CN1100467A

CN1100467A - 1-n-乙基庆大霉素衍生物及其制备方法

Info

Publication number: CN1100467A
Application number: CN93112412A
Authority: CN
Inventors: 赵敏; 范瑾; 刘军; 谢凤龙; 胡小玲; 杨晓伟; 范铭琦; 汪洁
Original assignee: Jiangsu Institute of Microbiology
Current assignee: Fangyuan Pharmaceutical Co., Ltd., Changzhou; Hangzhou love Pharmaceutical Co., Ltd.; Jiangsu Prov. Microbilogy Inst., Co., Ltd.
Priority date: 1993-04-23
Filing date: 1993-04-23
Publication date: 1995-03-22
Anticipated expiration: 2013-04-23
Also published as: CN1040177C; GB2293383A; JPH09500521A; GB9521654D0; AU6644094A; JP3578762B2; RU2180226C2; GB2293383B; WO1994025566A1; US5814488A

Abstract

本发明公开了一类新的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物。该类抗生素系广谱抗生素，尤其对庆大霉素耐药菌有较好的作用，而且耳、肾毒性低。本发明叙述了制备方法。

Description

本发明涉及抗生素领域。

本发明公开了新的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物及其制备方法。

庆大霉素（Gentamicin，下文简称（GM）是美国先令公司M.J.Weisten等人于1963年首先发现，并于1966年上市的氨基糖甙类抗生素。

庆大霉素是一族多组份的氨基糖甙类抗生素，其主要成分为庆大霉素C₁（GMC₁），庆大霉素C₂（GMC₂）和庆大霉素C_1a（GMC_1a），见下式：

＊庆大霉素国外称为Gentamicin，音译为艮他霉素。

R₁R₂

Gentamicin C₂H CH₃

C₁CH₃CH₃

C_1aH H

庆大霉素三个主要成分的含量多少与它的质量和疗效有密切的关系，经国内外有关专家研究证实GMC₁组份毒性较低，疗效较好。中国科学院杨蕴刘等人曾于1982年在《抗生素》7（1）：12～15报道GMC₁，GMC₂，GMC_1a单组份对74株临床分离到绿脓杆菌的最低抑菌浓度（MIC）及各组份的LD₅₀值，认为GMC_1a组份较好。

近十多年来，国际上已有十多个国家生产庆大霉素，并广泛被人们使用，但是，伴之而来的耳、肾毒性副作用在医疗上受到了一定的限制。因此，寻求耳、肾毒性低的氨基糖甙类抗生素引起人们的关注。

本发明的目的在于开发一类新的半合成抗生素，降低毒性、提高抗菌效力，尤其能对GM耐药菌株有效。

本发明人经过不断研究，半合成一类新的1-N-乙基-庆大霉素衍生物。

本发明提供了以下式表示的一类1-N-乙基-庆大霉素衍生物。

注：[1]表示1-N-乙基庆大霉素C₁，[2]表示1-N-乙基庆大霉素C₂，[3]表示1-N-乙基庆大霉素C_1a（爱大霉素），[4]表示1-N乙基庆大霉素C_2b（乙基小诺霉素）。

在上述中，1-N-乙基庆大霉素C_1a又命名为爱大霉素（其代号为8907）。

其拉丁名为1-N-Ethagentamycin C_1a

分子式：C₁₂H₄₃N₅O₇

分子量：477

英文化学名：O-2-amino-2，3，4，6-tertradeoxy-6-（amino）-2-D-erythro-hexopyranosyl-（1→4）-O-[3-deoxy-4-C-methyl-3-（methylamino）-β-L-arabinopy-ranosyl-（1→6）]-2-deoxy-N-ethyl-L-streptamine hemipenta sulfate

经仪器分析测定如下：

一.红外吸收光谱见附图1。

仪器：399-B（V.S.PECO）。

条件：KBr压片测试

测定数据

吸收峰振动类型基团吸收峰强度

cm^-1

3450-3000 υ_O-H-OH S

υ_N-H-NH

2920 υ_C-HC-H S

1580 υ_H-N-H-NH₂S

1470-1440 δ_CH2-CH₂- S

δ_CH3-CH₃-

1370-1300 δ_C-HC-H S

1100 υ_C-O-CC-O-C m

1050-1010 υ_C-CC-C和五碳环状醚 S

根据89-07的IR解析表示该分子内有-NH，-NH₂，-OH，不对称-CH₂-，-CH₃和C-O-C等功能基团，系典型氨基糖苷类抗生素的红外光谱。

二.紫外吸收光谱（见附图2）

仪器：岛津UV-240紫外分光光度计。

溶剂：H₂O

测定数据：

在200nm-400nm均无吸收峰

解析说明：

具有氨基糖苷类抗生素均无紫外吸收峰的特性。

三.¹H核磁共振（见附图3）

仪器：AM500核磁共振仪（BRURER公司）

溶剂：D₂O，内标TMS，¹H共振频率为500.13

测定数据：

质子序号化学位移(ppm) 多重性质子数相应质子

89-07 文献记载

a 1.09 1.06 三重峰 3 -C-CH₃

b 1.20 1.19 单峰 3 -C-CH₃

c 2.51 2.51 单峰 3 -N-CH₃

d 4.98 4.97 二重峰 1 -H

e 5.22 5.16 二重峰 1 -H

解析：

a.δ1.07为一个三重，峰偶合常数J＝7.0Hz为2-脱氧链霉胺1-N-CH₂CH₃中-CH₃（3H J＝7.0Hz-N-C-CH₃）;

b.δ1.20为一单峰，相当于三个质子，为加拉糖4″位上4″-CH₃（3H，S，-C-CH₃）

c.δ2.51为一单峰，相当于3个质子数，为加拉糖3″-N-CH₃（3H，S，-N-CH₃）

d.δ4.97为一双重峰，偶合常数J＝4.0Hz，为加拉糖1″位H（H，d，J＝4.0Hz）

e.δ5.22为一双重峰，偶合常数J＝3.5Hz为绛红糖1’位H（H，d，J＝3.5Hz）

从¹H-NMR得知分子中有1-N-CH₂CH₃

四.¹³CNMR核磁共振谱（见附图4）

仪器：AM-500核磁共振仪

溶剂：D₂O，TMS为内标（¹³C共振频率为125.76）

测定数据：

Cabor GMC_1m文献值爱大霉素(测定值)

(序号) (ppm) (ppm)

1 51.7 59.60

2 36.7 35.04

3 50.6 52.17

4 88.3 89.08

5 75.4 77.57

6 87.8 88.46

1-N-CH₂- / 47.02

1-N-CH₂-Me / 16.43

1' 102.2 103.79

2' 51.0 52.54

3' 27.0 30.06

4' 28.5 28.04

5' 71.5 72.49

6' 46.1 43.01

(接上页)

Cabor GMC_1m文献值爱大霉素(测定值)

1" 101.3 103.34

2" 70.2 72.10

3" 64.4 66.28

4" 73.3 75.02

5" 68.7 70.71

3"-N-Me 38.0 39.52

4"-C-Me 23.0 24.44

解析：

图上有21个峰，对应于分子中的21个碳，说明分子无对称性。

δ47.02为1-N-CH₂CH₃中亚甲基上的C。

δ16.43为1-N-CH₂CH₃中甲基上的C。

故从¹³C-NMR谱得知89-07的化学结构为庆大霉素C_1a在二脱氧链霉胺1-N上接一个乙基而成。

五.质谱（见附图5）

仪器：ZAB-2F型质谱仪

条件：EI源

测定数据：

解析：

质谱测得分子离子峰+1（M+1）⁺为478即其分子量为477与C₂₁H₄₃N₅O₇分子量相符，其余各m/e均与文献值完全一致。

综合解析：

1.质谱测得其分子离子峰m/e为477与C₁₂H₄₃N₅O₇相符。

2.质谱测得m/e317和m/e258系1-N-乙基庆大霉素C_1a裂解出来的碎片峰;而没有3-N-乙基庆大霉素C_1a裂解出来的碎片峰（m/e 289和m/e286）。

