

Ejemplo 23

Se repitieron los procedimientos y materiales del Ejemplo 22 utilizando 100 mg/ml de DPPC/colesterol relación en moles 55 : 45 en una relación final de 0,20 de medicamento con respecto al lípido (p/p).

Ejemplo 24

Se inocularon ratones femeninos DBA/2 pesando 18-22 gms en grupos de 6 a 10 mediante inyecciones intravenosas de 1,5x10^{6} células tumorales L1210 suspendidas en 0,5 ml de RPMI 1640. Se mantuvo la línea celular L1210 mediante pasadas en serie de fluido ascítico o como un cultivo congelado (N_{2} líquido). Los ratones desarrollaron sin tratamiento un tumor ascítico de 2 a 5 gm en 7 a 8 días, y tuvieron un tiempo medio de supervivencia de 8 a 10 días. Se emplearon liposomas hechos según el Ejemplo 22; se inició el tratamiento un día después de la inyección del tumor, y se suministró como una única dosis intravenosa por la vena lateral de la cola. Se trataron los animales con doxorrubicina libre o liposómica con 5 mg/kg de doxorrubicina. Se trataron los grupos control o con solución salina estéril o con liposomas vacíos en una dosis lipídica equivalente a la que se daba con la dosis más elevada de doxorrubicina liposómica. Se pesaron los ratones el día antes de la inyección del tumor, y se registraron los pesos diariamente hasta la primera muerte en un grupo. Se registró el tiempo de supervivencia en días después de la inyección del tumor. Se determinaron tiempos de supervivencia medios y medianos y la significancia estadística de los resultados empleando un test de clasificación de Wilcoxon de dos colas (diseño de dos grupos randomizado).

Se repitió lo anterior con 10, 20, 30 y 40 mg/kg de doxorrubicina libre y liposómica.

Ejemplo 25

Se hicieron liposomas según los procedimientos del Ejemplo 2. Cuando se empleó el modelo de leucemia P388, se inyectaron células tumorales (1X10^{5} células en 0,1 ml) intraperitonealmente en ratones hembra CDF-1. Un día después de la inoculación del tumor, se trataron los ratones con doxorrubicina liposómica (5 mg/kg de dosis) mediante inyección por la vena de la cola. Se calculó la dosificación según el peso medio de cada grupo, y se determinaron los pesos en el día 0 (día de la inyección del tumor) y el día 5. Se registraron las muertes diariamente.

Se repitió lo anterior a 10 y 20 mg/kg.

Se realizó el procedimiento anterior con los ratones inyectados o con solución salina, liposomas vacíos o doxorrubicina mediante inyección en la cola.

Ejemplo 26

Se prepararon liposomas según los métodos del Ejemplo 2 utilizando EPC/colesterol (relación en moles 55 : 45). Más del 98% del medicamento era atrapado por los liposomas.

Se inyectaron ratones macho hinogi (25-40 g, 9 por grupo) de manera subcutánea con 1X10^{5} células SC-115 obtenidas de un tumor primario en ratones previamente inoculados. Se controló el crecimiento tumoral mediante palpación y medidas del tumor con pie de rey. Después del crecimiento del tumor hasta 0,5-2,0 g (peso del tumor = [anchura^{2} x longitud/2, medidas en mm), se administró a los ratones dosis de doxorrubicina liposómica de 13 mg/kg intravenosamente en intervalos de siete días (3 inyecciones de la dosis indicada). Se controló el crecimiento tumoral 3 veces semanalmente durante 50 días después del primer tratamiento o hasta que el peso del tumor excedía de 9 g, entonces se sacrificaba el animal.

Las dosis de tratamiento se basaban en los pesos iniciales de los animales antes de la inoculación del tumor.

Se repitió el procedimiento anterior y se les administró a los ratones solución salina o liposomas vacíos (administrados en una dosis equivalente a la dada para una dosis de doxorrubicina liposómica de 13 mg/kg).

Se repitió el procedimiento anterior en dosis de 3,25 mg/kg y dosis de 6,5 mg/kg para doxorrubicina libre y liposómica.

Los resultados muestran una inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosis inducida por la doxorrubicina libre y liposómica.

