CN103665069B - 一种氨基糖苷类化合物及其提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氨基糖苷类化合物及其提取分离方法，该化合物是从硫酸依替米星粗品中分离得到的，具有如下的化学结构，本发明还涉及该氨基糖苷类化合物的分离方法。

Description

一种氨基糖苷类化合物及其提取分离方法

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别涉及一种新的氨基糖苷类化合物及其提取分离方法。

背景技术

氨基糖苷类化合物（Aminoglycosides）是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类。有来自链霉菌的链霉素等、来自小单孢菌的庆大霉素等天然氨基糖苷类，还有依替米星等半合成氨基糖苷类，均属广谱抗生素。

氨基糖苷类抗生素对于细菌的作用主要是抑制细菌蛋白质的合成，作用点在细胞30S核糖体亚单位的16SrRNA解码区的A部位。研究表明，此类药物可影响细菌蛋白质合成的全过程，妨碍初始复合物的合成，诱导细菌合成错误蛋白以及阻抑已合成蛋白的释放，从而导致细菌死亡。

氨基糖苷类抗生素主要用于敏感需氧革兰阴性杆菌所致的全身感染。虽然近年来有多种cephalosporins和quinolones药物在临床广泛应用，但由于氨基糖苷类抗生素对铜绿假单胞菌、肺炎杆菌、大肠杆菌等常见革兰阴性杆菌的PAE较长，所以，仍然被用于治疗需氧革兰阴性杆菌所致的严重感染，如脑膜炎、呼吸道、泌尿道、皮肤软组织、胃肠道、烧伤、创伤及骨关节感染等。

硫酸依替米星(Etimicinsulfate)是我国科研人员自行研制的，拥有自主知识产权的高效、低毒、抗耐药菌的新一代半合成氨基糖苷类抗生素，是唯一获得国家一类新药证书的抗感染药物。

硫酸依替米星注射液适用于对其敏感的大肠杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、沙雷氏杆菌属、枸橼酸杆菌、肠杆菌属、不动杆菌属、变形杆菌属、嗜血流感杆菌、绿脓杆菌和葡萄球菌等引起的各种感染。临床研究显示本品对以下感染有较好的疗效：呼吸道感染：如急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、社区肺部感染等。肾脏和泌尿生殖系统感染：如急性肾盂肾炎、膀胱炎、慢性肾盂肾炎或慢性膀胱炎急性发作等。皮肤软组织和其它感染：如皮肤及软组织感染，外伤、创伤和手术产后的感染及其他敏感菌感染。

硫酸依替米星的制备方法描述在中国专利93112412.3中，其主要步骤为：通过发酵制备庆大霉素C1a，进一步制备3，2，6，-三-N-乙酰基庆大霉素C1a（P1），和3，2，，6，-三-N-乙酰基-1-N乙基庆大霉素C1a（P2），最终获得1-N-乙基庆大霉素C1a（依替米星），由于该方法通过发酵获得的庆大霉素C1a含有杂质，进一步制备得到的硫酸依替米星中也含有多种杂质，目前对这些杂质研究的不多，本发明对有关杂质进行了研究，意外的发现一种活性和毒性都优于依替米星的一种新的化合物，经体外抗菌试验发现，该化合物在常规浓度下即可有效杀灭大肠埃希菌、克雷伯氏肺炎杆菌、沙雷氏杆菌属、枸橡酸杆菌、肠杆菌属、不动杆菌属、变形杆菌属、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌和葡萄球菌等。

发明内容

本发明之目的在于对氨基糖苷类化合物进行深入研究，以其寻找MRSA对其敏感，耳肾毒性低的新氨基糖苷类抗生素。

本发明提供一种结构式如下的化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的式（I）化合物可形成药学上可接受的无毒盐。这些盐包括与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸等的盐，与有机羧酸如乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、草酸、琥珀酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、扁桃酸、抗坏血酸或苹果酸的盐，或与磺酸如甲磺酸、对甲苯磺酸等的盐，以及与普通已知的其它酸的盐。可按常规转化方法制备这些酸加成盐。

