KR100225601B1 - 항생물질 wap-8294a와 이의 제조방법 및 항균조성물 - Google Patents

항생물질 wap-8294a와 이의 제조방법 및 항균조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR100225601B1
KR100225601B1 KR1019950025247A KR19950025247A KR100225601B1 KR 100225601 B1 KR100225601 B1 KR 100225601B1 KR 1019950025247 A KR1019950025247 A KR 1019950025247A KR 19950025247 A KR19950025247 A KR 19950025247A KR 100225601 B1 KR100225601 B1 KR 100225601B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
acid
mole
mol
minutes
wap
Prior art date
Application number
KR1019950025247A
Other languages
English (en)
Other versions
KR960030942A (ko
Inventor
요시타미오하시
하루히사히라타
세이고나까야
아쭈사가또
유지아이바
나오미고꾸보
노부유끼스즈끼
마꼬토마에다
Original Assignee
오쿠다 기요아키
와까모토 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP01604495A external-priority patent/JP3339235B2/ja
Application filed by 오쿠다 기요아키, 와까모토 세이야꾸 가부시키가이샤 filed Critical 오쿠다 기요아키
Publication of KR960030942A publication Critical patent/KR960030942A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100225601B1 publication Critical patent/KR100225601B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 라이소박터(Lysobacter)속에 속하는 균주로부터 생산된 신규 항생물질 WAP-8294A, A1, A2, A4, AX, AX-8, AX-9 및 AX-13 또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염; 항생물질을 생산하고 이를 배양배지에서 증식시키기 위해 라이소박터(Lysobacter)속에 속하는 항생물질 WAP-8294A의 생산능력을 가지는 미생물을 배양하는 단계와, 그 항생물질을 회수하는 단계로 이루어진 상기 항생물질 WAP-8294A의 생산방법; 및 상기 항생물질 또는 약제학적으로 수용가능한 염을 함유하는 항균조성물에 관한 것이다.
본 발명의 신규한 항생물질 WAP-8294A는 그람-양성균, 특히 MRSA로 인한 감염에 의해 진전되는 전염병에 효과적이고, 본 항생물질은 감염균으로서 그람 양성균 감염을 통해 진전되는 MRSA전염병을 포함한 질병치료에 효과적이다.

