JP3686693B2 - Novel physiologically active substances veractin A and B and method for producing the same - Google Patents

Description

〔式中、ＲはベラクチンＡでは水素原子であり、またＲはベラクチンＢでは次式

の基である〕で表わされる生理活性物質ベラクチンＡおよびベラクチンＢまたはその製薬学的に許容し得る塩を提供するものである。
【０００９】
ベラクチンＡおよびＢはその製薬学的に許容し得る塩の形態にあってもよく、このような塩としてはたとえば塩酸、硫酸、リン酸などの製薬学的に許容し得る無機酸、あるいは酢酸、メタンスルホン酸などの製薬学的に許容し得る有機酸との酸付加塩があげられる。
【００１０】
さらに第２の本発明は、サッカロポリスポラ属に属する上記一般式（Ｉ）のベラクチンＡおよびＢの生産菌を培養し、その培養物から酵素阻害物質ベラクチンＡおよび／またはベラクチンＢを採取することを特徴とするベラクチンＡおよび／またはベラクチンＢの製造法にある。
【００１１】
〔Ｉ〕ベラクチンＡの物理化学的性状を次に記載する。
（１）色および形状：薄黄色粉末
（２）分子式：Ｃ₁₇Ｈ₂₁ＣｌＮ₂ Ｏ₄
（３）マススペクトル：ＦＡＢ−ＭＳ(positive) ｍ／ｚ 353(Ｍ＋Ｈ）⁺
ＦＡＢ−ＭＳ(negative) ｍ／ｚ 351(Ｍ−Ｈ）^-
（４）比旋光度：〔α〕_D ²⁵＝−30.2°（ｃ 0.5，クロロホルム）
（５）融点：42.5〜44.5℃
（６）紫外部吸収スペクトル（メタノール）：ＵＶ λmax, nm（ε）
213(22,000), 256(9,300), 340(3,500)
（７）赤外部吸収スペクトル：添付図面の図１に示す。
【００１２】
（８） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを内部基準、重クロロホルム溶媒中）：
【表１】

【００１３】
〔上の表における化学シフト（δ_H ）にはそれぞれのシグナルの由来する ¹Ｈの数、結合パターン、および結合定数をHz単位で記載した〕。
【００１４】
（９）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを内部基準，重クロロホルム溶媒中）：
【表２】

【００１５】
（10）溶解性：酢酸エチル、クロロホルム、メタノールに可溶で、水に難溶である。
（11）薄層クロマトグラフにおけるＲｆ値：0.45
シリカゲル薄層クロマトグラフ（メルク社製，Art.5715）を用い、展開溶媒としてトルエン−酢酸エチル（２：１）を使用した。
【００１６】
〔II〕ベラクチンＢの物理化学的性状を次に記載する。
（１）色および形状：白色粉末
（２）分子式：Ｃ₂₃Ｈ₃₁ＣｌＮ₂ Ｏ₉
（３）マススペクトル：ＦＡＢ−ＭＳ(positive) ｍ／ｚ 515(Ｍ＋Ｈ）⁺
ＦＡＢ−ＭＳ(negative) ｍ／ｚ 513(Ｍ−Ｈ）^-
（４）比旋光度：〔α〕_D ²³＝−87.0°（ｃ 0.5，メタノール）
（５）融点： 150.0〜 153.0℃
（６）紫外部吸収スペクトル（メタノール）：ＵＶ λmax, nm（ε）
215(22,300), 257(13,300), 337(4,050)
（７）赤外部吸収スペクトル：添付図面の図２に示す。
【００１７】
（８） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを内部基準、重水含有重アセトニトリル溶媒中）：
【表３】

【００１８】
〔上の表における化学シフト（δ_H ）にはそれぞれのシグナルの由来する ¹Ｈの数、結合パターン、および結合定数をHz単位で記載した〕。
【００１９】
（９）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを内部基準，重アセトニトリル溶媒中）：
【表４】

