JPH0920794A - 新規生理活性物質ＡＨＰＡ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、その製造法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アミノペプチダーゼＮに対して酵素阻害活性
の特異性が高い新規生理活性物質を提供する。 【構成】 ストレプトミセスsp. MJ716-m3 (FERM P-145
94)の培養により、下記の式（Ｉ）で表わせる化合物で
あるAHPA-Ｖal-Ｐheが得られた。AHPA-Ｖal-Ｐheはアミ
ノペプチダーゼＮの阻害活性を有し、酵素阻害剤、もし
くは鎮痛持続および増強剤あるいは癌転移抑制剤などの
医薬としての用途が期待できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアミノペプチダーゼＮに
対する酵素阻害活性を有する新規な生理活性物質である
AHPA-Ｖal-Ｐheに関し、またその製造法およびその用途
に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミノペプチダーゼＮは細胞中のミクロ
ソーム及び細胞膜に局在する膜酵素であって亜鉛酵素で
ある。

【０００３】神経細胞のシナプスの膜に存在するアミノ
ペプチダーゼＮは、エンケファリナーゼと共に、モルヒ
ネ様鎮痛作用を示す内因性ペプチドの一種であるエンケ
ファリン（メチオニンエンケファリンとロイシンエンケ
ファリンとの２種類のペプチドが存在する）を分解し、
エンケファリン活性を低下させることが知られている
〔Biochemical Journal、第231巻、445〜449頁、1985
年〕及び〔Nature、第262巻、782〜783頁、1976年〕。
更に、アミノペプチダーゼＮ阻害物質をマウスに投与
し、鎮痛効果の検討を行い、エンケファリンの鎮痛効果
を増強することが報告されている〔European Journal o
f Pharmacology、第86巻、329〜336頁、1983年〕。した
がって、アミノペプチダーゼＮに対する酵素阻害物質
は、エンケファリンによる鎮痛作用の持続及び増強など
の、生体内鎮痛性物質に対する調節作用を示すことが期
待される。また、アミノペプチダーゼＮに対する酵素阻
害剤は転移性の癌細胞の侵潤を抑制することが報告され
ている〔International Journal ofCancer、第54巻、13
7〜143頁、1993年〕から、癌転移抑制剤としても有用で
あると期待される。

【０００４】アミノペプチダーゼＮの酵素阻害物質とし
ては、アクチノニン（Actinonin）〔The Journal of An
tibiotics、第38巻、1629〜1630頁、1985年〕、プロベ
スチン（Probestin）、ベスタチン（Bestatin)〔The Jo
urnal of Antibiotics、第43、143〜148頁、1990年〕及
びロイヒスチン（Leuhistin)〔The Journal of Antibio
tics、第44、573〜578頁、1991年〕等が知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】アクチノニン、プロベ
スチン、ベスタチン及びロイヒスチン等の如きアミノペ
プチダーゼＮの酵素阻害物質は、アミノペプチダーゼＮ
に対する酵素阻害活性の特異性が低い。従って、アミノ
ペプチダーゼＮに対する特異性の高い酵素阻害物質が望
まれている。本発明の目的は、そのような酵素阻害活性
の特異性の高いアミノペプチダーゼＮ阻害活性を有して
低毒性である新規な生理活性物質を提供し、またその製
造法及びその用途を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達するために種々研究を行った。その結果、本発明
者らにより土壌から分離されたストレプトミセス属に属
してMJ716-m3の菌株番号を付した菌株を培養して、その
培養液中にアミノペプチダーゼＮに対する酵素阻害物質
が産生していることを見出した。この物質を単離するこ
とに成功し、さらに後記の式（Ｉ）で表される新規な化
合物であることを確認した。そしてこの物質がアミノペ
プチダーゼＮに対して酵素阻害活性の特異性が高い物質
であることを知見し、ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheと命名した。

【０００７】従って、第１の本発明においては、次式
（Ｉ） で表される化合物である生理活性物質ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐ
heまたはその薬理学的に許容し得る塩を提供するもので
ある。

【０００８】第１の本発明による生理活性物質ＡＨＰＡ
-Ｖal-Ｐheの理化学的性質は下記の通りである。 （１）色および形状：白色粉末 （２）分子式：Ｃ₂₄Ｈ₃₁Ｎ₃Ｏ₅ （３）分子量：441 FAB-MS(Positive)によるm/z値は442(Ｍ+Ｈ)⁺である。

