KR100353262B1 - 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정 - Google Patents
위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100353262B1 KR100353262B1 KR1020000013074A KR20000013074A KR100353262B1 KR 100353262 B1 KR100353262 B1 KR 100353262B1 KR 1020000013074 A KR1020000013074 A KR 1020000013074A KR 20000013074 A KR20000013074 A KR 20000013074A KR 100353262 B1 KR100353262 B1 KR 100353262B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- extract
- leaflet
- berberine
- pylori
- organic solvent
- Prior art date
Links
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 122
- YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N berberine Chemical compound C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- 229940093265 berberine Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N berberine Natural products COc1ccc2C=C3N(Cc2c1OC)C=Cc4cc5OCOc5cc34 QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 67
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 5
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 title 1
- 241000229722 Perilla <angiosperm> Species 0.000 title 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 51
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 12
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000021995 interleukin-8 production Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000006049 herbal material Substances 0.000 claims abstract description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims description 32
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims description 31
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims description 27
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 21
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 15
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 abstract description 7
- HACSKNCIFXREIE-UHFFFAOYSA-N butanoic acid;ethoxyethane Chemical compound CCOCC.CCCC(O)=O HACSKNCIFXREIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- HTRXGEPDTFSKLI-UHFFFAOYSA-N butanoic acid;ethyl acetate Chemical compound CCCC(O)=O.CCOC(C)=O HTRXGEPDTFSKLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 20
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 15
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 15
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 15
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 206010019375 Helicobacter infections Diseases 0.000 description 11
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 10
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 10
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 10
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 10
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 8
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 8
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 7
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 7
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 7
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 7
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 7
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 4
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 4
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl n'-phenylcarbamimidothioate;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.CCN(CC)CCSC(N)=NC1=CC=CC=C1 XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 238000002768 Kirby-Bauer method Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 3
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 3
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 3
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 3
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 3
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 3
- 238000003929 heteronuclear multiple quantum coherence Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000012584 2D NMR experiment Methods 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001157 Fourier transform infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 2
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 2
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 2
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 2
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 231100000029 gastro-duodenal ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002032 methanolic fraction Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- XQYZDYMELSJDRZ-UHFFFAOYSA-N papaverine Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CC1=NC=CC2=CC(OC)=C(OC)C=C12 XQYZDYMELSJDRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 2
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 description 2
- 239000011675 vitamin B5 Substances 0.000 description 2
- 235000009492 vitamin B5 Nutrition 0.000 description 2
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 2
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 2
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930008281 A03AD01 - Papaverine Natural products 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000006000 Garlic extract Substances 0.000 description 1
- 206010017886 Gastroduodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 240000002045 Guettarda speciosa Species 0.000 description 1
- 235000001287 Guettarda speciosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000590017 Helicobacter felis Species 0.000 description 1
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 description 1
- 235000006964 Perilla frutescens var acuta Nutrition 0.000 description 1
- 240000001979 Perilla frutescens var. acuta Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 240000002657 Thymus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 description 1
- 229930003571 Vitamin B5 Natural products 0.000 description 1
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N Vitamin B6 Natural products CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 244000126002 Ziziphus vulgaris Species 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- -1 and finally Substances 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 230000001914 calming effect Effects 0.000 description 1
- 150000001765 catechin Chemical class 0.000 description 1
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000007905 drug manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002168 ethanoic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 239000000576 food coloring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020706 garlic extract Nutrition 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 235000009569 green tea Nutrition 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 235000021579 juice concentrates Nutrition 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N meoh methanol Chemical compound OC.OC COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 229960001789 papaverine Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229930193017 perilloside Natural products 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001585 thymus vulgaris Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2200/00—Function of food ingredients
- A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
- A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
- A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation, decoction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/37—Extraction at elevated pressure or temperature, e.g. pressurized solvent extraction [PSE], supercritical carbon dioxide extraction or subcritical water extraction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
- A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Non-Alcoholic Beverages (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
본 발명은 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정에 관한 것으로서, 생약소재인 소엽에 대해 약 5∼20배 중량의 물을 첨가한 다음, 90∼98℃에서 6∼15시간 동안 열수추출한 후, 40∼70cmHg로 감압농축하는 열수추출법에 대한 것으로 상기 제조방법으로 제조된 열수추출물은 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성 및 헬리코박터 필로리 우레아제활성 억제효과, 위상피세포 정착성 억제효과, 인터루킨-8 생성억제효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 버베린은 상기 소엽 추출물로부터 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 디에틸 에테르(diethyl ether), 에틸 아세테이트(ethyl acetate)의 유기 용매를 이용하여 얻어진 수용층을 XAD-7, 실리카 칼럼 크로마토그래피(silica column chromatography)를 통해 분획하고, 예비 TLC(Preparative TLC)를 이용하여 분리하여 된 것으로서 상기 소엽 추출물의 주요한 유효성분이 된다.
Description
본 발명은 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 위염, 위궤양의 원인균으로 알려진 헬리코박터 필로리에 대해 항균활성을 갖는 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정에 관한 것이다.
헬리코박터 필로리는 1983년 워렌(Warren)과 마샬(Marshall)에 의해 분리된 이래(Lancet, 1983, 1, 1273-1275) 위염 및 위십이지장 궤양의 원인균으로 밝혀졌으며(J. infect. Dis., 1990, 161, 626-633 ; Am. J. Med., 1991, 91, 566-572), 현재는 위암 발병 인자의 하나로서까지 인정되어 전세계적인 관심과 연구의 대상이 되고 있다. 헬리코박터 필로리(H. pylori)는 위점막 상피 세포간 접합부에 서식하는 그램 음성의 간균으로서 최적 pH는 7.0∼7.4이며 30∼37℃의 미호기적 조건에서 생장하는데 이러한 조건이 충족되지 못하거나 환경의 변화가 생기면 코코이드(coccoid) 형태로의 변화가 관찰된다. 그 병원성 인자로는 가장 대표적인 특징인 강력한 우레아제(urease) 생산능과 위점막층에 대한 부착 및 이동을 가능하게 하는 플라젤라(flagella) 등이 있으며 또한 Vag A, Cag A, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 등을 포함하는 사이토톡신(cytotoxin)이 연구되고 있다.
현재까지는 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 의한 소화기 질환의 예방 및 치료는 3중 화학요법(triple chemotherapy)으로 대표되는 다양한 항생제에 의존하고 있으나 지속적 사용에 의한 내성균의 출현이나 재발병의 위험이 여전히 그 한계로 지적되고 있다. 이를 극복하기 위한 노력으로서 백신(vaccine)의 개발을 위한 면역학적 방법이나 유산균을 이용한 접근(J. Appl. Bacteriol., 1995, 79, 475-479 ; J. Clin. Microbiol., 1989, 27, 2328-2330) 등이 시도되고 있다.
최근에는 다양한 천연물 소재로부터 헬리코박터 필로리(H. pylori)를 억제할 수 있는 활성 성분을 찾기 위한 노력이 지속되고 있다. 오오타(Ohta) 등은 마늘 추출물(garlic extract)로부터 다양한 활성 물질을 분리 보고하였고(Antimicrob. Agents and Chemother., 1999, 43, 1811-1812), 마브(Mabe) 등은 녹차 내의 카테킨(catechin)류 화합물에 대하여 시험관 내(in vitro)에서 뿐만 아니라 생체 내(in vivo) 수준에서 헬리코박터 필로리(H. pylori)억제능을 확인한 바 있다(Antimicrob. Agents and Chemother., 1999, 43, 1788-1791). 이 외에도 백리향(J. Appl. Bacteriol., 1996, 80, 667-672)이나 다양한 후라보노이드(flavonoids)(Arzneim.-Forsch./Drug Res., 1995, 45, 698-700)로부터도 강력한 활성이 보고되고 있다. 특히, 최근에는 한방 소재로부터 활성 식물을 탐색하기 위한 노력이 일본과 한국을 중심으로 활발히 전개되고 있다(J. Trad. Med., 1995, 12, 129-136 ; 新藥の 臨床, 1998, 46, 49-53 ; Biol. Pharm. Bull., 1998, 21, 990-992).
본 발명자들은 위궤양 예방과 치료에 식용과 약용으로 동시에 사용되는 소엽을 사용하고자 하였다. 소엽(Perilla frutescensvar. acuta KUDO)은 차즈기로도 불리며 한방에서는 발한(發汗), 지혈(止血), 진해(鎭咳), 풍질(風疾), 진통(鎭痛), 진정(鎭靜), 이뇨(利尿) 등에 사용해 왔다. 소엽은 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 1년초로서 꽃은 8-9월에 연한 자색으로 핀다. 일본에서는 '시소'('shiso')라 불리우며 향신료 및 식용 색소로서 중요한 위치를 차지하고 있다. 소엽에는 주로 안토시아닌(anthocyanin)이 다량 함유되어 있으며 페릴로사이드(perilloside) 등의 글루코시드(glucoside) 물질이 많이 보고되고 있다(Phytochem., 1994, 37, 543-546 ;Phytochem., 1992, 31, 3265-3267).
이에 본 발명자들은 식용소재인 소엽으로부터 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성, 우레아제 활성 등의 직접적인 제균효과와 위내 정착성, 인터루킨-8 생성억제 등의 효능을 확인하고, 이에 대한 유효성분을 동정하고자 하였다. 또한 소엽추출물과 유효성분을 이용한 위궤양 예방과 치료용 식품과 약품을 제공하고자 하였다.