Description

항생물질 WAP-8294A와 이의 제조방법 및 항균제 조성물
제1도는 항생물질 WAP-8294A가 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 통해 분리된 분획으로부터 관찰된 크로마토그램이다.
제2도는 항생물질 WAP-8294A2(염산염)의 UV 흡수 스펙트럼(H2O)양상을 나타낸 그래프이다.
제3도는 항생물질 WAP-8294A2(염산염)의 IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) 양상을 나타낸 그래프이다.
제4도는 항생물질 WAP-8294A2(염산염)의1H-NMR 스펙트럼(270 MHz, D2O) 양상을 나타낸 그래프이다.
제5도는 항생물질 WAP-8294A을 산으로 완전히 가수분해하여 제조된 가수분해물의 2차원(two-dimension) TLC 분리에 의한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
제6도는 항생물질 WAP-8294AX를 HPLC를 통과시켜 분리했을 때 관찰된 크로마토그램이다.
제7도는 항생물질 WAP-8294AX-8(염산염)의 UV 흡수 스펙트럼(H2O) 양상을 나타낸 그래프이다.
제8도는 항생물질 WAP-8294AX-8(염산염)의 IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) 양상을 나타낸 그래프이다.
제9도는 항생물질 WAP-8294AX-8(염산염)의1H-NMR 스펙트럼(270 MHz, DMSO-d6) 양상을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 병원미생물의 전염에 의해 발생되는 질병의 치료제로서 유용한 신규한 항생물질 WAP-8294A와 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
세균전염병에 대한 화학요법제(chemotherapeutic agents)의 역사는 퀴닌(quinine)과 샐바산(salvarsan)의 합성 및 페니실린의 발견으로 시작된 이래 인류는 이들 화학요법제의 개발에 대한 연구를 계속해 왔다.
하지만, 최근 이들 화학요법제들의 사용으로 인해 MRSA[메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococus aureus)]가 알려졌고, 이들은 반코마이신(Vancomycin)과 헤베카신(Hebekacin)외의 화학요법제로는 효과가 없음이 확인되어 이로인해 의약치료분야에 혼란이 야기되고 중대한 사회문제가 발생되고 있다.
항생물질로서 반코마이신은 미국의 엘리 릴리(Eli Lilly)사에 의해 개발된 것으로 MRSA에 의한 전염성질병을 치료하는데 유용하지만 치료시 신장해(腎障害, nephrotoxicity)와 간장해(肝障害, hepatoxicity) 및 심지어는 제8뇌(腦) 신경장해(ototoxicity)가 가끔 유발되기도 하고, 오랜 치료기간이 필요하며, 이에 따라 이 항생물질에 내성을 갖는 세균이 나타난 것이 아닌가 하는 의구심이 있어 왔다.
한편, 헤베카신은 아미노글리코사이드 항생물질중의 하나로 카나마이신(Kanamycin)의 골격을 가지면서 우수한 항균성을 가지며 다양한 종류의 내성 세균에 효과가 있는 항생물질로부터 화학적으로 유도된 것으로서 MRSA 전염성질환을 치료하는 화학요법제의 몇 안되는 것중의 하나로 사용되고 있다. 그러나 이의 사용은 아미노글리코사이드 항생물질의 특이한 부작용인 여러가지 신장해와 제8뇌 신경장해가 때때로 유발되기 때문에 의학치료의 관점에서 보면 반드시 안전한 항생물질이라고 할 수 없다.
이러한 상황에서 낮은 독성을 가지고, 짧은 시간에 항균작용을 보여줄 뿐 아니라 부작용이 거의 없는 새로운 화학요법제의 개발이 오랫동안 요구되어 왔고, 이 문제를 해결하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다.
본 발명은 상기한 요구를 만족시킬 수 있는 항균성을 가지는 신규한 항생물질을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 또 하나의 목적은 그 항생물질의 제조방법을 제공하는 것이며, 낮은 독성과 우수한 선택적 독성을 갖는 임상적으로 유용한 화학요법제를 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 발명자들은 신규하고 유용한 항생물질을 개발하기 위해 부단한 노력을 기울인 결과, 신규 미생물로서 토양에서 라이소박터(Lysobacter)속에 속하는 균주의 분리에 성공하였고 이 균주가 지금까지 항생물질을 생산한다는 사실이 공지되어 있지 않음을 알게되어 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 후술하는 물리화학적 특성을 갖는 항생물질 WAP-8294A와 이들의 약제학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항생물질을 생산하고 이를 배양배지에서 증식시키기 위해 항생물질 WAP-8294A의 생산능력을 가지며 라이소박터 속(Lysobacter sp.)에 속하는 미생물을 배지내에서 배양하는 단계와 항생물질을 회수하는 단계로 이루어진 상기 항생물질 WAP-8294A의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 항생물질 WAP-8294A의 생산능력을 가지는 라이소박터 속 미생물에 관한 것과, 항생물질 WAP-8294A로 이루어진 군에서 선택된 최소한 1개 이상으로 구성된 항균 조성물과 이들의 약제학적으로 수용가능한 염을 포함한다.
본 발명은 라이소박터(Lysobacter)속에 속하는 균주의 배양액 중에서 발견된 신규한 항생물질 WAP-8294A에 관한 것이다.
이 항생물질 WAP-8294A는 적어도 7개의 성분, 즉 AX, A1, A2, A3, A4, A5및 A6으로 구성되고, 그중 AX는 적어도 13개의 성분, 즉 AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 및 AX-13으로 구성된다.
그리고 여기서 사용되는 항생물질 WAP-8294A는 상기 AX, A1, A2, A3, A4, A5, A6, AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12, AX-13 또는 이들의 혼합물을 의미한다.
또한, 본 발명은 유리형태(free form)의 항생물질 WAP-8294A 이외에도 염산, 설페이트 및 메탄설포네이트 등과 같은 약제학적으로 수용가능한 염을 포함한다.
이들 물질들은 그람 양성균, 특히 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스(MRSA)에 강한 항세균 활성을 나타낸다.
이 항생물질 WAP-8294A는 C18역상 실라카겔-HPLC[컬럼 : YMC A-312(6×150㎜); 이동상 : 0.05% 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴 : 물(45 : 55); 검출파장 : UV 214 nm; 유속 : 1㎖/분]의 용출조건하에서 관찰된 바, 각각 4.0~6.1분, 8.0분, 11.1분, 12.5분, 16.5분, 17.9분 및 18.8분의 체류시간(retention time)을 갖는 성분, 즉 AX, A1, A2, A3, A4, A5및 A6의 분획들로 나누어진다(제1도). AX는 제6도에서 보여지듯 C18역상 실리카겔-HPLC[컬럼 : YMC A-312(6×150㎜); 이동상 : 0.05% 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴 : 물(37 : 63); 검출파장 : UV 214nm; 유속 : 1㎖/분]의 용출조건하에서 각각 5.3분, 5.9분, 6.2분, 6.5분, 6.9분, 7.3분, 8.1분, 9.3분, 9.8분, 11.3분, 12.1분, 13.7분 및 15.0분의 체류시간을 갖는 구성성분 AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 및 AX-13의 분획들로 추가로 나누어진다.
항생물질 WAP-8294A, A1, A2및 A4는 UV 흡수 스펙트럼(H2O) 분석결과 275nm, 280nm 및 287nm의 최대 파장(λmax)을 나타낸다. 이중 항생물질 WAP-8294A2의 UV 흡수 스펙트럼 양상은 첨부도면 제2도에 나타낸 바와 같다. 이 항생물질 WAP-8294A, A1, A2및 A4는 후술하는 이들의 산가수분해물의 분석에서 확인되듯이 분자내에 발색단(chromophore)으로서 트립토판을 가진다.
항생물질 WAP-8294A, A1, A2및 A4의 적외선(IR) 흡수분광분석은 -OH와 -NH기는 3300㎝-1, 카르복실 또는 에스테르카르보닐기에서는 1720 ~ 1715㎝-1, 아미도 결합에서는 1636 ~ 1541㎝-1그리고 C-O 신축진동에서는 1207 ~ 1137㎝-1의 흡수도를 각각 나타낼 뿐, 다른 특징적인 흡수도를 가지고 있지는 않다. 항생물질 WAP-8294A2의 IR 흡수 스펙트럼 양상을 제3도에 나타낸다.
항생물질 WAP-8294A, A1, A2및 A4의1H-NMR 분광 측정에서는 메틸, 메틸렌, 메틴 및 헤테로사이클 또는 방향족환으로부터 기인된 복잡한 수많은 H+시그널이 관찰된다. 항생물질 WAP-8294A2의1H-NMR 스펙트럼 챠트를 제4도에 나타낸다.
WAP-8294A1, A2및 A4의 FAB-질량-분광측정에서는 성분 A1, A2및 A4각각에 대한 (M+B)+이온의 m/z값이 각각 1548.9, 1562.9 및 1576.9이다.
그리고 성분 A1, A2및 A4의 나트륨 용융 실험(sodium-melting test)을 통해 이들 성분들이 각각 탄소, 수소, 산소 및 질소로 구성된 화합물임을 분명하게 알 수 있다.
다음 표 1의 분자식은 후술하는 이들 성분들을 구성하는 아미노산 및 지방산의 모든 구조 측정과 몰비를 고려하고 고분해능(high resolution) FAB-질량-분광측정의 결과로부터 얻어진 것이다.
[표 1]
항생물질 WAP-8294A, A1, A2및 A4는 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon-Smith), 요오드증기(iodine vapor), 과망간산칼륨 수용액 및 황산반응에서 각각 양성을 나타내고; UV 램프로부터 방사된 254nm의 광선을 가진 조사선을 통해 켄칭 스팟(quenching spot)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molisch), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reactions)에서는 음성을 나타낸다. 그리고, 항생물질 WAP-8294A, A1, A2및 A4의 아미노산 조성물을 조사하기 위해 이들 각각을 산으로 완전히 가수분해하고, 2차원(two dimension) TLC와 아미노산 분석법을 시행한 결과, 이들 각각은 3종의 미확인 아미노산외에 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), 로이신(Leu), 세린(Ser), 트립토판(Trp) 및 오르니틴(Orn)으로 구성되어 있음을 알 수 있다.
항생물질 WAP-8294A의 2차원 TLC 분석결과는 제5도에 나타낸 바와 같다.
또한, 미확인 아미노산 -1과 -2 및 -3을 규명하기 위해 산으로 WAP-8294A를 다시 가수분해함으로써 분리하였다. 그 미확인 아미노산 -1과 -2 및 -3은 여러가지 기구분석을 통해 각각 β-하이드록시아스파르트산, N-메틸발린 및 N-메틸페닐알라닌염이 밝혀졌다.
한편, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시-7-메틸옥탄산 또는 3-하이드록시-8-메틸노난산을 WAP-8294A, A1, A2또는 A4의 산-가수분해에 의해 얻어진 각 용액을 에테르로 추출한 추출물로부터 분리하였다.
또한, 항생물질 WAP-8294AX는 최소한 13개의 분획, 즉 AX-1 : 체류시간 5.3분; AX-2 : 체류시간 5.9분; AX-3 : 체류시간 6.2분; AX-4 : 체류시간 6.5분; AX-5 : 체류시간 6.9분; AX-6 : 체류시간 7.3분; AX-7 : 체류시간 8.1분; AX-8 : 체류시간 9.3분; AX-9 : 체류시간 9.8분; AX-10 : 체류시간 11.3분; AX-11 : 체류시간 12.1분; AX-12 : 체류시간 13.7분; AX-13 : 체류시간 15.0분으로 나누어지고, 이는 제6도에 나타낸 C18역상실리카겔 -HPLC의 크로마토그램에서 분명하게 확인된다.
항생물질 WAP-8294AX, AX-8, AX-9 및 AX-13은 273nm, 280nm 및 289nm의 UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) 파장(λmax)을 갖는다.
또한, WAP-8294AX, AX-8, AX-9 및 AX-13은 후술하는 이들의 산-가수분해물의 분석에 의해 확인되듯이 분자내에 발색단으로서 1몰의 트립토판을 가지고 있음이 분명하다.
항생물질 WAP-8294AX-8의 UV 흡수 스펙트럼 챠트는 제7도에 나타낸다.
항생물질 WAP-8294AX, AX-8, AX-9 및 AX-13의 적외선 흡수분광분석에 의해 각각 OH와 NH기는 3300㎝-1, 카르복실기 또는 에스테르카르보닐기는 1720 ~ 1715㎝-1, 아미도 결합은 1636 ~ 1541㎝-1그리고 C-O 신축진동은 1207 ~ 1137㎝-1에서 흡수도를 나타냄을 알 수 있으나 이들이 다른 특징있는 흡수도를 가지고 있지는 않다. 항생물질 WAP-8294AX-8의 IR 흡수 스펙트럼 챠트를 제8도에 나타낸다.
항생물질 WAP-8294AX, AX-8, AX-9 및 AX-13의1H-NMR 분광 측정에서는 메틸, 메틸렌, 메틴, 그리고 헤테로사이클 또는 방향족환으로부터 기인된 수많은 복잡한 H+시그널이 관찰된다. 항생물질 WAP-8294AX-8의1H-NMR 스펙트럼 챠트를 제9도에 나타낸다.
WAP-8294AX-8, AX-9 및 AX-13의 FAB-질량-분광측정에서는 성분 AX-8, AX-9 및 AX-13 각각에 대한 (M+H)+이온의 m/z 값이 각각 1549, 1549 및 1577을 나타낸다. 그리고 성분 AX-8, AX-9 및 AX-13의 나트륨 용융실험을 통해 이들 성분들이 각각 탄소, 수소, 산소 및 질소로 구성된 화합물임을 분명하게 알 수 있다.
다음 표 2의 분자식은 후술하는 이들 성분들을 구성하는 아미노산 및 지방산의 모든 구조 측정과 몰비를 고려하고, 고분해능 FAB-질량-분광측정의 결과로부터 얻어진다.
[표 2]
항생물질 WAP-8294AX, AX-8, AX-9 및 AX-13은 닌하이드린, 에리히, 라이돈-스미스, 요오드증기, 과망간산칼륨 수용액 및 황산반응에서 각각 양성을 나타내고; UV 램프로부터 방사된 254nm의 광선을 가진 조사선을 통해 켄칭 스팟을 보여주며; 그리고 몰리쉬, 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응에서는 음성을 나타낸다.
항생물질 WAP-8294AX, AX-8, AX-9 및 AX-13의 아미노산 조성물을 조사하기 위해 이들 각각을 산으로 완전히 가수분해시키고, 2차원 TLC 분석[셀룰로오스판; 1차 용매 n-부탄올/아세트산/물(4/1/2); 2차 용매 n-부탄올/피리딘/아세트산/물(15/10/3/12); 발색제 : 닌하이드린]과 아미노산 분석을 하였다.
그 결과 항생물질 WAP-8294AX는 닌하이드린 반응에서 양성을 나타내는 아미노산으로서 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), β-알라닌(β-Ala), 로이신(Leu), 세린(Ser), 트립토판(Trp) 및 오르니틴(Orn), 발린(Val), N-메틸발린(N-MeVal), β-하이드록시아스파르트산(β-OH-Asp), 페닐알라닌(Phe) 및 N-메틸페닐알라닌(N-MePhe)으로 구성됨이 확인되었다.
