CN1196794C

CN1196794C - 抗生素wap－8294a和ax,其制备方法和抗菌组合物

Info

Publication number: CN1196794C
Application number: CNB011196238A
Authority: CN
Inventors: 大桥良民; 平田晴久; 中谷清吾; 加藤阿斯莎; 相场勇志; 小久保直美; 铃木信之; 前田孚
Original assignee: Hitachi Medical Corp
Current assignee: Kyoto Biological Pharmaceutical Co
Priority date: 1995-02-02
Filing date: 2001-05-15
Publication date: 2005-04-13
Anticipated expiration: 2015-08-18
Also published as: KR960030942A; AU705610B2; CN1132252A; HU218351B; CN1080310C; HUT72397A; CN1357631A; HK1046155B; AU3012695A; NL1001012C2; KR100225601B1; HK1046155A1; HU9502434D0; NL1001012A1

Abstract

本文公开了用一种属于溶菌(Lysobacter)属的菌株产生的抗生素WAP-8294A和AX或其药用盐；一种生产上述抗生素WAP-8294A的方法，该方法包括在一培养基中培养一种属于溶菌属并具有生产抗生素WAP-8294A的微生物来生产该抗生素及在该培养基中富集该抗生素；然后回收该抗生素等步骤；以及一种包括该抗生素或其药用盐的抗菌组合物。这种新型的抗生素WAP-8294A对于由格兰氏阳性细菌，尤其是MRSA感染引发的感染疾病有极好的效果，因此，该抗生素对于治疗包括MRSA在内的由格兰氏阳性细菌感染而引发的疾病是非常有效的。

Description

抗生素WAP-8294A和AX，其制备方法和抗菌组合物

本专利申请是CN95115898.8的分案申请；原申请的申请日为1995年8月18日；原申请的发明名称为“抗菌素WAP-8294A，其制备方法和抗菌组合物”。

本发明涉及一种新型的作为治疗由病原微生物感染导致的疾病有用的药剂抗生素WAP-8295A，其制备方法和它们的用途。

自从用于细菌感染疾病的化学治疗剂的历史随着奎宁和洒尔佛散的合成和青霉素的发现开始以来，人类已经受惠于这些化学治疗剂了。然而，最近出现了耐这些化学治疗剂的细菌，正如由MRSA(抗2，6-二甲氧基苯青霉素金黄色葡萄球菌)所感染的疾病所代表的，对于这种疾病，化学治疗剂(除了万古霉素和去氢羟丁胺卡那霉素以外)没有效果，这就导致了医疗治疗界的混乱并构成了严重的社会问题。

万古霉素作为一种抗生素是由美国的Eli LiLLy公司开开发的，并已经被用于治疗MRSA感染的疾病。但是这样的治疗常常伴随有肾毒性，肝毒性，甚至颅神经VIII(第八脑神经)病症(耳毒性)，完成巴斯德消毒也需要很长的时间，并且怀疑会再出现耐这种抗生素的细菌。

另一方面，去氢羟丁胺卡那霉素是一种化学衍生的抗生素，它具有作为氨基糖苷抗菌素之一的卡那毒素骨架，对于各种类型的耐药细菌有极好的抗菌作用和效果，因此它作为有限的几种治疗MRSA传染病的化学治疗试剂中的一种来使用，但是，像氨基糖苷抗生素类特有的副作用一样，它的使用有时也会伴随有严重的肾毒性和颅神经VIII(第八脑神经)疾病(耳毒性)，因此从医学治疗的观点来看，它未必是安全的抗生素。

在这种情况下，人们一直期望着发现和开发一种新型的化学治疗试剂，它(应该)具有低的毒性，在短的时间内就能显示出其抗菌作用并且几乎没有副作用，并且为了解决这一问题人们已经做了很多研究。

本发明的一个目的是提供一种新型的，其有抗菌活性的，满足上述要求的抗生素。本发明的另一个目的是提供一种制备该抗生素的方法。本发明的又一个目的是提供一种具有较低毒性或极好选择毒性的临床上有用的化学治疗剂。

为了发现一种新型有用的抗生素，本发明的发明人已经进行了各种各样的研究，结果已经成功地从泥土中分离出一种属于溶菌(lysobacter)属的菌株作为一种新型的微生物，发现该菌株产生一种文献中没有叙述过的抗生素，从而完成了本发明。

因此本发明涉及具有下文中将要详叙的物理化学性质的抗生素WAP-8294A或其药用盐。本发明还涉及制备前述抗生素WAP-8294A的方法，该方法包括下面步骤：在一种培养基中培养一种属于溶菌(lysobacter)属并具有产生抗生素WAP-8294A能力的微生物来生产该抗生素和在培养基中富集该抗生素；然后回收该抗生素；本发明还涉及一种属于溶菌属并且具有产生抗生素WAP-8294A能力的微生物；和一种含有至少一个选自于抗生素WAP-8294A和其药用盐组成的一组抗生素的抗菌组合物。

图1是当抗生素WAP-8294A通过高性能液相色谱被分离成一系列组份时观测到的色谱图。

图2是抗生素WAP-8294A₂(氢氯化物)的紫外吸收光谱(在水中)的示意图。

图3是抗生素WAP-8294A₂(氢氯化物)的红外吸收光谱(FT-IR，KBr)的示意图。

图4是抗生素WAP-8294A₂(氢氯化物)的¹H-NMR核磁共振谱(270MHz，D₂O)的示意图。

图5是抗生素WAP-8294A的酸完全水解产物的二维TLC色层谱。

图6是当抗生素WAP-2894AX通过高效液相色谱被分离时观测到的色谱图。

图7是抗生素WAP-8294AX-8(氢氯化物)的紫外吸收光谱(在水中)的示意图。

图8是抗生素WAP-8294AX-8(氢氯化物)的红外吸收光谱(FT-IR，KBr)的示意图。

图9是抗生素WAP-8294AX-8(氢氯化物)的¹H-NMR核磁共振谱(270MHz，D₂O)的示意图。

本发明涉及一种，在一种属于溶菌(lysobacter)属的新的菌株的培养基中发现的新型的抗生素WAP-8294A。该抗生素WAP-8294A进一步被分离成至少七种组份AX，A₁，A₂，A₃，A₄，A₅和A₆，且组份AX进一步被分离成至少13种组份AX-1，AX-2，AX-3，AX-4，AX-5，AX-6，AX-7，AX-8，AX-9，AX-10，AX-11，AX-12和AX-13。本文中使用的术语″抗生素WAP-8 294A″意思是指上述组份AX，A₁，A₂，A₃，A₄，A₅，A₆，AX-1，AX-2，AX-3，AX-4，AX-5，AX-6，AX-7，AX-8，AX-9，AX-10，AX-11，AX-12，AX-13或它们的混合物。

除了游离形式的抗生素WAP-8294A以外，本发明还包括其药用盐，例如(其)氢氯化物，硫酸盐和甲磺酸盐。

这些物质对于格兰氏阳性细菌，尤其是抗2，6-二甲氧基苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)，显示出很强的抗菌活性。

抗生素WAP-8294A在C₁₈反相硅胶-高效液相色谱的洗脱条件下[色谱柱：YMC A-312(6×150mm)；流动相：0.05％含三氟乙酸的乙腈∶水(45∶50)；检测波长：UV214nm，流速：1毫升/分钟]被分离成保留时间为4.0-6.1分钟，8.0分钟，11.1分钟，12.5分钟，16.5分钟，17.9分钟和18.8分钟的馏份，即组份AX，A₁，A₂，A₃，A₄，A₅和A₆)(见图1)。

如图6所示，组份AX在C₁₈反相硅胶-高效液相色谱的洗脱条件件下[色谱柱：YMC A-312(6×150mm)；流动相：0.05％含三氟乙酸的乙腈∶水(37∶63)；检测波长：UV214nm；流速：1毫升/分钟]被进一步分离成保留时间为5.3分钟，5.9分钟，6.2分钟，6.5分钟，6.9分钟，7.3分钟，8.1分钟，9.3分钟，9.8分钟，11.3分钟，12.1分钟，13.7分钟和15.0分钟的馏份，即AX-1，AX-2，AX-3，AX-4，AX-5，AX-6，AX-7，AX-8，AX-9，AX-10，AX-11，AX-12和AX-13。

抗生素WAP-8294A，A₁，A₂和A₄紫外吸收光谱(在水中)的λ_max为275nm，280nm和287nm。抗生素WAP-8294A₂的紫外吸收光谱示于图2。正如其酸水解产物的分析所证实的(将在下文中详叙)，显然抗生素WAP-8294A，A₁，A₂和A₄在其分子中含有色氨的作为发色团。

抗生素WAP-8294A，A₁，A₂和A₄的红外吸收光谱分析显示了它们在3300cm^-1处有属于OH和NH基团的吸收，在1720-1715cm^-1处有羧基或酯羰基基团的吸收；1636和1541cm^-1处有属于酰胺键的吸收；和在1207及1137cm^-1处有属于C-O拉伸振动的吸收，但它们均没有其他任何的特征吸收。抗生素WAP-8294A₂的红外吸收光谱示于图3。