【０００９】（４）融点：190〜192℃ （５）比旋光度：〔α〕_D ²⁷−12.6°（ｃ 0.54, 酢酸） （６）赤外線吸収スペクトル：添付図面の図１に示す。 （７）水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図２に
示す。 （８）炭素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３に
示す。 （９）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノール、
水、酢酸に可溶であり、アセトン、酢酸エチルに不溶で
ある。

【００１０】（10）薄層クロマトグラフィーのＲf値：
シリカゲル（メルク社製シリカゲルＡrt.5715）の薄層
上で展開溶媒としてｎ-ブタノール-酢酸-水（４：１：
１）を用いて測定した時にＲf＝0.70 ＯＤＳ逆相シリカゲル（メルク社製シリカゲルＡrt.153
89）の薄層上で展開溶媒としてアセトニトリル−緩衝液
Ａ^*（7：13）を用いて測定した時にＲf＝0.34＊但し、
緩衝液Ａは５％酢酸カリウム、１％クエン酸・１水和物
を含む水溶液である。

【００１１】第１の本発明による生理活性物質ＡＨＰＡ
-Ｖal-Ｐheは薬理学的に許容し得る塩の形態にあっても
よく、このような塩としては、例えばナトリウム、カリ
ウムなどのアルカリ金属との塩（カルボキシレート）で
あることができ、また薬理学的に許容できる無機酸例え
ば塩酸、硫酸との酸付加塩（アミノ基における）である
ことができる。

【００１２】第１の本発明によるＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの
生理学的性質を下記に説明する。ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheは
低い急性毒性を示すものであり、その急性毒性を試験す
るために下記の試験例１を行った。試験例１ ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheをマウスに腹腔内投与して２週間観
察する試験を行った。その結果、２００mg／kgの投与で
も毒性を示さなかった。

【００１３】ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheのアミノペプチダーゼ
Ｎ阻害活性の測定のため下記の試験例２の実験を行っ
た。試験例２ アミノペプチダーゼＮ阻害活性の測定は「Jouranl of A
ntibiotics」第38巻、1629〜1630頁（1985）に記載の方
法の改良法で行った。即ち、２mMのＬ-ロイシン-β-ナ
フチルアミドの水溶液０.０５ml、０.１Ｍのトリス-塩
酸緩衝液（pＨ７.０）０.１ml、検体としてＡＨＰＡ-Ｖ
al-Ｐheを含む水溶液０.０３５mlを加えた混合溶液を３
７℃で、３分間加温した。その後、アミノペプチダーゼ
Ｎ（ベーリンガ・マイハイム社製）の水溶液０.０１５m
lを加え、３７℃で１時間反応させた。その反応液に１
０％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレー
ト（和光純薬工業製）および０.２％ファーストガーネ
ットＧＢＣ塩（Sigma Chemical社製）を含む０.５Ｍク
エン酸ナトリウム緩衝液（pＨ３.７８）を加えて反応を
停止させた。

【００１４】その反応停止液について、５２５nmにおけ
る吸光度(a）を測定し、また同時に検体を含まない緩衝
液のみを用いた盲検の吸光度(b）を測定した。それらの
測定値を用いてアミノペプチダーゼＮ阻害率を［(b-a)/
b］×100の式により計算した。５０％阻害率を示す検体
の濃度をＩＣ₅₀の値とした。この測定法で純粋なＡＨＰ
Ａ-Ｖal-Ｐheは０.１６μg/mlの濃度で、アミノペプチ
ダーゼＮを５０％阻害したので、アミノペプチダーゼＮ
に対するＡＨＰＡ-Ｖal-ＰheのＩＣ₅₀値は０.１６μg/m
lである。上記の試験例２から明らかなように、ＡＨＰ
Ａ-Ｖal-ＰheはアミノペプチダーゼＮに対して高い阻害
活性を示す。

【００１５】従って、第２の本発明においては、前記の
式（Ｉ）で表される化合物であるＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe、
あるいはその薬理学的に許容しうる塩を有効成分とする
アミノペプチダーゼＮ阻害剤が提供される。