3.在核磁共振图谱中（¹H，¹⁵C，¹H-¹H，¹H-¹⁵C-NMR）均证实在二脱氧链霉胺1-N位上确实接上了一个乙基。

4.红外光谱与紫外光谱均证实了其具有氨基糖苷类抗生素的基本特性。

综上所述庆大霉素C_1a分子中二脱氧链霉胺（2-DOS）1-N位被乙基取代与爱大霉素结构相符。

本发明公开的1-N-乙基庆大霉素衍生物如爱大霉素（以8907表示）经体外抗菌作用研究，结果表明它对临床分离的1106株常见致病菌抗菌活性，杀菌作用均与庆大霉素相似或优于庆大霉素;对耐庆大霉素，耐小诺霉素和耐头孢唑啉耐药菌株有半数或半数以上的菌株的最低抑菌浓度（MIC）值仍在其安全有效的血药浓度范围内，用同等剂量或参考乙基紫苏霉素，经过剂量与疗效及毒性相关研究，若能获得类似乙基紫苏霉素的结果，因而能适当提高临床剂量，适当提高临床剂量则对耐药菌的感染疗效可能会优于庆大霉素与小诺霉素，特别是53株高度耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）有66%的菌株可被≤8mg/1的浓度进行抑制。因此，本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物对提高对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌的疗效发挥积极作用（见表1-8）。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物经对小鼠体内药效测定表明对小鼠体内的细菌感染具有良好的疗效。它的体内保护作用与丁胺卡那霉素（AMK）相近，但优于庆大霉素，妥布霉素（Tobramycin），低于1-N-乙基紫苏霉素。它尤其对庆大霉素耐药菌株感染小鼠的体内疗效比丁胺卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素强1-4倍（见表9）。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物对所试各菌株感染小鼠体内疗效重复性好，而且对存活小鼠作心脏血培养，转阴率较高，说明其体内抑菌、杀菌活力很强，并与体外抑菌活力基本一致。

（体内试验表）见表10-15。

表1、89-07和其它抗菌药物对1108株临床分离致病菌抗菌活性的比较菌种抗菌药物 MIC₅₀MIC₉₀Mode MIC MIC_range

(No.)

绿脓杆菌庆大霉素 4 >256 2 0.125->6

(204) 89-07 8 >256 8 0.125->6

卡那霉素 64 >256 64 0.5->6

丁胺卡那霉素 4 32 2 0.125->6

妥布霉素 1 256 1 0.125->6

乙基紫苏霉素 8 >256 4 0.062->6

小诺霉素 4 >256 2 0.125->6

氧哌嗪青霉素 4 256 4 0.5->6

头孢唑啉 >256 >256 >256 >256

环丙氟沙星 0.25 2 0.25 0.062-256

阴沟肠杆菌庆大霉素 4 256 0.25 0.125->6

(29) 89-07 2 64 0.25 0.25->6

卡那霉素 16 >256 1 0.5->6

丁胺卡那霉素 0.5 32 0.5 0.5->6

妥布霉素 8 32 0.5 0.25->6

乙基紫苏霉素 0.25 32 0.25 0.25->6

小诺霉素 4 >256 0.25 0.25->6

氧哌嗪青霉素 128 256 256 2->6

头孢唑啉 >256 >256 >256 256->6

环丙氟沙星 0.062 1 0.031 <0.015-1

产气肠杆菌庆大霉素 0.25 32 0.25 0.125-128

(27) 89-07 0.25 16 0.125 0.062-32

卡那霉素 1 32 1 0.25->6

丁胺卡那霉素 0.5 1 0.5 0.062-16

妥布霉素 0.5 1 0.25 0.125-16

乙基紫苏霉素 0.25 2 0.25 0.062-8

小诺霉素 0.25 64 0.25 0.125-128

氧哌嗪青霉素 4 256 2 0.5->6

头孢唑啉 32 >256 2 0.5->6

环丙氟沙星 <0.015 0.062 <0.015 <0.015-2

大肠杆菌庆大霉素 0.5 32 0.25 0.062->6

(146) 89-07 0.25 16 0.25 0.125-64

卡那霉素 2 256 1 0.25->6

丁胺卡那霉素 0.5 1 0.5 0.125-32

妥布霉素 0.5 8 0.5 0.062->6

乙基紫苏霉素 0.5 8 0.25 0.062-64

小诺霉素 0.5 64 0.125 0.125->6

氧哌嗪青霉素 8 32 8 0.062->6

头孢唑啉 2 4 2 0.25->6

环丙氟沙星 <0.015 1 <0.015 <0.015-64

表1、89-07和其它抗菌药物对1108株临床分离致病菌抗菌活性的比较

菌种抗菌药物 MIC₅₀MIC₉₀Mode MIC MIC_range

(No.)

奇异变形杆菌庆大霉素 0.5 16 0.5 0.25-256

(60) 89-07 0.5 2 0.5 0.125-128

卡那霉素 1 256 1 0.5->6

丁胺卡那霉素 1 2 1 0.25-64

妥布霉素 0.5 8 0.5 0.25-64

乙基紫苏霉素 0.5 2 0.5 0.25-128

小诺霉素 0.5 16 0.5 0.125-256

氧哌嗪青霉素 0.5 4 0.5 0.25->6

头孢唑啉 4 128 4 2->6

环丙氟沙星 0.062 0.125 0.062 0.031-8

流感嗜血杆菌庆大霉素 0.125 8 0.062 0.031-8

(8) 89-07 0.031 4 0.031 0.031-4

卡那霉素 0.5 64 0.25 0.125-64

丁胺卡那霉素 0.25 64 0.125 0.062-64

妥布霉素 0.125 16 0.062 0.062-16

乙基紫苏霉素 0.125 2 0.031 0.031-2

小诺霉素 0.125 8 0.062 0.031-8

氧哌嗪青霉素 2 32 0.125 0.125-3

头孢唑啉 0.25 >256 0.125 0.125->6

环丙氟沙星 0.25 4 0.25 0.031-4

绿色链球菌庆大霉素 1 4 1 0.125-4

(27) 89-07 1 4 2 0.062-4

卡那霉素 8 16 8 0.5-32

丁胺卡那霉素 8 32 4 0.5-64

妥布霉素 4 8 4 0.25-16

乙基紫苏霉素 1 2 1 0.125-4

小诺霉素 2 4 4 0.125-4

氧哌嗪青霉素 0.25 16 0.5 0.031-16

头孢唑啉 0.5 16 0.125 0.031-64

环丙氟沙星 2 4 2 0.062-32

肺炎链球菌庆大霉素 0.25 4 0.062 0.062->6

(14) 89-07 0.25 4 0.031 0.031-16

卡那霉素 4 64 4 0.125->6

丁胺卡那霉素 8 16 16 0.031->6

妥布霉素 2 32 0.125 0.062->6

乙基紫苏霉素 1 16 1 0.062-64

小诺霉素 0.5 4 2 0.062->6

氧哌嗪青霉素 0.5 8 0.5 0.25-16

头孢唑啉 0.5 256 0.5 0.125->6

环丙氟沙星 0.5 1 0.5 0.125-2

表皮葡萄球菌庆大霉素 0.062 2 0.062 0.062-4

(27) 89-07 0.031 1 0.031 0.031-16

卡那霉素 0.5 128 0.125 0.125-128

丁胺卡那霉素 0.25 0.5 0.25 0.062-2

妥布霉素 0.062 2 0.062 0.062-16

乙基紫苏霉素 0.062 0.5 0.062 0.031-128

小诺霉素 0.062 32 0.062 0.062-64

氧哌嗪青霉素 1 16 0.125 0.125-256

头孢唑啉 0.5 32 1 0.125-32

环丙氟沙星 0.25 1 0.125 0.062-2

(续)

菌种抗菌药物 MIC₅₀MIC₉₀Mode MIC MIC_range

(No.)

