HU218351B

HU218351B - WAP-8294A antibiotikumok, eljárás előállításukra, a termelő mikroorganizmus és az antibiotikumokat tartalmazó antibakteriális gyógyszerkészítmények

Info

Publication number: HU218351B
Application number: HU9502434A
Authority: HU
Inventors: Yuji Aiba; Haruhisa Hirata; Azusa Katou; Naomi Kokubo; Makoto Maeda; Seigo Nakaya; Yoshitami Ohashi; Nobuyuki Suzuki
Original assignee: Nippon Medical Research, Inc.
Priority date: 1995-02-02
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 2000-08-28
Also published as: HK1046155B; CN1357631A; CN1132252A; KR960030942A; AU705610B2; HUT72397A; HU9502434D0; NL1001012A1; CN1080310C; NL1001012C2; AU3012695A; CN1196794C; HK1046155A1; KR100225601B1

Abstract

A találmány tárgya a WAP–8294A, A1, A2, A4, AX, AX–8, AX–9 és az AX–13antibiotikumok vagy ezek gyó- gyászatilag elfogadható sói, melyeketegy Lysobacter genusba tartozó törzs, közelebbről a Lysobacter sp.WAP– 8294 termel. A találmány tárgya egy eljárás is, a fenti WAP–8294Aantibiotikum előállítására a mikroorganizmus táptalajon valótenyésztésével, majd az antibiotikum kinyerésével. A találmány tárgyátképezi még a termelő törzs, valamint antibakteriálisgyógyszerkészítmények, amelyek hatóanyagai a találmány szerintiantibiotikumok vagy gyógyászatilag elfogadható sóik. Az új WAP–8294Aantibiotikumnak kiváló gyógyhatása van Gram-pozitív baktériumok,elsősorban MRSA által okozott fertőzéses megbetegedésekkel szemben. ŕ

Description

A találmány tárgya az új antibiotikum, a WAP-8294A, mely alkalmas patogén mikroorganizmusok által okozott fertőzéses megbetegedések kezelésére, eljárás az antibiotikum előállítására és az antibiotikum alkalmazása.

A baktériumok által kiváltott fertőzéses megbetegedésekre alkalmazott kemoterápiás hatóanyagok története a kinin és a neoszalvarzan szintézisével, a penicillin felfedezésével kezdődött, és ezek a kemoterápiás hatóanyagok az emberiség javát szolgálták. Manapság megjelentek a kemoterápiás hatóanyagokkal szemben rezisztens baktériumok, mint ezt az MRSA (meticillinrezisztens Staphylococcus aureus) által okozott fertőzéses megbetegedések mutatják, melyekre a vankomicin és a habekacin kivételével nem hatnak a kemoterápiás hatóanyagok. Ez zavart okozott a gyógykezelés terén, és komoly szociális problémához vezetett.

A vankomicint az Eli Lilly & Co. fejlesztette ki az Egyesült Államokban, és az MRSA fertőzéses megbetegedések kezelésére használták. De a kezelést gyakran nephrotoxicitás, hepatotoxicitás és cranialis VIII ideg- (nervus octavus) rendellenesség (ototoxicitás) kísérte, és hosszú pasztörizálási időt igényelt. Emiatt felmerült a gyanú, hogy ismét rezisztens baktériumok jelentek meg.

A habekacin kémiai úton kifejlesztett kanamicinvázas amino-glükozid típusú antibiotikum. Kitűnő antibiotikus hatása van a rezisztens baktériumok számos fajtájára, és azon kevés kemoterápiás hatóanyag egyikeként használják, melyek alkalmasak az MRSA fertőzéses megbetegedések kezelésére. De alkalmazása néha súlyos vesekárosodást és halláskárosodást (cranial nerve VIII disorder) okoz az amino-glükozid típusú antibiotikumok jellegzetes mellékhatásaként. Tehát ez sem tekinthető gyógyászati szempontból biztonságos antibiotikumnak.

Ilyen körülmények között felmerült az igény új, kemoterápiás hatóanyag kifejlesztésére, melynek kicsi a toxicitása, gyorsan kifejti antibiotikus hatását, gyakorlatilag nincs mellékhatása. Kutatást folytattunk a probléma megoldására.

A találmány tárgya egy olyan új antibiotikum kifejlesztése, mely megfelel a fenti igényeknek. A találmány tárgyát képezi még egy eljárás az antibiotikum előállítására. A találmány tárgya még egy klinikailag használható kemoterápiás hatóanyag, melynek csekély a toxicitása vagy kiváló a szelektív toxicitása.

A találmány feltalálói számos kutatást végeztek egy új, hasznos antibiotikum felfedezésére. Ennek eredményeként izoláltak a talajból egy a Lysobacter genusba tartozó új mikroorganizmus törzset, mely egy eddig le nem írt antibiotikumot termel.

így a találmány tárgya a WAP-8294A antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melynek fízikokémiai jellemzőit a továbbiakban ismertetjük. A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti WAP-8294A antibiotikum előállítására, mely a Lysobacter genusba tartozó mikroorganizmus tápközegben való tenyésztését is tartalmazza, mely mikroorganizmus alkalmas a WAP-8294A antibiotikum termelésére és a tápközegben való feldúsítására. Az eljáráshoz tartozik továbbá az antibiotikum feltárása. A találmány tárgyát képezi még a mikroorganizmus, mely a Lysobacter genusba tartozik, és WAP-8294A antibiotikumot termel. A találmány tárgyát képezi még egy antibakteriális gyógyszerkészítmény, mely a WAP-8294A antibiotikumot tartalmazza hatóanyagként, vagy pedig annak valamely gyógyászatilag elfogadható sóját.

A rajzok értelmezése:

Az 1. ábra egy kromatogram, mely a WAP-8294 elkülönítését ábrázolja egy sorozat frakcióból nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával.

A 2. ábra diagramja WAP-8294A (hidroklorid) UV-abszorpciós spektruma (vízben).

A 3. ábra diagramja a WAP-8294A antibiotikum (hidroklorid) IR abszorpciós spektrumát mutatja (FT-IR, KBr).

A 4. ábra diagramja a WAP-8294A (hidroklorid) ‘H-NMR-spektruma (270 MHz, D₂O).

Az 5. ábra a WAP-8294A savas teljes hidrolizátumának kétdimenziós TLC-kromatogramja.

A 6. ábra a WAP-8294AX nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás elkülönítésének diagramja.

A 7. ábra a WAP-8294AX-8 (hidroklorid) UV abszorpciós diagramja (vízben).

A 8. ábra a WAP-8294AX-8 (hidroklorid) IR abszorpciós diagramja (FT-IR, KBr).

A 9. ábra a WAP-8294AX-8 (hidroklorid) ‘H-NMR-spektruma (270 MHz, D₂O).

Az előnyös változatok ismertetése A találmány tárgya egy új antibiotikum, a

WAP-8294A, melyet egy új, a Lysobacter genusba tartozó törzs táptalajában találtunk. A WAP-8294A-t később frakcionáltuk, és legalább két komponenst találtunk: AX; A,; A₂; A₃; A₄; A₅; A₆. Az AX komponenst tovább frakcionáltuk, és legalább 13 további komponenst kaptunk: AX-1; AX-2; AX-3; AX-4; AX-5; AX-6; AX-7; AX-8; AX-9; AX-10; AX-11; AX-12 és AX-13. A WAP-8294A antibiotikum elnevezést a továbbiakban az AX, A_b A₂, A₃, A₄, A₅, A₆, AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12, AX-13 anyagokra vagy ezek keverékére használjuk.

A találmány tárgyát képezi továbbá maga a szabad WAP-8294A antibiotikum, valamint gyógyászatilag elfogadható sói, mint a hidrokloridok, szulfátok, és a metánszulfonátok.

Ezeknek az anyagoknak erős antibiotikus hatásuk van Gram-pozitív baktériumokra, különösen a meticillinrezisztens Staphylococcus aureus (MRSA)-ra.

A WAP-8294A antibiotikumot C₁₈ fordított fázisú szilikagél nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával [oszlop: YMC A-312 (5x150 mm); mozgó fázis 0,05% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril: víz (45:55); kijelző hullámhossz: UV 214 nm; áramlási sebesség: 1 ml/perc] leoldási fázisban 4,0-6,1 perc, 8,0 perc, 11,1 perc, 12,5 perc, 16,5 perc, 17,9 perc és

HU 218 351 Β

18,8 perc retenciós idővel bontottuk frakciókra, azaz az AX, A_b A₂, A_3j A₄, A₅ és A₆ (1. ábra) komponensekre.

Az AX frakciót, mint azt a 6. ábra mutatja, tovább frakcionáltuk 5,3 perc, 5,9 perc, 6,2 perc, 6,5 perc,

6,9 perc, 7,3 perc, 8,1 perc, 9,3 perc, 9,8 perc, 1,3 perc, 5 12,1 perc, 13,7 perc és 15,0 perc retenciós idővel (C₁₂) fordított fázisú szilikagél nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával [oszlop: YMC A-312 (6x150 mm), mozgó fázis 0,05% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril:víz (37:63); kijelző hullámhossz: UV 214 nm; 10 áramlási sebesség: 1 ml/perc], és az AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 és AX-13 frakciót kaptuk.

A WAP-8294A, Aj, A₂ és A₄ antibiotikumoknak UV-spektrumuk van (vízben) X_max=275 nm, 280 nm és 287 nm hullámhossznál. A WAP-8294A₃ UV abszorpciós spektrumát a 2. ábra mutatja. Nyilvánvaló, hogy a WAP-8294A, Aj, A₃ és A₄ triptofánt tartalmaz kromoforként, mint azt a savas hidrolizátumok analízise igazolta. Ezt később bővebben részletezzük.

A WAP-8294A, A,, A₂ és A₄ infravörös abszorpciós spektrumanalízise abszorpciós maximumot mutat 3300 cm-'-nél, ez -OH és -NH₂ csoportok jelenlétére utal; a maximum 1720-1715 cm-¹ között karboxilvagy észter-karbonil-csoportra utal; a 1636 és 1541 cm ¹ közötti maximum amidokötést jelent és a maximum 1207 és 1137 cm-'-nél C-0 kiteijedő rezgésre utal, de ezeknek nincs más karakterisztikus abszorpciójúk.

A WAP-8294AIR abszorpciós spektrumát mutatja a 3. ábra.

A WAP-8294A, Aj, A₂ és A₄ •H-NMR-spektroszkópiás méréseiben számos bonyolult protonjelet látunk, melyek metil-, metilén-, metincsoportoktól vagy heterociklusos vagy aromás gyűrűktől származnak.

A WAP-8294A₃ ’H-NMR-spektrumát mutatja a

4. ábra.

A WAP-8294Aj, A₂ és A₄ FAB-tömegspektrometriás mérései azt mutatják, hogy Aj (M+H)+ ionjának m/z értéke 1548,9, az A₂ (M+H)+ ionjának m/z értéke 15 1562,9 és az A₄ (M+H)⁺ ionjának m/z értéke 1576,9. Az Aj, A₂ és A₄ komponensek nátriumolvadék-vizsgálati eredményei azt bizonyítják, hogy ezek a komponensek szénből, hidrogénből, oxigénből és nitrogénből tevődnek össze. Az 1. táblázatban megadott tapasztalati 20 képleteket a fenti adatokból vezettük le úgy, hogy tekintetbe vettük azoknak az aminosavaknak és zsírsavaknak a szerkezeti felépítését és mólarányát, melyek ezeket a komponenseket alkotják. Ezeket a vizsgálatokat, valamint a FAB-tömegspektrometriás méréseket a továbbiakban még részletezzük.