【００２０】
（10）溶解性：酢酸エチル、アセトニトリル、メタノールに可溶で、水に難溶である。
（11）薄層クロマトグラフにおけるＲｆ値：0.42
シリカゲル薄層クロマトグラフ（メルク社製，Art.5715）を用い、展開溶媒としてクロロホルム−メタノール−精製水(100：20：１) を使用した。
【００２１】
ベラクチンＡおよびＢのカルボキシペプチダーゼ阻害活性は下記の方法で測定できる。
（ａ）カルボキシペプチダーゼＹの酵素阻害活性の検定は、カルボキシペプチダーゼＡ〔Journal of Antibiotics，37巻， 682〜 684頁，1984年〕の酵素阻害活性の測定法の変法で行った。すなわち、10mMのヒプリル−Ｌ−フェニルアラニン（ペプチド研究所製）0.01ml、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5) 0.05ml、検体としてベラクチンを含む水溶液 0.034mlを加えた混合液に、カルボキシペプチダーゼＹ（オリエンタル酵母工業社製） 0.05mg/mlと牛アルブミン１mg/ml を含む水溶液を 0.006ml加えて、37℃、45分間反応させた。１Ｎ苛性ソーダの 0.006mlを加えて反応を停止し、10分後に0.36Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2) の0.05mlを加え、次いで２％塩化シアヌルのメチルセロソルブ溶液0.15mlを加えて発色させ、室温に10分放置後 405nmにおける吸光度（ａ）を測定した。同時に検体を含まないで同様に測定した時の吸光度（ｂ）を測定した。なお、この時それぞれに対する盲検の吸光度（ａ′），（ｂ′）を測定した。酵素活性阻害率（％）を計算式〔１−（ａ−ａ′）／（ｂ−ｂ′）〕×100 により計算した。50％阻害率を示す検体の濃度をIC₅₀の値とした。
この定量法でベラクチンＡおよびベラクチンＢは、それぞれ0.18μg/mlおよび0.65μg/mlの濃度でカルボキシペプチダーゼＹを50％阻害した。
【００２２】
（ｂ）ラット尿管尿におけるブラジキニンの分解阻害活性の検定は、European Journal of Pharmacology， 232巻， 181〜 190頁（1993年）に記載の方法の改良法で行った。12〜14週齢の雄のＳＤラットの尿管から採取した尿管尿 0.01ml に検体としてのベラクチンを加えて20分間加温したのち、１μmole/ml のブラジキニン（ペプチド研究所製）を含む0.85％の塩化ナトリウム溶液0.03mlを加えて37℃で45分間反応させ、 0.1％のトリフルオロ酢酸と10％のアセトニトリルを含む水溶液 0.5mlを加えて反応を止めた。反応液をポアーサイズ0.45μm のメンブレン（日本ミリポア社製）に通した後、そのうち0.05mlを高速液体クロマトグラフィーのカラムに注入しブラジキニンの分解を測定した。
【００２３】
すなわち 1.2ml/minの流速でＡ液(0.1％のトリフルオロ酢酸を含む15％のアセトニトリル水溶液）を用いて平衡化したShodex Asahipak ODP-50−6Dカラム（昭和電工社製）に吸着させ、さらに３分間Ａ液で洗浄したのち、Ａ液からＢ液(0.1％のトリフルオロ酢酸、50％のアセトニトリル水溶液）への37分間の直線濃度勾配の条件下で溶出し、 210nmにおける吸光度を測定した。反応液中のブラジキニンとＣ末端のアルギニン残基が切断された des-Arg９−ブラジキニンの濃度は、クロマトグラフィーのピークの面積を測定し、基準物質（ともにペプチド研究所製）を用いた外部標準法によって定量できる。
【００２４】
上記の試験法にしたがって、37℃で20分間加温したラットの尿管尿に上記のとおりブラジキニンを含む水溶液を加え、37℃で45分間反応させ、その後に上記のとおりトリフルオロ酢酸とアセトニトリルを含む水溶液の添加により反応を停止させて得られた反応液を上記の条件の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のカラムに注入し、上記のとおり溶出して溶出液の 210nmにおける吸光度を測定した。この場合に測定された吸光度の変化と滞留時間（分）との関係を表わす曲線図を添付図面の図３（ａ）に示す。この場合、ブラジキニンは当初濃度0.75μmole/ml で存在したが、37℃で45分間の反応で分解されて0.32μmole/ml の濃度に減少したことが測定した吸光度曲線から認められた。また、ブラジキニンの分解により0.10μmole/ml の濃度の des-Arg９−ブラジキニンが生成されたことが認められた。
【００２５】
他方、ベラクチンＡを添加して加温したラットの尿管尿に、上記のとおりのブラジキニンを含む水溶液を加えて最終的に 100μg/mlの濃度のベラクチンＡを含む水溶液を、上記の条件で反応させた。そののちに上記と同様に反応停止させて得られた反応液を上記の条件でHPLCにかけ溶出し、そして溶出液の 210nmにおける吸光度を測定した。この後者の場合に測定された吸光度の変化と滞留時間（分）との関係を表わす曲線図を添付図面の図３（ｂ）に示す。
後者の場合に測定された吸光度曲線によると、ブラジキニンの分解で生じた des-Arg９−ブラジキニンの生成は0.01μmole/ml 以下に阻害され、ブラジキニンの残存量は0.42μmole/ml となりブラジキニンの分解が抑制されたことが認められた。
【００２６】
第２の本発明による方法で使用されるベラクチンＡおよびＢの生産菌の一例としては、本発明者らにより分離された放線菌サッカロポリスポラ属 MK19-42F6株がある。
【００２７】
MK19-42F6株の菌学的性状を次に記載する。
１．形態
気菌糸は、いびつなかぎ状〜ループ状を呈し、ビーズ状に分断する。気菌糸には円筒形〜長円形の胞子の連鎖を認め、その表面はとげ状である。胞子の大きさは約 0.5〜 0.6× 0.9〜 1.2ミクロンである。輪生枝および胞子のうは認められない。基生菌糸は断片化する。
【００２８】
２．各種培地における生育状態
色の記載について〔 〕内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル(Container Corporation of America のcolor harmony manual) を用いた。
【００２９】
（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（32℃培養）
うす黄［２ca, Lt Ivory］〜うすだいだい［３ca, Pearl Pink〜３ea, Lt Melon Yellow ］の発育上に、白の気菌糸をわずかにうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
（２）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、32℃培養）
うす黄［２ca, Lt Ivory〜３ca, Pearl Pink］の発育上に、白〜うすだいだい［５ba, Shell Pink〜４ca, Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、32℃培養）
無色〜うす黄色［３ba, Pearl ］の発育上に、白〜茶白［５cb〜３cb, Sand］の気菌糸を着生し、溶解性色素は暗い赤紫〜紫灰を呈する。
（４）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、32℃培養）
無色〜うす黄色［３ca, Pearl Pink］の発育上に、白〜灰白［ｃ，Lt Gray ］の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は暗い茶色味を帯びる。
（５）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、32℃培養）
無色の発育上に、白〜灰白［ｂ，Oyster White］の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は認められない。
【００３０】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン 1.0％、イースト・エキス 0.2％、ひも寒天 3.5％、 pH7.0）を用い、10℃、20℃、24℃、30℃、32℃、37℃および50℃の各温度で試験した結果、10℃、20℃、50℃を除き、そのいずれの温度でも生育したが、生育至適温度は37℃付近と思われる。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地；32℃培養）
培養後８日目頃より水解性が認められ、その作用は強い方である。
【００３１】
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培地７；いずれも32℃培養）
いずれの培地においても陰性である。
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９；32℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、ラムノース、ラフィノース、イノシトール、Ｄ−マンニトールを利用して発育し、シュクロース、Ｄ−フルクトースはおそらく利用する。Ｄ−キシロースはおそらく利用しない。
【００３２】
以上の性状を要約すると、 MK19-42F6株は、その形態上、気菌糸はいびつなかぎ状〜ループ状を呈し、ビーズ状に分断する。気菌糸には円筒形〜長円形の胞子の連鎖を認め、その表面はとげ状である。輪生枝及び胞子のうは認められない。基生菌糸は断片化する。種々の培地で、無色〜うす黄の発育上に白〜茶白の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色味を帯びるが、スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４）においては暗い赤紫〜紫灰を呈する。この菌株の生育至適温度は37℃付近で、放線菌としては高い方である。スターチの水解性は強く、メラニン様色素は生成しない。
【００３３】
ところで、 MK19-42F6株は、菌体成分として、細胞壁タイプはIV型（meso−ジアミノピメリン酸、アラビノース、ガラクトースを含有）、全菌体中の糖パターンはＡ型（アラビノース、ガラクトースを含有）である。全菌体を用いたグリコレートテストで、細胞壁のアシルタイプはアセチル型を示した。リン脂質は ＰIII 型（フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルメチルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトールを含有し、未知のグルコサミン含有リン脂質を含まない）である。ミコール酸は含有せず、主要なメナキノンは MK-９(H4)で、 MK-10(H4)も認められる。脂肪酸は、 anteiso−17：０、 iso−15：０、 iso−16：０、 iso−17：０を主成分とする。
【００３４】