在抗生素WAP-8294A，A₁，A₂和A₄的¹H-NMR核磁共振谱中，观测到源于甲基、亚甲基、次甲基，和杂环或芳香环的一些复杂的质子信号。抗菌素WAP-8294A₂的¹H-NMR谱各示于图4。

WAP-8294A₁，A₂和A₄的FAB-质谱测定表明组分A₁的(M+H)⁺离子的m/z为1548.9，组份A₂的(M+H)⁺离子的m/z为1562.9和组份A₄的(M+H)⁺离子的m/z为1576.9，并且组份A₁，A₂和A₄的钠熔融试验结果清楚地表明这些组份各为包含有碳，氢，氧和氮元素的化合物。下面表1中列出的分子式是从这些事实同时考虑结构估计和构成这些组份的所有氨基酸和脂肪酸的摩尔比(如以后详叙的)以及高分辨率FAB-质量测定结果而推断出的。

表1

A₁ A₂ A₄

FAB-质量(M+H)⁺ 1548.9 1562.9 1576.9

FAB-质量(M-H)^- 1546.7 1561.2 1575.4

△质量单位 14质量单位 14质量单位

A₁→A₂ A₂→A₄

分子量 1547.9 1561.9 1575.9

HR-FAB-质量 1548.8088 1562.8224 1576.8363

分子式 C₇₂H₁₀₉O₂₁N₁₇ C₇₃H₁₁₁O₂₁N₁₇ C₇₄H₁₁₃O₂₁N₁₇

抗生素WAP-8294A，A₁，A₂和A₄在茚三酮，艾氏菌素，Rydon-Smith，碘蒸汽，高锰酸钾水溶液和硫酸反应中均呈阳性；通过用紫外灯发出的254nm的光线照射呈现出猝灭斑点，并且在Molisch反应，硝酸银，氯化铁和Dragendorff氏反应中呈阴性。此外，为了测定抗生素WAP-8294A，A₁，A₂和A₄的氨基酸组份，将它们每个均用一种酸完全水解，然后用二维TLC处理并进行氨基酸分析，如此得到的结果表明它们的每一个均含有天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，亮氨酸(Leu)，丝氨酸(Ser)，色氨酸(Trp)和鸟氨酸(Orn)以及3个未知的氨基酸。抗菌素WAP-8294A的二维TLC分析结果示于图5。

因此为了确定这些未知的氨基酸，通过用酸再次水解WAP-8294A将未知氨基酸1，未知氨基酸2和未知氨基酸3分离。根据各种仪器分析结果，发现未知氨基酸1，2和3分别相应为β-羟基天冬氨酸，N-甲基α-氨基异戊酸和N-甲基苯基丙氨酸。

另一方面，从由酸水解WAP-8294A₁，A₂或A₄得到的各溶液的醚萃取液中分离出了，3-羟基辛酸，3-羟基-7-甲基辛酸或3-羟基-8-甲基壬酸。

此外，正如从示于图6中的C₁₈反相硅胶高效液相色谱中所清楚地看到的，抗生素WAP-8294AX被分离成至少13个组份，即AX-1：保留时间5.3分钟，AX-2：保留时间5.9分钟；AX-3：保留时间6.2分钟；AX-4：保留时间6.5分钟；AX-5：保留时间6.9分钟；AX-6：保留时间7.3分钟；AX-7：保留时间8.1分钟；AX-8：保留时间9.3分钟；AX-9：保留时间9.8分钟；AX-10：保留时间11.3分钟；AX-11：保留时间12.1分钟；AX-12：保留时间13.7分钟；和AX-13：保留时间15.0分钟。

抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13的紫外吸收光谱(在水中)λ_max为273nm，280nm，和289nm。正如通过其酸水解产物的分析所证实的(将在下面详细叙述)，显然WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13在分子中含有一摩尔的色氨酸作为发色团。抗生素WAP-8294AX-8的紫外吸收光谱各示于图7。

抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13的红外吸收光谱分析表明在3300cm^-1处有属于OH和NH基的吸收；在1720-1715cm^-1处有属于羧基或酯羰基的吸收；在1636和1541cm^-1处有属于酰氨键的吸收；和在1207和1137cm^-1处有属于C-O伸展振动的吸收；但它们均没有其他任何特征吸收。抗生素WAP-8294AX-8的红外吸收光谱各示于图8。

在抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13的¹H-NMR核磁共振测定中，观察到一些源于甲基，亚甲基，次甲基，和杂环或芳环的复杂的质子信号。抗菌素WAP-8294AX-8的¹H-NMR谱各示于图9。

WAP-8294AX-8，AX-9和AX-13的FAB-质量测定表明，组份AX-8的(M+H)⁺离子的m/z为1549，组份AX-9的(M+H)⁺离子的m/z为1549，组份AX-13的(M+H)⁺离子的m/z为1577，并且组份AX-8，AX-9和AX-13的钠熔融试验结果清楚地表明，每一组份均为含有碳、氢、氧和氮元素的化合物。如下面将要详叙的列于下面表2中的分子式是根据这些事实同时考虑结构估计和组成这些组份的所有的氨基酸与脂肪酸的摩尔比，以及高分辨率FAB质谱测定的结果推断出来的。

表2

AX-8 A_x-9 A_x-13

FAB-质量(M+H)⁺ 1549 1549 1577

FAB-质量(M-H)^- 1547

-14质量单位 -14质量单位 +14质量单位

△质量单位 A₂---->AX-8 A₂---->AX-9 A₂---->AX-13

分子量 1548 1548 1576

HR-FAB-质量 1548.8079 1548.8065 1576.8324

分子式 C₇₂H₁₀₉O₂₁N₁₇ C₇₂H₁₀₉O₂₁N₁₇ C₇₄H₁₁₃O₂₁N₁₇

抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9和AX-13在茚三酮反应，艾氏菌素反应，Rydon-Smith反应，碘蒸汽反应，高锰酸钾水溶液反应和硫酸反应中呈阳性；通过用从紫外灯发射出的254nm光线照射呈现出骤熄斑点；并且在Molisch反应，硝酸银反应，氯化铁反应和Dragendorff氏反应中呈阴性。

为了测定抗生素WAP-8294AX，AX-8，AX-9，和AX-13的氨基的组份，将该每一种抗生素都用酸完全水解，然后进行二维TLC分析[纤维素板；溶剂1：正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶2)；溶剂2：正丁醇∶吡啶∶醋酸∶水(15∶10∶3∶12)；喷显剂：茚三酮]和氨基酸分析。结果发现，由于在茚三酮反应中呈氨基酸阳性，所以WAP-8394AX包含天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，β-丙氨酸(β-Ala)，亮氨酸(Leu)，丝氨酸(Ser)，色氨酸(Trp)，鸟氨酸(Orn)，缬氨酸(Val)，N-甲基缬氨酸(N-MeVal)，β-羟基天冬氨酸(β-OH-Asp)，苯基丙氨酸(Phe)和N-甲基苯基丙氨酸(N-MePhe)。

另一方面，抗生素WAP-8294AX的酸完全水解产物的醚萃取液含有3-羟基-7-甲基辛酸也得到证实。

抗生素WAP-8294AX-8，AX-9和AX-13用与抗生素WAP-8294AX所用的处理方法相同的方法处理，并根据二维TLC分析，氨基酸分析，和酸完全水解产物的醚萃取液的气相色谱-质谱联用分析能够确定组成这些组份的氨基酸和脂肪酸。这些结果与抗生素WAP-8294A₂观察到的结果一起列于表3中。

表3：构成各组份的氨基酸和脂肪酸

(括号中给出的摩尔数)

组份 AX-8 AX-9 AX-13 A₂(min Component)

氨基酸

Asp(1) Asp(1) Asp(1) Asp(1)

Ser(2) Ser(2) Ser(2) Ser(2)

Glu(1) Glu(1) Glu(1) Glu(1)

Gly(1) Gly(1) β-Ala(1) Gly(1)

leu(1) leu(1) leu(1) leu(1)

Trp(1) Trp(1) Trp(1) Trp(1)

Orn(2) Orn(2) Orn(2) Orn(2)

β-OH-Asp(1) β-OH-Asp(1) β-OH-Asp(1) β-OH-Asp(1)

Val(1) N-MeVal(1) N-MeVal(1) N-MeVal(1)

N-MePhe(1) Phe(1) N-MePhe(1) N-MePhe(1)

脂肪酸

3H-7M-OA 3H-7M-OA 3H-7M-OA 3H-7M-OA

(1) (1) (1) (1)

注：3H-7M-OA表示3-羟基-7-甲基辛酸

本发明人根据有关该抗菌素WAP-8294A，A₁，A₂，A₄，AX，AX-8，AX-9和AX-13的酸完全水解产物，以及构成这些抗生素的氨基酸和脂肪酸的上述物理化学性质和知识查找已知的化合物，结果得到一明显的事实，即它们均为文献中没有报导过的新型物质。

