CN1292663C

CN1292663C - 一种防治植物细菌病害的生物制剂及其应用

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Publication number: CN1292663C
Application number: CNB2005100110784A
Authority: CN
Inventors: 姬广海; 张世光; 魏兰芳; 何月秋; 李成云; 吴亚鹏
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2007-01-03
Anticipated expiration: 2025-10-21
Also published as: CN1771810A

Abstract

本发明涉及一种防治植物细菌病害的生物制剂及其应用，属生物农药技术领域。该生物制剂按常规方法制备。其生产菌株为抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13-1，已于2005年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO：1456。发明的菌株具有以下显著特点：(1)菌落圆形，培养后期为棕褐色；(2)该菌株抑菌谱广、抑菌能力强，能在马铃薯、魔芋等作物的根际定殖。本发明将该菌株，通过液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过液体发酵生产，加入润湿剂、展着剂等制备成液剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和凉干，制备成可湿性粉剂。本发明对多种作物细菌病害具有明显稳定的防治效果，综合性状好，易于工业化生产。

Description

一种防治植物细菌病害的生物制剂及其应用

技术领域：

本发明涉及一种防治植物细菌病害的生物制剂及其应用，属生物农药技术领域。

背景技术：

植物细菌性病害是仅次于真菌性病害，危害大、损失重、分布较广的世界性植物病害之一，尤其是细菌性青枯病是一种世界性的土传病害，危害番茄、辣椒、烟草、马铃薯等400余种经济作物，目前尚无农药可防治。对于多种作物的软腐病、水稻白叶枯病、红掌细菌性疫病等，目前国内市场上只有大剂量的化学农药可以防治，但一些病原细菌对生产上常用的农用链霉素表现抗药性，因此，农用链霉素的防病效果较差，另外，由于化学农药使用和残留量超过国际标准，出口农产品纷纷遭到拒绝和退货。

随着我国人民生活水平的提高，蔬菜等农产品的数量问题已经不是大家考虑的主要问题，而其质量特别是农药残留问题已经引起了几乎全体国民的忧患意识。目前对于细菌性害国内外主要采取的保守控制措施为：进行种薯(种子)消毒，拔除病株，加强检疫和采用卫生洁园等农业措施，控制进一步传播。因此，研究开发高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治植物细菌病害的生物制剂，已经是我国农业发展中迫在眉睫的问题。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术之不足，通过抗生素溶杆菌(Lvsobacterantibioticus)13-1的研究，开发出一种高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治植物细菌病害的生物制剂。

本发明采用的细菌是抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2005年9月13日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.1456。

抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13-1，系本发明人于2002年发现的一个国内外未见报道，可用于植物细菌病害生物防治的新菌株。

本发明的生产菌株13-1，分离自昆明市郊土壤，经形态学、培养性状、常规生理生化和Biolog全自动鉴定系统测定，以及16s rRNA和16S-23S rRNA ITS序列分析，该生防细菌为抗生素溶杆菌Lysobacter antibioticus的一个新菌株。16s rRNA序列(Genebank No.DQ188260)分析与抗生素溶杆菌Lysobacter antibioticus DSM 2044菌株(Genebank No.AB019582)同源性达99％，但该菌株的16S-23S rRNA ITS序列(GenebankNo.DQ188259)分析在Genebank中未发现与溶杆菌属内不同种相似的同源性序列。该菌株具有以下特征：(1)菌落圆形，不透明稀液状，培养初期为暗黄色，后期转为棕褐色菌落，菌体长杆状；(2)该菌株抑菌谱广、抑菌能力和作物根际定殖能力强，该菌株可在马铃薯、魔芋等作物的根际定殖。对重要作物的病原细菌Ralstonia Solanacearum，Pseudomonas syringae，Erwinia carotovora，Xanthomonas属中的X.oryzae pv.oryzae，X.axonopodis pv.diffenbachiae等均有显著抑制作用，抑菌圈直径平均为11.0-20.0mm，同时还对真菌(镰孢菌Fusarium spp.等)亦具有抑菌作用。(3)具有以下生理生化特征：革兰氏染色阴性，氧化酶和过氧化氢酶阳性，硝酸盐不还原，明胶液化、淀粉和吐温80不水解，吲哚和精氨酸双水解酶和脲酶阴性。能利用葡萄糖产酸，可水解酪蛋白；常规和Biolog生理生化特征：能利用N-乙酰-D-半乳糖、N-乙酰-D-葡糖胺、D-甘露糖、α-D-葡萄糖、D-海藻糖、柠檬酸、3-羟基乙酸、α-丁酮酸、α-酮戊二酸、丙酸、琥珀酸、溴琥珀酸、丙氨酰胺、L-脯氨酸、L-苏氨酸；不能利用L-丝氨酸、L-组氨酸、阿拉伯糖、麦芽糖、密二糖、组氨酸、纤维二糖等。该菌株在糖原、麦芽糖、α-D-葡萄糖、柠檬酸盐等项目上与Lysobacter antibioticus DSM 2044菌株具有差异。(4)本发明的生物制剂对多种重要细菌病害具有显著的防治效果，如Ralstonia solanacearum引起的植物青枯病，Erwinia carotovora supsp.carotovora等引起的作物(如魔芋、马蹄莲等)细菌性软腐病，Xanthomonas属病原细菌引起的作物细菌性病害如水稻白叶枯病等。同时具备了工业化生产的基本性状。