以上の結果を総合すると、 MK19-42F6株は、サッカロポリスポラ(Saccharopolyspora) 属〔文献，Lacey, J. and M. Goodfellow, Journal of General Microbiology, 88巻，75−85頁，1975年〕に属すると考えられる。そこでサッカロポリスポラ属の既知菌種を検索した結果、近縁の種として、胞子の表面がとげ状を呈する２種、サッカロポリスポラ・エリスラ(Saccharopolyspora erythraea)〔文献１，Shirling, E.B. and D. Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology, 22 巻， 292− 293頁，1972年；文献２，Labeda, D.P.,International Journal of Systematic Bacteriology, 37巻，19−22頁，1987年〕及びサッカロポリスポラ・スピノサ(Saccharopolyspora spinosa)〔文献，Mertz,F.P. and R.C. Yao, International Journal of Systematic Bacteriology, 40 巻，34−39頁，1990年〕があげられた。これらの菌株を入手次第、実地に比較検討する予定であるが、現時点では MK19-42F6株をサッカロポリスポラ・エスピー (Saccharopolyspora sp.) MK19-42F6 とする。
【００３５】
なお、 MK19-42F6株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成６年７月５日、FERM P-14414として受託された。
【００３６】
MK19-42F6株は、他の放線菌に見られるようにその性状が変化し易い。例えば、 MK19-42F6株の、またはこの株に由来する突然変異体（自然発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、ベラクチンＡおよびベラクチンＢの少くとも一方を生産する菌は全て本発明に使用できる。
【００３７】
ベラクチンＡ及びＢ生産菌の培養は次のように実施できる。
【００３８】
本発明の方法では、前記の生産菌を通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。炭素源としては、グルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等を使用しうる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用しうる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、ベラクチンＡおよびＢの生産を促進するような有機および無機物を適当に添加することができる。
【００３９】
ベラクチン生産菌の培養法としては、好気的条件での培養法、特に深部培養法が最も適している。培養に適当な温度は15〜37℃であるが、多くの場合26〜30℃付近で培養する。ベラクチンＡおよびＢの生産は培地や培養条件により異なるが、振盪培養、タンク培養のいずれにおいても通常１〜10日間でその蓄積が最高に達する。培養中のベラクチンＡおよびＢの蓄積量が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製する。
【００４０】
ベラクチンＡおよびＢの精製は次のように実施できる。
本発明によって得られるベラクチンＡおよびＢの培養物からの採取にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段、例えば、溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル濾過法、透析法、沈澱法等を単独でまたは適宜組み合わせて抽出精製することができる。例えば、培養液中に蓄積されたベラクチンＡおよびＢは、酢酸エチル等の水不混和性の有機溶媒で抽出できる。菌体よりはメタノール、アセトン等の有機溶剤で抽出後、抽出液を減圧濃縮し、培養濾液と同様の方法でさらに溶媒抽出できる。ベラクチンＡおよびＢを更に精製するには、シリカゲルあるいはYMC-GEL ODS-A60-200/60（株式会社山村化学研究所製）等を用いる吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは向流分配法などを行うとよい。
【００４１】
以上のような方法により、あるいはこれらを適宜組み合わせることにより、高純度のベラクチンＡおよびＢが得られる。
【００４２】
ベラクチンＡおよびＢの急性毒性を調べるために、ベラクチンＡまたはＢをマウスに腹腔内投与して２週間観察した結果、100mg/kgの投与でも毒性を示さなかった。
【００４３】
第１の本発明によるベラクチンＡおよびＢまたはその塩は、そのセリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有することからセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤として利用できる。
【００４４】
したがって、第３の本発明によると、前記の一般式（ I ）で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤が提供される。
【００４５】
さらに、ベラクチンＡおよびＢはセリンカルボキシペプチダーゼに対して高い特異性で酵素阻害活性を有することにより抗高血圧剤または利尿剤として利用できる。
【００４６】
それゆえ、第４の本発明によると、前記の一般式（ I ）で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗高血圧剤が提供される。
【００４７】
また、第５の本発明によると、前記の一般式で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する利尿剤が提供される。
【００４８】
第１の本発明によるベラクチンＡおよびＢまたはその塩は、抗高血圧剤または利尿剤あるいはその他の医薬として使用する場合、製薬学的に許容できる通常の固体または液体状の担体と混和することにより医薬組成物として製剤できる。
【００４９】
したがって、本発明の抗高血圧剤と利尿剤は、ベラクチンＡおよびＢまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有し、かつこれと混和された製薬学的に許容できる固体または液体状の担体を含有する医薬組成物の形であることができる。
【００５０】
本発明によるベラクチンＡおよびＢまたはその塩は、医薬として用いる場合は、一般に経口的または非経口的に投与できる。
【００５１】
ベラクチンＡおよびＢまたはその製薬学的に許容できる塩は、賦形剤あるいは担体と混合して注射剤、経口剤または坐剤などの製剤の形で投与される。賦形剤および担体としては製薬学上許容されるものが選ばれ、その種類および組成は投与経路や投与方法によって決まる。たとえば、液状担体として水、アルコールもしくは大豆油、ゴマ油、ミネラル油などの動植物油、または合成油などが用いられる。固体担体としてはマルトース、シュクロースなどの糖類、リジンなどのアミノ酸類、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、シクロデキストリンなどの多糖類、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。
【００５２】
注射剤として製剤する場合には、液状担体は一般に生理食塩水、各種緩衝液、グルコース、イノシトール、マンニトールなどの糖類溶液、エチレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類であることができる。また、イノシトール、マンニトール、グルコース、マンノース、マルトース、シュクロースなどの糖類、フェニルアラニンなどのアミノ酸類などの賦形剤とともに凍結乾燥製剤とし、それを投与時に注射用の適当な溶剤、たとえば滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖液、電解質溶液、アミノ酸などの静脈投与用液体に溶解して使用できる。
【００５３】
製剤された組成物中におけるベラクチンＡおよびＢの含量は製剤型により種々異なるが、通常は 0.1〜 100重量％、好ましくは１〜90重量％である。たとえば注射液の場合には、通常 0.1〜５重量％の含量でベラクチンＡおよびＢを含むようにすることがよい。経口投与の場合には、前記固体担体もしくは液状担体とともに錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シロップ剤などの形態で用いられる。錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤の場合、一般にベラクチンＡおよびＢの含量は３〜 100重量％、好ましくは５〜90重量％であり、残部は担体である。
【００５４】
本発明によるベラクチンＡおよびＢまたはその塩の投与量は、患者の年齢、体重、症状、治療目的などにより決定される。しかし、その投与量は動物試験の結果など種々の状況を勘案して総投与量が一定量を超えない範囲で、連続的または間欠的に投与できる。一定の条件下における投与の適量と回数は専門医の決定による。
【００５５】
以下に本発明の実施例を示すが、ベラクチンＡおよびＢの性状が本発明によって明らかにされたので、それらの性状にもとずきベラクチンＡおよびＢの製造法を種々考案することができる。従って本発明は実施例に限定されるものではなく、実施例の修飾手段は勿論、本発明によって明らかにされたベラクチンＡおよびＢの性状にもとずいて公知の手段を施してベラクチンＡおよびＢを生産、濃縮、抽出、精製する方法をすべて包括する。
【００５６】
実施例１（ベラクチンＡの製造）
種培地として、グリセリン 2.0％、エスサンミート 1.5％、リン酸二カリウム 0.1％、塩化コバルト六水和物0.0005％の組成からなる培地を用いた。なお、滅菌前のpHは１Ｍのリン酸一カリウムを加えて 6.2に調整した。
【００５７】
前記の種培地(110ml) を分注した 500ml容三角フラスコを 120℃で20分間滅菌し、これに MK19-42F6株（FERM P-14414) の斜面寒天培養の１白金耳を接種し、毎分 180回転の回転式振盪器を用いて27℃で２日間振盪培養した。培養終了後、培養液を濾過し、濾液と菌体に分別した。
【００５８】
つぎに、得られた５Ｌの培養濾液に５Ｌの酢酸エチルを加え、よく攪拌して有効成分を抽出し、濃縮して褐色の粗物質を得た。菌体には２Ｌのメタノールを加え、よく攪拌して濃縮したのち、３Ｌの精製水と３Ｌの酢酸エチルを加え、よく攪拌して有効成分を抽出し、濃縮乾固して褐色の粗物質を得た。上記のように濾液と菌体から得られた褐色の粗物質、計 422.5mgを50mlのクロロホルム−メタノール(100：１) 混合溶媒で懸濁したのち、あらかじめ同混合溶媒で充填したシリカゲル60（メルク社製，Art.7734）、45mlのカラムにかけ、クロロホルム−メタノール(100：１) 混合溶媒 200mlで溶離し、活性画分を含む溶離液を減圧下に濃縮乾固し薄い褐色の粗物質39.9mgを得た。
【００５９】
この粗物質を20mlのトルエン−酢酸エチル（20：１）混合溶媒に溶解し、あらかじめ同混合溶媒で充填したシリカゲル60（メルク社製，Art.7734）、45mlのカラムにかけたのち、トルエン−酢酸エチル（20：１）、トルエン−酢酸エチル（10：１）各 200mlの混合溶媒で洗浄後、 200mlのトルエン−酢酸エチル（６：１）混合溶媒で溶離し、活性画分を減圧下に濃縮乾固した。
【００６０】
次に、これを酢酸エチル−メタノール（４：１）混合溶媒に溶解し、あらかじめ同混合溶媒で充填したセファデックスLH20（ファルマシア社製）、 350mlのカラムにかけ、 350mlの同混合溶媒で溶離した。得られた活性画分を減圧下に濃縮乾固したのち、少量のベンゼンに溶解して凍結乾燥を行うことにより純粋なベラクチンＡの黄薄色粉末19.4mgを単離した。