金黄色葡萄球菌庆大霉素 4 32 16 0.031->6

89-07 1 16 0.062 0.031-128

(190) 卡那霉素 128 >256 >256 0.25->6

丁胺卡那霉素 1 8 0.25 0.125-128

妥布霉素 4 32 0.125 0.125->6

乙基紫苏霉素 1 4 1 0.031-32

小诺霉素 8 256 0.062 0.002->6

氧哌嗪青霉素 8 256 4 0.25->6

头孢唑啉 1 128 1 0.125->6

环丙氟沙星 0.5 2 0.5 0.031-64

粪链球菌庆大霉素 32 >256 1 0.25->6

89-07 32 256 1 0.5-256

(33) 卡那霉素 256 >256 256 4->6

丁胺卡那霉素 32 128 16 2-256

妥布霉素 128 256 256 1-256

乙基紫苏霉素 4 32 1 0.5-128

小诺霉素 2 256 2 0.5-256

氧哌嗪青霉素 2 2 2 0.062-128

头孢唑啉 16 32 16 0.062->6

环丙氟沙星 1 1 1 0.5-2

酿脓链球菌庆大霉素 1 128 1 0.25->6

89-07 1 32 1 0.25-128

(27) 卡那霉素 16 >256 16 4->6

丁胺卡那霉素 16 16 16 4-32

妥布霉素 4 64 1 1-128

乙基紫苏霉素 1 8 1 0.25-32

小诺霉素 0.5 256 0.5 0.25-256

氧哌嗪青霉素 <0.015 1 <0.015 <0.015-4

头孢唑啉 0.125 8 0.125 0.031-16

环丙氟沙星 0.5 1 0.5 0.125-8

甲氧苯青霉素 >256 >256 >256 64->6

耐甲氧苯青霉素苯唑青霉素 >256 >256 >256 16->6

金黄色葡萄球菌头孢唑啉 128 256 128 16->6

庆大霉素 32 64 16 8->6

(53) 89-07 8 32 8 0.5-128

(续)

菌种抗菌药物 MIC₅₀MIC₉₀Mode MIC MIC_range

(No.)