【００１６】第２の本発明による酵素阻害剤は、その有
効成分であるＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheあるいはその塩を製薬
学的に許容される慣用の液体状担体、例えば水、エタノ
ール、あるいは慣用の固体状担体、例えばでんぷん、ラ
クトース、マルトースと混和させてなる組成物の形であ
ることができる。

【００１７】本発明による生理活性物質ＡＨＰＡ-Ｖal-
Ｐhe又はその塩はアミノペプチダーゼＮの酵素的性質を
研究するのに有用である。また、AHPA-Ｖal-Ｐheは、前
述のとおり、鎮痛作用をもつエンケファリンを加水分解
してその活性を低下させるアミノペプチダーゼＮの酵素
作用を阻害するから、動物又はヒトに投与する時に鎮痛
持続及び増強剤として有効であり、また癌転移抑制剤と
しても有用である。

【００１８】次に、AHPA-Ｖal-Ｐheはアミノペプチダー
ゼＮがヒトのメチオニンエンケファリンを加水分解する
のを阻害できることを下記の試験例３によって例証す
る。

【００１９】試験例３ アミノペプチダーゼＮによるヒトメチオニンエンケファ
リンの加水分解に対するＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの阻害活性
試験を次のように行った。すなわち、アミノペプチダー
ゼＮによるヒトメチオニンエンケファリン加水分解に対
するＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの阻害活性は、下記の方法で測
定した。１mMヒトメチオニンエンケファリン（ペプチド
社製）の水溶液０.０５ml、０.２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pＨ７.０）０.０２５ml、検体としてＡＨＰＡ-Ｖal-
Ｐheを含む水溶液０.０１mlを混合した溶液を３７℃で
５分間加温した。その後、その混液に前述したアミノペ
プチダーゼＮ水溶液０.０１５mlを加え、３７℃で３０
分間反応させた。反応後、０.３％トリフルオロ酢酸０.
０５mlを加えて反応を停止した。その反応停止液０.０
５mlを０.１％トリフルオロ酢酸を含む５％アセトニト
リル水溶液で平衡化した高速液体クロマトグラフィー用
カラム（資生堂社製、カプセルパックＣ₁₈, 4.6φ×150
mm）へ供し、１ml/minの流速で２５分間にＡ溶液からＢ
溶液（Ａ溶液は０.１％トリフルオロ酢酸／アセトニト
リル＝９０：５であり、Ｂ溶液は０.１％トリフルオロ
酢酸／アセトニトリル＝６０：２０）である）の直線的
なグラジエント法で溶出した。溶出液について２１０nm
における吸光度を測定した。その結果を添付図面の図４
に示す。図４から明らかなように、保持時間６.２分に
チロシンが、１８.８分にdes-Try¹−メチオニンエンケ
ファリンが、２０.７分にメチオニンエンケファリンが
検出された。

【００２０】このdes-Try¹−メチオニンエンケファリン
を内部標準法によって定量した。検体を含む溶液を用い
た場合の定量値(a)及び検体を含まない緩衝液のみを用
いた盲検の定量値(b)を測定し、アミノペプチダーゼＮ
阻害率を［(b-a)/b］×100の式により計算した。５０％
阻害率を示す検体の濃度をＩＣ₅₀の値とした。この定量
法で純粋なAHPA-Ｖal-Ｐheは０.１６μg/mlの濃度で、
ヒトメチオニンエンケファリンを加水分解させるアミノ
ペプチダーゼＮの活性を５０％阻害した。

【００２１】本発明によるＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe物質は、
ストレプトミセス属に属するＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe生産菌
を培養し、得られる培養物中にＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheを生
成し、蓄積させ、次いで培養物からＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe
を分離して採取することにより製造できる。

【００２２】従って、第３の本発明によると、ストレプ
トミセス属に属するＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe生産菌を栄養培
地中で培養し、その培養物から上記の式（Ｉ）で表され
るＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheを採取することを特徴とする生理
活性物質ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの製造法が提供される。

【００２３】第３の本発明の方法に使用されるＡＨＰＡ
-Ｖal-Ｐhe生産菌の一例としては、平成３年１０月、微
生物化学研究所において、本発明者らにより、東京都大
田区の土壌より分離された放線菌で、MJ716-m3の菌株番
号が付された菌株がある。