【００６１】
実施例２（ベラクチンＢの製造）
ベラクチンＡの場合と同様に MK19-42F6株（FERM P-14414) を培養した後、培養液を濾過し、濾液と菌体に分別した。さらに、得られた培養濾液５Ｌに酢酸エチル５Ｌを加え、よく攪拌して有効成分を抽出し、濃縮して褐色の粗物質を得た。菌体にはメタノール２Ｌを加え、よく攪拌して濃縮したのち、精製水３Ｌに懸濁した。次に酢酸エチル３Ｌを加え、よく攪拌して有効成分を抽出したのち、濃縮乾固して褐色の粗物質を得た。上記のように濾液と菌体から得られた褐色の粗物質、計 422.5mgをクロロホルム−メタノール(100：１) 50mlで懸濁後、あらかじめ同混合溶媒で充填したシリカゲル60（メルク社製，Art.7734）、45mlのカラムにかけ、クロロホルム−メタノール(100：１)200ml、クロロホルム−メタノール（50：１） 200ml、クロロホルム−メタノール（30：１） 200mlで順々に洗浄したのち、クロロホルム−メタノール（10：１） 200mlで溶離した。活性画分を含む溶離液は減圧下に濃縮乾固し褐色の粗物質95.8mgを得た。
【００６２】
この粗物質を25％のアセトニトリル水溶液に溶解し、あらかじめ毎分６mlの流速で同混合溶媒により平衡化したHPLC用カラム（Shiseido Capcellpak C18 SG120 φ20×250mm 、株式会社資生堂社製）に注入し、同混合溶媒で５分間洗浄したのち、 100分間で25％から50％のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配法により溶離した。
【００６３】
さらに、得られた活性画分を減圧下で濃縮し、L.L.N.モデルＮＭＦ（三鬼エンジニアリング社製）による遠心液液分配クロマトグラフを用いて精製を行った。すなわちクロロホルム−メタノール−水（５：６：４）の溶媒系の上層を固定相液とし下層を移動相液として20℃、遠心部の回転数を毎分 700回転、移動相液の流速を毎分５mlの条件で展開し、移動相液を 250ml送液したのち、固定相液を逆方向に送液して固定相中の移動度の低いものから順に溶離した。得られた活性画分を減圧下に濃縮し、少量のメタノールを含む精製水に溶解したのち凍結乾燥を行って、純粋なベラクチンＢの白色粉末15.7mgを単離した。
【００６４】
ベラクチンＡおよびＢの培養工程中の追跡は、カルボキシペプチダーゼＹに対する酵素阻害活性の測定で行ない、また精製工程中での追跡は、酵素阻害活性に加えて展開溶媒としてトルエン−酢酸エチル（２：１）あるいはクロロホルム−メタノール−水(100：20：１) によるシリカゲル薄層クロマトグラフ（メルク社製，Art.5715）を用いて行った。
【００６５】
実施例１で得たベラクチンＡと実施例２で得たベラクチンＢはそれぞれに前述した物理化学的性状を有する。
【００６６】
【発明の効果】
本発明のベラクチンＡおよびＢ物質は、セリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有しており、新しい薬理作用を有する薬剤としての有用性が期待される。尿中におけるブラジキニンの分解を抑制することから、利尿剤あるいは抗高血圧剤などとして有用性が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベラクチンＡの赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠法）である。
【図２】ベラクチンＢの赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠法）である。
【図３】（ａ）尿管尿にブラジキニンを添加して一定時間で反応させた後に反応を停止させて得られた反応液中のブラジキニンの残存量と生成した des-Arg９−ブラジギニンの量とを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定した場合における溶出液の吸光度(210nm) の変化と滞留時間（分）との関係を示す曲線図である。
（ｂ）尿管尿にブラジキニンとベラクチンＡ(100μg/ml) とを添加して反応させた後に反応を停止させて得られた反応液中のブラジキニンの残存量と生成した des-Arg９−ブラジキニンの量を同様にHPLCで測定した場合における溶出液の吸光度(210nm) の変化と滞留時間（分）との関係を示す曲線図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to veractin A and veractin B as novel physiologically active substances having serine carboxypeptidase inhibitory activity and a method for producing the same. Veractin A and B of the present invention are expected to be applied to fields such as pharmaceuticals, veterinary drugs and reagents.
[0002]
[Prior art]
Serine carboxypeptidase is a carboxypeptidase having a serine residue at the active center. Known serine carboxypeptidases include carboxypeptidase Y and platelet deamidase.
[0003]
Platelet deamidase degrades substance P and other tachykinins and bradykinins [The Journal of Biological Chemistry, 265, 11265-11272, 1990]. Substance P, which is degraded by platelet deamidase, has been reported to have a thrombolytic activation effect [Experimentia, 49, 242-244, 1993]. Therefore, compounds having serine carboxypeptidase inhibitory activity are expected to be applied to antithrombotic agents and activity regulators of these bioactive peptides.
[0004]
There is a carboxypeptidase Y-like enzyme that degrades bradykinin in rat urine, and this enzyme has been reported to be involved in the development of hypertension by degrading bradykinin in urine [European Journal of Pharmacology, 232, 181-190, 1993]. Therefore, since the compound having serine carboxypeptidase inhibitory activity enhances the physiological action of bradykinin in urine, it is expected to be applied to antihypertensive agents, diuretics and the like.
[0005]
Known substances having serine carboxypeptidase inhibitory activity include diisopropyl fluorophosphate (protein nucleic acid enzyme, 28, 1421-1143, 1983), chymostatin [The Journal of Biological Chemistry, 265, 11265-11272. Page, 1990] and poststatin [European Journal of Pharmacology, 232, 181-190, 1993].
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Diisopropyl fluorophosphate, chymostatin, poststatin and the like have low specificity for action on serine carboxypeptidase. Therefore, a highly specific inhibitor for serine carboxypeptidase is desired. An object of the present invention is to provide a novel physiologically active substance having such highly specific serine carboxypeptidase inhibitory activity, a method for producing the same, and a use thereof.
[0007]
[Means for solving problems]
The present inventors have continued to search for a substance having an enzyme inhibitory activity to meet the above-mentioned expectation. As a result, a substance having a serine carboxypeptidase inhibitory activity is produced in a culture of one strain belonging to the genus Saccharopolyspora. It was found that two active substances were isolated. They succeeded in determining the structures of these substances and recognized that these substances were novel substances, and named them Veractin A and Veractin B. Based on these findings, the present invention has been completed. An object of the present invention is to provide novel enzyme inhibitors veractin A and veractin B and a method for producing the same.
[0008]
The gist of the first aspect of the present invention is the following general formula (I)