本发明的式（I）化合物可以采用如下的制备方法制备：

取用中国专利93112412.3实施例1-3的方法制备的硫酸依替米星粗品，加水溶解，上样于HD-2弱酸性阳离子交换树脂柱，分别用水，氨水梯度洗脱，TLC检识(展开剂：氯仿-甲醇-氨水，1﹕1﹕1，取用下层液)，合并流份，得到杂质富集流份。分别将杂质富集流份经反复用硅胶柱层析分离（氯仿﹕甲醇﹕氨水（3﹕1﹕1，取用下层液）和制备液相纯化，得到本发明的式（I）化合物。

经核磁共振波谱解析，本发明的式（I）化合物的1H,13C-NMR数据如下表。

本发明的式（I）化合物的¹H,¹³CNMR数据

在¹H-NMR谱中，δ_H5.35(1H,d,J=3.6Hz,H-1″),4.98(1H,d,J=3.8Hz,H-1′)分别为糖的端基氢，提示本发明的式（I）化合物中含有两个糖。δ_H2.57(3H,s,H-7′,H-7″)为氨基上的取代甲基质子信号，提示该化合物含两个氨甲基，δ_H1.23(3H,s,H-6′)则为一个连在季碳上的甲基质子信号。

在¹³C-NMR谱中，显示δ_C102.0(C-1′),103.8(C-1″)为糖的端基碳信号，提示化合物结构中含有两个糖；与文献庆大霉素(GentamicinC1a)的碳谱数据比较，δ_C102.0(C-1′)，71.7(C-2′)，66.0(C-3′)，74.7(C-4′)，70.5(C-5′)，24.1(C-6′)，39.2(C-7′)，表示了C环古洛糖胺片段碳信号，δ_C103.8(C-1″)，52.0(C-2″)，27.6(C-3″)，29.9(C-4″)，68.8(C-5″)，56.1(C-6″)，显示了A环绛红糖胺片段碳信号，δ_C59.6(C-1)，34.5(C-2)，52.0(C-3)，88.3(C-4)，77.4(C-5)，87.1(C-6)则为B环碳信号。与文献中数据进一步比较发现多出一组δ_C42.9(C-7)，16.1(C-8)，可能为连在氨基上的乙基碳信号，δ_C36.5(C-7″)，可能为连在氨基上的甲基碳信号。此外，B环1位碳信号向低场位移8ppm，2位和6位分别向高场位移2ppm和1ppm，说明乙基取代在1位氨基上。A环上5″位碳信号向高场位移3ppm，6″位向低场位移10ppm，说明甲基取代在6″位氨基上，其余数据基本一致。

质谱解析（ESI-MS）：

ESI-MSⁿ的测定数据及解析结果：

ESI-MS：m/z492.3[M+H]⁺；

ESI-MS²（492.3）：m/z492,475,350,191.

结论：综合以上¹H，¹³C-NMR和ESI-MSn解析，确证化合物结构为1-N-乙基庆大霉素C2b，为一新化合物，化合物信息如下：

中文名：1-N-乙基庆大霉素C2b

英文名：1-N-EthylgentamicinC2b

化学名：O-3-deoxy-4-C-methyl-1-(ethylamino)-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-O-[2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-α-D-erythro-hexopyranosyl-(1→4)]-2-deoxy-N3-ethyl-D-Streptamine

分子式：C₂₂H₄₅N₅O₇

分子量：491

本发明还提供含有如上所定义的化合物，或其药效学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物。药物组合物含有的本发明化合物在组合物中的重量比为0.01-99.9%，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.01-99.9%。药物组合物以适合药用的制剂形式存在。药用的制剂为片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、气雾剂、滴剂、贴剂。

