WO1991017982A1 - Novel compound matristatin - Google Patents

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WO1991017982A1
WO1991017982A1 PCT/JP1991/000665 JP9100665W WO9117982A1 WO 1991017982 A1 WO1991017982 A1 WO 1991017982A1 JP 9100665 W JP9100665 W JP 9100665W WO 9117982 A1 WO9117982 A1 WO 9117982A1
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matristatin
methanol
strain
formula
powder
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PCT/JP1991/000665
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Japanese (ja)
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Kazuhiko Tanzawa
Takeshi Ogita
Shuji Takahashi
Takeshi Kinoshita
Hideyuki Haruyama
Takeshi Kagasaki
Takao Okazaki
Ryuzo Enokita
Original Assignee
Sankyo Company, Limited
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D237/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings
    • C07D237/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D237/04—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings not condensed with other rings having less than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound, matristatin, having collagenase inhibitory activity.
  • Collagenase is an enzyme that degrades collagen, which is one of the major components of connective tissue.) Among them, type IV collagenase is IV collagen, which is the main component of group 111)
  • proteinaceous collagenase inhibitors include Tissue Inhibitor of
  • TIMP Metalloproteinase
  • the present inventors have found that, from a ⁇ culture of an actinomycete SANK 61488 strain belonging to the genus Actinomadura isolated from soil, it is possible to obtain IV) a novel compound having anti-collagenase inhibition ⁇ ) and a matristatin analog ⁇ . 3 ⁇ 4 ⁇
  • the matlystatin of the present invention has the following structural formula and properties. 1) Structural formula
  • R 1 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 2 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 1 is a hydroxyl group and R 2 is a methyl group
  • R 3 is of the formula (n), (m), (IV) or (V);
  • R 1 is a hydrogen atom and R 2 is a methyl group
  • R 1 is a hydroxyl group and R 2 is a hydrogen atom
  • Ra is the formula (IV).
  • the infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption.
  • Solubility easily soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
  • the 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) measured in heavy methanol using IS inside is as follows.
  • the 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) measured using 13 ⁇ 4S inside the double-mouthed holm is as shown below.
  • Solubility Soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
  • the infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption.
  • the nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in heavy DMS0 (dimethyl sulfoxide) using TTUS as the internal standard is as shown below.
  • UV 210 run
  • Solubility Soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
  • the infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption.
  • Solubility Soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
  • the infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption. 3205 (br), 2960,2933, 2873,2861, 1638, 1543, 1517, 1461, 1443, 1379, 1318,1294,1240
  • the present invention also relates to a strain of Matris bacillus belonging to the genus Actinomadura, strain SANK61488.
  • the bacteriological properties are as follows.
  • ISP International Streptomyces Project (Ihe International Streptomyces Project)
  • ISP International Streptomyces Project
  • SANK 61488 strain After culture for 14 days at a culture medium of ⁇ 28 ° C, microscopic observation shows that the aerial mycelium of SANK 61488 strain is a simple branch. The spore chains only settle on the aerial hyphae, forming 2-4 short chains, almost perpendicular to the hyphae. The surface structure of the spores is smooth. No special organs such as branching, sclerotium, rupture of parasitic hyphae, or spores are observed.
  • the properties after culturing on various culture media at 28 ° C for 14 days are as shown in Table 1.
  • the color tone display is the color chip number of the standard color table of the Japan Color Institute.
  • Glycerin-G very, flat, ⁇ -like, asparagine-olive ash (2-5-10) ⁇ 3 ⁇ 4 1
  • Potato extract G good, flat, grayish white (N-9)
  • Ginseng extract AM slightly formed, powdery, white
  • the cell wall of the SANK61488 strain was examined according to the method of Hasegawa et al. [Hasegawa et al., The Journal of General Applied Microbiology, Vol. 29, pp. 319-322, 1983] As a result, mesodiaminopimelic acid was detected.
  • the sugar component in the whole cells of the SAK488 strain was determined by the method of MP Lechevalier [MP Lechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine. As a result of examinations in accordance with Volume 34-944, 1968), in addition to glucose, galactose, mannose and ribose, a small amount of madulose was detected.
  • menaquinone of SA K61488 share [identification experiment method of actinomycetes: Actinomycetes Japan Society, ed., (1985)] is the major menaquinone was examined by the method described been filed in the MK-9 (H S). It is clear from I ⁇ Lh that this strain belongs to the genus Actinomadura among actinomycetes. Actinomadura atramenta is a known strain of SAK61488 strain among the genus Actinomadura. ria) [International Journal of Systematic Bacteriology, 37, 342-346, 1987].
  • SA K61488 strain was identified as a new strain belonging to Actinomadura atramentaria, and was named Actinomadura atramentaria (Acti nomadura atramentaria) SA K & 1488 strain.
  • Actinomadura atramentaria Acti nomadura atramentaria
  • actinomycetes are mutated in the natural world and by artificial operations (for example, ultraviolet irradiation, irradiation, chemical treatment, etc.).
  • the same is true for the SANK 61488 strain of the present invention. is there.
  • the SA K61488 strain according to the present invention includes all the mutant strains. These mutants also include those obtained by genetic methods, for example, recombination, transduction, transformation, and the like. That is, in the present invention, all strains that produce matristatin and are not clearly distinguished from the SA K & 1488 strain and its mutant strain are included in the SA K61488 strain.
  • the SAK61488 strain of the present invention was prepared by sterilizing the soil from around Derby, Australia, with sterile water prepared in advance. Then, it was separated from the colonies of actinomycetes that emerged by culturing it at 28 ° C. for 10 days on the following agar medium for separation and agar medium HA for separation shown below.
  • any synthetic or natural medium may be used as long as the medium appropriately contains one selected from a carbon source, a nitrogen source, an inorganic ion and an organic nutrient source. It is possible.
  • the present invention relates to a method for matristatin, which comprises culturing a matristatin ⁇ bacterium belonging to the genus Actinomadura, and obtaining matristatin from the culture.More specifically, the present invention relates to a method wherein the bacterium is a SANK 61488 strain. It is about a certain ⁇ method.
  • Matris can be obtained by culturing SANK 61488 strain in an appropriate medium and then growing it.
  • the nutrient source known nutrients used for culturing fungal strains can be used.
  • a carbon source glucose, sucrose, starch, glycerin, syrup, molasses, and oil can be used.
  • a nitrogen source soybean flour, corn starch, ammonium sulfate, sodium nitrate, etc. may be used.
  • ⁇ such as calcium carbonate and phosphate, depending on the fog, organic and inorganic substances which help the growth of the strain and promote the production of matristatin can be appropriately added. .
  • the liquid culture method is the most suitable, as is the general method for producing 5 substances. Cultivation is performed under aerobic conditions, and the appropriate temperature for cultivation is 24-30, but in most cases it is cultivated at around 28 ° C. Matris ⁇ ⁇ usually reaches its maximum in 5-10 days in MM culture.
  • the cells and other solid parts present in the liquid part of the culture solution are separated by filtration or centrifugation using diatomaceous earth as a filtration aid, and the filtrate or supernatant Matristatins present in the yeast can be extracted and purified by measuring the inhibitory activity of type IV collagenase by utilizing its physicochemical properties.
  • the type IV collagenase activity can be measured by the method of Salo et al. (J. Biol. Chem., Vol. 258, 3058-3063 (1983)).
  • type IV collagenase was prepared from jd-free culture of human melanoma cells.
  • the substrate can be measured by measuring collagen cleavage using a type IV collagen prepared from mouse EHS tumor and labeled with a radioisotope.
  • the inhibitory activity of type IV collagenase can be measured by simultaneously adding a sample to this reaction mixture and calculating the inhibition rate of the m reaction.
  • Matris-tin present in the filtrate or supernatant, is an organic solvent that is immiscible with water under neutral pH conditions, such as n-butanol, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, chloroform, ethylene chloride, chloride Extraction and purification can be performed using methylene alone or a combination thereof.
  • an adsorbent for example, active resin or Amberlite AD-2, XAD-4 (manufactured by ROHM & Haas Co., Ltd.), which are adsorption resins, and Diaion HP-10, HP-20, CHP-20P Used, HP-50 (made by Mitsubishi ⁇ ⁇ ).
  • Matristatin-containing liquid is passed through the adsorbent layer as described above to absorb and remove impurities, or after adsorbing matristatin, elute with methanol water, acetone water, ⁇ -butanol water, etc. It is obtained by doing. Furthermore, adsorption column chromatography using a carrier such as silica gel or Florisil, separation column chromatography using Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia), Sephadex G25 (manufactured by Pharmacia), etc.
  • the matristatin of the present invention can be purified by gel filtration chromatography, high-performance liquid chromatography using a normal phase or reverse phase column, and the like.
  • Test Example 1 Inhibitory activity of matrisutin on type IV collagenase
  • the present invention relates to an angiogenesis inhibitor, a cancer invasion inhibitor or a cancer metastasis inhibitor comprising matrisutin as a main component.
  • the matricestin of the present invention is used as a blood growth inhibitor, a cancer invasion inhibitor or a cancer metastasis inhibitor, it is administered in various forms.
  • the dosage form include oral administration using
  • These various preparations are commonly used in the pharmaceutical formulation STi field, such as 1% active ingredient, binder, disintegrant, lubricant, flavoring agent, solubilizer, suspending agent, coating agent, etc. It can be formulated using known adjuvants.
  • the dosage varies depending on the condition, age, weight, administration method and form, etc. Usually 50 mg to 1000 mg per day can be administered.
  • Phosphoric acid sodium iodine 0.2 g
  • Actinomadura 'Atramentaria SA & 1488 strain was obtained by inoculating a colony expressed in the above-mentioned HA II culture medium into a slant culture medium of wheat wheat (ISP2) and culturing at 28 ° C for 14 days.
  • the strain obtained in this manner was confirmed to be a single strain by monocolony treatment or the like.
  • the strain thus pure-cultured was stored as an ampoule using 10% skim milk as a dispersing agent.
  • Actinomadura 'Atramentaria SANK61488 strain is aseptically sterilized and inoculated into a 2 £ Erlenmeyer flask (seed flask) containing 700 m £ of the aforementioned Makoto Seed Culture Medium. did. This was then precultured at 28 ° C for 8 days on a rotary shaker at 200 rpm. Further, this seed culture solution was placed in 60 tanks containing the same medium in an amount of 600 ml and cultured at 28 ° C for 2 days.
  • a medium (MP medium) of ⁇ ⁇ culture was put into a 600 tank at a rate of 300 pounds, and heated at 120 ° C for 30 minutes. Next, 9 £ of a seed culture solution of Jb was added thereto, and the mixture was stirred and cultured at 28 ° C for 5 days with 300 ° Z of air 3 ⁇ 4 ⁇ * at 100 rpm.
  • type IV collagenase activity was measured by the method of Salo et al. (J. Biol. Chem., Vol. 258, 3058-3063, (1983)). That is, type IV collagenase is prepared from a Jill-free culture of human melanoma cells, and is prepared from mouse EHS tumor as a substrate, and is labeled with 3- acetic acid anhydride.
  • the enzyme solution and the substrate solution are added to a 50 mM Tris-HCl buffer solution containing 0.2% NaC £, 10 L CaCl 2 , 4 mM N-ethyl maleimide, 40 / zg / L 7 protinin, and 0.05% Brij 35, and the final solution is added.
  • the liquid volume was set to 0.1 m.
  • Trichloroacetic acid (TCA) was added to a final concentration of 2% and tannic acid to a final concentration of 0.1% to stop the i-core. The mixture was allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes and then at 4 ° C and 10,000 rpni. Centrifuged for 20 minutes.
  • Insta-gel (manufactured by Packard) 10 was added to the quantification of the supernatant, and the radioactivity was measured. Matristatin inhibitory activity was determined by adding a matristatin solution for measurement to the upper solution, performing the same operation, measuring the radioactivity, and determining the inhibition of the reaction.
  • the culture filtrate 600 was applied to 60 Diaion HP-20, washed with 200 ion-exchanged water and 175 20% acetone, and eluted with 290 50% acetone to obtain 330 g of a black powder. . Of these, 150 g was dissolved in 7.5 ion-exchanged water, an equal volume of n-butanol was added, and the mixture was stirred for 30 minutes.
  • Matristin was purified by measuring IV collagenase inhibitory activity according to the method described in Example 2.
  • a culture filtrate was prepared by the method described in Example 2 (A).
  • the culture filtrate is applied to 30 Dyaro: XHP-20, washed with 100 ion-exchanged water, 90 £ of 20% acetone, eluted with 150 of 50% acetone, and 29.2 g of black after separation A powder was obtained. This was dissolved in 1.5 g of ion-exchanged water and extracted twice with an equal amount of n-butanol.
  • the eluate corresponding to the peak appearing at around 22 minutes was collected by monitoring with a thermometer. The same operation was performed for the remaining powders, and the eluates obtained by ⁇ were pooled. This was concentrated with E to remove acetonitrile, which was converted into ion-exchanged water. About 10 m of Diaion HP-20 was donated. After thoroughly washing the column with ion-exchanged water, the column was eluted with 50 ra of 50% acetone. The eluate was concentrated and frozen at the bottom to obtain 75 mg of matricestin as white powder.
  • the Dyura 'attramen Yuria SANK 61488 strain was inoculated into 21 Erlenmeyer flasks (seed flasks) containing aseptically sterilized thigh composition seed cultures, i. This was then precultured at 28 for 8 days on a rotary shaker at 200 rpm. Further, this seed culture solution was placed in a 60 tank containing the same medium 30 at 600 lpi, and cultured at 28 ° C for 2 days.
  • CB-422 Saitama Gakkai Co., Ltd.
  • MSG3-7 modified medium For fermentation, put the following medium (MBG3-7 modified medium) into a 600 £ tank, put 300 £ into a tank, and put this at 120 ° C. For 30 minutes. Then, 9 kg of the seed culture solution was added thereto, and the mixture was stirred and cultured at 28 ° C. for 5 days with an air flow rate of 300 1 / min and a stirring speed of 100 rpn.
  • the culture filtrate obtained by the above-described culture was treated with Diason HP20 n-BuOH extraction and Sephadex LH20 in exactly the same manner as in Example 1. That is, the culture filtrate was adsorbed on Diaion HP 20 at 60, washed with 200 £ of ion-exchanged water and 175 of 20% acetone, eluted with 290 of 50 ⁇ acetone, concentrated, and concentrated to obtain 540 g of black powder. I got This powder was dissolved in 30 ⁇ of water and extracted twice with an equal volume of BuOH. By collecting and concentrating the organic phase
  • Senshupak ODS-5301N 20 ⁇ x300 ran, flow rate 6 ml / min, detection: differential refractometer) and eluted with the same solvent.
  • the inhibitory activity of the eluate was measured, the inhibitory activity was detected at peaks observed at about 27 minutes and about 30 minutes.
  • the corresponding eluates were collected, and were designated as F and D components in the order of elution.
  • the eluates of the D and F components were concentrated to remove methanol, and the resulting aqueous solution was charged to 100 m Diaion HP 20, washed well with water, and eluted with 80% methanol.
  • the eluate was concentrated, and 24 rag of white powder was obtained as a single component from the D component. This substance was designated as matristatin.