한편, 항생물질 WAP-8294AX을 산으로 완전 가수분해한 가수분해물의 에테르 추출물은 3-하이드록시-7-메틸옥탄산을 함유하고 있음이 확인되었다.
항생물질 WAP-8294, AX-8, AX-9 및 AX-13을 WAP-8294AX와 동일한 방법으로 처리하고, 이들 성분들을 구성하는 아미노산과 지방산은 2차원 TLC 분석과 아미노산 분석 및 산으로 완전 가수분해한 가수분해물의 에테르 추출물의 GC-질량분석에 의해 확인될 수 있다.
항생물질 WAP-8294A2에 대한 WAP-8294AX-8 등의 아미노산 및 지방산의 결과치를 다음 표 3에 나타낸다.
[표 3]
본 발명자들은 항생물질 WAP-8294A, A1, A2, A4, AX-8, AX-9 및 AX-13의 상기한 물리화학적 특성, 산으로 완전히 가수분해한 가수분해물, 이들 항생물질을 구성하는 아미노산과 지방산 등에 기초하여 이들이 공지화합물인지를 조사한 결과 이들이 신규한 물질이라는 긍정적인 증거를 확보하였다.
본 발명의 항생물질 WAP-8294A, A1, A2, A4, AX-8, AX-9 및 AX-13은 라이소박터(Lysobacter)속에 속하는 항생물질 WAP-8294A 생산 박테리아를 배양배지에서 배양하는 단계와 이 항생물질 WAP-8294A를 분리수집 단계, 필요하다면 추가적으로 이들을 분리하고 정제하는 단계로 구성된 방법에 의해 제조될 수 있다.
라이소박터(Lysobacter) 속에 속하는 WAP-8294A 생산 세균의 한 예로는 본 발명자들에 의해 동정분리된 라이소박터 속(Lysobacter sp.) WAP-8294A 균주를 들 수 있는데 이는 일본 시즈오까현 시모다시의 토양에서 분리된 것이다.
이 균주의 세균학적 분류 특성은 다음과 같다.
1. 형태학적 특성
이 균주를 부이용-한천(bouillon-agar) 평판배지에서 25℃로 3일간 배양하였을 때 직경이 0.4 ~ 0.6㎛이고, 길이가 3.2 ~ 4.2㎛인 로드(rod) 형태의 세포가 관찰되었다. 이 균주는 그람 음성균이고 편모가 없으며 활주운동을 하고, 어떤 포자도 형성하지 않으며 항산성(抗酸性)을 나타낸다.
2. 여러가지 배양배지에서 생육상태
이 균주는 다양한 종류의 배지에서 25℃로 3~14일동안 관찰하였다.
(1) 부이용-한천-평판 배양(Bouillon-Agar-Plate Culture)
형성된 콜로니는 반투명하고 엷은 황색의 원형의 형태와, 볼록한 원형표면 및 전체적으로는 파도모양의 외변(periphery)를 갖는다.
이 균주는 어떠한 확산성 색소도 형성하지 않는다.
(2) 부이용-한천-사면 배양(Bouillon-Agar-Slant Culture)
이 균주는 내뻗친 옷(spreaded cloth)의 형태로 성장하고 반투명하고 엷은 황색을 갖는다.
(3) 부이용 액체 배양(Bouillon Liquid Culture)
이 배지는 약간 혼탁하고, 균이 환상(fairy ring)을 형성하며 배지용기의 바닥주위에 세균세포의 침전물이 관찰된다.
(4) 부이용-젤라틴 스탭 배양(Bouillon-Gelatin Stab Culture)
균주는 젤라틴이 액화되는 동안 배지의 표면에서 중간부분까지의 영역내에서 생육한다.
(5) 리트머스-밀크 배양(Litmus-Milk Culture)
균주는 리트머스를 감소시키는 어떤 활동도 보여주지 않고 응고도 생기지 않으나 펩톤화(peptonization) 능력을 갖는다.
(6) 탈지 밀크-아세테이트 한천 배양(Skimmed-Acetate Agar Culture)
균주는 강한 단백질 분해활성을 가지며 한천 평판배지에서 젤 상태의 점성있는 물질을 형성하면서 생육한다.
3. 생리학적 특성
WAP-8294 균주의 생리학적 특성은 다음과 같다.
(1) 질산염의 환원 －
(2) 탈질화반응(denitrification reaction) －
(3) MR 테스트 －
(4) VP 테스트 －
(5) 인돌(indole) 형성 －
(6) 황화수소 형성 －
(7) 녹말 가수분해 －
(8) 구연산 사용
① 코저(Koser) 배양배지 －
② 시몬즈(Simmonds) 배양배지 －
③ 크리스텐센(Christensen) 배양배지 ＋
(9) 무기질소원의 이용
① 질산나트륨 ＋
② 황산암모늄 ＋
③ 글루탐산나트륨 ＋
(10) 색소형성
① 킹(King) A 배양배지 －
② 킹 B 배양배지 －
(11) 우레아제 －
(12) 옥시다제 ＋
(13) 카탈라제(catalase) ＋
(14) 생육온도 15~37℃
(15) 생육 pH 5~8
(16) 산소에 대한 태도 호기적
(17) O-F 테스트 비분해형(non-decomposition type)
(18) 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease) ＋
(19) 포스파타아제 ＋
(20) 용혈성(Hemolysis) β
(21) 셀룰로오스 분해 －
(22) 트윈(Tween)의 분해
① 트윈 20 ＋
② 트윈 40 ＋
③ 트윈 60 ＋
④ 트윈 80 ＋
(23) 콜로이드성 키틴의 분해 ＋
(24) 다당류의 분해
① CMC ＋
② 알긴산 －
③ 펙틴산 －
(25) 용균(溶菌)활성
① 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) ＋
② 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) ＋
③ 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) ＋
(26) GC 함량 68.3%(HPLC 법)
(27) 당으로부터 산과 가스생성
상기한 WAP-8294 균주의 특성결과를 버어지스 메뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.3(1989))에 기재된 세균들과 비교하여 볼때, 본 균주는 편모가 없는 그람 음성 호기성 막대형 균주이고 활주운동을 하기 때문에 활주형 세균(Gliding Bacteria)에 속한다고 결론지을 수 있다.
활주형 세균은 어떠한 자실체(fruiting body)도 형성하지 않는 활주형 세균과 자실체를 형성하는 활주형 세균으로 나뉜다.
본 균주는 어떠한 자실체도 형성하지 않는 세균이다.
자실체를 형성하지 않는 활주형 세균은 세개의 목(order), 즉 사이토파갈레스(Cytophagales), 베기아톨레스(Beggiatoles) 및 라이소박테랄레스(Lysobacterales)로 나뉘는데, 이들은 가장 중요한 특성(key character)인 각 DNA의 GC 함량을 토대로 하여 분명히 구별된다.
이러한 이유로 하여 본 발명의 균주의 DNA는 통상의 방법에 의해 추출되고 이에 따라 이들의 GC 함량은 FEMS 미생물 학회지(FEMS Microbiol. Letters, 1984, 25, P.125)에 기재된 HPLC 방법에 의해 측정된 값이 68.3%로서 높은 수준임을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 균주는 65 ~ 71%의 높은 GC함량을 갖는 라이소박테랄레스 목의 라이소박터(Lysobacter) 속에 속한다고 결론지을 수 있다.
같은 속에 속하는 다른 종류들과 본 발명 균주의 특성을 비교해 보면 본 균주의 특성은 라이소박터 엔자이모게네스(Lysobacter enzymogenes)와 유사하지만 구연산의 이용능과 같은 구체적인 부분에서는 차이가 있다.
따라서, 본 발명의 균주를 라이소박터 속(Lysobacter sp.) WAP-8294로 명명하였다.
이 WAP-8294 균주는 기탁번호 FERM BP-4990(FERM P-14093)로 1994년 1월 31일 일본의 공업기술원(Agency of Industrial Science Technology)내의 생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human Technology)에 기탁되었다.
라이소박터를 포함하는 세균은 일반적 속성상 그들의 분류특성이 매우 쉽게 변하며 WAP-8294도 예외가 아니다.
하지만, 자연스럽게 돌연변이된 변종과 다양한 돌연변이 물질을 가지고 인위적으로 돌연변이시킨 것들을 포함하여 항생물질 WAP-8294A를 생산하는 능력을 가진 모든 미생물은 본 발명의 방법에 의해 사용될 수 있다.
[배양과 생산]
본 발명의 항생물질 WAP-8294A는 상기 WAP-8294A를 생산하는 박테리아를 영양원을 함유하는 배양배지를 접종하고 호기적으로 배양함으로써 제조된다.
항생물질 WAP-8294A를 생산하는 박테리아를 배양할 때에는 그 박테리아는 탄소원으로서 글루코오즈, 프락토오즈, 전분, 덱스트린, 글리세린, 당밀, 전분시럽, 유지류 그리고 유기산 등과 같은 화합물을 흡수 가능한 유기탄소; 질소원으로서 대두분, 목화종자분, 옥수수침지액, 카제인, 펩톤, 효모추출물, 고기추출물, 배아(germ), 우레아, 아미노산 및 암모늄염과 같은 화합물을 함유하는 무기 질소를 사용한 또한, 염으로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘염 및 인산염과 같은 무기염을 단독 또는 혼합 사용할 수 있다.
또한, 배양배지에 철염, 구리염, 아연염 및 코발트염 같은 중금속염과 바이오틴(biotin)과 비타민 B1같은 미생물 생육에 필요한 비타민 및 항생물질 WAP-8294A를 생산하는 박테리아의 성장을 촉진하고 WAP-8294A의 수율을 높일 수 있는 다른 유기 또는/및 무기 물질을 선택적으로 추가할 수 있다.
상기 배양배지에는 실리콘 오일 또는 폴리알킬렌 글리콜 에스테르와 같은 소포제와 계면활성제를 사용할 수도 있다.
본 발명의 균주는 항생물질의 생산에 통상 사용되는 방법으로 배양되지만 침수조건에서 호기 교반배양기술이 호기조건을 유지하는데 바람직하고 플라스크에서 통상 흔드는 배양은 실험실적 배양에 적합하다.
일반적으로 배양은 20 ~ 40℃, 바람직하게는 25 ~ 30℃에서 수행되고, pH는 6 ~ 8, 바람직하게는 7에서 수행한다. 배양시간은 약 2일 내지 6일 정도면 배양배지에서 집적된 WAP-8294A의 목적하는 바의 수율을 올리는데 충분하다.
[분리 및 정제]
배양배지에 집적된 항생물질 WAP-8294A의 회수는 후술하는 본 발명의 항생물질의 물리화학적 성질을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다.
좀더 구체적으로는 항생물질 WAP-8294A는 배양배지의 여과에 의해서도 존재하므로, 배양배지의 여과는 여기에 셀라이트(Celite) 또는 래디오라이트(Radiolite)와 같은 보조여과제를 먼저 추가하고 그 다음으로 감압 또는 원심분리하에서 여과하여 박테리아 세포들을 제거함으로서 이루어진다.
항생물질 WAP-8294A는 각 분자량이 1,400 ~ 1,700의 비교적 큰 화합물로 구성되기 때문에 구체적으로 후술하는 그들의 물리화학적 특성의 견지에서 보면 수용성 폴리펩티드 항생물질로 간주된다.
이들 특성들을 고려하면서 배양배지의 여과물로부터 WAP-8294A를 집적할 때는 다이아이온(Diaion) HP-20, 세파비즈(Sepabeads) sp207, CHP-20(미쯔비시화학공업(주) 제품), 엠버라이트 XAD-2(롬 앤드 하스사 제품) 또는 듀오라이트(Duolite) S-30(다이아몬드 샴록화학사 제품)와 같은 흡착성 수지가 사용되고, 특히 항생물질의 정제에는 활성탄 칼럼 크로마토그래피가 효과적이다.
예를 들어, pH 6.9인 배양배지의 여과를 위해 엠버라이트 IR-120B(H+타입)로 채워진 컬럼을 통과시키고, 그 컬럼을 통과하여 나온 산성액을 여과물을 흡착시키는 어떠한 처리를 하지 않고 활성탄을 채운 컬럼을 통과시킨다.
그 다음으로 물로 세척한 다음 항생물질 WAP-8294A를 회수하기 위한 용출로써 80% 아세톤-물 혼합물 또는 알칼리성의 80% 아세톤-물 혼합물을 사용하여 용출시킨다.
감압하에서 용출액으로부터 아세톤을 증발시킨 후에 얻어진 잔사를 지용성 불순물을 제거하기 위해 산성 조건하에서 에틸아세테이트로 추출한 다음, WAP-8294A를 회수하기 위해 n-부탄올 같은 극성이 매우 높은 유기용매로 다시 추출한다.
낮은 온도에서 추출물로부터 n-부탄올을 증발시킨 후에 그대로 잔사를 건조하여 농축시키고, WAP-8294A를 침전시키기 위해 빈용매(poor solvent)를 잔사농축액에 가한다.
그리고 나서 감압하에서 원심분리 또는 여과를 통해 잔사물질(crude substance)을 얻는다.
이렇게 회수된 잔사물질은 WAP-8294A가 산성조건하에서 n-부탄올과 같은 극성 유기용매로 추출될 수 있기 때문에 원심분리 액상-액상 분획 크로마토그래피, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 같은 흡착 크로마토그래피 및 셀룰로오즈 컬럼 크로마토그래피 같은 분획 크로마토그래피 등을 단독 또는 이들의 혼합사용으로 대표되는 역류 분배방법으로 추가로 정제함으로써 고순도의 물질을 얻을 수 있다.
이와는 달리, 세파덱스 G-10, G-15, LH-20(파마시아사 제품) 또는 바이오겔(Biogel) P-4 겔(Bio-Rad Laboratories사 제품)의 분자체 효과(molecular sieve dffect)를 이용하여, 물, 물함유 메탄올과 같은 물함유 저급알콜, 회석 알칼리 또는 산 수용액, 단독 또는 혼합사용이 가능한 적당한 염을 함유하는 수용액으로 그 물질을 용출시켜 정제할 수도 있다.
또 다른 7개 성분인 AX, A1, A2, A3, A4, A5및 A6은 WAP-8294A를 추가로 정제 및 분리하여 얻어지는데, 예를 들면 상기한 역류분배기술 및/또는 HPLC 기술에 의해 얻어진다.
또 13개의 성분인 AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 및 AX-13은 상기한 방법과 유사한 방법으로 AX 성분을 정제 및 분리하여 얻어진다.
HPLC에 사용되는 충전물질로는 실리카겔, 실리카겔의 실라놀기에 옥타데실과 옥틸기가 화학적으로 결합된 것과 같은 상업적으로 이용되는 우수한 담체 또는 폴리스티렌 형 기공 폴리머 겔(polystyrene type porous polymer gels)과 같은 일반 목적의 담체가 사용될 수 있다.
WAP-8294A와 AX 성분은 높은 효능을 가진 이들 충전물질의 사용으로 개개의 성분으로 분리된다.
HPLC에서 사용되는 이동상은, 예를들면 트리플루오로아세트산, 물함유 메탄올과 같은 물함유 저급알콜 및 완충용액에 의해 산성화된 물함유 아세토니트릴일수 있다.
[물리화학적 성질]
상기한 바와같은 다양한 크로마토그래피 기술을 통해 얻은 WAP-8294A, A1, A2, A4, AX, AX-8, AX-9 및 AX-13, 즉 완전히 산가수분해하여 닌하이드린(ninhydrin) 반응에서 양성이고, 산-가수분해 물질을 에테르로 추출한 추출물의 물리 화학적 성질은 다음에 나타낸 바와 같다.
[항생물질 WAP-8294A]
(1) 외양 : 백색분말
(2) 녹는점 : 213 ~ 220℃(분해됨)
(3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음
(4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon-Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
(5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류시간(Retention Time) : 첨부도면 제1도에 나타낸 바와 같이 4.0 ~ 6.1분, 8.0분, 11.1분, 12.5분, 16.5분, 17.9분 및 18.8분임
(6) UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) :
λmax : 275nm, 280nm, 287nm
(7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
