JP2001270835A - 胃潰瘍の予防及び治療に効果的な蘇葉抽出物とその用途及びその抽出物からベルベリンを得る工程 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 胃潰瘍の予防及び治療に効果的な蘇葉抽出物
とその用途及びそれからベルベリンを得る工程を提供す
る。 【解決手段】 蘇葉に対して約５〜２０倍重量の水を添
加し、８０〜１２０℃で６〜１５時間熱水抽出し、濾液
を４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮して製造した熱水抽出
物と、前記生薬素材添加量に対しておよそ５〜２０倍重
量の５０〜７０％のエタノールを添加した後、５０〜９
０℃で４〜８時間抽出し、その濾液を４０〜７０ｃｍＨ
ｇで減圧濃縮して製造した溶媒抽出物の１種以上を含
み、ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性とそのウレ
アーゼ活性抑制、胃上皮細胞定着性抑制、インターロイ
キン−８精製抑制等の効果を有する。また、本発明のベ
ルベリンは前記蘇葉抽出物からクロロホルムその他の有
機溶媒を用いて得た水溶層をＸＡＤ−７、シリカカラム
クロマトグラフィにより分画し、予備ＴＬＣで分離し蘇
葉抽出物の主要有効成分となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は胃潰瘍の予防及び治
療に効果的な蘇葉抽出物とその用途及びそれからベルベ
リンを得る工程に関し、より具体的には、胃炎、胃潰瘍
の原因菌として知られるヘリコバクターピロリに対して
抗菌活性を有する胃潰瘍の予防及び治療に効果的な蘇葉
抽出物とその用途及びそれからベルベリンを得る工程に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘリコバクターピロリは１９８３年ウォ
レンとマーシャルにより分離された後（Ｌａｎｃｅｔ，
１９８３，１，１２７３−１２７５）、胃炎及び十二指
腸潰瘍の原因菌と明かされ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ
ｓ．，１９９０，１６１，６２６−６３３；Ａｍ．Ｊ．
Ｍｅｄ．，１９９１，９１，５６６−５７２）、現在は
胃癌発病因子の一つと認められ全世界的な関心と研究の
対象となっている。ヘリコバクターピロリは胃粘膜上皮
細胞間の接合部に棲息するグラム陰性肝菌で、最適ｐＨ
は７．０〜７．４であり、３０〜３７℃の微好気的条件
で生長するが、このような条件が充足されないか又は環
境の変化が生ずると、コッコイド（球菌状）形態への変
化が観察される。その病原性因子として最も代表的な特
徴である強力なウレアーゼの生産能と胃粘膜層に対する
付着及び移動を可能にするフラジェラ（鞭毛）などがあ
り、また、Ｖａｇ Ａ、Ｃａｇ Ａ、リポ多糖類などを
含む細胞毒が研究されている。

【０００３】これまでは、ヘリコバクターピロリによる
消化器疾患の予防及び治療は３重化学療法に代表される
多様な抗生物質に依存しているが、持続的な使用による
耐性菌の出現又は再発性疾病の危険により依然としてそ
の限界が指摘されている。これを克服するための努力と
してワクチンの開発のための免疫学的方法又は乳酸菌を
用いるアプローチ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａ
ｌ．，１９９５，７９，４７５−４７９；Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，１９８９，２７，２３２８
−２３３０）などが試されている。

【０００４】最近では、多様な天然物素材からヘリコバ
クターピロリを抑制し得る活性成分を探し出すための努
力が持続されている。オオタ（Ｏｈｔａ）などはニンニ
ク抽出物（ｇａｒｌｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ）から多様な
活性物質を分離報告し（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇ
ｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１９９９，
４３，１８１１−１８１２）、マベ（Ｍａｂｅ）などは
緑茶内のカテキン類化合物に対し、試験管内でだけでな
く生体内水準でヘリコバクターピロリ抑制能を確認した
ことがある（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａ
ｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１９９９，４３，１７８
８−１７９１）。そのほかにも、イブキジャコウソウ
（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，１９９６，８
０，６６７−６７２）又は多様なフラボノイド（Ａｒｚ
ｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１
９９５，４５，６９７−７００）からも強力な活性が報
告されている。特に、最近には漢方素材から活性植物を
探索するための努力が日本国と韓国を中心に活発に展開
されている（Ｊ．Ｔｒａｄ．Ｍｅｄ．，１９９５，１
２，１２９−１３６；新薬の臨床，１９９７，４６，４
９−５３；Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９９
８，２１，９９０−９９２）。