本发明的抗生素WAP-8294A，A₁，A₂，A₄，AX，AX-8，AX-9和AX-13可以通过下述方法制备，该方法包括这些步骤：在一种培养基中培养一种产生抗生素WAP-8294A的、属于溶菌性细菌(lysobactor)属的细菌并分离和收集抗生素WAP-8294A，另外如果需要再将其分离和纯化。一个属于溶菌性细菌属的产生抗生素WAP-8294A细菌的例子是本发明人从取自日本静冈县Shimodo市的泥土中分离出的溶菌( Lysobacter)sp.WAP-8294菌株，该菌株的分类细菌学性质如下：

1.形态：

在一种肉汤-琼脂平皿上25℃培养该菌株3天，在显微镜下观察发现了一种直径范围为0.4-0.6μm，长度范围为3.2-4.2μm的棒状细胞。该菌株是格兰氏阴性细菌，无鞭毛，但表现出滑动运动，不形成芽胞，并且无耐酸性。

2.在各种培养基中的生长特征：

该菌株在各种培养基中25℃培养并观察3-14天。

(1)肉汤琼脂平板培养基

形成的菌落具有透明的淡黄色圆环形状，凸形圆环表面和完整的波状周边。该菌株不形成可扩散的色素。

(2)肉汤-琼脂-斜面培养基

菌株以铺展开的布状形成生长，并具有透明的淡黄色。

(3)肉汤液体培养基

培养基变得略微混浊，菌株形成一精巧的环并且在培养容器的底部边缘上观察到细菌细胞的沉淀。

(4)肉汤-明胶穿刺培养

菌株从培养基的表面向中间扩展的区域内生长，同时液化明胶。

(5)石蕊-牛奶培养基

菌株没有显示出还原石蕊的能力且无凝结，但具有胨化能力。

(6)脱脂乳-乙酸盐琼脂培养基

菌株显示出很强的蛋白分解活性并且生长，同时在琼脂平皿上形成高粘稠胶状块。

3.生理特征

WAP-8294菌株的生理特征如下：

(1)硝酸盐还原

(2)脱氮反应

(3)MR试验

(4)VP试验

(5)吲哚的生成

(6)硫化氢的生成

(7)淀粉的水解

(8)柠檬酸的利用

①Koser培养基

②Simmonds培养基

③Christensen培养基

(9)无机氮源的利用

①硝酸钠

②硫酸铵

③谷氨酸钠 +

(10)色素的形成

①King A绿脓杆菌产色试验培养基 -

②King B绿脓杆菌产色试验培养基 -

(11)脲酶 -

(12)氧化酶 +

(13)过氧化氢酶 +

(14)生长温度 15-37℃

(15)生长PH 5-8

(16)抗氧行为需氧的

(17)O-F试验非分解型

(18)脱氧核糖核酸酶 +

(19)磷酸酶 +

(20)溶血 β

(21)纤维素的降解 -

(22)吐温的降解

①吐温20 +

②吐温40 +

③吐温60 +

④吐温80 +

(23)胶体几丁质的降解 +

(24)多糖的降解

①CMC +

②藻酸 -

③果胶酸 -

(25)溶菌活性

①酿酒酵母 +

②枯草芽孢杆菌 +

③大肠杆菌 +

(26)GC含量 68.3％(HPLC法)

(27)由糖生成酸和气

糖形成酸(胨水)形成气(肉汤-琼脂)使用糖(Davis培养基)

L-阿拉伯糖 - - -

D-木糖 - - -

D-葡萄糖 + - -

D-甘露糖 + - -

D-果糖 + - -

D-半乳糖 + - -

麦芽糖 + - +

蔗糖 + - -

乳糖 + - -

海藻糖 + - -

D-山梨醇 - - -

D-甘露糖醇 - - -

肌醇 - - -

甘油 - - -

淀粉 + - +

纤维素二糖 + - +

当上述关于WAP-8294菌株的结果与伯杰的《系统细菌学手册》第3卷(1989年)中公开的细菌种类的详细内容相比较时，可以得出结论，该菌株是格兰氏阴性的需氧的棒状物，无鞭毛，并且具有因滑动而致的游动现象，因此，该菌株属于滑动细菌。

滑动细菌被分成不形成子实体的非子实滑动细菌和形成子实体的子实滑动细菌。该菌株不形成子实体，所以属于非子实滑动细菌，此滑动细菌又被进一步分成三个类型，即噬纤维菌目(Cytophagales)，贝氏菌目和溶菌目，根据各自DNA的GC含量(这是一个重要的关键特性)可以清楚地将它们彼此区分开来。由于这一原因，将该菌株的DNA通过常用的方法被萃取出来，用FEMSMicrobiol.Letters，1984， 25，P.125中描述的HPLC方法测定，结果发现其GC含量是高含量的为68.3％。所以，结论是该菌株属于具有65-71％高GC含量的溶菌目的溶菌属。

当将此菌株的特征与属于同一属的种进行比较时，其特征类似于Lysobactor enzymogenes，但与后者在微小细节上，例如同化柠檬的能力上，不一致。因此，此菌株被命名为溶菌属SP.WAP-2894( Lysobacter sp.WAP-8294)。

此WAP-8294菌株于1994年1月31日寄存于日本工业科学的技术社(agency)国家生物科学和人类技术研究所，登记号为FERM BP-4990(FERM P-14093)。包括了溶菌属作为其通性细菌均相当容易改变它们的分类学性质，WAP-2894菌株也不例外。可是，所有具有产生抗生素WAP-2894能力的微生物，包括天然突变体或那些通过用种种诱变剂导致的人突变的变异体，均可以在本发明的方法中使用。

(培养和生产)

本发明的抗生素WAP-8294A是通过将上述产生WAP-8294A的细菌接种到含有营养源的培养基并在有氧条件下培养此细菌制备的。当培养该产生抗生素WAP-8294A的细菌时，该细菌使用，例如含有能同化的有机碳化合物，例如葡萄糖，果糖，淀粉，糊精，甘油，糖蜜，淀粉糖浆，脂肪和油以及有机酸作为碳源；并使用含有机和无机氮的化合物，例如大豆粉，棉子粉，玉米浸渍液，酪朊，胨，酵母萃取液肉汤胚芽，尿素，氨基酚和铵盐作为氮源。此外，这样的盐的例子是无机盐，例如钠，钾，钙和镁盐及磷酸盐，它们可以单独使用或以任一种结合方式使用。还可以任选地向培养基中加入例如铁盐，铜盐，锌盐和钴盐的重金属盐；微生物生长所需要的维生素，例如维生素H和维生素B₁；以及其他的能有促进产生抗生素WAP-8294A细菌的生长和改进WAP-8294A产率的有机和/或无机物质。培养基也可以含有抗泡沫剂，例如硅油或聚亚烷基二醇醚和表面活性剂。

此菌株用生产抗生素的一般常用方法培养，但为了维持有氧的条件，优选使用水底鼓气搅拌培养技术，而在烧瓶中摇动培养适用于实验室培养。一般来说培养可以在20-40℃的温度范围进行，优选为25-30℃。在PH约6-8的范围进行培养，优选是大约7。约2-6天的培养时间足以确保在培养基中富集的WAP-8294A有一个理想的产率。

(分离和纯化)

如以下将要详叙的，通过利用本发明抗生素物质的物理化学性质可以有效地进行上述在培养基中的富集抗生素WAP-8294A的回收。更具体地说，抗生素WAP-8294A存在于培养基的滤液中，因此，通过先加入助滤剂，例如硅藻土或钠沸石收集培养基滤液，然后通过减压过滤或离心分离分离出细菌细胞。

从其下面详叙的物理化学性质来看，抗生素WAP-8294A被认为是水溶性的多肽抗生素并且是由相对大的化合物(每个化合物分子量范围1,400-1,700)组成的。当从培养基滤液中收集WAP-8294A时，应将这些性质考虑进去，吸附剂树脂，例如Diaion HP-20 SepabeadsSP207，CHP-20(可从Mitsubishi Chemicai Industries Ltd购买到)，Amberlite XAD-2(可从Rohn & Haas Co.购买到)，Duolite S-30(可从Diamond Shamrock Chemical Co.购买到)，以及，尤其是用活性碳柱色谱该抗生素能有效地被纯化。

例如，将PH为6.9的培养基滤液通过一个用Amberlite IR-120B(H⁺型)装填的柱子，然后把得到的酸性液体通过一个用未经过任何处理的活性碳装填的柱以吸附滤液，接着用水洗，然后用80％的丙酮-水混合物或碱性80％丙酮-水混合物作为提洗剂洗脱从而回收抗生素WAP-8294A。减压下从洗脱液中蒸馏出丙酮之后，得到的残存物用乙酸乙酯在酸性条件下萃取除去油溶性杂质，然后水相再用高极性有机溶剂，例如正丁醇萃取以回收WAP-8294A。低温下从萃取液中将正丁醇蒸馏出来后，将剩余物本身浓缩至干，或加入一种不溶性溶剂到剩余物浓缩物中沉淀WAP-8294A，接着离心或减压过滤得到粗(产物)物质。

由于WAP-8294A在酸性条件下能够用极性有机溶剂，例如正丁醇萃取，所以上述回收的粗(产物)物质可以通过下面的方法进一步纯化，得到高纯的物质，这些方法是由离心液-液分配色谱代表的逆流分配法，吸附色谱法，例如硅胶柱色谱，和分配色谱法，例如纤维素柱色谱，它们可以单独使用或联合使用。

