JPH09221497A - メチルプロリン化合物、その製造方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 下記式〔Ｉ〕 【化１】 〔式中、Ａは−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −又は−ＣＨ＝ＣＨ−を
表す〕で表されるメチルプロリン化合物、スピロスファ
エラ属に属する化合物〔Ｉ〕の生産菌を培養することに
より化合物〔Ｉ〕を製造する方法、化合物〔Ｉ〕を有効
成分として含有するカルパイン阻害剤。 【効果】 化合物〔Ｉ〕はカルパイン阻害作用を有し、
急性腎不全、心筋梗塞、脳梗塞のような、カルパインが
関与する虚血性疾患を治療又は予防するための医薬とし
て有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なメチルプロリ
ン化合物に関する。詳細には、本発明はカルパイン阻害
活性を有する新規なメチルプロリン化合物、スピロスフ
ァエラ属に属する該メチルプロリン化合物の生産菌を培
養することにより該メチルプロリン化合物を製造する方
法、及び該メチルプロリン化合物を含有する医薬組成物
に関する。

【０００２】

【従来の技術】カルパイン（カルシウム依存性中性プロ
テアーゼ）はカルシウムイオンによって活性化される、
細胞質内可溶性画分に存在するプロテアーゼであり、基
質として細胞骨格蛋白や細胞内酵素を分解することが知
られている。カルパインは、カルシウムオーバーロード
に基づく虚血性の細胞障害（腎臓、脳、心臓などにおい
て）に関与する酵素として関心を集めている。

【０００３】カルパイン阻害剤の中でも細胞透過性が優
れているとされるカルペプチン（Calpeptin)を用いて急
性腎不全における細胞障害に対する作用をＭＤＣＫ細胞
で検討した結果、急性腎不全を反映する３種類のストレ
スによる細胞骨格の破壊に対しカルペプチンは明らかな
抑制作用を示した。またカルペプチンはＬＤＨ（乳酸デ
ヒドロゲナーゼ）の遊離も抑制した。これらの結果は、
カルパイン阻害剤が急性腎不全治療時に細胞保護作用を
有する腎不全治療剤として用いられる可能性を示すもの
である。

【０００４】また、摘出モルモット心臓で１５分間の虚
血と再潅流を行い、カルパイン阻害剤であるロイペプチ
ン（leupeptin)の効果を左心内圧の回復等を指標として
評価した結果、ロイペプチンの処置によって正常対照群
と同じレベルに回復すること、またカルシウムイオンの
細胞内流入による心収縮にも改善が見られることが報告
されている。

【０００５】さらに、カルパイン阻害剤であるＭＤＬ２
８１７０がラット脳虚血（両総頸動脈、片側中大脳動脈
結紮モデル）による神経細胞壊死に対し抑制効果を示す
こと、カルペプチンが自家血注入によるイヌ脳血管攣縮
に対し抑制効果を有することなどが報告されている。ア
ルツハイマー病におけるカルパインの関与は以前から推
測されていたが、最近アルツハイマー病患者の死後脳で
カルパインＩ（μ−カルパイン）の活性が上昇している
ことが報告された。

【０００６】このように、カルパイン阻害剤は腎臓、心
臓、脳などにおける虚血性の細胞障害に対して抑制作用
（細胞保護作用）を示すことが報告されている。従っ
て、急性腎不全、心筋梗塞、脳梗塞のような、腎臓、心
臓、脳などにおける虚血性疾患の治療にはカルパイン阻
害剤が有効な治療薬となり得ると期待される。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、カル
パイン阻害活性を有する新規化合物を提供することであ
る。また本発明の目的は、カルパイン阻害活性を有する
新規化合物の製造方法を提供することである。さらに本
発明の目的は、新規なカルパイン阻害剤を提供すること
である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物の
生産物の中から新規なカルパイン阻害剤のスクリーニン
グ研究を行った結果、スピロスファエラ属に属する菌の
培養物からカルパイン阻害活性を有する新規なメチルプ
ロリン化合物を単離した。