본 발명의 주요한 목적은 식용소재인 소엽으로부터 위염 및 위십이지장궤양의 원인균인 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대해 항균활성, 우레아제 활성, 위내 정착성, 인터루킨-8 생성억제 등의 효능을 확인하고, 이에 대한 유효성분을 동정하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 부가적인 목적은 소엽추출물의 제조방법과 유효성분을 이용한 위궤양 예방과 치료용 식품과 약품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 소엽 추출물로부터 크로마토그래피를 이용한 버베린의 분리 과정도,
도 2는 버베린의 화학 구조를 나타낸 도면,
도 3은 분리된 활성물질의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면,
도 4는 분리된 활성물질의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면,
도 5는 분리된 활성물질의1H-1H COSY(2D NMR) 스펙트럼을 나타낸 도면,
도 6은 분리된 활성물질의 DEPT(2D NMR) 스펙트럼을 나타낸 도면,
도 7은 분리된 활성물질의 HMQC(2D NMR) 스펙트럼을 나타낸 도면,
도 8은 분리된 활성물질의 HMBC(2D NMR) 스펙트럼을 나타낸 도면,
도 9는 분리된 활성물질의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면,
도 10은 소엽추출물과 버베린의 헬리코박터 필로리 우레아제(H. pyloriurease) 활성억제 효과를 나타낸 도면,
도 11은 세포(Cell) 현탁도 측정에 의한 소엽추출물과 버베린의 헬리코박터 필로리(H. pylori) 증식억제 효과 비교도를 나타낸 도면,
도 12는 헬리코박터 필로리(H. pylori)위상피세포 부착에 대한 소엽추출물의 억제효과를 나타낸 도면,
도 13은 헬리코박터 필로리(H. pylori)감염에 의해 유도 생성되는 IL-8에 대한 소엽추출물의 생성억제 효과를 나타낸 도면,
도 14는 소엽 추출물의 열 안정성을 나타낸 도면,
도 15는 소엽 추출물의 pH 안정성을 나타낸 도면,
도 16은 락토바실러스의 생육에 대한 소엽추출물의 영향을 나타낸 도면,
도 17은 비피도박테리움의 생육에 대한 소엽추출물의 영향을 나타낸 도면,
도 18은 스트렙토코커스 써모필러스의 생육에 대한 소엽추출물의 영향을 나타내는 도면이다.
본 발명자들은 예로부터 한방에서는 발한(發汗), 지혈(止血), 진해(鎭咳), 풍질(風疾), 진통(鎭痛), 진정(鎭靜), 이뇨(利尿) 등에 사용해오면서 식용으로도 사용한 소엽을 열수추출하여, 국내 위궤양 환자로부터 분리한 헬리코박터 필로리(H. pylori)KS 51 균주에 대한 항균활성을 확인하였다. 이 소엽 추출물에 대해 헬리코박터 필로리 우레아제(H. pyloriurease) 활성억제와 위내 정착 억제 효과 그리고 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 의한 위염발생 기작에 관여하는 인터루킨-8의 생성억제 효과를 확인하였다. 또한 소엽으로부터 컬럼 크로마토그래피(XAD-7, 실리카, 세파덱스 LH-20)와 박막 크로마토그래피를 실시하여 그 유효성분으로 버베린(Berberine)을 분리, 동정하였다.본 발명은 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성 및 헬리코박터 필로리 우레아제활성 억제효과, 위상피세포 정착성 억제효과, 인터루킨-8 생성억제효과를 갖도록 생약소재인 소엽을 열수추출하고 농축하여 제조한 열수추출법으로 위궤양 예방 및 치료효과를 갖는 소엽 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.상기 열수추출물은 상기 소엽에 일정량의 물을 첨가하고, 고온하에서 일정시간 열수추출한 후에 그 여액을 감압농축하여 제조된다. 바람직하게는 소엽에 첨가되는 물의 양은 소엽의 중량에 대해 약 5∼20배 첨가되고, 90∼98℃에서 6∼15시간동안 열수추출되고, 40∼70cmHg로 감압농축하여 제조된다.상기의 방법에 의해서 제조된 소엽추출물(열수 추출액)을 유효성분으로 함유하여 발효유나 음료 및 제조될 수 있다. 또한, 상기의 방법에 의해서 제조된 소엽추출물을 유효성분으로 함유하고, 여기에 약제학적으로 허용되는 부형제 및 보조제를 혼합하여 약제학적으로 허용되는 방법으로 제형화하여 약학 제제가 제조될 수 있다.
소엽 추출물(특히, 열수추출물) 제조 열수추출물은 소엽에 일정량의 물을 첨가하고, 고온하에서 일정시간 열수추출한 후에 그 여액을 감압농축하여 제조된다. 바람직하게는 소엽에 첨가되는 물의 양은 소엽의 중량에 대해 약 5∼20배 첨가되고, 90∼98℃에서 6∼15시간동안 열수추출되고, 40∼70cmHg로 감압농축하여 제조된다.
본 발명의 실시예 1에서는 소엽 150g을 가열 순환식 추출탱크에 넣고 물 1350ml을 가하여 85℃, 95℃, 98℃, 100℃, 105℃, 110℃로 하여 6~15시간 동안 추출하여 조추출액을 얻었다. 상기 조추출액을 149㎛의 여과포로 여과하고 40∼70cmHg로 감압농축하여 65brix°의 소엽 농축액 37g을 얻었다. (실시예 1 참조)
소엽 용매추출물 제조
용매추출물은 소엽에 일정량의 에탄올을 첨가하고, 고온하에서 일정시간 추출한 후에 그 여액을 감압농축하여 제조된다. 바람직하게는 에탄올은 소엽 중량에 대해 약 5∼20배 첨가되고, 50∼90℃에서 4∼8시간동안 추출하고 40∼70cmHg로 감압 농축하여 제조된다.본 발명의 실시예 2에서는 소엽 1kg을 가열순환식 추출탱크에 넣고 50∼70% 에탄올 10kg을 가하여 55∼85℃에서 4∼15시간동안 추출한 후, 149㎛ 크기의 여과포로 여과하고 40∼70cmHg로 감압농축하여 고형분이 0.1∼20 %인 추출액을 얻었다. 여기에 덱스트린 등의 부용제를 혼합하여 농축도가 10∼70 brix°인 소엽 용매 추출물을 얻었다. (실시예 2 참조)
소엽으로부터 버베린의 분리
소엽으로부터 버베린을 분리하기 위해서는 소엽 추출물에 증류수(물)과 유기용매를 가하여 혼합한 후, 유기 용매층을 제거한 후 수용층을 XAD-7 칼럼 크로마토그래피에 넣고 아세톤과 메탄올을 가하여 유기 용매 용출액을 얻고, 상기 유기 용매 용출액을 실리카 칼럼 크로마토그래피(silica column chromatography)을 이용하여 분획액을 얻고, 상기 분획액을 예비(preparative TLC)를 이용하여 버베린을 분리 할 수 있다.상기 유기 용매의 바람직한 예는 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 디에틸 에테르(diethyl ether), 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)이다.다양한 천연물이 소엽의 이차 대사산물로서 보고된 바 있으나 이 가운데 항 헬리코박터 필로리(H. pylori)활성을 가진 물질은 알려지지 않았기에 추출물에 존재하는 여러 성분들로부터 항 헬리코박터 필로리(H. pylori)활성 물질을 여러가지 분리기법을 이용하여 분리하였다. 소엽 추출물에 대한 유기용매 분획을 통해 비수용성 분획을 분리한 후 수용성 분획에 대해 XAD-7 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 수용층 내에 존재하는 다량의 당 성분들을 제거하였다. 이후 실리카 컬럼 크로마토그래피와 박막 크로마토그래피(TLC) 등의 분리 기법을 이용하여 분리된 활성 분획으로부터 단일의 유효 성분을 얻을 수 있었다. 각 분리 단계에서 얻어진 분획들에 대해 억제환 방법을 이용하여 활성을 추적하였으며 활성 물질의 분리 정도는 TLC 및 HPLC 분석을 통해 확인하였다. (실시예 3 참조)
버베린의 동정
크로마토그래피에 의해 활성 성분이 단일 불질로 분리됨에 따라 ESI-MS (electrosparay ionization mass spectroscopy)와 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 그 구조를 결정하여 활성 물질의 구조를 확인하였고, 이 구조가 이소퀴놀린 계열의 알칼로이드 물질인 버베린으로 동정되었다. ESI-MS 측정에서 [M]+가 336으로 관찰되었고1H-NMR과13C-NMR 스펙트럼에서 수소와 탄소의 갯수를 확인하여 분자식이 C21H21NO3임을 알 수 있었다. 이하1H-1H COSY, DEPT, HMQC, HMBC 등의 2D-NMR 실험 및 FT-IR 스펙트럼으로부터 물질의 구조식을 확인하였고 이러한 결과가 버베린 표준 물질의 스펙트럼과 정확히 일치함을 확인하였다.(실시예 4 참조)