克雷伯氏肺炎杆菌庆大霉素 0.125 32 0.125 0.002-256

89-07 0.125 8 0.125 0.002-128

(115) 卡那霉素 0.5 128 0.5 0.25-256

丁胺卡那霉素 0.5 2 0.5 0.125-128

妥布霉素 0.25 8 0.25 0.062->6

乙基紫苏霉素 0.25 4 0.125 0.062-128

小诺霉素 0.125 16 0.125 0.062->6

氧哌嗪青霉素 4 128 4 1->6

头孢唑啉 2 32 2 1->6

环丙氟沙星 0.031 0.25 0.031 <0.015-8

沙门氏菌属庆大霉素 4 32 4 0.25-128

89-07 0.5 8 0.5 0.062-32

(58) 卡那霉素 32 >256 32 0.5->6

丁胺卡那霉素 1 1 1 0.25-16

妥布霉素 8 16 8 0.125-16

乙基紫苏霉素 0.25 4 0.25 0.125-16

小诺霉素 8 64 16 0.062-128

氧哌嗪青霉素 128 256 256 1-256

头孢唑啉 8 64 64 1-128

环丙氟沙星 0.25 0.5 0.25 <0.015-2

痢疾志贺氏菌属庆大霉素 0.25 0.5 0.25 0.25-64

89-07 0.25 0.5 0.25 0.125-64

(60) 卡那霉素 2 2 1 1->6

丁胺卡那霉素 1 2 1 0.5-16

妥布霉素 0.5 1 0.5 0.25-32

乙基紫苏霉素 0.25 1 0.125 0.125-64

小诺霉素 0.5 2 0.5 0.25-256

氧哌嗪青霉素 0.5 16 0.125 0.062-32

头孢唑啉 2 4 1 1-32

环丙氟沙星 <0.015 0.062 0.015 <0.015-0.5

不动杆菌属庆大霉素 0.5 >256 0.25 0.125->6

89-07 0.5 256 0.25 0.125-256

(27) 卡那霉素 1 >256 0.5 0.25->6

丁胺卡那霉素 1 64 0.5 0.25-256

妥布霉素 0.5 256 0.5 0.062-256

乙基紫苏霉素 1 256 0.5 0.125-256

小诺霉素 0.5 256 256 0.125-512

氧哌嗪青霉素 32 256 256 4-256

头孢唑啉 256 >256 >256 8-256

环丙氟沙星 0.25 2 0.25 0.062-4

枸橼酸:杆菌属庆大霉素 0.25 64 0.25 0.125->6

(30) 89-07 0.25 16 0.25 0.125-128

卡那霉素 1 64 1 0.5->6

丁胺卡那霉素 0.5 1 0.5 0.25-32

妥布霉素 0.5 8 0.5 0.125->6

乙基紫苏霉素 0.25 8 0.25 0.125->6

小诺霉素 0.25 128 0.25 0.125-256

氧哌嗪青霉素 2 64 2 2-128

头孢唑啉 16 >256 >256 2->6

环丙氟沙星 0.031 0.125 <0.015 <0.015-2

沙雷氏杆菌属庆大霉素 0.25 128 0.25 0.125->6

(24) 89-07 0.5 32 0.5 0.062-256

卡那霉素 1 16 1 0.125->6

丁胺卡那霉素 0.5 2 0.5 0.062-64

妥布霉素 1 32 1 0.062-256

乙基紫苏霉素 0.5 4 1 0.062-256

小诺霉素 0.25 256 0.25 0.125-256

氧哌嗪青霉素 2 128 2 0.25->6

头孢唑啉 >256 >256 >256 >256

环丙氟沙星 0.062 0.25 0.062 <0.015-1

表2.89-07与庆大霉素的HIC和MBC作用比较

89-07 庆大霉素

菌种株数

MIC₅₀MBC₅₀MIC

MBC

MIC₅₀MBC₅₀MIC

MBC

绿脓杆菌 20 1 2 4 8 2 2 4 8

金黄色葡萄球菌 31 0.062 0.5 0.25 2 0.125 0.5 0.5 2

大肠杆菌 20 0.125 0.25 0.5 1 0.125 0.5 0.25 1

克雷伯氏肺炎杆菌 20 0.125 0.25 0.125 0.5 0.125 0.25 0.25 1

志贺氏菌属 10 0.062 0.5 0.125 1 0.125 0.25 0.25 1

表2.89-07与庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素的MBC作用比较续

89-07 庆大霉素卡那霉素丁胺卡那霉素

菌种株数

MBC

MBC_rangeMBC MBC_rangeMBC

MBC_rangeMBC

MBC_range

绿脓杆菌 20 8 0.25-16 8 0.5-16 128 2-256 64 1-64

金黄色葡萄球菌312 0.062-4 2 0.062-4 64 0.125-128 320.125-128

大肠杆菌 20 1 0.125-8 1 0.125-8 8 0.5-128 2 0.25-8

克雷伯氏肺炎杆菌 20 0.5 0.062-1 1 0.062-2 4 0.25-4 1 0.125-2

志贺氏菌属 10 1 0.125-1 1 0.125-1 2 0.5-4 0.5 0.25-1

表3.细菌接种量对89-07最低抑菌浓度的影响

89-07

菌种 MIC

mg/l 10³10⁴10⁵10⁶10⁷

克雷伯氏肺炎杆菌 MIC₉₀0.125 0.125 0.125 0.125 0.25

大肠杆菌 MIC₉₀0.5 0.5 1 2 2

绿脓杆菌 MIC₉₀2 2 4 4 4

阴沟肠杆菌 MIC₉₀0.031 0.25 0.25 0.25 0.5

志贺氏菌属 MIC₉₀0.031 0.062 0.25 0.25 1

金黄色葡萄球菌 MIC₉₀0.25 0.25 0.25 0.5 0.5

表4.PH值对89-07最低抑菌浓度的影响

菌种 MIC 89-07

mg/l PH_5.0PH_0.5PH_7.0PH_7.5PH_7.8-8.0PH_8.5PH_9.0

绿脓杆菌 MIC₉₀64 32 16 8 4 8 无

克雷伯氏 MIC₉₀64 4 0.5 0.25 0.125 0.25 细

肺炎杆菌菌

大肠杆菌 MIC₉₀64 4 1 0.5 0.25 0.25 生

长

表5.89-07对53株MRSA菌株MIC值的比较

Methicillin Oxacillin Cefazolin Gentamicin 89-07

1 91-131 128 128 128 32 8

2 106 >256 >256 128 32 16

3 528 >256 >256 128 32 8

4 281 >256 >256 128 16 4

5 1124 128 >256 64 32 8

6 210 32 32 32 >256 32

7 1044 256 256 64 64 1

8 480 >256 >256 128 32 4

9 525 32 32 32 16 8

10 1057 128 256 32 128 16

11 1140 256 128 32 16 4

12 126 128 128 32 32 8

13 134 64 64 16 32 16

14 57 128 128 32 32 8

15 912 128 128 32 32 16

16 624 >256 >256 32 >256 32

17 130 128 128 64 >256 64

18 408 256 >256 64 32 2

19 124 128 128 64 32 8

20 351 128 128 64 8 4

21 58 256 128 128 32 8

22 259 >256 >256 256 32 8

23 92-20 >256 >256 >256 16 8

24 22 64 32 64 32 16

25 24 >256 >256 >256 16 2

26 107 >256 256 128 16 64

27 85 >256 >256 256 16 16

28 90 64 16 32 32 8

29 50 >256 >256 128 32 16

30 92-49 >256 128 128 32 32

31 70 >256 >256 128 16 4

32 73 >256 >256 256 16 4

33 75 >256 256 256 16 8

34 40 >256 >256 128 32 16

35 43 >256 >256 256 16 8

36 44 >256 >256 256 16 8

37 45 >256 >256 128 16 8

38 91 >256 >256 256 16 4

39 89 >256 >256 128 16 4

40 108 >256 >256 128 64 16

41 79 >256 >256 128 16 1

42 19 64 16 >256 32 16

43 93 >256 >256 256 16 4

44 116 >256 >256 256 32 16

45 77 >256 >256 256 >256 128

46 80 >256 >256 256 16 8

47 84 >256 >256 128 >256 32

48 111 >256 >256 256 16 8

49 110 >256 >256 256 16 8

50 334 >256 >256 64 16 4

51 55 >256 >256 32 16 1

52 347 64 256 128 16 8

53 495 64 256 128 64 0.5

表6.89-07和其它九种抗菌物药对庆大霉素耐药菌的作用比较

菌种抗菌药物 MIC₅₀MIC₉₀Mode MIC MIC_range

(No.)

金黄色葡萄球菌庆大霉素 16 64 16 8→256

(92) 89-07 8 32 8 1-128

卡那霉素 >256 >256 >256 16→256

丁胺卡那霉素 4 32 4 0.5-128

妥布霉素 16 128 16 1→256

乙基紫苏霉素 2 8 2 0.25-32

小诺霉素 128 >256 64 8→256

氧哌嗪青霉素 32 256 256 2→256

头孢唑啉 32 128 32 0.5→256

环丙氟沙星 0.5 8 0.25 0.25-64

绿脓杆菌庆大霉素 256 >256 >256 8→256

(78) 89-07 64 >256 >256 1→256

卡那霉素 256 >256 >256 2→256

丁胺卡那霉素 8 64 4 0.25→256

妥布霉素 64 >256 >256 1→256

乙基紫苏霉素 32 >256 >256 0.125→256

小诺霉素 >256 >256 >256 4→256

氧哌嗪青霉素 16 >256 4 2→256

头孢唑啉 >256 >256 >256 >256

环丙氟沙星 0.5 4 0.5 0.125-256

大肠杆菌庆大霉素 32 64 16 8→256

(54) 89-07 8 32 16 0.25-64

卡那霉素 4 >256 4 2→256

丁胺卡那霉素 0.5 1 0.5 0.25-32

妥布霉素 8 32 8 0.5→256

乙基紫苏霉素 4 8 4 1-16

小诺霉素 64 256 64 8→256

氧哌嗪青霉素 16 32 16 1→256

头孢唑啉 2 16 2 1→256

环丙氟沙星 <0.015 32 <0.015 <0.015-64

克雷伯氏肺炎菌庆大霉素 64 256 32 16-256

(14) 89-07 16 128 16 0.5-128

卡那霉素 >256 >256 >256 8→256

丁胺卡那霉素 4 128 32 0.5-128

妥布霉素 64 >256 64 4→256

乙基紫苏霉素 16 128 128 1-128

小诺霉素 128 >256 >256 1→256

氧哌嗪青霉素 128 >256 >256 1→256

头孢唑啉 16 >256 >256 2→256

环丙氟沙星 0.125 4 1 <0.015-8

表7.89-07与其它九种抗菌药物对头孢唑啉耐药菌的作用比较

菌种抗菌药物 MIC₅₀MIC₉₀Mode MIC MIC_range

(No.)

金黄色葡萄球菌头孢唑啉 64 256 32 32->6

(55) 89-07 8 32 8 0.5-128

庆大霉素 16 64 16 0.5->6

卡那霉素 >256 >256 >256 1->6

丁胺卡那霉素 4 32 4 0.5-128

妥布霉素 16 256 16 1->6

乙基紫苏霉素 2 8 2 0.25-32

小诺霉素 128 >256 128 2->6

氧哌嗪青霉素 256 >256 256 0.25->6

环丙氟沙星 1 16 0.5 0.25-64

绿脓杆菌头孢唑啉 >256 >256 >256 >256

(204) 89-07 8 >256 8 0.125->6

庆大霉素 4 >256 4 4->6

卡那霉素 64 >256 32 0.5->6

丁胺卡那霉素 4 32 2 0.125->6

妥布霉素 1 256 1 0.125->6

乙基紫苏霉素 8 >256 4 0.062->6

小诺霉素 4 >256 2 0.125->6

氧哌嗪青霉素 4 >256 4 0.25->6

环丙氟沙星 0.25 2 0.25 0.062-256

大肠杆菌头孢唑啉 32 >256 32 32->6

(6) 89-07 16 64 16 1-64

庆大霉素 16 >256 16 0.125->6

卡那霉素 128 >256 128 4->6

丁胺卡那霉素 0.5 32 0.5 0.5-32

妥布霉素 8 >256 8 2->6

乙基紫苏霉素 4 8 8 0.5-8

小诺霉素 64 256 256 1-256

氧哌嗪青霉素 32 >256 32 8->6

环丙氟沙星 0.125 4 0.125 0.015-4

克雷伯氏肺炎杆菌头孢唑啉 >256 >256 >256 32->6

(15) 89-07 0.5 128 0.125 0.125-128

庆大霉素 2 256 0.125 0.125-256

卡那霉素 16 >256 >256 0.5->6

丁胺卡那霉素 4 128 32 0.5-128

妥布霉素 8 >256 0.25 0.25->6

乙基紫苏霉素 1 128 0.125 0.125-128

小诺霉素 1 >256 0.125 0.125->6

氧哌嗪青霉素 8 >256 1 1->6

环丙氟沙星 0.25 4 0.015 0.015-4

表8.89-07与其它九种抗菌药物对头胞唑啉耐药的作用比较

菌种抗菌药物 MIC₅₀MIC₉₀Mode MIC MIC_range

(No.)

金黄色葡萄球菌头孢唑啉 64 256 32 32→256

(55) 89-07 8 32 8 0.5-128

庆大霉素 16 64 16 0.5→256

卡那霉素 >256 >256 >256 >256

丁胺卡那霉素 4 32 4 0.5-128

妥布霉素 16 256 16 1→256

乙基紫苏霉素 2 8 2 0.25-32

小诺霉素 128 >256 128 2→256

氧哌嗪青霉素 256 >256 256 0.25→256

环丙氟沙星 1 16 0.5 0.25-64

绿脓杆菌头孢唑啉 >256 >256 >256 >256

(204) 89-07 8 >256 8 0.125→256

庆大霉素 4 >256 4 4→256

卡那霉素 64 >256 32 0.5→256

丁胺卡那霉素 4 32 2 0.125→256

妥布霉素 1 256 1 0.125→256

乙基紫苏霉素 8 >256 4 0.062→256

小诺霉素 4 >256 2 0.125→256

氧哌嗪青霉素 4 >256 4 0.25→256

环丙氟沙星 0.25 2 0.25 0.062-256

大肠杆菌头孢唑啉 32 >256 32 32→256

(6) 89-07 16 64 16 1-64

庆大霉素 16 >256 16 0.125→256

卡那霉素 128 >256 128 4→256

丁胺卡那霉素 0.5 32 0.5 0.5-32

妥布霉素 8 >256 8 2→256

乙基紫苏霉素 4 8 8 0.5-8

小诺霉素 64 256 256 1-256

氧哌嗪青霉素 32 >256 32 8→256

环丙氟沙星 0.125 4 0.125 0.015-4

克雷伯氏肺炎杆菌头孢唑啉 >256 >256 >256 32→256

(15) 89-07 0.5 128 0.125 0.125-128

庆大霉素 2 256 0.125 0.125-256

卡那霉素 16 >256 >256 0.5→256

丁胺卡那霉素 4 128 32 0.5-128

妥布霉素 8 >256 0.25 0.25→256

乙基紫苏霉素 1 128 0.125 0.125-128

小诺霉素 1 >256 0.125 0.125→256

氧哌嗪青霉素 8 >256 1 1→256

环丙氟沙星 0.25 4 0.015 0.015-4

＊皮下给药为感染后即刻与6小时各给药一次。

ED50值以单次给药剂量计算。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物动物体内药代动力学和组织分布研究结果如下：