本发明按常规方法制备。即将抗生素溶杆菌13-1菌株，通过液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过液体发酵生产，加入润湿剂、展着剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和凉干，制备成液剂或可湿性粉剂。

本发明的生物制剂的具体制备过程如下：

一.液体发酵制剂生产

1.供试菌株

抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13-1菌株，由云南农业大学云南省植物病理重点实验室提供。

2.试管种培养(以下均为重量百分比)：将13-1菌株接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为1000毫升NA培养基：蛋白胨5g，蔗糖10克，酵母粉1g，牛肉浸膏3g，琼脂17-20g(培养基用)，蒸馏水(补足1000ml)。22-26℃下培养24-48h，获得试管种。

3.菌种摇床扩大培养

将斜面种子接种茄瓶斜面培养基上，培养基为NA培养基，配方前述试管种培养(2)相同。24-28℃下培养24-48h，获得茄瓶种子，供发酵生产用。

4.中试液体发酵生产

工艺流程如下：

试管菌种→茄瓶种子→孢子悬浮液→发酵罐(无菌空气，培养液)→发酵液→填充罐(轻质碳酸钙)→板框压滤机(弃去滤液)→滤饼→调浆→加入润湿剂、展着剂等→60℃烘干→粉碎→菌粉→质量检查。

具体发酵生产过程如下：

(1)茄瓶斜面种子液的制备

将已培养好的茄瓶斜面上的菌苔，用灭菌水洗下，制备细菌悬浮液。

(2).接种

采用茄瓶种子，将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐，操作严格，避免污染。升压时罐压不能超过1.5/平方厘米。

(3)液体发酵生产

a.发酵罐培养基：黄豆粉2％，葡萄糖0.3％，蛋白胨0.2％，淀粉3％、碳酸钙0.2％，鱼粉0.5％，花生油0.1％，硫酸铵0.05％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，磷酸氢二钾0.03％，消泡剂0.01％，NaOH 600g。灭菌前pH8.5。

b.灭菌：锅炉的总蒸汽压应在4-5公斤/平方厘米，以保证各管道的蒸汽压力。管道、空气过滤器、发酵罐及培养基的灭菌，均按生产工艺标准进行。

C.发酵条件的控制

罐温：发酵罐的罐温均控制在29±1℃，通过插入培养基的温度计测量，以夹层内通入冷却水或热水的方法进行调节。

罐压：发酵罐的罐压控制在0.06MPa，通过无菌空气入口和废气排放口进行调节。

搅拌：发酵罐的搅拌速度为200转/分钟。

通风量：8至15m³/h(根据细菌不同培养时期产气泡量进行调节)。

抽样检查：每2小时自取样管取样1次，测定pH，并涂片以结晶紫染色镜检菌体形态、有无杂菌的污染等，发酵罐放罐时镜检计数，并用培养基平板方法进行活菌的计数。

培养周期：发酵罐的培养周期约为36-48小时，当培养基中的菌数不再增加时即可停止培养，立即放罐。

液体发酵制剂：经平板计数测定含菌量，含菌量达180亿CFU/ml，供田间防治病害用。

2.固体生物制剂的生产

首先进行细菌的液体发酵生产(同前述一相同)。然后经加入填充剂、板框过滤、

打浆、干燥、粉碎，制成可湿性粉剂，供实验用。具体过程如下：

具体加入填充剂：将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入硅藻土(轻质碳酸钙)作为填充剂，加入后搅拌30分钟。