  • a powder of 24 m was obtained from the F component, but it was not a single powder on HPLG, so it was further purified as follows. This powder was dissolved in 27% acetate nitrile -2% (v / v) trichetylamine phosphate buffer PH3.0, and the solution was mixed with the same solvent to prepare a preparative liquid chromatography column (column: Senshupak ODS-53OlN, 2O 0x3OO ran, flow rate 6 ml / min, detection: differential refractometer) and eluted with the same solvent.
  • the Y component crude powder l was dissolved in 20-acetitol nitrile-23 ⁇ 4 (v / v) tritricylamine phosphate buffer PH3.0, and the same solvent was used to prepare a preparative liquid chromatography column (column: Sens hupak ODS.-5301N, 20 ⁇ 300 mm, flow rate 6 ml / min, detection: differential refractometer) and eluted with the same solvent.
  • a preparative liquid chromatography column column
  • Sens hupak ODS.-5301N 20 ⁇ 300 mm
  • flow rate 6 ml / min detection: differential refractometer
  • ⁇ S inhibitory activity was observed in the peak observed at about 46 minutes in the ⁇ S diffractometer.
  • the corresponding eluate was collected and concentrated to remove methanol.
  • the powder having the above formulation was mixed and passed through a 30-mesh sieve, and 350 mg of this powder was placed in a gelatin capsule to prepare a capsule.
  • the matristatins of the present invention exhibit remarkable IV collagenase inhibitory activity, and are useful as, for example, cancer suppressants.

Abstract

A novel substance matristatin represented by general formula (I) and a matristatin producing microorganism belonging to the genus Actinomadura, wherein R1 represents hydrogen or hydroxyl, R2 represents hydrogen or methyl, and R3 represents a group represented by formulae (II), (III), (IV), or (V), provided that: R3 represents a group of formulae (II), (III), (IV) or (V), when R1 represents hydroxyl and R2 represents methyl; R3 represents a group of formula (II) when R1 represents hydrogen and R2 represents methyl; and R3 represents a group of formula (IV) when R1 represents hydroxyl and R2 represents hydrogen. This compound has a collagenase inhibitory activity and is effective in controlling vascularization and infiltration and metastasis of cancer.

Description

明 細 書  Specification
新規化 吻マトリス夕チン  Newly developed rostral matrices
[技術分野]  [Technical field]
本発明はコラゲナ一ゼ阻害活性を有する新規化合物マ卜リスタチンに関する。  The present invention relates to a novel compound, matristatin, having collagenase inhibitory activity.
[背景技術]  [Background technology]
コラゲナーゼは結合組織などの主要構] ¾)¾分の 1つであるコラーゲンを分解す る酵素であり、 このうち、 IV型コラゲナーゼは基 )111の主要成分である IV コラ Collagenase is an enzyme that degrades collagen, which is one of the major components of connective tissue.) Among them, type IV collagenase is IV collagen, which is the main component of group 111)
—ゲンを分解する。 そして、 癌力生育する際の血 生、 癌の浸潤及び転移にお いては IV型コラゲナーゼ活 カ^ h昇し、 基 JSfiiの破壊に主要な役割を果たしてい ることが知られている （William G. Stetler-Stevenson ； Cancer and Metastasis Reviews, vol.9, 289-303, (1990) ) 0 従って、 コラゲナーゼ阻 ¾ は これら疾患の予防 ·治療に有用である。 —Decomposes gen. It is known that the type IV collagenase activity increases in blood and cancer invasion and metastasis during cancer growth, and plays a major role in destroying the basic JSfii (William G. Stetler-Stevenson; Cancer and Metastasis Reviews, vol. 9, 289-303, (1990) 0 Therefore, collagenase inhibition is useful for prevention and treatment of these diseases.
従来、 コラゲナーゼ阻 用を示す低^! ¾質としてはメルカブト基を含むぺ プチド性化^!^ (Robert D. Gray, Hossain H. Saneii and Arno F. Spatola ； Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 101, No. 4 ， 1251-1258, (1981) /Charles F. Vencill, David Rasnick, Katherine V. Crumley, Norikazu Nishino and James C. Powers ； Biochemistry Vol. 24， 3149-3157, (1985) )、 カルボキシル基を含むペプチド性化合物 (Jean-Marie Delaisse, . Yves Eeckhout, Christopher Sear, Alan Galloway, Keith  Conventionally, as a low-quality protein exhibiting collagenase inhibition, a peptide containing a mercapto group has been used. (Robert D. Gray, Hossain H. Saneii and Arno F. Spatola; Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 101 , No. 4, 1251-1258, (1981) / Charles F. Vencill, David Rasnick, Katherine V. Crumley, Norikazu Nishino and James C. Powers; Biochemistry Vol. 24, 3149-3157, (1985)), carboxyl group (Jean-Marie Delaisse, .Yves Eeckhout, Christopher Sear, Alan Galloway, Keith
McCullagh and Gilbert Vaes ； Biochemical and Biophysical Research McCullagh and Gilbert Vaes; Biochemical and Biophysical Research
Communications, Vol.133, 483-490, (1985) )、 ベンジルォキシカルボ二ループ口 リル一ロイシルーグリシルヒドロキサム酸 （William M. Moore and Curtis A. Spilburg ； Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 136, 390-395, (1986) ) , ヒドロキシルァミン誘導体 （特開平第 1-160997号） など力 告されている。 また IV¾コラゲナ一ゼに対して比較的特異性の強いものとして SC 44463 (Reuven Reich, Erik W. Thompson, Yukihide Iwamoto, George R. Communications, Vol. 133, 483-490, (1985)), Benlyloxycarbodiloop mouth lyl-leucyl-glycylhydroxamic acid (William M. Moore and Curtis A. Spilburg; Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 136) , 390-395, (1986)) and hydroxylamine derivatives (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-160997). SC44463 (Reuven Reich, Erik W. Thompson, Yukihide Iwamoto, George R.
Martin, James R. Deason, George C. Fuller, and Ruth Miskin ； Cancer Research, Vol.48, 3307-3312, (1988) )力 s報告されている。 この SC44463 は、 癌 転移抑制活性を示すこと力 ¾ft物実験により確認されている。 しかしこれらはいず れも合成品であり、 また未だ実用に供されていない。 Martin, James R. Deason, George C. Fuller, and Ruth Miskin; Cancer Research, Vol. 48, 3307-3312, (1988)). This SC44463 is for cancer It has been confirmed by experiments with the ability to exhibit metastatic activity. However, these are all synthetic products and have not yet been put to practical use.
一方、 蛋白性のコラゲナ一ゼ阻害物質としては Tissue Inhibitor of  On the other hand, proteinaceous collagenase inhibitors include Tissue Inhibitor of
Metalloproteinase (TIMP)及びその類緣物質が知られている。 TIMPは組み換え DMetalloproteinase (TIMP) and related substances are known. TIMP is recombinant D
N A技術により か^ r能になっている力、 未だ実用に供されていない Power that has been turned into NA by NA technology, not yet in practical use
(Docherty. A. J. P, Lyons A, ^mith B. J, Wright E. , Stephens P. E， Harris T. J. R, Murphy G, and Reynolds J. J ； Sequence of human tissue inhibitor of metalloproteinases and its identity to erythroid- potentiating activity. Nature, vol. 318, 66-69, (1985) ) 0 (Docherty. AJ P, Lyons A, ^ mith B. J, Wright E., Stephens P. E, Harris TJ R, Murphy G, and Reynolds J. J; Sequence of human tissue inhibitor of metalloproteinases and its identity to erythroid- potentiating activity.Nature, vol. 318, 66-69, (1985)) 0
またヒドロキシァミノ化された 2—ペンチルコハク酸を有している点でマ卜リ スタチンと類似している化^として、 放線菌の培養瀘液から単離されたァクチ ノニン （actinonin)がある。 本化^！は、 アミノぺプチダーゼ Mを低濃度で阻害 すること力 S報告されている （Umezawa, H.， Aoyagi, T.， Tanaka, Τ. , Suda, Τ.， Okuyama, A.， Naganawa, H.， Hamada, M. and. Takeuchi, T. ： J. Antibiot.， vol.38, 1629-30, (1985) ) が IV型コラゲナーゼを阻害するかどうかは検討され ていない。  Also similar to matristatin in that it has 2-aminopentylated succinic acid is actinonin isolated from the culture filtrate of actinomycetes. . Realization ^! Has been reported to inhibit aminopeptidase M at low concentrations (Umezawa, H., Aoyagi, T., Tanaka, Τ., Suda, Τ., Okuyama, A., Naganawa, H., Hamada, M. and. Takeuchi, T .: J. Antibiot., Vol. 38, 1629-30, (1985)) have not investigated whether type IV collagenase is inhibited.
[発明の開示]  [Disclosure of the Invention]
本発明者らは、 土壌より分離したァクチノマデュラ属に属する放線菌 SANK 61488株 φ培養物から、 IV¾コラゲナーゼ阻難用を有する新規化^)、 マトリ スタチン類力 ¾ されることを見出し、 本発明を ¾ ^した。  The present inventors have found that, from a φ culture of an actinomycete SANK 61488 strain belonging to the genus Actinomadura isolated from soil, it is possible to obtain IV) a novel compound having anti-collagenase inhibition ^) and a matristatin analog 力. ¾ ^
(発明の構成）  (Structure of the invention)
本発明のマトリスタチン （Matlystatin)は下記の構造式および性状を有する。 1) 構造式 The matlystatin of the present invention has the following structural formula and properties. 1) Structural formula
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0001
(式中、 R1は水素原子又は水酸基、 R2は水素原子又はメチル基、 (Wherein, R 1 is a hydrogen atom or a hydroxyl group, R 2 is a hydrogen atom or a methyl group,
R3は、 R 3 is
式
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000005_0004
formula
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000005_0004
、 又は、
Figure imgf000006_0001
を有する基を示す。 , Or
Figure imgf000006_0001
A group having the formula:
但し、  However,
R1が水酸基、 R2がメチル基のときは、 When R 1 is a hydroxyl group and R 2 is a methyl group,
R3は、 式 （n) 、 （m) 、 (IV) 又は （V) であり、 R 3 is of the formula (n), (m), (IV) or (V);
R1が水素原子、 R2がメチル基のときは、 When R 1 is a hydrogen atom and R 2 is a methyl group,
R3は、 式 （Π) であり、 R 3 is the equation (Π),
R1が水酸基、 R2が水素原子のときは、 When R 1 is a hydroxyl group and R 2 is a hydrogen atom,
Raは式 （IV) である。 ） Ra is the formula (IV). )
また、 本発明における化^!名を下記の表のごとく定義する < 化合物名 R1 R2 Ra マ卜リスタチン OH CH3 " (Π) Also, of the present invention ^! Is defined as in the table below the name <Compound Name R 1 R 2 R a Ma Bok Risutachin OH CH 3 "(Π)
マ卜リスタチン A2 H CH3 (Π) Matristatin A 2 H CH 3 (Π)
マ卜リス夕チン OH CH3 (m) Matris Evening OH CH 3 (m)
マ卜リスタチン OH CH3 (IV) Matristatin OH CH 3 (IV)
マトリスタチン OH H ( )  Matristatin OH H ()
マ卜リス夕チン Ft OH CH3 (V) Matrisu Yutin Ft OH CH 3 (V)
(表中、 R R2および Raは、 式 (I) における R1 R2および R3を示! (Π) 、 (Π) 、 (IV) 及び （V) は上言己と同意慕を示す。 ） 2)物性 (In Table, RR 2 and R a has the formula (shown! ([Pi the R 1 R 2 and R 3 in I)), ([pi), indicating the (IV) and (V) above words agree with himself cherishing ) 2) Physical properties
マトリスタチン A,  Matristatin A,
1) 性 質；白色、 吸湿性粉末、 メタノール又はクロ口ホルム中では室温 で不安定。  1) Properties: White, hygroscopic powder, unstable in methanol or black form at room temperature.
2) 溶 解 性；メタノールに易溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。  2) Solubility; easily soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
3) 呈色試験； 50%硫酸、 ヨウ素、 ニンヒドリン反応に陰性。 塩化第二鉄反 応に陽性。  3) Color test; negative for 50% sulfuric acid, iodine and ninhydrin reactions. Positive for ferric chloride reaction.
4) 分 子 式； C27 «70aN5S 4) Molecular formula; C 27 « 70 a N 5 S
5) 分 子 量； FAB-MASS法により決定 （M+H) +  5) Molecular weight; determined by FAB-MASS method (M + H) +
602.3198 (測定値）  602.3198 (measured value)
602.3224 (計算値）  602.3224 (calculated value)
6) 融 点； 113-115 。C (分解）  6) Melting point: 113-115. C (decomposition)
7) 比旋 ； [a]D 25 一 38.9° 7) The ratio handed; [a] D 25 one 38.9 °
(c, 1.06 メタノール） (c, 1.06 methanol)
) 紫外線吸収スペクトル； λπ>Μ nm  ) UV absorption spectrum; λπ> Μ nm
メタノール中で に極大吸収を示す。 Shows maximum absorption in methanol.
) 赤外線吸収スペクトル； v (KBr) cm"1 ) Infrared absorption spectrum; v (KBr) cm " 1
KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。  The infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption.
3292、 2961、 2932、 2873、 2861、 1719、 1655, 1627、 1537、 1443、 1414、 1379、 1241 3292, 2961, 2932, 2873, 2861, 1719, 1655, 1627, 1537, 1443, 1414, 1379, 1241
) —核磁気共鳴スぺク卜ル； （ δ : PPM ) ) — Nuclear magnetic resonance spectrum; (δ : PPM)
重メタノール中、 内部 ¾ ^に TMS (テトラメチルシラン） を使用して測定 した ^ —核磁気共鳴スペクトル （400 MHz ) は以下のとおりである。  ^-Nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) measured in heavy methanol using TMS (tetramethylsilane) for internal 重 ^ is as follows.