1. táblázat

	A,	A₂	a₄
FAB-tömeg (M+H)⁺	1548,9	1562,9	1576,9
FAB-tömeg (M-H)	1546,7	1561,2	1575,4
Delta tömegegység		14 tömegegység A,-—A₂	14 tömegegység A₂ -— a₄
Mólsúly	1547,9	1561,9	1575,9
HR-FAB-tömeg	1548,8088	1562,8224	1576,8363
Tapasztalati képlet	^72Ηΐ09θ2ΐΝΐ7	C₇₃H_1hO₂₁N₁₇	£-74Ηιι₂Ο₂\|Ν₁₇

A WAP-8294A, Aj, A₂ és A₄ ninhidrin-pozitív, Ehrlich-pozitív, Rydon-Smith-pozitív, és pozitív eredményt ad jódgőzzel, kálium-permanganát vizes oldatával és kénsawal. Kioltási pontot adnak 254 nm-es UV-lámpából származó fénnyel besugározva, és negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-próbát adnak. A WAP-8294A, Aj, A₂ és A₄ aminosav-összetételének vizsgálatai - teljes savas hidrolízissel, majd kétdimenziós TLC-vizsgálattal - azt mutatják, hogy a négy anyag mindegyike aszparaginsavból (Asp), glutaminsavból (Glu), glicinből (Gly), leucinból (Leu), szerbiből (Ser), triptofánból (Trp) és omitinből (Om) és még három ismeretlen aminosavból áll. Az 5. ábra WAP-8294A kétdimenziós TLC-analízisének eredményeit mutatja.

így az ismeretlen 1-, 2- és 3-aminosavakat izoláltuk a WAP-8294A hidrolízisével, hogy meghatározzuk azokat. Az ismeretlen 1-, 2- és 3-aminosav a különböző műszeres analitikai vizsgálatok eredményeként bétahidroxi-aszpartámsavnak, N-metil-valinnak, illetve Nmetil-fenil-alaninnak bizonyult.

Másrészt 3-hidroxi-oktánsavat, 3-hidroxi-7-metil-oktánsavat vagy 3-hidroxi-8-metil-nonánsavat izoláltunk éteres extrakcióval a WAP-8294Aj, A₂ vagy A₄ komponensek savas hidrolizátumából.

A továbbiakban a WAP-8294AX-ből 13 frakciót különítettünk el:

AX-1 retenciós idő 5,3 perc, AX-2 retenciós idő 5,9 perc,

AX-3 retenciós idő 6,2 perc, AX-4 retenciós idő

6,5 perc,

AX-5 retenciós idő 6,9 perc, AX-6 retenciós idő

7.3 perc,

AX-7 retenciós idő 8,1 perc, AX-8 retenciós idő

9.3 perc,

AX-9 retenciós idő 9,8 perc, AX-10 retenciós idő

11.3 perc,

AX-11 retenciós idő 12,1 perc, AX-12 retenciós idő 13,7 perc és AX-13 retenciós idő 15,0 perc. Ezeket az eredményeket C,₂ fordított fázisú szilikagél nagy teljesítmé3

HU 218 351 Β nyű folyadékkromatográfíával kaptuk. Az eredményeket a 6. ábra mutatja.

A WAP-8294AX-nek, az ΑΧ-8-nak, az AX-9nek és az AX- 13-nak UV abszorpciós maximuma van (vízben) k_max 273 nm-nél, 280 nm-nél és 289 nm-nél. Az is kiderült, hogy a WAP-8294AX, az AX-8, AX-9 és AX-13 egy molekula triptofánt tartalmaz kromoforként a molekulájában, mint ezt a savas hidrolizátum analízise megmutatta. Ezt később részletezzük.

A WAP8294AX-8 UV abszorpciós spektrumát a 1 7. ábra mutatja.

A WAP-8294AX, AX-8, AX-9 és AX-13 infravörös spektruma abszorpciót mutat 3300 cm '-nél, ami -OH és -NH csoportra utal; 1720-tól 1715 cm-'-ig, ami karboxil- vagy észter-karbonil-csoportra utal; 1 1636 és 1541 cm '-nél, ami amidokötésre utal; és 1207 és 1137 cm-'-nél, ami C-O kiterjedő rezgésre utal, és ezeken kívül nincs más jellemző abszorpció. A WAP8294AX-8 IR abszorpciós spektrumát a 8. ábra mutatja.

e

2. tá

A WAP-8294AX, AX-8, AX-9 és

AX-13 Ή-NMR-spektrumában számos bonyolult protonjel van, melyek metil-, metilén- vagy metincsoportoktól, vagy heterociklusos vagy aromás gyűrűktől származnak. A WAP-8294AX-8 Ή-NMR-spektrumát mutatja a 9. ábra.

A WAP-8294AX-8, AX-9 és AX-13 FAB-tömegspektrometriás mérései szerint az AX-8 (M+H)⁺ionjának m/z értéke 1549, az AX-9 (M+H)⁺ ionjának m/z értéke 1577. A nátriumolvadék-teszt azt mutatja, hogy az AX-8, AX-9 és AX-13 komponensek hidrogénből, oxigénből, szénből és nitrogénből épülnek fel. A 2. táblázatban felsorolt tapasztalati képleteket ezekből az adatokból vezettük le, tekintetbe vettük a szerkezetkutatások eredményeit és az ezen komponenseket felépítő aminosavak és zsírsavak moláris részesedési arányait, valamint a nagy teljesítményű FAB-tömegspektrometriás mérések eredményeit, mint később részletezzük.

Komponensek	AX-8	AX-9	AX-13
FAB-tömeg (M+H)⁺	1549	1549	1577
FAB-tömeg (M-H)		1547
-14 tömegegység	-14 tömegegység	-14 tömegegység
Delta tömegegység	A₂-—AX-8	Aj—-AX-9	Aj—-AX-13
Molekulatömeg	1548	1548	1576
HR-FAB-tömeg	1548,8079	1548,8065	1576,8324
Tapasztalati képlet	£·72Ηΐ09θ2ΐΝΐ7	CrfHi iO₉O₂iH₁₇	C₇₄H,\|₂Oj₂N₁₇

A WAP-8294AX, AX-8, AX-9 és AX-13 antibiotikumok ninhidrin-, Ehrlich- és Ryson-Smith-pozitívak, és pozitív jódgőz-, kálium-permanganát- és kénsavreakciót adnak, kioltási foltokat produkálnak 254 nm-es UVfénnyel besugározva, és negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-próbát adnak.

A WAP-8294AX, AX-8, AX-9 és AX-13 aminosav-összetételének meghatározására mindegyiket teljes savas hidrolízisnek vetettük alá, majd kétdimenziós TLC-analízist [cellulózlemez; 1. oldószer: n-butanol: ecetsav: víz (4:1:2); 2. oldószer: n-butanol:piridin :ecetsav: víz (15:10:3:12); spray-reagens: ninhidrin] és aminosavanalízist végeztünk. Az eredmény az lett, hogy a WAP-8294AX pozitív ninhidrinreakciót adó aszparaginsavból (Asp), glutaminsavból (Glu), glicinből (Gly), béta-alaninból (β-Ala), leucinből (Leu), szerinből (Ser), triptofánból (Trp), omitinből (Om), váltéból (Val), N-metil-valinból (N-MeVal), béta-hidroxi-aszparaginsavból (β-ΟΗ-Asp), fenil-alaninból (Phe) és N-metil-fenil-alaninból (N-MePhe) épül föl.

Bebizonyosodott az is, hogy a WAP-8294AX teljes savas hidrolízis éteres extraktuma 3-hidroxi-7-metil-oktánsavat tartalmaz.

A WAP-8294AX-8, AX-9 és AX-13 antibiotikumokat ugyanazon vizsgálatoknak vetettük alá, mint a WAP-8294AX-et. Az azokat felépítő aminosavakat és zsírsavakat kétdimenziós TLC-analízissel, aminosavanalízissel és a teljes savas hidrolizátum éteres extraktumának GC-tömeg analízisével azonosítottuk.

Az eredményeket a 3. táblázat mutatja a WAP-8294A₂ (fő komponens) megfelelő értékei mellett.

3. táblázat

Az egyes frakciókat felépítő aminosavak és zsírsavak (A mólok száma a zárójelben)

Komponensek	AX-8	AX-9	AX-13	a₂
Aminosavak
	Asp (1)	Asp (1)	Asp (1)	Asp (1)
	Ser (2)	Ser(2)	Ser (2)	Ser (2)
	Glu(l)	Glu (1)	Glu(l)	Glu(l)

HU 218 351 Β

3. táblázat (folytatás)

Komponensek	AX-8	AX-9	AX-13	a₂
	Gly (1)	Gly (1)	β-Ala (1)	Gly (1)
	Leu (1)	Leu (1)	Leu (1)	Leu (1)
	Trp(l)	Tip(l)	Trp(l)	Trp(l)
	Om(2)	Om (2)	Om(2)	Om (2)
	β-ΟΗ-Asp (1)	β-ΟΗ-Asp (1)	β-ΟΗ-Asp (1)	β-ΟΗ-Asp (1)
	Val (1)	N-MeVal (1)	N-MeVal (1)	N-MeVal(l)
	N-MePhe (1)	Phe (1)	N-MePhe (1)	N-MePhe (1)
Zsírsavak
	3H-7M-OA (1)	3H 7M-0A (1)	3H-7M-OA (1)	3H 7M-0A (1)

Megjegyzés: a 3H-7M-OA a 3-hidroxi-7-metiloktánsav.

A feltalálók ismert vegyületeket kerestek a WAP-8294A, A„ A₂, A₄, ΑΧ, AX-8, AX-9 és AX-13 fenti fizikokémiai tulajdonságai, aminosav- és zsírsavösszetétele alapján, és így bebizonyosodott, hogy ezek új, az irodalomban eddig le nem írt vegyületek.

A találmány szerinti WAP-8294A, A_b A₂, A₄, AX, AX-8, AX-9 és AX-13 úgy állítható elő, hogy egy WAP-8294A előállítására alkalmas baktériumot a Lysobacter genusból tápközegben tenyésztünk, és ha szüksé- 25 ges, elválasztjuk és tisztítjuk. A WAP-8294A előállítására alkalmas, a Lysobacter genusba tartozó baktériumra példa a Lysobacter sp. WAP-8294 törzs, melyet a találmány feltalálói izoláltak a talajból Shimoda City, Shizuoka Prefektúra környékéről Japánban. A törzs taxo- 30 nómiai bakteriológiai tulajdonságai a következők.

1. Morfológia

A törzset 25 °C-on tenyésztettük 3 napig bouillonagar lemezen, mikroszkóp alatt megvizsgáltuk, és pálcika alakú sejtnek találtuk, melynek átmérője 0,4-0,6 pm 35 és hossza 3,2-4,2 pm. A törzs Gram-negatív, flagelluma nincs, de csúszó mozgást végez, nem képez spórákat, és nincs ellenállása savakkal szemben.

2. Növekedési jellemzők különböző tápközegekben

A törzset 25 °C-on tenyésztettük különböző tápkö- 40 zegekben, és 3-14 napig figyeltük.

(1) Bouillon-agar lemezkultúra

A képződött telepnek áttetsző, halványsárga, körkörös alakja van, konvex körkörös felülete és hullámos körvonala. A törzs nem termel diffu- 45 zibilis pigmentet.

(2) Bouillon-ferde agar kultúra

A törzs kiterített kendő formájában növekszik, és áttetsző, halványsárga színe van.

(3) Bouillon-folyadék kultúra 50

A tápközeg kissé megzavarosodik, a törzs világos gyűrűt képez, meg lehet figyelni baktériumsejt kiválasztásokat a tápkonténer alsó részében.

(4) Bouillon-zselatin szúrt kultúra

A törzs a felszíntől a táptalaj közepe felé növek- 55 szik, miközben elfolyósítja a zselatint.

(5) Lakmusz-tej kultúra

A törzs nem redukálja a lakmuszt, nem koagulál, de peptonizálásra képes.