【００２４】MJ716-m3株の菌学的性状は次の通りであ
る。 １．形態 MJ716-m3株は、分枝した基生菌糸より比較的長い気菌糸
を伸長し、輪生枝を形成する。胞子鎖の先端はかぎ状を
呈する場合があり、また、縄状に絡み合う形態が観察さ
れる。成熟した胞子鎖は５〜20個の卵円形〜円筒形の胞
子を連鎖する。胞子の大きさは約０.５〜０.６×０.８
〜１.０ミクロンであり、胞子の表面は平滑である。な
お、らせん形成、菌束糸、菌核及び胞子のうは認められ
ない。

【００２５】２．各種培地における生育状態 色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル（Container Corporation ofAmerica
のcolor harmony manual）を用いた。

【００２６】（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（27
℃培養） 無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解
性色素は認められない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（27℃培養） うす黄［2 gc, Bamboo］の発育上に、黄味灰［１¹/₂ca,
Cream〜2 ca, Lt Ivory］の気菌糸を綿状に着生し、溶
解性色素は認められない。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP-培地
５、27℃培養） うす黄茶［2 pg, Mustard Gold］の発育上に、白〜黄味
灰［2 ca, Lt Ivory］の気菌糸を着生し、溶解性色素は
かすかに茶色味を帯びる。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ISP-培地４、27℃培
養） うす黄茶［3 le, Cinnamon］の発育上に、黄味灰［2 b
a, Pearl〜2 ca, Lt Ivory］の気菌糸を綿状に着生し、
溶解性色素は認められない。

【００２７】（５）チロシン寒天培地（ISP-培地７、27
℃培養） うす黄茶［2 le, Mustard〜3 le, Cinnamon］の発育上
に、茶白［3 ba, Pearl］の気菌糸をうっすらと着生す
る。溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。 （６）栄養寒天培地（27℃培養） 発育はうす黄茶［3 ng, Yellow Maple］、気菌糸は着生
せず、溶解性色素は黄茶を帯びる。 （７）イースト・麦芽寒天培地（ISP-培地２、27℃培
養） 黄茶［3 ng, Yellow Maple〜4 pi, Oak Brown］の発育
上に、灰白［2 dc, Natural］〜黄味灰［2 ba, Pearl］
の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。 （８）オートミール寒天培地（ISP-培地３、２７℃培
養） 黄味灰［2 ca, Lt Ivory］の発育上に、黄味灰［2 ca,
Lt Ivory］〜うすだいだい［3 ca, Pearl Pink］の気菌
糸を綿状に着生し、溶解性色素はかすかに茶色味を帯び
る。 （９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（27℃培養） うす黄［2 ic, Honey Gold］〜黄茶［3 ne, Topaz］の
発育上に、黄味灰［2ba, Pearl］〜茶白［3 ba, Pear
l］の気菌糸をうっすらと着生し、黄［2 ia,Squash Yel
low］の溶解性色素を産生する。

【００２８】（10）スターチ寒天培地（27℃培養） うす黄［2 ic, Honey Gold］〜うす黄茶［2 le, Mustar
d］の発育上に、白〜黄味灰［2 ca, Lt Ivory］の気菌
糸を着生し、溶解性色素を認められない。 （11）マルトース・ベンネット寒天培地（２７℃培養） 黄茶［3 ng, Yellow Maple］の発育上に、黄味灰［2 c
a, Lt Ivory］の気菌糸を着生し、溶解性色素はかすか
に茶色味を帯びる。 （12）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（20℃培養）では、発育はうす
黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は黄茶を呈する。グ
ルコース・ペプトン、ゼラチン培地（27℃培養）の場
合、発育はうす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素は
黄茶を呈する。 （13）脱脂牛乳（37℃培養） 発育はうす黄〜黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素は
茶色味を帯びる。

【００２９】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース１.０
％、アスパラギン０.５％、リン酸二カリウム０.５％、
ひも寒天３.０％、pＨ７.０）を用い、１０℃、２０
℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、５０℃の各温度
で試験した結果、５０℃を除き、そのいずれの温度でも
生育する。生育至適温度は２７℃〜３０℃付近と思われ
る。 （２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０
℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７℃
培養） １５％単純ゼラチン培地では培養後３日目頃より、グル
コース・ペプトン・ゼラチン培地の場合は、培養後４日
目頃より液化が始まる。液化の進行は遅く、ともに２１
日間の培養で完了しなかった。その作用は中等度〜弱い
方である。