另一方面，用下面的方法纯化粗产物物质也是可能的，即利用Sephadex G-10，G-15，LH-20(可从Pharmacia Company购买到)或Biogel P-4 Gel(可从Bio-Rad Laboratries购买到)的分子筛作用，然后用水，含水的低级醇，例如含水甲醇，稀释的碱性或酸性水溶液和含有适当盐的水溶液液展开和洗脱，上述液体可以单独或混合使用。

例如通过上述的逆流分配技术和/或高性能液相色谱技术进一步提纯和分离WAP-8294A可以得到单独的7种组分AX、A₁、A₂、A₃、A₄、A₅和A₆。通过使用类似于上面所用的那些方法提纯和分离AX组分，同样可以得到13种组分：AX-1、AX-2、AX-3、AX-4、AX-5、AX-6、AX-7、AX-8、AX-9、AX-10、AX-11、AX-12和AX-13。

在高效液相色谱中用的填充物可以是硅胶，其是市场上可以买到的优良的载体，其中的烷基例如十八烷基和辛基被化学键合到硅胶的硅烷醇基上，或者可以是通用的载体例如聚苯乙烯型多孔聚合物凝胶。通过使用这些填充物可以高效的把WAP-8294A和AX组分分离成单独的组分。可用于高效液相色谱的流动相的可以是酸化的例如通过三氟乙酸酸化的含水乙腈，含水低碳醇例如含水甲醇，和缓冲溶液。

(物化性能)

通过由上述的各种色谱技术得到的WAP-8294A、A₁、A₂、A₄、AX、AX-8、AX-9和AX-13，通过其完全的酸水解得到的以及在茚三酮反应中呈阳性的物质和酸水解产物醚萃取物的物化性能在下面详细描述。

抗生素 WAP-8294A

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：213-220℃(分解)；

(3)溶解性：溶于水、甲醇、正丁醇、二甲基甲酰胺和二甲亚砜，不溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿；

(4)显色反应：在茚三酮、Ehrlich、Rydon-Smith、高锰酸钾水溶液、硫酸和碘蒸气反应中呈阳性，通过用紫外灯发射的254nm光线进行照射显示出骤熄；在Molishch、硝酸银、氯化铁和Dragendorff反应中呈阴性；

(5)高效液相色谱中的保留时间(图1)：4.0-6.1分钟，8.0分钟，11.1分钟，12.5分钟，16.5分钟，17.9分钟和18.8分钟；

(6)紫外线吸收谱(在水中)：

λ_max：275nm、280nm、287nm；

(7)红外吸收谱(FT-IR，KBr)：特征吸收谱：3300cm^-1、1720-1715cm^-1、1636cm^-1、1541cm^-1、1404cm^-1、1207cm^-1、1137cm^-1；

(8)分子量：1400-1700；

(9)有机化合物的定性试验(熔钠法)：该抗生素是含有碳、氢、氧和氮元素的化合物；

(10)作为茚三酮阳性物质酸完全水解提供：Asp、Glu、Gly、Leu、Ser、Trp、Orn、N-甲基缬氨酸、β-羟基天冬氨酸和N-甲基苯基丙氨酸；

(11)旋光率：[α]²⁰ _D＝+42℃(C＝0.5，H₂O)；

(12)碱性、酸性和中性分类：两性。

抗生素 WAP-8294A ₁

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：215-225℃(分解)；

(4)颜色反应：在茚三酮、艾氏菌素、Rydon-Smith、高锰酸钾水溶液、硫酸和碘蒸气反应中呈阳性，用紫外灯发射的254nm光线照射显示出骤熄斑；在Molishch、硝酸银、氯化铁和Dragendorff反应中呈阴性；

(5)高效液相色谱的保留时间：8.0分钟；

(6)紫外线吸收谱(在水中)：

λ_max：275nm、280nm、287nm；

(7)红外吸收谱(FT-IR，KBr)：特征吸收谱：3300cm^-1、1720-1715cm^-1、1636cm^-1、1541cm^-1、1404cm^-1、1207cm^-1、1133cm^-1；

(8)分子量：1547.9[FAB-MS m/z 1548.9(M+H)⁺，m/z1546.7(M-H)^-]；

(9)分子式：C₇₂H₁₀₉O₂₁N₁₇[高分辨率FAB-Mass测定的(M+H)⁺离子的m/z的测定值：1548，8088；m/z的计算值：1548，8063]；

(10)酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基缬氨酸(1mole)、β-羟基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羟基辛酸(1mole)；

(11)旋光率：[α]²⁰ _D＝+41°(C＝0.5，H₂O)；

(12)碱性、酸性和中性分类：两性。

抗生素 WAP-8294A ₂

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：215-225℃(分解)；

(5)高效液相色谱的保留时间：11.1分钟；

(6)紫外线吸收谱(在水中)(图2)：

λ_max：275nm(E₁ cm^1％ 31.8)、280nm(E₁ cm^1％ 33.4)、287nm(E₁ cm^1％ 29.2)；

(7)红外吸收谱(FT-IR，KBr)(图3)：特征吸收谱：3300cm^-1、1720-1715cm^-1、1636cm^-1、1541cm^-1、1404cm^-1、1207cm^-1、1137cm^-1；

(8)¹H-NMR谱：(270MHz，D₂O)(图4)：观察到源于甲基、亚甲基、次甲在和杂环或芳环的复杂的质子信号；

(9)分子量：1561.9[FAB-质谱m/z 1562.9(M+H)⁺，m/z 1561.2(M-H)^-]；

(10)分子式：C₇₂H₁₁₁O₂₁N₁₇[由高分辨率FAB-Mass测定的(M+H)⁺离子的m/z的测定值：1562，8224；m/z的计算值：1562，8219]；

(11)作为水解产物酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基缬氨酸(1mole)、β-羟基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羟基-7-甲基辛酸(1mole)；

(12)旋光率：[α]²⁰ _D＝+42°(C＝0.5，H₂O)；

(12)碱性、酸性和中性分类：两性。

抗生素 WAP-8294A ₄

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：215-225℃(分解)；

(5)高效液相色谱的保留时间：16.5分钟；

(6)紫外线吸收谱(在水中)：

λ_max：275nm、280nm、287nm；

(8)分子量：1575.9[FAB-质谱m/z 1576.9(M+H)⁺，m/z 1575.4(M-H)^-]；

(9)分子式：C₇₄H₁₁₃O₂₁N₁₇[由高分辨率FAB-Mass测定的(M+H)⁺离子的m/z的测定值：1576，8363；m/z的计算值：1576，8375]；

(10)作为水解产物，酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基缬氨酸(1mole)、β-羟基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羟基-8-甲基壬酸(1mole)；

(11)旋光率：[α]²⁰ _D＝+43°(C＝0.5，H₂O)；

(12)碱性、酸性和中性分类：两性。

抗生素WAP-8294A、A₁、A₂和A₄的C₁₈反相硅凝胶高性能液相色谱的洗脱条件如下：

柱：YMC A-312(6×150mm)

流动相：含0.05％三氟乙酸的乙腈∶水(45∶55)

检测波长：UV 214nm

流速：1ml/min

抗生素 WAP-8294AX

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：196-200℃(分解)；

(5)高效液相色谱的保留时间：(图6)：5.3分钟、5.9分钟，6.2分钟、6.5分钟，6.9分钟，7.3分钟，8.1分钟，9.3分钟、9.8分钟、11.3分钟、12.1分钟、13.7分钟和15.0分钟。

(6)紫外线吸收谱(在水中)：

λ_max：273nm、280nm、289nm；

(8)分子量：1400-1700；

(9)有机化合物定性试验(钠熔融法)：该抗生素是含有碳、氢、氧和氮元素的化合物；

(10)作为茚三酮阳性的物质和脂肪酸，酸完全水解提供Asp、Glu、Gly、β-Ala、Leu、Ser、Trp、Orn、Val、N-甲基缬氨酸、β-羟基天冬氨酸、Phe、N-甲基苯基丙氨酸和3-羟基-7-甲基辛酸；

(11)旋光率：[α]²⁰ _D＝+24°(C＝0.5，H₂O)；

(12)碱性、酸性和中性分类：两性。

抗生素 WAP-8294AX-8

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：196-200℃(分解)；

(5)高效液相色谱的保留时间：9.3分钟；

(6)紫外线吸收谱(在水中)(图7)：

λ_max：273nm、280nm、289nm；

(7)红外吸收谱(FT-IR，KBr)(图8)：特征吸收谱：3300cm^-1、1720-1715cm^-1、1636cm^-1、1541cm^-1、1404cm^-1、1207cm^-1、1133cm^-1；

(8)¹H-NMR谱：(270MHz，DMSO-D₆)(图9)：观察到甲基、亚甲基、次甲基和杂环或芳环产生的复杂的质子信号；

(9)分子量：1548[FAB-质谱m/z 1549(M+H)⁺]；

(10)分子式：C₇₂H₁₀₉O₂₁N₁₇[由高分辨率FAB-Mass测定的(M+H)⁺离子的m/z的测定值：1548，8079；m/z的计算值：1548，8063]；