本发明的药物组合物，作为制剂形式，每剂中含有的发明化合物的有效量为0.1mg-1000mg，所述每剂指的是，每一制剂单位，如片剂的每片，胶囊的每粒，也可指每次服用剂量，如每次服用100mg。

本发明的药物组合物在制备成粉剂、片剂、可分散粉剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和软膏形式的固体或半固体药物制剂时，可使用固体载体。可使用的固体载体优选为选自稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、膨胀剂等中的一种或多种物质，或可为包封物质。在粉状制剂中，在载体中含有5%到70%的微粒化活性成分。适宜的固体载体包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低沸点蜡、可可脂等。由于它们易于给药，片剂，粉剂、扁囊剂和胶囊代表最有利的口服固体制剂。

本发明的液体制剂包括溶液、悬液和乳液。例如，非胃肠道给药的注射制剂可为水或水-丙二醇溶液形式，调节其等渗度，pH等使适于活体的生理条件。液体制剂还可制成在聚乙二醇、水溶液中的溶液形式。可通过将活性成分溶解在水中，再加入适量的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂，来制备口服水溶液。可将微粒化的活性成分分散在粘性物质如天然和合成胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它已知悬浮剂中制备适于口服的水悬液。

为了易于给药及剂量均一，将上述药物制剂配制成剂量单位形式是特别有利的。制剂的剂量单位形式指适于作为单一剂量的物理分离单位，每个单位含有产生所期望的治疗效果的计算好的预定量的活性成分。这种剂量单位形式可为包装形式，如片剂、胶囊或装在小管或小瓶中的粉剂，或装在管或瓶中的软膏、凝胶或霜剂。

虽然剂量单位形式中所含活性成分的量可以变化，但一般根据所选择活性成分的效力，调节在1-800mg范围内。

当本发明的式（I）化合物用作治疗细菌感染的药物时，给药剂量可随着病人的需要、欲治疗的感染的严重性、所选化合物等而变化。本领域技术人员可按常规方法确定适于某种情况的优选剂量。一般，开始治疗的量低于活性成分的最佳剂量，然后逐渐增加给药剂量，直到达到最佳治疗效果。为方便起见，总的日剂量可分为几部分，分数次给药。

以下通过实验数据说明本发明的有益效果。

1、抗菌活性实验：

本发明的式（I）化合物和依替米星的抗菌活性试验结果如下：

2、毒性实验：

小鼠和大鼠肌肉注射LD50

和硫酸依替米星相比，本发明的活性更强毒性更低。

3、另外和与之结构相似的其他氨基糖苷类化合物进行了抗菌实验对比，实验如下：

附图说明：

图1：化合物(I)的ESI-MS图谱

图2：化合物(I)的¹H-NMR放大图谱（1.0-3.2ppm）

图3：化合物(I)的¹H-NMR放大图谱（3.2-5.5ppm）

图4：化合物(I)的¹³CNMR放大图谱（10-110ppm）

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

取用现有技术生产的依替米星粗品20克，加40ml纯化水溶解，将水溶液沿柱子内壁缓缓流下，上样于HD-2弱酸性阳离子交换树脂柱，先用纯化水洗脱，再用浓度为1%，1.5%，2%，3%氨水梯度洗脱，TLC检识(展开剂：氯仿-甲醇-氨水，1﹕1﹕1，取用下层液)，合并流份，得到杂质富集流份。分别将杂质富集流份浓缩，冻干，得到10克固体混合物，取100-200目硅胶300克，用硅胶柱层析分离（氯仿﹕甲醇﹕氨水（3﹕1﹕1，取用下层液）和制备液相纯化（以0.2mol/L三氟乙酸水溶液：甲醇=84:16为流动相），将含有目标化合物的流分浓缩，冻干，得到200mg淡黄色固体粉末状产品，质谱和核磁结合确定目标化合物结构。