(6) Fölözött tej-acetát-agar kultúra 60

A törzsnek erős proteolitikus aktivitása van, és nőve

kedése közben erősen viszkózus, gélszerű tömegek kép-
ződnek az agarlemezen.
3. Fiziológiai tulajdonságok
A WAP-8294 törzs fiziológiai tulajdonságai a kö-
vetkezők:
(1) Nitrát-redukció	-
(2) Denitrifikálási reakció	-
(3) MR-teszt	-
(4) VP-teszt	-
(5) Indolképzés	-
(6) Kén-hidrogén-képzés	-
(7) Keményítőhidrolízis	-
(8) Citromsav alkalmazása
1 Koser-tápközeg	-
2 Simmonds-tápközeg	-
3 Christensen-tápközeg	+
(9) Szervetlen nitrogénforrás
1 Nátrium-nitrát	+
2 Ammónium-szulfát	+
3 Nátrium-glutamát	+
(10) Pigmentképzés
1 King A tápközeg	-
2 King B tápközeg	-
(11) Ureáz	-
(12) Oxidáz	+
(13) Kataláz	+
(14) Növekedési hőmérséklet	15-37°C
(15) Növekedési pH	5-8
(16) Oxigénnel szembeni
viselkedés	aerob
(17) O-F teszt nem	bomló típus
(18) Deoxiribonukleáz	+
(19) Foszfatáz	+
(20) Hemolízis	béta
(21) Cellulózlebontás	-
(22) Tween-lebontás
1 Tween 20	+
2 Tween 40	+
3 Tween 60	+
4 Tween 80	+
(23) Kolloid kitin lebontása	+
(24) Poliszacharidok lebontása
1 CMC	+

HU 218 351 Β

Alginsav 3 Peptonsav (25) Bakteriolitikus aktivitás

Saccharomyces cerevisiae +

Bacillus subtilis +

Escherichia coli + (26) GC-tartalom 68,3% (HPLC-módszer) (27) Sav- és gázképzés cukorból

Cukor	Savképződés (Pepton-víz)	Gázképződés (Bouillon- agar)	Cukor alkalmazása (Davis- tápközeg)
L-arabinóz	-	-	-
D-xilóz	-	-	-
D-glükóz	+	-	-
D-mannóz	+	-	-
D-fruktóz	+	-	-
D-galaktóz	+	-	-
Maltóz	+	-	+
Szukróz	+	-	-
Laktóz	+	-	-
Trebalóz	+	-	-
D-szorbitol	-	-	-
D-mannitol	-	-	-
Inozitol	-	-	-
Glicerin	-	-	-
Keményítő	+	-	-
Cellulóz	+	-	+

Ha a WAP-8294 törzsre vonatkozó fenti eredményeket összehasonlítjuk a Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology 3. kötet (1989) megfelelő adataival, megállapíthatjuk, hogy a törzs Gram-negatív aerob, ostor nélküli pálcika, mely csúszva mozog, és ezért a törzs a csúszó baktériumokhoz tartozik.

A csúszó baktériumokat a szaporítótest nélküli csúszó baktériumokra és a szaporítótestet képező csúszó baktériumokra osztják, az előzőek nem képeznek szaporítótestet, az utóbbiak képeznek. A találmány szerinti törzs nem képez szaporítótestet, ezért a szaporítótest nélküli csúszó baktériumokhoz tartozik. A csúszó baktériumokat a továbbiakban három rendbe osztják: Cytophagales, Beggiatoles and Lysobacteriales. Ezeket jól el lehet különíteni egymástól DNS-ük GC-tartalma alapján. Ez az egyik legfontosabb kulcsjellemzőjük. Ezért a törzs DNS-ét szokásos módon extraháltuk, és úgy találtuk, hogy GC-tartalma magas, 68,3%, mint azt a HPLC-módszerrel meghatároztuk a FEMS Microbiol. Letters, 1984, 25, p. 125. szerint. Ennek megfelelően megállapíthatjuk, hogy a törzs a Lysobacter genusba, ezen belül a Lysobacteriales rendbe tartozik, melynek GC-tartalma magas, azaz 65-71%.

Ha a törzs tulajdonságait összehasonlítjuk az azonos genusba tartozó fajok törzseinek tulajdonságaival, azokat hasonlónak találjuk a Lysobacter enzymogenes törzseinek tulajdonságaihoz, azzal az eltéréssel, hogy a mi törzsünk nem termel citromsavat. Ennek megfelelően a törzset Lysobacter sp. WAP-8294-nek neveztük.

A WAP-8294 törzset letétbe helyeztük a National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science & Technology, Japán intézetben 1994. január 31-én FERM BP-4990. (FERM P-14093) számon. A baktériumoknak a Lysobacter fajokat is beleértve könnyen megváltoznak a taxonómiai tulajdonságai és akár az egész természetük, és ez alól a WAP-8294 sem kivétel. így minden mikroorganizmus, mely képes WAP-8294A antibiotikumot termelni - beleértve a természetes mutációkat vagy a mesterségesen, különböző mutagének segítségével létrehozottakat -, alkalmazható a találmány szerinti eljárásban.

(Tenyésztés és termelés)

A találmány szerinti WAP-8294A antibiotikumot úgy állítjuk elő, hogy egy tápanyagforrást tartalmazó tápközeget beoltunk egy WAP-8294A-t termelő baktériummal, és aerob körülmények között tenyésztjük. A WAP-8294A-t termelő baktériumnak a tenyésztés során szüksége van például asszimilálható szerves szenet tartalmazó vegyületekre, ezek lehetnek például a glükóz, ffuktóz, keményítő, dextrin, glicerin, melasz, keményítőszirup, zsírok és olajok és szerves savak, mint szénforrások. A baktériumnak szüksége van még szerves vagy szervetlen nitrogént tartalmazó vegyületekre mint nitrogénforrásokra, ezek lehetnek szójaliszt, gyapotmagliszt, kukoricalekvár, kazein, pepton, élesztőkivonat, húskivonat, csíra, karbamid, aminosavak és ammóniumsók. Ezen túlmenően szükség van még szervetlen sókra, mint nátrium-, kálium-, kalcium- és magnéziumsókra és foszfátokra, melyeket magukban vagy keverékekben alkalmazhatunk. Ezenfelül előnyösen hozzáadunk még a táptalajhoz nehézfémsókat, így vassókat, rézsókat, cinksókat és kobaltsókat, vitaminok is szükségesek a mikrooganizmusok növekedéséhez, mint a biotin és a Bl-vitamin. Szükség van még más szerves és/vagy szervetlen anyagokra, melyek elősegítik a WAP-8294A antibiotikumot termelő baktériumok növekedését és javítják a WAP-8294A-hozamot. A tápközeg tartalmazhat még egy habzásgátló szert mint szilikonolajat vagy egy polialkilénglikol-étert és egy felületaktív anyagot is.

A törzset bármely, az antibiotikumok előállításában szokásosan alkalmazott eljárással lehet tenyészteni, de a levegőztetett mélykultúrás technika előnyös az aerob körülmények fenntartására, és a gyakran rázott palackos kultúra alkalmas a laboratóriumi tenyésztéshez. A tenyésztést általában 20-40 °C-on végezzük, előnyös a 25-30 °C. A tenyésztéshez megfelelő a 6-8, előnyös a 7 pH-érték. A fermentáció ideje 2-6 nap, ez elég ahhoz, hogy kielégítő mennyiségű WAP-8294A halmozódjék fel a tápközegben.

(Izolálás és tisztítás)

A tápközegben felhalmozódott WAP-8294A feltárását előnyösen a találmány szerinti antibiotikum fizikokémiai tulajdonságainak felhasználásával végezzük, és később részletesen ismertetjük. Pontosabban a

HU 218 351 Β

WAP-8294A a táptalaj filtrátumában van, és ezért a filtrátumot összegyűjtjük úgy, hogy először egy szűrést segítő anyagot, Celitet vagy Radiolitot adunk hozzá, majd eltávolítjuk a baktériumsejteket szűréssel csökkentett nyomás segítségével vagy centrifugálással.

A WAP-8294A antibiotikumokat vízoldható polipeptideknek találtuk később részletezendő fizikokémiai tulajdonságaik alapján, és így meglehetősen nagy molekulákat képeznek, melyeknek molekulatömege 1400 és 1700 között van.

Mikor a WAP-8294A-t összegyűjtjük a tápközeg szűrletéből, ezeket a tulajdonságokat tekintetbe véve, adszorbens gyantákkal - mint a Diaion HP-20, Sephades Sp207, CHP-20 (Mitsubishi Chemical Industrial Ltd.), Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas Co.), Duolite S-30 (Diamond Shamrock Chemical Co.) - és különösen aktívszén-oszlopos kromatográfiával hatásosan tisztítjuk az antibiotikumot.

Például a tápközeg szűrletét, melynek pH-ja 6,9, átengedjük egy Amberlite IR-120B- (H+ fázisú) tartalmú oszlopon, a kapott savanyú folyadékot átengedjük egy aktív szénnel töltött oszlopon, és nem teszünk semmit azért, hogy adszorbeáltassuk a szűrletet, ezután vizes mosás következik, majd eluálás 80%-os aceton-víz eleggyel, vagy egy alkoholos 80%-os aceton-víz eleggyel, és így feltáljuk a WAP-8294A antibiotikumot. Az eluátumról ledesztilláljuk az acetont csökkentett nyomáson. A kapott maradékot etil-acetáttal extraháljuk savas közegben. így eltávolítjuk az olajban oldódó szennyezéseket, majd a vizes fázist ismét extraháljuk, olyan erősen poláros szerves oldószerrel, mint a n-butanol. így kinyerhető a WAP-8294A. A n-butanol ledesztillálása után - alacsony hőmérsékleten - a maradékot önmagában szárazra pároljuk, vagy kevés oldószert adunk hozzá, és így kiválik a WAP-8294A, ezt centrifugáljuk vagy leszűrjük, és csökkentett nyomás alatt megszárítjuk, így kapjuk a nyersterméket.

Az így kinyert nyersterméket tovább tisztíthatjuk ellenáramú megosztásos módszerrel, folyadék: folyadék centrifugálásos megosztásos kromatográfiával, abszorpciós kromatogárfiával, szilikagél-oszlopkromatográfiával, melyeket külön vagy kombinálva alkalmazhatunk. így nagy tisztaságú termékhez jutunk. A WAP-8294A-t poláros szerves oldószerrel extrahálhatjuk, így butanollal savas közegben.

Más módon is tisztíthatjuk ezt az anyagot. Használhatjuk a Sephadex G-10, G-15, LH-20 (Pharmacia Company) vagy a BIOGEL P-4 Gél (Bio-Rad Laboratories) molekulaszita-effektusát és kifejleszthetjük és eluálhatjuk az anyagot vízzel vagy víztartalmú rövid szénláncú alkohollal, mint víztartalmú metanollal, hígított bázisos vagy savas vizes oldattal vagy alkalmas sót tartalmazó vizes oldattal, melyeket önmagukban vagy egymással kombinálva alkalmazunk.

Az egyes komponenseket a 7 közül, az AX, A_b A₂, Aj, A₄, A₅ és A₇ komponenst további tisztítással és elválasztással nyerhetjük a WAP-8294A-ból, például ellenáramú megosztásos technikával, mint fentebb leírtuk, és/vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával. Az AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6,

AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 és AX-13 komponenseket (13 db) a fentiekhez hasonlóan tisztítással és elválasztással kaphatjuk meg.

A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia töltőanyaga lehet szilikagél, lehetnek a kereskedelemben kapható kitűnő vivőanyagok, melyekben az alkilcsoportok, mint az oktadecil- és oktilcsoportok kémiailag kötődnek a szilikagél szilanolcsoportjaihoz, vagy lehetnek általános felhasználásra készült vivőanyagok, mint polisztirol típusú porózus polimer gélek. A WAP-8294A és az AX komponensei ezen töltőanyagok segítségével jó hatásfokkal szétválaszthatok. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia mozgó fázisa lehet víztartalmú acetonitril megsavanyítva például trifluor-ecetsawal, a mozgó fázis lehet víztartalmú, rövid szénláncú alkohol, mint víztartalmú metanol, vagy pufferoldat.