[Wherein R is a hydrogen atom in veractin A, and R is the following formula in veractin B:

The present invention provides veractin A and veractin B or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0009]
Veractin A and B may be in the form of their pharmaceutically acceptable salts, such as pharmaceutically acceptable inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, or acetic acid, And acid addition salts with pharmaceutically acceptable organic acids such as methanesulfonic acid.
[0010]
Furthermore, the second aspect of the present invention cultivates veractin A and B producing bacteria of the above general formula (I) belonging to the genus Saccharopolyspora, and collects the enzyme inhibitory substances veractin A and / or veractin B from the culture. The present invention resides in a method for producing veractin A and / or veractin B.
[0011]
[I] The physicochemical properties of veractin A are described below.
(1) Color and shape: light yellow powder
(2) Molecular formula: C₁₇H_{twenty one}ClN₂O_Four
(3) Mass spectrum: FAB-MS (positive) m / z 353 (M + H)⁺
FAB-MS (negative) m / z 351 (M-H)^-
(4) Specific rotation: [α]_D ^{twenty five}= -30.2 ° (c 0.5, chloroform)
(5) Melting point: 42.5-44.5 ° C
(6) UV absorption spectrum (methanol): UV λmax, nm (ε)
213 (22,000), 256 (9,300), 340 (3,500)
(7) Infrared absorption spectrum: shown in FIG. 1 of the accompanying drawings.
[0012]
(8)¹H-NMR spectrum (TMS as internal reference, in deuterated chloroform solvent):
[Table 1]