【０００９】本発明は、下記式〔Ｉ〕

【００１０】

【化２】

【００１１】〔式中、Ａは−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −又は−Ｃ
Ｈ＝ＣＨ−を表す〕で表されるメチルプロリン化合物又
はその塩を提供する。また本発明は、スピロスファエラ
属に属する式〔Ｉ〕で表されるメチルプロリン化合物の
生産菌を培養し、培養物から該メチルプロリン化合物を
採取することを特徴とする式〔Ｉ〕で表されるメチルプ
ロリン化合物の製造方法を提供する。さらに本発明は、
有効成分として式〔Ｉ〕で表されるメチルプロリン化合
物又はその塩を含有し、カルパイン阻害剤として有用な
医薬組成物を提供する。

【００１２】本発明の式〔Ｉ〕で表されるメチルプロリ
ン化合物としては、具体的には次の物理化学的性質を有
するＷＦ１０２２５Ａ及びＷＦ１０２２５Ｂが示され
る。 (1) ＷＦ１０２２５Ａ a)形状：白色粉末 b)分子式：Ｃ₄₀Ｈ₆₈Ｎ₆ Ｏ₈ d)融点：166-169 ℃ e)分子量： 760 [ESI-MS: m/z 761 (M+H)] f)紫外線吸収スペクトル：（図１に示す） λ_max ^MeOH 210nm g)赤外線吸収スペクトル：（図２に示す） ν_max ^KBr 3290, 2960, 2930, 2860, 1640, 1550, 143
0, 1240, 1080, 700 cm ^-1 h)溶解性： 易溶：メタノール、ジメチルスルホキシド 不溶：水 i)呈色反応： 陽性：硫酸セリウム反応、ヨウ素蒸気との反応 陰性：ニンヒドリン反応、塩化第二鉄反応、モーリッシ
ュ反応 j) ¹H-核磁気共鳴スペクトル（500MHz, DMSO-d₆ ) （図
３に示す） k)¹³C-核磁気共鳴スペクトル（125MHz, DMSO-d₆ ) （図
４に示す） m)薄層クロマトグラフィー 固定相：シリカゲル 60 F ₂₅₄ （メルク社製） 展開溶媒：ジクロロメタン：メタノール (10:1) Rf = 0.25

【００１３】(2) ＷＦ１０２２５Ｂ a)形状：白色粉末 b)分子式：Ｃ₄₀Ｈ₇₀Ｎ₆ Ｏ₈ d)融点：164-167 ℃ e)分子量： 762 [ESI-MS: m/z 763 (M+H)] f)紫外線吸収スペクトル：（図５に示す） λ_max ^MeOH 210nm g)赤外線吸収スペクトル：（図６に示す） ν_max ^KBr 3290, 2960, 2930, 2850, 1640, 1540, 146
0, 1240, 1070, 690 cm ^-1 h)溶解性： 易溶：メタノール、ジメチルスルホキシド 不溶：水 i)呈色反応： 陽性：硫酸セリウム反応、ヨウ素蒸気との反応 陰性：ニンヒドリン反応、塩化第二鉄反応、モーリッシ
ュ反応 j) ¹H-核磁気共鳴スペクトル（500MHz, CD₃ OD) （図７
に示す） k)¹³C-核磁気共鳴スペクトル（125MHz, CD₃ OD) （図８
に示す） m)薄層クロマトグラフィー 固定相：シリカゲル 60 F ₂₅₄ （メルク社製） 展開溶媒：ジクロロメタン：メタノール (10:1) Rf = 0.25

【００１４】図１及び図５において、実線はｐＨ無修
正、点線は酸性（サンプル１．５mlに１Ｎ塩酸１５μｌ
を添加）、一点鎖線はアルカリ性（サンプル１．５mlに
１ＮＮａＯＨ１５μｌを添加）で測定した紫外線吸収ス
ペクトルをそれぞれ示す（サンプル １００μｇ／ml、
溶媒 メタノール）。

【００１５】ＷＦ１０２２５Ａ及びＷＦ１０２２５Ｂの
構造式を以下に示す。

【００１６】

【化３】

【００１７】

【化４】

【００１８】式〔Ｉ〕で表されるメチルプロリン化合物
（以下、メチルプロリン化合物〔Ｉ〕という）は、スピ
ロスファエラ・フロリフォルミス（Spirosphaera flori
formis) Ｎｏ．１０２２５のようなスピロスファエラ属
に属するメチルプロリン化合物〔Ｉ〕の生産菌を培養
し、培養物からメチルプロリン化合物〔Ｉ〕を採取する
ことにより製造することができる。スピロスファエラ属
に属するメチルプロリン化合物〔Ｉ〕の生産菌の中で、
スピロスファエラ・フロリフォルミスＮｏ．１０２２５
は、本発明者らによって岩手県八幡平で採取した落枝か
ら分離された真菌である。