(Fizikokémiai tulajdonságok)

A WAP-8294A, A„ A₂, A₄, AX, AX-8, AX-9 és AX-13 komponensek - melyeket a fent ismertetett kromatográfiás technikákkal kaptunk -, és az ezekből teljes savas hidrolízissel kapott, ninhidrin-pozitív anyagok, és a savas hidrolizátum éteres extraktumai fizikokémiai tulajdonságait az alábbiakban részletezzük.

WAP-8294A (1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 213-220 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, nbutanolban, dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, nem oldódik acetonban; etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakció: ninhidrin-pozitív, pozitív Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldata, kénsav-, jódgőzreakciót ad és kioltási foltot ad UV-lámpa által kibocsátott 254 nm-es fénnyel besugározva, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, vas-klorid- és Dragendorffreakciót ad.

(5) A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (1. ábra) retencióidői: 4,0-6,1 perc, 8 perc, 11,1 perc,

12,5 perc, 16,5 perc, 17,9 perc és 18,8 perc.

(6) Ultraibolya abszorpciós spektrum (vízben): X_max=275 nm; 280 nm; 287 nm.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (FT-IR; KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm*¹; 1720-1715 cm*¹; 1636 cm*¹; 1541 cm*¹; 1404 cm*¹; 1207 cm*¹; 1137 cm*¹.

(8) Molekulatömeg: 1400-1700.

(9) A szerves anyag kvalitatív analízise: (nátriumolvadék-módszer): az antibiotikum szén- és hidrogéntartalmú anyag, tartalmaz oxigént és nitrogént.

(10) A teljes savas hidrolízis eredménye: ninhidrinpozitív anyagok: Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Trp, Om, N-metil-valin, β-hidroxi-aszpartámsav és N-metil-fenil-alanin.

(11) Fajlagos forgatóképesség: [a]_p ²⁰ = +42° (c=0,5,H₂O).

(12) Bázisos, savas és semleges besorolás: amfoter.

A WAP-8294A antibiotikum.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 215-225 °C (bomlik).

HU 218 351 Β (3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, n-butanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakciók: ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsav- és jódgőzreakciója pozitív, kioltási foltot ad 254 nm-es UV-fénnyel besugározva; negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, vas-klorid- és Dragendorff-reakciót ad.

(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfiánál: 8,0 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): Á_max=275 nm; 280 nm; 287 nm.

(7) IR abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr); jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm¹, 1720-1715 cm^-1, 1636 cm-¹, 1541 cm-¹, 1404 cm-¹, 1207 cm-¹, 1133 cm-¹.

(8) Molekulatömeg: 1547,9 [FAB-MS m/z

1548.9 (M+H)+, m/z 1546,7 (M-H)].

(9) Tapasztalati képlet: C₇₂H102O21A7, [(M+H)⁺ion mért m/z értéke, FAB-Mass High Resolution mérés eredménye: 1548,8088; számított m/z érték: 1548,8063].

(10) A teljes savas hidrolízis eredménye: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól) Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metil-fenil-alanin (1 mól) és 3-hidroxioktánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség: [a]_p ²⁰=+41° (c=0,5, H₂O) (12) Bázisos, savas és semleges besorolás: amfoter.

WAP-8294A₂ antibiotikum (1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 215-225 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, n-butanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, nem oldódik acetonban, etil-acetátban, kloroformban.

(4) Színreakciók: ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsav-, jódgőz-pozitív reakciókat ad, kioltási foltot ad 254 nm-es UV-fénnyel besugározva, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-kloridés Dragendorff-próbát ad.

(5) A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia retenciós ideje: 11,1 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben) (2. ábra): X_max: 275 nm (E! cm^I% 31,8); 280 nm (Ej cm^ls 33,4); 287 nm (E, cm^1% 29,2).

(7) IR abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr) (3. ábra): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm-¹, 1720-1715 cm¹, 1636 cm-¹, 1541 cm-‘, 1404 cm-¹, 1207 cm¹,1137 cm-¹.

(8) ’H-NMR-spektrum: (270 MHz, D₂O) (4. ábra): komplikált protonjeleket figyeltünk meg, melyek metil-, metilén-, metincsoportoktól és heterociklusos vagy aromás gyűrűktől erednek.

(9) Molekulatömeg: 1561,9 [FAB-Mass m/z

1562.9 (M+H)+, m/z 1561,2 (M-H)-].

(10) Tapasztalati képlet: C93H_lllO₂iN_i7 [(M+H)⁺ion m/z mért értéke High Resolution FAB-Mass segítségével meghatározva: 1562,8224; számított m/z érték 1562,8219], (11) A teljes savas hidrolízis eredménye: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metil-fenil-alanin (1 mól) és 3-hidroxi-7-metiloktánsav (1 mól).

(12) Fajlagos forgatóképesség: [a]_D ²⁰=+42° (C=0,5;H₂O).

(13) Bázisos, savas és semleges besorolás: amfoter.

WAP-8294A₄ antibiotikum.

(1) Megjelentés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 215-225 °C (bomlik).

(4) Színreakciók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsav-, jódgőzreakciókat ad, kioltási foltot ad 254 nm-es UV-fénnyel besugározva; negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciót ad.

(5) Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia retenciós ideje: 16,5 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): X_max=275 nm, 280 nm, 187 nm.

(7) IR abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm¹, 1720- 1715 cm ', 1636 cm-¹, 1541 cm-¹, 1404 cm-', 1207 cm-¹, 1137 cm¹.

(8) Molekulatömeg: 1575,9 [FAB-Mass m/z

1576,9 (M+H)+, m/z 1575,4 (M-H) ].

(9) Tapasztalati képlet: υ^Η^Ο^Νβ [mért m/z érték (M+H)⁺ ionra High Resolution FAB-Mass méréssel: 1576,8363; számított m/z érték: 1576,8375].

(10) Savas hidrolizátum: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól) β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metil-fenil-alanin (1 mól) és 3-hidroxi-8metilnonánsav (1 mól).

(11) Fajlagos rotáció: [α][)^2θ=+43^θ (c=0,5 H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges besorolás: amfoter.

Az elúciós feltételek a C₁₀ fordított fázisú szilikagél nagy teljesítményű folyadékkromatográfia a WAP-8294A, A,, A₂ és A₄-ra

Oszlop: YMC A-312 (6x150 nm).

Mobil fázis: 0,05% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril: víz (45:55).

Jellemző hullámhossz: UV 214 nm.

Áramlási sebesség: 1 ml/perc.

WAP-8294AX antibiotikum (1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 196-200 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, nbutanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban és nem oldódik acetonban, etil-acetátban, kloroformban.

(4) Színreakciók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsavés jódgőzreakciókat ad, kioltási foltot ad 254 nm-es UV-fénnyel besugározva, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciót ad.

HU 218 351 Β (5) Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (6. ábra) retenciós idői: 5,3 perc, 5,9 perc, 6,2 perc,

6,5 perc, 6,9 perc, 7,3 perc, 8,1 perc, 9,3 perc, 9,8 perc, 11,3 perc, 9,8 perc, 11,3 perc, 12,1 perc, 13,7 perc és 15,0 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): λ_ιη3Χ: 273 nm, 280 nm, 289 nm.

(7) IR abszorpciós spektrum (FT-ÍR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm^-1,1720-1715 cm^-1, 1636 cm^-1, 1541 cm^-1, 1404 cm^-1, 1207 cm^-1, 1137 cm-i.

(8) Molekulatömeg: 1400-1700.

(9) Kvalitatív elemanalízis (nátriumolvadékos módszer): az antibiotikum alkotóelemei: szén, hidrogén, oxigén és nitrogén.

(10) Teljes savas hidrolízis: ninhidrin-pozitív anyagok és zsírsavak: Asp, Glu, Gly, β-Ala, Leu, Ser, Trp, Om, Val, N-metil-valin, β-hidroxi-aszpartámsav, Phe, N-metil-fenil-alanin és 3-hidroxi-7-metiloktánsav.

(11) Fajlagos fogatóképesség [a]_D ²⁰=+24° (c=0,5, H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges besorolás: amfoter.

WAP-8294AX-8 antibiotikum (1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 196-200 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, nbutanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakció: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldatban, kénsav- és jódgőzreakciókat ad, kioltási foltokat ad 254 nm-es UV-fénnyel besugározva, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciót ad.

(5) Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia retenciós ideje: 9,3 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben) (7. ábra): X_max: 273 nm, 280 nm, 289 nm.

(7) IR abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr) (8. ábra): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm¹, 1720-1715 cm-·, 1636 cm-¹, 1541 cm-¹, 1404 cm¹, 1207 cm-¹,1133 cm-'.

(8) Ή-NMR-spektrum: (270 MHz BMSO-D₆) (9. ábra): komplikált protonjeleket figyeltünk meg, melyek a metil-, metilén-, metincsoportoktól, illetve a heterociklusos és aromás gyűrűktől származtak.

(9) Molekulatömeg: 1548 [FAB-Mass m/z 1549(M+H)+], (10) Tapasztalati képlet: C₇₂H₁₀₉O₂₁N₁₇ [mért m/z érték (M+H)⁺ ionra, High Resolution FAB-Mass meghatározással: 1548,8079; számított m/z érték: 1548,8063], (11) Teljes savas hidrolízis: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), Val (1 mól), β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metil-fenil-alanin (1 mól) és 3-hidroxi-7-metiloktánsav (1 mól).

(12) Fajlagos forgatóképesség: [a]_D ²⁰ =+25° (c=0,5, H₂O).

(13) Bázisos, savas, semleges besorolás: amfoter.

WAP-8294AX-9 antibiotikum.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 216-220 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, n-butanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakció: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldatban, kénsav- és jódgőzreakciókat ad, kioltási foltokat ad 254 nm-es UV-fénnyel besugározva; negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciókat ad.

(5) Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia retenciós ideje: 9,8 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): ^^=273 nm, 280 nm; 289 nm.

(7) IR abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm^-1, 1720-1715 cm¹, 1636 cm¹, 1541 cm-¹, 1404 cm¹, 1207 cm-', 1137 cm-¹.

(8) Molekulatömeg: 1548 [FAB-Mass m/z 1549 (M+H)⁺; m/z 1547 (M-H)-].

(9) Tapasztalati képlet: C₇₂H₁₀₉O_hN₁₇ [High Resolution FAB-Mass méréssel kapott m/z érték (M+H)⁺ionra: 1548,8065; számított m/z érték: 1548,8062].

(10) Teljes savas hidrolízis: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxiaszpartámsav (1 mól), Phe (1 mól) és 3-hidroxi-7-metiloktánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség: [α]₀ ^2θ = + 28° (c=0,5,H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges besorolás: amfoter.

WAP-8294AX-13 antibiotikum (1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 205-210 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, nbutanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban és nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakció: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsav-, jódgőzreakciókat ad, kioltási foltokat ad 254 nm-es UV-fénnyel besugározva; negatív Molisch-, ezüstnitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciókat ad.

(5) Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia retenciós ideje: 15,0 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): λ_πιί1χ = =273 nm, 280 nm, 289 nm.

(7) IR abszorciós spektrum (FT-IR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm^-1, 1720-1715 cm-¹, 1636 cm¹, 1541 cm-¹, 1404 cm^-1, 1207 cm-·, 1137 cm-·.

(8) Molekulatömeg: 1576 [FAB-Mass m/z 1577 (M+H)+], (9) Tapasztalati képlet: C₇₄H₁₁₂O₂₁N₁₇ [mért m/z érték (M+H)⁺ ionra High Resolution FAB-Mass segítségével: 1576,8324; számított m/z érték: 1576,8375], (10) Teljes savas hidrolízis: Asp (1 mól), Glu (1 mól), β-Ala (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxi9

HU 218 351 Β aszpartámsav (1 mól), N-metil-fenil-alanin (1 mól) és 3-hidroxi-7-metiloktánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség: [a]_D ²⁰ = + 27° (c=0,5 H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges besorolás: amfoter.