Ejemplo 27

Se prepararon liposomas mediante la hidratación de una lámina de DSPC/colesterol (relación en moles 55 : 45) en tampón de ácido cítrico 300 mM (pH 4,0) con mezclado en vórtex. Se extruyeron 10 veces estas MLVs (100 mg de lípido total/ml de tampón) a través de un filtro de policarbonato de tamaño de poro de 200 nm en una termocubierta LUVET calentada a 60ºC. Se añadieron los liposomas a una solución de 1 mg/ml de sulfato de vincristina (Oncovin, disponible de Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN) para conseguir una relación en peso de medicamento con respecto al lípido total de aproximadamente 0,17 : 1. A esto se añadió una cantidad suficiente de Na_{2}HPO_{4} 1,0 M para llevar el pH de la solución a aproximadamente 7,0. Seguidamente se calentaron las muestras a 60ºC durante 10 minutos, en el tiempo en que el medicamento estaba encapsulado dentro de los liposomas con una eficacia de atrapado en exceso de 98%.

Se repitió lo anterior utilizando EPC/colesterol y PSC/colesterol.

Se midió la retención del medicamento a 21ºC y 37ºC bajo diálisis en HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (dializado). La Tabla 1 muestra las características de la toma de vincristina para vesículas de EPC/colesterol, PSC/colesterol, y DSPC/colesterol, empleando vincristina de diferentes fuentes, específicamente, la de Sigma Chemical Co. (San Luis, MO), y derivado de vincristina de Oncovin, Eli Lilly & Co. (Indianápolisi, IN).

La diálisis reveló que los liposomas de HSPC/colesterol y DSPC/colesterol dejan escapar menos del 10% de la vincristina encapsulada (Figura 6).

Ejemplo 28

Se completaron los estudios de supervivencia en respuesta a la dosis mediante la inyección de cantidades de vincristina encapsulada en el liposoma en la vena lateral de la cola a ratones hembra DBA/2J (18-22 gramos, 10 ratones por grupo) en 0,2 ml y controlando la tasa de mortalidad y peso corporal medio después de 30 días.

Se determinó la actividad antitumoral de vincristina libre y liposómica empleando un modelo de leucemia linfocítica L1210. Se inyectaron intraperitonealmente a ratones DBA/2J (6 ratones por grupo) 1 X 10^{6} células L1210 derivadas del fluido ascítico de un ratón previamente infectado. Se administró por vía intravenosa vincristina liposómica hecha según el Ejemplo 27 a diferentes tiempos después de la inoculación del tumor y se controlaron los pesos de los animales así como las tasas de mortalidad.

Se repitió el ejemplo anterior mediante la administración de vincristina libre y liposomas vacíos.

Ejemplo 29

Se prepararon vesículas de DSPC/colesterol (5: 45) mediante la extrusión 10 veces a 60ºC a través de 2 filtros de paso recto de policarbonato Nucleopore de 0,2 \mum en carbonato sódico 300 mM pH 9,6 (ajustado con H_{2}SO_{4} al 10%) con una concentración lipídica de 100 mg/ml. Se eliminó el tampón externo y el gradiente de pH establecido mediante el paso de las vesículas por una columna de Sephadex G-50 equilibrada con K_{2}SO_{4} 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4 (ajustado con NaOH). Se incubaron estas vesículas con 5-fluorouracilo 2 mM (FU) (Sigma Chemical Co., San Luis, MO) durante 60 minutos a 21ºC, y se aumentó la temperatura de incubación a 60ºC durante 60 minutos. Se eliminó el FU que no había sido atrapado mediante su paso por una columna G-50 equilibrada con el tampón externo.

La Figura 7 demuestra la toma de FU como una función de la temperatura. La incubación de los liposomas a 60ºC aumentaron grandemente la toma de FU. En la Figura 7, la delta T refleja un aumento de temperatura de 21ºC a 60ºC.

Seguidamente, se pasaron los liposomas anteriores conteniendo FU por una columna de Sephadex G-50 equilibrada con NaCl 150 mM a 37ºC. Se reequilibró 5-FU según el gradiente de pH (Figura 8). La Figura 8 es un gráfico que representa el efecto del tampón externo sobre la liberación de FU a 37ºC.

Tal como anteriormente, también se cambiaron los liposomas conteniendo el tampón original de K_{2}SO_{4} por acetato amónico 250 mM. Dio como resultado la liberación total de FU (Figura 8).