3300cm-1, 1720~1715cm-1, 1636cm-1, 1541cm-1, 1404cm-1, 1207cm-1, 1137cm-1
(8) 분자량 : 1,400 ~ 1,700
(9) 유기 화합물에 대한 정성분석(Na-용융방법) : 본 항생물질은 탄소, 수소, 산소 및 질소원소로 구성된 화합물임.
(10) 완전한 산 가수분해는 닌하이드린-양성물질로서 Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Trp, Orn, N-메틸발린, β-하이드록시아스파르트산 및 N-메틸페닐알라닌을 제공한다.
(11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+42°(C=0.5, H2O)
(12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
[항생물질 WAP-8294A1]
(1) 외양 : 백색분말
(2) 녹는점 : 215 ~ 225℃(분해됨)
(3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음.
(4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
(5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류시간(Retention Time) : 8.0분
(6) UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) :
λmax : 275nm, 280nm, 287nm
(7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
3300cm-1, 1720 ~ 1715cm-1, 1636cm-1, 1541cm-1, 1404cm-1, 1207cm-1, 1133cm-1
(8) 분자량 : 1547.9[FAB-MS m/z 1548.9(M+H)+, m/z 1546.7(M-H)-]
(9) 분자식 : C72H109O21N17[HR FAB-질량에 의해 측정된 (M+H)+의 m/z 측정치 : 1548.8088 : m/z 계산치 : 1548.8063]
(10) 완전한 산 가수분해는 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 3-하이드록시옥탄산(1몰)을 제공한다.
(11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+41°(C=0.5, H2O)
(12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
[항생물질 WAP-8294A2]
(1) 외양 : 백색분말
(2) 녹는점 : 215 ~ 225℃(분해됨)
(3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음.
(4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
(5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류시간(Retention Time) : 11.1분
(6) UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) : 첨부도면 제2도에 나타난 바와 같이 λmax : 275nm(E1cm 1%31.8), 280nm(E1cm 1%33.4), 287nm(E1cm 1%29.2)
(7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 첨부도면 제3도에 나타낸 바와 같이 특성 흡수 스펙트럼 : 3300cm-1, 1720 ~ 1715cm-1, 1636cm-1, 1541cm-1, 1404cm-1, 1207cm-1, 1137cm-1
(8)1H-NMR 스펙트럼(270 MHz, D2O) : 첨부도면 제4도에 나타낸 바와 같이 메틸, 메틸렌, 메틴, 그리고 헤테로사이클 또는 방향족환들로부터 기인한 복잡한 H+시그널이 관측됨
(9) 분자량 : 1561.9[FAB-질량 m/z 1562.9(M+H)+, m/z 1561.2(M-H)-]
(10) 분자식 : C73H111O21N17[HR FAB-질량에 의해 측정된 (M+H)+이온의 m/z 측정치 : 1562.8224 : m/z 계산치 : 1562.8219]
(11) 완전한 산 가수분해는 가수분해물질로서 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(1몰)을 제공한다.
(12) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+42°(C=0.5, H2O)
(13) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
[항생물질 WAP-8294A4]
(1) 외양 : 백색분말
(2) 녹는점 : 215 ~ 225℃(분해됨)
(3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음.
(4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
(5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류시간(Retention Time) : 16.5분
(6) UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) :
λmax : 275nm, 280nm, 287nm
(7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
3300cm-1, 1720 ~ 1715cm-1, 1636cm-1, 1541cm-1, 1404cm-1, 1207cm-1, 1137cm-1
(8) 분자량 : 1575.9[FAB-질량 m/z 1576.9(M+H)+, m/z 1575.4(M-H)-]
(9) 분자식 : C74H113O21N17[HR FAB-질량에 의해 측정된 (M+H)+의 m/z 측정치 : 1576.8363 : m/z 계산치 : 1576.8375]
(10) 산 가수분해는 가수분해 물질들로서 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 3-하이드록시-8-메틸노난산(1몰)을 제공한다.
(11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+43°(C=0.5, H2O)
(12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
상기 항생물질 WAP-8294A, A1, A2및 A4의 C18역상 실리카겔-HPLC에 대한 용출조건은 다음과 같다.
컬럼 : YMC A-312(6×150nm)
이동상 : 0.5% 트리플루오로 아세트산을 함유한 아세토니트릴 / 증류수(45/55)
검출파장 : UV 214nm
유속 : 1㎖/분
[항생물질 WAP-8294AX]
(1) 외양 : 백색분말
(2) 녹는점 : 196 ~ 200℃(분해됨)
(3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음.
(4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
(5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류시간(Retention Time) : 첨부도면 제6도에 나타낸 바와 같이 5.3분, 5.9분, 6.2분, 6.5분, 6.9분, 7.3분, 8.1분, 9.3분, 9.8분, 11.3분, 12.1분, 13.7분 및 15.0분임
(6) UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) :
λmax : 273nm, 280nm, 289nm
(7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
3300cm-1, 1720 ~ 1715cm-1, 1636cm-1, 1541cm-1, 1404cm-1, 1207cm-1, 1137cm-1
(8) 분자량 : 1,400 ~ 1,700
(9) 유기 화합물에 대한 정성분석(Na-용융방법) : 본 항생물질은 탄소, 수소, 산소 및 질소원소로 구성된 화합물임
(10) 완전한 산 가수분해는 닌하이드린-양성물질과 지방산으로 Asp, Glu, Gly, β-Ala, Leu, Ser, Trp, Orn, Val, N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산, Phe, N-메틸페닐알라닌 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산을 제공한다.
(11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+24°(C=0.5, H2O)
(12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
[항생물질 WAP-8294AX-8]
(1) 외양 : 백색분말
(2) 녹는점 : 196 ~ 200℃(분해됨)
(3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음.
(4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
(5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류시간(Retention Time) : 9.3분
(6) UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) : 첨부도면 제7도에 나타난 바와 같이 λmax : 273nm, 280nm, 289nm
(7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 첨부도면 제8도에 나타낸 바와 같이 특성 흡수 스펙트럼 : 3300cm-1, 1720 ~ 1715cm-1, 1636cm-1, 1541cm-1, 1404cm-1, 1207cm-1, 1133cm-1
(8)1H-NMR 스펙트럼(270 MHz, DMSO-D6) : 첨부도면 제9도에 나타낸 바와 같이 메틸, 메틸렌, 메틴, 그리고 헤테로사이클 또는 방향족환들로부터 기인한 복잡한 H+시그널이 관측됨
(9) 분자량 : 1548[FAB-MS m/z 1549(M+H)+]
(10) 분자식 : C72H109O21N17[HR FAB-질량에 의해 측정된 (M+H)+의 m/z 측정치 : 1548.8079 : m/z 계산치 : 1548.8063]
(10) 완전한 산 가수분해는 가수분해로서 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), Val(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(1몰)을 제공한다.
(11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+25°(C=0.5, H2O)
(12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
[항생물질 WAP-8294AX-9]
(1) 외양 : 백색분말
(2) 녹는점 : 216 ~ 220℃(분해됨)
(3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음.
(4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
(5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류시간(Retention Time) : 9.8분
(6) UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) :
λmax : 273nm, 280nm, 289nm
(7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
3300cm-1, 1720 ~ 1715cm-1, 1636cm-1, 1541cm-1, 1404cm-1, 1207cm-1, 1137cm-1
(8) 분자량 : 1548[FAB-MS m/z 1549(M+H)+, m/z 1547(M-H)-]
(9) 분자식 : C72H109O21N17[HR FAB-질량에 의해 측정된 (M+H)+의 m/z 측정치 : 1548.8065 : m/z 계산치 : 1548.8063]
(10) 산 가수분해는 가수분해물질로서 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), Phe(1몰) 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(1몰)을 제공한다.
(11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+28°(C=0.5, H2O)
(12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
[항생물질 WAP-8294AX-13]
(1) 외양 : 백색분말
(2) 녹는점 : 205 ~ 210℃(분해됨)
(3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음.
(4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
(5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류시간(Retention Time) : 15.0분
(6) UV 흡수 스펙트럼(물, H2O) :
λmax : 273nm, 280nm, 289nm
(7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
3300cm-1, 1720 ~ 1715cm-1, 1636cm-1, 1541cm-1, 1404cm-1, 1207cm-1, 1137cm-1
(8) 분자량 : 1576[FAB-MS m/z 1577(M+H)+]
(9) 분자식 : C74H113O21N17[HR FAB-질량에 의해 측정된 (M+H)+의 m/z 측정치 : 1576.8324 : m/z 계산치 : 1576.8375]
(10) 완전한 산 가수분해는 가수분해물질로서 Asp(1몰), Glu(1몰), β-Ala(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(1몰)을 제공한다.
(11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+27°(C=0.5, H2O)
(12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
상기 항생물질 WAP-8294AX, AX-8, AX-9 및 AX-13의 C18역상 실리카겔-HPLC에 대한 용출조건은 다음과 같다.
컬럼 : YMC A-312(6×150mm)
이동상 : 0.05％ 트리플루오로 아세트산을 함유한 아세토니트릴 / 증류수(37/ 63)
검출파장 : UV 214nm
유속 : 1ml/ 분
[생물학적 성질]
(1)항균활성
상기 WAP-8294A, A1, A2및 A4의 항균활성 실험결과는 다음 표 4에 나타낸 바와 같다.
최소 생육저지농도(MIC)의 측정은 감수성 부이용(bouillon) 배치(Eiken Chemical Co. 제품)를 이용한 브로스 희석법(broth dilution method)으로 측정하였다.
다음 표 4에 나타난 결과로부터 WAP-8294A, A1, A2및 A4는 MRSA(메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus))를 포함한 그람 양성균에 대한 매우 강한 항균활성도를 나타내고, 그리고 10％ 소의 혈청을 상기 배지에 첨가할 때 배지에서 관찰되는 활성도에 비해 그렇지 않은 경우 적어도 8배 정도 활성도가 증가하는 것을 알 수 있다.
반면에, 그람-음성균, 진균 및 효모에 대해서는 어떤 활성도 나타내지 않는다.
[표 4a]
[표 4b]