항균활성
소엽 추출물과 그 유효 성분인 버베린이 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대해 갖는 항균활성을 헬리코박터 필로리(H. pylori)의 한천배지와 액체배지에서 각각 확인하였다. 한천 배지를 이용한 억제환 측정에서 소엽 추출물은 10mg/ml 이하의 저농도에서는 억제환을 형성하지 못하였으나 20mg/ml의 농도에서 직경 18mm의 억제환을 형성함이 관찰되었다. 버베린의 경우에는 2.0mg/ml의 저농도에서도 25mm의 억제환을 형성함으로써 강력한 항균활성을 보였다. 상기의 실험에서 소엽 추출물 및 버베린이 강력한 항균활성을 확인함에 따라 헬리코박터 필로리(H. pylori)의 액체배양을 통해 추출물과 버베린의 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 최소저해농도(MIC)를 측정하였다. 이배 희석법에 따라 농도를 달리한 소재를 액체 배지에 각각 녹이고 각 배지에 균을 접종한 뒤 균의 생장 억제를 생균수, 우레아제(urease) 활성, 균 현탁도 측정을 통해 관찰하였다. 세 가지 측정 방법 모두에서 농도 의존적으로 소재가 균의 생장을 억제함이 관찰되었으며 소엽 추출물과 버베린 각각 250㎍/㎖과 12.5㎍/㎖ 이 최소저해농도인 것으로 측정되었다. (실시예 5, 6 참조)
헬리코박터 필로리(
H. pylori
) 위내 정착 억제 효과
상기의 항균활성과는 별도로 헬리코박터 필로리(H. pylori)의 위표피 세포정착에 대한 소엽 추출물의 억제 효과를 관찰하고자, 위상피 종양 세포인 AGS 세포 배양액에 헬리코박터 필로리(H. pylori) 접종 전과 후에 각각 농도별로 소재를 첨가하여 예방과 치료의 두 가지 방법으로 억제능을 측정하였다. 헬리코박터 필로리(H. pylori) 접종에 앞서 소재를 투여한 예방 효과 측정군에서는 2%의 소재 농도에서 98%의 효과를 보였으며 1%와 0.5% 농도에서도 60% 이상의 높은 효과를 보였다. 소재를 접종 이후 투여한 치료 효과 측정군에서도 2%의 소재 농도에서 80%, 1%와 0.5%의 농도에서는 40%이상의 효과가 관찰되었으나 예방 효과보다는 억제능이 낮음을 알 수 있었다. (실시예 7 참조)
헬리코박터 필로리(
H. pylori
) 감염에 의해 유도되는 인터루킨-8
생성억제 효과
위장 및 소장의 상피세포가 박테리아에 노출되면 사이토카인의 생성을 유도하게 되는데 이러한 사이토카인의 증가는 헬리코박터 필로리(H. pylori)의 감염에 의한 염증 반응을 일으키는 원인으로 알려져 있다. 헬리코박터 필로리(H. pylori)의 경우 인터루킨-8이 위상피세포에서 뉴트로필 혹은 매크로파지를 활성화시키는 대표적 인 사이토카인으로 알려져 있다. 따라서 감염된 조직 세포의 인터루킨-8 생성량 감소를 통해 소재에 의한 감염 억제 효과를 확인할 수 있다. AGS 세포에 헬리코박터 필로리(H. pylori)를 감염시킨 후 1% (w/v) 농도의 소엽 추출물을 투여하고 인터루킨-8의 생성량을 측정한 결과 대조군에 비해 AGS 세포에의한 인터루킨-8의 생성량이 85% 감소하는 것이 관찰되었다. (실시예 8 참조)
동물실험을 통한
헬리코박터 필로리(
H. pylori
)
감염 억제효과 확인
헬리코박터 필로리 감염에 대한 소엽 추출물의 예방과 치료효과를 4주령의 BALB/c 마우스를 통해 확인하였다. 그 결과 소엽 열수추출물을 먼저 투여하여 헬리코박터 필로리의 감염을 예방한 경우, 헬리코박터 필로리의 우레아제 활성 측정과 우레아제 활성 측정 결과 각각 92.5%와 87.5%의 예방율을 나타냈다.
또한 헬리코박터 필로리를 먼저 감염시킨 후 선발유산균을 투여한 치료측면에서는, 소엽 열수추출물을 투여한 경우 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 각각 82.5%와 80.0%의 치료율을 나타냈다.
따라서 헬리코박터 필로리의 감염에 대해 소엽 추출물을 사용한다면 높은 예방, 치료효과를 얻을 수 있음을 확인하였다. (실시예 9 참조)
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
실시예 1
소엽의 열수추출
식용과 약용으로 모두 사용되고 있는 소엽으로부터 열수추출물을 제조하였다. 먼저 소엽을 열수추출하는데 있어서 추출온도가 소엽 농축액 제조에 미치는 영향을 화인하였다. 소엽 150g을 가열 순환식 추출탱크에 넣고, 물 1350ml을 가한 다음, 추출온도를 85℃, 95℃, 98℃, 100℃, 105℃로 하여 6~15시간 동안 추출하여 조추출액을 제조하였다. 상기 조추출액을 149㎛의 여과포로 여과한 후, 40~70cmHg로 감압농축하여 60brix°이상의 소엽 농축액을 제조하였다. 이렇게 제조된 소엽 열수추출물의 양을 측정하여 소엽추출물을 제조하는데 있어서, 추출온도의 영향을 확인하였다.표 1에 나타난 바와 같이 90℃이상의 온도에서 20% 이상의 생산수율을 기대할 수 있었으며, 그 이하의 온도에서는 추출시간을 15시간 이상 가져가도 생산수율의 증가가 나타나지 않아 소엽 열수추출물의 생산에 부적법함을 알 수 있었다. 그리고 소엽은 향기 성분이 강하여 일반적으로 식품의 원재료로 사용하기 쉽지 않았다. 그러나 표1에서 보는 바와 같이 열수추출 조건을 95℃ 이상의 온도로 설정할 경우에는 향기 성분이 대부분 제거되는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 추출온도를 생산수율과 향기 성분 제거에만 맞추어 100℃ 이상의 온도에서 열수추출 할 경우, 소엽으로부터 전분이 많이 추출되어 오히려 열수추출물내에 유효성분인 버베린의 함량이 감소하는 결과를 가져왔으며, 여과과정에도 많은 어려움을 초래하였다. 이는 열수추출물에 대한 항균활성 비교를 통해서도 확인할 수 있어서 100℃ 이상의 온도에서 소엽을 열수추출하는 것은 품질의 저하를 가져옴을 알 수 있었다. 따라서 소엽의 열수추출조건을 90~98℃에서 6~15시간으로 설정하면 경제적인 생산수율과 최적의 품질을 갖는 소엽 열수추출물을 얻을 수 있었다.
실시예 2
소엽의 용매 추출
소엽 1kg을 가열순환식 추출탱크에 넣고 60％ 에탄올 10kg을 가하여 60℃에서 10시간동안 추출한 후, 149㎛ 크기의 여과포로 여과하고 55cmHg로 감압농축하여 고형분이 10％인 추출액을 얻었다. 여기에 덱스트린 등의 부용제를 혼합하여 농축도가 40 brix°인 생약농축액을 제조하였다.
실시예 3
소엽으로부터 버베린 분리
소엽에 존재하는 항 헬리코박터 필로리 활성 물질을 동정하기 위하여 실시예 1에서 제조된 소엽 추출물에 대해 도 1에 도시된 바와 같이 순차적으로 크로마토그래피 기법들을 실시하고 이로부터 단일의 주활성 물질을 분리하였다. 각 분리 단계에서 나누어진 분획들에 대해서는 억제환 방법을 이용하여 활성을 확인하고 분리의 정도를 TLC 및 HPLC 분석을 통해 관찰하였다.
1) 억제환 방법을 이용한 항균 활성의 확인
활성을 확인하고자 하는 분획물을 일정 농도로 메탄올에 녹인 후 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 여과액 20㎕를 멸균된 디스크(Bacto Concentration Disk, Difco, U.S.A.)에 흡수시키고 디스크가 건조되면 20㎕를 더 떨어뜨린 뒤 용매가 완전히 제거될 때까지 무균 조건에서 방치하였다. 배양 24-48시간이 지난 헬리코박터 필로리를 브루셀라 한천 배지에 도말하고 그 위에 디스크를 올려 놓은 뒤 플레이트를 10% CO2 배양기에서 37℃, 72시간 배양하였다. 분획물의 활성은 디스크 주위에 형성된 억제환의 크기로 확인하였다.
2) 분획물의 분석
분획물의 분석은 TLC와 HPLC를 통하여 이루어졌다. TLC 플레이트는 머크(Merck)사의 제품(silica gel 60 F254, Germany)을 이용하였다. 전개 용매는 CHCl3/MeOH/AcOH = 7:1:0.5와 톨루엔(toluene)/CHCl3= 1:1의 두 가지를 사용하였으며 요오드 증기(iodine vapor)와 UV (254nm)에서 확인하였다.
HPLC 분석에 사용된 컬럼은 워터스(Waters)사의 제품(microbondapak, C18, 300×4.6mm)이었으며 이동상은 물(water)/MeOH을 1.0㎖/min의 유속으로하여 이용하였다. 분석은 285nm에서 하였으며 20㎕를 주입하여 분석하였다.