0.88(t,3H), 0.89(t，3H)， 0.94 (d, 3H) , 1.0-1.8 (m, 12H) , 1.98 (m, 2Η) , 2.02 (s, 3Η), 2.1-2.5(m,3H), 2.7-3.0 (m, 6H) , 3.0-3.1 (m，2H)，  0.88 (t, 3H), 0.89 (t, 3H), 0.94 (d, 3H), 1.0-1.8 (m, 12H), 1.98 (m, 2Η), 2.02 (s, 3Η), 2.1-2.5 (m, 3H), 2.7-3.0 (m, 6H), 3.0-3.1 (m, 2H),
3.98(m, 1H), 4.40(d，lH)， 4.59 (t,lH), 5.17(d, 1H) 3.98 (m, 1H), 4.40 (d, lH), 4.59 (t, lH), 5.17 (d, 1H)
) 13C一核磁気共鳴スぺクトル； （ δ ： PPM ) ) 13 C mononuclear magnetic resonance spectrum; (δ: PPM)
重メタノール中、 溶媒のシグナルを (メタノールの中心にあるシグナ ルを 49.3 ppmとする） として測定した13 C —核磁気共鳴スペクトルは以下 のとおりである。 In heavy methanol, the signal of the solvent is The 13 C nuclear magnetic resonance spectrum measured as follows:
209.8 (s), 179.6 (s), 174.6 (s), 174.6 (s), 173.6 (s), 171.8 (s), 64.2(d), 52.1(d), 52.0(d), 47.9 (t), 42.0 (t) , 37.9(d), 36.9 (d) , 36.2 (t), 35.1(t), 33.7 (t), 32.9 (t), 27.6 (t) , 27.3 (t), 27.0(t), 25.7 (t), 23.4 (t), 22.6(q), 22.0(t), 16.4 (q), 14.4 (q), 11.7 (q)) 高速液体クロマトグラフィー  209.8 (s), 179.6 (s), 174.6 (s), 174.6 (s), 173.6 (s), 171.8 (s), 64.2 (d), 52.1 (d), 52.0 (d), 47.9 (t), 42.0 (t), 37.9 (d), 36.9 (d), 36.2 (t), 35.1 (t), 33.7 (t), 32.9 (t), 27.6 (t), 27.3 (t), 27.0 (t), 25.7 (t), 23.4 (t), 22.6 (q), 22.0 (t), 16.4 (q), 14.4 (q), 11.7 (q)) High-performance liquid chromatography
分離カラム；ノバパック ·カー卜リツジ  Separation column; Novapack Cartridge
8 VC18 (カラムサイズ， φ8Χΐ00 ππ， ウォーターズ社製） 溶 媒； 58% (ν/ν)メタノ一ル /0.2 % (ν/ν)卜リェチルァミン一  8 VC18 (column size, φ8Χΐ00 ππ, Waters) Solvent; 58% (ν / ν) methanol / 0.2% (ν / ν) triethylamine
リン酸 （ ΡΗ 3.0 )  Phosphoric acid (about 3.0)
流 速； 1.5 ml /分  Flow rate; 1.5 ml / min
検 出； UV 210 nm  Detection: UV 210 nm
保持時間； 90分  Retention time; 90 minutes
マトリスタチン A2 Matristatin A 2
) 性 質；白色、 吸湿性粉末。) Property: White, hygroscopic powder.
) 溶 解 性；メタノールに易溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。) Solubility; easily soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
) 呈色試験； 50%硫酸、 ョゥ素、 ニンヒドリン反応に陰性。) Color test; negative for 50% sulfuric acid, iodine and ninhydrin reactions.
) 分 _子 式； C27 «707N5S) Molecular formula; C 27 « 7 0 7 N 5 S
) 分 子 量； FAB-MASS法により決定（M+H) + ) Molecular weight; determined by FAB-MASS method (M + H) +
586.3281 (測定値）  586.3281 (Measured value)
586.327 & (計算値） 586.327 & (calculated)
) 融 点； 71-74 °C) Melting point: 71-74 ° C
) 比旋光度； [CZ] D2S — 37.Γ ) Specific rotation: [CZ] D 2S — 37.Γ
(c， 1.11 メタノール） (c, 1.11 methanol)
) 紫外線吸収スぺクトル； ； M nm ) UV absorption spectrum;; M nm
メタノール中で に極大吸収を示す。 Shows maximum absorption in methanol.
) 赤外線吸収スペクトル； max (KBr) cnT1 KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。 ) Infrared absorption spectrum; max (KBr) cnT 1 The infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption.
3311, 2961、 2932, 2873、 2862、 1718, 1667、 1627、 1541、 1443、 1408、 1308、 12430) 核磁気共鳴スぺクトル； （ δ ： PPM )  3311, 2961, 2932, 2873, 2862, 1718, 1667, 1627, 1541, 1443, 1408, 1308, 12430) Nuclear magnetic resonance spectrum; (δ: PPM)
重メタノール中、 内部 に IS を使用して測定した1 H—核磁気共鳴スぺ クトル （400 MHz ) は、 以下のとおりである。 The 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) measured in heavy methanol using IS inside is as follows.
0.88 (t,3H), 0.90(t,3H), 0.93 (d, 3H), 1.0-1.8 (m,12H) , 1.96(ιπ, 2Η) , 2.01 (s, 3Η), 2.13(m, 1Η) , 2.29 (dd, 1H) , 2.53 (dd, 1H) , 2.7-2.9 (m, 6H) , 2.9-3.1(m,2H), 3.92(m，lH)， 4.39 (d, 1H) , 4.57 (dd, 1H) , 5.18 (d, 1H)1) 13C 一核磁気共鳴スぺクトル； （ δ ： PPM ) 0.88 (t, 3H), 0.90 (t, 3H), 0.93 (d, 3H), 1.0-1.8 (m, 12H), 1.96 (ιπ, 2Η), 2.01 (s, 3Η), 2.13 (m, 1Η) , 2.29 (dd, 1H), 2.53 (dd, 1H), 2.7-2.9 (m, 6H), 2.9-3.1 (m, 2H), 3.92 (m, lH), 4.39 (d, 1H), 4.57 (dd , 1H), 5.18 (d, 1H) 1) 13 C mononuclear magnetic resonance spectrum; (δ: PPM)
重メタノール中、 溶媒のシグナルを ¾i (メ夕ノールの中心にあるシグナ ルを 49.3 ppmとする） として測定した13 C —核 共鳴スペクトル 13 C—nuclear resonance spectrum measured in heavy methanol with the solvent signal as i (49.3 ppm signal at the center of methanol)
(100 MHz ) は、 以下に示す通りである。  (100 MHz) is as shown below.
209. l(s) ， 179.5 (s) , 177.3 (s) ， 174.3 (s) ， 174.3 (s) ， 173. l(s) ， 64.2(d) ， 54.0(d) ， 51.9(d) ， 47.9 (t) ， 42.0 (t) ， 38.7 (t) ， 38.0(d) ， 36.9(d) , 35.2 (t) , 33.7 (t) ， 33.0(t) ， 27.6 (t) ， 27.5 (t) ， 26.9 (t) ， 25.7 (t) ， 23.5 (t) ， 22.6 (q) ， 22.2 (t) ， 16.4 (q) , 14.4 (q) ， 11.7 (q) 209. l (s), 179.5 (s), 177.3 (s), 174.3 (s), 174.3 (s), 173. l (s), 64.2 (d), 54.0 (d), 51.9 (d), 47.9 (t), 42.0 (t), 38.7 (t), 38.0 (d), 36.9 (d), 35.2 (t), 33.7 (t), 33.0 (t), 27.6 (t), 27.5 (t), 26.9 (t), 25.7 (t), 23.5 (t), 22.6 (q), 22.2 (t), 16.4 (q), 14.4 (q), 11.7 (q)
) 高速液体クロマトグラフィー ) High performance liquid chromatography
分 カラム；ノバパック ·カートリッジ  Min column; Novapack cartridge
8NVC18 (カラムサイズ， 08X100圆， ウォーターズ社製） 溶 媒； 58% (v/v)メタノール Z0.2 % (v/v)卜リェチルァミン一  8NVC18 (column size, 08X100 圆, manufactured by Waters) Solvent; 58% (v / v) methanol Z0.2% (v / v) triethylamine
リン酸 (pH 3.0)  Phosphoric acid (pH 3.0)
流 速； l.S rolZ分  Flow velocity; l.S rolZ min
検 出； UV 210 nm  Detection: UV 210 nm
保持時間； 7.82分  Retention time; 7.82 minutes
マトリス夕チン Matrice Evening Chin
) 性 質；白色、 吸湿性粉末、 メタノール又はクロ口ホルム中では室温 で不安定。 ) 溶 解 性；メタノール、 クロ口ホルムに易溶、 水に難溶。) Properties: White, hygroscopic powder, unstable in methanol or black form at room temperature. ) Solubility: Easily soluble in methanol and black form, slightly soluble in water.
) 呈色試験； 50%硫酸、 ョゥ素、 ニンヒドリン SiEに陰性。 塩化第二鉄反 応に陽性。) Color test: 50% sulfuric acid, iodine, ninhydrin Negative for SiE. Positive for ferric chloride reaction.
) 分 子 式； C22H4。Ni05 ) Partial telescopic; C 22 H 4. Ni0 5
) 分 子 量； FAB - MASS法により決定（M+H) + ) Molecular weight; determined by FAB-MASS method (M + H) +
441.3082 (測定値）  441.3082 (measured value)
441.3078 (計算値） 441.3078 (calculated value)
) 融 点； 57-61 °C (分解）) Melting point: 57-61 ° C (decomposition)
) 紫外線吸収スぺク卜ル； J ai nm ) UV absorption spectrum; J ai nm
メタノ一ル中で ^に極大吸収を示す。 ^ Shows maximum absorption in methanol.
) 核 鳥スぺクトル； （δ： PP ) ) Nuclear bird spectrum; (δ: PP)
重クロ口ホルム中、 内部^に 1¾Sを使用して測定した1 H—核磁気其鳴ス ぺクトル （400 MHz)は、 以下に示す通りである。 The 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz) measured using 1¾S inside the double-mouthed holm is as shown below.
0.83(t, 3H), 0.86(t,3H), 0.92(d, 3H) , 1.09 (t, 3Η), 1.09(m，lH)，  0.83 (t, 3H), 0.86 (t, 3H), 0.92 (d, 3H), 1.09 (t, 3Η), 1.09 (m, lH),
1.2-1.9 (m,12H), 1.98 (m, 1H) , 2.03 (m, 1H) , 2.31(dd，lH)， 2.49 (dd, 1H) , 2.55(q,lH), 2.82 (m, 1H) , 3.01 (m, 1H) , 3.93(ra,lH)， 4.63 (dd, 1H) , 4.71(dd，lH), 5.28(d, 1H) , 7.25(d，lH) 1.2-1.9 (m, 12H), 1.98 (m, 1H), 2.03 (m, 1H), 2.31 (dd, lH), 2.49 (dd, 1H), 2.55 (q, lH), 2.82 (m, 1H) , 3.01 (m, 1H), 3.93 (ra, 1H), 4.63 (dd, 1H), 4.71 (dd, 1H), 5.28 (d, 1H), 7.25 (d, 1H)
) 13C-核磁気共鳴スぺクトル （ δ : PPM ) ) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (δ : PPM)
重 ロ口ホルム中、 溶媒のシグナルを基準 （クロ口ホルムの中心のシグナ ルを 77.7 ppmとする） として測定した13 C—核磁気共鳴スペクトル 13 C nuclear magnetic resonance spectrum measured with solvent signal as reference (77.7 ppm signal at center of chromate form)
(100 MHz ) は、 以下に示す通りである。  (100 MHz) is as shown below.
211.3 (s) , 177.3 (s) , 172.3 (s) ， 169.8 (s) ， 62.2(d) ， 50.2(d) ， 47.4 (t) ， 36.9(d) ， 36.8(d) , 34.8 (t) ， 34.6 (t) ， 32.7 (t) ， 31.8 (t) ， 26.3 (t) ， 26.3 (t) ， 24.3 (t) ， 22.4 (t) ， 20.9 (t) ， 16.1(q) , 14.0(q) ， 11.5 (q) ， 7.6(q) 211.3 (s), 177.3 (s), 172.3 (s), 169.8 (s), 62.2 (d), 50.2 (d), 47.4 (t), 36.9 (d), 36.8 (d), 34.8 (t), 34.6 (t), 32.7 (t), 31.8 (t), 26.3 (t), 26.3 (t), 24.3 (t), 22.4 (t), 20.9 (t), 16.1 (q), 14.0 (q), 11.5 (q), 7.6 (q)
) 高速液体クロマトグラフィー ) High performance liquid chromatography
分離カラム：ノバパック ·カートリツジ  Separation column: Novapack · Cartridge
8 VC18 (カラムサイズ、 φ8Χΐ00 ηπ、 ウォーターズ社製） 溶 媒： 70%メタノール/ 0.2 %トリェチルァミン一リン酸 (pH 3.0) 流 速： 1.5 ml/分 8 VC18 (column size, φ8Χΐ00 ηπ, Waters) Solvent: 70% methanol / 0.2% triethylamine monophosphate (pH 3.0) Flow rate: 1.5 ml / min
検 出： UV 210 nm  Detection: UV 210 nm
保持時間： 7.53分  Retention time: 7.53 minutes
マトリスタチン  Matristatin
1) 性 質 ；白色、 吸湿性粉末。  1) Properties: White, hygroscopic powder.
2) 溶 解 性；メタノールに可溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。 2) Solubility: Soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
) 分 子 式； C27H45N606 ) Partial telescopic; C 27 H 45 N 6 0 6
) 分 子 量； FAB-MASS法により決定（M+H) +  ) Molecular weight; determined by FAB-MASS method (M + H) +
549.3385 (測定値）  549.3385 (Measured value)
549.3400 (計算値） 549.3400 (calculated value)
) 融 点； 122— 126。C (分解） ) Melting point: 122-126. C (decomposition)
) 比旋光度； [ct]D 2S — 20. 26° ) Specific rotation: [ct] D 2S — 20. 26 °
(c 1. 14 メタノール） (c 1.14 methanol)
) 紫外吸収スペクトル；メタノール中で 228-230nm(sh ε 7690)に極大吸 収を示す。) Ultraviolet absorption spectrum: shows maximum absorption in methanol at 228 to 230 nm (sh ε 7690).
) 赤外吸収スペクトル； max (KBr) cm" 1 ) Infrared absorption spectrum; max (KBr) cm " 1
KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。  The infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption.
3261, 2960, 2931, 2873， 2860, 1637, 1545， 1515, 1444, 1408， 1376, 1351， 1296, 1238 3261, 2960, 2931, 2873, 2860, 1637, 1545, 1515, 1444, 1408, 1376, 1351, 1296, 1238
) 核磁気共鳴スペクトル ) Nuclear magnetic resonance spectrum
重 DMS0 (ジメチルスルホキシド） 中、 内部基準に TTUS を使用して測定した 核磁気共鳴スペクトル （500 MHz)は、 以下に示す通りである。  The nuclear magnetic resonance spectrum (500 MHz) measured in heavy DMS0 (dimethyl sulfoxide) using TTUS as the internal standard is as shown below.
0.76 (d, 3H) , 0.82 (t， 3H)， 0.84 (t,3H)， 1.17 (m， 1H)， 1.18 (m, 2H) , 1.26 (m,2H )， 1.30 (m，lH)， 1.34 (m，2H)， 1.34 (m, 1H) , 1.44 (m,lH)， 1.48 (m, 1H) , 1.49 (m, 1H)， 1.68 (m, 1H) , 1.90 (m, 1H) , 1.94 (m, 1H) , 1.97 (m，lH)， 1.99 (m， 1H)， 2.02 (m, 1H) , 2.03 (m, 1H)， 2.25 (dd，lH)， 2.56 (m, 1H) , 2.63 (dd， 1H)， 2.87 (dd，lH)， 3.63 (m, 1H) , 4.23 (m, 1H) , 0 0.76 (d, 3H), 0.82 (t, 3H), 0.84 (t, 3H), 1.17 (m, 1H), 1.18 (m, 2H), 1.26 (m, 2H), 1.30 (m, lH), 1.34 (m, 2H), 1.34 (m, 1H), 1.44 (m, lH), 1.48 (m, 1H), 1.49 (m, 1H), 1.68 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.94 ( m, 1H), 1.97 (m, lH), 1.99 (m, 1H), 2.02 (m, 1H), 2.03 (m, 1H), 2.25 (dd, lH), 2.56 (m, 1H), 2.63 (dd , 1H), 2.87 (dd, lH), 3.63 (m, 1H), 4.23 (m, 1H), 0
4.49 (ra，lH)， 4.81 (t, IH) , 4.84 (t，lH)， 4.97 (brd, IH)， 4.49 (ra, lH), 4.81 (t, IH), 4.84 (t, lH), 4.97 (brd, IH),
5.09 (brd, IH) , 6.83 (d, IH) , 8.31 (d.lH), 8.54 (d,lH)， 10.31 (s，l) 13C-核磁気共鳴スぺク卜ル 5.09 (brd, IH), 6.83 (d, IH), 8.31 (d.lH), 8.54 (d, lH), 10.31 (s, l) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum
重 DMS0中、 溶媒のシグナルを基準 （0 0の中; のシグナルを39.5 ppmとす る） として測定した13 C —核 共鳴スペクトル （125 MHz ) は、 以下に 示す通りである。 The 13 C-nuclear resonance spectrum (125 MHz) measured in heavy DMS0 with the solvent signal as a reference (the signal in 00; 39.5 ppm is taken as the signal) is as shown below.