A WAP-8294AX, AX-8, AX-9 és AX-13 antibiotikumok elúciós adatai a C₁₃ fordított fázisú szilikagél nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában a következők.

Oszlop: YMCA-312 (6x150 nm).

Mozgó fázis: 0,05% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril: víz (37:63).

Jelző hullámhossz: UV 214 nm.

Áramlási sebesség: 1 m/perc.

Biológiai tulajdonságok (1) Antibakteriális hatás

A 4. táblázat mutatja a WAP-8294A, Al, A₂ és A₄anyagok antibakteriális hatását a vizsgálat eredményeként. A minimális inhibitorkoncentráció- (MIC) értéket tápközeg-hígításos módszerrel állapítottuk meg, és eh5 hez szenzitív bouillon (húsleves) közeget használtunk (Eiken Chemical Co., Ltd.).

A 4. táblázat adatai azt mutatják, hogy a WAP-8294A, A_b A₂ és A₄ erős antibakteriális hatást fejt ki Gram-pozitív baktériumokkal szemben, beleért10 ve az MRSA-t (meticillinrezisztens Staphylococcus aureus) is, és az aktivitás nem kevesebb, mint nyolcszoros értékre nő, ha a tápközeghez 10% szarvasmarhaszérumot adunk.

Másrészt az anyagok teljesen hatástalanok Gram-ne15 gatív baktériumokkal, gombákkal és élesztőkkel szemben.

4-1. táblázat

	MIC (gg/ml)
A	A!
Szérum hozzáadása
A vizsgált baktérium	Nincs	10%	Nincs	10%
Staphylococcus aureus 1. (MRSA klinikán izolált törzs)	0,78	<0,10	0,39	<0,10
Staphylococcus aureus 11. (MRSA klinikán izolált törzs)	0,78	<0,10	0,39	<0,10
Staphylococcus aureus 371 R (MRSA klinikán izolált törzs)	0,78	<0,10	0,39	<0,10
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)	0,78	<0,10	0,39	<0,10
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)	0,78	<0,10	0,39	<0,10
Streptococcus pyogenes (ATCC 19615)	6,25	25	6,25	25
Bacillus subtilis (ATCC 6633)	0,78	<0,10	0,39	<0,10
Escherichia coli (ATCC 25922)	>100	>100	>100	>100
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)	>100	>100	>100	>100
Candida albicans (TIMM 0239)	>100	>100	>100	>100
Aspergillus fumigatus (IÁM 2004)	>100	>100	>100	>100

4-2. táblázat

	MIC (gg/ml)
A	A,
Szérum hozzáadása
A vizsgált baktérium	Nincs	10%	Nincs	10%
Staphylococcus aureus 1. (MRSA klinikán izolált törzs)	0,78	<0,10	0,78	<0,10
Staphylococcus aureus 11. (MRSA klinikán izolált törzs)	0,78	<0,10	0,78	<0,10

HU 218 351 Β

4-2. táblázat (folytatás)

	MIC (Mg/ml)
A	^A1
Szérum hozzáadása
A vizsgált baktérium	Nincs	10%	Nincs	10%
Staphylococcus aureus 371 R (MRSA klinikán izolált törzs)	0,78	<0,10	0,78	<0,10
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)	0,78	<0,10	0,39	<0,10
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)	0,78	<0,10	0,78	<0,10
Streptococcus pyogenes (ATCC 19615)	6,25	25	6,25	25
Bacillus subtilis (ATCC 6633)	0,78	<0,10	0,78	<0,10
Escherichia coli (ATCC 25922)	>100	>100	>100	>100
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)	>100	>100	>100	>100
Candida albicans (TIMM 0239)	>100	>100	>100	>100
Aspergillus fumiaatus (IÁM 2004)	>100	>100	>100	>100

A WAP-8294AX, AX-8, AX-9 és AX-13 anti- 25 bakteriális aktivitását hasonlóképpen határoztuk meg. Az eredményeket az 5. táblázatban tüntettük fel. A minimális inhibitorkoncentrációt (MIC) tápközeghígításos módszerrel határoztuk meg. A méréshez Muller-Hintontápközeget használtunk (DIFCO Company) 2% nát- 30 rium-kloriddal dúsítva az MRSA számára, és MullerHinton-tápközeget önmagában a többi baktériummal.

Az 5. táblázat adatai azt mutatják, hogy a WAP-8294AX, AX-8, AX-9 és AX-13 erős antibakteriális hatást mutat Gram-pozitív baktériumokkal szemben, beleértve a meticillinrezisztens Staphylococcus aureust is, és úgy találtuk, hogy az aktivitás kétszeresére növekszik, ha a tápközeghez 10% szarvasmarhaszérumot adunk.

Másrészt ezek az anyagok teljesen hatástalanok Gram-negatív baktériumokkal, gombákkal és élesztőkkel szemben.

5-7. táblázat

	MIC (Mg/ml)
AX-9	AX-8
Szérum hozzáadása
A vizsgált baktérium	Nincs	10%	Nincs	10%
Staphylococcus aureus 1. (MRSA klinikán izolált törzs)	1,56	0,78	3,13	3,13
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)	1,56	0,78	3,13	1,56
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)	1,56	0,78	1,56	0,78
Streptococcus pyogenes (ATCC 19615)	>100	>100	>100	>100
Bacillus subtilis (ATCC 6633)	1,56	0,78	1,56	0,78
Escherichia coli (ATCC 25922)	>100	>100	>100	>100
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)	>100	>100	>100	>100
Candida albicans (TIMM 0239)	>100	>100	>100	>100
Aspergillus fumigatus (IÁM 2004)	>100	>100	>100	>100

HU 218 351 Β

5-2. táblázat

	MIC (pg/ml)
AX-9	AX-8
Szérum hozzáadása
A vizsgált baktérium	Nincs	10%	Nincs	10%
Staphylococcus aureus 1. (MRSA klinikán izolált törzs)	3,13	1,56	3,13	3,13
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)	3,13	1,56	3,13	3,13
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)	1,56	0,78	1,56	0,78
Streptococcus pyogenes (ATCC 19615)	>100	>100	>100	>100
Bacillus subtilis (ATCC 6633)	3,13	1,56	3,13	1,56
Escherichia coli (ATCC 25922)	>100	>100	>100	>100
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)	>100	>100	>100	>100
Candida albicans (TIMM 0239)	>100	>100	>100	>100
Aspergillus fumigatus (IÁM 2004)	>100	>100	>100	>100

(2) A WAP-8294A védőhatása egerek kísérleti MRSA-fertőzésével szemben

Az AP-8294A erős antibakteriális hatást mutat in vitro Gram-pozitív baktériumokkal szemben, beleértve az MRSA-t is, mint azt a 4. táblázat adatai mutatják. Ezért kísérletileg határoztuk meg az antibiotikum védőhatását Staphylococcus aureus No. 1 (klinikán izolált MRSA törzs) fertőzéssel szemben, egerekben.

A kísérletben ICR-MCG egereket [4 hetes hím állatok, 8-8 db csoportonként (Nippon CLEA Co., Ltd.)] inraperitoneálisan kezeltünk 0,5 mg/0,5 ml/állat ciklofoszfamiddal három nappal a fertőzés előtt. Ezután intraperitoneálisan fertőztük az állatokat 0,5 ml, 2xl0⁵/ml Saphylococcus aureus No. 1 tenyészetet tartalmazó folyadékkal, melyben 5% mucin is volt. Egy órával a fertőzés után 10 mg/kg vankomicinhidrokloridot (Shionogi & Co., Ltd.) és 0,2 ml/egér WAP-8294A antibiotikumot (10 mg/kg, 5 mg/kg,

2,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,1 mg/kg vagy 0,05 mg/kg antibiotikumtartalommal) adtunk be az egereknek egyszeri szubkután injekcióban. A kontrollcsoportot szubkután kezeltük, 0,2 ml fiziológiás konyhasóoldattal.

Ezen kísérlet eredményei - melyeket a továbbiakban a 6. táblázatban mutatunk be - azt mutatják, hogy a kezelést nem kapott állatok mind elpusztultak a fertőzést követően 3 napon belül. Ezzel szemben az antibiotikummal kezelt csoportban a 8 db 10 mg/kg vankomicinkezelést kapott állat közül 5 db túlélte a fertőzés utáni 5 napot. Ezzel összehasonlítva a WAP-8294A kitűnő terápiás hatást produkált kis mennyiségben adagolva, ahogy a 6. táblázatban feltüntetett adatokból kitűnik. Az ED₅₀-értéket probit módszerrel határoztuk meg, és értékét 0,155 mg/kg-nak találtuk.

6. táblázat

Kísérleti szisztémiás MRSA-fertőzés WAP-8294A kezelésének eredményei egérben

30	Tcsztcsoport	Adag (mg/kg)	Túlélők A tesztelt állatok száma
35	Kontroll (fiziológiás sóoldat)		0/8
Vankomicin	10	5/8
	WAP-8294A anti-	10	8/8
	biotikum	5	8/8
		2,5	8/8
40		L0	8/8
	0,5	7/8
		0,25	5/8
		0,10	3/8
		0,05	1/8

A WAP-8294AX antibiotikum erős antibakteriális hatást mutat Gram-pozitív baktériumokkal szemben, beleértve az MRSA-t is, amint ezt az 5. táblázatban feltüntetett in vitro adatok mutatják, ezért elvégeztük az in vivő kísérletet is, azaz megvizsgáltuk a védőhatást Sta50 phylococcus aureus JCM8702 (klinikán izolált MRSA törzs) fertőzésével szemben.

A kísérlet során ICR-MCH egereket [4 hetes hím állatok (Nippon CLEA Co., Ltd.), csoportonként 8 db] kezeltünk intraperitoneálisan 0,5 mg/0,5 ml/egér ciklofoszfamiddal, három nappal azelőtt, hogy az állatokat intraperitoneálisan fertőztük 0,5 ml folyadékkal, mely 2xl0⁴/ml Staphylococcus aureus JCM8702 csírát és 5% mucint tartalmazott. Egy órával a fertőzés után 10 mg/kg vankomicin-hidrokloridot (Shionogi &

Co., Ltd.) és 2 ml/egér WAP-8294AX antibiotikumot

HU 218 351 Β (10 mg/kg; 2,5 mg/k„ 1,0 mg/kg és 0,5 mg/kg antibiotikumtartalommal) adtunk egyetlen szubkután injekcióval az egereknek. A kontrollcsoport tagjai ugyanúgy 0,2 ml fiziológiás sóoldatot kaptak.

A kísérlet eredményét a 7. táblázatban tüntettük fel. Mint az adatokból látszik, a 8 kontrollállatból, melyek semmiféle kezelést nem kaptak, hat darab 3 napon belül elpusztult a fertőzést követően. Az antibiotikummal kezelt csoportból 5 állat 5 nappal élte túl a fertőzést azon 8 állat közül, melyeket 10 mg/kg vankomicinnel kezeltünk. Ezzel szemben a WAP-8294AX kitűnő terápiás hatást mutatott kis dózisban is, amint ezt a 7. táblázat mutatja. Az ED₅₀-értékét meghatároztuk probitmódszerrel, és 1,25 mg/kg-nak találtuk.

7. táblázat

Kísérleti szisztémiás MRSA-fertőzés WAP-8294AX kezelésének eredményei egérben

Tesztcsoport	Adag (mg/kg)	Túlélők A tesztelt állatok száma
Kontroll (fiziológiás sóoldat)		2/8
Vankomicin	10	5/8
WAP-8294A anti-	10	7/8
biotikum	2,5	5/8
	1,0	4/8
	0,5	2/8

(3) Akut toxicitási vizsgálat egérben

A WAP-8294A antibiotikumot 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg és 250 mg/kg mennyiségben adtuk be intravénásán egereknek (4 hetes ICRMCH hím állatok, csoportonként 5 db), de akut toxicitást nem figyeltünk meg.