1.狗分别肌注89-07 1.5mg/Kg、3.0mg/Kg和4.5mg/Kg均能很快吸收;达峰时间分别为0.60±0.08hr，0.65±0.23hr和0.56±0.20hr;峰浓度C_max分别为5.39±0.99，8.26±2.10和17.54±2.68mg/L，均无吸收迟滞时间，其血药浓度-时间曲线均附合一室模型。三种剂量的药时曲线下面积AUC分别12.32±3.47，22.70±4.68和41.23±8.28mg/Lh。消除半衰期分别为1.08±0.43，1.40±0.25和1.20±0.26hr。上述结果和GM药代动力学参数相近。

2.比较了89-07与GM在狗肌注3mg/kg及大鼠肌注2mg/kg时药代动力学，结果表明上述两药在动物体内动态变化规律相似，药代动力学参数相近，其血药浓度-时间曲线均符合一室模型，详见下表。

由以上药代动力学参数表明，89-07吸收迅速，消除半衰期较短，且血药浓度随剂量增加而增高;此项研究结果对今后Ⅰ期临床试验的进行提供了理论依据。

3.89-07和GM的排泄实验结果表明：

（1）狗：分别肌注89-07和GM 3mg/Kg，12hr尿中排出率分别为85.11%和93.03%;肌注89-071.5mg/Kg和4.5mg/Kg，12hr尿中排出率分别为77.07%和83.97%。

（2）大鼠：肌注89-07和GM 2mg/Kg，12hr尿中排出率分别为76.76%和90.49%;8hr胆汁中的浓度分别为0.93～2.69和1.25～3.18mg/L。胆汁中药物排出总量为给药量的0.38%和0.85%;粪中浓度分别为1.62μg/g和2.29μg/g粪中药物排出总量为给药量的2.5%和3.4%。由此可见肾排泄为89-07的主要代谢途径。

4.89-07在大鼠体内组织分布于正常人血浆蛋白结合率，结果表明：

（1）大鼠体内组织分布情况，大鼠单次肌注2mg/Kg89-0730分钟时，89-07组肾浓度为相应时间血药浓度的320%;其次为肺、心、脾，分别为相应时间血浓度的75.74%，45.25%，46.88%在240分钟时脑、肠、胰、生殖腺、脂肪组织中仅能测出少量药物浓度，此时，肾中药物浓度仍为12.27μg/g。值得一提的是在实验发现89-07较GM能透过血脑屏障进入脑组织，在临床使用时将有参考价值。

（2）89-07及GM三种血药浓度10，4，2μg/ml都在临床有效血药浓度范围内，其蛋白结合率分别为23.21%和25.51%，两药间无显著性差异，皆属于血浆蛋白结合率较低药物。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物的药理研究结果：

89-07对神经系统的影响。实验选用昆明种小鼠，从89-07的3个剂量（6.24，48mg/Kg s.c.）四个方面，17个指标的观察分析，结合与阴性对照组（生理盐水）的统计学比较，及参比各阳性对照组，结果表明89-07对清醒小鼠的神经活动，自主神经系统、姿势、步态及肌肉收缩和对刺激的应答反应，并无明显的兴奋或抑制作用。

89-07对麻醉猫的心血管、呼吸系统的影响。89-07采用5mg/ml和20mg/ml二个剂量，在颈静脉恒连给药，在60分钟的试验期内，各参数比较稳定，5mg/Kg剂量组的各测定值均在正常范围内波动;20mg/Kg剂量组的血压，呼吸频率和通气量有下降趋势，但与前提值相比无明显差别（P＞0.05），结合生理盐水对照组及89-07 5mg/Kg组各参数值分析认为20mg/Kg组显示变化趋势，不象是药物所致，故认为89-07i.v.治疗剂量应对血压、心率、心电图及呼吸均无明显影响。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物的肌肉刺激性实验结果：

89-07系碱性水溶性抗生素，临床使用其硫酸盐注射液，给药途径为肌注和静注。为评价肌注的刺激性，单次肌肉注射法及注射刺激反应的分级和评价标准，以丁胺卡那霉素为阳性对照药物，同时进行比较试验。从肉眼和病理学检查均表明，89-07肌注的局部刺激性比丁胺卡那霉素小，即使有轻微刺激，96hr观察显示出恢复的趋势。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物的毒理研究结果：

1.89-07动物急性毒性研究

89-07对昆明小白鼠i.v.，s.c.，i.m.给药LD₅₀分别为65.47，479.91，172.89mg/kg;对NIH小鼠i.v.，s.c.给药LD₅₀分别为79.88mg/Kg和460.42mg/Kg，89-07的急性毒性明显低于NTL与GM接近。

89-07对大鼠i.v.，s.c.，i.m.，i.p.给药LD₅₀分别为73.75，402.65，565.16和627.98mg/Kg。

2.动物长期毒性研究

为评价89-07反复用药的安全性，进行了大白鼠腹腔注射89-0790天和Beagle狗静注89-07 90天毒性试验。

大鼠低，中，高三剂量分别为30，100，180mg（效价）/Kg，经腹腔给药，实验中进行一般生理学观察，血液学检查和病理学检查。结果表明：89-07腹腔注射90天，中毒表现明显的剂量大于100MKD;基本安全剂量为30MKD，与小诺霉素（MCR）有关文献相比（MCR基本安全剂量为25MKD，主要的中毒表现剂量为63MKD以上）认为大鼠反复给药的毒性，89-07不比小诺霉素大。

Beagle狗静脉注射给药剂量分别为10、30、60mg（效价）/Kg三组，除按大鼠作上述三项观察、检查外，还进行了眼底检查。将试验结果与MCR文献相比较，作者认为89-07 10MKD连续90天的静注效应，基本上相当于MCR10MKD连续30天的肌注效应，因此在89-07的临床研究中，MRC的临床用量具有比较大的参考价值。

3.耳毒性研究

89-07的听毒性和前庭毒性;采用大鼠听源性反应模型和小鼠游泳实验研究了89-07，GM和KM三种氨基糖苷类抗生素的耳毒性。研究结果表明89-07的耳毒性远远低于GM和KM。

89-07与GM，AMK对豚鼠耳毒性的比较;实验中各种药物均设低、中、高三个剂量，每天一次肌肉注射，连续给药28日，实验中分别进行听力和前庭机能测定;给药结束后次日，断头处死豚鼠，取颞骨固定，制作内耳标本，进行全耳蜗铺片，计数坏死毛细胞，扫描电镜观察和火棉胶切片。由实验结果表明：

（1）耳蜗毒性：89-07与生理盐水对照组相比较，在低、中、高三个剂量组均未观察到明显的耳蜗毒性;而GM及AMK除小剂量外，在中剂量组即显示听阈升高;高剂量组则出现动物听力几乎全部丧失的情况。由形态学观察89-07组豚鼠耳蜗切片中毛细胞没有任何变化，螺旋神经节正常;即使是100mg/Kg/day大剂量组，柯替氏器也完全正常，在本实验的剂量范围内，未观察到89-07的耳蜗毒性。而GM，AMK各组均显示出耳蜗毒性，中、小剂量组已可观察到毛细胞散在性或灶状坏死，大剂量组则发现柯替氏器毛细胞大量坏死，严重时还可波及支持细胞与神经节细胞。故认为89-07的耳蜗毒性极小而GM及AMK对耳蜗的损伤较明显。

（2）前庭毒性：三种药物与对照组相比较均显示一定差异。89-07组仅在大剂量时出现眼震抑制率增高现象，形态学观察大剂量89-07组出现对椭圆束斑与壶腹嵴的位觉毛粘连，但胶质膜完好;而GM和AMK均能引起动物前庭机能损伤和形态破坏，扫描电镜观察，两者大剂量组椭圆束斑中央部的胶质膜与位觉毛消失，残留的少量位觉毛毛束粘连，耳石较小或境界不清，球束斑上皮位觉毛残缺或消失。故认为89-07与GM，AMK相比，89-07的前庭毒性程度要低得多，属低水平;AMK稍大些，GM的前庭毒性最为严重。

