JP4452078B2 - ヒドロペリレン誘導体 - Google Patents
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Description
アルテイチン(D. Robeson et al. Experientia, 40, 1248-1250, 1984)、
アルテルロシン類(A. Stierle et al. J. Nat. Prod. 52, 42-47, 1989)及び
アルテナリア種(Alternaria spp.)からのアルテルペリレノール(T. Okuno et al. Tetrahedron Lett. 24, 5653-5656, 1983);
ステムフィリウムボツリオサム(Stemphylium botryosum)の培養菌から採取されたス
テムフィルトキシン類及びステムフィピレノール(A. Arnone et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1986, 525-530)。
10, 449-453, 1998);しかしながら、IC50値は30μMであり、酵素阻害特性として
は弱いものである。
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R10及びR11は、それぞれ独立に、
1. 水素原子、
2. (C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、無置換又は以下の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.1 −OH、
2.2 =O、
2.3 −O−(C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、無置換又
は以下の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.3.1 −CN、
2.3.2 −NH2、
2.3.3 =N−OH、又は
2.3.4 =N−O(C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、
2.4 −O−(C2−C6)−アルケニル基で、アルケニル基は直鎖又は有枝で、無置
換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.5 −O−(C2−C6)−アルキニル基で、アルキニル基は直鎖又は有枝で、無置
換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.6 −アリール基で、アリール基は無置換又は以下の基でそれぞれ独立に、1回、
2回又は3回置換され、
2.6.1 ハロゲン、
2.6.2 −(C1−C4)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、
2.6.3 −O−(C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、
2.6.4 −OH、又は
2.6.5 −(C1−C4)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、ハロゲンで1回、2回又は3回置換され、
2.7 −C(O)−OH、
2.8 −C(O)−O−NH2、
2.9 −C(O)−O−(C1−C4)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、
2.10 −NH−(C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、無置
換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.11 −NH−(C2−C6)−アルケニル基で、アルケニル基は直鎖又は有枝で、
無置換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.12 −NH−(C2−C6)−アルキニル基で、アルキニル基は直鎖又は有枝で、
無置換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.13 −NH2、又は
2.14 ハロゲン、
4. (C2−C6)−アルキニル基で、アルキニル基は直鎖又は有枝で、無置換又は上記2.1から2.14記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
5. −O−R9で、R9は
1. (C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、無置換又は上記2.
1から2.14記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2. (C2−C6)−アルケニル基で、アルケニル基は直鎖又は有枝で、無置換又は上記2.1から2.14記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、又は
3. (C2−C6)−アルキニル基で、アルキニル基は直鎖又は有枝で、無置換又は上記2.1から2.14記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
6. −NH−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
7. −NH−C(O)−H、
8. −NH−C(O)−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
9. −NH−アリール基、アリール基は無置換又はR9で1回、2回又は3回置換され、
10. =N−OH、
11. =N−O−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
12. −S−H、
13. −S−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
14. −S(O)−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
15. −S(O)2−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
16. −SO2、又は
R4とR5又はR10とR11は、それぞれ互いに結合している炭素原子により、それぞれ3−、4−、5−又は6−員環を形成し、それらは酸素、窒素及び硫黄の群から選択される1又は2個の複素原子を含む芳香環又は飽和環であり、
R7は上記2から16記載の通りに定義され、そして
−C14−C15−間の結合は一重結合又は二重結合である。
R1、R2、R3及びR6はそれぞれ−OH、
R4及びR5は、それぞれ互いに結合している炭素原子によりエポキシドを形成し、
R7は、−S−CH2−CHOH−COOH基であり、
R8は、=O、
R10及びR11は、それぞれ水素原子であり、そして−C14−C15−間の結合は一重結合であり、及び/又は化学式Iで表される化合物の生理学的に許容され得る塩である。
a)微生物DSM14452又はその変異種または変種を液体栄養培地中で培養した後に、チオペリレノールを単離及び精製、又は
b)化学的誘導化によるチオペリレノールの化学式Iで表される化合物への変換、又は
c)工程a)又は工程b)で得られた化学式Iで表される化合物は、その化学構造に由来するエナンチオマー型であるため、エナンチオマー活性的に純粋な酸又は塩基と塩を形成させた後にキラル定常相でのクロマトグラフィー分画により、或いは、アミノ酸のようなキラル的にまたエナンチオマー的に純粋な化合物との誘導体を合成して得られるジアステレオマーからキラルの異なるグループを除去する工程、又は