【００３０】（３）スターチの加水分解（スターチ・無
機塩寒天培地、ISP-地培４及びスターチ寒天培地、いず
れも２７℃培養） いずれの培地においても培養後３日目頃より水解性が認
められ、その作用は強い方である。 （４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 培養後１４日目頃より凝固することなくペプトン化が始
まるが、その作用は極めて弱く、２１日目にも完了しな
かった。

【００３１】（５）メラニン様色素の生成（トリプトン
・イースト・ブロス、ISP-培地１：ペプトン・イースト
・鉄寒天培地、ISP-培地６：チロシン寒天培地、ISP-培
地７：いずれも２７℃培養） トリプトン・イースト・ブロス及びペプトン・イースト
・鉄寒天培地では陽性、チロシン寒天培地はおそらく陰
性である。 （６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培
地、ISP-培地９、２７℃培養） Ｄ-グルコースを利用して発育し、Ｄ-フラクトース及び
イノシトールはおそらく利用せず、Ｌ-アラビノース、
Ｄ-キシロース、シュクロース、ラフィノース、ラムノ
ース及びＤ-マンニトールは利用しない。 （７）硝酸塩の還元反応（０.１％硝酸カリウム含有ペ
プトン水、ISP-培地８、２７℃培養） 陽性である。

【００３２】以上の性状を要約すると、MJ716-m3株は、
その形態上、基生菌糸より比較的長い気菌糸を伸長し、
輪生枝を形成する。らせん形成、菌束糸、菌核及び胞子
のうは認められない。胞子鎖の先端はかぎ状を呈する場
合があり、また縄状に絡み合う形態が観察される。成熟
した胞子鎖には５〜２０個以上の円筒形の胞子を連鎖
し、その表面は平滑である。種々の培地で、うす黄〜う
す黄茶の発育上に、綿状の茶白〜黄味灰の気菌糸を着生
し、溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。生育至適温
度は２７〜３０℃付近である。メラニン様色素の生成は
トリプトン・イースト・ブロス及びペプトン・イースト
・鉄寒天培地では陽性、チロシン寒天培地はおそらく陰
性である。スターチの水解性は強い方、蛋白分解力は中
程度から弱い方である。なお、細胞壁に含まれる２，６
−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型であった。

【００３３】これらの性状より、MJ716-m3株は、ストレ
プトミセス（Streptomyces）属に属すると考えられる。
近縁の既知菌種を検索すると、ストレプトミセス・アル
ビレティキュリ（Streptomyces albireticuli)[文献１;
Shirling, E.B. and D.Gottlieb, International Jour
nal of Systematic Bacteriology, 18巻, 80頁, 1968
年, 文献２；Validation of the publication of new n
ames and new combinations previously effectively p
ublished outside the IJSB, List No. 38, Internatio
nal Journal of Systematic Bacteriology, 41巻, 456
頁, 1991年, 文献３；S.A.Waksman著, The Actinomycet
es, 2巻, 169頁, 1961年〕及びストレプトミセス・ユー
ロシディクス（Streptomyces eurocidicus)[文献１; Sh
irling, E.B. and D.Gottlieb, International Journal
of Systematic Bacteriology, 22巻, 293頁, 1972年,
文献２；Validation of the publication of new names
and new combinations previously effectively publis
hed outside the IJSB,List No. 38, International Jo
urnal of Systematic Bacteriology, 41巻, 456頁, 199
1年, 文献３；S.A.Waksman著, The Actinomycetes, 2
巻, 205頁, 1961年〕があげられた。そこで上記２菌種
の当研究所保存菌株とMJ716-m3株とを実地に比較検討し
た。その成績の大要を表１に示す。

【００３４】

【００３５】表１から明らかなように、MJ716-m3株はス
トレプトミセス・アルビレティキュリ及びストレプトミ
セス・ユーロシディクスのいずれとも、イノシトールの
利用性を除き、よく類似した性状を示した。ところで、
ストレプトミセス・アルビレティキュリ及びストレプト
ミセス・ユーロシディクスは互いによく一致した性状を
示している。さらに、ストレプトミセス・アルビレティ
キュリは抗生物質ユーロシディン（eurocidin）を生産
（文献３）し、ストレプトミセス・ユーロシディクスも
またユーロシディンの生産株（文献３）である。これら
のことからストレプトミセス・アルビレティキュリとス
トレプトミセス・ユーロシディクスは同一種である可能
性が考えられる。MJ716-m3株は両者に極めて近縁である
が、いずれか一方の種と同定することは困難であり、MJ
716-m3株をストレプトミセス・エスピー（Streptomyces
sp.）MJ716-m3とした。なお、MJ716-m3株を工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成６年10月
20日、FERM P-14594として受託された。