3) 유기용매에 의한 수용성 물질의 분획
유기 용매에 대한 물질의 용해도와 극성의 차를 이용하여 소엽 추출물 내의 물질들을 수용층과 유기용매층으로 분리하였다. 적절한 유기 용매의 선정을 위하여 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 디에틸 에테르(diethyl ether), 에틸 아세테이트(ethyl acetate)의 네 가지 유기 용매를 비교한 결과 클로로포름(chloroform)과 디클로로메탄(dichloromethane)으로는 0.9%(w/w)의 물질이 이동하였으며 나머지 유기 용매들로는 0.2% 이하밖에 이동이 이루어지지 않았다. 또한 디클로로메탄(dichloromethane)이 클로로포름(chloroform)보다 인체에 더 유해하므로 클로로포름(chloroform)을 이용하기로 하고 추출물을 20mg/ml의 농도로 증류수에 녹인 뒤 여기에 동일 부피의 클로로포름(chloroform)으로 분획 퍼넬(separatory funnel)에서 2회 분획하여 물층으로부터 비극성 물질들을 제거하였다.
4) XAD-7 칼럼 크로마토그래피(XAD-7 Column chromatography)
수용층을 여과지(Whatman No.4)로 여과하여 침전물을 제거한 뒤 감압 농축하고 다시 증류수를 가하여 25mg/ml 농도의 추출 용액(extract solution)을 제조하였다. 암벌리트 XAD-7(Amberlite XAD-7)(Nonionic polymeric adsorbent, Sigme Chemical Co.)을 오픈 칼럼(open column)에 충진한 후 메탄올(methanol)로 충분히 씻어주고 다시 두 배 부피의 증류수를 부어 메탄올(Methanol)을 제거하였다. 수지(Resin)에 대해 1:14 (건조추출물 무게/수지(resin) 무게)의 추출물 용액을 칼럼(column)에 떨어뜨린 뒤 표본(sample) 부피의 60배의 증류수로 칼럼(column)을 용출시켜 당류를 포함한 수용성 물질들을 제거하였다. 표본(Sample) 부피의 80배 메탄올(methanol)을 다시 용출시켜 비수용성 물질들을 얻었으며 마지막으로메탄올(methanol) 부피 절반의 아세톤(acetone)을 가하여 씻어주었다. 아세톤 조각(Acetone fraction)과 메탄올 조각(methanol fraction)은 TLC로 확인한 결과 동일한 패턴(pattern)을 보였으며 항균 활성 역시 같은 수준이었으므로 두 조각(fraction)을 서로 합하였다.
각 엘루언트 조각(eluent fraction)을 감압농축한 뒤에 정량적으로 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균 활성을 측정한 결과를 이하의 표 1 에 나타내었다. 수용층에서는 항균 활성이 전혀 나타나지 않았으며 활성이 유기용매층으로 모두 이동되었음을 확인할 수가 있었다. 용출액으로 얻어진 수용성 분획과 메탄올(methanol) 분획에 대하여 1.0㎖씩을 취한 후 페놀-술포릭 법(phenol-sulfuric method)을 실시하여 두 분획 내의 총당량을 정량하였다. 추출액 용액을 XAD-7을 통해 용출시켰을 때, 물층에서의 당 함량은 98.0mg/L로 나타났으며 유기 용매층에서는 2.9mg/L의 당 함량이 측정되었다. 즉 XAD-7 칼럼(XAD-7 column)을 이용하여 추출물(extracts)로부터 96% 이상의 당을 제거할 수 있었다.
5) 실리카 칼럼 크로마토그래피(Silica column chromatography)
XAD-7을 통과한 유기용매 분획을 소량의 메탄올(methanol)에 녹인 후 충분한 양의 셀리트(celite)(Yakuri, Japan)를 붓고 감압농축기에서 메탄올(methanol)을 완전히 제거하여 추출물을 셀리트(celite)에 흡착시켰다. 칼럼(Column)을 유리 섬유(glass wool)로 막은 후 그 위에 셀리트(celite)를 표면이 수평이 되도록 팩킹(packing)하였다. 실리카 겔(Silica gel)(Cat. No. 1.09385, Merck, Germany)을 높이 8.0cm되도록 부은 후 진공(vacuum)을 건 상태에서 20분간 압력을 가하여 단단하게 팩킹(packing)하였다. 감압 하에서 200ml의 아세톤(acetone)을 부어 불순물을 제거한 뒤 아스피레이터(aspirator)를 이용하여 12시간 건조시켰다. 소엽 추출물이 흡착된 셀리트(celite)를 실리카 칼럼(silica column)위에 충진한 후 감압 하에서 메탄올(methanol)의 비율이 0%에서 50%까지 단계적으로 증가된 클로로포름/메탄올 용액(chloroform/methanol solution)을 차례대로 용출시킨 뒤 튜브(tube)에 받았다. 각 분획을 TLC로 확인한 결과 6개의 분획으로 나눌 수가 있었으며 이중 Fr.5에서 높은 활성이 관찰되었다.
6) 예비 TLC(Preparative TLC)
활성 분획을 감압 농축한 뒤 TLC 판(TLC plate)(Cat.No., 1.05744, Silica Gel 60 F254, 0.5mm, Merck, Germany)의 출발선상에 흡착시키고 MeOH/CHCl3/AcOH = 7:2:0.5로 전개하였다. 판(Plate)을 280nm에서 관찰하였을 때 Rf 값이 각각 0.11-0.15, 0.15-0.21, 0.22-0.37, 0.37-0.64, 0.69-0.71인 5개의 밴드를 확인한 뒤 스크래퍼(scraper)로 긁어내었다. 긁어낸 실리카(silica)는 아세톤(acetone)과 클로로포름(chloroform)/ MeOH (7:1, v/v) 용액(solution)으로 일루션(elution)하여 흡작된 물질을 분리하였다. 항균 활성을 확인한 결과 Rf 값이 0.15-0.21 인 분획(Fr.5-M)에서만 활성이 나타났다.
실시예 4
버베린의 구조분석
크로마토그래피의 실시에 의해 활성 성분이 단일 불질로 분리됨에 따라 ESI-MS (electrosparay ionization mass spectroscopy)와 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 그 구조를 결정하여 활성 물질이 도 2의 구조를 가지고 있음을 확인하였고 이 구조는 이소퀴놀린 계열의 알칼로이드 물질인 버베린으로 동정되어졌다. ESI-MS 측정에서 [M]+가 336으로 관찰되었고1H-NMR(도 3, 표 2)과13C-NMR 스펙트럼(도 4, 표 3)에서 수소 와 탄소의 갯수를 확인하여 분자식이 C21H21NO3임을 알 수 있었다. 이하1H-1H COSY(도 5), DEPT(도 6), HMQC(도 7), HMBC(도 8)등의 2D-NMR 실험 및 FT-IR(도 9)스펙트럼으로부터 물질의 구조식이 도 2와 같음을 확인하였고 이러한 결과는 버베린 표준 물질의 스펙트럼과 정확히 일치하였다.
실시예 5
배지 분산(Well diffusion) 방법에 의한
헬리코박터 필로리(
H. pylori
) 항균활성 비교
상기 실시예 1과 2로부터 얻어진 소엽추출물과 버베린에 대해 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성을 배지 분산(well diffusion) 방법에 의해 확인하였다. 먼저 멸균된 실린더(Cylinder)를 패트리 디쉬(petri dish)의 적당한 위치에 세운 뒤 25ml의 브루셀라(brucella) 한천배지를 부어 굳혔다. 미리 배양된 헬리코박터 필로리(H. pylori)를 브루셀라 브로스(brucella broth)에 현탁하여 흡광도(450nm)를 1.2가 되도록 하였다. 균 현탁액 200㎕를 액체 상태의 소프트 한천(soft agar)(0.8%) 배지에 첨가하여 이것을 바로 실린더 판(cylinder plate)에 부어 골고루 퍼지게 하였다. 이 판(plate)을 10% 이산화탄소 인큐베이터(CO2incubator)에 넣어 배지를 굳힌 뒤 실린더(cylinder)를 핀셋으로 제거하고, 각 시료를 실린더(cylinder)에 의해 형성된 배지(well)에 170㎕씩 가하였다(loading). 이 판(plate)을 37℃, 10% CO2조건하에서 72시간 배양 후, 형성된 클리어 존(clear zone)의 크기를 측정하여 항균효과를 비교하였다.
배지 분산(Well diffusion) 방법에 의한 소엽추출물과 버베린의 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성 결과를 표 4에 나타내었다. 소엽 추출물은 2.0mg/ml과 20.0mg/ml의 두 가지 농도로 브루셀라 브로스(brucella broth)에 녹인 후 필트레이션(filtration)으로 제균하여 사용하였으며, 버베린은 2.0mg/ml의 농도로 DMSO에 녹이고 제균하여 사용하였다. 대조군(Control)으로서 DMSO의 항균활성의 유무를 같이 확인하였다. 소엽추출물은 2.0mg/ml의 농도에서는 전혀 클리어 존(clear zone)을 형성하지 못하였으나 20.0mg/ml의 농도에서는 18mm 정도의 클리어 존(clear zone)을 형성해 높은 항균활성을 나타냈다. 그 유효성분인 버베린의 경우는 2.0mg/ml의 농도에서 클리어 존(clear zone)이 25mm 정도로 매우 큰 항균 활성을 보였다. 반면 대조군인 DMSO는 클리어 존(clear zone)을 전혀 형성하지 못했으므로 버베린 활성에 대한 용매의 영향은 없음을 확인하었다.