175.6 (s)， 170.9 (s)， 167.9 (s) , 166.4 (s)， 149.5 (s)， 135.3 (d) , 106.8 (d), 62.1 (d), 50.1 (d) , 49.4 (d) , 48.3 (t)， 46.5 (t)， 36.7 (d)， 36.7 (d)， 34.6 (t) , 31.6 (t), 31.3 (t)， 25.7 (t) ,  175.6 (s), 170.9 (s), 167.9 (s), 166.4 (s), 149.5 (s), 135.3 (d), 106.8 (d), 62.1 (d), 50.1 (d), 49.4 (d), 48.3 (t), 46.5 (t), 36.7 (d), 36.7 (d), 34.6 (t), 31.6 (t), 31.3 (t), 25.7 (t),
25.7 (t)， 24.5 (t), 23.3 (t)， 21.8 (t)， 20.6 (t), 17.1 (t)，  25.7 (t), 24.5 (t), 23.3 (t), 21.8 (t), 20.6 (t), 17.1 (t),
15.5 (q), 13.8 (q), 10.4 (q) 15.5 (q), 13.8 (q), 10.4 (q)
) 高速液体クロマトグラフィー ) High performance liquid chromatography
分離カラム：ノバパック ·力一卜リツジ  Separation column: Novapack · Power cartridge
8 VC18 (力ラムサイズ、 φ 8 X 100 ππ、 ゥォ一夕ーズ社製） 溶 媒： 55% (ν/ν) メタノール/ 0.2 % (ν/ν) トリェチルァミン-リン 酸 ( Η 3.3)  8 VC18 (force ram size, φ 8 X 100 ππ, manufactured by 一 Isuzu Corporation) Solvent: 55% (ν / ν) methanol / 0.2% (ν / ν) triethylamine-phosphoric acid (Η3.3)
流 速： 1 mlZ分  Flow rate: 1 mlZ min
検 出： UV 210 run  Detection: UV 210 run
保持時間 ： 4.90分  Retention time: 4.90 minutes
マ卜リスタチン Matristatin
) 性 質；白色、 吸湿性粉末。) Property: White, hygroscopic powder.
) 溶 解 性；メタノールに可溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。) Solubility: Soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
) 分 子 式； G2sH43Ns06 ) Molecular formula; G 2 sH 43 N s 0 6
) 分 子 量； FAB-MASS法により決定（M + H) + ) Molecular weight; determined by FAB-MASS method (M + H) +
535.3229 (測定値）  535.3229 (Measured value)
535 · 3243 (計算値） 535 · 3243 (calculated value)
) 融 点； 89-94 °C) Melting point: 89-94 ° C
) im^t ; [ ]v2S -21.95 ° (c， 0.41 メタノール） ) im ^ t; [] v 2S -21.95 ° (c, 0.41 methanol)
7) 紫外吸収スペクトル；メタノール中で 228-230nm(sh ε 8770)に極大吸 収を示す。  7) Ultraviolet absorption spectrum: shows maximum absorption in methanol at 228 to 230 nm (sh ε 8770).
8) 赤外吸収スペクトル； max (KBr) cm" 1 8) Infrared absorption spectrum; max (KBr) cm " 1
KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。  The infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption.
3257， 2960, 2933, 2873, 1638, 1544, 1515, 1442, 1409, 1377， 1350, 1269, 1239  3257, 2960, 2933, 2873, 1638, 1544, 1515, 1442, 1409, 1377, 1350, 1269, 1239
9) 核磁気共鳴スぺク卜ル  9) Nuclear magnetic resonance spectrum
重 DMSO中、 内部 に TMS を使用して測定した1 H—核 共鳴スペクトル 1 H—nuclear resonance spectrum measured in heavy DMSO using TMS internally
(500 MHz)は、 以下に示す通りである。 (500 MHz) is as shown below.
0.76 (d，3H), 0.82 (t,3H)， 0.84 (t,3H)， 1.17 (m,lH)， 1.18 (m,2H)， 1.26 (m，2H)， 1.30 (m,lH)， 1.34 (m,2H)， 1.34 (m,lH)， 1.44 (m, 1H) , 0.76 (d, 3H), 0.82 (t, 3H), 0.84 (t, 3H), 1.17 (m, lH), 1.18 (m, 2H), 1.26 (m, 2H), 1.30 (m, lH), 1.34 (m, 2H), 1.34 (m, lH), 1.44 (m, 1H),
1.48 (m, 1H) , 1.49 (m, 1H) , 1.68 (m, 1H) , 1.90 (m，lH)， 1.94 (m， 1H)， 1.97 (m，lH)， 1.99 (ra，lH)， 2.02 (m，lH)， 2.03 (m，lH)， 2.25 (dd'lH), 2.56 (m, 1H) , 2.63 (dd, 1H) , 2,87 (dd，lH)， 3.63 (m, 1H) , 4.23 (m，lH)，1.48 (m, 1H), 1.49 (m, 1H), 1.68 (m, 1H), 1.90 (m, lH), 1.94 (m, 1H), 1.97 (m, lH), 1.99 (ra, lH), 2.02 (m, lH), 2.03 (m, lH), 2.25 (dd'lH), 2.56 (m, 1H), 2.63 (dd, 1H), 2,87 (dd, lH), 3.63 (m, 1H), 4.23 (m, lH),
4.49 (m, 1H) , 4.81 (t， 1H)， 4.84 (t，lH)， 4.97 (brd, 1H) , 4.49 (m, 1H), 4.81 (t, 1H), 4.84 (t, lH), 4.97 (brd, 1H),
5.09 (brd, 1H) , 6.83 (d， 1H)， 8.31 (d,lH)， 8.54 (d, 1H) , 10.31 (s，lH)) 13C-核磁気共鳴スペクトル 5.09 (brd, 1H), 6.83 (d, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.54 (d, 1H), 10.31 (s, 1H)) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum
重 D_MS0中、 溶媒のシグナルを基準 （DMSOの中心のシグナルを 39.5 ppmとす る） として測定した13 C —核磁気共鳴スペクトル （125 MHz ) は、 以下に 示す通りである。 The 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (125 MHz) measured using the solvent signal as the standard (assuming the signal at the center of DMSO to be 39.5 ppm) in the heavy D_MS0 is as shown below.
175.7 (s)， 170.9 (s)， 168.0 (s)， 166.9 (s)， 149.4 (s)， 135.2 (d)， 175.7 (s), 170.9 (s), 168.0 (s), 166.9 (s), 149.4 (s), 135.2 (d),
106.8 (d), 62.2 (d)， 50.1 (d)， 49.5 (d) , 48.2 (t)， 46.4 (t)，106.8 (d), 62.2 (d), 50.1 (d), 49.5 (d), 48.2 (t), 46.4 (t),
36.6 (d)， 36.6 (d)， 34.6 (t)， 31.3 (t)， 28.3 (t)， 25.7 (t)， 36.6 (d), 36.6 (d), 34.6 (t), 31.3 (t), 28.3 (t), 25.7 (t),
24.4 (t), 23.3 (t), 22.1 (t)， 20.6 (t)， 17.1 (t)， 15.4 (q)，  24.4 (t), 23.3 (t), 22.1 (t), 20.6 (t), 17.1 (t), 15.4 (q),
13.7 (q), 10.3 (q) 13.7 (q), 10.3 (q)
) 高速液体クロマトグラフィー ) High performance liquid chromatography
分離カラム：ノバパック 'カー卜リツジ 8 VC18 (カラムサイズ、 Φ8Χ100画、 ウォーターズ社製） 溶 媒： 50% (v/v) メ夕ノ一ル Z0.2 % (ν/ν) 卜リェチルァミン一 リン酸 （ΡΗ3.3 ) Separation column: Novapack 'cartridge' 8 VC18 (column size, Φ8Χ100, Waters) Solvent: 50% (v / v) Medium Z0.2% (ν / ν) Triethylamine phosphoric acid (ΡΗ3.3)
流 速-. 2 mlZ分  Flow rate-2 mlZ min
検 出： UV 210 ran  Detection: UV 210 ran
保持時間 ： 3.90分  Retention time: 3.90 minutes
マトリス夕チン Ft Matrice Evening Chin F t
) 性 質；白色、 吸湿性粉末。) Property: White, hygroscopic powder.
) 溶 解 性；メタノールに可溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。) Solubility: Soluble in methanol, poorly soluble in water and black form.
) 分 子 式； C27H45N606 ) Partial telescopic; C 27 H 45 N 6 0 6
) 分 子 量； FAB-MASS法により決定（M+H ) + ) Molecular weight; determined by FAB-MASS method (M + H) +
549.3388 (測定値）  549.3388 (Measured value)
549.3400 (計算値） 549.3400 (calculated value)
) 融 点； 69-75 V) Melting point: 69-75 V
) 比旋光度； [σ]。25 +1.43° ) Specific rotation; [σ]. 25 + 1.43 °
(c， 0.14 メタノール） (c, 0.14 methanol)
) 紫外吸収スペクトル；メタノール中で 228-230nm(sh、 ε 7030)に極大吸 収を示す。) Ultraviolet absorption spectrum: maximum absorption in methanol at 228 to 230 nm (sh, ε 7030).
) 赤外吸収スペクトル； m x (KBr) cm" 1 ) Infrared absorption spectrum; mx (KBr) cm " 1
KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。 3205 (br)， 2960,2933, 2873,2861, 1638, 1543， 1517, 1461, 1443, 1379, 1318,1294,1240 The infrared absorption spectrum measured on the KBr disk shows the following maximum absorption. 3205 (br), 2960,2933, 2873,2861, 1638, 1543, 1517, 1461, 1443, 1379, 1318,1294,1240
) 一核磁気共鳴スぺクトル ) Mononuclear magnetic resonance spectrum
重 DMS0中、 内部 に IMS を使用して測定した1 H—核磁気共鳴スペクトル 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum measured using IMS inside DMS0
(500 MHz)は、 以下に示す通りである。 (500 MHz) is as shown below.
0.78 (d, 3H), 0.86(t,3H), 0.86(t,3H), 1.12 (m, 2H) , 1.15(m, 1H) , 1.16(m, 2H), 1.20(m, 2H) , 1.34 (m, 1H) , 1.37 (m, 1H) , 1.37(m, 1H) , 1.38(m，lH)， 1.58(m，lH)， 1.71(m，lH)， 1.88(m，lH)， 1.90 (in, 1H), 3 0.78 (d, 3H), 0.86 (t, 3H), 0.86 (t, 3H), 1.12 (m, 2H), 1.15 (m, 1H), 1.16 (m, 2H), 1.20 (m, 2H), 1.34 (m, 1H), 1.37 (m, 1H), 1.37 (m, 1H), 1.38 (m, lH), 1.58 (m, lH), 1.71 (m, lH), 1.88 (m, lH), 1.90 ( in, 1H), Three
1.96(m, IH), 1.97(m，lH), 1.97 (m, IH) , 2.16(m, IH) , 2.23 (dd, IH) , 2.46 (m,lH), 2.65(t,lH) , 2.87(m,lH), 3.69(m, IH), 4.12 (m, IH) t. 4.61 (m, IH) , 4.74 (brd, IH), 4.80 (brd, IH) , 4.96 (brd, IH)， 1.96 (m, IH), 1.97 (m, lH), 1.97 (m, IH), 2.16 (m, IH), 2.23 (dd, IH), 2.46 (m, lH), 2.65 (t, lH), 2.87 (m, lH), 3.69 ( m, IH), 4.12 (m, IH) t. 4.61 (m, IH), 4.74 (brd, IH), 4.80 (brd, IH), 4.96 (brd, IH),
5.00 (brd, IH), 6.75 (d, IH) , 8.30(d, IH) , 8.80(d，lH)， 10.28(s,lH) ) 13C-核磁気共鳴スペクトル 5.00 (brd, IH), 6.75 (d, IH), 8.30 (d, IH), 8.80 (d, lH), 10.28 (s, lH)) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum
重 DMSO中、 溶媒のシグナルを基準 （DMSOの中心のシグナルを 39. 5ppm とする） として測定した13 C —核磁気期 スペクトル （125 MHz ) は、 以 下に示す通りである。 The 13 C-nuclear magnetic phase spectrum (125 MHz) measured in heavy DMSO with the solvent signal as a reference (the signal at the center of DMSO is 39.5 ppm) is shown below.
175.9 (s)， 171.9 (s)， 167.9 (s)， 167.5 (s)， 149.8 (s)， 138.4 (d)， 104.5 (d)， 64.0 (d), 49.7 (d)， 48.6 (d), 46.9 (t)， 46.3 (t) , 37.2 (d)， 35.6 (d)， 34.6 (t)， 31.7 (t)， 31.3 (t) , 25.9 (t)，  175.9 (s), 171.9 (s), 167.9 (s), 167.5 (s), 149.8 (s), 138.4 (d), 104.5 (d), 64.0 (d), 49.7 (d), 48.6 (d), 46.9 (t), 46.3 (t), 37.2 (d), 35.6 (d), 34.6 (t), 31.7 (t), 31.3 (t), 25.9 (t),
25.7 (t)， 24.5 (t)， 23.0 (t) , 21.8 (t)， 20.7 (t) , 17.4 (t) ,  25.7 (t), 24.5 (t), 23.0 (t), 21.8 (t), 20.7 (t), 17.4 (t),
14.8 (q), 13.8 (q), 10.5 (q) 14.8 (q), 13.8 (q), 10.5 (q)
) 高速液体クロマトグラフィー ) High performance liquid chromatography
分離カラム：ノバパック ·カートリツジ  Separation column: Novapack · Cartridge
8 VC18 (カラムサイズ、 φ 8 Χΐ00 ππη、 ウォーターズ社製） 溶 媒： 55%メタノール/ 0.2 %(ν/ν) トリェチルアミソ-リン酸 - 8 VC18 (column size, φ8 Χΐ00 ππη, manufactured by Waters) Solvent: 55% methanol / 0.2% (ν / ν) triethylamiso-phosphoric acid-
(ρΗ 3.3) (ρΗ 3.3)
流 _ 速： 2 mlZ分  Flow _ speed: 2 mlZ min
検 出： UV 210 nm  Detection: UV 210 nm
保持時間 ： 4.30分 本発明は、 また、 ァクチノマデュラ属に属するマトリス夕チン^菌、 SANK 6 1488株に関するものである。 その菌学的性状は次の通りである。 Holding time: 4.30 minutes The present invention also relates to a strain of Matris bacillus belonging to the genus Actinomadura, strain SANK61488. The bacteriological properties are as follows.