【００３６】MJ716-m3株は他の放線菌の場合に見られる
ように、その性状が変化しやすい。例えば、MJ716-m3株
に由来する突然変異株（自然発生または誘発生）、形質
融合体または遺伝子組み換え体であっても、第１の本発
明による生理活性物質ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの生産能を有
するストレプトミセス属の菌はすべて第３の本発明の方
法に使用することができる。

【００３７】第３の本発明の方法では、前記のＡＨＰＡ
-Ｖal-Ｐhe生産菌を通常の微生物が利用しうる栄養源を
含有する培地で培養する。炭素源としては、グルコー
ス、水飴、デキストリン、シュクロース、でんぷん、糖
蜜、動・植物油等を使用できる。また、窒素源として
は、大豆粉、小麦、小麦胚芽、コーンスティープ・リカ
ー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸
アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を利用できる。
その他、必要に応じ、ナトリウム、コバルト、塩素、硫
酸、燐酸、及びその他のイオンを生成することのできる
無機塩類を添加することは有効である。また、生産菌の
生育を助け、生理活物質ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの生産を促
進するような有機物及び無機物を適当に添加することが
できる。

【００３８】ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe生産菌の培養法として
は、好気的条件での培養法、特に深部液体培養法が適し
ている。培養に適当な温度は１５〜３７℃であるが、多
くの場合、２６〜３０℃付近で培養する。生理活性物質
ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの生産は培地や培養条件により異な
るが、振盪培養、タンク培養とも通常１〜１０日の間で
その蓄積が最高に達する。培養物中の生理活性物質ＡＨ
ＰＡ-Ｖal-Ｐheの蓄積量が最高になった時に、培養を停
止し、培養液から目的物質を単離精製する。

【００３９】本発明によって得られるＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐ
heの培養液からの採集にあたっては、その性状を利用し
た通常の分離手段、例えば、溶媒抽出法、イオン交換樹
脂法、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わ
せ、あるいは繰り返すことによって抽出および精製する
ことができる。

【００４０】ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの薬理学的に許容し得
る塩は、公知の方法によって製造することができ、例え
ば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸などを含む
溶液でＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheを処理することによって形成
できる。

【００４１】以下に本発明の実施例を示すが、ＡＨＰＡ
-Ｖal-Ｐheの性状が本発明によって明らかにされたの
で、それらの性状にもとずきＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの製造
法を種々考案することができる。従って本発明は実施例
に限定されるものではなく、実施例の修飾手段は勿論、
本発明によって明らかにされたＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの性
状にもとずいて公知の手段を施してＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe
物質を生産、濃縮、抽出、精製する方法をすべて包括す
る。

【００４２】実施例１ 種培地として、バクトソイトン１.０％、ガラクトース
２.０％、コーン・スティープ・リカー０.５％、デキス
トリン２.０％、グリセリン１.０％、硫酸アンモニウム
０.２％、炭酸カルシウム０.２％の組成から成る培地を
用いた。なお、殺菌前のpＨは７.４に調整した。

【００４３】前記の種培地（１１０ml）を分注した５０
０ml容三角フラスコを１２０℃で２０分間殺菌した。殺
菌した種培地にストレプトミセス属sp.MJ716-m3株(FERM
P-14594)の斜面寒天培養の１〜２白金耳を接種した。
さらに２７℃、１８０回転／分の回転式振盪機にて２日
間培養し種培養液とした。次いで前記の培地を５００ml
容三角フラスコに１１０mlずつ分注し、１２０℃で２０
分間滅菌し、前記種培養液２mlずつを接種し、２７℃で
３日間振盪培養した。培養終了後、培養液を濾過し、培
養濾液と菌体に分別した。