항생물질 WAP-8294AX, AX-8, AX-9 및 AX-13의 항균 활성도도 유사하게 관찰되며, 그 결과는 다음 표 5에 나타낸 바와같다. 이 물질들의 최소 생육저지농도(MIC)의 측정은 MRSA에 대해 2％ 염화나트륨이 첨가된 뮬러-힌튼 브로스(broth)(DIFCO사 제품)와 다른 세균에 대해 그대로 뮬러-힌튼 브로스를 이용한 브로스 희석법으로 시행하였다.
다음 표 5에 나타난 결과로부터 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함한 그람 양성균에 대한 매우 강한 항균활성도를 나타내고, 그리고 10％ 소의 혈청을 첨가하였을 때의 활성도에 비해 첨가하지 않은 배지에서 적어도 2배 정도 활성도가 증가함을 알 수 있다.
반면에, 그람-음성균, 진균 및 효모에 대해서는 어떤 활성도 나타내지 않는다.
[표 5a]
[표 5b]
(2) 쥐내에서 실험적 MRSA감염에 대한 WAP-8294A의 방어능
항생물질WAP-8294A가 상기 표 4에서 보여진바, 그들이 in vitro상에서 항균 활성도로부터 보여진 바와같이 MRSA를 포함한 그람 양성균에 대해 매우 강한 항균 활성도를 보여주기 때문에 MRSA임상분리균 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) NO.1가 갖는 감염으로부터 쥐를 방어하는 것에 대한 시험을 실시하였다.
실험은 감염 3일전 ICR-MCH계 쥐[4주령의 수컷 쥐(Nippon CLEA사), 군당 8마리]에 0.5㎎/ 0.5ml/ 쥐 양의 시클로포스파마이드(Cyclophosphamide)를 복강내 투여(intra-peritoneally administering)하고, 그리고 나서 5％ 뮤신으로서 첨가된 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) NO.1 균주 2×106/ ml를 함유하는 0.5ml 액체를 복강내 투여하여 동물을 감염시킴으로써 실행하였다. 감염 1시간 후, 10㎎/㎏의 반코마이신(Vancomycin HC1, 시오노기사 제품)과 각각 10㎎/㎏, 5㎎/㎏, 2.5㎎/㎏, 1.0㎎/㎏, 0.5㎎/㎏, 0.25㎎/㎏, 0.1㎎/㎏ 또는 0.05㎎/㎏ 함량의 항생물질 WAP-8294A를 쥐에 0.2㎖씩 각각 피하에 주입하였다. 무처리 대조군은 생리식염수를 각각 0.2ml 피하적 투여한 것으로 하였다.
이와같은 실험의 결과는 다음 표 6에 나타낸 바와 같은 바, 모든 무처리 대조군은 어떤 처치에도 감염 후 3일 내에 죽었다. 반면에 항생물질 투여군, 즉 10㎎/㎏ 반코마이신이 복용된 여덟마리 중 다섯마리는 감염 후 5일까지 생존하였다.
이와는 반대로, WAP-8294A는 다음 표 6에 나타낸 바와같이 저투여량에서 우수한 치료효과를 보여준다. 항생물질 WAP-8294A의 ED50값은 프로빗(probit) 법으로 측정한 결과 0.155㎎/㎏이었다.
[표 6]
항생물질 WAP-8294AX가 상기 표 5에서처럼 in vitro상에서의 항균 활성도에서와 같이 MRSA를 포함한 그람-양성균에 대해 강한 항균 활성도를 나타내기 때문에, MRSA 임상분리균 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) JCM 8702의 감염으로부터 쥐를 방어하는 것에 대한 시험을 실시하였다.
실험은 감염 3일전 ICR-MCH계 쥐[4주령의 수컷 쥐(Nippon CLEA사), 군당 8마리]에 0.5㎎/ 0.5ml/ 쥐 양의 시클로포스파마이드(Cyclophosphamide)를 복강내 투여(intra-peritoneally administering)하고, 그리고 나서 5％뮤신으로서 첨가된 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) JCM 8702균주 2×104/ml를 함유하는 0.5ml 액체를 복강내 투여하여 동물을 감염시킴으로써 실행하였다. 감염 1시간후, 10㎎/㎏의 반코마이신 HC1(Vancomycin HC1, 시오노기사 제품)과 각각 10㎎/㎏, 2.5㎎/㎏, 1.0㎎/㎏ 또는 0.5㎎/㎏ 함량의 항생물질 WAP-8294A를 쥐에 0.2ml씩 각각 피하에 주사하였다. 무처리 대조군은 생리식염수를 각각 0.2ml 피하적 투여한 것으로 하였다.
상기 실험의 결과는 다음 표 7에 나타낸 바와 같은 바, 8마리 대조군중 6마리는 어떤 처치에도 감염 후 3일 이내에 죽었다. 반면, 항생물질 투여군, 즉 반코마이신을 10㎎/㎏복용한 8마리중 다섯마리가 감염 후 5일까지 생존하였다.
이와는 반대로, WAP-8294AX는 다음 표 7에 나타낸 바와같이 저투여량에서 우수한 치료효과를 보여준다. 항생물질 WAP-8294AX 의 ED50값은 프로빗(probit)법으로 측정한 결과 1.25㎎/㎏이었다.
[표 7]
(3) 쥐에서의 급성독성시험
항생물질 WAP-8294A를 25㎎/㎏, 50㎎/㎏, 100㎎/㎏ 또는 250㎎/㎏의 용량으로 쥐(4주령 ICR-MCH 수컷 : 군당 다섯마리)에 정맥내 투여하였다. 그러나 어떤 급성독성도 관찰되지 않았다.
항생물질 WAP-8294AX 를 25㎎/㎏ 또는 100㎎/㎏ 용량으로 쥐(4주령 ICR-MCH 수컷 : 군당 다섯마리)에 정맥내 투여하였으나 어떤 급성독성도 관찰되지 않았다.
상기의 결과로부터, 항생물질 WAP-8294A, A1, A2, A3, A4, A5, A6, AX, AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 및 AX-13은 사람과 동물에서 세균 전염성 질병, 특히 메티실린내성 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감염에 의한 전염성 질병을 치료하는데 치료제로서 유용함을 알 수 있다.
[적용]
본 발명의 신규한 항생물질이 의약품으로서 투여된다면, 통상의 방법에 의해 다양한 제형으로 투여될 수 있다. 예를들어 분말, 과립, 정제, 캡슐 및 시럽과 같은 경구적 복용으로 사용될 수 있고, (정맥내, 근육내, 피하)주사제, 점적제, 좌약, 도포제 및 연고제와 같이 비경구적으로 안전하게 사용될 수 있다. 더구나, 본 발명의 신규한 항생물질은 반코마이신에 비해 빠른 살균속도, 그리고 저농도에서 효과를 고려한다면 점안제와 점안 연고와 같은 비경구적 투여에 있어 눈치료제로 안전하게 사용될 수 있다.
이들 다양한 약품 제제들은 통상의 방법으로 제조되는데, 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
필수 성분내에, 제약적으로 허용되며 계속적으로 사용되어 알려진 부형제, 결합제, 붕괴제, 외피제, 윤활제, 안정화제, 교미교취제, 용해보조제, 현탁제 및 희석제와 같은 첨가물을 넣고 혼합하면 원하는 제형의 약제가 제조된다.
약제의 투여량은 치료하고자 하는 병 투여경로 및 투여회수에 따라 다른데, 바람직하게는 일회 또는 수회투여하는 성인에 대해 1일 5~2000㎎을 투여하는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
4개의 500ml 삼각플라스크에 글루코스 2.5％, 탈지방 대두분 2.0％, 대두유 0.4％, 염화나트륨 0.25％ 및 탄산칼슘 0.5％를 함유하는 배양배지(pH 7.2) 100ml를 첨가하고, 교반한 후 사면(slant) 한천배지에서 배양한 라이소박터 속(Lysobacatersp.) WAP-8294 균주 각각을 일백금이(白金耳)씩 이들 배지에 접종한 다음, 180왕복/ 분 속도로 회전 셰이커내에서 플라스크를 왕복 운동하면서 2일동안 30℃에서 배양하였다.
상기 배지 100ml를 500ml 삼각플라스크(No. 150)에 첨가하고 교반하였다. 그리고 배양액 2ml씩 그것을 접종하고 180 왕복/분 속인 회전 셰이커에서 플라스크를 왕복하면서 30℃에서 4일동안 배양하였다. 항균 활성도는 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) No. 1을 이용한 한천 평판법으로 측정하였다.
[실시예 2]
상기 실시예 1에서 얻은 배양액을 계속적으로 9,000 rpm으로 원심분리하여 상청액(supernatant) 15ℓ를 얻었다. 상청액(pH 6.9)을 앰버라이트 IR-120B(Amberlite IR-120B, H+타입, 1.5ℓ, 롬 앤드 하스사 제품)로 충전된 컬럼으로 옮겨 유출액 15ℓ와 수용성 세척액 3ℓ를 얻었다. 유출액과 세척액을 혼합하고 pH3으로 조절한 후에, 혼합액을 활성탄(700ml, Wako Pure Chemical사 제품)으로 충전된 컬럼으로 옮겨 크로마토그래피법으로 분리하였다.
증류수 4ℓ로 세척한 후, 활성물질을 80％ 아세톤-물 4ℓ와 80％ 아세톤-물(pH12)을 용출액으로 하여 용출하였다. 용출액을 800ml로 농축하고, 염산으로 pH3으로 조정한 다음, 에틸 아세테이트(400ml ×3), n-부탄올(400ml ×3)로 추출하였다. 부탄올상을 농축하고 그것을 동결건조하여 6.4ｇ의 잔사 생성물(염산염)을 얻었다.
[실시예 3]
상기 실시예 2에서 얻어진 잔사 물질 6.4ｇ을 셀룰로오스(450ml, E. 머크사 제품)로 충전된 컬럼에서 크로마토그래피하여 용출하고 용출액을 아세토니트릴-아세트산-물(75 : 1 : 25)로 하여 분획하였다. 활성분획을 모으고, 농축한 다음 동결건조하여 WAP-8294A(염산염) 880㎎을 얻었다(백색분말).
[실시예 4]
상기 실시예 3에서 얻어진 WAP-8294A 700㎎을 옥타데실 실리카겔로 충전된 역상 HPLC[컬럼 : YMC-겔 SH-343-5, 20×250mm, Yamamura Chemical Research Laboratory사 제품, 이동상 : 아세토니트릴(0.05％ 트리플로로아세트산 함유) : 물(45 : 55)]에 십수회로 나누어 주입하여 WAP-8294A1, A2및 A4를 포함하는 분획을 모았다. 그리고 각 분획을 농축하여 WAP-8294A1(50㎎), A2(210㎎) 및 A4(16㎎)을 백색 분말(염산염)로 얻었다.
[실시예 5]
WAP-8294A의 아미노산 분석
상기 실시예 3에서 얻어진 WAP-8294A 5㎎을 0.2％ 3-(2-아미노메틸)인돌이 첨가된 4N 메탄설폰산 0.5ml에 녹이고, 110℃에서 24시간동안 완전히 가수분해 하였다. 얻어진 가수분해액을 농축하여 건조하고, 소량의 물에 녹인다. 그리고나서, 이 용액을 Dowex 50WX-8(H+타입, 1ml, 다우케미칼사)로 충전된 컬럼으로 옮겨, 물 20ml로 세척한 다음 0.5N 암모니아수 20ml로 용출하였다. 용출액을 농축하여 건조하고, 소량의 물에 녹인 후 2차원 TLC[셀룰로오즈 판; 전개용매 1 : n-부탄올 : 아세트산 : 물(4 : 1 : 2) ; 전개용매 2; n-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물(15 : 10 : 3 : 12)]를 통해 분리하였다. 그리고 히타치 아미노산 분석기(Hitachi Amino Acid Analyzer L-8500)으로 아미노산을 분석한 결과 용출물은 세가지의 미확인 아미노산을 포함하여 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Ser(2몰), Leu(1몰), Trp(1몰) 및 Orn(2몰)로 구성되어 있음을 확인하였다.
항생물질 WAP-8294A의 2차원 TLC분석결과는 첨부도면 제5도에 나타낸 바와 같다.
[실시예 6]
미확인 아미노산 동정
상기 실시예 3에서 제조된 WAP-8294A 100㎎에 4％ 티오글리콜산(thioglycollic acid)을 함유하는 6N HCL 용액 10ml를 첨가하여 110℃에서 20시간동안 가수분해하였다. 가수분해액을 농축한 후 pH를 7.0으로 조절한 다음 세파비드 SP207 (Sepabeads SP207, 미쯔비시 케미칼 인더스트리 제품)을 사용한 컬럼크로마토그래피로 옮겨 물로 전개하였다. 미확인 아미노산-1 함유하는 용출액량 18~27 ml의 분획을 농축하고 도웩스 50WX-8(Dowex 50 WX-8, H+타입, 9ml)로 충전된 컬럼으로 옮겼다. 0.1N HC1용액으로 용출한 후, 용출액을 농축하여 건조함으로써 미확인 아미노산-1(염산염)을 백색 분말로 4㎎얻었다.
상기 아미노산은 분자량이 149[FAB-MS m/ z : 150(M+H)+]이고1H-NMR 스펙트럼[D2O, 270 MHz; 화학적 이동: σ(ppm)] 분석결과 4.53(1H, d, J=2.9 Hz)과 5.00(1H, d, J=2.9 Hz)에서 피크가 나타났다. 이는 β-하이드록시 아스파르트산임을 뒷받침한다. 시그마(Sigma)사 제품인 β-하이드록시 아스파르트산(염산염)과 상기 시료를 비교하였을 때,1H-NMR 스팩트럼(화학적이동)과 미확인 아미노산-1 (HC1)을 전기용매, n-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물(15 : 10 : 3 : 12)의 비율로하여 셀룰로오즈 TLC하여 측정된 Rf치(0.20)는 완전하게 실제 시료와 일치되며, 따라서 미확인 아미노산-1을 β-히드록시아스파르트산으로 동정하였다.
또한, 세파비드 SP207(Sepabeads SP207)로부터 용출액량 30ml~45ml로 용출시키고 미확인 아미노산-2을 함유하는 분획을 농축하고 활성탄 10ml로 충전된 컬럼에서 전개하여 용출액량 24ml~34ml의 용출분획을 모았다. 그리고, 이것을 도웩스 50 WX-8(Dowex 50 WX-8) 컬럼(1ml)에 옮겨 0.5N NH4OH용액으로 용출하였으며, 농축 건조하여 백색분말로서 미확인 아미노산-2 2.1㎎ 을 얻었다.
이 아미노산의 분자량은 131[FAB-MS m/z : 132(M+H)+이고1H-NMR 분석[D2O, 270 MHz; 화학적 이동 : δ(ppm)]분석결과 1.18(6H, dd, J=7.0Hz), 2.38(1H, dq, J=4.8, 7.0Hz), 2.87(3H, s) 및 3.55(1H, d, J=4.8Hz)에서 피크가 나타났다. 이것으로 보아 이 물질을 N-메틸발린으로 추측하였다. 따라서, 이같은 아미노산을 시그마사 제품인 N-메틸-DL-발린과 비교하였으며, 그 결과1H-NMR 스팩트럼(화학적 이동)과 전개용매를 n-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물(15 : 10 : 3 : 12)의 비로 하여 셀룰로오즈 TLC분석한 결과 Rf값이 0.71로서 시판제품과 완전히 동일하였다. 그러므로 본 미확인 아미노산-2을 N-메틸발린으로 동정하였다.
그밖에도 세파비드 SP207(Sepabeads SP207)컬럼으로부터 80％ 아세톤을 사용하여 용출되었으며 미확인 아미노산-3를 함유하는 분획을 농축하고 도웩스 50 WX-8 컬럼(Dowex 50 WX-8 column, H+ 타입, 1ml)에 옮겼다.
그리고나서, 그것을 1N HC1 용액으로 용출하고 용출액을 농축하여 건조함으로써 미확인 아미노산-3 (염산염) 3.5㎎을 백색 분말로 얻었다. 이 아미노산의 분자량은 179[FAB-MS m/ z : 180(M+H)+]이고1H-NMR 스펙트럼 분석결과[D2O, 270 MHz; 화학적 이동 : δ(ppm)] 2.78(1H,s), 3.32(2H, d, J=6.2Hz), 3.95(1H, t, J=6.2Hz), 7.4~7.5(5H, m)에서 피크가 나타나는 것으로 보아, 이물질을 N-메틸페닐알라닌으로 추측하였다.
따라서, 이 아미노산을 시그마 제품인 N-메틸-L-페닐알라닌과 비교하였으며, 그 결과1H-NMR 스펙트럼(화학적 이동)과 전개용매를 n-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물(15 : 10 : 3 : 12)의 비인 것으로 한 셀룰로오즈 TLC에서 측정된 Rf값(0.82)이 시판제품과 동일하였다. 따라서, 본 미확인 아미노산-3을 N-메틸페닐알라닌으로 동정하였다.
[실시예 7]
WAP-8294A1, A2및 A4의 아미노산 분석