(11)作为水解产物酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、Val(1mole)、β-羟基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羟基-7-甲基辛酸(1mole)；

(11)旋光率：[α]²⁰ _D＝+25°(C＝0.5，H₂O)；

(12)碱性、酸性和中性分类：两性。

抗生素 WAP-8294AX-9

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：216-220℃(分解)；

(4)颜色反应：在茚三酮、Ehrlich、Rydon-Smith、高锰酸钾水溶液、硫酸和碘蒸气反应中呈阳性，用紫外灯发射的254nm光线照射显示出骤熄斑；在Molishch、硝酸银、氯化铁和Dragendorff反应中呈阴性；

(5)高效液相色谱的保留时间：9.8分钟；

(6)紫外线吸收谱(在水中)：

λ_max：273nm、280nm、289nm；

(7)红外吸收谱(FI-IR，KBr)：特征吸收谱：3300cm^-1、1720-1715cm^-1、1636cm^-1、1541cm^-1、1404cm^-1、1207cm^-1、1137cm^-1；

(8)分子量：1548[FAB-质谱m/z 1549(M+H)⁺，m/z 1547(M-H)^-]；

(9)分子式：C₇₂H₁₀₉O₂₁N₁₇[由高分辨率FAB-Mass测定的(M+H)⁺离子的m/z的测定值：1548，8065；m/z的计算值：1548，8063]；

(10)作为水解产物，酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基缬氨酸(1mole)、β-羟基天冬氨酸(1mole)、Phe(1mole)、和3-羟基-7-甲基辛酸(1mole)；

(11)旋光率：[α]²⁰ _D＝+28°(C＝0.5，H₂O)；

(12)碱性、酸性和中性分类：两性。

抗生素 WAP-8294AX-13

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：205-210℃(分解)；

(5)高效液相色谱的保留时间：15.0分钟；

(6)紫外线吸收谱(在水中)：

λ_max：273nm、280nm、289nm；

(8)分子量：1576[FAB-MS m/z 1577(M+H)⁺；

(9)分子式：C₇₄H₁₁₃O₂₁N₁₇[由高分辨率FAB-Mass测定的(M+H)⁺离子的m/z的测定值：1576，8324；m/z的计算值：1576，8375]；

(10)作为水解产物，酸完全水解提供Asp(1mole)、Glu(1mole)、β-Ala(1mole)、Leu(1mole)、Ser(2mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、N-甲基缬氨酸(1mole)、β-羟基天冬氨酸(1mole)、N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和3-羟基-7-甲基辛酸(1mole)；

(11)旋光率：[α]²⁰ _D＝+27°(C＝0.5，H₂O)；

(12)碱性、酸性和中性分类：两性。

抗生素WAP-8 294AX、AX-8、AX-9和AX-13的C₁₈反相硅凝胶高性能液相色谱的洗脱条件如下：

柱子：YMC A-312(6×150mm)

流动相：含0.05％三氟乙酸的乙腈∶水(37∶63)

检测波长：UV 214nm

流速：1ml/min

(生物特性)

(1)抗菌活性

WAP-8294A、A₁、A₂和A₄的抗菌活性的检验结果列于表4。用肉汤稀释法来测定最小抑制浓度(MIC)，该方法是利用敏感的肉汤培养基(可以从Eiken Chemical Co.，Ltd.买到)进行的。

列于表4的数据明显地表明WAP-8294A、A₁、A₂和A₄对包括MRSA(抗甲氧苯青霉素的金黄色酿脓葡萄球菌)在内的革兰氏阳性细菌呈现很强的抗菌活性，该活性的特征在于当把10％牛血清加到该培养基中时，在上述培养基中观察到增加到不小于8倍的活性。

另一方面，它们对革兰氏阴性细菌、真菌和酵母菌没有表现出任何的活性。

表4-1

MIC(μg/ml)

A A ₁

加血清

试验的细菌无 10％无 10％

金黄色酿脓葡萄球菌1号(MRSA 0.78 ＜0.10 0.39 ＜0.10

临床分离的菌株)

金黄色酿脓葡萄球菌11号(MRSA 0.78 ＜0.10 0.39 ＜0.10

临床分离的菌株)

金黄色酿脓葡萄球菌371号R(MRSA 0.78 ＜0.10 0.39 ＜0.10

临床分离的菌株)

金黄色酿脓葡萄球菌(ATCC 25923) 0.78 ＜0.10 0.39 ＜0.10

表皮葡萄球菌 0.78 ＜0.10 0.39 ＜0.10

(ATCC 12228)

酿脓链球菌 6.25 25 6.25 25

(ATCC 19615)

枯草杆菌(ATCC 6633) 0.78 ＜0.10 0.39 ＜0.10

大肠杆菌(ATCC 25922) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

绿脓杆菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100

(ATCC 9027)

白色念球菌(TIMM 0239) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

烟曲霉(IAM 2004) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

表4-2

MIC(μg/ml)

A ₂ A ₄

加血清

试验的细菌无 10％无 10％

金黄色酿脓葡萄球菌1号(MRSA 0.78 ＜0.10 0.78 ＜0.10

临床分离的菌株)

金黄色酿脓葡萄球菌11号(MRSA 0.78 ＜0.10 0.78 ＜0.10

临床分离的菌株)

金黄色酿脓葡萄球菌371号R(MRSA 0.78 ＜0.10 0.78 ＜0.10

临床分离的菌株)

金黄色酿脓葡萄球菌(ATCC 25923) 0.78 ＜0.10 0.78 ＜0.10

表皮葡萄球菌 0.78 ＜0.10 0.78 ＜0.10

(ATCC 12228)

酿脓链球菌 6.25 25 6.25 25

(ATCC 19615)

枯草杆菌(ATCC 6633) 0.78 ＜0.10 0.78 ＜0.10

大肠杆菌(ATCC 25922) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

绿脓杆菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100

(ATCC 9027)

白色念球菌(TIMM 0239) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

烟曲霉(IAM 2004) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

以同样的方式来测定抗生素WAP-8294AX、AX-8、AX-9和AX-13的抗菌活性将结果列于表5中。

的抗菌活性将结果列于表5中。使用Muller-Hinton肉汤(可以从DIFCO公司买到)并用2％氯化钠增补的MRSA测定它们的最小抑制浓度(MIC)，(而其他细菌则用Muller Hinton肉汤本身)。

表5中的数据表明，抗菌素WAP-8294AX、AX-8、AX-9和AX-13对包括抗甲氧苯青霉素的金黄色酿脓葡萄球菌在内的革兰氏阳性细菌呈现很强的抗菌活性，并发现当把10％牛血清加到该培养基时其活性增加到约2倍于在上述培养基中观察到的活性。

表5-1

MIC(μg/ml)

AX AX-8

加血清

试验的细菌无 10％无 10％

金黄色酿脓葡萄球菌1号(MRSA 1.56 0.78 3.13 3.13

临床分离的菌株)

金黄色酿脓葡萄球菌 1.56 0.78 3.13 1.56

(ATCC 25923)

表皮葡萄球菌 1.56 0.78 1.56 0.78

(ATCC 12228)

酿脓链球菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100

(ATCC 19615)

枯草杆菌(ATCC 6633) 1.56 0.78 1.56 0.78

大肠杆菌(ATCC 25922) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

绿脓杆菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100

(ATCC 9027)

白色念球菌(TIMM 0239) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

烟曲霉(IAM 2004) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

表5-2

MIC(μg/ml)

AX-9 AX-13

加血清

试验的细菌无 10％无 10％

金黄色酿脓葡萄球菌1号(MRSA 3.13 1.56 3.13 3.13

临床分离的菌株)

金黄色酿脓葡萄球菌 3.13 1.56 3.13 3.13

(ATCC 25923)

表皮葡萄球菌 1.56 0.78 1.56 0.78

(ATCC 12228)

酿脓链球菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100

(ATCC 19615)

枯草杆菌(ATCC 6633) 3.13 1.56 3.13 1.56

大肠杆菌(ATCC 25922) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

绿脓杆菌＞100 ＞100 ＞100 ＞100

(ATCC 9027)

白色念球菌(TIMM 0239) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

烟曲霉(IAM 2004) ＞100 ＞100 ＞100 ＞100

(2)在鼠中，WAP-8294A对抗实验MRSA于感染的保护作用。

正如在体外所看到的它的抗菌活性(如表4所示)那样，由于抗生素WAP-8294A对包括MRSA在内的革兰氏阳性细菌显示很强的抗菌活性，因而进行了保护鼠不受金黄色酿脓葡萄球菌1号(临床分离的MRSA的菌株)感染的试验。