[0013]
[Chemical shift in the above table (δ_H) Comes from each signal¹The number of H, binding pattern, and binding constant are listed in Hz].
[0014]
(9)¹³C-NMR spectrum (TMS as internal reference, in deuterated chloroform solvent):
[Table 2]

[0015]
(10) Solubility: Soluble in ethyl acetate, chloroform and methanol, but hardly soluble in water.
(11) Rf value in thin layer chromatograph: 0.45
A silica gel thin layer chromatograph (Merck, Art. 5715) was used, and toluene-ethyl acetate (2: 1) was used as a developing solvent.
[0016]
[II] The physicochemical properties of veractin B are described below.
(1) Color and shape: white powder
(2) Molecular formula: C_{twenty three}H₃₁ClN₂O₉
(3) Mass spectrum: FAB-MS (positive) m / z 515 (M + H)⁺
FAB-MS (negative) m / z 513 (M-H)^-
(4) Specific rotation: [α]_D ^{twenty three}= -87.0 ° (c 0.5, methanol)
(5) Melting point: 150.0-153.0 ° C
(6) UV absorption spectrum (methanol): UV λmax, nm (ε)
215 (22,300), 257 (13,300), 337 (4,050)
(7) Infrared absorption spectrum: shown in FIG. 2 of the accompanying drawings.
[0017]
(8)¹H-NMR spectrum (TMS as internal reference, in heavy water-containing heavy acetonitrile solvent):
[Table 3]

[0018]
[Chemical shift in the above table (δ_H) Comes from each signal¹The number of H, binding pattern, and binding constant are listed in Hz].
[0019]
(9)¹³C-NMR spectrum (TMS as internal reference, in deuterated acetonitrile solvent):
[Table 4]