【００４４】培養濾液９Ｌをあらかじめ脱イオン水で充
填したダイヤイオンＨＰ-２０ (三菱化成社製)、９００
mlのカラムにかけ、脱イオン水で洗浄後、有効成分を５
０％アセトンの0.005Ｎ塩酸溶液により溶出し、減圧濃
縮によりアセトンを除去した。この濃縮液５００mlをpH
２に調整後、ブタノール５００mlを加え、よく攪拌して
有効成分を抽出し、これを濃縮乾固して褐色の粗粉末
６.９ｇを得た。

【００４５】この粗粉末をメタノール１０mlに溶解し、
アビセル (三菱化成社製) １２ｇを加えて減圧下で濃縮
乾固した。次に、これを酢酸ブチル-ブタノール-酢酸-
水（６：４：１：１）で懸濁後、その懸濁液を、あらか
じめ同混合溶媒で充填したシリカゲル60（メルク社製、
Ａrt.7734）、５００mlのカラムにかけ、有効成分を同
混合溶媒で溶出し、濃縮乾固することにより粗粉末４９
８.５mgを得た。この粗粉末を０．１Ｍピリジン酢酸緩
衝液（ｐＨ３）で溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化
したダウエックス５０Ｗ-Ｘ８(ダウケミカル社製）、３
５mlのカラムにかけ、同混合溶媒で洗浄した。続いて、
有効成分を０.１Ｍピリジン酢酸緩衝液（ｐＨ３）〜２
Ｍピリジン酢酸緩衝液(ｐＨ４.７５）の直線的濃度勾配
溶出法により溶出し、濃縮乾固した。次に、これを脱イ
オン水で溶解し、あらかじめ脱イオン水で充填したダウ
エックス５０Ｗ-Ｘ４（Ｈ⁺)（ダウケミカル社製)、３０
mlのカラムにかけ、脱イオン水で洗浄した。続いて、有
効成分を１Ｎアンモニウム水で溶出し、濃縮乾固するこ
とにより粗粉末４４.３mgを得た。

【００４６】この粗粉末をアセトニトリル：０.１％ト
リフルオロ酢酸(６：19）で溶解し、あらかじめ同混合
溶媒で平衡化した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）用カラム（資生堂製、カプセルパックＣ₁₈、20Φ×
250mm、流速８ml/min）へ通し、前記平衡液で溶出し、
活性画分を濃縮乾固することにより粗粉末２３.０mgを
得た。更に、この粉末をあらかじめアセトニトリル−
０.１％トリフルオロ酢酸(11：39）で平衡化したＨＰＬ
Ｃ用カラム（カプセルパックＣ₁₈、10Φ×250mm、流速
２ml/min）へ通し、前記平衡液で溶出し、活性画分を濃
縮乾固することにより粗粉末１６.７mgを得た。次に、
これをメタノール０.５mlに溶解し、あらかじめメタノ
ールで充填したセファデックスＬＨ-２０（ファルマシ
ア社製)、１６０mlにかけ、メタノールで溶出し、得ら
れた活性画分を濃縮乾固することにより融点１９０〜１
９２℃の純粋なAHPA-Ｖal-Ｐheの白色粉末１４.２mgを
得た。

【００４７】ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの培養行程中の追跡
は、抗アミノペプチダーゼＮ活性の測定に基づいて行っ
た。その測定は前記の試験例２で示すアミノペプチダー
ゼＮ阻害活性の測定法と同様の方法を用いた。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの臭化カリウム錠内での赤
外線吸収スペクトルを示す。

【図２】ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheについて重ジメチルスルフ
ォキシド中で５００MHzで測定した水素核核磁気共鳴ス
ペクトルを示す。

【図３】ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheについて重ジメチルスルフ
ォキシド中で１２５MHzで測定した炭素核核磁気共鳴ス
ペクトルを示す。

【図４】(a) 試験例３において高速液体クロマトグラフ
ィーを用いてＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの不存在下におけるア
ミノペプチダーゼＮによるヒトメチオニンエンケファリ
ンの加水分解を２１０nmの吸光度の測定により分析した
クロマトグラム図である。縦軸は吸光度、横軸は時間
（分）を示す。 (b) 試験例３においてＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe ０.２μｇ
／mlを反応液に含有させた条件でヒトメチオニンエンケ
ファリンの加水分解を行った場合の２１０nmの吸光度の
測定により分析したクロマトグラム図である。