试验按如下方法进行：将ICR-MCH鼠[4周令雄鼠(可以从Nippon CLEA有限公司买到)，每组8只]在用细菌感染前三天腹膜内给药环磷酰胺0.5mg/0.5ml/鼠，然后腹膜内给每只鼠0.5ml含有2×10⁴ml的金黄色酿脓葡萄球菌1号菌株(用5％粘蛋白增补)的液体来感染这些动物。感染后1小时，每只鼠给予一次皮下注射，10mg/kg盐酸万古霉素(可以从Shionogi有限公司购买)和0.2ml/小鼠的抗生素WAP-8294A(含10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1.0mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg、0.1mg/kg或0.05mg/kg的抗生素)。而对照组，每只皮下给于0.2ml生理盐水。

从下面给出的表6中这些试验的结果可以看出，在感染之后3天内，所有没有任何治疗的对照动物全部死亡。另一方面，关于抗生素给药的组，给药万古霉素10mg/kg的8只动物中的5只甚至在感染后5天还存活。与此相反，由表6所列的结果可以看出，在低剂量水平，WAP-8294A显示出优异的治疗效果。由概率法测定的其ED₅₀值是0.155mg/kg。

表6：在鼠感染实验系统的MRSA时

WAP-8294A的治疗结果

试验组剂量(mg/kg) 试验动物的存活数/动物数

对照(生理盐水) 0/8

万古霉素 10 5/8

抗生素WAP-8294A 10 8/8

5 8/8

2.5 8/8

1.0 8/8

0.5 7/8

0.25 5/8

0.10 3/8

0.05 1/8

正如表5所示其体外抗菌活性，由于抗生素WAP-8294AX对包括MRSA在内的革兰氏阳性细菌显示很强的抗菌活性，因而进行了保护鼠不受金黄色酿脓葡萄球菌JCM8702(临床分离的MRSA的菌株)感染的试验。

试验按如下方法进行：在用细菌感染前3天给予ICR-MCH鼠[4周令雄鼠(可以从Nippon CLEA有限公司买到)，每组8只]腹膜内注射0.5mg/0.5ml/鼠的环磷酰胺，然后通过腹膜内给予每只鼠0.5ml含有2×10⁴/ml的金黄色酿脓葡萄球菌JCM8702菌株(用5％粘蛋白增补)的液体。感染后1小时，用10mg/kg的万古霉素HCl(可从Shionogi有限公司购买)和0.2ml/鼠的抗生素WAP-8294AX(含有10mg/kg、2.5mg/kg、1.0mg/kg或0.5mg/kg的抗菌素)绐鼠皮下注射一次。而对照组，每只皮下给药0.2ml生理盐水。

从下面给出的表7所示的这些试验的结果看出，没有给以任何治疗的8只对照动物中的6只在感染后3天内死亡，对于抗生素给药的组，给药10mg/kg万古霉素的8只动物中的5只甚至在感染后5天仍存活。与此相反，从表7列出的结果看出，WAP-8294AX在低剂量水平上显示出优异的治疗效果。由概率法测定的其ED₅₀值是1.25mg/kg。

表7：在鼠中实验系统的MRSA感染时

WAP-8294AX的治疗结果

试验组剂量(mg/kg) 试验动物的存活数/动物数

对照(生理盐水) 2/8

万古霉素 10 5/8

抗生素WAP-8294A 10 7/8

2.5 5/8

1.0 4/8

0.5 2/8

(3)对鼠的急性毒性试验

以25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg或250mg/kg的剂量，把抗生素WAP-8294A给鼠静脉内给药(4周令ICR-MCH雄鼠，每组5只)，但是没有观察到任何的急性毒性。

以25mg/kg或100mg/kg的剂量，把抗生素WAP-8294AX给鼠腹膜内给药(4周令ICR-MCH雄鼠，每组5只)，但是未观察到任何的急性毒性。

由上述可以看出，抗生素WAP-8294A、A₁、A₂、A₃、A₄、A₅、A₆、AX、AX-1、AX-2、AX-3、AX-4、AX-5、AX-6、AX-7、AX-8、AX-9、AX-10、AX-11、AX-12和AX-13是给人和动物治疗细菌感染性疾病，特别是由抗甲氧苯青霉素的金黄色酿脓葡萄球菌感染导致的感染性疾病的有效治疗剂。

(应用)

如果把本发明的新颖的抗生素作为药品给药，可以按照通常的方式以各种剂型施用。例如，它们可以以口服给药的形式例如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊和糖浆剂施用，可以以非经肠道的药药形式例如(静脉的、肌内的、皮下的)注射液、滴剂、栓剂、涂布剂和软膏来使用，均很安全。另外，本发明的新颖的抗菌素同样可以用做眼科领域以非经肠道给药剂型例如眼药水和眼膏安全地使用。同时注意到它们的杀菌速度比万古霉素的快，以及在低浓度下的有效性。

可以用通常的方法制备这些各种各样的药物制剂，例如通过混合的方法，加到主成分、药用的和已知的通用的辅剂例如赋形剂、粘结剂、崩解剂、包衣剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂或香料、助溶剂、悬浮剂和稀释剂中，然后使混合物形成所要求的剂型。

其剂量可以根据例如要治疗的疾病、给药的途径和给药时间而变化，但优选的给药剂量范围对成人来说是每天5mg-2000mg，可以一次给药或分次给药。

在下文要参考下面的实施例更详细地描述本发明，但是本发明并不限制到这些特例的范围。

实施例1

向4个500ml体积的锥形烧瓶中每一个加入100ml培养基(pH7.2)，该培养基含有2.5％葡萄糖、2.0％脱脂大豆粉、0.4％大豆油、0.25％氯化钠和0.5％碳酸钙，灭菌，然后用一个白金圈分别将斜面琼脂培养基中培养的溶菌性Sp.WAP-8294菌株又在这些培养基接种，并在30℃培养2天，同时在180次/分钟下在旋转振动器中往复震荡这些烧瓶。然后分别向这些500ml体积的锥形烧瓶(150)中加入100ml的上述培养基，灭菌，接着各接种2ml培养基，并在30℃培养4天，同时在旋转振动器中以180次/分钟往复震荡这些烧瓶。使用金黄色酿脓葡萄球菌1号用琼脂板法测定抗菌活性。

实施例2

将实施例1得到的培养基进行连续离心分离(9000rpm)，得到15升上清液。把该上清液(pH6.9)装到填有Amberlite IR-120B(H⁺型，1.5升，可以从Rohm和Haas公司买到)的柱子上，收集15升流出物和3l含水洗液。合并该流出物和洗液，调整其pH到3，把该合并的液体装到填有活性碳(700ml，可从Wako Pure Chemical有限公司买到)的柱子上进行色层分离。用4升水洗涤后，用4升80％丙酮-水以及4升80％丙酮水(pH12)洗脱活性物质。将得到的洗脱液浓缩到800ml，接着用盐酸调整pH到3，并用乙酸乙酯(400ml×3)萃取，然后用正丁醇(400ml×3)萃取，浓缩正丁醇相并将其冻干，得到6.4g粗产物(盐酸化物)。

实施例3

将实施例2获得的粗产物(6.4g)装到填有纤维素的柱子(450ml，可以从E.Merck公司买到)上进行色层分离，用溶剂体系：乙腈-乙酸-水(75∶1∶25)洗脱并分组。收集活性组分，浓缩然后冻干，得到880mg白色粉状WAP-8294A(盐酸化物)。

实施例4

把实施例3得到的WAP-8294A(700mg)装到填有18烷基硅凝胶的反相高效液相色谱柱上[柱子：YMC-GEL SH-343-5，20×250mm，可以从Yamamura Chemical Research Laboratory；流动相：含0.05％三氟乙酸的乙腈-水(45∶55)](以10份)，收集含有WAP-8294A₁、A₂和A₄的组分，接着把每一组分浓缩，得到白色粉末(盐酸化物)WAP-8294A₁、(50mg)、A₂(210mg)和A₄(16mg)。

实施例5： WAP-8294A的氨基酸分析

将实施例3得到的WAP-8294A(5mg)溶于0.5ml的4N甲烷磺酸溶液中，向该溶液中加0.2％3-(2-氨基甲基)吲哚，在110℃完全水解该抗生素24小时。浓缩生成的水解产物至干燥，溶解在少量水中，接着把该溶液装到填有Dowex 50WX-8(H⁺-型，1ml，可以从DowChemical Company买到)的柱子上，用20ml水洗涤，然后用20ml0.5N NH₄OH溶液洗脱，将洗脱液浓缩至干，再溶于少量水中，然后加到两向薄层色谱中[纤维素板；溶剂1：正丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶2)；溶剂2：正丁醇∶吡啶∶乙酸∶水(15∶10∶3∶12)]并进行氨基酸分析(Hitachi Amino Acid Analyzer L-8500)，发现该洗脱液含有Asp(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Ser(2mole)、Leu(1mole)、Typ(1mole)和Orn(2mole)以及三种未知的氨基酸。抗生素WAP-8294A的该两向TLC分析的结果示于图5。