d)工程a)、工程b)又は工程c)により調製された化学式Iで表される化合物の遊離型としての単離、或いは酸性又は塩基性の基を有している場合は、それを生理学的に許容され得る塩に変換する工程、
から成るものである。
、及び約0.05%〜3%、好ましくは0.05%〜1%の酵母エキスを含んでいる。パーセントは、全液体培地に対する重量比である。
酸素の通気攪拌培養で行った。微生物培養は、ファーメンター中で48時間〜720時間、好ましくは72時間〜144時間の時間で行うことができる。
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10及びR11は、それぞれ独立に、
1. 水素原子、
2. (C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、無置換又は以下の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.1 −OH、
2.2 =O、
2.3 −O−(C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、無置換又
は以下の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.3.1 −CN、
2.3.2 −NH2、
2.3.3 =N−OH、又は
2.3.4 =N−O−(C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、
2.4 −O−(C2−C6)−アルケニル基で、アルケニル基は直鎖又は有枝で、無置
換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.5 −O−(C2−C6)−アルキニル基で、アルキニル基は直鎖又は有枝で、無置
換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.6 −アリール基で、アリール基は無置換又は以下の基でそれぞれ独立に、1回、
2回又は3回置換され、
2.6.1 ハロゲン、
2.6.2 −(C1−C4)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、
2.6.3 −O−(C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、
2.6.4 −OH、又は、
2.6.5 −(C1−C4)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、ハロゲンで1回、2回又は3回置換され、
2.7 −C(O)−OH、
2.8 −C(O)−O−NH2、
2.9 −C(O)−O−(C1−C4)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、
2.10 −NH−(C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、無置
換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.11 −NH−(C2−C6)−アルケニル基で、アルケニル基は直鎖又は有枝で、
無置換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.12 −NH−(C2−C6)−アルキニル基で、アルキニル基は直鎖又は有枝で、
無置換又は上記2.3.1から2.3.4記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2.13 −NH2、又は
2.14 ハロゲン、
4. (C2−C6)−アルキニル基で、アルキニル基は直鎖又は有枝で、無置換又は上記2.1から2.14記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
5. −O−R9で、R9は
1. (C1−C6)−アルキル基で、アルキル基は直鎖又は有枝で、無置換又は上記2.
1から2.14記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
2. (C2−C6)−アルケニル基で、アルケニル基は直鎖又は有枝で、無置換又は上記2.1から2.14記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、又は
3. (C2−C6)−アルキニル基で、アルキニル基は直鎖又は有枝で、無置換又は上記2.1から2.14記載の基でそれぞれ独立に、1回、2回又は3回置換され、
6. −NH−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
7. −NH−C(O)−H、
8. −NH−C(O)−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
9. −NH−アリール基で、アリール基は無置換又はR9で1回、2回又は3回置換され
、
10. =N−OH、
11. =N−O−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
12. −S−H、
13. −S−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
14. −S(O)−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
15. −S(O)2−R9で、R9は上記5で定義されたものであり、
16. −SO2、又は
R4とR5又はR10とR11は、それぞれ互いに結合している炭素原子によりそれぞれ3−、4−、5−又は6−員環を形成し、それらは酸素、窒素及び硫黄の群から選択される1又は2個の複素原子を含む芳香環又は飽和環であり、
そして−C14−C15−間の結合は一重結合又は二重結合である。
R2は−OH、
R4及びR5は、それぞれ独立に、−OH、又は水素原子、或いはR4及びR5は、それぞれ互いに結合している炭素原子によりエポキシドを形成し、
R6、R10及びR11は、それぞれ独立に、−OH、又は水素原子、或いはR10及びR11は、それぞれ互いに結合している炭素原子によりエポキシドを形成し、
R7は、水素原子又は−S−CH2−CHOH−COOH基で、
そして−C14−C15−間の結合は一重結合又は二重結合である。
化学式Iにおいて、R1、R2、R3及びR6はそれぞれ−OH、R4及びR5はそれぞれ互いに結合している炭素原子によりエポキシドを形成し、R7は−S−CH2−CH
OH−COOH基であり、R8は=Oであり、R10及びR11は、それぞれ水素原子であり、そして−C14−C15−間の結合は一重結合で表されるチオペリレノール、
或いは化学式Iにおいて、R1、R2、R5及びR6はそれぞれ−OH、R3及びR8はそれぞれ=O、R4、R7、R10及びR11はそれぞれ水素原子、そして−C14−C15−間の結合は二重結合で表されるアルテルペリレノール、
或いは、化学式Iにおいて、R1、R2、R5及びR6はそれぞれ−OH、R3及びR8はそれぞれ=O、R4、R7、R10及びR11はそれぞれ水素原子、そして−C14−C15−間の結合は一重結合で表されるアルテルトキシンI、
或いは、化学式Iにおいて、R1、R2及びR6はそれぞれ−OH、R3及びR8はそれぞれ=O、R4及びR5はそれぞれ互いに結合している炭素原子によりエポキシドを形成し、R7、R10及びR11はそれぞれ水素原子、そして−C14−C15−間の結合は一重結合で表されるアルテルトキシンII、
或いは、化学式Iにおいて、R1及びR3はそれぞれ=O、R2及びR8はそれぞれ−OH、R4とR5及びR10とR11は、それぞれ互いに結合している炭素原子によりエポキシドを形成し、R6及びR7はそれぞれ水素原子、そして−C14−C15−間の結合は一重結合で表されるアルテルトキシンIII
の使用に関するものである。
滅菌した100mlのエーレンマイヤーフラスコに、30mlの液体培地(麦芽エキス2.