1. 形態学的性状  1. Morphological properties
ISP [ジ.インターナショナル ·ストレブトミセス 'プロジェクト （Ihe International Streptomyces Project ) 規定の培 ¾±、 28°C、 14日間培養後、 顕微 鏡下観察では SANK 61488株の気菌糸は単純分枝である。胞子鎖は気菌糸上にのみ 着生し、 菌糸に対してほぼ直角に主として 2— 4個の短い連鎖を形成する。 胞子 の表面構造は平滑状 (smooth) である。 分枝、 菌核、 寄生菌糸の断裂、 胞子 のうなどの特殊器官は観察されない。  ISP [I. International Streptomyces Project (Ihe International Streptomyces Project)] After culture for 14 days at a culture medium of ± 28 ° C, microscopic observation shows that the aerial mycelium of SANK 61488 strain is a simple branch. The spore chains only settle on the aerial hyphae, forming 2-4 short chains, almost perpendicular to the hyphae. The surface structure of the spores is smooth. No special organs such as branching, sclerotium, rupture of parasitic hyphae, or spores are observed.
2. 各種培鐘上の諸性質  2. Properties on various culture bells
各種培養基上で 28°C、 14日間培養後の性状は第 1表に示す通りである。 色調の 表示は日本色彩研術版、 "標準色表 のカラーチップ ·ナンバーを表す。  The properties after culturing on various culture media at 28 ° C for 14 days are as shown in Table 1. The color tone display is the color chip number of the standard color table of the Japan Color Institute.
培地の種類 項目 SAN 61488株の性状 シュクロー G 良好、 平坦、 灰味白 Medium type Item Properties of SAN 61488 strain Sucrose G Good, flat, grayish white
ス ·硫酸塩 (N-9)  Sulfate (N-9)
寒天 AM あまり良くない、 粉状、 白  Agar AM Not very good, powdery, white
R 黄味灰 (1-9-10)  R Yellowish gray (1-9-10)
SP 庠牛せず グルコース · G -.平坦—^ 灰味 ァスパラギン ォリーブ （3— 6 - 10) 寒天 AM 僅かに形成、 粉状、 白  Glucose G-.flat— ^ Asparagus olive (3-6-10) Agar AM Slightly formed, powdery, white
R 灰味ォリーブ（3— 5— 10) R Ashy olive (3-5-10)
SP 庠牛せず 5 SP sushi beef Five
グリセリン - G 非常に 、 平坦一^^状、 ァスパラギン オリ—ブ灰 (2- 5- 1 0)
Figure imgf000017_0001
ρ¾ 1 Glycerin-G very, flat, ^^-like, asparagine-olive ash (2-5-10)
Figure imgf000017_0001
ρ¾ 1
p D#J7P (2—4— 9)  p D # J7P (2—4— 9)
S p 陪ぃ昔 ffife本 ( 3— 4— 8 ")  S p ぃ ぃ ffife book (3—4—8 ")
澱粉 -無機塩 G 平坦— 状、 寒天 （ISP4) 灰味白 （N - 9) Starch-Inorganic salt G Flat-like, agar (ISP4) Grayish white (N-9)
AM あまり良く !'、、 粉状、 白 蓮 v^苗i1^ ffifef^ -sz. ί、 " 2— q— q )ノ g¾¾ャ：廿ず 4 AM Not so good! ', Powdery, White lotus v ^ Seedling i 1 ^ ffifef ^ -sz. Ί, "2— q— q) ノ
チロシン寒天 G 非常に跳 平坦—離状、Tyrosine agar G very jumpy flat—separated,
(ISP7) オリ一ブ （ 4一 4一 1 1 ) (ISP7) Olive (4-14-11-1)
AM あまり良くない、 ¾S^ ^r ή AM Not so good, ¾S ^ ^ r ή
Ώ Ώ
B¾し、本 ( A — Λ — ς \  B¾, book (A — Λ — ς \
ペプトン · G 良好、 隆起状、 薄オリ一ブ ィーストェキ (4- 6- 1 0) PeptoneG good, raised, thin orientated (4-6-10)
ス ·鉄寒天 AM 形成せず S · Iron agar AM not formed
(ISP6) R 灰味気茶 (3- 5-8)  (ISP6) R Ashy tea (3- 5-8)
SP 薄黄味茶 (3-7-8) 6 SP light yellow tea (3-7-8) 6
栄鶴天 G 平坦、 黄味灰 (1-9-Eizuruten G Flat, Yellowish Ash (1-9-
(Difico) 10) (Difico) 10)
AM 僅かに形成、 粉状、 白  AM slightly formed, powdery, white
R 黄味灰 (2-9-10) R Yellow ash (2-9-10)
SP 庠牛せず SP sushi beef
イーストェキ G 非常に跳 平坦一^^、 ス .麦芽ェキ 黄味茶 (4-6-9) ス、 ·実ゝ天ノ、 AM 僅かに形成、 粉状、 白 Yeast g G Very jumpy flat ^^, S. Malt yellowish tea (4-6-9) S, ゝ ゝ, AM slightly formed, powdery, white
(ISP2) R 暗い黄味茶 (3-3-8) s P 黄味茶（ 6— 5— 7  (ISP2) R Dark yellow tea (3-3-8) s P Yellow tea (6—5—7
オートミール G 常に^?、 平坦、 灰味白 実天 (ISP3) ( N - 9 ) Oatmeal G Always ^ ?, flat, grayish white (ISP-3) (N-9)
AM 舰- 粉状- 白  AM 舰-powdery- white
R 薄黄味橙 (2-9-9) R Light yellowish orange (2-9-9)
S P 庠牛せず S P
水寒天 G あまり良くない、 平坦、 灰味白 Water agar G Not very good, flat, grayish white
(N-9)  (N-9)
AM 僅かに形成、 粉状、 白  AM slightly formed, powdery, white
R 黄味灰 (1-9-10) R Yellowish gray (1-9-10)
SP 庠牛せず 7 SP sushi beef 7
ポテトエキス G 良好、 平坦、 灰昧白 （N— 9)Potato extract G good, flat, grayish white (N-9)
•人参エキス AM 僅かに形成、 粉状、 白• Ginseng extract AM slightly formed, powdery, white
'寒天 R . 黄味灰 (1-9-10) 'Agar R. Yellowish gray (1-9-10)
SP 庠牛せず  SP sushi beef
G：生育 AM ：気菌糸 R：裏面 S P：可溶性色素. 生理学的性質 G: Growth AM: Aerial mycelium R: Back surface S P: Soluble pigment. Physiological properties
SANK 61488株の生理学的性質は第 2表に示す通りである c The physiological properties of SANK 61488 strain are shown in Table 2c
第 2 表  Table 2
澱粉の水解 陰性  Starch hydrolysis negative
ゼラチンの液化 陰性  Gelatin liquefaction negative
硝酸塩の還元 離  Reduction of nitrate
ミルクの凝固 陰性  Milk coagulation negative
ミルクのペプトン化  Making peptone from milk
生育温度範囲 （培地 1 ) * 18-41 °C 生育適正温度 （培地 1) 25-34 °C 食塩耐性 （培地 1) >2%-<3 ゼインの分解 瞧  Growth temperature range (medium 1) * 18-41 ° C Suitable growth temperature (medium 1) 25-34 ° C Salt tolerance (medium 1)> 2%-<3 Decomposition of zein 瞧
チロシンの分解 陰性  Tyrosine degradation negative
キサンチンの分解 陰性  Xanthine degradation negative
メラニン様色素 性 （培地 2) 離  Melanin-like pigment (medium 2)
(培地 3) 隱  (Medium 3) Oki
(培地 4) 隱  (Medium 4) Oki
* ：培地 1 ；ィ一ス卜エキス ·麦芽エキス寒天 (ISP2)  *: Medium 1; List extract · Malt extract agar (ISP2)
2 ; トリプトン ·イーストエキス ·ブロス （ISP2) 2; Trypton yeast extract broth (ISP2)
3 ；ペプトン ·イーストエキス ·鉄寒天（ISP6)3 ； Peptone · Yeast extract · Iron agar (ISP6)
4；チロシン寒天 (ISP7) また、 プリドハム ·ゴトリ一ブ寒天培地を使用して、 28° 14日間培養後の炭 素源の資化性を調べた。 結果を第 3表に示す。 4; Tyrosine agar (ISP7) In addition, the assimilation of the carbon source after cultivation at 28 ° C for 14 days was examined using a Prideham-Gotrib agar medium. Table 3 shows the results.
第 3 表  Table 3
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+ :利用する 一：利用しない  +: Use one: Do not use
4. 菌体成分について  4. About bacterial components
SANK61488株の細胞壁は長谷川らの方法 [長谷川等、 ザ ·ジャーナル ·ォブ · ジェネラル ·アプライド ·マイクロバイオロジー （ The Journal of General Applied Microbiology )、 29巻 319-322頁、 1983年） ] に従い検討した結果、 メ ソジアミノピメリン酸が検出された。 また、 SA K 488株の全細胞中の糖成分を ェム ·ピ一 レシエバリエの方法 [M. P. Lechevalier , ジャーナル ·ォブ ·ラボ ラトリ一 ·アンド ·クリニカル ·メディシン （Journal of Laboratory and Clinical Medicine) . 71巻 34 - 944頁、 1968年） に従い検討した結果、 グルコ一 ス、 ガラクトース、 マンノース、 リボ一スの他、 微量のマジュロース力 s検出され た。  The cell wall of the SANK61488 strain was examined according to the method of Hasegawa et al. [Hasegawa et al., The Journal of General Applied Microbiology, Vol. 29, pp. 319-322, 1983] As a result, mesodiaminopimelic acid was detected. In addition, the sugar component in the whole cells of the SAK488 strain was determined by the method of MP Lechevalier [MP Lechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine. As a result of examinations in accordance with Volume 34-944, 1968), in addition to glucose, galactose, mannose and ribose, a small amount of madulose was detected.
さらに SA K61488株のメナキノンを [放線菌の同定実験法：日本放線菌学会 編、 （1985年） ]記載の方法で調べたところ主要なメナキノンは MK-9 (HS)であつ た。 I^Lhのことから本菌株は放線菌の中でもァクチノマデュラ属に属することは 明らかである。 ァクチノマデュラ属の中で SA K61488株に最も皿と考えられる 既知菌種としてァクチノマデュラ ·アトラメンタリア （Actinomadura atramenta ria) [インターナショナル，ジャーナル ·ォブ ·システマティック ·バクテリオ ロジ一 ( International Journal οτ systematic Bacteriology)、 37 、 342 ― 346頁、 1987年] 力と考えられる。 そこで SA K61488株とァクチノマデュラ ·アト ラメンタリア JCM 6250株との比 行培養を実施したが、 種を E ^する程の差異 は認められなかった。 そこで SA K61488株はァクチノマデュラ ·アトラメンタリ ァに属する新菌株であると同定し、 ァクチノマデュラ 'アトラメンタリア (Acti nomadura atramentaria) SA K&1488株と命名し、 1 9 9 0年 1月 1 0日に曰本国 微生物工業技術研爾に国内寄託をし （»：研菌寄第 11185号： FP-11185) 、 さ らに、 1 9 9 1年 3月 2 0日に、 日本国徬性物ェ m¾術研 に国際寄託をした (微ェ研条寄第 3327号： BP-3327 ) 。 In addition menaquinone of SA K61488 share [identification experiment method of actinomycetes: Actinomycetes Japan Society, ed., (1985)] is the major menaquinone was examined by the method described been filed in the MK-9 (H S). It is clear from I ^ Lh that this strain belongs to the genus Actinomadura among actinomycetes. Actinomadura atramenta is a known strain of SAK61488 strain among the genus Actinomadura. ria) [International Journal of Systematic Bacteriology, 37, 342-346, 1987]. Therefore, the culture of SA K61488 strain and Actinomadura atramentaria JCM 6250 strain was carried out, but no difference was observed in which the species was E ^. Therefore, SA K61488 strain was identified as a new strain belonging to Actinomadura atramentaria, and was named Actinomadura atramentaria (Acti nomadura atramentaria) SA K & 1488 strain. Deposited in Japan with the National Institute of Microbial Technology (»: Kenkyu No. 11185: FP-11185), and on March 20, 1990, the Japanese Institute of Natural Science and Technology International Depositary (John Kenjo No. 3327: BP-3327).
周知の通り、 放線菌は自然界において、 また人工的な操作 （例えば、 紫外線照 射、 放射線照射、 化学薬品処理等） により、 変異をおこしゃすく、 本発明の SANK 61488株もこの点は同じである。 本発明にいう SA K61488株はそのすベての変異 株を包含する。 また、 これらの変異株の中には、 遺伝学的方法、 例えば組換え、 形質導入、 形質転換等により得られたものも包含される。 すなわち、 本発明では マトリスタチンを生産し、 SA K&1488株およびその変異株と明確に区別されない 菌株は、 すべて SA K61488株に包含されるものである。  As is well known, actinomycetes are mutated in the natural world and by artificial operations (for example, ultraviolet irradiation, irradiation, chemical treatment, etc.). The same is true for the SANK 61488 strain of the present invention. is there. The SA K61488 strain according to the present invention includes all the mutant strains. These mutants also include those obtained by genetic methods, for example, recombination, transduction, transformation, and the like. That is, in the present invention, all strains that produce matristatin and are not clearly distinguished from the SA K & 1488 strain and its mutant strain are included in the SA K61488 strain.
本発明の SA K61488株はオース卜ラリァ国ダービー市周辺より した土壌を あらかじめ 意した滅菌水で ^した。 ついで、 下記に示した糸誠の分離用 寒天培地 H A培地に Μ¾し、 28°Cにて 10日間培養することにより出現してくる放 線菌のコロニーの中から分離することができた。  The SAK61488 strain of the present invention was prepared by sterilizing the soil from around Derby, Australia, with sterile water prepared in advance. Then, it was separated from the colonies of actinomycetes that emerged by culturing it at 28 ° C. for 10 days on the following agar medium for separation and agar medium HA for separation shown below.
H A培地  HA medium
燐酸 素ナトリウム 0.2 g  Sodium phosphate 0.2 g
塩化カリウム 0.1 g  Potassium chloride 0.1 g
硫酸第一鉄 0.1 g  Ferrous sulfate 0.1 g
硫酸マグネシウム 0.1 g  Magnesium sulfate 0.1 g
炭酸カルシウム 5.0 g  Calcium carbonate 5.0 g
フミン酸 2.0 g  Humic acid 2.0 g
寒天 20.0 g 蒸留水 1000 mlAgar 20.0 g 1000 ml of distilled water
H (滅菌前） 7.4  H (before sterilization) 7.4
本発明の新菌株を分離するに際し使用される分離培地としては炭素源、 窒素源 、 無機イオンおよび有機栄養源等より選択されたものを適宜含有する培地であれ ば合成または天然培地の何れでも使用可能である。  As a separation medium used for isolating the new strain of the present invention, any synthetic or natural medium may be used as long as the medium appropriately contains one selected from a carbon source, a nitrogen source, an inorganic ion and an organic nutrient source. It is possible.