상기 실시예 4에서 얻은 WAP-8294A1, A2및 A4각각 30㎍을 6N HC1 용액으로 110℃에서 2시간동안 가수분해하였다. 그 결과, 이들 각각은 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Ser(2몰), Leu(1몰), Orn(2몰), Trp(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸발린(1몰) 및 N-메틸페닐알라닌(1몰)로 구성되어 있었다.
[실시예 8]
WAP-8294A1, A2및 A4를 구성하는 지방산의 분리와 그들의 구조
(1) 상기 실시예 4에서 얻은 WAP-8294A110㎎을 6N HCl로 110℃에서 2시간동안 가수분해하였다. 가수분해액을 에테르로 추출하였으며 에테르층을 농축하여 건조한 결과 백색 분말 0.8㎎을 얻었다. 이 물질의 분자량은 160[FAB-MS m/ z : 161(M+H)+]이고 1H-NMR 스펙트럼 분석[CDC13, 270 MHz; 화학적 이동 : δ(ppm)결과 0.89(3H, t, J=7.0, Hz), 1.3~1.55(8H, m), 2.46(1H, dd, J=16.5, 8.8Hz), 2.58(1H, dd, J=16.5, 3.3Hz) 및 4/03(1H, m)에서 피크가 나타났고 그로써 이 물질을 3-하이드록시옥탄산으로 추정하였다. 이 물질 100㎍을 벤젠과 메탄올이 8 : 2로 혼합된 용매 0.1ml에 녹이고 여기에 트리메틸실릴 디아조메탄(도쿄 케미칼 인더스트리 제품)을 적가하여 상온에서 10시간동안 반응시켜 메틸에스테르로 전환시켰다. 이 메틸에스테르 유도체를 EI-MS측정한 결과 m/z가 173(M+-1)에서 이온피크가 관찰되었고 프래그먼트 이온 피크들이 156(M+-18), 143(M+-31) 및 125(M+-31-18)로 나타났으며, 특성 베이스 프래그먼트 이온피크가 m/ z 103에서 3-하이드록시 지방산 메틸에스테르의 C3-C4의 절단으로부터 기인하여 나타났다. 따라서, 이 물질을 3-하이드록시옥탄산으로 규정하였다.
(2) WAP-8294A210㎎으로 상기와 같은 방법으로 산으로 가수분해하고, 에테르로 추출하고 에테르층을 농축 건조하여 0.9㎎의 백색 분말을 얻었다. 이 물질의 분자량은 174[FAB-MS m/z : 175(M+H)+]이고,1H-NMR 스펙트럼 분석[CDC13, 270 MHz; 화학적 이동 : δ(ppm)] 결과 0.87(6H, d, J=6.6 Hz), 1.15~1.56(7H, m), 2.50(1H, dd, J=16.5, 8.8Hz), 2.60(1H, dd, J=16.5, 3.3Hz) 및 4.03(1H, m)에서 피크가 나타났다.
그리고 그것들의 메틸에스테르 유도체들은 m/z 값 187(M+-1), 170(M+-18), 157(M+-31), 139(M+-31-18) 및 103(C3-C4결합의 절단으로부터 기인한 베이스 프래그먼트 이온 피크)등의 EI-MS피크를 나타내었다. 따라서, 이 물질을 3-하이드록시-7-메틸옥탄산으로 규정하였다.
(3) WAP-8294A410㎎으로 상기와 같은 방법으로 산으로 가수분해하고, 에테르로 추출하고 에테르층을 농축 건조하여 0.8㎎의 백색 분말을 얻었다. 이 물질의 분자량은 188[FAB-MS m/z : 189(M+H)+]이고1H-NMR 스펙트럼 분석[CDCL3, 270 MHz; 화학적 이동 : δ (ppm)] 결과 0.80(6H, d, J=6.8 Hz), 1.15~1.6(9H, m), 2.43(1H, dd, J=16.5, 8.8Hz), 2.50(1H, dd, J=16.5, 3.3Hz) 및 3.95(1H, m)에서 피크가 나타났다.
그리고 그것들의 메틸에스테르 유도체들은 m/z 값 201(M+-1), 184(M+-18), 171(M+-31), 153(M+-31-18) 및 103(C3-C4결합의 절단으로부터 기인한 베이스 프래그먼트 이온 피크)등의 EI-MS 피크를 나타내었다. 따라서, 이 물질을 3-하이드록시-8-메틸노난산으로 규정하였다.
[실시예 9]
상기 실시예 2와 같은 방법으로 얻어진 잔사 물질 9.0ｇ을 옥타데실 실리카겔(Chromatolex ODS-DM1020T, 후지 실리시아 케미컬사, 450ml)로 충전된 컬럼으로 옮겨 크로마토그래피하였다. 그리고나서 용출하고 0.05％트리플루오로아세트산을 함유한 아세토니트릴 : 물(4 : 6)의 비인 전개용매로 분획하였다. 활성분획들을 모으고, 농축한 다음 동결건조하여 WAP-8294AX(염산염)을 백색 분말로 450㎎ 얻었다.
[실시예 10]
상기 실시예 9에서 얻은 WAP-8294AX 120㎎을 옥타데실 실리카겔로 충전된 HPLC용 컬럼[컬럼 : YMC-GEL SH-343-5, 20×250 mm, 야마무라 케미컬리서어치 레버러터리사 제품; 이동상 : 0.05％ 트리플루오로아세트산을 함유한 아세토니트릴 : 물(37 : 63)]에 십수회로 나누어 주입하고 WAP-8294AX-8, AX-9 및 AX-13을 각각 포함한 분획을 수집하였다. 그리고나서 각 분획을 농축하여 WAP-8294AX-8 14㎎, AX-9 10㎎ 또는 AX-13 12㎎을 백색 분말(염산염)로 제조하였다.
[실시예 11]
WAP-8294AX-8, AX-9 및 AX-13의 아미노산 분석
상기 실시예 10에서 제조된 WAP-8294AX-8 5㎎을 0.2％ 3-(2-아미노메틸)인돌을 첨가한 4N 메탄설폰산 0.5ml에 녹여 110℃에서 24시간동안 산으로 완전가수분해 하였다. 그리고 나서 가수분해액을 농축 건조하여 소량의 물에 녹인 다음, 도웩스 50 WX-8(H+타입, 다우케미컬사, 1ml)로 충전된 컬럼에 옮긴 후 물 20ml로 세척하고 0.5N NH4OH 20ml로 용출하였다.
용출액을 농축하여 건조하여 이를 소량의 물에 녹인 다음 2차원 TLC[1차 전개용매; n-부탄올 : 아세트산 : 물(4 : 1 : 2), 2차 전개용매; n-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물(15 : 10 : 3 : 12)]하고, 히타치 아미노산 분석기(Hitachi Amino Acid Analyser L-8500)로 아미노산을 분석하였다.
그 결과, WAP-8294AX-8은 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Ser(2몰), Leu(1몰), Trp(1몰), Orn(2몰), Val(1몰), N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 β-하이드록시아스파르트산(1몰)로 구성되어져 있음을 밝혔다.
또한, WAP-8294AX-9와 AX-13 각각 5㎎을 상기와 같은 방법으로 산으로 완전 가수분해하고 가수분해물의 아미노산을 분석한 결과, WAP-8294AX-9는 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Ser(2몰), Leu(1몰), Trp(1몰), Orn(2몰), Phe(1몰), N-메틸발린(1몰) 및 β-하이드록시아스파르트산(1몰)로 구성되어져 있었다.
그리고 WAP-8294AX-13은 Asp(1몰), Glu(1몰), β-Ala(1몰), Ser(2몰), Leu(1몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸페닐알라닌(1몰), N-메틸발린(1몰) 및 β-하이드록시아스파르트산(1몰)로 구성되어 있음을 확인하였다.
[실시예 12]
WAP-8294AX-8, AX-9 및 AX-13의 지방산 분석
상기 실시예 10에서 제조된 WAP-8294AX-8, AX-9 및 AX-13 각각 1㎎을 6N HCL로 110℃에서 2시간동안 가수분해 하였다.
각 가수분해액을 에테르로 추출하고, 에테르층을 농축 건조하고 잔사를 벤젠과 메탄올을 8 : 2 부피비로 혼합한 용매 0.1ml에 녹이고 여기에 트리메틸실릴 디아조메탄(도쿄 케미컬 인더스트리 제품)을 적가하여 상온에서 10분동안 반응하여 상기 물질을 메틸에스테르로 전환하였다.
각각의 메틸에스테르 유도체를 GC-MS 분석하였다[컬럼 : DB-5(내경 : 0.25mm; 길이 : 30m; 필름 두께 : 0.25㎛; 제이 앤드 더블유사 제품); 온도 : 100~240℃(가열속도 : 10℃/ 분); 기체상 : 헬륨; 유속 : 0.993ml/ 분].
어떤 경우에 있어서도, GC 분석에서 체류시간(retention time)은 9.7분이고, EI-MS로 측정한 m/z값은 187(M+-1), 170(M+-18), 157(M+-31), 139(M+-31-18) 및 103(C3-C4결합의 절단의 절단으로부터 기인한 특성 베이스 프래그먼트 이온 피크)으로서 WAP-8294A2를 구성하는 지방산인 3-하이드록시-7-메틸옥탄산의 메틸에스테르 유도체에서와 동일하다.
이같은 사실로부터 WAP-82924AX-8, AX-9 및 AX-13 모두가 지방산 성분으로서는 3-하이드록시-7-메틸옥탄산으로 이루어져 있음을 알 수 있다.
[실시예 13]
WAP-8294A의 약제 제조방법
WAP-8294A의 전형적인 약제 제조방법은 다음과 같다.
(1) 주사제(Injection)
일본 약국방해설서 제제총직(12개정판, General Rule for Preparations) 주사제규정에 따라 WAP-8294A(염산염) 40㎎을 무균 생리식염수[일국(日局)]3ml에 녹이고 3ml부피 앰플속으로 무균 충전 후, 용융하여 봉인함으로써 제조하였다.
(2) 정제(Tablet)
일본 약국방해설서 제제총칙(12 개정판, General Rule for Preparations) 정제 규정에 따라 WAP-8294A2(염산염) 100㎎에 부형제로서 락토오즈(일국) 65㎎과 전분(일국) 14.2㎎; 결합제로서 폴리비닐 피롤리돈 K25(일국) 20㎎; 윤활제로서 스테아린산 마그네슘(일국) 0.8㎎을 첨가하고 균일하게 혼합하고, 정제기로 압축 성형하여 1정당 각각 200㎎중량의 소정(素錠)을 제조하였다.
(3) 연고
일본 약국방해설서 제제총칙(12개정판, General Rule for Preparations)연고 규정에 따라 WAP-8294A2(염산염) 40㎎에 폴리에틸렌 글리콜 4000(일국) 1.2g, 폴리에틸렌 글리콜 400(일국) 600㎎, 친수성 바셀린 156㎎(일국), 그리고 항진균제로서 프로필 p-옥시벤조에이트(일국) 0.8㎎과 에틸 p-옥시벤조에이트(일국) 3.2㎎을 첨가하고 용융한 다음 가열하면서 균일하게 반죽하여 연고를 제조하였다(4g/ 접는식 튜브(collapsible tube)).
(4) 점안제
일본 약국방해설서 제제총칙(12개정판, General Rule for Preparations) 점안제규정에 따라 WAP-8294A2(염산염) 25㎎을 0.9％ 무균 식염수 5ml에 녹인 다음 방부제로서 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride, 일국)을 첨가하여 균일하게 녹이고 무균 여과하고 5ml점안용기(eye dropper)에 무균 충전하여 점안제를 제조하였다.
상술한 바와같이 소동물 감염균의 사용을 통하여 본 발명의 신규한 항생물질 WAP-8294A가 그람 양성균의 감염, 특히 최근 의학분야에서 심각한 문제가 되고 있는 MRSA(메틸실린 내성 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus))로 인한 전염병에 있어서 우수한 치료효과를 가짐을 알 수 있었다.
따라서, 상기 항생물질은 전염균으로서 그람 양성균을 갖는 감염을 통해 진전되는 MRSA전염병을 포함한 질병 치료에 대해 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 라이소박터 속(Lysobacter sp.) WAP-8294균주로부터 생산된 것으로 다음과 같은 물리화학적 성질을 갖는 항생물질 WAP-8294A 또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
    (1) 외양 : 백색분말
    (2) 녹는점 : 213~220℃(분해됨)
    (3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음
    (4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon-Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor)반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄.
    (5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류 시간(Retention Time) : 4.0~6.1분, 8.0분, 11.1분, 12.5분, 16.5분, 17.9분 및 18.8분임
    (6) UV흡수 스펙트럼(물, H2O) :
    λmax: 275nm, 280 nm, 287nm
    (7) IR흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특수 흡수 스펙트럼 :
    3300㎝-1, 1720~1715㎝-1, 1636㎝-1, 1541㎝-1, 1404㎝-1, 1207㎝-1,
    1137㎝-1
    (8)1H-NMR 스펙트럼(270 MHZ, D2O) : 메틸, 메틸렌, 메틴, 그리고 헤테로사이클 또는 방향족환으로부터 기인한 복잡한 H+시그널이 관측된다.
    (9) 분자량 : 1,400~1,700
    (10) 유기 화합물에 대한 정성분석(Na-용융방법) : 본 항생물질은 탄소, 수소, 산소 및 질소원소로 구성된 화합물임.
    (11) 완전한 산 가수분해는 닌하이드린-양성물질들로서 Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Trp, Orn, N-메틸발린, β-하이드록시아스파르트산 및 N-메틸페닐알라닌을 제공한다.
    (12) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+42°(C=0.5, H2O);
    (13) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
  2. 다음과 같은 물리화학적 성질을 갖는 항생물질 WAP-8294A1또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
    (1) 외양 : 백색분말
    (2) 녹는점 : 215~225℃(분해됨)
    (3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음.
    (4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine vapor)반응에 있어서 양성을 나타내고, UV램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄.
    (5) HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류 시간(Retention Time) : 8.0분
    (6) UV흡수 스펙트럼(물, H2O) :
    λmax: 275nm, 280nm, 287nm
    (7) IR흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
    3300㎝-1, 1720~1715㎝-1, 1636㎝-1, 1541㎝-1, 1404㎝-1, 1207㎝-1,
    1133㎝-1
    (8) 분자량 : 1547.9[FAB-MS m/z 1548.9(M+H)+, m/z 1546.7(M-H)-]
    (9) 분자식 : C72H109O21N17
    (10) 완전한 산 가수분해는 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰) N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 3-하이드록시옥탄산(1몰) 및 3-하이드록시옥탄산(1몰)을 제공한다.
    (11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+41°(C=0.5, H2O);
    (12) 염기, 산 및 중성분류 : 양쪽성(Amphoteric)