[0020]
(10) Solubility: Soluble in ethyl acetate, acetonitrile and methanol, but hardly soluble in water.
(11) Rf value in thin layer chromatograph: 0.42
A silica gel thin layer chromatograph (Merck, Art. 5715) was used, and chloroform-methanol-purified water (100: 20: 1) was used as a developing solvent.
[0021]
The carboxypeptidase inhibitory activity of veractins A and B can be measured by the following method.
(A) The enzyme inhibitory activity of carboxypeptidase Y was assayed by a modified method of measuring the enzyme inhibitory activity of carboxypeptidase A [Journal of Antibiotics, 37, 682-684, 1984]. That is, carboxypeptidase was added to a mixture obtained by adding 0.01 ml of 10 mM hippuryl-L-phenylalanine (manufactured by Peptide Institute), 0.05 ml of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), and 0.034 ml of an aqueous solution containing veractin as a specimen. 0.006 ml of an aqueous solution containing Y (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.05 mg / ml and bovine albumin 1 mg / ml was added and reacted at 37 ° C. for 45 minutes. Stop the reaction by adding 0.006 ml of 1N sodium hydroxide, add 0.05 ml of 0.36M sodium phosphate buffer (pH 7.2) after 10 minutes, and then add 0.15 ml of 2% cyanuric chloride in methyl cellosolve to develop color. After 10 minutes at room temperature, the absorbance (a) at 405 nm was measured. At the same time, the absorbance (b) when measured in the same manner without containing the sample was measured. At this time, the absorbances (a ′) and (b ′) were measured blind for each. The enzyme activity inhibition rate (%) was calculated according to the formula [1- (aa ′) / (bb ′)] × 100. The concentration of the sample showing 50% inhibition is determined by IC₅₀The value of
In this assay, veractin A and veractin B inhibited carboxypeptidase Y by 50% at concentrations of 0.18 μg / ml and 0.65 μg / ml, respectively.
[0022]
(B) Bradykinin degradation inhibitory activity in rat urinary urine was assayed by an improved method described in the European Journal of Pharmacology, Vol. 232, 181-190 (1993). Veractin as a specimen was added to 0.01 ml of urinary urine collected from the ureters of 12-14 week old male SD rats, heated for 20 minutes, and then 0.85 containing 1 μmole / ml of bradykinin (Peptide Institute). 0.03 ml of% sodium chloride solution was added and reacted at 37 ° C. for 45 minutes, and 0.5 ml of an aqueous solution containing 0.1% trifluoroacetic acid and 10% acetonitrile was added to stop the reaction. The reaction solution was passed through a membrane having a pore size of 0.45 μm (manufactured by Nihon Millipore), and 0.05 ml was injected into a high performance liquid chromatography column to measure the degradation of bradykinin.
[0023]
That is, it was adsorbed on a Shodex Asahipak ODP-50-6D column (made by Showa Denko) equilibrated with A liquid (15% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% trifluoroacetic acid) at a flow rate of 1.2 ml / min. After washing with solution A for 3 minutes, elution was performed under conditions of a linear concentration gradient of 37 minutes from solution A to solution B (0.1% trifluoroacetic acid, 50% acetonitrile aqueous solution), and the absorbance at 210 nm was measured. The concentration of bradykinin and des-Arg9-bradykinin cleaved at the C-terminal arginine residue in the reaction solution was determined by measuring the area of the chromatographic peak and using an external standard method using a reference substance (both from Peptide Institute) Can be quantified.
[0024]
According to the above test method, an aqueous solution containing bradykinin as described above is added to the urinary urine of a rat that has been heated at 37 ° C. for 20 minutes, and reacted at 37 ° C. for 45 minutes. The reaction solution obtained by stopping the reaction by the addition of the aqueous solution was injected into a high performance liquid chromatography (HPLC) column under the above conditions, and eluted as described above, and the absorbance at 210 nm of the eluate was measured. A curve diagram showing the relationship between the change in absorbance measured in this case and the residence time (minutes) is shown in FIG. In this case, bradykinin was initially present at a concentration of 0.75 μmole / ml, but was determined from the absorbance curve measured to degrade to a concentration of 0.32 μmole / ml by reaction at 37 ° C. for 45 minutes. Further, it was confirmed that des-Arg9-bradykinin having a concentration of 0.10 μmole / ml was produced by the degradation of bradykinin.
[0025]
On the other hand, the aqueous solution containing bradykinin as described above is added to the urinary urine of a rat that has been warmed with addition of veractin A, and finally an aqueous solution containing veracin A at a concentration of 100 μg / ml is reacted under the above conditions. I let you. Thereafter, the reaction solution obtained by stopping the reaction in the same manner as described above was subjected to HPLC under the above conditions and eluted, and the absorbance at 210 nm of the eluate was measured. A curve diagram showing the relationship between the change in absorbance measured in the latter case and the residence time (minutes) is shown in FIG.
According to the absorbance curve measured in the latter case, the production of des-Arg9-bradykinin produced by the degradation of bradykinin is inhibited to 0.01 μmole / ml or less, and the residual amount of bradykinin is 0.42 μmole / ml, which suppresses the degradation of bradykinin. It was recognized that
[0026]
An example of a veracin A and B producing bacterium used in the second method of the present invention is the actinomycete Saccharopolispora MK19-42F6 strain isolated by the present inventors.
[0027]
 The mycological properties of the MK19-42F6 strain are described below.
1. Form
The aerial hyphae have a crunchy to loop-like shape and are divided into beads. The aerial hyphae have a cylindrical to oval spore chain, and the surface is spiny. The size of the spore is about 0.5-0.6 × 0.9-1.2 microns. No roticular branches or spores are observed. The basic mycelium is fragmented.
[0028]
2. Growth conditions in various media
Regarding the color description, the standard shown in [] is the color harmony manual of Container Corporation of America.
[0029]
(1) Sucrose / Nitrate agar medium (32 ℃ culture)
On the growth of light yellow [2ca, Lt Ivory] to light orange [3ca, Pearl Pink to 3ea, Lt Melon Yellow], white aerial mycelia are slightly grown slightly, and no soluble pigment is observed.
(2) Glycerin / asparagine agar medium (ISP-medium 5, 32 ° C. culture)
On the growth of light yellow [2ca, Lt Ivory-3ca, Pearl Pink], aerial mycelia of white to light blue [5ba, Shell Pink-4ca, Flesh Pink] are grown, and the soluble pigment has a faint brown taste. Tinged.
(3) Starch / inorganic salt agar medium (ISP-medium 4, 32 ° C. culture)
On the growth of colorless to light yellow [3ba, Pearl], aerial mycelia of white to brown [5cb to 3cb, Sand] are formed, and the soluble pigment exhibits dark reddish purple to purple ash.
(4) Yeast / malt agar medium (ISP-medium 2, 32 ° C. culture)
On the growth of colorless to light yellow [3ca, Pearl Pink], the aerial mycelia of white to gray [c, Lt Gray] are slightly formed, and the soluble pigment is dark.teaIt is tinged with color.
(5) Oatmeal agar medium (ISP-medium 3, 32 ° C. culture)
On the colorless development, white to gray white [b, Oyster White] aerial mycelia are slightly formed, and no soluble pigment is observed.
[0030]
3. Physiological properties
(1) Growth temperature range
Use yeast starch agar medium (soluble starch 1.0%, yeast extract 0.2%, string agar 3.5%, pH 7.0) at 10 ° C, 20 ° C, 24 ° C, 30 ° C, 32 ° C, 37 ° C and 50 ° C. As a result of testing at each temperature, it grew at any temperature except 10 ° C, 20 ° C and 50 ° C, but the optimum temperature for growth seems to be around 37 ° C.
(2) Starch hydrolysis (starch, inorganic salt agar medium; culture at 32 ° C)
Water decomposability is observed from about the 8th day after culturing, and its action is stronger.
[0031]
(3) Production of melanin-like pigment (tryptone yeast broth, ISP-medium 1; peptone yeast iron agar medium, ISP-medium 6; tyrosine agar medium, ISP-medium 7; all cultured at 32 ° C.)
It is negative in any medium.
(4) Availability of carbon source (Prideham-Godrieve agar medium, ISP-medium 9; 32 ° C. culture)
It grows using D-glucose, L-arabinose, rhamnose, raffinose, inositol, D-mannitol, and sucrose and D-fructose are probably used. D-xylose is probably not used.
[0032]
Summarizing the above properties, the strain MK19-42F6 has an aerial hyphae that is in the form of a hook-and-loop-like loop and is divided into beads. The aerial hyphae have a cylindrical to oval spore chain, and the surface is spiny. No roticular branches or spores are observed. The basic mycelium is fragmented. In various media, white-brown aerial hyphae grow on colorless to light yellow growth. The soluble pigment has a brown taste, but dark red-purple to purple ash is exhibited in the starch / inorganic salt agar medium (ISP-medium 4). The optimal temperature for growth of this strain is around 37 ° C., which is higher for actinomycetes. Starch is highly water-degradable and does not produce melanin-like pigments.
[0033]
By the way, as for the MK19-42F6 strain, the cell wall type is type IV (containing meso-diaminopimelic acid, arabinose and galactose), and the sugar pattern in all cells is type A (containing arabinose and galactose). . In the glycolate test using whole cells, the acyl type of the cell wall showed acetyl type. Phospholipids are of the PIII type (containing phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylmethylethanolamine, phosphatidylinositol and free of unknown glucosamine-containing phospholipids). It contains no mycolic acid, the main menaquinone is MK-9 (H4), and MK-10 (H4) is also observed. Fatty acids are mainly composed of anteiso-17: 0, iso-15: 0, iso-16: 0, iso-17: 0.
[0034]
Summing up the above results, the strain MK19-42F6 was found to belong to the genus Saccharopolyspora [Lacey, J. and M. Goodfellow, Journal of General Microbiology, 88, 75-85, 1975]. Considered to belong. Therefore, as a result of searching for known bacterial species of the genus Saccharopolyspora, two closely related species, Saccharopolyspora erythraea (Reference 1, Shirling, EB and Saccharopolyspora erythraea). D. Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology, 22, 292-293, 1972; Reference 2, Labeda, DP, International Journal of Systematic Bacteriology, 37, 19-22, 1987] and Saccharopolispora・ Saccharopolyspora spinosa [Mertz, FP and RC Yao, International Journal of Systematic Bacteriology, 40, 34-39, 1990]. theseofAs soon as the strain is obtained, it will be compared to the actual site, but at this time it is MK19-42F6 strain.TheSaccharopolyspora sp. MK19-42F6.
[0035]
An application was made to deposit MK19-42F6 strain at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and it was entrusted as FERM P-14414 on July 5, 1994.
[0036]
 The MK19-42F6 strain is likely to change its properties as seen in other actinomycetes. For example, a mutant (naturally occurring or inducible), a transzygote or a gene recombinant of or derived from MK19-42F6 strain produces at least one of veractin A and veractin B All fungi can be used in the present invention.
[0037]
The culture of veractin A and B producing bacteria can be carried out as follows.
[0038]
In the method of the present invention, the producing bacteria are cultured in a medium containing nutrients that can be used by ordinary microorganisms. As the carbon source, glucose, sucrose, starch syrup, dextrin, starch, glycerol, molasses, animal / vegetable oil, etc. can be used. As the nitrogen source, soy flour, wheat, wheat germ, corn steep liquor, cottonseed meal, meat extract, peptone, yeast extract, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea and the like can be used. In addition, it is effective to add inorganic salts capable of generating sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid and other ions as required. In addition, organic and inorganic substances that help the growth of bacteria and promote the production of veracins A and B can be appropriately added.
[0039]
As a method for cultivating veractin-producing bacteria, a culture method under aerobic conditions, particularly a deep culture method is most suitable. A suitable temperature for culturing is 15 to 37 ° C., but in many cases, culturing is performed at around 26 to 30 ° C. The production of veractin A and B varies depending on the medium and culture conditions, but the accumulation reaches the maximum in 1 to 10 days in both shaking culture and tank culture. When the accumulated amount of veractin A and B in the culture reaches the maximum, the culture is stopped, and the target substance is isolated and purified from the culture solution.
[0040]
Purification of veratin A and B can be carried out as follows.
In collecting from the cultures of veractin A and B obtained by the present invention, conventional separation means utilizing the properties, for example, solvent extraction method, ion exchange resin method, adsorption or distribution column chromatography method, gel filtration method, A dialysis method, a precipitation method, etc. can be extracted and purified alone or in appropriate combination. For example, veractin A and B accumulated in the culture solution can be extracted with a water-immiscible organic solvent such as ethyl acetate. After the cells are extracted with an organic solvent such as methanol or acetone, the extract can be concentrated under reduced pressure and further extracted with a solvent in the same manner as the culture filtrate. For further purification of veractin A and B, adsorption chromatography using silica gel or YMC-GEL ODS-A60-200 / 60 (manufactured by Yamamura Chemical Laboratory Co., Ltd.), gel filtration chromatography, high performance liquid chromatography or A flow distribution method is recommended.