실시예 6
최소 억제 농도(Minimal inhibitory concenration, MIC) 측정에 의한
헬리코박터 필로리(
H. pylori
) 항균활성 비교
상기 실시예 1과 2로부터 얻어진 소엽추출물과 버베린에 대해 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성을 최소억제농도(MIC : Minimal inhibitory concentration) 측정에 의해 확인하였다.
각 시료를 24 배지 판(well plate)에 2배 희석법으로 희석하여 900㎕/well이 되도록 하였다. 24시간 배양한 헬리코박터 필로리 브로스 배양물(H. pyloribroth culture)에서 1.0ml을 취하고 106cfu/ml의 농도로 희석하여 각 배지(well)에 100㎕씩 첨가하였다(total volume, 1.0ml). 판(Plate)을 10% CO2조건하에서 쉐이킹(shaking) 배양하면서 시간별로 표본(sample)을 취하여 생균수, 우레아제(urease) 활성, 세포(cell) 현탁도에 의한 최소억제농도(MIC)를 측정하였다.
1) 생균수 측정에 의한 최소 억제 농도(MIC)
생균수 측정은 배양 36시간 후에 판(plate)에서 배지(well) 당 100㎕를 취하여 103배 희석한 뒤 브루셀라 한천 판(Brucella agar plate)에 도말하고 10% CO2인큐베이터(incubator)에서 37℃, 72시간 배양하여 나타난 균의 집락을 계수하였다.
2) 우레아제(urease) 활성 측정에 의한 최소 억제 농도(MIC)
우레아제(urease) 활성 측정은 배지(well)당 100㎕를 취하여 1.0ml의 우레아 알 브로스(urea R broth)에 첨가(addition)하고 이를 10% CO2인큐베이터(incubator)에서 6시간 배양한 뒤 560nm에서 흡광도를 측정하였다.
3) 세포(Cell) 현탁도 측정에 의한 최소 억제 농도(MIC)
세포(Cell) 현탁도 측정은 배양 완료 후 각 배지(well)로부터 브로스(broth)를 모두 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮기고 다시 배지(well)에 1.0ml의 증류수로 씻어서 더하였다. 튜브(Tube)를 12,000 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 상등액을 버리고 세포 팰릿(cell pellet)을 400㎕의 증류수에 현탁시킨 후 200㎕를 취하여 96 배지 판(96 well plate)으로 옮겨 660nm에서 흡광도를 측정하였다.
헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 소엽추출물과 버베린의 항균활성을 생균수 측정에 따른 최소 억제 농도(MIC) 결과로 표 5에 나타내었다. 소엽추출물의경우 1,000㎍/ml 이상의 농도에서는 2.0 ×108cfu/ml의 헬리코박터 필로리(H. pylori)가 완전히 억제됨을 확인하였으며, 버베린의 경우는 25 ㎍/ml 이상의 농도에서 헬리코박터 필로리(H. pylori)가 완전히 억제됨을 확인하였으며, 12.5 ㎍/ml의 농도에서도 50% 이상이 억제됨을 알 수 있었다.
▷ 대조군(Control) : 2.0 ×108cfu/ml
++ : 균수가 많아 계수 불가
소엽 추출물과 버베린에 의한 헬리코박터 필로리 우레아제(H. pyloriurease) 활성억제 정도를 통한 최소 억제 농도(MIC) 결과를 도 10에 나타내었다. 도시된 바와 같이, 각 소재들의 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 최소억제농도(MIC)를 결정하기 위해 헬리코박터 필로리(H, pylori) 배양 60시간 후 우레아제(urease)의 활성을 알 브로스(R broth)를 이용하여 측정하였다.
도 10에서 보는 바와 같이, 소엽 추출물의 경우 우레아제 분석시험(Urease assay)에 의해 측정된 최소억제농도(MIC)는 250mg/ml의 농도로 결정되었으며, 이는 이전의 실험 결과인 100mg/ml과 차이를 보이는데 이는 측정시 배양 시간(48hr vs. 60hr)의 차이와 측정방법(Viable cell counting vs. urease assay)에 따라 차이를 보이는 것으로 설명된다. 버베린의 최소억제농도(MIC)는 12.5㎍/ml로 결정되었다. 버베린에 대한 용매(solvent)로 사용된 DMSO도 고농도에서는 세포 성장(cell growth)에 영향을 미치는 것을 알 수 있지만 분획물의 활성이 여전히 존재하는 저농도에서는 전혀 저해 효과가 나타나지 않으므로 분획물의 최소억제농도(MIC) 결정에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
그리고 세포(cell) 현탁도에 의한 최소억제농도(MIC) 결정은 소엽 추출물과 버베린에 의해 배양 60시간 후 나타난 증식억제 정도를 세포(cell) 현탁도에 의해 측정한 것으로 그 결과는 도 11과 같다. 소엽추출물은 0.5mg/ml의 농도까지는 완전한 항균활성을 보였으며 250, 125mg/ml 의 농도에서는 각각 50, 30%의 저해율을 보였다. 이 결과는 이전에 생균수 측정을 통해 확인된 최소억제농도(MIC)(100㎍/ml)와 일치하는 결과로 볼 수 있다. 또한 버베린의 최소억제농도(MIC)는 12.5㎍/ml로 우레아제 분석시험(urease assay)에서의 결과와 동일하게 결정되었다.
실시예 7
헬리코박터 필로리(
H. pylori
)
위내 정착 억제효과
헬리코박터 필로리(H. pylori)의 위내 정착억제효과를 다음과 같이 예방과 치료의 관점에서 확인하였다.
가. 예방효과의 측정
AGS 세포(AGS cell, 106cfu/well)를 6-배지 판(6-well plate)에 부착시킨 후 각 소재와 RPMI 1640(10% FBS) 배지를 넣고 3시간 인큐베이션(incubation)하였다. 헬리코박터 필로리(H. pylori)를 107cells/well 농도로 접종하여 다시 1시간 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 판 쉐이커(Plate shaker)로 3번 워싱(washing) 한 뒤 멸균증류수 1.0㎖를 넣고 1시간 동안 반응하여 AGS 세포(AGS cell)을 리시스(lysis) 시켰다. 세포(Cell)를 수거하여 원심분리한 세포 팰릿(cell pellet)에 우레아 알-브로스(urea R-broth) 1.0㎖을 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜 O.D(560nm)를 측정하였다.
나. 처리(Treatment)
AGS 세포(AGS cell, 106cells/well)를 6 배지 판(6 well plate)에 부착시킨 후 헬리코박터 필로리(H. pylori)를 107cfu/well(0.1㎖) 접종하여 3시간 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 0.2㎖의 소재와 2.7㎖의 RPMI 1640(10% FBS) 배지를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 판 쉐이커(Plate shaker)로 3번 워싱(washing)한 뒤멸균증류수 1.0㎖을 넣어 1시간 동안 AGS 세포(AGS cell)를 리시스(lysis)시켰다. 세포(Cell)를 수거하여 원심분리한 셀 팰릿(cell pellet)에 우레아 알-브로스(urea R-broth) 1.0㎖을 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜 O.D(560nm)를 측정하였다.
소엽 추출물을 각각 헬리코박터 필로리(H. pylori) 접종 전과 후에 AGS 세포(AGS cell) 배지에 첨가시키고 그 부착저해율을 측정한 결과를 도 12에 나타내었다. 도시된 바와 같이, 0.5%, 1%, 2% 첨가시 농도를 달리한 모든 실험군 에서 헬리코박터 필로리 감염(H. pyloriinfection) 이전에 소엽을 투여한 군이 감염(infection) 이후에 소엽을 투여한 군보다는 더 높은 활성을 보임을 알 수 있었다. 특히 예방과 치료군 모두 2%에서는 98%와 82%의 높은 저해 효과를 보였으며 그 이하의 농도에서는 활성에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
실시예 8
헬리코박터 필로리(
H. pylori
) 감염에 의해 유도되는
인터루킨-8 생성억제 효과
헬리코박터 필로리의 감염에 의해 유도되는 위 상피세포에서의 인터루킨-8의 생성량의 변화를 통해 소엽 추출물의 감염 억제 효과를 측정하였다.
먼저 한천 배지에서 배양된 헬리코박터 필로리를 10㎖의 PBS 완충액(buffer)으로 씻어낸 후, 4℃, 9,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 침전된 세포를 1㎖의 Han's F12 배지에 현탁하고 현탁액의 소량을 취하여 1:50으로 희석한 뒤 660nm에서 현탁도를 재어 아래와 같이 농도를 실험 조건에 맞추었다.