A WAP-8294AX antibiotikummal intraperitoneálisan kezeltünk egereket (4 hetes ICR-MCH hím állatok, csoportonként 5 db). A dózis 25 mg/kg és 100 mg/kg volt, de akut toxicitást nem észleltünk.

Az előzőek szerint a WAP-8294A, A_b A_b A₂, A₃, A₄, A_s, A₆, AX, AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 és AX-13 antibiotikumokat jó hatású terápiás hatóanyagnak találtuk bakteriális fertőzések kezelésében, különösen ha a fertőzést meticillinreszisztens Staphylococcus aureus okozta, mind emberben, mind állatban.

(Gyógyszerformák)

A találmány szerinti új antibiotikumokat gyógyszerként alkalmazhatjuk a szokásos módon, különböző adagolási formákban. Például alkalmazhatjuk orális készítményként mint por, granulátum, tabletta, kapszula és szirup, és alkalmazhatjuk parenterálisan a megfelelő gyógyszerformákban, mint (intravénás, intramuszkuláris, szubkután) injekciók, cseppek, kúpok, kenőcsök és ecsetelőszerek formájában. Ezen túlmenően a találmány szerinti új antibiotikumot biztonsággal lehet alkalmazni a szemészetben is parenterális készítmények formájában, mint szemcseppek vagy szemkenőcsök, minthogy baktericid hatása erősebb, mint a vankomiciné, és kis koncentrációban lehet alkalmazni.

A különböző gyógyászati készítményeket az ismert módszerekkel lehet előállítani, azaz inkorporálni lehet azokat a szokásos ingrediensekbe, gyógyászatilag elfogadható, manapság használt, ismert segédanyagokba, mint excipiensek, kötőanyagok, szétdobószerek, bevonószerek, kenőanyagok, stabilizátorok, javítók vagy aromaanyagok, szolubilizálószerek, szuszpendálószerek, hígítószerek, és ezután a keveréket a megfelelő adagolási formává alakíthatjuk.

A dózis változhat, például a kezelt betegség, a kezelés módja, az adagolási időközök szerint, de előnyös az 5 mg - 2000 mg napi adag felnőtteknek, melyet napjában egyszer vagy több részletben adhatunk be.

A találmányt a jobb megértés érdekében a következő példákkal is bemutatjuk, de a találmány nem korlátozódik a példákra.

1. példa

Négy darab 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba 100100 ml (pH 7,2) táptalajt mérünk, mely 2,5% glukózt, 2,0% zsírmentesített szójalisztet, 0,4% szójaolajat, 0,25% nátrium-kloridot és 0,5% kalcium-karbonátot tartalmaz, sterilezve van, és be van oltva 1 platinakacs Lysobacter sp. WAP-8294 törzzsel, melyet ferde agar közegben tenyésztettünk, ezt 30 °C-on 2 napig tenyésztjük, mialatt a lombikokat rotációs rázógépen 180 löket/perc sebességgel rázatjuk. Ezután 150 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba, 100-100 ml előbbi módon készített és sterilezett táptalajt mérünk, és az előbbi tenyészetből 2 ml-rel beoltjuk, és 30 °C-on 4 napig tenyésztjük az előbbi sebességgel működő rázógépen. Meghatározzuk az antibiotikus aktivitást agarlemezmódszerrel, Staphylococcus aureus No 1. tesztorganizmussal.

2. példa

Az 1. példa szerinti tápközeget folyamatos centri&gálásnak vetjük alá (9000 rpm), és így 15 1 felülúszót kapunk. Ezt (pH 6,9) átengedjük egy Amberlite IR-120B (H⁺ fázis 1,5 1; Rohm & Haas Co.) töltetű oszlopon, így 15 1 effluenst és 3 1 vizes mosófolyadékot kapunk. Az effluenst és a mosófolyadékot egyesítjük, a pH-t 3-ra állítjuk, az egyesített folyadékot kromatografáljuk, aktív szenes töltetű oszlopon átengedve (700 ml WAKO PURE Chemical Co., Ltd.). A töltetet 4 1 vízzel mossuk, az aktív anyagokat leoldjuk 2x4 1 80%-os aceton:víz eleggyel (pH 12). A kapott eluátumot 800 ml-re koncentráljuk, a pH-t sósavval 3-ra állítjuk, etil-acetáttal (3x400 ml), majd n-butanollal (3 x 400 ml) extraháljuk. A butanolos fázis bekoncentrálásával, majd liofilizálással 6,4 g nyersterméket (hidroklorid) kapunk.

3. példa

A 2. példa szerint kapott nyersterméket (6,4 g) kromatografáljuk cellulóztöltetű (450 ml; E. Merck Company) oszlopon, frakcionáltan eluáljuk acetonitril-ecetsav-víz (75:1:25) eleggyel. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, betöményítjük és liofilizáljuk. így 880 mg

HU 218 351 Β

WAP-8294A (hidroklorid)-hoz jutunk, fehér por formájában.

4. példa

A 3. példában kapott WAP-8294A-t (700 mg) fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás oszlopon engedjük keresztül, melynek töltete oktadecil szilikagél [oszlop: YMC-GEL SH-343-5, 20x250 mm, Yamamura Chemical Research Laboratory; mobil fázis: 0,05% trifluor-ecetsav-tartalmú acetonitril: víz (45:55)], tíz nem egyenlő frakciót szedünk, melyek a WAP-8294A_b A₂ és A₄ komponenseket tartalmazzák, ezeket koncentráljuk. így WAP-8294A] (50 mg), A₂ (210 mg) és A₄ (16 mg) frakciókat kapunk fehér por formájában (hidroklorid).

5. példa

A WAP-8294A aminosav analízise

A 3. példában kapott WAP-8294A (5 mg) anyagot 0,5 ml 4N metánszulfonsav-oldatban oldunk, melyhez 0,2% 3-(2-amino-metil)-indolt adtunk. így teljes hidrolízisnek vetjük alá 110 °C-on 24 órán kresztül. A kapott hidrolizátumot szárazra pároljuk, kevés vízben oldjuk, ezután átengedjük az oldatot egy Dowex 50WX-8 (H⁺fázis, 1 ml, Dow Chemical Company) töltetű oszlopon, 20 ml vízzel mossuk, majd 20 ml 0,5 N NH₄OH-oldattal. Az eluátumot szárazra pároljuk, kevés vízben oldjuk, majd kétdimenziós vékonyréteg-kromatográfiának vetjük alá [cellulózlemez; oldószer 1: n-butanol: ecetsav: víz (4:1:2); oldószer 2: n-butanol:piridin:ecetsav: víz (15:10:3:12)]. Ezután aminosavanalízist (Hitachi Amino Acid Analizátor L-8500) végzünk, és így az eluátum összetétele: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Ser (2 mól), Leu (1 mól), Trp (1 mól) és Om (2 mól), valamint még háromféle ismeretlen aminosav. Ezt a kétdimenziós TLC-analízist (WAP-8294A antibiotikum) mutatja az 5. ábra.

6. példa

Az ismeretlen aminosavak azonosítása

A 3. példában kapott WAP-8294A-ból 100 mg-hoz hozzáadunk 10 ml 6N sósavoldatot, melyben 4% tioglikolsav van, majd elvégezzük az antibiotikum hidrolízisét 110 °C-on, 20 óra alatt. A hidrolizátumot összegyűjtjük, koncentráljuk, a pH-t 7-re állítjuk, és oszlopkromatográfiának vetjük alá Sepabeads SP207 töltetű oszlopon (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), víz segítségével. Az 1. számú ismeretlen aminosavat tartalmazó 18-27 ml-es frakciót bekoncentráljuk, és Dowex 50WX-8 (H⁺ fázis, 9 ml) töltetű oszlopon engedjük át. Ezután 0,1 N sósavval eluálunk, a kapott eluátumot szárazra párolva 4 mg ismeretlen 1. számú aminosavat kapunk fehér por alakjában. A kapott aminosav molekulatömege 149 [FAB-MS m/z: 150 (M + H)⁺], és Ή-NMR-spektruma [D₂O, 270 MHz; kémiai sift: δ (ppm)] 4,53 (1H, d, J=2,9 Hz)-nál és 500 (1H, d, J=2,9 Hz)-nál és így a kapott anyag β-hidroxi-aszpartámsavanak bizonyul.

Autentikus β-hidroxi-aszpartámsavval (Sigma Company) összehasonlítva az ismeretlen 1. számú aminosav-hidroklorid ’H-NMR-spektruma (kémiai siftek) és R_rértéke (0,20) cellulóz TLC-a [oldószer=n-butanol : piridin: ecetsav :víz(15:10:3:12)] azonosnak bizonyult az autentikus minta megfelelő eredményeivel, így az ismeretlen 1. számú aminosavat β-hidroxi-aszpartámsavként azonosítottuk.

A Sepabeads SP207 oszlopról eluált 30-45 ml-es frakciót, mely az ismeretlen 2. számú aminosavat tartalmazza, bekoncentráljuk, és 10 ml-es aktívszén-töltetű oszlopra visszük. Az eluált frakciót 24 és 34 ml között fogjuk fel, (1 ml-es) Dowex 50WX-8 töltetű oszlopra visszük, 0,5 N NH₄OH-oldattal eluáljuk, szárazra pároljuk, és így 2,1 mg fehér por alakjában kapjuk az ismeretlen 2. számú aminosavat. Ennek az aminosavnak a molekulatömege 131 [FAB-MS m/z=132 (M+H)+], Az 'H-NMR-spektrum [D₂O, 270 MHz; kémiai siftek: δ (ppm)] 1,18-nál (6H, dd, J=7,0 Hz), 2,38-nál (1H, dg, J=4,8, 7,0 Hz), 2,87-nél (3H, s) és 3,55-nél (1H, d, J=4,8 Hz), és így ez az anyag N-metil-valinnak bizoyul. így ezt az aminosavat összehasonlítottuk N-metil-DL-valin (Sigma Company) autentikus mintájával, és azt találtuk, hogy az Ή-NMR-spektrum (kémiai siftek) és az R_rérték (0,71), (cellulóz TLC) [oldószer: n-butanol:piridin: ecetsav: víz (15:10:3:12)] az ismeretlen 2. számú aminosav és az autentikus N-metil-DL-valin esetében azonos volt, így az ismeretlen 2. számú aminosav Nmetil-valinnak bizonyult.

Ezután 80%-os acetonnal leoldjuk a következő frakciót a Sepabeads SP207 oszlopról, mely az ismeretlen

3. számú aminosavat tartalmazza, betöményítjük, és Dowex 50WX-8 töltetű oszlopra (H⁺ fázis, 1 ml) visszük. Az eluálást IN HCl-oldattal végezzük, és a kapott eluátumot szárazra párolva az ismeretlen 3. számú aminosav hidrokloridját kapjuk 3,5 mg-nyi fehér por formájában. Úgy találtuk, hogy ezen aminosav molekulatömege 179 [FAB-MS m/z; 180 (M + H)+], és Ή-NMR-spektruma [D₂O, 270 MHz; kémiai sift=δ (ppm)] 2,78-nál (1H, s), 3,32-nél (2H, d, J=6,2 Hz), 3,95-nél (1H, t, J=6,2 Hz), 7,4 - 7,5 (5H, m) jelenik meg, és így az anyag metil-fenil-alaninnak bizonyul, így ezt az aminosavat összehasonlítottuk az N-metil-Lfenil-alanin autentikus mintájával (Sigma Company) és azt találtuk, hogy az Ή-NMR-spektrum (kémiai siftek) és az R_rérték (0,82), melyet cellulóz TLC-n mértünk [oldószer=n-butanol: piridin: ecetsav: víz (15:10:3:12)] értékek teljesen megegyeznek. így az ismeretlen 3. számú aminosavat N-metil-fenil-alaninként azonosítottuk.