Ejemplo 30

Se dispersó fosfatidilcolina de huevo (15 mg) en 2ml de ácido cítrico 300 mM, pH 4,0 y se congelaron las MLVs resultantes en nitrógeno líquido y se descongelaron en agua caliente (aproximadamente 35ºC) un total de cinco veces. Seguidamente se extrusionó el lípido 10 veces a través de 2 filtros apilados de policarbonato de tamaño de poro de 100 nm utilizando el procedimiento de LUVET. Se creó un gradiente protónico mediante el paso de las vesículas por una columna de Sephadex G-50 (fina) (1,5 cm x 10 cm) preequilibrada con NaCl 300 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5. Se diluyó una parte alícuota de las vesículas unilaminares grandes eluidas de la columna en NaCl 300 mM, HEPES mM, pH 7,5 para dar una concentración lipídica de 0,75 mgml^{-1} en un volumen total de 2 ml y seguidamente se añadió daunorrubicina (113 \mug) procedente de una solución patrón (5,64 mgml^{-1}) en agua destilada. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente (25ºC) y en intervalos de 2, 10, 20, 30, 60 y 120 minutos se centrifugaron partes alícuotas de 100 \mul a través de ``minicolumnas'' de 1 ml de Sephadex G-50 (fina) para eliminar de las vesículas toda la daunorrubicina no encapsulada. Se determinó la concentración de daunorrubicina atrapada a partir de su absorbancia a 500 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV-265, seguido de la solubilización de las vesículas en Trton X-100 al 1%. Se cuantificó el lípido por conteo por centelleo utilizando niveles de marcador de ^{3}H-DPPC. Más del 98% de la daunorrubicina se encapsuló en las vesículas dando una relación molar de medicamento con respecto a lípido de 1 : 5.

Ejemplo 31

Se emplearon los materiales y métodos del Ejemplo 30, excepto que se añadió epirrubicina (116 \mug) a la suspensión de vesículas (2 ml) procedente de una solución patrón (5,8 mgml^{-1}). Se cuantificó la toma de epirrubicina según su absorbancia a 500 nm seguido de la solubilización de las vesículas en Triton X-100 al 1%. La encapsulación por las vesículas de epirrubicina era de más de 98%, dando una relación molar de medicamento con respecto al lípido de 1 : 5.

Ejemplo 32

Se emplearon los materiales y métodos del Ejemplo 30, excepto que se añadió mitoxantrona (103 \mug) a la suspensión de vesículas (2 ml) procedente de una solución patrón (2 mgml^{-1}). Se cuantificó la toma de mitoxantrona según su absorbancia a 670 nm seguido de la solubilización de las vesículas en Triton X- 100 al 2%. La encapsulación por las vesículas de mitoxantrona era de más de 98%, dando una relación molar de medicamento con respecto al lípido de 1 : 5.

Ejemplo 33

Se emplearon los materiales y métodos del Ejemplo 30, excepto que se combinó cisplatina (200 \muM) con la suspensión liposómica. La cisplatina no se acumulaba en los liposomas mediante el gradiente de pH transmembranal.

Claims (9)

1. Un liposoma unilaminar grande que tiene una bicapa que comprende colesterol y un fosfolípido, en el que el fosfolípido consiste esencialmente en dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina o diaraquidonoilfosfatidilcolina y en el que los lípidos se calientan durante la formación del liposoma para conseguir que el lípido haga la transición de estado de gel a estado cristalino-líquido.

2. El liposoma de la reivindicación 1, en el que el fosfolípido y el colesterol están presentes en la bicapa en una relación molar de 55 : 45.

3. El liposoma de la reivindicación 1, que tiene un diámetro de 60 nm a 300 nm.

4. El liposoma de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un agente bioactivo.

5. El liposoma de la reivindicación 4, en el que el agente bioactivo es un agente antineoplásico.

6. Un método para preparar liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que se emplea un extrusor que tiene un tambor calentado que sirve para aumentar la temperatura de suspensión de los liposomas permitiendo la extrusión de los LUVs.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que los liposomas se extruyen a aproximadamente 5ºC por encima de la T_{C} del lípido.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que la población liposómica es de una distribución uniforme de tamaño.

9. El liposoma de la reivindicación 5, en el que el agente antineoplásico se selecciona de una antraciclina, un alcaloide de vinca, un derivado púrico o pirimidínico, un agente alquilante o un antibiótico.