综合以上情况，认为89-07的耳毒性极低，在本实验中几乎没有观察到耳蜗毒性，虽有轻度的前庭毒性，但也远低于GM和AMK。

4.89-07肾毒性的研究

新药89-07属氨基糖苷类化合物，肾是毒性靶器官之一。为此在进行89-07毒理研究时，又专门比较大鼠肌注89-07，丁胺卡那和庆大霉素的肾毒性比较。试验中选择了评价肾毒性作用常用的6项尿液指标和2项血液生化指标，结合肾脏的病理形态学观察，以比较三者的肾毒作用。

各试验组动物随着给药时间的延长和剂量的增加，出现异常的指标也相应增多，病理变化也逐渐加重。自给药第七天开始，庆大霉素150MKD，100MKD组，中毒死亡的动物逐渐增加，89-07和丁胺卡那霉素各剂量组均未出现死亡。因此，三个药物的肾毒作用，可比性较强的是低剂量，即50MKD组。

50MKD组给药5-15天，庆大霉素组的异常指标由3项（u-LDH，u-pr和BUN）增至6项（u-GOT，u-LDH，u-pr，u-su，BUN，Scr）。肾小管上皮细胞也由给药5天的单个散在性的坏死发展到多数动物的肾脏大片状和广泛性的严重坏死。而89-07和丁胺卡那组动物在此期间仅出现个别指标统计学上的异常或略有升高的趋势，病理形态学上也仅由给药5天的轻微变性发展到单个散在性的细胞坏死。因此，从功能和形态学上的比较，89-07的肾毒作用明显比庆大霉素轻，与丁胺卡那无明显差异。

致突变试验研究：

1.Ams's试验，结果为阴性。

2.小鼠微核试验的研究，结论是：89-07小鼠骨髓多染红细胞微核试验结果为阴性。

3.89-07体外对CHL细胞染色体畸变的影响研究，研究结果为阴性。

上述三个结果均表明89-07无致突变作用。因89-07系抗生素类药物，在Ams's试验中平皿加药量还达不到5mg/皿，故2，3试验作为一重要的验证。

生殖毒性试验研究：

89-07对SD孕大鼠的胚胎胎仔毒性和致畸性（二段试验），研究结果表明89-07是不具有胚胎毒性药物。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物系广谱抗生素，对庆大霉素耐药菌有较好的作用，而且耳、肾毒性低，因此适合于对本品敏感的绿脓杆菌、变形杆菌、沙雷氏菌属等引起的感染以及对庆大霉素、卡那霉素（KM）、甲氧西林、丁胺卡那霉素等多种药物耐药的大肠杆菌、克雷伯氏菌属、大肠杆菌属、葡萄球菌属引起的感染如败血症、支气管炎、支气管扩张症、肺炎、腹膜炎、肾盂肾炎、膀胱炎等症，此外还适用于对青霉素过敏的患者作为优良的治疗剂，特别对儿童和老年使用本发明的抗生素比用GM、KM和AMK更安全可靠。对耐GM、KM、AMK、甲氧西林的耐药菌感染可以作为首选药物，与AMK无交叉耐药、故可用于治疗对AMK耐药的细菌感染。因而，本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物是较好的新的半合成抗生素。

本发明的另一个目的是提供上述1-N-乙基庆大霉素衍生物的制备方法。该方法包括从庆大霉素C_1a单组份菌种棘孢小单孢菌JIM-202突变株制得庆大霉素C_1a母核，再通过半合成方法在其1-N位置上引入乙基而制得本发明的1N-乙基庆大霉素衍生物。

本发明的制备方法具体叙述如下：

一.制备庆大霉素C_1a母核：

1.菌种诱变产生JIM-202突变株：

棘孢小单孢菌JIM-401（M.echinospora JIM-401）为出发菌株以紫外光三分钟，0.5%LiCl半小时处理后单孢子悬浮液涂布于含小诺霉素粗品（2000u/ml）的平板上，37℃培养14天后挑取单个菌落，经筛选得到JIM202，然后斜面培养后制成沙土（或冷冻管）保藏。

经提取精制得到的JIM-202硫酸盐的核磁共振谱分析采用JIM-FX90Q型核磁共振波谱仪（D₂O）;红外光谱的分析采用577型红外分光光度计（KBr压片）;紫外光谱测定采用554型紫外分光光度计（H₂O）质谱的测定采用JIMS-D300型色-质联用仪（EI）。

注：色谱标用链霉菌鉴定手册中色谱。

对JIM-202菌株进行的全细胞水解物氨基酸分析表明其含有甘氨酸和meso-DAP。

薄层层析：

JIM-202菌株发酵产物在硅胶G薄层层析上主要呈现一个斑点，其Rf值与GMC_1a相同（图6）。

UV、IR、NMR和Ms：

见图7、8、9、10。

从图7可知该抗生素无紫外吸收峰符合于氨基糖苷类抗生素特性，在IR中该抗生素显示了典型的氨基糖苷类抗生素特性，该抗生素的NMR各质子信号见图标示，与文献GMC_1a完全一致;该抗生素Ms各分子离子碎片峰与文献值一致，其（M+1）峰为450（即分子量为449）与庆大霉素C_1a分子量相同，因此从UV、IR、NMR、Ms等四大谱解析可知该抗生素与庆大霉素C_1a同质。

本发明人在对棘孢小单孢菌突变型菌株JIM-401进行诱变育种时，得到了一株JIM-202突变株，由突变株产生了一个单组份的抗生素GMC_1a，效价可达800u/ml。因而，本发明提供了从改变遗传学途径办法产生GMC_1a的方法。

日本公开特许公报（昭和54-160795）曾报道将SIM通过微生物转化的方法使其产生GMC_1a。但至今为止，尚未发现从菌种选育一改变遗传学途径的办法得到阻断型的突变株产生GMC_1a或SIM，也没有发现报告由小单孢菌产生单一的GMC_1a的方法。

本发明人用上述方法得到的GMC_1a菌株生产能力较强，能直接应用于生产，从而为庆大霉素C_1a的衍生物提供了母核制备。

2.母核庆大霉素C_1a（GMC_1a）的制备

庆大霉素C_1a单组份菌种棘孢小单孢菌JIM-202^＃突变株;（发酵效价800u/ml左右，GMC_1a组份85%以上）经三级发酵得GMC_1a发酵液，经离子交换提取后，精制得到含量为90～95%GMC_1a供半合成用。

工艺流程：

JIM202#沙土孢子 (孢子培养)/(35℃ 9天) 斜面孢子 (摇瓶培养)/(35℃ 2天) 摇瓶菌丝

(种子培养)/() 一级种子罐 (35℃±1℃)/(48小时) 二级繁殖罐 (35℃±1℃)/(42小时)

三级发酵罐 (35～32℃)/(126小时) 放罐 (酸化)/(PH2～3) 酸化液 (中和)/(PH6.8)

732树脂吸附 ( )/() 上柱 (去Ca⁺⁺,Mg⁺⁺,Cl^-)/() 饱和树脂

(4.5%氨水解析)/() 解析液 (711树脂脱色)/() 脱色液 (薄膜浓缩)/() 浓缩液

(柱层析)/(精制) 得到组份为90％以上庆大霉素C_1a.