【００１９】本明細書中に記載した特定の微生物を利用
する方法は単に説明の目的で挙げたものであり、メチル
プロリン化合物〔Ｉ〕の製造はこれに限定されるもので
はない。本発明には、メチルプロリン化合物〔Ｉ〕の生
産能を有するいかなる変異体（自然突然変異体ならびに
本明細書に記載の微生物からＸ線、紫外線照射、Ｎ−メ
チル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理、２
−アミノプリン処理等の通常の手法により得られる人工
変異体を含む）を利用する方法も包含される。

【００２０】生産菌１０２２５株は、次の形態的、培養
的及び生理学的特徴を有する。生産菌１０２２５株は各
種培地上で抑制的に拡がり、オリーブ色から灰色のコロ
ニーを形成する。生産菌１０２２５株は、培地上で分生
子を形成した。分生子は分枝したらせん状の菌糸が絡み
合い、ほぼ球形となる。これらの特徴から、本菌株は不
完全糸状菌類スピロスファエラ属菌Spirosphaera van B
everwijk 1953(van Beverwijk, A.L., Helicosporous H
yphomycetes. I, Transactions of theBritish Mycolog
ical Society, 36, pp.111-124, 1953)に該当する。以
下に本菌株の菌学的性質を示す。各種培地上での培養的
性質を表１に示した。

【００２１】

【表１】

【００２２】＊：麦芽抽出寒天、ツァペック氏液寒天、
ＭＹ２０寒天の組成は、ＪＣＭカタログ（Nakase, T.,
5th ed., p.503, Japan Collection of Microorganisms
and Life Science Research Information Section of
the Institute of Physical and Chemical Research, S
aitama, 1992) に従った。これらのデータは接種後２５
℃で１４日間培養後に観察した。色調の記載はMethuen
Handbook of Colour (Kornerup, A. and J.H. Wansche
r, Methuen Handbook of Colour, 3rd ed., p.525, Met
huen, London, 1978)をもとに行った。

【００２３】形態的特徴の観察は分生子形成培地上での
培養（１５℃、６週間）をもとに行った。分生子形成培
地の組成は以下の通りである。グリセリン１．０ｇ、Ｎ
ａＮＯ₃ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．２ｇ、酵母エキス
０．１ｇ、寒天１５ｇ、水道水１リットル、滅菌前にｐ
Ｈ５．５に調整。分生子柄は菌糸との区別が不明瞭で、
無色・滑面で隔壁を有し、その先端に分生子を形成す
る。分生子柄の末端はらせん状のほぼ一巻きを形成する
ように湾曲する。分生子柄は最初の一巻きのわずかに下
部からいくつか分枝し、その分枝も最初の一巻きと同様
に様々な方向に湾曲する。各分枝で複数の隔壁が形成さ
れる。分枝と湾曲を繰り返して、ほぼ球形の分生子が形
成される。分生子は直径２５〜１２０μｍで、らせん状
分枝は幅３．０〜５．５μｍであった。

【００２４】１０２２５株は４〜２８℃で生育可能で、
生育最適温度は２２〜２５℃である。これらのデータは
ポテトデキストロース寒天（ニッスイ社製）上で決定し
た。

【００２５】スピロスファエラ属菌の分類学的基準（Ab
dullah, S.K., Y. Horie and S. Udagawa, New or inte
rsting aero-aquatic conidial fungi from Japan, Nov
a Hedwigia, 43(3-4), pp.507-513, 1986)に従えば、１
０２２５株の菌学的性質はスピロスファエラ・フロリフ
ォルミス（Spirosphaera floriformis van Beverwijk19
53)と一致し、van Beverwijk (van Beverwijk, A.L., H
elicosporous Hyphomycetes. I, Transactions of Brit
ish Mycological Society, 36, pp.111-124,1953) の記
載とも一致する。よって、本菌をスピロスファエラ・フ
ロリフォルミスと同定した。本菌株スピロスファエラ・
フロリフォルミスＮｏ．１０２２５は、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５茨城県
つくば市東一丁目１番３号）に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１５３７８（受託日平成７年１２月２７日）として寄託
されている。