7. példa

A WAP-8294A_It A₂és A₄ aminosav analízise

A 4. példa szerint kapott WAP-8294A_b A₂ vagy A₄ körülbelül 30 pg-ját teljesen elhidrolizáljuk 6N HCl-dal, 110 °C-on 24 óra alatt, ezután betöményítjük, és aminosavanalízist végzünk rajta. Az eredmény: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Ser (2 mól), Leu (1 mól), Om (2 mól) Trp (1 mól), β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metil-valin (1 mól) és N-metil-fenilalanin (1 mól).

HU 218 351 Β

8. példa

A IVAP-8294A/, A₂ és A^-ben megtalálható zsírsavak izolálása és ezek szerkezete A 4. példában kapott WAP-8294A_rből 10 mg-ot

6N HCl-dal hidrolizálunk 110 °C-on 2 órán keresztül. A kapott hidrolizátumot éterrel extraháljuk, az étert bepárlással eltávolítjuk. így szárazra párolva 0,8 mg fehér port kapunk. Ennek az anyagnak a molekulatömege 160 [FAB-MS m/z=161 (M+H)+] és ’H-NMRspektrumában a csúcsok [CDClj, 270 MHz; kémiai csúcsok=ö (ppm)] 0,89-nál (3H, t, J=7,0 Hz) 1,3-1,55-nél (8H, m); 2,46-nál (1H, dd, J=16,5, 8,8 Hz), 2,58-nál (1H, dd, J= 16,5,3,3 Hz) és 4,3-nál (1H, m) vannak. Ennek megfelelően az anyag 3-hidroxioktánsav. Ezt az anyagot (100 pg) 0,1 ml benzol:metanol (8:2) elegyben oldjuk, és metil-észterévé alakítjuk szobahőmérsékleten, 10 perc alatt, egy csepp trimetil-szilil-diazometán (Tokyo Chemical Industry, Co., Ltd.) hozzáadásával. A metil-észter-származék EI-MS mérése során megfigyeltünk egy ioncsúcsot m/z 173-nál (M⁺-l), ioncsúcs-töredéket m/z 103-nál a 3-hidroxi-zsírsav-metilészter C₃-C₄ atomjainak hasításából. így ezt az anyagot 3-hidroxioktánsavnak találtuk.

A WAP-8294A,10 mg-ját savas közegben, a fentiekhez hasonló módon hidrolizáljuk, éterrel extraháljuk, szárazra pároljuk, és így 0,9 mg fehér port kapunk. Ennek az anyagnak a molekulatömege 174 [FAB-MS m/z = 175 (M+H)⁺] és az 'H-NMR-spektrumában [CDClj, 270 MHz; kémiai csúcsok: δ (ppm)] a csúcsok 0,87-nél (6H, d, J=6,6 Hz), 1,15—1,56-nál (7H, m), 2,50-nél (1H, dd, J=16,5, 8,8 Hz), 2,60-nál (1H, dd, J=16,5, 3,3 Hz) és 4,03-nál (1H, m) jelennek meg, és a metil-észter-származék EI-MS csúcsai m/z 187nél (M+-1), 170-nél (M+-18), 157-nél (M+-31), 139nél (M+-31-18) és 103-nál (bázis töredékion csúcs, mely a C₃-C₄ hasításából származik). Ezt az anyagot ennek megfelelően 3-hidroxi-7-metiloktánsavként azonosítottuk.

A WAP-8294A₄ 10 mg-ját savas közegben hidrolizáljuk a fenti módon, majd éterrel extraháljuk, szárazra pároljuk, és így 0,8 mg fehér port kapunk. Ennek az anyagnak a molekulatömege 188 [FAB-MS m/z=189 (M+H)⁺] és 'H-NMR-spektrumában a csúcsok [CDClj, 270 MHz; kémiai csúcs:δ (ppm)] 0,80nál (6H, d, J=6,8 Hz), 1,15-1,6 (9H, m), 2,43-nál (1H, dd, J=16,5, 8,8 Hz), 2,50-nél (1H, dd, J= 16,5, 3,3 Hz) és 3,95-nél (1H, m) vannak és a metil-észter-származék EI-MS csúcsai m/z 201-nél (M+-1), 184-nél (M+-18), 171-nél (M+-31), 153-nál (M+-31-18) és 103-nál (bázis iontöredék csúcs, mely a C₃-C₄ hasításából származik). Ezt az anyagot ennek megfelelően 3hidroxi-8-metilnonánsavként azonosítottuk.

9. példa

A 2. példa szerint kapott nyersterméket (9,0 g) kromatografáljuk úgy, hogy oktadecil-szilikagél-töltetű (Chromatolex ODS-DM1020T, Fuji Silica Chemical CO., Ltd., 450 ml) oszlopon engedjük át, és ezután eluáljuk 0,05% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril: víz (4:6) oldószerrendszerrel. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, koncentráljuk, majd liofílizáljuk. így

450 mg WAP-8294AX hidrokloridot kapunk fehér por formájában.

10. példa

A 9. példában kapott WAP-8294AX antibiotikumot körülbelül 10 részletben engedjük át egy oktadecilszilikagél-töltetű oszlopon nagy teljesítményű folyadékkromatográfia céljából [oszlop: YMC-GEL SH-343-5, 20x250 mm; Ayamamura Chemical Research Laboratory; mobil fázis: 0,05% trifluorecetsavat tartalmazó acetonitril: víz (37:63)], körülbelül 10 részletben összegyűjtjük a frakciókat, melyek a WAP-8294AX-8, AX-9 vagy az AX-13 antibiotikumokat tartalmazzák. Ezután minden frakciót bekoncentrálunk, és így kapjuk a WAP-8294AX-8 (14 mg), az AX-9 (10 mg) vagy az AX-13 (12 mg) frakciókat fehér por formájában (hidroklorid).

11. példa

A WAP-8294AX-8, AX-9, AX-13 aminosav analízise

A 10. példában kapott WAP-8294AX-8-ból 5 mgot feloldunk 0,5 ml 1 n metánszulfonsavban, az oldathoz hozzáadunk 0,2% 3-(2-amino-metil)-indolt és teljes savas hidrolízist végzünk 110 °C-on 24 órán keresztül. Ezután a kapott hidrolizátumot szárazra pároljuk, kevés vízben oldjuk, majd egy oszlopon engedjük át, melynek töltete DOWEX 50WX-8 (H⁺ fázis Dow Chemical Company, 1 ml), 20 ml vízzel mossuk, és 20 ml 0,5 n NH₄OH-dal eluáljuk. A kapott eluátumot kocentráljuk, szárazra pároljuk, kevés vízben oldjuk, majd kétdimenziós vékonyréteg-kromatográfiának [kifejlesztőoldat az

1. dimenzióhoz: n-butanol:ecetsav:víz (4:1:2); kifejlesztőoldat a 2. dimenzióhoz: n-butanol: piridin :ecetsav:víz (15:10:3:12)] és aminosavanalízisnek (Hitachi Amino Acid Analyzer L-8500). A vizsgálat eredménye szerint a WAP-8294 AX-8 aminosavai a következők: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Ser (2 mól) Leu (1 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), Val (1 mól), Nmetil-fenil-alanin 1 mól) és β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól).

Ezen túlmenően 5 mg WAP-8294AX-9-et és ΑΧ-13-at is teljes savas hidrolízisnek vetettünk alá, és elvégeztük az aminosavanalízist is, a fenti módon.

A WAP-8294AX-9 aminosav-összetétele a következő: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Ser (2 mól), Leu (1 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), Phe (1 mól), Nmetil-valin (1 mól) és β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól). A WAP-8294 AX-13 aminosav-összetétele a következő: Asp (1 mól), Glu (1 mól), β-Ala (1 mól), Ser (2 mól), Leu (1 mól) Trp (1 mól), Om (2 mól), Nmetil-fenil-alanin (1 mól), N-metil-valin (1 mól) és βhidroxi-aszpartámsav (1 mól).

12. példa

A WAP-8294AX-8, AX-9 és AX-13 zsírsav analízise

A 10. példában kapott WAP-8294AX-8-at, ΑΧ-9-et és AX13-at (1-1 mg) 6N sósavban 110 °C-on

HU 218 351 Β ?

órán keresztül hidrolizáljuk. Mindegyik hidrolizátumot éterrel extraháljuk, majd az extraktumot szárazra pároljuk, a maradékot 0,1 ml benzol: metanol (8:2) elegyben oldjuk, és metil-észterré alakítjuk szobahőmérsékleten 10 perc alatt egy csepp trimetil-szilil-diazometán (Tokyo Chemical Industry, Co., Ltd.) hozzáadásával. Mindegyik metil-észter-származékot GC-MS-analízisnek [oszlop: DB-5 (belső átmérő: 0,25 mm; hosszúság: 30 m; fílmvastagság: 0,25 pm; J. & W. Company); hőmérséklet: 100-240 °C (felfűtési sebesség: 10 °C/perc); gázfázis: héliumáramlási sebesség: 0,993 ml/perc] vetettük alá. Mindhárom esetben a retenciós idő (9,7 perc) a GC-analízisben és m/z az EI-MSmeghatározás szerint 187 (M⁺-l), 170 (M+-18), 157 (M+-31), 139 (M+-31-18) és 103 (a C₃-C₄ hasításból ered; karakterisztikus bázis töredékion csúcs) megegyezett a 3-bidroxi-7-metiloktánsav (a WAP-8294A₂ egyik alkotó zsírsava) megfelelő értékeivel. Ez azt mutatja, hogy a WAP-8294 AX-8, AX-9 és AX-13 tartalmaz 3-hidroxi-7-metiloktánsavat zsírsavkomponensként.

73. példa lVAP-8294A-t tartalmazó gyógyszerkészítmények

A továbbiakban néhány tipikus WAP-8294A gyógyszerkészítményt ismertetünk.

Injekció: a Japán Gyógyszerkönyv 12. kiadás, „Általános alapelvek a készítményekkel kapcsolatban” „Injections” fejezetében leírtak alapján 40 mg WAP-8294A hidrokloridot oldunk 3 ml sterilezett fiziológiás sóoldatban (Japán Gyógyszerkönyv), sterilen töltjük 3 ml-es ampullákba, és leforrasztjuk.

Tabletta: a Japán Gyógyszerkönyv 12. kiadás „Általános alapelvek készítményekkel kapcsolatban „Tabletták” fejezetében leírtak szerint 100 mg WAP-8294A, hidrokloridhoz 65 mg laktózt (Japán Gyógyszerkönyv) és 14,2 mg keményítőt (Japán Gyógyszerkönyv) és adalékanyagokat, 20 mg poli(vinil-pirrolidon) K25-öt (Japán Gyógyszerkönyv) és kötőanyagokat; és 0,8 mg magnézium-sztearátot (Japán Gyógyszerkönyv) adunk (ez utóbbit lubrikánsként). Ezután az elegyet homogenitásig kevertetjük, tablettázógépen bevonat nélküli tablettákat préselünk, tömegük 200 mg).

Kenőcsök: az „Általános alapelvek készítményekkel kapcsolatban „Kenőcsök” fejezetében leírtak szerint 40 mg WAP-8294A, hidrokloridhoz hozzáadunk 1,2 g polietilénglikol 4000, (Japán Gyógyszerkönyv)-et 600 mg polietilénglikol 400-at (Japán Gyógyszerkönyv), 156 mg hidrofd vazelint (Japán Gyógyszerkönyv), 0,8 mg propil-p-oxibenzoátot (Japán Gyógyszerkönyv), 3,2 mg etil-p-oxi-benzoátot (Japán Gyógyszerkönyv) gombaellenes szerekként, ezt megolvasztva, egyneművé gyúrva és melegítve kenőccsé alakítjuk (4 g/összenyomható tubus).

Szemcseppek: az „Általános alapelvek készítményekkel kapcsolatban” „Szemcseppek” fejezetében leírtak szerint 25 mg WAP-8294A₂ hidrokloridot feloldunk 5 ml 0,9%-os sterilezett nátrium-klorid-oldatban, majd 0,5 mg benzalkónium-kloridot (Japán Gyógyszerkönyv) adunk hozzá tartósítószerként és így oldatot készítünk, ezt sterilre szűrjük és steril körülmények között kiszereljük 5 ml-es csepegtetőüvegekbe.