【０００５】本発明者らは胃潰瘍の予防と治療に食用と
薬用に同時に使用される蘇葉を使用しようとした。蘇葉
（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ ｖａｒ．ａ
ｃｕｔａ ＫＵＤＯ）は紫蘇とも言われ、漢方では発
汗、止血、鎮咳、風疾（中風）、鎮痛、鎮静、利尿など
に使用してきた。蘇葉は紫蘇科（Ｌａｂｉａｔａｅ）に
属する１年生草で、花は８〜９月に薄い紫色で咲く。日
本国では“シソ”と言われ、香辛料及び食用色素として
重要な位置を占めている。蘇葉には主としてアントシア
ニンが多様に含有されており、ペリロサイド（ｐｅｒｉ
ｌｌｏｓｉｄｅ）などのグルコシド物質が多く報告され
ている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．，１９９４，３７，５４
３−５４６；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．，１９９２，３１，
３２６５−３２６７）。

【０００６】そこで、本発明者らは食用素材である蘇葉
からヘリコバクターピロリに対する抗菌活性、ウレアー
ゼ活性などの直接的な除菌効果と胃内定着性、インター
ロイキン−８生成抑制などの効能を確認し、これに対す
る有効成分を同定しようとした。また、蘇葉抽出物と有
効成分を用いる胃潰瘍予防と治療用食品及び薬品を提供
しようとした。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の主目的は、食
用素材である蘇葉から胃炎及び胃、十二指腸潰瘍の原因
菌であるヘリコバクターピロリに対して抗菌活性、ウレ
アーゼ活性、胃内定着性、インターロイキン−８生成抑
制などの効能を確認し、これに対する有効成分を同定し
て提供することを目的とする。

【０００８】また、本発明のほかの目的は、蘇葉抽出物
と有効成分を用いる胃潰瘍予防及び治療用食品と薬品を
提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは昔から漢方
で発汗、止血、鎮咳、風疾（中風）、鎮痛、鎮静、利尿
などに使用してきながら食用にも使用した蘇葉を熱水抽
出して、国内の胃潰瘍患者から分離したヘリコバクター
ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＫＳ ５１菌下部に対する
抗菌活性を確認した。この蘇葉抽出物に対してヘリコバ
クターピロリウレアーゼ活性抑制と胃内定着抑制効果、
そしてヘリコバクターピロリによる胃炎発生メカニズム
に関与するインターロイキン−８の生成抑制効果を確認
した。また、蘇葉からカラムクロマトグラフィ（ＸＡＤ
−７，シリカ、セファデックスＬＨ−２０）と薄層クロ
マトグラフィを実施して、その有効成分としてベルベリ
ン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）を分離、同定した。

【００１０】本発明は、ヘリコバクターピロリに対する
抗菌活性及びヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制
効果、胃上皮細胞定着性抑制効果、インターロイキン−
８生成抑制効果を有するように、生薬素材である蘇葉を
熱水抽出し濃縮して製造した熱水抽出物と、前記生薬素
材である蘇葉を溶媒抽出し濃縮して製造した溶媒抽出物
との中で１種以上を含むことを特徴とする胃潰瘍予防及
び治療効果を有する蘇葉抽出物を提供する。

【００１１】前記熱水抽出物は、前記蘇葉に一定量の水
を添加し、高温で一定時間熱水抽出した後、その濾液を
減圧濃縮することで製造される。好ましくは、蘇葉に添
加される水の量は蘇葉の重量に対しておよそ５〜２０倍
添加され、８０〜１２０℃で６〜１５時間熱水抽出さ
れ、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮することで製造され
る。

【００１２】前記溶媒抽出物は、前記蘇葉に一定量のエ
タノールを添加し、高温で一定時間抽出した後、その濾
液を減圧濃縮することで製造される。好ましくは、エタ
ノールは蘇葉の重量に対しておよそ５〜２０倍添加さ
れ、５０〜９０℃で４〜８時間抽出し、４０〜７０ｃｍ
Ｈｇで減圧濃縮することで製造される。

【００１３】前記方法により製造された蘇葉抽出物（熱
水抽出液及び／又は溶媒抽出液）を有効成分として含有
して発酵乳又は飲料に製造できる。また、前記方法によ
り製造された蘇葉抽出物を有効成分として含有し、これ
に薬剤学的に許容される及び補助剤を混合し、薬剤学的
に許容される方法で剤形化して薬学製剤を製造すること
ができる。

【００１４】

【発明の実施の形態】蘇葉抽出物（特に、熱水抽出物）
の製造 熱水抽出物は蘇葉に一定量の水を添加し、高温で一定時
間熱水抽出した後、その濾液を減圧濃縮することで製造
される。好ましくは、蘇葉に添加される水の量は蘇葉の
重量に対しておよそ５〜２０倍添加され、８０〜１２０
℃で６〜１５時間熱水抽出され、４０〜７０ｃｍＨｇで
減圧濃縮することで製造される。