【００２６】メチルプロリン化合物〔Ｉ〕は通常、メチ
ルプロリン化合物〔Ｉ〕の生産菌を同化可能な炭素源及
び窒素源を含有する栄養培地で、好ましくは好気性条件
下（例えば振盪培養、液内培養等）にて培養することに
より製造することができる。

【００２７】栄養培地中の好適な炭素源はグルコース、
フルクトース、グリセリン及びデンプン等の炭水化物で
ある。他の含有してもよい炭素源としては乳糖、アラビ
ノース、キシロース、デキストリン、糖みつ等が挙げら
れる。

【００２８】好適な窒素源は酵母エキス、ペプトン、グ
ルテンミール、綿実粉、大豆粉、コーンスティープリカ
ー、乾燥酵母等、及びアンモニウム塩（例えば硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等）、尿素、アミノ酸等のような無機及び有機窒素化合
物である。

【００２９】炭素源及び窒素源は組合わせて使用するこ
とが有利であるが、純品を使用する必要はない。なぜな
ら、純度の低い原料でも微量の発育因子及び相当量の無
機栄養素を含有するものであれば好適に使用することが
できる。必要に応じて、炭酸カルシウム、リン酸ナトリ
ウム、リン酸カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、塩化コバルト等の無機塩を培地
に添加してもよい。必要ならば、特に培養液がかなり発
泡する場合は、流動パラフィン、高級アルコール、植物
油、鉱油、又はシリコーンのような消泡剤を添加しても
よい。

【００３０】大量に製造する場合、メチルプロリン化合
物〔Ｉ〕の製造には好気性液内培養が好ましい。少量を
製造する場合はフラスコ又はボトル内で振盪培養又は表
面培養を行なう。さらに大型タンクで培養する場合は、
メチルプロリン化合物〔Ｉ〕の製造過程における増殖遅
延を防止するために、増殖型の微生物を製造タンク内へ
接種することが好ましい。従って、まず比較的少量の培
地を微生物の胞子又は菌糸と共に接種し、接種した培地
を培養することによって微生物の増殖型接種原を製造
し、培養した増殖型接種原を無菌的に大型タンクに移
す。増殖型接種原を製造する培地としては、メチルプロ
リン化合物〔Ｉ〕の本培養で利用する培地と実質的に同
じか或いは若干異なる培地を使用することができる。

【００３１】培養混合物の攪拌及び通気は種々の方法で
行うことができる。攪拌はプロペラ又は同様の機械的攪
拌装置により、醗酵槽を回転又は振盪することにより、
種々のポンプ装置により、あるいは無菌空気を培養液中
に通すことにより行うことができる。通気は無菌空気を
醗酵混合物中に通すことにより行うことができる。

【００３２】培養は通常約２０℃〜約４０℃、好ましく
は２５℃付近で、５０時間〜１００時間行う。これは培
養条件及び培養規模により変更することができる。

【００３３】メチルプロリン化合物〔Ｉ〕は、抗生物質
のような他の醗酵生成物を採取するために通常用いられ
る公知の手段により培養物から採取される。

【００３４】一般に生産されたメチルプロリン化合物
〔Ｉ〕の大部分は培養菌体中に存在するので、メチルプ
ロリン化合物〔Ｉ〕は、培養物を濾過又は遠心分離して
得られる菌体の抽出物から、慣用の溶媒を用いる抽出、
減圧濃縮、凍結乾燥、ｐＨ調整、慣用の樹脂（例、陰イ
オン又は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂）によ
る処理、慣用の吸着剤（例、活性炭、ケイ酸、シリカゲ
ル、セルロース、アルミナ）による処理、結晶化、再結
晶等の慣用の方法により単離される。