세포농도(Cell population) = 16.95 ×A660×(dilution factor) ×108/ ml
헬리코박터 필로리(H. pylori) = 1.084 ×16.95 ×50 ×108= 9.18 ×108
AGS 배양액은 A, B, C, D의 네 개 군으로 나누고 2반복으로 처리하였다. A군은 AGS만을 배양하였으며 B군과 C군은 각각 AGS에 소엽 추출물과 헬리코박터 필로리만을 각각 처리하였다. D군은 배지에 녹인 소엽 추출물을 1%(w/v) 되도록 첨가하고 한 시간 후에 헬리코박터 필로리 현탁액 100㎕를 7.5×108cfu/ml 농도로 다시 첨가하였다. 모든 군으로부터 배양 후 0, 2, 4, 6, 9 시간에 각각 배지를 취하여 4℃, 12,000rpm에서 3분간 원심분리하고 그 상등액을 취한 후 엘리사(ELISA)방법(QuantikineTM Human IL-8 Immunoassay kit, RD systems Europe Ltd.)으로 인터루킨-8의 양을 측정하였다.
A : 대조군
B : 소엽추출물 처리군
C : 헬리코박터 필로리 처리군
D : 소엽추출물 + 헬리코박터 필로리 처리군
1) 샘플링(Sampling)
판 배지(Plate well) 내의 배지를 수거한 뒤 4℃, 12,000rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상등액을 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮긴 후 -70℃에 저장하였다.
2) 표준용액
RD5P(5 ×) 2.0㎖을 D.W.로 5배 희석한 뒤 5.0㎖을 취하여 IL-8 표준 용액 약병(vial)에 첨가하여 2,000pg/㎖ 스톡(stock)을 제조하였다. 2중 희석(Two-folded dilution)에 의해 8가지 농도의 100㎕ 표준용액을 준비하였다.
3) 분석 시험(Assay)
분석 희석액(Assay diluent) (RD1-8) 100㎕를 판 배지(plate well)에 넣고 50㎕의 표본(sample)과 표준용액을 첨가하였다. 공액(Conjugate) 용액 100㎕를 가한 후 상온에서 두 시간 반 동안 쉐이킹(shaking)하였다. 판(Plate)을 400㎕의 워싱 완충액(washing buffer)으로 여섯 번 씻어내고 여기에 시약 A(Reagent A)와 시약 B(Reagent B)를 각각 1:1로 섞은 기질 용액 200㎕를 첨가하였다. 판(Plate)을 30분간 정치한 뒤 색 변화를 관찰하며 492nm에서 흡광도를 관찰하였다.
헬리코박터 필로리가 위점막의 상피세포와 상호작용(interaction)할 때, 다양한 사이토킨(cytokine)의 생성을 촉진하게 되는데 이 중에서도 IL-8의 분비(secretion)가 가장 현저하게 나타난다. 그리고 IL-8은 위염의 직접적인 원인이 되는 뉴트로필(neutrophil) 또는 마크로파지(macrophge)까지 유도하게 된다. 따라서 헬리코박터 필로리 감염에 의해 유도되는 IL-8의 생성을 억제하는 것이 위염발생을 억제하는 한 방법이 될 수 있다.
도 13에 배양 시간에 따른 네 개의 군에서의 인터루킨-8의 생성량 변화를 나타내었다. 헬리코박터 필로리에 감염되지 않은 군(A, B군)에서는 9시간 경과 후에도 인터루킨-8의 생성이 거의 없었지만 헬리코박터 필로리 감염군(C군)에서는 6시간 경과 때까지 급격히 증가하여 그 이후에 약 2,500pg/ml 수준에서 인터루킨-8의 양이 유지되었다. 반면 AGS를 소엽 추출물과 함께 한 시간 동안 배양한 후 헬리코박터 필로리를 감염시켰을 때(D군) 인터루킨-8의 생성량은 현저히 감소하여 배양 9시간 후에도 300pg/ml 정도로 C군의 15% 수준에 그치는 것으로 나타났다. 따라서 소엽추출물이 헬리코박터 필로리 감염에 의해 유도, 생성되는 인터루킨-8의 생성량을 약 85%정도 감소시킴으로써 위염의 발생율도 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9
동물실험을 통한 헬리코박터 필로리(
H. pylori
) 감염예방, 치료 효과 확인
헬리코박터 필로리 감염에 대한 소엽추출물의 예방과 치료효과를 마우스를 통해 확인하였다. 실험에 사용된 BALB/c 마우스는 마우스 위장관내에 존재하여 우레아제 활성을 나타내는 헬리코박터 휄리스(Helicobacter felis)가 존재하지 않는 것만을 선별하여 사용하였다. 사용한 BALB/c 마우스는 4주령의 암컷으로 예방과 치료 각 그룹당 40마리를 사용하였으며, 양성, 음성대조군에는 그룹당 20마리를 사용하였다. 마우스는 25℃, 50% 습도, SPF 조건하에서 사육하면서 실험하였다. 이 때 음성 대조군으로는 헬리코박터 필로리 현탁액 대신 7.5% 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer)만을 0.5ml씩 경구투여한 15마리의 마우스를 사용하였으며, 양성대조군으로는 헬리코박터 필로리를 7.5% 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer)에 2∼4 ×109cfu/ml의 농도로 현탁하여 경구투여한 15마리의 마우스를 사용하였다.
1) 예방효과
마우스에 소엽 열수추출물을 음용수에 1mg/ml의 농도로 혼합하여 하루에 마리당 10ml씩 14일간 투여한 후, 7.5% 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer)에 현탁한 2∼4 ×109cfu/ml의 헬리코박터 필로리 균액을 2일 동안 마우스당 0.5ml씩 6회 연속 감염시켰다. 감염 6주 후 각 실험군의 위를 적출하여 위조직내 헬리코박터 필로리 생균수와 우레아제 활성여부를 측정함으로써 헬리코박터 필로리 감염에 대한 예방효과를 확인하였다.
2) 치료효과
헬리코박터 필로리를 7.5% 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer)에 2∼4 ×109cfu/ml의 농도로 현탁하고 이 균액을 2일 동안 마우스에 0.5ml씩 6회 연속 감염시켰다. 헬리코박터 필로리가 마우스 위내 완전히 정착한 감염 6주 후 소엽 열수추추물을 음용수에 1mg/ml의 농도로 혼합하여 마리당 하루에 10ml씩 3주간 투여하였다. 투여 후 각 실험군의 위를 적출하여 위조직내 헬리코박터 필로리 생균수와 우레아제 활성을 측정함으로써 헬리코박터 필로리 감염에 대한 치료효과를 확인하였다.
3) 위조직내 헬리코박터 필로리 생균수와 우레아제 활성 측정
적출한 위조직은 위내 고형분을 제거한 후 신속히 2등분하여 ½은 10% 마혈청이 첨가된 브루셀라 브로스(brucella broth)에 침지시킨 후 호모제나이즈(homogenize)하여 브루셀라 한천 판(brucella agar plate)에 스프레딩(spreading)하였다. 판(Plate)은 습도가 높은 10% CO2배양기에서 37℃로 5∼7일간 배양한 후 나타난 컬러니(colony)를 확인하여 헬리코박터 필로리의 존재여부를 확인한다. 나머지 ½은 우레아 브로스(urea broth)에 침지시켜 습도가 높은 10% CO2배양기에서 37℃로 5일간 배양하면서 색의 변화를 관찰하여 헬리코박터 필로리의 존재여부를 판단하였다.
헬리코박터 필로리 감염에 대한 소엽 열수추출물의 예방과 치료효과를 이하의 표 6에 나타내었다. 음성 대조군의 경우 감염 6주 후에도 헬리코박터 필로리가 전혀 감염되어 있지 않았으며, 양성 대조군의 경우는 감염 6주 후에 100%의 헬리코박터 필로리 감염율을 나타냈다. 그러나 소엽 열수추출물을 먼저 투여하여 헬리코박터 필로리의 감염을 예방한 경우, 헬리코박터 필로리의 우레아제 활성 측정 결과와 우레아제 활성 측정 결과 각각 92.5%와 87.5%의 예방율을 나타냈다.
또한 헬리코박터 필로리를 먼저 감염시킨 후 선발유산균을 투여한 치료측면에서, 소엽 열수추출물을 투여한 경우 생균수와 우레아제 활성 측정 결과 각각 82.5%와 80.0%의 치료율을 나타냈다.
따라서 헬리코박터 필로리의 감염에 대해 소엽 열수추출물을 사용한다면 높은 예방, 치료효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
실시예 10
열, pH 및 소화효소에 대한 안정성
소엽 추출물이 실제 위 내에서 헬리코박터 필로리(H. pylori)를 저해하기 위해서는 위 내의 소화 효소 및 위산에 의한 산성 조건에서 안정성을 유지해야만 한다. 그리고 발효유와 같은 저산성 조건의 식품에 이용성을 높이기 위해서는 제품 자체의 저산성 조건에서 소재의 활성이 장시간 유지될 수 있어야 한다. 또한 식품이나 약품의 제조 공정 상 가해지는 열처리 조건에서도 그 활성이 유지되어야 한다. 따라서 소엽추출물에 대해 열, pH, 소화효소에 대한 안정성을 확인하였다.
1) 열안정성
소엽 추출물을 5㎎/㎖의 농도로 증류수에 녹이고 5개의 캡 튜브(cap tube)로 옮겼다. 열처리를 하지 않는 대조군을 제외한 각각의 캡 튜브(cap tube)를 60, 80 및 100℃ 에서 1시간씩 그리고 121℃에서 15분간 처리하고 각 샘플을 0.45㎛ 여과막으로 제균하였다. 제균된 샘플을 디스크 분산 테스트(disc diffusion test)를 이용하여 항 헬리코박터 필로리(H. pylori) 활성을 측정하였다.