填充剂硅藻土(轻质碳酸钙)的加入量(公斤)＝〖发酵液菌数(亿/毫升)×放罐体积(升)×收率〗/成品菌数一发酵液中的残存物(公斤)。

板框过滤：用2公斤/平方厘米的压力，将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力应随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升。

打浆：将滤饼卸入打浆罐，按加入碳酸钙量的8％加入浓乳100号，或按3％加入SDS，加入适量的滤液均匀搅拌30分钟。

干燥：在温度60℃以下的烘于房内通风干燥至含水量5％-8％。

粉碎：粉碎时出料温度不能超过60℃，以防止菌体失活。

成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量18亿/克，其余各项指标均符合标准。

具体实施方式：

本发明的制剂主要防治对象为作物青枯病、魔芋软腐病、水稻白叶枯病等。本制剂可通过常规的灌根、浸种、喷雾等方式施用。本发明的制剂已在云南昆明市郊、曲靖富源和红河州蒙自等地的温室和田间小区防效试验，证明该生防制剂防效显著、稳定，可以有效地解决长期困扰青枯病、细菌性软腐病等防治难题。对青枯病的防效达94.3％～95.0％，细菌性软腐病防效达67.64-79.00％，对水稻白叶枯病的防治效果达到69.41-78.33％。

本生防制剂可以与其他的杀细菌农药、植物生长调节剂混合使用，但必须保证所混药剂对本发明采用的抗生素溶杆菌无副作用。

本发明的细菌生防制剂一般在作物播种或病害始发期施用。方法是播种前，采用发酵制剂与种球或种子浸(拌)种后，凉干施入土壤中，或在病害始发期将本制剂通过灌根施入作物根际周围或喷雾施用。对植物细菌病害发生严重地区可在作物生长过程中追施1至2次。

本发明的生防制剂具有明显稳定的防治效果，综合性状好，易于工业化生产。

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实例一：生防制剂对马铃薯青枯病的药效试验

1、试验用药剂：按液体发酵方法制备；以未接种的培养基3600转离心20分钟后过滤作为对照。

2、青枯病菌菌悬液体制备：青枯病菌菌株Tb23由中国农科院植物保护研究所何礼远教授提供。采用TTC培养基进行培养，28℃培养48-72h，接种是将病菌从固体培养基上用无菌水洗下制成菌悬液，在摇床上摇匀。接种时的浓度用分光光度计测定吸收值，OD(600nm)＝0.1，浓度相当于10⁸CFU/ml。

3、试验方法和结果分析：分为预防和治疗两组试验。预防控病试验方案为将马铃薯于2003年3月1日播种。每处理3次重复。在马铃薯成株期用发酵液体菌剂，生长期使用时，对水100、250、500倍灌根处理(2003.4.25)，3d后再用青枯病菌悬液灌根(2003.4.29)。并设清水对照处理和病原菌(Tb₂₃)处理。观察马铃薯的发病情况，在用病原菌灌根后14d、25d分别进行调查，记载各个处理的病情指数、发病率，并计算防效。治疗控病试验方法同上。不同之处是先用病原菌对马铃薯进行灌根处理，3d后再用生防菌剂的菌悬液进行灌根。在用病原菌灌根后14d、25d分别进行调查。所设对照、观察记载方法同上，每处理重复三次。