培养基：

孢子斜面培养基：（%）

可溶性淀粉1.0 氯化钠0.05

KNO₃0.1 CaCO₃0.1

K₂HPO₄0.03 麸皮1.7～1.8

MgSO₄0.05 琼脂1.8～2.0

种子培养基（%）

淀粉1.0 玉米粉1.5

黄豆饼粉1.0 葡萄糖0.5

蛋白胨0.2 硝酸钾0.05

碳酸钙0.5 豆油0.15

二级繁殖培养基（%）

淀粉2 蛋白胨0.1

黄豆饼粉1.5 CoCl₂4r/ml

玉米粉1.5 豆油0.2

发酵培养基（%）

淀粉4 葡萄糖0.5

玉米粉1.5 黄豆饼粉3.5

蛋白胨0.2 鱼粉0.5

硝酸钾0.01 碳酸钙0.5

硫酸铵0.05 泡敌适量

在小诺霉素生产时，其分离工段分离小诺霉素时可得一定纯度的GMC_1a取纯度较高的GMC_1a也可直接供半合成用。

1-N-乙基庆大霉素衍生物的合成

工艺路线

GMC₁＝ (醋酸钴.乙酐)/(溶剂中^〔1〕) 3，2’，6’一三一N一乙酰基GMC_1a(pl)

(提取浓缩)/(通H₂S除Co⁺⁺;分离) P₁（纯度90～95％） (乙醛)/(还原剂^〔2〕氢化) 3，2’，6’－

0－5℃冰水浴

三－N－乙酰基－1－N－乙基GMC_1a（P₂）经吸附型大孔树脂分离后

得纯度较高P₂(1N NaOH)/(水解回流48hr) 水解液 (吸附型大孔树脂分离)/()

得含量在90％以上的1－N－乙基庆大霉素 ( )/() 成盐 (碳脱色)/()

冷冻干燥（或乙醇沉淀）即得1－N－乙基庆大霉素C_1a盐。

注：[1]非质子极性的有机熔剂如二甲基甲酰胺，二甲亚砜等

[2]为还原剂LiAlH₄，吗啉甲硼烷，氰基硼氢化合物。

反应式如下：

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物系碱性水溶性抗生素，在临床使用时可制备成易溶于水的无机酸盐如盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐硫酸盐等，或是有机酸盐如马来酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、草酸盐等，其中常用硫酸盐。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物可以制备成药用制剂，以口服或非肠胃道的途径给药，如片剂、水针剂、粉针剂、眼药水、油膏、气雾剂等。

本发明的又一目的是公开了1-N-乙基庆大霉素衍生物的药用制剂的制备方法。具体的方法是将1-N-乙基庆大霉素衍生物的盐作为活性成份与药物上可应用的载体如缓冲剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂、表面活性剂、防腐剂、甜味剂、等渗剂等，以重量比为活性成份占0.01～99.99%与药用载体占99.99%～0.01%的比例配制而成。

上述药用载体中的润滑剂有缓冲剂为磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂等，崩解剂为淀粉、羧甲基淀粉钠等，甜味剂为果糖、麦芽糖醇、木糖醇等，粘合剂为淀粉浆、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶等，防腐剂为苯酚（石碳酸）、尼泊金甲酯（对羟基苯甲酸甲酯）、苯甲醇等，等渗剂为氯化钠、氯化钾、葡萄糖等，赋形剂为右旋糖酐（低分子量）、蔗糖等，表面活性剂为吐温80，润滑剂为白凡士林、聚甘油硬脂酸酯、液体石腊等，气雾剂为内抛射剂，氟氯烷类：如氟里昂;卤代烷类：如氯乙烯、氯化甲烯等;非卤素烷类：如丙烷，丁烷，二甲醚等;压缩气体抛射剂：如氮、氦、氛、CD₂，NO等惰性气体等。

本发明的1-N-乙基庆大霉素衍生物系广谱抗生素，对GM耐药菌有较好的作用，且耳、肾毒性低，因此适合于对本品敏感的绿脓杆菌，变形杆菌，沙雷氏菌属等引起的下列感染以及对GM、KM、甲氧西林AMK等多种药物耐药的大肠杆菌，克雷伯氏菌属，大肠杆菌属，葡萄球菌属引起的下列感染：败血症，支气管炎，支气管扩张症，肺炎，腹膜炎，肾盂肾炎，膀胱炎等症，此外还适用于对青霉素过敏的患者作为优良的治疗剂，特别对儿童和老年，使用本品比用GM，KM和AMK更安全可靠。对耐GM，KM，MCR，甲氧西林的耐药菌感染可以作为首选药物，与AMK无交叉耐药，故可用于治疗对AMK耐药的细菌感染。该新药的问世无疑给社会带来福音。

以爱大霉素为例按100mg/支为5.00元/支计，年产1000年十亿原料药，针剂每年可获得税利2500万元，故经济效益可观。

实施例1：制备硫酸庆大霉素C_1a

将JIM-202菌种孢子悬浮液接种于内含100ml种子培养基的500ml种子瓶中，在35℃±0.5℃，摇床培养40小时（220rpm），取5只种子瓶的种子液接种于10L发酵培养基内，通气（1vvm），搅拌，35℃±0.5℃培养120小时，其间补水以补充水分的挥发，得到含GMGa的发酵液9.5L，用草酸调PH至3，加热至70℃，维持10分钟后，用6N NaOH回调PH至6.8，过滤，滤液用120ml 732（NH⁺ ₄）树脂柱吸附，水洗后用2N NH₃H₂O解析，解析液先用120ml 711（OH^-）树脂柱脱色后减压浓缩至60ml，用6NH₂SO₄调PH至5.0，加入5g活性炭，60℃保温30分钟，过滤，滤液冷冻干燥得9g GM_1a硫酸盐，其纯度93%。

实施例2：制备庆大霉素C_1a

将JIM-202菌种孢子悬浮液接种于100L种子培养基中，在35℃±0.5℃通气（1.2vvm），搅拌190rpm）下培养40小时后移种于2000L种子培养基内繁殖、培养条件同上，24小时后接入6500L发酵培养基中，开始通气0.5vvm，6小时后通气1.0vvm，84℃±0.50℃搅拌（90rpm）培养140小时，其间在24小时和60小时时补料1500L，在84小时时补水1000L。最后得到含GMC_1a的培养液9000L。用草酸或硫酸或盐酸调PH2.5，加热至70℃，维持10分钟用6N氢氧化钠回调PH至6.8，加入120 L732（NH⁺ ₄）树脂搅拌吸附5小时。筛出树脂并经漂洗后装柱，水洗后用2N NH₃·H₂O解析，解析液经120升711（OH^-）柱脱色后减压浓缩至80L，用450 LYPR-Ⅱ树脂柱（40×400cm）吸附，经水洗后用20%乙醇水溶液解析，含GMC_1a组分的解析液减压浓缩至80L，冻干得7000gGMC_1a粉。其纯度90%。

实施例3：制备爱大霉素硫酸盐

在室温下，将10g GMC_1a冻干粉在搅拌下溶解于40ml水中，加入360ml二甲基甲酰胺，再加入20g CaAc₂·4H₂O并溶解。搅拌1小时，滴加56ml新鲜配制的M乙酐四氢呋喃溶液。速度1ml/min，滴加完后继续搅拌1小时，反应结束。反应液加一倍水混合，通入500ml 732（H⁺）树脂柱吸附。水洗后用2N NH₃·H₂O解析。解析液减压浓缩后用YPR-Ⅱ树脂柱（40×500mm）纯化。用6%-30%的乙醇浓度梯度洗脱，收集10%-15%乙醇浓度的洗脱液，合并浓缩后冻干得9.5g 3，2'，6'-三乙酰GMC_1a。

上述产物的冻干品溶解于300ml水中，用6N H₂SO₄调PH5，自然冷却后，用冰浴冷至3℃，用1N HCl调PH至2.5，加6ml 40%乙醛-四氢呋喃（1∶1）溶液。搅拌下滴加5%硼氢化钠水溶液至PH4.0，搅拌1小时后重复上述操作至转化完全（硅胶TLC分析，溶媒系统，氯仿∶甲醇∶28%氨水∶2∶1∶1）。反应液减压浓缩后用400ml YPR-Ⅱ树脂柱纯化，乙醇浓度梯度洗脱，收集15-20%乙醇浓度的洗脱液并浓缩50ml，浓缩液用6N氢氧化钠调整至1N氢氧化钠浓度，于100℃水解48小时，冷却并稀释至1000ml，用160ml732（H⁺）树脂搅拌吸附2小时，装柱，水洗后用2N氨水解析。解析液减压浓缩后用YPR-Ⅱ树脂柱（30×300mm）纯化，乙醇浓度梯度洗脱，合并90%以上纯度的爱大霉素的洗脱液并经减压浓缩后用6N H₂SO₄调PH6.0，加1.5g活性炭，60℃搅拌保温30'，过滤，滤液冻干得3.0g爱大霉素硫酸盐粉，重量收率30%。