0%、酵母エキス0.2%、グルコース1.0%、(NH4)2HPO4 0.05%、pH6.0)を入れ、真菌DSM14452のST003367菌株を接種し、振とう培養機上で、25℃で毎分140回転で6日間培養した。この培養液1.5mlを採取し、80%グリセロール2.5mlで希釈し、−135℃で保存した。
滅菌した300mlのエーレンマイヤーフラスコ中に100mlの液体培地(麦芽エキス2.0%、酵母エキス0.2%、グルコース1.0%、(NH4)2PO4 0.05%、pH6)を入れ、真菌DSM14452のST003367菌株を接種し、振とう培養機上で、25℃で毎分140回転で4日間培養した。この初期培養液の2mlを採取し、主培養の調製に用いた。
フラスコの場合:
ポテトデキストロース2.4%、酵母エキス0.2%、pH5.1の液体培地を含む滅菌
した300mlのエーレンマイヤーフラスコに試験管斜面培養(上記培地に、寒天2%を含むもの)、又は実施例2において記載した初期培養液2mlを接種した後、振とう培養機上で25℃で毎分140回転で培養した。化学式Iで表される1種又はそれ以上の化合物の最大生成は96時間培養後に得られた。
ファーメンターの場合:
真菌DSM14452のST003367菌株の初期培養は、2リットルのエーレンマイヤーフラスコ中で(フラスコ中の培養液量は500ml)25℃、毎分140回転で行い、72時間後にファーメンターに接種した。菌の培養は8リットルのファーメンター中で行った。培養条件は次のように調整し、本発明に係るチオペリレノール化合物の生成を誘導した。
温度=25℃;通気=0.5vvm;回転数=200〜220毎分回転数(rpm);接種量
=6%;培養時間=96時間
麦芽エキス 20g/L
酵母エキス 2g/L
グルコース 10g/L
(NH4)2PO4 0.5g/L
主培養
ポテトデキストロース汁 24g/L
酵母エキス 2g/L
デスモフェン 1.25mL/L
消泡剤として、エタノール様多価アルコール溶液の連続添加を用いることができた。最大生成は培養96時間から144時間後に得られた。
実施例3に記載の培養によって得られた培養液15リットルを遠心分離して菌体を除去した。菌体(1.5リットル)を5リットルのエタノールで抽出した。得られた清澄なア
ルコール相を減圧下で約2リットルにまで濃縮した後、培養濾液と一緒にした。濁った水溶液は、吸着樹脂MCI Gel(R) CHP20Pを充填した。1リットル容量のカラム上に積載した
。カラムの直径は6cmで、高さは35cmである。カラムは、2−プロパノールで溶出後、0.1%のアンモニウムとホルマートの水溶性緩衝液pH4.5の傾斜溶媒で展開した。展開速度は、毎分60mlで、各分画は220mlごとに分画採集した。チオペリレノールを含有している画分21及び22をHPLC分析法で検定して採集し、減圧下で濃縮した。カラムSP 250/21 NUCLEOSIL 100−7 C18 HD(R)(Macherey−Nagel, Dueren)を装着した
分画用HPLCで、0.1%アンモニアとホルマートとの水溶液及び95%アセトニトリ
ル水溶液からなる傾斜展開液を用いて精製チオペリレノールを得ることができた。展開速度は毎分25mlで、チオペリレノールはアセトニトリル比率がおよそ25%のカラム分画において採取された。減圧下で徐々に濃縮することにより10mgのチオペリレノール結晶が得られた。
カラム:YMC−Pack Pro C18(R),AS−303,250×4.6mm,S−5μm;
展開相:0〜2分:0.02%トリフルオロ酢酸(TFA)
2〜20分:0.1%TFA中0%から100%のアセトニトリル
20〜25分:100%アセトニトリル
展開速度:毎分1ml
検出は210nmにおける紫外線吸収
チオペリレノールの保持時間は、12.1分に検出された。
チオペリレノールの物理化学的及びスペクトル分析の特性は以下のように要約される。
外観:
褐色を帯びた結晶で、極性又は半極性の有機溶媒及び中性の水溶性緩衝液に可溶性。中性及び弱酸性並びに非酸化培地では安定ではあるが、強酸及び強アルカリ性では不安定。
実験式:C23H20O9S
分子量:472.47
プロトンNMR及びカーボンNMRは表1を参照。
水/アセトニトリル(1対1)pH3.0中の紫外線最大吸収は、216nm、259nm
、292nm及び383nm。
以下の検出結果に基づき、チオペリレノールの質量は472と決定された。ESI+ス
ペクトルは490質量単位(M+NH4)+及び962質量単位(2M+NH4)+に弱いピークとして観察された。ESI-スペクトルは、中でも471質量単位(M−H)-にピークが観察された。
SI-のピークを観察でき、更に、リン酸付加のピークが観察された。この測定値は、計
算値(M+H2PO4)-=C23H22O13PS=569.0524質量単位によく一致する(0
.2ppm誤差)。
ションは、471から349質量単位(−C3H6O3S)、331質量単位(−C3H8O4S)、313質量単位(−C3H10O5S)、303質量単位(−C4H8O5S)、285
質量単位(−C4H10O6S)、261質量単位(−C6H10O6S)及び数種の微小断片であった。
血小板凝集は、就中、Bornの文献(Born,GV,Nature, 1962, 194:927-929)に記載されている血小板凝集の濁度測定法により測定することができる。
タイロード緩衝液:
NaCl 120mM
KCl 2.6mM
NaHCO3 12mM
NaH2PO4×H2O 0.39mM
ヘペス 10mM
グルコース 5.5mM
BSA 0.35%
グルコースとBSAは毎日新しく調製し添加する。
pHは7.4に調整する。
カルセンAM:1mlのDMSO(1mM)中1mgのカルセンAM
ヒトアルファトロンビン(保存液):0.9%NaCl 1ml中に1000単位
アクチベーターの最終濃度:1ml中トロンビン0.05単位又は1ml中コラーゲン1μg
ウォルトマンニン保存液:DMSO(10mM)の233.43μl中ウォルトマンニン1mg
血小板凝集計(PAP4)中の凝集
- 細胞数、μl当り3×105栓球
- シリコンガラスミクロチューブ中の粒子塊
- 総量はチューブ当たり400μl
ミクロチューブ当たり:
- 栓球320μl
- 10mM CaCl2(最終濃度0.5mM)20μl
- 検定に用いる基質 20μl
- アゴニスト 40μl
対照:
- ブランク(無添加対照):緩衝液(タイロード、0.35%BSA)400μl
- 陰性コントロール:栓球320μl
5mM CaCl2(最終濃度0.5mM)40μl
緩衝液 40μl
- 陽性コントロール:緩衝液320μl
5mM CaCl2(最終濃度0.5mM)40μl
アクチベーター 40μl
分間のインキュベーション後に、全コントロールに緩衝液を、そして陽性コントロールでは、アクチベーターを添加した。添加後6分で血小板凝集計の曲線表示の記録が開始された。インキュベーションは、37℃で、攪拌速度は毎分1050回転で行った。
Claims (8)
- 式Iにおいて、
R1、R2、R3及びR6は、それぞれ−OHであり、
R4及びR5は、それぞれ結合している炭素原子と一緒にエポキシドを形成し、
R7は、−S−CH2−CHOH−COOH基であり、
R8は、=Oであり、
R10及びR11はそれぞれ水素原子であり、そして
−C14−C15−間の結合は一重結合である、
請求項1記載の式Iで表される化合物、及び/又は式Iで表される化合物の生理学的に許容され得る塩。 - a)微生物DSM14452又はその変異種もしくは変種の液体栄養培地中での培養、及び化合物チオペリレノールの単離及び精製、又は
b)化学的誘導化によるチオペリレノールの式Iで表される化合物への変換、又は