实施例6：未知氨基酸的鉴别

在实施例3得到的100mg WAP-8294A中加入含有4％巯基乙酸的10ml 6N HCl溶液，接着在110℃水解该抗生素20小时。浓缩该水解产物之后，调整其pH到7.0并将它加到Sepabeads SP207的层析柱上(可以从Mitsubishi Chemical Industries，Ltd，买到)，同时用水展开。将该柱的18ml和27ml之间洗脱的含有未知氨基酸-1的组分浓缩，并装到填有Dowex 50wx-8(H⁺型，9ml)的柱子上。用0.1NHCl溶液洗脱后，将得到的洗脱液浓缩至干，得到4mg白色粉状未知氨基酸-1盐酸化物。发现该氨基酸的分子量是149[FAB-MS m/z：150(M+H)⁺]；¹H-NMR谱[D₂O，270MHz；化学位移：δ(ppm)]在4.53(1H，d，J＝2.9Hz)和5.00(1H，d，J＝2.9Hz)，因而证实是β-羟基天冬氨酸。

当把它与β-羟基天冬氨酸盐酸化物可靠的样品(可以从Sigma公司买到)比较时其¹H-NMR谱(化学位移)，和在纤维素TLC[溶剂：正丁醇∶吡啶∶乙酸∶水(15∶10∶3∶12)]观察到未知氨基酸-1盐酸化物的Rf值(0.20)完全与用可靠的样品观察到的结果相同，因此，未知氨基酸-1被鉴别为β-羟基天冬氨酸。

另外，浓缩从Sepabeads SP207柱的30ml至45ml之间洗脱的并含有未知氨基酸-2的组分并装到填有10ml活性炭的柱子上。收集24和34ml之间洗脱的组分，装到Dowex 50wx-8柱(1ml)上，用0.5NNH₄OH溶液洗脱，接着浓缩至干，得到2.1mg未知氨基酸-2白色粉末。发现该氨基酸的分子量是131[FAB-MS m/z：132(M+H)⁺]，¹H-NMR谱[D₂O，270MHz；化学位移：δ(ppm)]在1.18(6H，dd，J＝7.0Hz)，2.38(1H，dq，J＝4.8，7.0Hz)，2.87(3H，S)和3.55(1H，d，J＝4.8Hz)，因而假定它是N-甲基缬氨酸。然后，把这种氨基酸与N-甲基-DL-缬氨酸(可从Sigma公司买到)的可靠样品比较，发现其¹H-NMR谱(化学位移)和在纤维素TLC[溶剂：正丁醇∶吡啶∶乙酸∶水(15∶10∶3∶12)]上观察到的未知氨基酸-2Rf值(0.71)完全与用可靠样品得到的结果相同，因此，未知氨基酸被鉴别为N-甲基缬氨酸。

此外，把用80％丙酮从Sepabead，SP207柱洗脱的并含有未知氨基酸-3的组分浓缩，并装到Dowex 50wx-8柱上(H⁺型，1ml)。用1N盐酸溶液将其洗脱后，将得到的洗脱液浓缩至干，得到3.5mg未知氨基酸-3盐酸化物白色粉末。发现该氨基酸的分子量是179[FAB-MSm/z：180(M+H)+]和¹H-NMR谱[D₂O，270MHz；化学位移：δ(ppm)]在2.78(1H，S)，3.32(2H，d，J＝6.2Hz)，3.95(1H，t，J＝6.2Hz)，7.4-7.5(5H，m)，因而假定它是N-甲基苯基丙氨酸。把该氨基酸与N-甲基-L-苯基丙氨酸的可靠样品(可从Sigams公司买到)进行比较，发现其¹H-NMR谱(化学位移)和在纤维素TLC[溶剂：正丁醇∶吡啶∶乙酸∶水(15∶10∶3∶12)]观察到的未知氨基酸-3的Rf值(0.82)完全与用可靠样品观察到的结果相同，因此，该未知氨基酸-3被鉴定为N-甲基苯基丙氨酸。

实施例7： WAP-8294A ₁ 、A ₂ 和A ₄ 的氨基酸分析

把在实施例4得到的约30μg WAP-8294A₁、A₂或A₄在110℃用6N HCl溶液完全水解24小时，然后浓缩并进行氨基酸分析，结果，发现它们各自都含有Asp(1mole)、GIu(1mole)、Gly(1mole)、Ser(2mole)、Leu(1mole)、Orn(2mole)、Trp(1mole)、β-羟基天冬氨酸(1mole)、N-甲基缬氨酸(1mole)和N-甲基苯基丙氨酸(1mole)。

实施例8：构成WAP-8294A ₁ 、A ₂ 和A ₄ 的脂肪酸的分离和它们的结构

把实施例4得到的WAP-8294A₁(10mg)在110℃用6N HCl水解2小时，用乙醚萃取得到的水解产物，接着浓缩该醚相至干，得0.8mg白色粉末。发现该物质的分子量是160[FAB-MS m/z：161(M+H)⁺]和¹H-NMR谱[CDCl₃，270MHz；化学位移：δ(ppm)]在0.89(3H，t，J＝7.0Hz)，1.3-1.55(8H，m)，2.46(1H，dd，J＝16.5，8.8Hz)，2.58(1H，dd，J＝16.5，3.3Hz)和4.03(1H，m)，因此证实是3-羟基辛酸。把该物质(100μg)溶于0.1ml的苯∶甲醇(8∶2)中，并通过加入一滴三甲基甲硅烷基重氮甲烷(可从Tokyo Chemical，Industry Co.，Ltd购买)在室温10分钟将其转化成其甲酯。当把该甲酯衍生物进行EI-MS测定时，观察到在m/z 173(M⁺-1)有一个离子峰、碎片离子峰在156(M⁺-18)，143(M⁺-31)和125(M⁺-31-18)以及由3-羟基脂肪酸甲酯的C₃-C₄的断裂产生的特征基本碎片离子峰在m/z103，因此，鉴定该物质是3-羟基辛酸。

用上述相同的方法，把WAP-8294A₂(10mg)用酸水解，接着用乙醚萃取，浓缩该醚相至干，得到0.9mg白色粉末。发现该物质的分子量是174[FAB-MS m/z：175(M+H)⁺]及¹H-NMR谱[CDCl₃，270MHz；化学位移：δ(ppm)]在0.87(6H，d，J＝6.6Hz)，1.15-1.56(7H，m)，2.50(1H，dd，J＝16.5，8.8Hz)，2.60(1H，dd，J＝16.5，3.3Hz)和4.03(1H，m)和其甲酯衍生物显示的EI-MS峰在m/z187(M⁺-1)，170(M⁺-18)，157(M⁺-31)，139(M⁺-31-18)和103(由C₃-C₄断裂产生的基本碎片离子峰)。因此，鉴定该物质是3-羟基-7-甲基辛酸。

用上述所用的相同方法，把WAP-8294A₄(10mg)用酸水解，接着用乙醚萃取，浓缩醚相至干，得到0.8mg白色粉末。发现该物质的分子量为188[FAB-Ms m/z：189(M+H)⁺及¹H-NMR谱[CDCl₃，270MHz；化学位移：δ(ppm)]在0.80(6H，d，J＝6.8Hz)，1.15-1.6(9H，m)，2.43(1H，dd，J＝16.5，8.8Hz)，2.50(1H，dd，J＝16.5，3.3Hz)和3.95(1H，m)和其甲酯衍生物显示的EI-MS峰在m/z 201(M⁺-1)，184(M⁺-18)，171(M⁺-31)，153(M⁺-31-18)和103(由C₃-C₄的断裂产生的基本碎片离子峰)。因此，鉴定该物质是3-羟基-8-甲基壬酸。

实施例9

把用与实施例2的相同方法得到的粗制产品(9.0g)装到填有十八烷基硅凝胶的柱子上(Chromatolex ODS-DM1020T，可从FujiSilisia Chemical Co.，Ltd买到，450ml)，进行色谱分离，然后用0.05％含有三氟乙酸的乙腈∶水(4∶6)溶剂体系洗脱并分组。收集活性组分，浓缩，然后冻干，得到450mg WAP-4294AX(盐酸化物)白色粉末。

实施例10

把实施例9得到的WAP-8294AX(120mg)，10份装到填有十八烷基硅凝胶的用于高效液相色谱的柱子中[柱子：YMC-GEL SH-343-5，20×250mm，可以从Yamamura Chemical Research Laboratory购买；流动相：0.05％含有三氟乙酸的乙腈-水(37∶63)]，以十份收集各含有WAP-8294AX-8，AX-9或AX-13的组分，接着把各组分浓缩，得到WAP-8294AX-8(14mg)、AX-9(10mg)或AX-13(12mg)白色粉末(盐酸化物)。

实施例11： WAP-8294AX-8、AX-9、AX-13的氨基酸分析

把实施例10得到的WAP-8294AX-8(5mg)溶于用0.2％3-(2-氨基甲基)吲哚增补的0.5ml 4N甲烷磺酸溶液中，在110℃进行完全水解24小时。然后浓缩所得到的水解产物至干，溶于少量水中，接着将它装到填有Dowex 50wx-8的柱子上(H⁺型，可以从Dow ChemicalCompany买到，1ml)，用20ml水洗涤，用20ml 0.5N NH₄OH洗脱。浓缩得到的洗脱液至干，溶于少量水中，然后进行两向薄层色谱分析[第一向的展开溶剂：正丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶2)，第二向的展开溶剂：正丁醇∶吡啶∶乙酸∶水(15∶10∶3∶12)]并进行氨基酸分析(HitachiAmino Acid Analyzer L-8500)。结果，发现WAP-8249AX-8含有ASP(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Ser(2mole)、Leu(1mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、Val(1mole)，N-甲基苯基丙氨酸(1mole)和β-羟基天冬氨酸(1mole)。