本発明は、 ァクチノマデュラ属に属するマトリスタチン^菌を培養し、 その 培養物よりマ卜リスタチンを,することを とするマ卜リスタチンの 法 に関するものであり、 さらに詳しくは、 菌が SANK 61488株である^^法 に関するものである。  The present invention relates to a method for matristatin, which comprises culturing a matristatin ^ bacterium belonging to the genus Actinomadura, and obtaining matristatin from the culture.More specifically, the present invention relates to a method wherein the bacterium is a SANK 61488 strain. It is about a certain ^^ method.
マ卜リス夕チンは SANK 61488株を適当な培地で培養し、 それから すること によって得られる。 栄養源としては、 菌類の菌株の培養に利用されてい る公知のもの力 用できる。 例えば、 炭素源としてはグルコース、 シュクロース 、 澱粉、 グリセリン、 水飴、 糖蜜、 ^油などカ 用できる。 また、 窒素源とし ては大豆粉、 コーンスチ一プリカ一、 硫酸アンモニゥム、 硝酸ナトリウム等を使 用しうる。 このほカ^^に応じて炭酸カルシウム、 リン酸塩等の^ を添加 するほか、 菌株の発育を助け、 マトリスタチンの生産を促進するような有機およ び無機物を適当に添加することができる。 培養法としては、 一般の 5¾物質を生. 産する方法と同じく液 咅養法、 特に深 養法が最も適している。培養は、 好 気的条件下で行なわれ、 培養に適当な温度は 24-30でであるが、 多くの場合 28°C 付近で培養する。 マトリス夕チンの^は、 MM培養で通常 5-10日で最高値に達 する。  Matris can be obtained by culturing SANK 61488 strain in an appropriate medium and then growing it. As the nutrient source, known nutrients used for culturing fungal strains can be used. For example, as a carbon source, glucose, sucrose, starch, glycerin, syrup, molasses, and oil can be used. Also, as a nitrogen source, soybean flour, corn starch, ammonium sulfate, sodium nitrate, etc. may be used. In addition to ^^ such as calcium carbonate and phosphate, depending on the fog, organic and inorganic substances which help the growth of the strain and promote the production of matristatin can be appropriately added. . As the culture method, the liquid culture method, especially the deep culture method, is the most suitable, as is the general method for producing 5 substances. Cultivation is performed under aerobic conditions, and the appropriate temperature for cultivation is 24-30, but in most cases it is cultivated at around 28 ° C. Matris ^ ^ usually reaches its maximum in 5-10 days in MM culture.
培養終了後、 培養液中の液体部分に存在する菌体、 その他の固形部分を、 珪藻 土をろ過操作助剤とするろ過操作または遠心分離によつて分別し、 そのろ液また は上清中に存在するマ卜リスタチン類を、 IV型コラゲナ一ゼの阻害活性を測定す ることにより、 その物理化学的性状を利用し抽出精製することができる。  After completion of the culture, the cells and other solid parts present in the liquid part of the culture solution are separated by filtration or centrifugation using diatomaceous earth as a filtration aid, and the filtrate or supernatant Matristatins present in the yeast can be extracted and purified by measuring the inhibitory activity of type IV collagenase by utilizing its physicochemical properties.
IV型コラゲナ一ゼ活性は、 Saloらの方法 (J. Biol. Chem. , vol.258, 3058- 3063 (1983) ) の方法により測定することができる。  The type IV collagenase activity can be measured by the method of Salo et al. (J. Biol. Chem., Vol. 258, 3058-3063 (1983)).
すなわち、 IV型コラゲナ一ゼはヒトメラノーマ細胞の無 jd清培養液より調製し たものを、 また基質としては、 マウス EHS腫瘍より調製した IV型コラ一ゲンを放 射性同位元素で標識したものを用いてコラーゲンの切断を計測することにより測 定できる。 That is, type IV collagenase was prepared from jd-free culture of human melanoma cells. The substrate can be measured by measuring collagen cleavage using a type IV collagen prepared from mouse EHS tumor and labeled with a radioisotope.
IV型コラゲナーゼの阻害活性は、 この瞧反応液に検体を同時に添加し、 m 反応の阻害率を算定することにより、 測定することができる。  The inhibitory activity of type IV collagenase can be measured by simultaneously adding a sample to this reaction mixture and calculating the inhibition rate of the m reaction.
ろ液または、 上清中に存在するマトリス夕チンは、 中性 PH条件下で水と混和し ない有機溶剤、 例えば n—ブタノール、 メチルェチルケトン、 酢酸ェチル、 クロ 口ホルム、 塩化エチレン、 塩化メチレンなどの単独または、 それらの組み合わせ により抽出精製することができる。 あるいは吸着剤として、 例えば活 ffi ^または 吸着用樹脂であるアンバーライ卜 AD — 2、 XAD - 4 (ローム 'アンド 'ハース 社製） 等や、 ダイヤイオン HP -10、 HP - 20、 CHP - 20P、 HP - 50 (三菱 ^βξ ㈱製） 等力 '使用される。 マトリスタチンを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通 過させて不純物を吸着させて取り除く力 \ またはマトリスタチンを吸着させた後 、 メタノール水、 アセトン水、 η—ブタノール水などを用いて溶出させることに より得られる。 更にシリカゲル、 フロリジルのような坦体を用いた吸着カラムク 口マトグラフィー、 セフアデックス LH -20 (フアルマシア社製） などを用いた分 配カラムクロマトグラフィー、 セフアデックス G 25 (フアルマシア社製） など を用いたゲルろ過クロマトグラフィー、 および順相、 逆相カラムを用いた高速液 体クロマ卜グラフィ一等で本発明のマトリスタチンを精製することが出来る。  Matris-tin, present in the filtrate or supernatant, is an organic solvent that is immiscible with water under neutral pH conditions, such as n-butanol, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, chloroform, ethylene chloride, chloride Extraction and purification can be performed using methylene alone or a combination thereof. Alternatively, as an adsorbent, for example, active resin or Amberlite AD-2, XAD-4 (manufactured by ROHM & Haas Co., Ltd.), which are adsorption resins, and Diaion HP-10, HP-20, CHP-20P Used, HP-50 (made by Mitsubishi ^ βξ). Matristatin-containing liquid is passed through the adsorbent layer as described above to absorb and remove impurities, or after adsorbing matristatin, elute with methanol water, acetone water, η-butanol water, etc. It is obtained by doing. Furthermore, adsorption column chromatography using a carrier such as silica gel or Florisil, separation column chromatography using Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia), Sephadex G25 (manufactured by Pharmacia), etc. The matristatin of the present invention can be purified by gel filtration chromatography, high-performance liquid chromatography using a normal phase or reverse phase column, and the like.
[発明の効果]  [The invention's effect]
試験例 1 . マ卜リス夕チンの IV型コラゲナーゼに対する阻害活性 Test Example 1. Inhibitory activity of matrisutin on type IV collagenase
実施例 2及び 3で得られたマトリスタチンについて、 IV型コラゲナーゼに対す る阻害活性を測定した。 結果 (150値で表わす） を以下に示す。 With respect to the matristatins obtained in Examples 2 and 3, the inhibitory activity against type IV collagenase was measured. The results (expressed in 1 50 value) are shown below.
マトリスタチン類 I5。 ( u g/ml) Matrigel statins I 5. (ug / ml)
A , 0.23 A, 0.23
A 2 45 A 2 45
B , 0.39 D 2.0 B, 0.39 D 2.0
E 10.3  E 10.3
F 1.0  F 1.0
[産業上の利用可能性] [Industrial applicability]
本発明は、 マトリス夕チンを ¾成分とする、 血管新生抑制剤、 癌浸潤抑制剤 又は癌転移抑制剤に関するものである。  TECHNICAL FIELD The present invention relates to an angiogenesis inhibitor, a cancer invasion inhibitor or a cancer metastasis inhibitor comprising matrisutin as a main component.
本発明のマトリス夕チンを、 血^ ί生抑制剤、 癌浸潤抑制剤又は癌転移抑制剤 として用いる場合、 種々の形態で投与される。 その投与形態としては例えば |£ 、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤等による経口投与または注射剤 （静脈 内、 筋肉内、 皮下） 、 点眼剤、 »J等による非経口投与を挙げることができる。 これらの各種製剤は、 常法にしたがって主薬に 1©¾剤、 結合剤、 崩壊剤、 潤沢剤 矯味矯臭剤、 溶解補助剤、 懸濁剤、 コ一ティング剤等 の医薬製剤 STi分野 において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。 その使 用量は症状、 年齢、 体重、 投与方法およ 形等によって異なる力通常は こ 対して 1日 50 mg乃至 1000 mgを投与することができる。 When the matricestin of the present invention is used as a blood growth inhibitor, a cancer invasion inhibitor or a cancer metastasis inhibitor, it is administered in various forms. Examples of the dosage form include oral administration using | £, capsules, granules, powders, syrups, etc. or parenteral administration using injections (intravenous, intramuscular, subcutaneous), eye drops, »J, etc. it can. These various preparations are commonly used in the pharmaceutical formulation STi field, such as 1% active ingredient, binder, disintegrant, lubricant, flavoring agent, solubilizer, suspending agent, coating agent, etc. It can be formulated using known adjuvants. The dosage varies depending on the condition, age, weight, administration method and form, etc. Usually 50 mg to 1000 mg per day can be administered.
次に実施例、 試験例及び製剤例をあげて本発明を更に具体的に説明する。Next, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, Test Examples and Formulation Examples.
(実施例 1 ) SA K61488株の分離 (Example 1) Isolation of SA K61488 strain
オーストラリァ国ダ一ビー市より纖した土壌 1 gを 9 ιη·6の菌水に懸濁し、 キサ一で充分攪拌し、 約 30分間放置した。 このようにして得られた土壌懸濁液 上清 1 m£を 1000倍希釈した後、 その上清 0.05 m を下記に示す分離用寒天培地 HA培地に滅菌コンラージ棒を用いて ¾し 28°Cにて 10日間培養した。  1 g of soil soiled from Dabbie City, Australia, was suspended in 9 ιη · 6 bacterial water, stirred thoroughly with a mixer, and allowed to stand for about 30 minutes. After diluting 1 ml of the soil suspension supernatant obtained in this manner 1000-fold, 0.05 m of the supernatant was put on an agar medium for separation HA medium shown below using a sterile conical rod at 28 ° C. For 10 days.
H A培地  HA medium
燐酸: ΙΤΚ素ナトリウム 0.2 g  Phosphoric acid: sodium iodine 0.2 g
塩化カリウム 0. 1 g  Potassium chloride 0.1 g
硫酸第一鉄 0. 1 g  Ferrous sulfate 0.1 g
硫酸マグネシウム 0. 1 g  Magnesium sulfate 0.1 g
炭酸カルシウム 5.0 g  Calcium carbonate 5.0 g
フミン酸 2. 0 g  Humic acid 2.0 g
20. 0 g イオン交換水 1000 m£  20.0 g ion exchange water 1000 m £
pH (滅菌前） 7.4  pH (before sterilization) 7.4
ァクチノマデュラ 'アトラメンタリァ SA &1488株は上記の HA¾天培 に出 現したコロニーからィ一スト麦魏天 (ISP2)の斜面培地に接種し、 28°Cで 14日間 培養して得られた。  Actinomadura 'Atramentaria SA & 1488 strain was obtained by inoculating a colony expressed in the above-mentioned HA II culture medium into a slant culture medium of wheat wheat (ISP2) and culturing at 28 ° C for 14 days.
このようにして得られた本菌株はモノコロニー処理等により単一菌株であるこ とを確認した。 このようにして純粋培養された菌株は、 分散剤に 1 0 %スキムミ ルクを用いた 結!^アンプルとして保存した。  The strain obtained in this manner was confirmed to be a single strain by monocolony treatment or the like. The strain thus pure-cultured was stored as an ampoule using 10% skim milk as a dispersing agent.
(実施例 2 ) マトリスタチン 及び A2の精製 Purification of (Example 2) Matricaria statins and A 2
(A) 培 養  (A) Cultivation
ァクチノマデュラ 'アトラメンタリア SANK61488株を、 無菌的に、 滅菌した後 述の誠の種培養培地 700 m£を含む 2 £の三角フラスコ （種フラスコ） に接種 した。 次いでこれを 28°Cで 8日間、 200 rpmのロータリー振とう機で前培養し た。 更に、 同培地 30 £を含む 60 タンクに、 この種培養液を 600 m£入れ、 28°C で 2日間培養した。 Actinomadura 'Atramentaria SANK61488 strain is aseptically sterilized and inoculated into a 2 £ Erlenmeyer flask (seed flask) containing 700 m £ of the aforementioned Makoto Seed Culture Medium. did. This was then precultured at 28 ° C for 8 days on a rotary shaker at 200 rpm. Further, this seed culture solution was placed in 60 tanks containing the same medium in an amount of 600 ml and cultured at 28 ° C for 2 days.
培地誠 騰難地）  Medium medium
グルコース 10 g  10 g glucose
グリセロール 10 g  Glycerol 10 g
ォ—卜ミール 5 g シユークロース 10 g  Oatmeal 5 g sucrose 10 g
S . B . M. 20 g  S.B.M.20 g
カザミノ酸 5 g  Casamino acid 5 g
生イースト 10 g  10 g raw yeast
イースト ·エキストラクト 3 g  3 g yeast extract
炭酸カルシウム 1 g  1 g calcium carbonate
消泡剤 （ニッサンディフォーム GB-442：  Defoamer (Nissan Deform GB-442:
曰棚 0.2 g イオン交換水 1000 m£  Sauna 0.2 g ion exchange water 1000 m £
pH 7.0  pH 7.0
^±咅養 の,の培地 （MP培地） を 600 タンクに 300 £入れ、 これを 120 °Cで 30分間加熱 菌した。 次いでこれに Jb の種培養液を 9 £入れ、 28°Cで 5日間 300 £Z分の空気 ¾ϋ*で攪拌 ^を 100 rpmにして攪拌培養した。  A medium (MP medium) of ^ ± culture was put into a 600 tank at a rate of 300 pounds, and heated at 120 ° C for 30 minutes. Next, 9 £ of a seed culture solution of Jb was added thereto, and the mixture was stirred and cultured at 28 ° C for 5 days with 300 ° Z of air ¾ϋ * at 100 rpm.
培觸脈 （MP培地）  Venous vein (MP medium)
グルコース 5 g  Glucose 5 g
マル! ^一ス 15 g  Maru! ^ 1 g 15 g
イースト *エキストラクト 3 g  Yeast * Extract 3 g
ファーマメディア 10 g  Pharma Media 10 g
塩 ίヒナトリウム 3 g  Salt sodium arsenate 3 g
リン酸二カリウム 2 g 消泡剤 （ニッサンディフォーム CB-442) 0.2 g イオン交換水 1000 m-β 2 g dipotassium phosphate Defoamer (Nissan Deform CB-442) 0.2 g ion exchange water 1000 m-β
pH 7.2  pH 7.2
(B) 単 離  (B) Isolation
IV型コラゲナ一ゼの阻害活'性を測定することにより、 マトリス夕チン 及び A2を単離精製した。 By measuring the inhibitory activity 'of the type IV Collagenase Ichize it was isolated and purified Matorisu evening Chin and A 2.