c)工程a)又は工程b)で得られ、そしてその化学構造式のためエナンチオマー型である式Iで表される化合物を、エナンチオマー活性的に純粋な酸又は塩基と塩を形成することにより、キラル定常相でのクロマトグラフィー分画により、或いは、アミノ酸のようなキラル的にまたエナンチオマー的にも純粋な化合物と誘導体化することにより純粋なエナンチオマーにし、得られるジアステレオマーを分離し、そしてキラル補助グループの除去、又は
d)工程a)、工程b)又は工程c)により調製された式Iで表される化合物を遊離型として単離、或いは酸性又は塩基性の基を有している場合は、それを生理学的に許容され得る塩への変換、
することから成る、請求項1〜3のいずれか一項に記載の式Iで表される化合物、及び/又は式Iで表される化合物の立体異性体、及び/又は式Iで表される化合物の生理学的に許容され得る塩の製法。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の式Iで表される化合物の少なくとも1つ、及び/又は式Iで表される化合物の生理学的に許容され得る塩、及び/又は式Iで表される任意な立体異性体の有効成分を、医薬的に適当でありかつ生理学的に許容され得る担体物質、又は添加剤、及び/又は他の活性化合物そして補助剤物質と共に含有する医薬品。
- 高血小板凝集が引き起す疾患の予防及び治療用医薬の製造のための、請求項1記載の式Iで表される化合物の少なくとも1つ、及び/又は式Iで表される化合物の全ての立体異性体、及び/又は比率の如何に関わらずそれらの混合物、及び/又は式Iで表される化
合物の生理学的に許容され得る塩の使用であって、ここで、
R1、R3及びR8は、それぞれ独立に、−OH又は=Oであり、
R2は−OHであり、
R4及びR5は、それぞれ独立に−OH又は水素原子であるか、又は、
R4及びR5は、それぞれ結合している炭素原子と一緒にエポキシドを形成し、
R6は−OH又は水素原子であり、R10及びR11はそれぞれ水素原子であり、
R7は、水素原子又は−S−CH2−CHOH−COOH基であり、そして
−C14−C15−間の結合は一重結合又は二重結合である、
上記の使用。 - 式Iにおいて、R1、R2、R3及びR6はそれぞれ−OHであり、R4及びR5はそれぞれ結合している炭素原子と一緒にエポキシドを形成し、R7は−S−CH2−CHOH−COOH基であり、R8は=Oであり、R10及びR11はそれぞれ水素原子であり、そして、−C14−C15−間の結合は一重結合である式Iで示される化合物であるチオペリレノール、
式Iにおいて、R1、R2、R5及びR6はそれぞれ−OHであり、R3及びR8はそれぞれ=Oであり、R4、R7、R10及びR11はそれぞれ水素原子であり、そして、−C14−C15−間の結合は二重結合である式Iで示される化合物であるアルテルペリレノール、
式Iにおいて、R1、R2、R5及びR6はそれぞれ−OHであり、R3及びR8はそれぞれ=Oであり、R4、R7、R10及びR11はそれぞれ水素原子であり、そして、−C14−C15−間の結合は一重結合である式Iで示される化合物であるアルテルトキシンI、
式Iにおいて、R1、R2及びR6はそれぞれ−OHであり、R3及びR8はそれぞれ=Oであり、R4及びR5はそれぞれ結合している炭素原子と一緒にエポキシドを形成し、R7、R10及びR11はそれぞれ水素原子であり、そして−C14−C15−間の結合は一重結合である式Iで示される化合物であるアルテルトキシンII、又は
式Iにおいて、R1及びR3はそれぞれ=Oであり、R2及びR8はそれぞれ−OHであり、R4とR5及びR10とR11は、それぞれ結合している炭素原子と一緒にエポキシドを形成し、R6及びR7はそれぞれ水素原子であり、そして−C14−C15−間の結合は一重結合である式Iで示される化合物であるアルテルトキシンIII
が用いられる、請求項6記載の使用。 - 高血小板凝集により引き起される病気が、心筋梗塞症、不安定狭心症、卒中発作、一過性虚血発作及び末梢動脈閉塞症である、請求項6又は7に記載の使用。
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