2) pH 안정성
소엽 추출물 70㎎을 pH를 각각 2.0, 3.0, 4.0, 5.0에 맞춘 소듐 아세테이트 완충액(sodium acetate buffer)과 pH 7.0의 PBS 완충액(PBS buffer) 6.0㎖ 에 녹인 후, 아세트 산(acetic acid)과 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 각각의 pH를 맞추고 최종 부피가 7.0㎖이 되도록 하였다. 완충(Buffer) 용액을 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 각 샘플을 아세트산(acetic acid)과 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여pH 7로 중화시켜서 부피가 10.0㎖이 되도록 하였다. 여과막을 이용하여 제균한 뒤 디스크 분산 테스트(disc diffusion test)를 통해서 활성의 변화를 측정하였다.
3) 위액 안정성
위액은 4명의 성인으로부터 각각 식사 후 30, 60, 90, 120분 후, 그리고 공복 상태에서 취하여 냉동시킨 것을 녹여서 사용하였다. 위액 400㎕가 든 테스트 튜브(test tube)에 100㎎/㎖의 농도로 증류수에 녹인 소재 50㎕를 첨가하였다. 대조군은 위액 대신 PBS 완충액(PBS buffer)을 시용하였다. 각 테스트 튜브(test tube)를 37℃ 의 물 베스(water bath)에서 30분간 반응시킨 뒤 5% 탄산 나트륨(sodium carbonate)을 사용하여 pH 7로 맞추었다(최종부피, 500㎕). 각 샘플에 대한 활성의 변화를 디스크 분산 테스트(disc diffusion test)로 측정하였다.
소엽 추출물을 각각의 열처리 조건하에 두었을 때, 도 14에서 보는바와 같이 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성은 대조군(control)과 비교하여 변화가 없는 것으로 나타났다. 특히, 121℃, 15분의 살균 조건하에서도 활성은 전혀 감소를 보이지 않았으므로 소엽의 활성은 제품의 생산 공정 상의 가열 처리 조건에 의해 영향을 받지 않음을 확인하였다.
그리고 pH 안정성의 경우 pH2∼5의 조건에서 소엽 추출물의 활성을 pH 7 조건을 대조군과 비교한 결과, 도 15에서 보는 바와 같이 소엽 추출물의 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성 은 모든 pH 조건에서 안정하게 나타났다.
위액에 대한 소엽 추출물의 안정성을 각 위액 샘플과 소재를 30분간 반응시킨 후, 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성을 확인하였다. 표 7에서 보는 바와 같이 소엽 추출물의 항균활성은 위액에 의해 전혀 영향을 받지 않음을 알 수 있었으며, 이는 실제 위장 환경 내에서도 소엽 추출물이 헬리코박터 필로리(H. pylori)의 증식을 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 11
유산균에 대한 영향
소엽 추출물을 발효유에 첨가할 경우 소엽 추출물이 갖는 항균활성이 유산균의 생육에는 영향을 미치지 않으면서 헬리코박터 필로리(H. pylori)에만 선택적으로 작용할 수 있어야 한다.
발효유의 종균으로 사용되는 락토바실러스(Lactobacillus),스트렙토코커스(Streptococcus),비피도박테리움(Bifidobacterium)에 대한 소엽 추출물의 영향을 다음과 같이 확인하였다. 먼저 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus),락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei),스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus),비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum)을 12% 스킨 밀크(skim milk)에 접종하여 37℃에서 9시간 동안 혼합배양하였다. 배양이 완료된 후 각각의 선택배지를 이용하여 초기 생균수를 측정하였다. 소엽 추출물은 감압 농축하여 60brix°의 농축액을 제조한 뒤 1.0%(v/v)의 농도로 유산균 배양액에 첨가하였다. 소엽 추출물이 첨가된 유산균 배양액을 10일간 4℃에서 냉장 보관하면서 2일 간격으로 각 유산균에 대한 선택배지를 이용하여 생균수를 측정하였다. 각 유산균에 대한 생균수 측정 조건은 표 8과 같다.
유산균 배양액의 초기 생균수는 락토바실러스(Lactobacillus)5 ×106cfu/ml, 비피도박테리움(Bifidobacterium)3 ×106cfu/ml, 에스. 텀필리우스(S. thermphilius)3.0 ×109cfu/ml 이였으며, 60 brix°소엽 추출물 1.0 %(v/v)을 유산균 배양액에 첨가하여 10일간 냉장 보관한 후에도 각각의 유산균수가 초기 생균수를 그대로 유지하고 있음을 확인하였다. 따라서 소엽 추출물의 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대한 항균활성은 유산균에 영향이 없으며 다만 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 대해서만 선택성을 갖고 있음을 확인하였다.
실시예 12
소엽 추출물을 이용한 발효유 제조
탈지분유로 무지유고형분 함량을 8∼20 중량%로 조정한 원료유를 72∼75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 일정 온도로 냉각시킨 후 락토바실러스 카제이 HY 2782를 106cfu/ml의 농도로 접종하여 배양액이 pH 4∼5가 될 때까지 37℃에서 배양하고 냉각시켰다. 시럽은 과즙 농축액 0.1∼50 중량%, 식이섬유 0.1∼20 중량%, 포도당 0.5∼30 중량%, 올리고당 0.1∼15 중량%, 칼슘 0.001∼10 중량%, 비타민 0.0001∼5 중량%, 소엽 추출물 0.1∼5 중량% 등을 녹여 제조하고 살균한 뒤 냉각하였다. 이렇게 제조된 시럽을 상기 배양액과 일정비율로 혼합, 교반하여 균질화한 뒤 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 제조된 발효유는 관능검사 결과 풍미, 물성, 전체적인 맛에서 양호한 결과를 보였다.
실시예 13
소엽 추출물을 이용한 위궤양 예방, 치료용 음료 제조
소엽 추출물 14중량%, 대추엑기스 1.5 중량%, 당귀농축액 7중량%에 액상과당 7.4중량%를 혼합하고 여기에 정제수를 첨가, 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 90∼95℃에서 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조하였다.
실시예 14
소엽 추출물을 이용한 위궤양 예방, 치료용 생약제제 제조
소엽 추출물 0.01∼30 중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올을 조성분의 5∼10%가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량%를 첨가, 혼합하고 직경 1∼2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40∼50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후, 12∼14 메쉬를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조될 수 있다.
실시예 15
버베린을 이용한 위궤양 예방, 치료용 생약제제 제조
소엽 추출물로부터 얻어진 버베린 0.001∼10 중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산아미드), 올리고당, 50% 에탄올을 조성분의 5∼10%가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10 중량%를 첨가, 혼합하고 직경 1∼2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40∼50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후, 12∼14 매쉬를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정에 관한 것으로서, 생약소재인 소엽에 대해 약 5∼20배 중량의 물을 첨가한 다음, 90∼98℃에서 6∼15시간 동안 열수추출한 후, 그 여액을 40∼70cmHg로 감압농축하는 열수추출법으로 소엽추출물을 제조하여 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성 및 헬리코박터 필로리 우레아제활성 억제효과, 위상피세포 정착성 억제효과, 인터루킨-8 생성억제효과를 갖는다.
또한, 본 발명의 버베린은 상기 소엽 추출물로부터 클로로포름(chloroform),디클로로메탄(dichloromethane), 디에틸 에테르(diethyl ether), 에틸 아세테이트(ethyl acetate)의 유기 용매를 이용하여 얻어진 수용층을 XAD-7, 실리카 칼럼 크로마토그래피(silica column chromatography)를 통해 분획하고, 예비 TLC(Preparative TLC)를 이용하여 분리하여 된 것으로서 상기 소엽 추출물의 주요한 유효성분으로서 버베린을 용이하게 얻을 수 있는 효과를 갖는다.
Claims (11)
- 삭제
- 삭제
- 헬리코박터 필로리에 대한 항균활성 및 헬리코박터 필로리 우레아제활성 억제효과, 위상피세포 정착성 억제효과, 인터루킨-8 생성억제효과를 갖도록 생약소재인 소엽에 물이 상기 소엽 중량에 대해 약5∼20배 첨가되고, 90∼98℃에서 6∼15시간동안 열수추출하고 40∼70cmHg로 감압농축하는 열수추출법으로 위궤양 예방 및 치료효과를 가지는 것을 특징으로 하는 소엽추출물의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 3항의 제조방법으로 제조된 소엽추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 위궤양 예방 및 치료효과가 있는 발효유.
- 제 3항의 제조방법으로 제조된 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 위궤양 예방 및 치료효과가 있는 음료.
- 제 3항의 제조방법으로 제조된 추출물을 유효성분으로 함유하고, 여기에 약제학적으로 허용되는 부형제 및 보조제를 혼합하여 약제학적으로 허용되는 방법으로 제형화한 위궤양 예방 및 치료효과가 있는 약학 제제.