IV型コラゲナーゼ活性は、 Salo等の方法 (J. Biol. Chem. , vol.258, 3058-30 63， （1983) )を^して測定した。 すなわち、 IV型コラゲナ一ゼはヒトメラノ一 マ細胞の無 Jill清培養液より調製し、 また、 基質としてマウス EHS腫瘍より ΐνϋコ ラ一ゲンを調製し 3Η—無水酢酸で標識しすこ。 The type IV collagenase activity was measured by the method of Salo et al. (J. Biol. Chem., Vol. 258, 3058-3063, (1983)). That is, type IV collagenase is prepared from a Jill-free culture of human melanoma cells, and is prepared from mouse EHS tumor as a substrate, and is labeled with 3- acetic acid anhydride.
この酵素液及び基質液を、 0.2Μ NaC£ , 10 ιπ CaCl2 ， 4 mM N—ェチルマレ イミド， 40 /z g / ιπ 7プロチニン， 0.05%Brij35を含む 50 mM 卜リス塩酸緩衝 液に添加し、 最終液量を 0.1 m .として 37°Cて 3時間^ ;させた。 トリクロル酢 酸 (TCA) を終濃度 2 %， タンニン酸を終濃度 0.1 %となるように加えて i芯を停 止させ、 4 °Cで 30分放置し、 4°C， 10, 000 rpni で 20分間遠心した。 この上清の —定量に Insta-gel (パッカード社製） 10 を加えて放射活性を測定した。 マトリスタチンの阻害活性は、 上 液に測定用のマ卜リスタチン溶液を添 加して、 同様の操作を行い、 放射活性を測定し、 ^¾反応の阻^より求めた。 培養ろ液 600 を 60 のダイヤイオン HP- 20 に付し、 200 のイオン交換水、 175 の 20%アセトンで洗浄後、 290 の 50%アセトンにて溶出し、 330 gの黒 色粉末を得た。 このうち、 150 g を 7.5 のイオン交換水に溶解し、 等量の n—ブ夕ノールを加え 30分間攪拌した。 4— 5時間静置すると 2層に分かれるの で、 上層 '下層を分離した。 下層にはさらに 6.5 £の n—ブタノ一ルを加えて再 び抽出した。 抽出液を合わせ、 濃縮 ·凍結 し 35.6 gの濃^ の粉末を得た。 この粉末を 200 m£の 80%メタノール一稀トリフルォロ酢酸（TFA) 水溶液 （pH 3. 5 ) に溶かし、 不溶物はろ過により除去した。 この溶液をセフアデックス L H 20 (カラムサイズ： 8.5 φ X 76cm) に ^した。 同じ溶媒で溶出し、 溶出開 始より 1.5 から 300 m£ずつ分画し、 20の画分を得た。 各画分の瞧 P且害活性 を測定し、 阻害活性の強い 5番目の画分を濃縮， し、 褐色粉末 2.52 g¾ 得た。 この粉末をさらに調製用の H PLCで精製した。 すなわち、 上記で得られ た褐色粉末のうち約 200 mgを 1.0 m£の 34%CH3C — 1 % (v/v) 卜リェチルァミ ンリン酸バッファ一 (pH 3.3) に溶解し、 同じ溶媒で 化した H PLCカラムThe enzyme solution and the substrate solution are added to a 50 mM Tris-HCl buffer solution containing 0.2% NaC £, 10 L CaCl 2 , 4 mM N-ethyl maleimide, 40 / zg / L 7 protinin, and 0.05% Brij 35, and the final solution is added. The liquid volume was set to 0.1 m. Trichloroacetic acid (TCA) was added to a final concentration of 2% and tannic acid to a final concentration of 0.1% to stop the i-core. The mixture was allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes and then at 4 ° C and 10,000 rpni. Centrifuged for 20 minutes. Insta-gel (manufactured by Packard) 10 was added to the quantification of the supernatant, and the radioactivity was measured. Matristatin inhibitory activity was determined by adding a matristatin solution for measurement to the upper solution, performing the same operation, measuring the radioactivity, and determining the inhibition of the reaction. The culture filtrate 600 was applied to 60 Diaion HP-20, washed with 200 ion-exchanged water and 175 20% acetone, and eluted with 290 50% acetone to obtain 330 g of a black powder. . Of these, 150 g was dissolved in 7.5 ion-exchanged water, an equal volume of n-butanol was added, and the mixture was stirred for 30 minutes. After standing for 4-5 hours, the two layers were separated, so the upper and lower layers were separated. The lower layer was extracted again with an additional 6.5 £ of n-butanol. The extracts were combined, concentrated and frozen to obtain 35.6 g of a concentrated powder. This powder was dissolved in 200 ml of an 80% methanol-diluted trifluoroacetic acid (TFA) aqueous solution (pH 3.5), and insolubles were removed by filtration. This solution was applied to Sephadex LH20 (column size: 8.5 φ X 76 cm). Elution with the same solvent, elution open From the beginning, fractionation was carried out for 1.5 to 300 ml each to obtain 20 fractions. The P and harmful activity of each fraction was measured, and the fifth fraction having strong inhibitory activity was concentrated and concentrated to obtain 2.52 g of brown powder. This powder was further purified by preparative HPLC. That is, about 200 mg of the brown powder obtained above was dissolved in 1.0 ml of 34% CH 3 C—1% (v / v) triethylamine phosphate buffer (pH 3.3), and the mixture was dissolved in the same solvent. H PLC column
(Seushupak ODS -5301N, 20φ X300 mm, センシュ一科^^) に し、 流 速 6.0 m /分で溶出した。 示 ¾ 折計でモニタ一し、 25分及び 32分に現われ るピークに相当する溶出液を分取した。 残りの褐色粉末についても同様の操作を 行い、 分取した溶出液をブールした。 それぞれの溶出液を E濃縮して、 ァセト 二卜リルを留去し、 この溶液をダイヤイオン HP— 20カラムに ^した。 カラム をよくイオン交換水で洗浄したのち、 50 m の 50%アセトンで溶出した。 溶出液 を濃縮， 凍結 することにより、 25分のピークに対応する溶出液からはマトリ スチン が 76 mg， 32分のピークに対応する溶出液からはマ卜リス夕チン A2の 112 mの白色粉末力 尋られた。 (Seushupak ODS -5301N, 20φ X300 mm, Senshu family), and eluted at a flow rate of 6.0 m / min. The eluate corresponding to the peaks appearing at 25 minutes and 32 minutes was collected by monitoring with a diffractometer. The same operation was performed with respect to the remaining brown powder, and the eluate collected was subjected to boiling. Each eluate was concentrated by E to remove acetate nitrile, and this solution was applied to a Diaion HP-20 column. The column was washed well with ion-exchanged water and eluted with 50 m of 50% acetone. The eluate was concentrated and freeze, 25 minutes of Matrigel cystine is 76 mg from the eluate corresponding to the peak, 32 minutes white 112 m Ma Bok squirrel evening Chin A 2 is from the eluate corresponding to the peak Powdered.
(実施例 3) マトリスタチン の精製  (Example 3) Purification of matristatin
実施例 2で記載した方法により IV コラゲナーゼ阻害活性を測定することによ り、 マトリス夕チン ^を精製した。  Matristin was purified by measuring IV collagenase inhibitory activity according to the method described in Example 2.
実施例 2 (A) で記載した方法により培養ろ液を調製した。 培養ろ液を 30 のダ ィャィォ: X HP— 20に付し、 100 のイオン交換水、 90 £の 20%アセトンで洗浄 後、 150 の 50%アセトンにて溶出し、 離^後 29.2 gの黒色粉末を得た。 こ れを 1.5 gのイオン交換水に溶解し、 等量の n—ブタノールで 2回抽出した。  A culture filtrate was prepared by the method described in Example 2 (A). The culture filtrate is applied to 30 Dyaro: XHP-20, washed with 100 ion-exchanged water, 90 £ of 20% acetone, eluted with 150 of 50% acetone, and 29.2 g of black after separation A powder was obtained. This was dissolved in 1.5 g of ion-exchanged water and extracted twice with an equal amount of n-butanol.
2回分の抽出液をプールし濃縮'凍結^し、 5.29 gの濃 の粉末を得た。 こ の粉末を 40 m の 80%メタノール一稀 TFA水溶液 (PH 3.5) に溶かし、 同じ溶媒 平後 匕したセフアデックス LH (カラムサイズ： 60 X43 cm ) に" ^した。 同 じ溶媒で約 420 m£溶出すると黄色の溶出液が溶出し始める。 この時点より 500 m£を 取した。 このものを濃縮， |^して濃褐色の粉末 4.4 gを得た。 こ の粉末を 3回に分けて、 30%メ夕ノールで平衡化したローバー 'カラムThe two extracts were pooled and concentrated and 'frozen' to give 5.29 g of a thick powder. It was dissolved in 80% methanol one rare aqueous TFA powder this a 40 m (P H 3.5), the same solvent Rights after spoon the Sephadex LH. (Column size: 60 X43 cm) to "^ and in the same solvent to about 420 After elution of m £, the yellow eluate began to elute, from which point 500 ml was taken and concentrated and concentrated to give 4.4 g of a dark brown powder, which was divided into three portions. Rover 'column equilibrated with 30% methanol
(RP-8, サイズ B， メルク社製） に^し、 200 m の 30%メタノール、 そ れぞれ 300 m の 50%、 60%, 70%、 80%、 90%のメタノールで溶出した。 70%のメタノール画分に,阻害活性が見い出されたので、 このものを濃縮， 凍 結體し、 3回の操作で 1.10 gの褐色粉末を得た。 (RP-8, size B, manufactured by Merck), 200 m of 30% methanol, Elution was performed with 300 m of 50%, 60%, 70%, 80%, and 90% methanol, respectively. An inhibitory activity was found in 70% of the methanol fraction, which was concentrated and frozen, and 1.10 g of a brown powder was obtained by three operations.
この粉末を 3 し、 それぞれ 50%メタノールで 匕したセフアデックス C -25 (カラムサイズ 2.8 Φ X 70 cm ) に供与し、 約 1滴ノ 5秒の流速で溶出 し、 300滴 Z画分ずつ採取した。 54-57番目の画分を集め濃縮， し、 360 mの黄色粉末を得た。 このものを調製用 HPLCでさらに精製した。 すなわち、 1回の操作において約 50 mgの黄色粉末を 0.2 m£の 38%CH3CN - 0.2 %卜リエ チルァミンリン酸バッファー （PH 3.3) に溶解し、 同じ溶媒で^^化した。 Sens hu PAK0DS - 4251 Nカラム （10 φ Χ 250 mm) に^!して、 5.0 m ノ分で溶 出した。 示難折計でモニタ一し、 22分付近に現われるピークに相当する溶出液 を採取した。 残りの粉末についても同様の操作を行い、 ^¾した溶出液をプール した。 このものを E濃縮してァセトニ卜リルを留去し、 イオン交換水で 化 した。 約 10 m のダイヤイオン H P— 20に供与した。 カラムをイオン交換水でよ く洗浄したのち、 50 ra の 50%アセトンで溶出した。 溶出液を 下において濃 縮， 凍結 し、 75 mgの白色粉末のマトリス夕チン を得た。 This powder was divided into 3 and applied to Sephadex C-25 (column size: 2.8 Φ X 70 cm), each of which was immersed in 50% methanol, eluted at a flow rate of about 1 drop per 5 seconds, and collected 300 drops per Z fraction did. The 54th to 57th fractions were collected and concentrated to obtain 360 m yellow powder. This was further purified by preparative HPLC. That is, in one operation, about 50 mg of yellow powder was dissolved in 0.2 ml of 38% CH 3 CN-0.2% triethylamine phosphate buffer (PH 3.3) and converted into the same solvent. Sens hu PAK0DS-4251 N column (10 φ m 250 mm) ^! The eluate corresponding to the peak appearing at around 22 minutes was collected by monitoring with a thermometer. The same operation was performed for the remaining powders, and the eluates obtained by ^^ were pooled. This was concentrated with E to remove acetonitrile, which was converted into ion-exchanged water. About 10 m of Diaion HP-20 was donated. After thoroughly washing the column with ion-exchanged water, the column was eluted with 50 ra of 50% acetone. The eluate was concentrated and frozen at the bottom to obtain 75 mg of matricestin as white powder.
(実施例 4 ) マトリス夕チン D,， Ei , F, の精製  (Example 4) Purification of matrices D ,, Ei, F,
(A) 培養  (A) Culture
ァクチノ？デユラ' アトラメン夕リア SANK 61488株を、 無菌的に滅菌した腿 の組成の種培養 i咅地 700 πι£を含む 2 1 の三角フラスコ （種フラスコ） に接種 した。 ついでこれを 28でで 8 日間、 200 rpmのロータリー振とう機で前培養 した。 更に、 同培地 30 を含む 60 タンクに、 この種培養液を 600 ιπ£入 れ、 28°C で 2日間培養した。 Actino? The Dyura 'attramen Yuria SANK 61488 strain was inoculated into 21 Erlenmeyer flasks (seed flasks) containing aseptically sterilized thigh composition seed cultures, i. This was then precultured at 28 for 8 days on a rotary shaker at 200 rpm. Further, this seed culture solution was placed in a 60 tank containing the same medium 30 at 600 lpi, and cultured at 28 ° C for 2 days.