发病率％＝发病株(叶)数×100/调查总株(叶)数

病情指数＝∑(各级病株(叶)数×该病级值)×100/调查总株(叶)数×最高级值

防效％＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数

马铃薯青枯病病情调查分级标准(病情分为6级)：

0级：没有症状；I级：1-2个叶片萎蔫；II级：3片至全株1/3叶片萎蔫；III级：全株1/2叶片萎蔫；IV级：全株3/4叶片萎蔫：V级：整株植物萎蔫或死亡。

4、试验结果

结果表明：液体发酵制剂对马铃薯青枯病具有较好的防治效果，其中预防控病效果好于治疗控病效果(表1)。预防控制试验中14d测定的结果可知，病原菌处理的病株率达100％，病情指数最高为70.0；液体菌剂处理的病情指数为0，发病率为0；25d调查结果显示液体菌剂处理的马铃薯病情指数在5.0左右，植株发病率为14.3％至25.0％，防效为94.3％-95.0％。治疗控病试验中，14d测定的结果可知，对照的病情指数为70.0，发病率为100％，液体菌剂处理的平均病情指数18.3，最低病情指数为10.0，平均防效为73.8％，最高防效为85.7％。25d调查结果显示，液体菌剂处理平均防效仍达到52.5％，最高防效为62.5％。

表1 液体发酵制剂对马铃薯青枯病的防治效果

处理	病情指数		预防控病				治疗控病
			预防控病				治疗控病						发病率(％)		防效(％)		病情指数		发病率(％)		防效(％)
			14d	25d	14d	25d	14d	25d	14d	25d	14d	25d	发病率(％)		防效(％)		病情指数		发病率(％)		防效(％)		14d	25d
	100倍250倍500倍平均CK(Tb₂₃)	0b0b0b070.0a	14d	25d	14d	25d	14d	25d	14d	25d	14d	25d	5.7b5.7b5.0b5.47100.0a	0000100.0	14.314.325.017.9100.0	100.0100.0100.0100.0-	94.394.395.094.5-	10.0c20.0bc25.0bc18.370.0a	37.5b45.0ab60.0ab44.2100.0a	50.050.050.050..0100.0	100.075.0100.091.7100.0	85.771.464.373.8-	14d	25d	62.555.040.052.5-

注：同一栏中不同小与英文字母表示差异显著水平达0.05。

实例二：生防制剂对魔芋软腐病田间药效试验

1、实验地点及时间

试验地点：富源县竹园镇新街村委会补陆村

试验时间：2005年7月6日至2005年8月15日

2.试验材料及方法

2.1、供试药剂：生防菌13-1、可湿性粉剂(固体制剂)，对照杀菌剂为百菌清

2.2、供试作物：魔芋

2.3、防治对象：魔芋细菌性软腐病

2.4、试验方法：试验设5个处理，3次重复，共15个小区。小区面积不小于60平方米，随机排列。施药方法采用浇根法。每株魔芋根部浇药液50毫升，发病初期施第一次药，共施药2次，间隔7天。

2.5、调查方法：在魔芋发病后期，对试验小区进行病害调查。根据魔芋软腐病地上部分症状特点及病情发展趋势，我们将病斑分为环绕型和纵向型，前者病斑环绕叶柄，病情发展快。会很快引起复叶倒伏，危害性大；后者病斑只在叶柄一侧，多沿维管束纵向扩展，后期向横向扩展后导致整个叶柄腐烂。

魔芋软腐病的分级标准(病情分为5级)：

0级：无症状；1级：叶柄一侧有2cm以下小型水浸状病斑，或病斑长占叶柄总长度的1/10以下，同侧叶片轻度黄化；2级：叶柄一侧有2cm以上病斑，或病斑长占叶柄总长度的1/10--5/10，同侧叶片黄化；3级：病斑呈环绕型，或纵向型病斑长度占叶柄总长的5/10以上，叶片大部分黄化或部分枯死；4级：全叶枯黄或倒伏腐烂。

若整个复叶从顶端开始黄化，叶柄与块茎连接处有软腐症状，为块茎发病，病情归入3级。

3、实验结果及分析

从表2可以看出生防菌13-1可湿性粉剂对魔芋软腐病防治效果明显，其中稀释250倍处理防治效果最好，达到79％。灌根500倍和1000倍的处理，对魔芋软腐病控制效果分别为70.57％和67.64％。与稀释500倍百菌清相比，施用生防菌13-1的各个处理(250倍，500倍，1000倍，)的病株率分别比其低1.64％，2.01％，1.55％，病情指数比百菌清低4.22、3.53、3.29，防治效果比其高52.75％，44.32％，41.39％，显示了该生防制剂具有较好的防效，具备了生产上大量推广的基本条件。