【００１５】本発明の実施例１においては、蘇葉１５０
ｇを加熱循環式抽出タンクに入れ、水１３５０ｍｌを加
え９５℃で８時間抽出した後、１４９μｍの濾過布で濾
過し、４０〜７０ｃｍＨｇで５０℃で減圧濃縮すること
により、６５ｂｒｉｘ°の蘇葉濃縮液３７ｇを得た（実
施例１参照）。

【００１６】蘇葉溶媒抽出物の製造 溶媒抽出物は、蘇葉に一定量のエタノールを添加し、高
温で一定時間抽出した後、その濾液を減圧濃縮すること
で製造される。好ましくは、エタノールは蘇葉の重量に
対しておよそ５〜２０倍添加され、５０〜９０℃で４〜
８時間抽出し、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮すること
で製造される。

【００１７】本発明の実施例２においては、蘇葉１ｋｇ
を加熱循環式抽出タンクに入れ、５０〜７０％のエタノ
ール１０ｋｇを加え５５〜８５℃で４〜１５時間抽出し
た後、１４９μｍの濾過布で濾過し、４０〜７０ｃｍＨ
ｇで減圧濃縮することにより、固形分が０．１〜２０％
である抽出液を得た。これにデキストリンなどの副溶剤
を混合して濃縮度１０〜７０ｂｒｉｘ°の蘇葉溶媒抽出
物を得た（実施例２参照）。

【００１８】蘇葉からのベルベリンの分離 蘇葉からベルベリンを分離するためには、蘇葉抽出物に
蒸留水（水）と有機溶媒を加えて混合した後、有機溶媒
層を除去し、水溶層をＸＡＤ−７カラムクロマトグラフ
ィに入れ、アセトンとメタノールを加えて有機溶媒溶出
液を得、前記有機溶媒溶出液からシリカカラムクロマト
グラフィより分画液を得、前記分画液から予備ＴＬＣ
（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＴＬＣ）によりベルベリン
を分離することができる。

【００１９】前記有機溶媒の好ましい例は、クロロホル
ム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル及び酢酸エチル
である。

【００２０】多様な天然物が蘇葉の二次代謝産物として
報告されたことがあるが、そのなかで抗ヘリコバクター
ピロリ活性を有する物質は知られていないため、抽出物
に存在する種々の成分から抗ヘリコバクターピロリ活性
物質をいろいろの分離技法で分離した。蘇葉抽出物に対
する有機溶媒分画により非水溶性分画を分離した後、水
溶性分画に対してＸＡＤ−７カラムクロマトグラフィを
実施して水溶層内に存在する多量の糖成分を除去した。
以後、シリカカラムクロマトグラフィと薄層クロマトグ
ラフィ（ＴＬＣ）など分離技法により分離された活性分
画から単一の有効成分を得ることができる。各分離段階
で得られた分画に対して抑制環法で活性を追跡し、活性
物質の分離程度はＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析により確認し
た（実施例３参照）。

【００２１】ベルベリンの同定 クロマトグラフィにより活性成分が単一物質として分離
されることにより、ＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐ
ｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔ
ｒｏｓｃｏｐｙ）とＮＭＲ（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎ
ｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によりその構造を決定
して活性物質の構造を確認し、この構造がイソキノリン
系列のアルカロイド物質であるベルベリンと同定され
た。ＥＳＩ−ＭＳ測定で［Ｍ］＋が３３６と観察され、
１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで水素と炭素
の数を確認して分子式がＣ₂₁Ｈ₂₁ＮＯ₃であることが分
かった。以下、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、ＤＥＰＴ、ＨＭ
ＱＣ、ＨＭＢＣなどの２Ｄ−ＮＭＲ実験及びＦＴ−ＩＲ
スペクトルから物質の構造式を確認し、このような結果
がベルベリン標準物質のスペクトルと正確に一致するこ
とを確認した（実施例４参照）。