培職誠 養培地）  Cultivation culture medium)
グルコース 10 g  10 g glucose
グリセロール 10 g  Glycerol 10 g
ォ一トミール 5 g  5 g of oatmeal
シュ一クロース 10 g 大豆粉 20 g Sucrose 10 g 20 g soy flour
カザミノ酸 5  Casamino acid 5
生イースト 10 g  10 g raw yeast
イースト ·エキストラクト · 3 g  Yeast extract3 g
炭酸カルシウム 1 g  1 g calcium carbonate
消泡剤 （ニッサンディスフォ一一ム  Antifoaming agent (Nissan Disposal
CB-422: 曰棚旨 （株） ) 0.2 g イオン交換水 1000 m£ pH 7.0 咅養は後述の の培地（MBG3-7改変培地） を 600£タンクに 300 £入れ、 こ れを 120 °Cで 30分間加熱 菌した。 ついでこれに の種培養液を 9£入れ、 28°C 5 日間 300 1/分の空気流量で攪拌速度を 100 rpnにして攪拌培養した。 CB-422: Saitama Gakkai Co., Ltd.) 0.2 g Ion-exchanged water 1000 m £ pH 7.0 For fermentation, put the following medium (MBG3-7 modified medium) into a 600 £ tank, put 300 £ into a tank, and put this at 120 ° C. For 30 minutes. Then, 9 kg of the seed culture solution was added thereto, and the mixture was stirred and cultured at 28 ° C. for 5 days with an air flow rate of 300 1 / min and a stirring speed of 100 rpn.
m . (MBG3-7 改変培地）  m. (MBG3-7 modified medium)
グルコース 30 g  30 g glucose
グリセロール 70 g  Glycerol 70 g
ポリ プトン 10 g  Polypton 10 g
^MB IO g  ^ MB IO g
コーンスチープリカー 10 g  Corn steep liquor 10 g
硫酸マグネシウム- 7水和塩 5 g  Magnesium sulfate-7 hydrate 5 g
硝酸ナトリウム 5 g Sodium nitrate 5 g
消泡剤 （ニッサンディスフオーム  Defoamer (Nissan Disform
CB-442) 0.2 g イオン交換水 1000 m£  (CB-442) 0.2 g ion exchange water 1000 m £
pH 7.2 ( B ) 単離 pH 7.2 (B) Isolation
上述の培養で得た培養濾液を実施例 1とまったく同様にダイャィォン HP 20 n-BuOH 抽出、 及びセフアデックス LH 20 で処理した。 すなわち培養濾液を 60 のダイアイオン HP 20 に吸着し、 200 £のイオン交換水、 175 の 20% アセトンによる洗浄の後、 290 の 50¾ アセトンで溶出し、 濃縮、 を 行うことにより 540 g の黒色粉末を得た。 この粉末を 30 £の水に溶解し、 等 量の BuOHで 2回抽出した。 有機相を集め、 濃縮 することにより  The culture filtrate obtained by the above-described culture was treated with Diason HP20 n-BuOH extraction and Sephadex LH20 in exactly the same manner as in Example 1. That is, the culture filtrate was adsorbed on Diaion HP 20 at 60, washed with 200 £ of ion-exchanged water and 175 of 20% acetone, eluted with 290 of 50 、 acetone, concentrated, and concentrated to obtain 540 g of black powder. I got This powder was dissolved in 30 水 of water and extracted twice with an equal volume of BuOH. By collecting and concentrating the organic phase
158. 5gの濃^粉末を得た。 この粉末を約 18gずつ 80¾ メ夕ノール一卜リフル ォロ酢酸水溶液 PH 3. 5 に溶解し、 同じ溶媒で 化したセフアデックス LH 20 クロマト （カラムサイズ： 8. 5 φ X 76 cm) で精製し、 実施例 1で示した分画を 集めることにより褐色の凍結 ^品 73g を得た。 この粉末を 約 25 gずつ & 4¾メタノール- 2% (v/v) トリチェチルァミン、)ン酸緩衝液 H3. 0 に溶解し、 同じ溶媒で fi化した大量分取用液クロカラム （カラム： 栗田エ^， 0DS 15 一 30 ，10 X30 cm, 流速： 200 m£ /min、 検出： UV 230 ηπ ) にチャージ し、 同じ溶媒で溶出した。 溶出液の酵阻害活性を測定すると、 約 17分付近、 及び約 25分付近に活性ピーク力認められたので、 対応する溶出液を集め、 それ ぞれを溶出順に Υ 成分、 X成分とした。 Υ成分、 X成分の溶出液を濃縮してメ タノール 除き、 得られた水溶液を 100 m£ のダイアイオン HP 20 にチヤ一 ジし、 よく水洗した後に 80% メタノールで溶出した。 溶出液を濃縮、 凍結 し、 Y成分より 3.8g， X成分より 3. 2 gの粗粉末を得た。 以下、 X成分、 Y成 分の順に精製法について述べる。  158.5g of concentrated powder was obtained. Approximately 18 g of this powder was dissolved in an 80% aqueous solution of trichloroacetic acid (pH 3.5) and purified with Sephadex LH20 chromatograph (column size: 8.5 x 76 cm). The fractions shown in Example 1 were collected to obtain 73 g of a brown frozen ^ product. Approximately 25 g of this powder was dissolved in & 4¾methanol-2% (v / v) trichetylamine,) acid buffer H3.0, and the solution was converted to fi column with the same solvent. : Kurita et ^, 0DS15-130, 10 X30 cm, flow rate: 200 m £ / min, detection: UV 230 ηπ) and eluted with the same solvent. When the enzyme inhibitory activity of the eluate was measured, activity peaks were observed at about 17 minutes and about 25 minutes. The corresponding eluates were collected, and the respective eluates were designated as the Υ component and the X component in the order of elution. The eluates of the Υ component and the X component were concentrated to remove methanol, and the obtained aqueous solution was washed with 100 ml of Diaion HP 20, washed well with water and eluted with 80% methanol. The eluate was concentrated and frozen to obtain a crude powder of 3.8 g from the Y component and 3.2 g from the X component. Hereinafter, the purification method will be described in the order of the X component and the Y component.
X成分 X component
X成分粗粉末 800 mgを 55¾メタノール- 2¾ (v/v) トリエチルァミンリン酸緩衝 液 PH3. 0 に溶解し、 同じ溶媒で ¥ ί化した分取用液クロカラム （カラム：  800 mg of X component crude powder was dissolved in 55¾ methanol-2¾ (v / v) triethylamine phosphate buffer PH3.0 and purified with the same solvent.
Senshupak ODS-5301N, 20 ø x300 ran、 流速 6 ml/min 、 検出：示差屈折計） に チャージし、 同じ溶媒で溶出した。 溶出液の,阻害活性を測定すると、 約 27 分付近、 及び約 30分付近の示 折計で認められるピークに,阻害活性力認 められたので、 対応する溶出液を集め、 それぞれを溶出順に F 成分、 D成分と した。 D成分、 F成分の溶出液を濃縮してメタノールを除き、 得られた水溶液を 100 m のダイアイオン HP 20 にチャージし、 よく水洗した後に 80% メタ ノールで溶出した。 溶出液を濃縮、 し、 D成分より 24 ragの白色粉末を 単一成分として得た。 この物質をマトリスタチン とした。一方、 F成分より 24mの粉末を得たがこれは HPLG上で単一ではなかったので、 さらに以下のよう に精製した。 この粉末を 27¾ ァセ卜二トリル -2¾(v/v)卜リチェチルァミンリン 酸緩衝液 PH3.0 に溶解し、 同じ溶媒で 匕した分取用液クロカラム （カラム： Senshupak ODS-53OlN, 2O 0x3OO ran、 流速 6 ml/min、 検出：示差屈折計） に チャージし、 同じ溶媒で溶出した。溶出液の瞧阻害活性を測定すると、 約 31 分付近の示^ S折計で認められるピークに酵阻害活性が認められたので、 対応 する溶出液を集め、 濃縮してァセ卜二卜リルを^した。 得られた水溶液中の活 性物質を SEPPAK(C-18， E V タイプ、 millipore corp. Ltd. ) に吸着し、 80¾メ タノールで溶出した。溶出液を濃縮、 ^^ を行い、 単一成分の マ卜リス夕 チン を白色の粉末として 12 mg 得た。 Senshupak ODS-5301N, 20 øx300 ran, flow rate 6 ml / min, detection: differential refractometer) and eluted with the same solvent. When the inhibitory activity of the eluate was measured, the inhibitory activity was detected at peaks observed at about 27 minutes and about 30 minutes. As a result, the corresponding eluates were collected, and were designated as F and D components in the order of elution. The eluates of the D and F components were concentrated to remove methanol, and the resulting aqueous solution was charged to 100 m Diaion HP 20, washed well with water, and eluted with 80% methanol. The eluate was concentrated, and 24 rag of white powder was obtained as a single component from the D component. This substance was designated as matristatin. On the other hand, a powder of 24 m was obtained from the F component, but it was not a single powder on HPLG, so it was further purified as follows. This powder was dissolved in 27% acetate nitrile -2% (v / v) trichetylamine phosphate buffer PH3.0, and the solution was mixed with the same solvent to prepare a preparative liquid chromatography column (column: Senshupak ODS-53OlN, 2O 0x3OO ran, flow rate 6 ml / min, detection: differential refractometer) and eluted with the same solvent. When the 瞧 inhibitory activity of the eluate was measured, the enzyme inhibitory activity was observed in the peak observed at about 31 minutes in the indicator, and the corresponding eluate was collected, concentrated, and concentrated. I did. The active substance in the obtained aqueous solution was adsorbed on SEPPAK (C-18, EV type, millipore corp. Ltd.) and eluted with 80¾ methanol. The eluate was concentrated and subjected to ^^ to obtain 12 mg of a single component, matricestin as a white powder.
Y成分 Y component
Y成分粗粉末 l を 20¾ァセ卜二トリル- 2¾ (v/v) 卜リチェチルァミンリン酸緩 衝液 PH3.0 に溶解し、 同じ溶媒で 化した分取用液クロカラム （カラム： Sens hupak ODS.-5301N, 20 φχ300 mm、 流速 6 ml/min、 検出：示差屈折計） にチヤ一 ジし、 同じ溶媒で溶出した。 溶出液の賺阻害活性を測定すると、 約 46分付近 の示^ S折計で認められるピークに^ S阻害活性が認められたので、 対応する溶 出液を集め、 濃縮してメタノールを除き、 得られた水溶液を 100 m£のダイアイ オン HP 20 にチャージし、 よく水洗した後に 80% メタノールで溶出した。 溶 出液を濃縮、 凍結乾燥し、 8 ragの粉末を得た。 この粉末を さらに 50% メタ ノール- 2¾ (v/v)卜リチェチルァミンリン酸緩衝液 pH3.0 に溶解し、 同じ溶媒で平 衡化した分取用液クロカラム （カラム： Senshupak ODS-5301N, 200x300 πη、 流 速 6 m£ /min. 検出：示 折計） にチャージし、 同じ溶媒で溶出した。 溶出液 の 阻害活性を測定すると、 約 30分付近の示 ^折計で認められるピークに 3 酵素阻害活性が認められたので、 対応する溶出液を集め、 濃縮してメタノールを 除去した。 得られた水溶液中の活性物質を SEPPAK (C-18， E V タイプ、 millipor e corp. Ltd. ) に吸着し、 80¾メタノールで溶出した。 溶出液を濃縮、 ^ ^ し、 6 mg マトリス夕チン を白色粉末として得た。 The Y component crude powder l was dissolved in 20-acetitol nitrile-2¾ (v / v) tritricylamine phosphate buffer PH3.0, and the same solvent was used to prepare a preparative liquid chromatography column (column: Sens hupak ODS.-5301N, 20 φχ300 mm, flow rate 6 ml / min, detection: differential refractometer) and eluted with the same solvent. When the eluate was measured for inhibitory activity, the ^ S inhibitory activity was observed in the peak observed at about 46 minutes in the ^ S diffractometer.The corresponding eluate was collected and concentrated to remove methanol. the resulting aqueous solution was charged to 100 m £ Daiai on HP 2 0 of eluted with 80% methanol after thorough rinsing with water. The eluate was concentrated and freeze-dried to obtain 8 rag of powder. This powder was further dissolved in 50% methanol-2% (v / v) trichetylamine phosphate buffer, pH 3.0, and equilibrated with the same solvent. A preparative liquid chromatography column (column: Senshupak ODS-5301N) , 200x300 πη, flow rate 6 m £ / min. Detection: diffractometer) and eluted with the same solvent. When the inhibitory activity of the eluate was measured, it was found that the peak observed at 3 Since enzyme inhibitory activity was observed, the corresponding eluate was collected and concentrated to remove methanol. The active substance in the obtained aqueous solution was adsorbed on SEPPAK (C-18, EV type, millipore corp. Ltd.) and eluted with 80 ° methanol. The eluate was concentrated and concentrated to obtain 6 mg of matricestin as a white powder.
(製剤例 1 ) 経口用カプセル剤  (Formulation Example 1) Oral capsule
処 方  Method
マトリスタチン 30 mg  Matristatin 30 mg
乳 糖 170 mg  Lactose 170 mg
トウモロコシ澱粉 148.8 mg  Corn starch 148.8 mg
ステアリン酸マグネシウム 1.2 mg  Magnesium stearate 1.2 mg
350 350
上記処方の粉末を混合し、 30メッシュのふるいを通した後、 この粉末 350 mgを ゼラチンカプセルに入れ、 カプセル剤とした。  The powder having the above formulation was mixed and passed through a 30-mesh sieve, and 350 mg of this powder was placed in a gelatin capsule to prepare a capsule.
以上から、 本発明のマトリスタチン類は顕著な IV コラゲナ一ゼ阻^用を示 し、 例えば、 癌転 制剤として有用である。  As described above, the matristatins of the present invention exhibit remarkable IV collagenase inhibitory activity, and are useful as, for example, cancer suppressants.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1 . —般式 ( で表わされる新規化^!マ卜リスタチン：  1. —New formula represented by general formula (^!
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(式中、 R1は水素原子又は水酸基、 R2は水素原子又はメチル基、 (Wherein, R 1 is a hydrogen atom or a hydroxyl group, R 2 is a hydrogen atom or a methyl group,
R3は、 R 3 is
式
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formula
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、 又は、
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, Or
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を有する基を示す。  A group having the formula:
但し、  However,
R1が水酸基、 R2がメチル基のときは、 When R 1 is a hydroxyl group and R 2 is a methyl group,
R3は、 式 （n) 、 (m) 、 (IV) 又は （V) であり、 R 3 is of the formula (n), (m), (IV) or (V);
R1が水素原子、 R2がメチル基のときは、 When R 1 is a hydrogen atom and R 2 is a methyl group,
R3は、 式 （Π) であり、 R 3 is the equation (Π),
R1が水酸基、 R2が水素原子のときは、 When R 1 is a hydroxyl group and R 2 is a hydrogen atom,
R3は、 式 (IV) である。 ） R 3 is the formula (IV). )
2. ァクチノマデュラ属に属するマ卜リス夕チン^菌。  2. Matris bacillus belonging to the genus Actinomadura.
3. 請求項 2記載のァクチノマデュラ属に属するマ卜リスタチン^菌が、 ァク チノマデュラ ·ァ卜ラメンタリア SANK 61488株 （»：研条寄第 3327号： BP - 3327 ) である菌。  3. A bacterium according to claim 2, wherein the matristatin ^ bacterium belonging to the genus Actinomadura is Actinomadura atramentaria SANK 61488 strain (»: Kenjo No. 3327: BP-3327).
4. ァクチノマデュラ属に属するマトリスタチン^菌を培養し、 その培養物よ りマ卜リスタチンを することを特徴とするマ卜リスタチンの 法。  4. A method for matristatin, which comprises cultivating a matrix bacterium belonging to the genus Actinomadura, and producing matristatin from the culture.
5. 請求項 4記載のァクチノマデュラ属に属するマトリスタチン^菌が、 ァク チノマデュラ ·アトラメンタリア SANK61488株 （ 江研条寄第 3327号： BP-3327 ) であるマトリスタチンの製造法。  5. A method for producing matristatin, wherein the matristatin ^ bacteria belonging to the genus Actinomadura according to claim 4 is Actinomadura attramentaria SANK61488 strain (Jken Kenjo No. 3327: BP-3327).
6. 請求項 1記載のマトリスタチンを ¾J成分とする、 血^ ί生抑制剤。  6. A blood growth inhibitor comprising the matristatin according to claim 1 as a ¾J component.
7. 請求項 1記載のマトリスタチンを ¾成分とする、 癌浸潤抑制剤。  7. A cancer invasion inhibitor comprising the matrix of claim 1 as a component.
8. 請求項 1記載のマ卜リス夕チンを雄成分とする、 癌転棚制剤。 8. A cancer transfer shelf inhibitor comprising the matricestin according to claim 1 as a male component.
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