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【手続補正書】

【提出日】平成７年１２月５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１９】試験例３ アミノペプチダーゼＮによるヒトメチオニンエンケファ
リンの加水分解に対するＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの阻害活性
試験を次のように行った。すなわち、アミノペプチダー
ゼＮによるヒトメチオニンエンケファリン加水分解に対
するＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの阻害活性は、下記の方法で測
定した。１mMヒトメチオニンエンケファリン（ペプチド
社製）の水溶液０.０５ml、０.２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pＨ７.０）０.０２５ml、検体としてＡＨＰＡ-Ｖal-
Ｐheを含む水溶液０.０１mlを混合した溶液を３７℃で
５分間加温した。その後、その混液に前述したアミノペ
プチダーゼＮ水溶液０.０１５mlを加え、３７℃で３０
分間反応させた。反応後、０.３％トリフルオロ酢酸０.
０５mlを加えて反応を停止した。その反応停止液０.０
５mlを０.１％トリフルオロ酢酸を含む５％アセトニト
リル水溶液で平衡化した高速液体クロマトグラフィー用
カラム（資生堂社製、カプセルパックＣ₁₈, 4.6φ×150
mm）へ供し、１ml/minの流速で２５分間にＡ溶液からＢ
溶液（Ａ溶液は０.１％トリフルオロ酢酸／アセトニト
リル＝９０：５であり、Ｂ溶液は０.１％トリフルオロ
酢酸／アセトニトリル＝６０：２０である）の直線的な
グラジエント法で溶出した。溶出液について２１０nmに
おける吸光度を測定した。その結果を添付図面の図４に
示す。図４から明らかなように、保持時間６.２分にチ
ロシンが、１８.８分にdes-Try¹−メチオニンエンケフ
ァリンが、２０.７分にメチオニンエンケファリンが検
出された。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】（10）スターチ寒天培地（27℃培養） うす黄［2 ic, Honey Gold］〜うす黄茶［2 le, Mustar
d］の発育上に、白〜黄味灰［2 ca, Lt Ivory］の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。 （11）マルトース・ベンネット寒天培地（２７℃培養） 黄茶［3 ng, Yellow Maple］の発育上に、黄味灰［2 c
a, Lt Ivory］の気菌糸を着生し、溶解性色素はかすか
に茶色味を帯びる。 （12）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（20℃培養）では、発育はうす
黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は黄茶を呈する。グ
ルコース・ペプトン、ゼラチン培地（27℃培養）の場
合、発育はうす黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素は
黄茶を呈する。 （13）脱脂牛乳（37℃培養） 発育はうす黄〜黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素は
茶色味を帯びる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２９】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース１.０
％、アスパラギン0.05％、リン酸二カリウム0.05％、ひ
も寒天３.０％、pＨ７.０）を用い、１０℃、２０℃、
２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、５０℃の各温度で試
験した結果、５０℃を除き、そのいずれの温度でも生育
する。生育至適温度は２７℃〜３０℃付近と思われる。 （２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０
℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７℃
培養） １５％単純ゼラチン培地では培養後３日目頃より、グル
コース・ペプトン・ゼラチン培地の場合は、培養後４日
目頃より液化が始まる。液化の進行は遅く、ともに２１
日間の培養で完了しなかった。その作用は中等度〜弱い
方である。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年１２月６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４７】ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの培養行程中の追跡
は、抗アミノペプチダーゼＮ活性の測定に基づいて行っ
た。その測定は前記の試験例２で示すアミノペプチダー
ゼＮ阻害活性の測定法と同様の方法を用いた。なお、前
記のＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheはフェベスチン（Phebestin）
と改名することにする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長縄 博 東京都大田区田園調布本町３番17号 (72)発明者 永井 真知子 東京都目黒区中央町１丁目７番10号 シャ レー学芸大カワベ第２−207号

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式（Ｉ） で表される化合物である生理活性物質ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐ
   he、またはその薬理学的に許容し得る塩。
2. 【請求項２】 ストレプトミセス属に属するＡＨＰＡ-
   Ｖal-Ｐhe生産菌を栄養培地中で培養し、その培養物か
   らＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheを採取することを特徴とする、生
   理活性物質ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐheの製造法。
3. 【請求項３】 生理活性物質ＡＨＰＡ-Ｖal-Ｐhe、ある
   いはその薬理学的に許容しうる塩を有効成分とするアミ
   ノペプチダーゼＮ阻害剤。