【００２２】抗菌活性 蘇葉抽出物とその有効成分であるベルベリンがヘリコバ
クターピロリに対して有する抗菌活性をヘリコバクター
ピロリの寒天培地と液体培地でそれぞれ確認した。寒天
培地を用いる抑制環測定において、蘇葉抽出物は１０ｍ
ｇ／ｍｌ以下の低濃度では抑制環を形成することができ
なかったが、２０ｍｇ／ｍｌの濃度では直径１８ｍｍの
抑制環を形成することが観察された。ベルベリンの場合
には、２．０ｍｇ／ｍｌの低濃度でも２５ｍｍの抑制環
を形成することにより強力な抗菌活性を表した。前記実
験で蘇葉抽出物及びベルベリンが強力な抗菌活性を確認
することにより、ヘリコバクターピロリの液体培養を通
じて抽出物とベルベリンのヘリコバクターピロリに対す
る最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。二倍希釈法によ
り濃度の異なる素材を液体培地にそれぞれ溶かし、各培
地に菌を接種した後、菌の生長抑制を、生菌数、ウレア
ーゼ活性、菌懸濁度の測定により観察した。三つの測定
方法とも濃度依存的に素材が菌の生長を抑制することが
観察され、蘇葉抽出物とベルベリンはそれぞれ２５０μ
ｇ／ｍｌと１２．５μｇ／ｍｌが最小阻止濃度であるこ
とが測定された（実施例５、６参照）。

【００２３】ヘリコバクターピロリ胃内定着抑制効果 前記抗菌活性とは別にヘリコバクターピロリの胃表皮細
胞定着に対する蘇葉抽出物の抑制効果を観察するため、
胃上皮腫瘍細胞であるＡＧＳ細胞培養液にヘリコバクタ
ーピロリ接種前と接種後にそれぞれ濃度別に素材を添加
して予防と治療の２方法で抑制能を測定した。ヘリコバ
クターピロリ接種に先立って、素材を投与した予防効果
測定群においては、２％の素材濃度で９８％の効果を示
し、１％と０．５％濃度でも６０％以上の高い効果を示
した。素材を接種後に投与した治療効果測定群において
も、２％素材濃度で８０％、１％と０．５％の濃度では
４０％以上の効果が観察されたが、予防効果よりは抑制
能が低いことが判明した（実施例７参照）。

【００２４】ヘリコバクターピロリ感染により誘導され
るインターロイキン−８生成抑制効果 胃腸及び小腸の上皮細胞がバクテリアに露出されると、
サイトカインの生成を誘導することになり、このような
サイトカインの増加はヘリコバクターの感染による炎症
反応を起こす原因として知られている。ヘリコバクター
ピロリの場合、インターロイキン−８が胃上皮細胞に好
中球又はマクロファージを活性化させる代表的なサイト
カインとして知られている。したがって、感染された組
織細胞のインターロイキン−８生成量の減少により素材
による感染抑制の効果を確認することができる。ＡＧＳ
細胞にヘリコバクターピロリを感染させた後、１％（ｗ
／ｖ）濃度の蘇葉抽出物を投与し、インターロイキン−
８の生成量を測定した結果、対照群に比べＡＧＳ細胞に
よるインターロイキン−８の生成量が８５％減少するこ
とが観察された（実施例８参照）。

【００２５】動物実験によるヘリコバクターピロリ感染
抑制効果の確認 ヘリコバクターピロリ感染に対する蘇葉抽出物の予防と
治療効果を４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスで確認した。そ
の結果、蘇葉熱水抽出物をまず投与してヘリコバクター
ピロリの感染を予防した場合、ヘリコバクターピロリの
ウレアーゼ活性測定とウレアーゼ活性測定の結果、それ
ぞれ９２．５％と８７．５％の予防率を示した。

【００２６】また、ヘリコバクターピロリをまず感染さ
せた後、選択された乳酸菌を投与した治療の側面では、
蘇葉熱水抽出物を投与した場合、生菌水とウレアーゼ活
性測定の結果、それぞれ８２．５％と８０．０％の治療
率を示した。

【００２７】したがって、ヘリコバクターピロリの感染
に対して蘇葉抽出物を使用すると、高い予防と治療効果
が得られることを確認した（実施例９参照）。

【００２８】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明する。しかし、つぎの実施例は本発明の範囲を限
定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲で当業
者による通常の変化が可能である。

【００２９】実施例１ 蘇葉の熱水抽出 食用と薬用の両方に使用されている蘇葉から熱水抽出物
を製造した。蘇葉１５０ｇを加熱循環式抽出タンクに入
れ、水１３５０ｍｌを加えた後、およそ９５℃で８時間
抽出して粗抽出液を得た。前記粗抽出液を１４９μｍの
濾過布で濾過した後、５５ｃｍＨｇで減圧濃縮して６０
ｂｒｉｘ°以上の蘇葉濃縮液３７ｇを得た。