【００３５】メチルプロリン化合物〔Ｉ〕は常法により
医薬上許容される塩に変換することができる。医薬上許
容される塩は、慣用の無毒性の酸付加塩であり、有機酸
付加塩（例えば、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸
塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、メタンスル
ホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸
塩など）、無機酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸
塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、アミノ
酸との塩（例えば、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩
など）などが挙げられる。

【００３６】以下の試験によりメチルプロリン化合物
〔Ｉ〕の生物学的性質を詳細に説明する。 試験例１ ブタＩ型カルパイン（μカルパイン）に対す
る阻害活性 カルパイン活性はカゼインの分解反応を指標とした。酵
素反応は０．４ｍｇ／ｍｌカゼイン、１０ｍＭジチオス
レイトール、４ｍＭ塩化カルシウム２水和物、及び予め
目的濃度に希釈した被験物質を含む１０ｍＭＴｒｉｓ緩
衝液（ｐＨ７．４）に、０．１２５μｇのブタ赤血球由
来μカルパイン（ナカライテスク社製）を添加すること
によって開始した。最終液量は１００μｌとした。室温
で１５分間反応後、酵素反応液のうち２０μｌを、蒸留
水で４．５倍に希釈したプロテインアッセイ試液（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社製）１８０μｌに添加して反応を停止し
た。充分混合した後、未反応のカゼインに由来する６０
０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果より被験物質
のμカルパインに対する阻害活性を求めた。５０％阻害
濃度（ＩＣ₅₀）を表２に示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】試験例２ ヒトカテプシンＢに対する阻害
活性 カルパインに対する特異性を判定するために、同じくチ
オールプロテアーゼであるカテプシンＢに対する阻害活
性を測定した。基質として蛍光ラベルした合成ペプチド
を使用した。１０μＭ合成基質（Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
ＭＣＡ）、５ｍＭジチオスレイトール、及び予め目的濃
度に希釈した被験物質を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．５）にヒト肝臓由来カテプシンＢ（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）０．０２５μｇを添加するこ
とによって酵素反応を開始した。最終液量は１００μｌ
とした。３７℃、３０分反応させた後、遊離したＡＭＣ
（７−アミノ−４−メチルクマリン）に由来する蛍光強
度（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）の増加
を測定し、その結果より検体のカテプシンＢに対する阻
害活性を求めた。５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を表３に示
す。本発明のメチルプロリン化合物はヒトカテプシンＢ
に対する阻害活性が低く、カルパインに対して特異的な
阻害活性を有する。

【００３９】

【表３】

【００４０】本発明のメチルプロリン化合物〔Ｉ〕は、
カルパイン阻害活性を有し、急性腎不全、心筋梗塞、脳
梗塞のような、カルパインが関与する虚血性疾患（特
に、腎臓、心臓、脳などにおける虚血性疾患）を治療又
は予防するための哺乳動物用の医薬組成物として使用さ
れ得る。

【００４１】本発明のメチルプロリン化合物〔Ｉ〕は、
医薬上許容される担体と混合してカプセル剤、錠剤、顆
粒剤、散剤、バッカル剤、舌下剤、注射剤及び液剤のよ
うな医薬組成物の形態でヒトを含む哺乳動物（例えば、
ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ブ
タなど）に経口又は非経口的（皮下、静脈内、筋肉内及
び直腸投与を含む）に投与することができる。

【００４２】医薬上許容される担体としては、医薬用途
に使用される慣用の有機又は無機担体原料、例えば賦形
剤（例えばショ糖、デンプン、マンニトール、ソルビト
ール、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、
リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等）、結合剤（例え
ばセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル
セルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラ
ビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン
等）、崩壊剤（例えばデンプン、カルボキシメチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロースのカルシウム塩、
ヒドロキシプロピルデンプン、グリコール−デンプン
ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、
クエン酸カルシウム等）、滑沢剤（例えばステアリン酸
マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナト
リウム等）、矯味剤（例えばクエン酸、メントール、グ
リシン、オレンジ末等）、保存剤（例えば安息香酸ナト
リウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロ
ピルパラベン等）、安定化剤（例えばクエン酸、クエン
酸ナトリウム、酢酸等）、懸濁化剤（例えばメチルセル
ロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニ
ウム等）、分散剤（例えば界面活性剤等）、水性希釈剤
（例えば水）、油類（例えばゴマ油等）、及び基剤ワッ
クス（例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、白色
ワセリン等）が例示される。