  3. 다음과 같은 물리화학적 성질을 갖는 항생물질 WAP-8294A2또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
    (1) 외양 : 백색분말
    (2) 녹는점 : 215~225℃(분해됨)
    (3)용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음
    (4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon-Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine Vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254 nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며 ; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
    (5) HLPC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류 시간(Retention Time) : 11.1분
    (6) UV흡수 스펙트럼(물, H2O) :
    λmax: 275nm, 280nm, 287nm
    (7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
    3300㎝-1, 1720~1715㎝-1, 1636㎝-1, 1541㎝-1, 1404㎝-1, 1207㎝-1,
    1137㎝-1
    (8) 분자량 : 1561.9 [FAB-질량 m/z 1562.9(M+H)+, m/z 1561.2(M-H)-]
    (9) 분자식 : C73H111O21N17
    (10) 완전한 산 가수분해는 가수분해물질로서 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(1몰)을 제공한다.
    (11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+42°(C=0.5, H2O);
    (12) 염기, 산 및 중성분류 : 양쪽성(Amphoteric)
  4. 다음과 같은 물리화학적 성질을 갖는 항생물질 WAP-8294A2또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
    (1) 외양 : 백색분말
    (2) 녹는점 : 215~225℃(분해됨)
    (3) 용해성 : 물,메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음
    (4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rhdon-Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine Vapor)반응에 있어서 양성을 나타내고, UV램프로부터 방출된 254 nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며 ; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
    (5) HLPC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류 시간(Retention Time) : 16.5분
    (6) UV흡수 스펙트럼(물, H2O) :
    λmax: 275nm, 280nm, 287nm
    (7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
    3300㎝-1, 1720~1715㎝-1, 1636㎝-1, 1541㎝-1, 1404㎝-1, 1207㎝-1,
    1137㎝-1
    (8) 분자량 : 1575.9 [FAB-질량 m/z 1576.9(M+H)+, m/z 1575.4(M-H)-]
    (9) 분자식 : C74H113O21N17
    (10) 산 가수분해는 가수분해 물질들로서 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌 및 3-하이드록시-8-메틸노난산(1몰)을 제공한다.
    (11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+43°(C=0.5, H2O)
    (12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
  5. 상기 제1항의 항생물질 WAP-8294A 또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염으로부터 얻은 것으로 다음과 같은 물리화학적 성직을 갖는 항생물질 WAP-8294AX 또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
    (1) 외양 : 백색분말
    (2) 녹는점 : 196~200℃(분해됨)
    (3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음
    (4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon-Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine Vapor) 반응에 있어서 양성을 나타내고, UV 램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며 ; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
    (5) HLPC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류 시간(Retention Time) : 5.3분, 5.9분, 6.2분, 6.5분, 6.9분, 7.3분, 8.1분. 9.3분, 9.8분, 11.3분, 12.1분, 13.7분 및 15.0분임
    (6) UV 흡수 스펙트럼(물, H20) :
    λmax: 275nm, 280nm, 287nm
    (7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
    3300㎝-1, 1720~1715㎝-1, 1636㎝-1, 1541㎝-1, 1404㎝-1, 1207㎝-1,
    1137㎝-1
    (8)1H-NMR 스펙트럼(270 MHz, DMSO-d6) : 메틸,메틸렌, 메틴, 그리고 헤테로사이클 또는 방향족환으로부터 기인한 복잡한 H+시그널이 관측된다.
    (9) 분자량 : 1,400~1,700
    (10) 유기 화합물에 대한 정성분석(Na-응용방법) : 본 항생물질은 탄소, 수소, 산소 및 질소원소로 구성된 화합물임
    (11) 완전한 산 가수분해는 닌하이드린-양성물질과 지방산으로서 Asp, Glu, Gly, β-Ala, Leu, Ser, Trp, Orn, N-메틸발린, β-하이드록시아스파르트산, Phe, N-메틸페닐알라닌 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산을 제공한다.
    (12) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+24°(C=0.5, H2O)
    (13) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
  6. 다음과 같은 물리화학적 성질을 갖는 항생물질 WAP-8294AX-8 또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
    (1) 외양 : 백색분말
    (2) 녹는점 : 196~200℃(분해됨)
    (3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음
    (4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon-Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine Vapor)반응에 있어서 양성을 나타내고, UV램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
    (5) HLPC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류 시간(Retention Time) : 9.3분
    (6) UV 흡수 스펙트럼(물, H20) :
    λmax: 273nm, 280nm, 289nm
    (7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
    3300㎝-1, 1720~1715㎝-1, 1636㎝-1, 1541㎝-1, 1404㎝-1, 1207㎝-1,
    1133㎝-1
    (8) 분자량 : 1548[FAB-MS m/z 1549(M+H)+]
    (9) 분자식 : C72H109O21N17
    (10) 완전한 산 가수분해는 가수분해 물질들로서 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(2몰), Orn(2몰), Val(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(1몰)을 제공한다.
    (11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+25°(C=0.5, H2O)
    (12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
  7. 다음과 같은 물리화학적 성질을 갖는 항생물질 WAP-8294AX-9 또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
    (1) 외양 : 백색분말
    (2) 녹는점 : 216~220℃(분해됨)
    (3) 용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음
    (4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon-Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine Vapor)반응에 있어서 양성을 나타내고, UV램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
    (5) HLPC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류 시간(Retention Time) : 9.8분
    (6) UV 흡수 스펙트럼(물, H20) :
    λmax: 273nm, 280nm, 289nm
    (7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
    3300㎝-1, 1720~1715㎝-1, 1636㎝-1, 1541㎝-1, 1404㎝-1, 1207㎝-1,
    1137㎝-1
    (8) 분자량 : 1548[FAB-MS m/z 1549(M+H)+, m/z 1547(M-H)-]
    (9) 분자식 : C72H109O21N17
    (10) 산 가수분해는 가수분해 물질들로서 Asp(1몰), Glu(1몰), Gly(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린(1몰), β-하이드록시아스파르트산(1몰), Phe(1몰) 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(1몰)을 제공한다.
    (11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+28°(C=0.5, H2O)
    (12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
  8. 다음과 같은 물리화학적 성질을 갖는 항생물질 WAP-8294AX-13 또는 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
    (1) 외양 : 백색분말
    (2)녹는점 : 205~210℃(분해됨)
    (3)용해성 : 물, 메탄올, n-부탄올, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드에 녹고, 아세톤, 에틸아세테이트 및 클로로포름에 녹지 않음
    (4) 색반응 : 닌하이드린(ninhydrin), 에리히(Ehrlich), 라이돈-스미스(Rydon-Smith), 과망간산칼륨 수용액, 황산 및 요오드 증기(iodine Vapor)반응에 있어서 양성을 나타내고, UV램프로부터 방출된 254nm 광선을 갖는 조사선(irradiation)을 통해 켄칭스팟(quenching spots)을 보여주며; 그리고 몰리쉬(Molish), 질산은, 염화철(Ⅲ) 및 드라겐도르프 반응(Dragendorff's reaction)에서는 음성을 나타냄
    (5) HLPC(High Performance Liquid Chromatography)에서의 체류 시간(Retention Time) : 15.0분
    (6) UV 흡수 스펙트럼(물, H20) :
    λmax: 273nm, 280nm, 289nm
    (7) IR 흡수 스펙트럼(FT-IR, KBr) : 특성 흡수 스펙트럼 :
    3300㎝-1, 1720~1715㎝-1, 1636㎝-1, 1541㎝-1, 1404㎝-1, 1207㎝-1,
    1137㎝-1
    (8) 분자량 : 1576[FAB-MS m/z 1577(M+H)+]
    (9) 분자식 : C74H113O21N17
    (10) 완전한 산 가수분해는 가수분해 물질들로서 Asp(1몰), Glu(1몰), β-Ala(1몰), Leu(1몰), Ser(2몰), Trp(1몰), Orn(2몰), N-메틸발린, β-하이드록시아스파르트산(1몰), N-메틸페닐알라닌(1몰) 및 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(1몰)을 제공한다.
    (11) 비선광도(比旋光度, Specific Rotation) : [α]D 20=+27°(C=0.5, H2O)
    (12) 염기, 산 및 중성 분류 : 양쪽성(Amphoteric)
  9. 라이소박터(Lysobacter)속에 속하고 상기 제1항 내지 제8항의 어느 한항의 항생물질 WAP-8294A를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 배양중 상기 항생물질을 생산하는 균을 축적하며 : 그 항생물질을 회수하는 단계로 이루어진것을 특징으로 하는 항생물질 WAP-8294A를 생산하는 방법.
  10. 라이소박터(Lysobacter)속에 속하고 항생물질 WAP-8294A를 생산하는 능력을 가진 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 미생물은 라이소박터 속(Laysobacter sp.)WAP-8294(FERM BP-4990)인 미생물.
  12. 제1항 내지 제8항의 어느 한항에서의 항생물질 WAP-8294A와 이들의 약제학적으로 수용가능한 염들로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 항균제 조성물.
KR1019950025247A 1995-02-02 1995-08-17 항생물질 wap-8294a와 이의 제조방법 및 항균조성물 KR100225601B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP01604495A JP3339235B2 (ja) 1994-02-18 1995-02-02 抗生物質ｗａｐ−８２９４ａ、その製造法及び抗菌剤
JP7-16044 1995-02-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR960030942A KR960030942A (ko) 1996-09-17
KR100225601B1 true KR100225601B1 (ko) 1999-10-15