实施例2，盐酸盐的制备：

取用现有技术生产的依替米星粗品20克，加40ml纯化水溶解，将水溶液沿柱子内壁缓缓流下，上样于HD-2弱酸性阳离子交换树脂柱，先用纯化水洗脱，再用浓度为1%，1.5%，2%，3%氨水梯度洗脱，TLC检识(展开剂：氯仿-甲醇-氨水，1﹕1﹕1，取用下层液)，合并流份，得到杂质富集流份。分别将杂质富集流份浓缩，冻干，得到10克固体混合物，取100-200目硅胶300克，用硅胶柱层析分离（氯仿﹕甲醇﹕氨水（3﹕1﹕1，取用下层液）和制备液相纯化（以0.2mol/L三氟乙酸水溶液：甲醇=84:16为流动相），将含有目标化合物的流分浓缩，冻干，得到200mg淡黄色固体粉末状产品，质谱和核磁结合确定目标化合物结构。取10ml纯化水溶解固体样品，用10mol/L的盐酸调节PH至4.0-5.0，再加入2%-5%的活性炭，60-80℃搅拌脱色30分钟，过滤，滤液冻干，即得该物质的盐酸盐固体。

实施例3，硫酸盐的制备：

取用现有技术生产的依替米星粗品20克，加40ml纯化水溶解，将水溶液沿柱子内壁缓缓流下，上样于HD-2弱酸性阳离子交换树脂柱，先用纯化水洗脱，再用浓度为1%，1.5%，2%，3%氨水梯度洗脱，TLC检识(展开剂：氯仿-甲醇-氨水，1﹕1﹕1，取用下层液)，合并流份，得到杂质富集流份。分别将杂质富集流份浓缩，冻干，得到10克固体混合物，取100-200目硅胶300克，用硅胶柱层析分离（氯仿﹕甲醇﹕氨水（3﹕1﹕1，取用下层液）和制备液相纯化（以0.2mol/L三氟乙酸水溶液：甲醇=84:16为流动相），将含有目标化合物的流分浓缩，冻干，得到200mg淡黄色固体粉末状产品，质谱和核磁结合确定目标化合物结构。取10ml纯化水溶解固体样品，用10mol/L的盐酸调节PH至4.0-5.0，再加入2%-5%的活性炭，60-80℃搅拌脱色30分钟，过滤，滤液冻干，即得该物质的硫酸盐固体实施例4，片剂的制备：

取该物质的硫酸盐固体或盐酸盐固体5到20份，加入5到10份的滑石粉或其他，加入5到10份羧甲基纤维素钠，粉末制粒，压片即得。

实施例5，注射剂的制备：

取该物质的硫酸盐固体或盐酸盐固体，加入10-25倍量的注射用水，加万分之一至千分之五的活性炭，搅拌半小时、过滤，用1ml、2ml、5ml或10ml安瓿瓶灌封、灭菌即得。

Claims (1)

1.所示化合物盐酸盐的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：取用现有技术生产的依替米星粗品20克，加40ml纯化水溶解，将水溶液沿柱子内壁缓缓流下，上样于HD-2弱酸性阳离子交换树脂柱，先用纯化水洗脱，再用浓度为1％，1.5％，2％，3％氨水梯度洗脱，TLC检识，展开剂:氯仿-甲醇-氨水＝1：1：1，取用下层液，合并流份，得到杂质富集流份，分别将杂质富集流份浓缩，冻干，得到10克固体混合物，取100-200目硅胶300克，用硅胶柱层析分离，氯仿:甲醇:氨水＝3：1:1，取用下层液；制备液相纯化，以0.2mol/L三氟乙酸水溶液:甲醇＝84:16为流动相，将含有目标化合物的流分浓缩，冻干，得到200mg淡黄色固体粉末状产品，质谱和核磁结合确定结构，将200mg产品溶解于10ml纯化水中，用10mol/L的盐酸调节pH至4.0-5.0，再加入2％-5％的活性炭，60-80℃搅拌脱色30分钟，过滤，滤液冻干，即得该物质的盐酸盐固体，