【００４３】メチルプロリン化合物〔Ｉ〕の投与量は、
疾患の種類、患者の体重及び／又は年齢、投与経路など
の種々の要素により変更し得る。メチルプロリン化合物
〔Ｉ〕の好ましい投与量は、非経口投与（皮下、静脈
内、筋肉内、直腸投与など）の場合０．０１〜１０ｍｇ
／ｋｇ／日、経口投与の場合０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ
／日の範囲から適宜選択される。

【００４４】

【実施例】以下に本発明を説明するために実施例を挙げ
る。 実施例１ (1) 培養 グリセロール（２％）、スクロース（２％）、綿実粉
（２％）、乾燥酵母（１％）、ペプトン（１％）、リン
酸二水素カリウム（０．１％）、及びポリソルベート８
０（０．１％）を含む前培養培地（１６０ｍｌ）を、そ
れぞれ３本の５００ｍｌ容エルレンマイヤーフラスコに
入れ、１２０℃で３０分間滅菌した。ＹｐＳｓ寒天上で
２５℃、２週間培養した生産株（スピロスファエラ・フ
ロリフォルミスＮｏ．１０２２５）を各培地に接種し、
ロータリシェーカー（２２０ｒｐｍ、振幅５．１ｃｍ）
上で２５℃、８日間振盪培養を行い、種培養液とした。

【００４５】変性澱粉 日食＃３６００（３％）、チキ
ンミートボーンミール（２％）、小麦胚芽（１％）、リ
ン酸水素二カリウム（２％）、及びリン酸水素二ナトリ
ウム１２水和物（１．５％）を含む本培養培地を３０Ｌ
容ジャーファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間滅
菌した。上記の種培養液全量を本培養培地（２０Ｌ）に
接種し、培養は２５℃で５日間、通気量は２０リットル
毎分、攪拌は２００ｒｐｍで行った。ＷＦ１０２２５Ａ
及びＷＦ１０２２５Ｂの生産量は逆相カラム（ＹＭＣ−
ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ３０３，５μｍ，２５０×４．
６ｍｍ ｉ．ｄ．，ワイエムシィ社）を用いた高速液体
クロマトグラフィーで測定した。移動相は９０％メタノ
ール水、流速は１．０ｍｌ／分、検出波長は２１０ｎｍ
で行った。

【００４６】(2) ＷＦ１０２２５Ａ及びＷＦ１０２２５
Ｂの単離精製 培養液（３０Ｌ）に濾過補助剤（ラジオライト）を加
え、フィルタープレスにて濾過を行った。得られた菌体
に４０Ｌのアセトンを添加し、２時間室温で攪拌し濾過
した。この菌体抽出液に８０Ｌのイオン交換水を添加
し、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社、３
Ｌ）に通液した。水、５０％メタノール水、７０％メタ
ノール水で洗浄し、メタノールで溶出した。溶出液（１
０Ｌ）は水で２倍に希釈した後、ＹＭＣ−ゲル（ＯＤＳ
−ＡＭ，１２０−Ｓ５０，ワイエムシィ社，２Ｌ）に通
液した。カラムを７０％メタノール水で洗浄した後、９
０％メタノール水で溶出した。その結果、主としてＷＦ
１０２２５Ａを含む画分とＷＦ１０２２５Ｂを含む画分
がそれぞれ得られた。

【００４７】まず、ＷＦ１０２２５Ａを含む活性画分
（１２９０ｍｌ）をメタノール濃度が７０％になるよう
に希釈してＹＭＣ−ゲル（２Ｌ）に通液し、９０％メタ
ノール水で展開した。活性画分（５００ｍｌ）を濃縮乾
固し、シリカゲル（ＹＭＣ−ゲル ＳＩＬ−６０−２３
０／７０，ワイエムシィ社，５００ｍｌ）に吸着させ、
ジクロロメタン及びジクロロメタン−メタノール混合液
で溶出した。ジクロロメタン−メタノール（１０：１）
によって溶出された活性画分（１０００ｍｌ）を減圧下
で濃縮し、残渣をジエチルエーテルに懸濁し、濃縮乾固
して４７２．４ｍｇの淡黄色粉末を得た。このうち、２
００ｍｇをシリカゲル（２００ｍｌ）に吸着させ、ジク
ロロメタン−メタノール（１０：１）で溶出した。活性
画分を上記と同様の処理方法で処理し、ＷＦ１０２２５
Ａの白色粉末１６５．６ｍｇを得た。