Family

ID=11905579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019950025247A KR100225601B1 (ko) 1995-02-02 1995-08-17 항생물질 wap-8294a와 이의 제조방법 및 항균조성물

Country Status (6)

Country Link
KR (1) KR100225601B1 (ko)
CN (2) CN1080310C (ko)
AU (1) AU705610B2 (ko)
HK (1) HK1046155B (ko)
HU (1) HU218351B (ko)
NL (1) NL1001012C2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101286038B1 (ko) * 2006-06-29 2013-07-19 링크 제노믹스 가부시키가이샤 항생 물질의 주사제 및 그 투여액

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1292663C (zh) * 2005-10-21 2007-01-03 云南农业大学 一种防治植物细菌病害的生物制剂及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588588A (en) * 1983-12-05 1986-05-13 E. R. Squibb & Sons, Inc. Antibiotic EM5487
CA1266247A (en) * 1985-03-25 1990-02-27 Adrienne A. Tymiak Antibiotic prepared from lysobacter sp. sc 14,067

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101286038B1 (ko) * 2006-06-29 2013-07-19 링크 제노믹스 가부시키가이샤 항생 물질의 주사제 및 그 투여액

Also Published As

Publication number Publication date
CN1357631A (zh) 2002-07-10
KR960030942A (ko) 1996-09-17
CN1132252A (zh) 1996-10-02
AU705610B2 (en) 1999-05-27
HK1046155B (zh) 2005-09-30
CN1080310C (zh) 2002-03-06
HU218351B (hu) 2000-08-28
NL1001012A1 (nl) 1996-08-21
NL1001012C2 (nl) 1998-09-01
HK1046155A1 (en) 2002-12-27
HUT72397A (en) 1996-04-29
HU9502434D0 (en) 1995-10-30
CN1196794C (zh) 2005-04-13
AU3012695A (en) 1996-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0231111B1 (en) Glycopeptide antibiotics, their preparation and use and microorganisms for producing them
JP3684432B2 (ja) アクタガルジンに関連した新規なランチビオティック、その製法およびその使用
EA016608B1 (ru) Антибиотик 107891, его фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция и применение
EP0451486B1 (en) Antibiotic GE 2270 factors B1, B2, C1, C2, D1, D2,E and T
EP0668358B1 (en) Antibiotic WAP-8294A, method for preparing the same and antibacterial composition
KR100225601B1 (ko) 항생물질 wap-8294a와 이의 제조방법 및 항균조성물
FI100112B (fi) Menetelmä bakteerien vastaisen tiomarinolin valmistamiseksi
US5081225A (en) Gram-positive and gram-negative antibacterial compounds from the microorganism, janthinobacterium lividum
KR950013857B1 (ko) 신규 항생물질 무레이도마이신 a, b, c 및 d 그의 제조 방법 및 치료학적 용도
KR0137944B1 (ko) 항생제 ge 2270
US6586393B2 (en) Antibiotics GE 23077, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof
JP2863934B2 (ja) 抗生物質プラスバシン
EP0545955B1 (en) Antibiotic ge1655 complex and its factors a, b and c
JPH0430400B2 (ko)
JP2003113192A (ja) 抗生物質ｗａｐ−２６０７ｂ、その製造法及び抗菌剤
IE913058A1 (en) Antibiotic ge1655 complex and its factors a, b, and c
JP3092877B2 (ja) 新規ペプチドｓｎａ−１１５及びｓｎａ−１１５ｔ、その製造法及び新規ペプチド産生菌株
EP1213298A1 (en) Antibiotics GE 23077, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof
JP2006176406A (ja) ペプチド系抗生物質
JPH0639479B2 (ja) 抗生物質ｔａｎ−７４９，その製造法およびそれを含有する細菌感染症治療剤
JPS6250474B2 (ko)
JPH07291992A (ja) 新規化合物ｂ４３１７
JPS6147491A (ja) 抗生物質，その製造法および微生物
MXPA98008484A (en) New lantibiotic related with actagardine, procedure for its preparation and employment of the mi
JPH0859691A (ja) カレドスリシン類及びその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130604

Year of fee payment: 15

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140618

Year of fee payment: 16

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150630

Year of fee payment: 17

EXPY Expiration of term