另外，以上述所用的相同方法，分别取5mg WAP-8294AX-9和AX-13进行酸完全水解，然后把得到的水解产物进行氨基酸分析。结果，发现WAP-8294AX-9含有ASP(1mole)、Glu(1mole)、Gly(1mole)、Ser(2mole)、Leu(1mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)、Phe(1mole)，N-甲基缬氨酸(1mole)和β-羟基天冬氨酸(1mole)；WAP-8294AX-13含有ASP(1mole)、Glu(1mole)、β-Ala(1mole)、Ser(2mole)、Leu(1mole)、Trp(1mole)、Orn(2mole)，N-甲基苯基丙氨酸(1mole)，N-甲基缬氨酸(1mole)和β-羟基天冬氨酸(1mole)。

实施例12： WAP-8294AX-8、AX-9、AX-13的脂肪酸分析

将实施例10得到的WAP-8294AX-8、AX-9和AX-13(各1mg)在110℃用6N HCl水解2小时。用乙醚萃取每一水解产物，接着浓缩醚相至干，把残余物溶于0.1ml的苯∶甲醇(8∶2)中，并通过加入一滴三甲基甲硅烷基重氮甲烷(可从Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.买到)在室温下10分钟转化成其甲酯。把每一甲酯衍生物进行GC-Ms分析[柱子：DB-5(内径：0.25mm；长度：30m；膜厚度：0.25μm；可从J&W Company买到)；温度：100-240℃(加热速度：10℃/分钟)；气相：氨；流速：0.993ml/分钟]。总之，在GC分析中的保留时间(9.7分钟)和由EI-MS测定的m/z 187(M⁺-1)、170(M⁺-18)、157(M⁺-31)、139(M⁺-31-18)和103(源于C₃-C₄的断裂产生的；特征基本碎片离子峰)都与对3-羟基-7-甲基辛酸(构成WAP-8294A₂的脂肪酸)的甲酯衍生物观察到的结果一致。这表明，所有的WAP-8294AX-8、AX-9和AX-13都含有3-羟基-7-甲基辛酸作为它们的脂肪酸组分。

实施例13： WAP-8294A的药物制剂

WAP-8294A的药物制剂的典型例子描述如下：

注射液：根据第12版日本药典中的制剂“注射液”的通则规定的规则，把40mg WAP-8294A盐酸化物溶于3ml灭菌的生理盐水(日本药典)中，无菌地引入到3ml体积的安瓿中，熔封得到注射液。

片型：按照制备“片剂”的通则规定的规则，在100mg WAP-8294A₂盐酸化物中加入65mg乳糖(日本药典)和14.2mg淀粉(日本药典)作为赋形剂；20mg聚乙烯吡咯烷酮K25(日本药典)作为粘结剂；和0.8mg硬酯酸镁(日本药典)作为润滑剂，接着均匀混合，用压片机模压，得到未包衣的片剂，每片重200mg。

软膏：按照制剂“软膏”的通则规定的规则，在40mg WAP-8294A₂盐酸化物中加入1.2g聚乙二醇4000(日本药典)、600mg聚乙二醇400(日本药典)、156mg亲水的凡士林(日本药典)、0.8mg对羟苯甲酸丙酯(日本药典)和3.2mg对羟苯甲酸乙酯(日本药典)作为杀真菌剂，接着加热熔化并均匀混合，得到一种软膏(4g/可挤的胶管)。

滴眼剂：按照制剂“滴眼剂”的通则规定的规则，把25mg WAP-8294A₂盐酸化物溶于5ml 0.9％灭菌氯化钠溶液中，然后把0.5mg氯化苯甲烃铵(日本药典)作为防腐剂加入其中，得到一种均匀的溶液，接着灭菌过滤并灭菌包装到5ml体积的点眼瓶中，得到一种滴眼剂。

如上所述，通过使用小的动物感染模式，说明本发明的新颖的抗生素WAP-8294A对由革兰氏阳性细菌，特别是MRSA(抗甲氧苯青霉素的金黄色酿脓葡萄球菌)感染引起的感染性疾病有很好的治疗效果，这种感染疾病目前在医学领域变成一个严重的问题。因此，对于治疗包括由感染性细菌革兰氏阳性细菌的传染引起的MRSA感染性疾病在内的疾病，该抗生素会是很有效的。

Claims

1.一种具有下列物理化学性质的抗生素WAP-8294A或其药用盐：

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：213-220℃；分解；

(3)溶解性：溶于水，甲醇，正丁醇，二甲基甲酰胺和二甲亚砜，还溶于丙酮，乙酸乙酯和氯仿；

(4)颜色反应：在茚三酮，艾氏菌素，Rydon-Smith，高锰酸钾水溶液，硫酸和磺蒸汽反应中呈阳性，并且用紫外灯发出的254nm的光线进行照射显示出聚熄斑；在Molisch反应，硝酸银反应，氯化铁反应和Dragendorff氏反应中呈阴性；

(5)高效液相色谱的保留时间：4.0至6.1分钟，8.0分钟，11.1分钟，12.5分钟，16.5分钟，17.9分钟和18.8分钟；

(6)紫外吸收光谱；在水中：

λmax：275nm，280nm，287nm；

(7)红外吸收光谱；FT-IR，KBr：特征吸收谱：3300cm^-1，1720-1715cm^-1，1636cm^-1，1541cm^-1，1404cm^-1，1207cm^-1，1137cm^-1；

(8)¹H-NMR谱；270MHz，D₂O：观察到复杂的、源于甲基、亚甲基、次甲基、和杂环或芳环的质子信号；

(9)分子量：1,400-1,700；

(10)有机化合物的定性试验；钠熔融法：该抗菌素是含有碳、氢、氧和氮元素的化合物；

(11)作为茚三酮阳性物质酸完全水解提供，Asp，Glu，Gly，Leu，Ser，Trp，Orn，N-甲基α-氨基异戊酸，β-羟基天冬氨酸和N-甲基苯基丙氨酸；

(12)旋光率：[α]_D ²⁰＝+42°；C＝0.5，H₂O；

(13)碱性、酸性和中性分类：两性。

2.一种具有下列物理化学性质的抗生素WAP-8294AX或其药用盐：

(1)外观：白色粉末；

(2)熔点：196-200℃；分解；

(3)熔解性：溶于水，甲醇，正丁醇，二甲基甲酰胺和二甲亚砜，不溶于丙酮，乙酸乙酯和氯仿；

(4)颜色反应：在茚三酮，艾氏菌素，Rydon-Smith，高锰酸钾水溶液，硫酸和碘蒸汽反应中呈阳性，用从紫外灯发出的254nm的光线照射显示出骤熄斑；在Molisch，硝酸银，氯化铁和Dragendorff氏反应中呈阴性；

(5)高效液相色谱的保留时间：5.3分钟，5.9分钟，6.2分钟，6.5分钟，6.9分钟，7.3分钟，8.1分钟，9.3分钟，9.8分钟，11.3分钟，12.1分钟，13.7分钟和15分钟；

(6)紫外吸收光谱；在水中：λmax：273nm，280nm，289nm；

(7)红外吸收光谱FT-IR，KBr：特征吸收谱：3300cm^-1，1720-1715cm^-1，1636cm^-1，1541cm^-1，1404cm^-1，1207cm^-1，1137cm^-1；

(8)¹H-NMN核磁共振谱；270MHz，DMSO-D₆：观察到复杂的、源于甲基、亚甲基、次甲基和杂环或芳环的质子信号；

(9)分子量：1,400-1,700；

(10)有机化合物定性试验；钠熔融法：该抗菌素是含有碳、氢、氧和氮元素的化合物；

(11)作为茚三酮阳性物质和脂肪酸酸完全水解提供Asp，Glu，Gly，β-Ala，Leu，Ser，Trp，Om，Val，N-甲基缬氨酸，β-羟基天冬氨酸，Phe，N-甲基苯基丙氨酸和3-羟基-7-甲基辛酸；

(12)旋光率：[α]_D ²⁰＝+42°；C＝0.5，H₂O；

(13)碱性、酸性和中性分类：两性。

3.一种制备权利要求1的抗生素WAP-8294A的方法，该方法包括：在一培养基中培养溶菌(Lysobacter)FERM BP-4990，以生产该抗生素和在该培养基中富集该抗生素；然后回收该抗生素。

4.一种制备权利要求2的抗生素WAP-8294AX的方法，该方法包括：在一培养基中培养溶菌FERM BP-4990，以生产该抗生素和在该培养基中富集该抗生素；然后回收该抗生素。

5.一种微生物，其中该微生物是溶菌FERM BP-4990。

6.一种抗菌组合物，该组合物包括至少一个选自由权利要求1所述的抗生素WAP-9284A和权利要求2所述的抗生素WAP-9284AX组成的一组抗生素和其药用盐。