【００４８】次に、ＷＦ１０２２５Ｂを含む活性画分
（１０００ｍｌ）をメタノール濃度が７０％になるよう
に希釈してＹＭＣ−ゲル（２Ｌ）に通液し、９０％メタ
ノール水で溶出した。活性画分（５００ｍｌ）を濃縮乾
固し、シリカゲル（ＹＭＣ−ゲル ＳＩＬ−６０−２３
０／７０，ワイエムシィ社，５００ｍｌ）に吸着させ、
ジクロロメタン及びジクロロメタン−メタノール混合液
で展開した。ジクロロメタン−メタノール（１２：１〜
１０：１）によって溶出された活性画分（１０００ｍ
ｌ）を減圧下で濃縮し、残渣をジエチルエーテルに懸濁
し、濃縮乾固して５８３．８ｍｇの白色粉末を得た。こ
の粉末を６０％メタノール水に溶解した後に、ＹＭＣ−
ゲル（ＯＤＳ−ＡＭ，１２０−Ｓ５０，ワイエムシィ
社，２Ｌ）に通液し、９０％メタノール水で溶出した。
溶出液（７００ｍｌ）を減圧下で濃縮し、残渣をジエチ
ルエーテルに懸濁し、濃縮乾固してＷＦ１０２２５Ｂの
白色粉末３１５．１ｍｇを得た。

【００４９】

【発明の効果】本発明のメチルプロリン化合物〔Ｉ〕は
カルパイン阻害活性を有し、カルパイン阻害剤として医
薬用途に使用することができる。カルパイン阻害剤は、
虚血性の細胞障害に対して抑制効果を有するので、急性
腎不全、心筋梗塞、脳梗塞のような、カルパインが関与
する虚血性疾患（特に腎臓、心臓、脳などにおける虚血
性疾患）を治療又は予防するための医薬として有用であ
る。本発明のメチルプロリン化合物〔Ｉ〕はカルパイン
に対して特異的な阻害剤であり、上記のような虚血性疾
患の治療又は予防に使用し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＷＦ１０２２５Ａの紫外線吸収スペクトルを示
す図である。

【図２】ＫＢｒ法で測定したＷＦ１０２２５Ａの赤外線
吸収スペクトルを示す図である。

【図３】ＷＦ１０２２５Ａの ¹Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共
鳴）スペクトルを示す図である。

【図４】ＷＦ１０２２５Ａの¹³Ｃ−ＮＭＲ（核磁気共
鳴）スペクトルを示す図である。

【図５】ＷＦ１０２２５Ｂの紫外線吸収スペクトルを示
す図である。

【図６】ＫＢｒ法で測定したＷＦ１０２２５Ｂの赤外線
吸収スペクトルを示す図である。

【図７】ＷＦ１０２２５Ｂの ¹Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共
鳴）スペクトルを示す図である。

【図８】ＷＦ１０２２５Ｂの¹³Ｃ−ＮＭＲ（核磁気共
鳴）スペクトルを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 35/74 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＶ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式〔Ｉ〕 【化１】 〔式中、Ａは−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −又は−ＣＨ＝ＣＨ−を
   表す〕で表されるメチルプロリン化合物又はその塩。
2. 【請求項２】 スピロスファエラ属に属する請求項１記
   載のメチルプロリン化合物の生産菌を培養し、培養物か
   ら該メチルプロリン化合物を採取することを特徴とする
   請求項１記載のメチルプロリン化合物の製造方法。
3. 【請求項３】 有効成分として請求項１記載のメチルプ
   ロリン化合物又はその塩を含有する医薬組成物。
4. 【請求項４】 有効成分として請求項１記載のメチルプ
   ロリン化合物又はその塩を含有するカルパイン阻害剤。
5. 【請求項５】 スピロスファエラ・フロリフォルミスＮ
   ｏ．１０２２５の生物学的に純粋な培養物。