[0041]
High purity veractin A and B can be obtained by the method as described above or by appropriately combining them.
[0042]
In order to examine the acute toxicity of veractin A and B, veractin A or B was intraperitoneally administered to mice and observed for 2 weeks. As a result, even when administered at 100 mg / kg, no toxicity was shown.
[0043]
Veractin A and B or a salt thereof according to the first present invention can be used as a serine carboxypeptidase inhibitor because it has serine carboxypeptidase inhibitory activity.
[0044]
  Therefore, according to the third invention,The general formula ( I )There is provided a serine carboxypeptidase inhibitor containing at least one of veractins A and B or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[0045]
Furthermore, veractin A and B can be used as antihypertensive agents or diuretics by having an enzyme inhibitory activity with high specificity for serine carboxypeptidase.
[0046]
  Therefore, according to the fourth invention,The general formula ( I )There is provided an antihypertensive agent containing at least one of veractin A and B or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[0047]
  According to the fifth aspect of the present invention,Represented by the above general formulaThere is provided a diuretic containing at least one of veractin A and B or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[0048]
Veractin A and B or a salt thereof according to the first present invention, when used as an antihypertensive agent or diuretic agent or other pharmaceutical agent, is mixed with a pharmaceutically acceptable ordinary solid or liquid carrier to produce a pharmaceutical agent. It can be formulated as a composition.
[0049]
Therefore, the antihypertensive agent and diuretic of the present invention contain veractin A and B or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and are in a pharmaceutically acceptable solid or liquid form mixed therewith. It can be in the form of a pharmaceutical composition containing any carrier.
[0050]
Veractin A and B or a salt thereof according to the present invention can generally be administered orally or parenterally when used as a medicament.
[0051]
Veractin A and B or a pharmaceutically acceptable salt thereof are administered in the form of a preparation such as an injection, an oral preparation or a suppository, mixed with an excipient or carrier. As the excipient and carrier, pharmaceutically acceptable ones are selected, and the type and composition thereof are determined by the administration route and the administration method. For example, water, alcohol or soybean oil, animal or vegetable oil such as sesame oil, mineral oil, or synthetic oil is used as the liquid carrier. As the solid carrier, sugars such as maltose and sucrose, amino acids such as lysine, cellulose derivatives such as hydroxypropylcellulose, polysaccharides such as cyclodextrin, organic acid salts such as magnesium stearate, and the like are used.
[0052]
When formulated as an injection, the liquid carrier can generally be physiological saline, various buffers, sugar solutions such as glucose, inositol, mannitol, and glycols such as ethylene glycol and polyethylene glycol. In addition, a lyophilized preparation is prepared together with excipients such as sugars such as inositol, mannitol, glucose, mannose, maltose, and sucrose, and amino acids such as phenylalanine. It can be used after being dissolved in a liquid for intravenous administration such as saline, glucose solution, electrolyte solution, amino acid and the like.
[0053]
The contents of veractin A and B in the formulated composition vary depending on the formulation type, but are usually 0.1 to 100% by weight, preferably 1 to 90% by weight. For example, in the case of an injection solution, veratin A and B are preferably contained in a content of usually 0.1 to 5% by weight. In the case of oral administration, it is used in the form of tablets, capsules, powders, granules, dry syrups, liquids, syrups and the like together with the solid carrier or liquid carrier. In the case of tablets, capsules, powders and granules, the contents of veractin A and B are generally 3 to 100% by weight, preferably 5 to 90% by weight, and the balance is the carrier.
[0054]
The dosage of veractin A and B or a salt thereof according to the present invention is determined by the patient's age, weight, symptoms, therapeutic purpose and the like. However, the dose can be administered continuously or intermittently within a range where the total dose does not exceed a certain amount in consideration of various situations such as the results of animal tests. The appropriate amount and frequency of administration under certain conditions is at the discretion of the specialist.
[0055]
Examples of the present invention will be described below. Since the properties of veractin A and B have been clarified by the present invention, various methods for producing veractin A and B can be devised based on these properties. Therefore, the present invention is not limited to the examples. Of course, not only the modification means of the examples but also the known methods based on the properties of veractins A and B revealed by the present invention are applied to veratin A and B. All methods for producing, concentrating, extracting and purifying
[0056]
Example 1(Production of veractin A)
As a seed medium, a medium having a composition of glycerin 2.0%, essan meat 1.5%, dipotassium phosphate 0.1%, cobalt chloride hexahydrate 0.0005% was used. The pH before sterilization was adjusted to 6.2 by adding 1M monopotassium phosphate.
[0057]
Sterilize a 500 ml Erlenmeyer flask containing the above seed medium (110 ml) at 120 ° C for 20 minutes, and inoculate one platinum loop of MK19-42F6 strain (FERM P-14414) slope agar culture every minute. The culture was shaken for 2 days at 27 ° C. using a rotary shaker of 180 rotations. After completion of the culture, the culture solution was filtered and separated into a filtrate and cells.
[0058]
Next, 5 L of ethyl acetate was added to the resulting 5 L culture filtrate, and the mixture was stirred well to extract the active ingredient and concentrated to obtain a brown crude substance. Add 2 L of methanol to the cells, stir and concentrate well, then add 3 L of purified water and 3 L of ethyl acetate, stir well to extract the active ingredients, concentrate to dryness and remove the brown crude material. Obtained. As described above, the crude brown material obtained from the filtrate and the cells, 422.5 mg in total, was suspended in 50 ml of chloroform-methanol (100: 1) mixed solvent, and then silica gel 60 (Merck (Art.7734), applied to a 45 ml column, eluted with 200 ml of chloroform-methanol (100: 1) mixed solvent, and the eluent containing the active fraction was concentrated to dryness under reduced pressure to give a pale brown crude substance 39.9 mg Got.
[0059]
This crude material is dissolved in 20 ml of a toluene-ethyl acetate (20: 1) mixed solvent, applied to a silica gel 60 (Merck, Art.7734), 45 ml column previously packed with the same mixed solvent, and then toluene-acetic acid. After washing with 200 ml each of ethyl (20: 1) and toluene-ethyl acetate (10: 1), elution with 200 ml of toluene-ethyl acetate (6: 1) and concentrating the active fraction under reduced pressure Dried to dryness.
[0060]
Next, this was dissolved in a mixed solvent of ethyl acetate-methanol (4: 1), applied to a Sephadex LH20 (Pharmacia), 350 ml column previously packed with the same mixed solvent, and eluted with 350 ml of the same mixed solvent. The obtained active fraction was concentrated to dryness under reduced pressure, then dissolved in a small amount of benzene and freeze-dried to isolate 19.4 mg of pure veracin A yellow pale powder.
[0061]
Example 2(Production of veractin B)
After culturing MK19-42F6 strain (FERM P-14414) in the same manner as in the case of veractin A, the culture solution was filtered and separated into a filtrate and cells. Further, 5 L of ethyl acetate was added to 5 L of the obtained culture filtrate, and the mixture was stirred well to extract the active ingredient and concentrated to obtain a brown crude substance. To the cells, 2 L of methanol was added, stirred and concentrated, and then suspended in 3 L of purified water. Next, 3 L of ethyl acetate was added, and the active ingredient was extracted by stirring well, and then concentrated to dryness to obtain a brown crude substance. Silica gel 60 (manufactured by Merck & Co., Art. Co., Ltd.) was suspended in 50 ml of chloroform-methanol (100: 1) after total suspension of brown crude material obtained from the filtrate and the cells as described above. .7734), applied to a 45 ml column, washed sequentially with 200 ml of chloroform-methanol (100: 1), 200 ml of chloroform-methanol (50: 1), 200 ml of chloroform-methanol (30: 1), and then chloroform-methanol ( 10: 1) Eluted with 200 ml. The eluent containing the active fraction was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 95.8 mg of brown crude material.
[0062]
This crude material was dissolved in 25% acetonitrile aqueous solution and injected into a HPLC column (Shiseido Capcellpak C18 SG120 φ20 × 250mm, manufactured by Shiseido Co., Ltd.) equilibrated with the same mixed solvent at a flow rate of 6 ml / min. After washing with a mixed solvent for 5 minutes, elution was performed by a linear concentration gradient method of 25% to 50% acetonitrile aqueous solution in 100 minutes.
[0063]
Furthermore, the obtained active fraction was concentrated under reduced pressure, and purified using a centrifugal liquid-liquid distribution chromatograph by L.L.N. Model NMF (manufactured by Miki Engineering Co., Ltd.). That is, the upper layer of the solvent system of chloroform-methanol-water (5: 6: 4) is the stationary phase liquid and the lower layer is the mobile phase liquid at 20 ° C., the rotation speed of the centrifugal section is 700 rotations per minute, and the mobile phase liquid flow rate is Development was performed under the condition of 5 ml per minute, and after 250 ml of the mobile phase solution was fed, the stationary phase solution was fed in the reverse direction to elute in order from the lowest mobility in the stationary phase. The obtained active fraction was concentrated under reduced pressure, dissolved in purified water containing a small amount of methanol, and then lyophilized to isolate 15.7 mg of pure veracin B white powder.
[0064]
Tracking during the cultivation process of veractin A and B was performed by measuring the enzyme inhibitory activity against carboxypeptidase Y, and tracking during the purification process was performed using toluene-ethyl acetate (2: 1 as a developing solvent) in addition to the enzyme inhibitory activity. ) Or a silica gel thin layer chromatograph (Merck, Art. 5715) using chloroform-methanol-water (100: 20: 1).
[0065]
Veractin A obtained in Example 1 and Veractin B obtained in Example 2 each have the physicochemical properties described above.
[0066]
【The invention's effect】
The veractin A and B substances of the present invention have serine carboxypeptidase inhibitory activity and are expected to be useful as drugs having new pharmacological actions. Since it suppresses the degradation of bradykinin in urine, it can be expected to be useful as a diuretic or antihypertensive agent.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an infrared absorption spectrum (potassium bromide tablet method) of veractin A.
FIG. 2 is an infrared absorption spectrum (potassium bromide tablet method) of veractin B.
[FIG. 3] (a) The amount of bradykinin remaining in the reaction solution obtained by adding bradykinin to the urinary urine and reacting for a certain period of time and then stopping the reaction, and the amount of des-Arg9-bradiginine produced. 5 is a curve diagram showing the relationship between the change in absorbance (210 nm) of the eluate and the residence time (min) when measured by high performance liquid chromatography (HPLC).
(B) Bradykinin and veractin A (100 μg / ml) were added to the urinary urine and reacted to stop the reaction, and the remaining amount of bradykinin in the reaction solution obtained and the des-Arg9-bradykinin produced FIG. 4 is a curve diagram showing the relationship between the change in absorbance (210 nm) of the eluate and the residence time (minutes) when the amount is similarly measured by HPLC.

Claims (5)

The following general formula (I)

[Wherein R is a hydrogen atom in veractin A, and R is the following formula in veractin B:

Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.   Bacterins that belong to the genus Saccharopolyspora and produce veractin A and B represented by the general formula (I) shown in claim 1 are cultured, and veractin A and / or veractin B is collected from the culture. A method for producing veractin A and / or B, which is a physiologically active substance. A serine carboxypeptidase inhibitor comprising as an active ingredient at least one of veractins A and B represented by the general formula ( I ) shown in claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. An antihypertensive agent comprising, as an active ingredient, at least one of veractin A and B represented by the general formula ( I ) shown in claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. A diuretic comprising at least one of veractin A and B represented by the general formula ( I ) shown in claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

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