Mint fent leírtuk és bemutattuk fertőzéses állatmodellen, a találmány szerinti új WAP-8294A antibiotikum kiváló terápiás tulajdonságokkal rendelkezik Gram-pozitív baktériumok által okozott fertőzéses megbetegedések kezelésében, különösen az MRSA (meticillinrezisztens Staphylococcus aureus) esetében, mely újabban a gyógyászat területén súlyos problémát jelent. Ezért ez az antibiotikum hatékony lehet Gram-pozitív baktériumok, beleértve az MRSA-t is, okozta fertőzések kezelésében.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. A WAP-8294A antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melynek fizikokémiai tulajdonságai a következők.

(1) Megjelenés: fehér por.
(2) Olvadáspont: 213-220 °C (bomlik).
(3) Oidékonyság: oldódik vízben, metanolban, n-butanolban, dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, és oldhatatlan acetonban, etil-acetátban és kloroformban.
(4) Színreakciók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsavés jódgőzreakciók, és kioltási foltot ad 254 nm-es UV besugárzás hatására; negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciók.
(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában: 4,0-6,1 perc, 8,0 perc, 11,1 perc, 12,5 perc,

16,5 perc, 17,9 perc és 18,8 perc.
(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): λ_ΠΜΚ: 275 nm, 280 nm, 287 nm.
(7) Infravörös abszorciós spektrum (FT-IR, KBr); jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm^-1, 1720-1715 cm-', 1636 cm-', 1541 cm ', 1404 cm->, 1207 cm-', 1137 cm-'.
(8) Ή-NMR-spektrum: (270 MHz, D₂O): bonyolult protonjelek, melyek metil-, metilén-, metincsoportoktól és heterociklusos és aromás gyűrűktől származnak.
(9) Molekulatömeg: 1400-1700.
(10) Kvalitatív analízis (nátriumolvadékos módszer): az antibiotikumfelépítő elemek: szén, hidrogén, oxigén és nitrogén.
(11) A teljes savas hidrolízis ninhidrin-pozitív anyagai: Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Trp, Om, N-metil-valin, β-hidroxi-aszpartámsav és N-metil-fenil-alanin;
(12) Fajlagos forgatóképesség: [a]_D ²⁰=+42° (c=0,5; H₂O).
(13) Bázisos, savas, semleges jelleg: amfoter.

2. A WAP-8294A] antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melyek fizikokémiai tulajdonságai a következők.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 215-225 °C (bomlik).

(3) Oidékonyság: oldódik vízben, metanolban, nbutanolban, dimetil-formamidban és vízben, és oldhatatlan acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

HU 218 351 Β (4) Színreakciók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsavés jódgőzreakciók, és kioltási foltot ad 254 nm-es UVbesugárzás hatására; negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciók;

(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában: 8,0 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): L_max: 275 nm, 280 nm, 287 nm.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm ', 1720-1715 cm', 1636 cm-', 1541 cm¹, 1404 cm ', 1207 cm-', 1133 cm '.

(8) Molekulatömeg: 1547,9 [FAB-MS m/z

1548.9 (M+H)+, m/z 1546,7 (M-H)-].

(9) Tapasztalati képlet: C₇₂H₁₀₉O₂₁N₁₇ (10) A teljes savas hidrolízis eredménye: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metil-fenil-alanin (1 mól) és 3-hidroxioktánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség: [a]_D ²⁰=+41° (c=0,5, H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges jelleg: amfoter.

3. A WAP-8294A₂ antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melyek fizikokémiai tulajdonságai a következők.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 215-225 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, nbutanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakciók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsav-, jódgőzreakciók, kioltási foltot ad 254 nm-es UVbesugárzásra, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciók.

(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában: 11,1 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): Z_max: 275 nm, 280 nm, 287 nm.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): Jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm-', 1720-1715 cm ', 1636 cm-', 1541 cm ', 1404 cm-', 1207 cm-', 1137 cm'.

(8) Molekulatömeg: 1561,9 [FAB-Mass m/z

1562.9 (M+H)⁺, m/z 1561,2 (M-H)-].

(9) Tapasztalati képlet: C₇₃H_inO₂₁N₁₇.

(10) Teljes savas hidrolízis eredménye: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxiaszpartámsav (1 mól), N-metil-fenil-alanin (1 mól) és 3hidroxi-7-metiloktánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség·. [a]_D ²⁰ = +42° (c=0,5, H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges jelleg: amfoter.

4. A WAP-8294A₄ antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melyek fizikokémiai tulajdonságai a következők.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 215-225 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, n-butanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, és nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakciók : pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsav-, és jódgőzreakciók, kioltási foltot ad 254 nm-es UV besugárzásra, negatív Molisch-, ezüst-nitrát, ferri-kloridés Dragendorff-reakciók.

(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában: 16,5 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): X_max: 275 nm, 280 nm, 287 nm.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm-', 1720-1715 cm-', 1636 cm-', 1541 cm-', 1404 cm ', 1207 cm~', 1137 cm^-1.

(8) Molekulatömeg: 1575,9 [FAB-Mass m/z

1576.9 (M+H)+, m/z 1575,4 (M-H)-].

(9) Tapasztalati képlet: C₇₄Hii₃O₂iN₁₇.

(10) A teljes savas hidrolízis eredménye: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Orn (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metil-fenilalanin (1 mól) és 3-hidroxi-8-metilnonánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség: [a]_D ²⁰=+43° (c=0,5,H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges jelleg : amfoter.

5. A WAP-8294AX antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melyek fizikokémiai tulajdonságai a következők.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 196-200 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, n-butanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, és nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakciók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsavés jódgőzreakciók, kioltási foltot ad 254 nm-es UVbesugárzásra, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferriklorid- és Dragendorff-reakciók.

(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában: 5,3 perc, 5,9 perc, 6,2 perc, 6,5 perc,

6.9 perc, 7,3 perc, 8,1 perc, 9,3 perc, 9,8 perc, 11,3 perc, 12,1 perc, 13,7 perc és 15,0 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): X_max: 273 nm, 280 nm, 289 nm.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): Jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm-', 1720-1715 cm-', 1636 cm-', 1541 cm-', 1404 cm-', 1207 cm-', 1137 cm-'.

(8) Ή-NMR-spektrum: (270 MHz, DMSO-D₆): bonyolult protonjelek vannak a spektrumban, melyek metil-, metilén- és metincsoportoktól és heterociklusos vagy aromás gyűrűktől erednek.

(9) Molekulatömeg: 1400-1700.

(10) Kvalitatív analízis (nátrium-olvadékos módszer): az antibiotikum alkotóelemei: szén, hidrogén, oxigén és nitrogén.

HU 218 351 Β (11) A teljes savas hidrolízis eredménye: ninhidrinpozitív anyagok és zsírsavak: Asp, Glu, Gly, β-Ala, Leu, Ser, Trp, Om, Val, N-metil-valin, β-hidroxi-aszpartámsav, Phe, N-metil-fenil-alanin és 3-hidroxi-7-metiloktánsav.

(12) Fajlagos forgatóképesség: [a]_D ²⁰=+24° (c=0,5; H₂O).

(13) Bázisos, savas, semleges jelleg: amfoter.

6. A WAP-8294AX-8 antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melyek fizikokémiai tulajdonságai a következők.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 196-200 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, n-butanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban. nem oldódik: acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakiók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldatban, kénsav- és jódgőzreakciók, kioltási foltot ad 254 nm-es UV-besugárzásra, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakció.

(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfia: 9,3 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): k_max=273 nm, 280 nm, 289 nm.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm¹, 1720-1715 cm¹, 1636 cm’¹, 1541 cm’¹, 1404 cm¹, 1207 cm’¹,1133 cm’¹.

(8) Molekulatömeg: 1548 [FAB-Mass m/z 1549 (M+H)+], (9) Tapasztalati képlet: C₇₃H₁₀₉O₂₁N₁₇.

(10) A teljes savas hidrolízis eredménye: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), Val (1 mól), βhidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metil-fenil-alanin (1 mól) és 3-hidroxi-7-metilnonánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség: [α]₀ ^2θ=+25° (c=0,5, H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges jelleg: amfoter.

7. A WAP-8294AX-9 antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melyek fizikokémiai tulajdonságai a következők.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 216-220 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, nbutanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, és nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakeiók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsav- és jódgőzreakciók, kioltási foltot ad 254 nm-es UV-besugárzás hatására, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferri-klorid- és Dragendorff-reakciók.

(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában: 9,8 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): λ,_η3Χ: 273 nm, 280 nm, 289 nm.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm-¹,

1720-1715 cm¹, 1636 cm’¹, 1541 cm’¹, 1404 cm¹,

1207 cm’¹,1137 cm¹.

(8) Molekulatömeg: 1548 [FAB-Mass m/z 1549 (M+H)+; m/z 1547 (M-H)-].

(9) Tapasztalati képlet: C₇₂H₁₀₉O₂|N_I7.

(10) A teljes savas hidrolízis eredménye: Asp (1 mól), Glu (1 mól), Gly (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), Phe (1 mól) és 3-hidroxi-7-metiloktánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség: [α]₀ ^2θ = + 28° (c=0,5, H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges jelleg: amfoter.

8. A WAP-8294AX-13 antibiotikum vagy gyógyászatilag elfogadható sói, melyek fizikokémiai tulajdonságai a következők.

(1) Megjelenés: fehér por.

(2) Olvadáspont: 205-210 °C (bomlik).

(3) Oldékonyság: oldódik vízben, metanolban, nbutanolban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban, és nem oldódik acetonban, etil-acetátban és kloroformban.

(4) Színreakeiók: pozitív ninhidrin-, Ehrlich-, Rydon-Smith-, kálium-permanganát vizes oldat, kénsav-, és jódgőzreakciók, kioltási foltot ad 254 nm-es UV-besugárzás hatására, negatív Molisch-, ezüst-nitrát-, ferriklorid- és Dragendorff-reakciók.

(5) Retenciós idő nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában: 15,0 perc.

(6) UV abszorpciós spektrum (vízben): Á_max: 273 nm, 280 nm, 289 nm.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (FT-IR, KBr): jellemző abszorpciós spektrum: 3300 cm’¹, 1720-1715 cm-¹, 1636 cm >, 1541 cm ', 1404 cm 1207 cm¹, 1137 cm¹.

(8) Molekulatömeg: 1576 [FAB-Mass m/z 1577 (M+H)+j.

(9) Tapasztalati képlet : C₇₄H₁₁₃O₂₁N₁₇ (10) Teljes savas hidrolízis eredménye: Asp (1 mól), Glu (1 mól), β-Ala (1 mól), Leu (1 mól), Ser (2 mól), Trp (1 mól), Om (2 mól), N-metil-valin (1 mól), β-hidroxi-aszpartámsav (1 mól), N-metilfenil-alanin (1 mól) és 3-hidroxi-7-metiloktánsav (1 mól).

(11) Fajlagos forgatóképesség: [a]_D ²⁰= + 27° (c=0,5,H₂O).

(12) Bázisos, savas, semleges jelleg: amfoter.

9. Eljárás az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti WAP-8294A antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy a Lysobacter sp. WAP-8294 törzset megfelelő táptalajban aerob körülmények között tenyésztjük, majd az antibiotikumot elkülönítjük.

10. A WAP-8294A antibiotikumot termelő Lysobacter sp. WAP-8294 törzs.

11. Antibakteriális gyógyszerkészítmény, amely az 1-8. igénypontok szerinti WAP-8294A antibiotikumok közül legalább egyet, vagy annak valamely gyógyászatilag elfogadható sóját és legalább egy gyógyászatilag elfogadható segédanyagot tartalmaz.