实施例4：制备爱大霉素硫酸盐

在室温下将100g GMC_1a冻干粉400ml水中，加入3600ml二甲基亚砜，加150g CoAc₂·4H₂O，搅拌溶解后，滴加560ml新鲜酸制的M乙酐的四氢呋喃溶液，速度3ml/min，加完后继续搅拌1小时，反应结束。反应液加一倍水，混匀，用2NHCl调PH2.5，用5000ml 732（NH⁺ ₄）柱吸附，水洗后用2N NH₃·H₂O解析。解析液经减压浓缩后用6N H₂SO₄调PH5.0，自然冷却后用冰浴冷至3℃，2NHCl调PH2.5，加80ml 40%乙醛-四氢呋喃（1∶1）溶液，搅拌下滴加5%硼氢化钠水溶液至PH4.0，搅拌1小时后，重复上述操作至转化完全，反应液经减压浓缩至1000ml，用YPR-Ⅱ树脂柱（85×900mm）纯化，乙醇浓度梯度洗脱，收集15-20%乙醇浓度的洗脱液并减压浓缩至500ml后，用6N HaOH调整溶液至1N NaOH浓度于100℃下水解48小时。冷却并稀释后用1000ml 732（H⁺）树脂搅拌下吸附。吸附树脂装柱，水洗后用2N NH₃·H₂O解析，解析液经减压浓缩后用YPR-Ⅱ树脂柱（65×650mm）纯化，乙醇浓度梯度洗脱，收集爱大霉素90%以上纯度的洗脱液并经减压浓缩后用6N H₂SO₄调PH5.0，加20g活性炭60℃搅拌保温30分钟，后过滤，滤液冻干得45g爱大霉素硫酸盐，重量收率45%。

实施例5：制备硫酸爱大霉素水针剂

硫酸爱大霉素或其溶于水的盐均可制成水针剂供临床使用，配方如下：

硫酸爱大霉素 50g

无水亚硫酸钠 2g

注射用水加至 1L

PH 5.0～7.0

工艺：称取主辅料，溶于配液量80%注射用水中，调整PH加活性炭适量，加水至全量，去炭后微孔滤膜、精滤至净，充氮、灌封灭菌即得。

上述配方中还可加入焦亚硫酸钠（抗氧剂）和少量对羟基苯甲酸甲酯（1.3mg/50mg（效价）/支），对羟基苯甲酸丙酯（0.2mg/50mg/支）作为防腐剂。

规格：50mg（效价）/1ml;75mg（效价）/1.5ml及100mg（效价）/2ml。

实施例6：制备硫酸爱大霉素粉针剂 5万单位/支

爱大霉素硫酸盐 5万单位/支

NaCl（注射用） 9mg/支

低分子右旋糖酐 7mg/支

焦亚硫酸钠（分析纯） 3mg/支

注射用水加至 0.5ml/支

工艺：取占体积70%的新鲜灭菌注射用水，加入焦亚硫酸钠（分析纯），氯化钠，爱大霉素硫酸盐原料，使其溶解后加入低分子右旋糖酐液，最后用灭菌注射用水加至全量，测药液PH，用0.22um微孔滤膜两次无菌过滤后，灌装每支0.5～0.54ml，冻干封口、检漏、灯检、印色。

实施例7：制备爱大霉素片剂（包括缓释剂型，肠溶剂型）10万单位/片

配方Ⅰ硫酸爱大霉素 10Kg

蔗糖粉 12.4Kg

CaCO₃6.8Kg

淀粉 5Kg

枸橼酸 0.3Kg

乙醇（70%）约8L

硬脂酸镁 0.4Kg/10万片

配方Ⅱ硫酸爱大霉素 50Kg

糊精 4.7Kg

20%淀粉浆适量

搅拌透后立即制片（16目），颗粒65℃烘干14目整粒，压片前加1%硬脂酸镁。

适应症，用于细菌性痢疾，肠炎，腹泻。

实施例8：制备爱大霉素眼药水

配方：硫酸爱大霉素 5000单位（效价）

NaCl 8.0g

焦亚硫酸钠 2g

蒸馏水适量/制成1000ml

工艺：准确按处方称取NaCl焦亚硫酸钠，用适量蒸馏水溶解后加入硫酸爱大霉素搅拌溶解用0.5NaOH调PH至7.0左右，补加蒸馏水至1000ml过滤，过澄明，灌装于已处理合格的滴眼瓶中，盖腹塞及铝盖，压盖，100℃流通空气灭菌30分钟，澄明后检查，印标鉴，包装，成品检验合格。

适应症：细菌性结膜炎，红眼病等。

实施例9：制备爱大霉素搽剂

配方：硫酸爱大霉素 1.6克

液体石蜡 3.3克

凡士林适量

全量 100克

工艺：硫酸爱大霉素与液体石醋混合后加入凡士林再混合均匀后即可。

适应症：脓疱疮、糜烂疮伤，烫伤，烧伤及其它细菌性皮肤感染。

实施例10：制备爱大霉素气雾剂

配方：硫酸爱大霉素 10mg（效价）

乙醇 4.5mg

二氟二氯甲烷适量

每罐 5ml

适应症：细菌性感染气管炎和重症扁桃腺发炎及喉炎等

实施例11：制备爱大霉素软膏剂乳剂型基质实例：

1.水包油型（油/水）基质

处方：硫酸爱大霉素 1.6g

乳化蜡 30g

白凡士林 50g

液体石蜡 20g

2.油包水型基质：

处方：硫酸爱大霉素 1.6g

聚甘油硬脂酸酯Ⅲ 6g

凡士林 96.8g

3.水溶性基质：

处方：硫酸爱大霉素 1.6g

明胶 3g

甘油 30g

水适量

全量100g

Claims

1、一种半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物，其特征以下式表示：

R₁R₂

[1]1-N-乙基庆大霉素C₁CH₃CH₃

[2]1-N-乙基庆大霉素C₂， CH₃H

[3]1-N-乙基庆大霉素C_1a(爱大霉素) H H

[4]1-N乙基庆大霉素C_2b(乙基小诺霉素) H CH₃

式中R₁和R₂可以相同或不同，它们可以分别为氢原子或-CH₃基。

2、一种如权利要求1所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物和其盐的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

（1）制备庆大霉素C_1a母核

A.菌种诱变产生JIM-202突变株

B.母核庆大霉素C_1a的制备

工艺流程：

732树脂吸附 ( )/() 上柱 (去Ca⁺⁺,Mg⁺⁺,Cl^-)/() 饱和树脂

(柱层析)/(精制) 得到组份为90％以上庆大霉素C_1a.

（2）1-N-乙基庆大霉素衍生物和其盐的制备

GMC₁＝ (醋酸钴.乙酐)/(溶剂中) 3，2’，6’一三一N一乙酰基GMC_1a(pl)

(提取浓缩)/(通H₂S除Co⁺⁺;分离) P₁（纯度90～95％） (乙醛)/(还原剂氢化) 3，2’，6’－

0－5℃冰水浴

冷冻干燥（或乙醇沉淀）即得1－N－乙基庆大霉素C_1a盐。

3、一种如权利要求1所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其特征在于将1-N-乙基庆大霉素衍生物盐作为活性成份与药物上可应用的载体缓冲剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂、表面活性剂、防腐剂、甜味剂、等渗剂或气雾剂等，以重量比为活性成份占0.01～99.99%与药用载体占99.99～0.01%的比例配制而成。

4、根据权利要求2所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物和盐的制备方法，其中所述的盐为盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐等无机酸盐及马来酸盐、乳酸盐、洒石酸盐、柠檬酸盐、苯果酸盐、草酸盐等有机酸盐。

5、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的药用制剂为片剂、水针剂、粉针剂、眼药水、油膏、气雾剂和软膏剂。

6、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的润滑剂为白凡士林、聚甘油硬脂酸酯、液体石腊。

7、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的崩解剂为淀粉、羧甲基、纤维素钠。

8、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的粘合剂为淀粉浆、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶。

9、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的表面活性剂为吐温80。

10、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的防腐剂为苯酚（石碳酸）、尼泊金甲酯（对羟基苯甲酸甲酯）、苯甲醇。

11、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的甜味剂为果糖、麦芽糖醇、木糖醇。

12、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的等渗剂为氯化钠、氯化钾、葡萄糖。

13、根据权利要求3所述的半合成抗生素1-N-乙基庆大霉素衍生物药用制剂的制备方法，其中所述的气剂为氟氯烷、非卤素烷及氮、氦、氛、CD₂、NO等惰性气体。