本次施药方法采用浇根法。研究中发现，处理的魔芋植株，病原菌从茎基部侵入的机率显著降低，但仍发现一些田间地上部分腐烂植株，主要从叶片等地上部位侵入。因此，今后在施药方法上应用浇根法和叶面喷雾法结合使用，达到有效控制魔芋软腐病的目的。

表2 13-1可湿性粉剂对魔芋软腐病田间防治效果

处理	病情指数			总株数(株)	平均病株率(％)	平均病指	防治效果(％)
	病情指数							重复I	重复II	重复III
	CK稀释250倍稀释500倍稀释1000倍百菌清500倍	9.6251.4293.402.0256.83	7.211.7082.163.7154.92					重复I	重复II	重复III	7.7352.0231.6702.2106.080	900941953952927	123.593.223.685.23	8.191.722.412.655.94	79.0070.5767.6426.25

实施例三：生防制剂对水稻白叶枯病的药效试验

1、实验材料与方法

1.1、供试药剂：生防菌13-1液剂

1.2、供试作物：水稻

1.3、防治对象：水稻白叶枯病

1.4.实验地点：云南省红河州农业科学研究所(蒙自)水稻实验田，肥力中等，栽种感白叶枯病品种黄壳糯，小区为单行区，面积33平方米，每处理设3个重复，随机排列，共9个小区，四周设保护行，按优质水稻栽培措施规范化管理。

1.5病原菌和生防菌剂的制备：

水稻白叶枯病菌株53的制备：菌株在固体培养基上培养36-48h(28℃-30℃)接种是将病菌从固体培养基上用无菌水洗下制成菌悬液，在摇床上摇匀。接种时的浓度用分光光度计测定吸收值，0D(600nm)＝0.5，浓度相当于10⁸-10⁹CFU/ml。

1.6接种方法：先将生防菌13-1液剂喷雾接种在水稻叶片上(孕穗期)，3个重复，早、晚各喷一次并保温、保湿2天。4天后，将配好的水稻白叶枯病菌53喷雾接种到喷过生防菌13-1的水稻上，早、晚各喷一次并保温、保湿2天。同时设只喷白叶枯病菌株53的对照(CK)。21天后调查，调查病叶数，病叶级值、总叶数，计算发病率、病情指数。调查记载和分级标准如表3

表3 喷雾接种的病级标准

病级	病斑反映和大小
病级	病斑反映和大小	013579	免疫，剪口仅有伤痕无病斑只有1-2个短条斑，病斑面积占叶面积的1/5以下病斑面积占叶面积的1/4左右病斑面积占叶面积的1/2左右病斑面积占叶面积的3/4左右全叶发病

发病率％＝发病株(叶)数×100/调查总株(叶)数

防效％＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数。

2.试验结果与分析

试验结果详见表4，结果表明：该发明制剂对水稻白叶枯病有良好的防治效果，施用药剂三个重复病叶率和病情指数与对照相比，均有显著的降低，对水稻白叶枯病的防治效果达到69.41-78.33％。显示其潜在的应用开发前景。

表4 可湿性粉剂剂对水稻白叶枯病的防治效果

	病叶数(片)	总叶数(片)	病叶率(％)	病情指数(％)	防效(％)
	病叶数(片)	总叶数(片)	病叶率(％)	病情指数(％)	防效(％)	重复1重复2重复3CK	413635169	101102125222	40.5935.292876.13	10.678.717.5634.68	69.4175.0378.33-

Claims

1、一种防治多种植物细菌病害的生物制剂，由生产菌株和辅料按液体发酵或固体发酵生产方法制备，其特征在于该菌剂的生产菌株为抗生素溶杆菌(Lysobacterantibioticus)13-1，该菌株已于2005年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO：1456。

2、权利要求1所述生物制剂的应用，其特征在于该生物制剂用于马铃薯青枯病、魔芋软腐病及水稻白叶枯病多种作物病害的生物防治。