- 소엽 추출물에 증류수(물)와 유기용매를 가하여 혼합하는 혼합단계 및;상기 유기 용매에 대한 물질의 용해도와 극성의 차를 이용하여 소엽 추출물내의 물질들을 수용층과 유기용매층으로 분리하는 유기용매에 의한 수용액 물질의 분획단계;상기 수용층을 여과지로 여과하여 침전물을 제거한 되 감압 농축하고 다시 증류주를 가하여 추출용액(extract solution)을 제조한 뒤 상기 추출 용액을 XAD-7 칼럼 크로마토그래피에 넣는 XAD-7 칼럼 크로마토그래피(XAD-7 Column chromatography)단계;아세톤과 메탄올을 가하여 유기 용매 용출액을 얻고 상기 유기 용매 용출액을 실리카 칼럼 크로마토그래피(silica column chromatography)를 이용하여 분획액을 얻는 단계;상기 분획액을 예비 TLC(preparative)를 이용하여 버베린을 분리하는 것을 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 위궤양 예방 및 치료효과를 갖는 버베린 추출방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 유기 용매는 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 디에틸 에테르(diethyl ether), 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 이루어지는 군으로부터 선택되어 지는 것을 특징으로 하는 위궤양 예방 및 치료효과를 갖는 버베린 추출방법.
- 제 9항의 버베린 추출방법에 의해서 얻어진 버베린을 유효성분으로 함유하고, 여기에 약제학적으로 허용되는 부형제 및 보조제를 혼합하여 약제학적으로 허용되는 방법으로 제형화한 위궤양 예방, 치료효과가 있는 약학 제제.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020000013074A KR100353262B1 (ko) | 2000-03-15 | 2000-03-15 | 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정 |
| JP2001045047A JP4888750B2 (ja) | 2000-03-15 | 2001-02-21 | 胃潰瘍の予防及び治療に効果的な蘇葉抽出物とその用途及びその抽出物からベルベリンを得る工程 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020000013074A KR100353262B1 (ko) | 2000-03-15 | 2000-03-15 | 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010100198A KR20010100198A (ko) | 2001-11-14 |
| KR100353262B1 true KR100353262B1 (ko) | 2002-09-18 |
Family
ID=19655430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020000013074A KR100353262B1 (ko) | 2000-03-15 | 2000-03-15 | 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4888750B2 (ko) |
| KR (1) | KR100353262B1 (ko) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100512403B1 (ko) * | 2002-05-23 | 2005-09-07 | 송도원 | 차조기 추출액의 제조방법 |
| KR100506955B1 (ko) * | 2002-05-23 | 2005-08-11 | 송도원 | 참깨 추출액의 제조방법 |
| KR100496146B1 (ko) * | 2002-06-12 | 2005-06-20 | 주식회사 뉴로넥스 | 감초, 강황 및 소엽의 추출물을 함유한 위염 및 위궤양의예방 및 치료를 위한 조성물 |
| KR100892180B1 (ko) * | 2007-04-23 | 2009-04-10 | 강릉원주대학교산학협력단 | 귤껍질 분말 또는 이의 추출물을 함유하는 위장 질환 예방및 치료용 조성물 |
| CN102215852B (zh) * | 2008-10-30 | 2014-06-11 | 国立大学法人琉球大学 | 抗幽门螺杆菌活性剂 |
| KR101127675B1 (ko) | 2009-09-28 | 2012-03-22 | 영남대학교 산학협력단 | 차조기 추출액 및 이를 이용한 음료 |
| KR20140033998A (ko) * | 2012-09-11 | 2014-03-19 | 씨제이제일제당 (주) | 사이코사포닌 ａ, 베르베린 및 리코이소플라본 ｂ를 포함하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| CN103254189B (zh) * | 2013-04-23 | 2015-11-04 | 广西民族大学 | 应用盐酸小檗碱分子印迹色谱柱分离盐酸小檗碱的方法 |
| CA2916972A1 (en) * | 2013-07-18 | 2015-01-22 | Amino Up Chemical Co., Ltd. | A composition having a prebiotic effect |
| KR101650522B1 (ko) | 2014-11-03 | 2016-08-25 | 경상북도(농업기술원) | 자소로부터 미리스티신을 추출하는 방법 |
| CN109187841B (zh) * | 2018-08-31 | 2020-11-13 | 成都大学 | 黄连花的薄层鉴别方法 |
| CN112684093B (zh) * | 2020-12-08 | 2022-11-25 | 广西中医药大学 | 一种十一方药酒的质量检测方法 |
| KR102416803B1 (ko) * | 2021-12-21 | 2022-07-05 | 주식회사 유담 | 배치식 살균과 후살균 공정을 이용한 상온유통 스파우트 파우치 포장 식물성 발효 유산균 음료 개발 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3059795B2 (ja) * | 1991-08-27 | 2000-07-04 | 鐘紡株式会社 | 精神安定用食品 |
| US5340833A (en) * | 1992-05-01 | 1994-08-23 | Eisai Co., Ltd. | Urokinase inhibitors |
| JP3547782B2 (ja) * | 1993-12-28 | 2004-07-28 | ロート製薬株式会社 | 抗ヘリコバクター・ピロリ活性剤 |
| JPH08295632A (ja) * | 1995-03-02 | 1996-11-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 抗菌剤 |
| JPH0987189A (ja) * | 1995-09-19 | 1997-03-31 | Ichimaru Pharcos Co Ltd | エンメイソウ、ボタンピ、シソ、アルニカ含有抗アレルギー剤 |
| JP3326589B2 (ja) * | 1996-10-26 | 2002-09-24 | 祥之 亀山 | 桑葉、梅肉、梅仁、紫蘇葉等を素材とする健康食品 |
-
2000
- 2000-03-15 KR KR1020000013074A patent/KR100353262B1/ko active IP Right Review Request
-
2001
- 2001-02-21 JP JP2001045047A patent/JP4888750B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20010100198A (ko) | 2001-11-14 |
| JP2001270835A (ja) | 2001-10-02 |
| JP4888750B2 (ja) | 2012-02-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100353262B1 (ko) | 위궤양의 예방 및 치료에 효과가 있는 소엽 추출물의 제조방법과 그 용도 및 그로부터 버베린을 얻는 공정 | |
| KR101625262B1 (ko) | 레보캐리마이신, 약학 조성물, 제조방법 및 응용 | |
| JP2023507704A (ja) | 菌株をベースとする組成物および抗炎症剤としてのその使用 | |
| JP2023507048A (ja) | 菌株およびベリーエキスをベースとする組成物ならびに抗炎症剤としてのその使用 | |
| JP7395622B2 (ja) | 新規なフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株ｅｂ－ｆｐｄｋ１１およびその用途 | |
| KR101409194B1 (ko) | 에쿠올 농도 조절제 | |
| KR100996056B1 (ko) | 대장염 발생 예방 효능을 가진 락토바실러스 브레비스에이치와이7401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 | |
| CN111548954B (zh) | 四种蒽醌类化合物及其制备方法和用途 | |
| Chaleshtori et al. | Antibacterial effects of the methanolic extract of Glycine Max (Soybean) | |
| KR101689746B1 (ko) | 프로바이오틱스로 사용될 수 있는 신규 유산균 및 이의 용도 | |
| WO2010131910A2 (ko) | 발효차를 함유하는 혈액 순환 개선용 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 및 건강 식품 조성물 | |
| KR20130114942A (ko) | 신규한 바실러스 서브틸리스 ｂｃｎｕ 9169 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물 | |
| KR101142598B1 (ko) | 다시마 정유 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물 | |
| CN117143769A (zh) | 一株既能转化甘草酸又能转化芦丁和大豆苷的植物乳植杆菌ccfm1275 | |
| CN109985027B (zh) | 杨梅醇在制备抗革兰阴性细菌毒力药物中的应用 | |
| CN116747245A (zh) | 动物双歧杆菌乳亚种bx-245在抑菌和/或生产功能活性物质中的应用 | |
| KR101882475B1 (ko) | 베타-글루코시다제 활성을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도 | |
| KR101077202B1 (ko) | 감잎으로부터 추출된 헬리코박터 파이로리균에 대한 항균성추출물 | |
| JP7479521B2 (ja) | 新規なフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイｅｂ－ｆｐｄｋ９菌株およびその用途 | |
| KR101644607B1 (ko) | 흑미 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 파이로리 유래 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강식품 | |
| KR20180120933A (ko) | 류코노스톡 메센테로이데스 신균주 및 이를 이용해 제조한 브로컬리 발효물을 유효성분으로 포함하여 대장염 예방, 치료 또는 개선 기능을 갖는 조성물 | |
| KR102177552B1 (ko) | 락토바실러스 프란타룸 g72 균주를 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 조성물 | |
| KR101376629B1 (ko) | 신규한 락토바실러스 아리조넨시스 ｂｃｎｕ 9200 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물 | |
| KR101783673B1 (ko) | 유아 분변에서 분리한 균주 및 이를 이용한 항산화 기능을 갖는 발효유의 제조방법 | |
| KR102506366B1 (ko) | 락토바실러스 플란타럼 ku15120 균주 또는 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20120905 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130906 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140905 Year of fee payment: 13 |
|
| J204 | Request for invalidation trial [patent] | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR INVALIDATION REQUESTED 20141008 Effective date: 20150331 |
|
| J121 | Written withdrawal of request for trial | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150904 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160906 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170904 Year of fee payment: 16 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180905 Year of fee payment: 17 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190902 Year of fee payment: 18 |