【００３０】実施例２ 蘇葉の溶媒抽出 蘇葉１ｋｇを加熱循環式抽出タンクに入れ、６０％エタ
ノール１０ｋｇを加え６０℃で１０時間抽出した後１４
９μｍの濾過布で濾過し、５５ｃｍＨｇで減圧濃縮して
固形分１０％の抽出液を得た。これにデキストリンなど
の副溶剤を混合して濃縮度が４０ｂｒｉｘ°である生薬
濃縮液を製造した。

【００３１】実施例３ 蘇葉からのベルベリン分離 蘇葉に存在する抗ヘリコバクターピロリ活性物質を同定
するため、実施例１で製造された蘇葉抽出物に対し、図
１に示すように、順次クロマトグラフィ技法を実施して
単一の主活性物質を分離した。各分離段階で分けられた
分画に対しては抑制環法で活性を確認し、分離の程度を
ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析で観察した。

【００３２】１）抑制環方による抗菌活性の確認 活性を確認しようとする分画物を一定濃度でメタノール
に溶かした後、０．４５μｍフィルタで濾過した。濾過
液２０μｌを滅菌されたディスク（ＢａｃｔｏＣｏｎｃ
ｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｄｉｓｋ， Ｄｉｆｃｏ， Ｕ．
Ｓ．Ａ．）に吸収させ、ディスクが乾燥すると、２０μ
ｌを更に滴下した後、溶媒が完全に除去されるまで無菌
条件で放置した。培養２４〜４８時間を経たヘリコバク
ターピロリをブルセラ寒天培地に塗抹し、その上にディ
スクを置いた後、プレートを１０％ＣＯ₂培養器で３７
℃で７２時間培養した。分画物の活性はディスク周囲に
形成された抑制環の大きさで確認した。

【００３３】２）分画物の分析 分画物の分析はＴＬＣとＨＰＬＣにより行われた。ＴＬ
Ｃプレートはメルク社の製品（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ
６０ Ｆ２５４， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。展開溶
媒はＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ＝７：１：０．５
とトルエン／ＣＨＣｌ₃＝１：１の２種を使用し、ヨー
ド蒸気とＵＶ（２５４ｎｍ）で確認した。

【００３４】ＨＰＬＣ分析に使用されたカラムはウォー
ターズ社の製品（ｍｉｃｒｏｂｏｎｄａｐａｋ，Ｃ１
８，３００×４．６ｍｍ）であり、移動相は水／ＭｅＯ
Ｈを１．０ｍｌ／分の流速にして用いた。分析は２８５
ｎｍで行い、２０μｌを注入して分析した。

【００３５】３）有機溶媒による水溶性物質の分画 有機溶媒に対する溶解度と極性の差を用いて蘇葉抽出物
内の物質を水溶層と有機溶媒層に分離した。適切な有機
溶媒の選定のため、クロロホルム、ジクロロメタン、ジ
エチルエーテル、酢酸エチルの４種の有機溶媒を比較し
た結果、クロロホルムとジクロロメタンでは０．９％
（ｗ／ｗ）の物質が移動し、残りの有機溶媒では、０．
２％以下しか移動しなかった。また、ジクロロメタンが
クロロホルムより人体にもっと有害であるので、クロロ
ホルムを利用し、抽出物を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留
水に溶かした後、これに同じ容積のクロロホルムを分離
ファネル（ｓｅｐａｒａｔｏｒｙ ｆｕｎｎｅｌ）で２
回分画して水層から非極性物質を除去した。

【００３６】４）ＸＡＤ−７カラムクロマトグラフィ 水溶層を濾過紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．４）で濾過し
て沈殿物を除去した後、減圧濃縮し、再び蒸留水を加え
て２５ｍｇ／ｍｌ濃度の抽出溶液を製造した。アンバー
ライトＸＡＤ−７（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７）
（Ｎｏｎｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｄｓｏｒ
ｂｅｎｔ， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）
をオープンカラム（ｏｐｅｎ ｃｏｌｕｍｎ）に充填し
た後、メタノールで十分に洗浄し、再び２倍容積の蒸留
水を注いでメタノールを除去した。樹脂に対して１：１
４（乾燥抽出物重量／樹脂重量）の抽出物溶液をカラム
に滴下した後、標本容積の６０倍の蒸留水でカラムを溶
出させて糖類を含む水溶性物質を除去した。標本容積の
８０倍のメタノールを再び溶出させて非水溶性物質を
得、最後にメタノール容積の半分のアセトンを加えて洗
浄した。アセトン分画物とメタノール分画はＴＬＣで確
認した結果、同じパターンを示し、抗菌活性も同じ水準
であったので、２分画物を合わせた。

【００３７】各溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ）を減圧濃縮した後、定量的にヘリコバクターピロリ
に対する抗菌活性を測定した結果を以下の表１に示し
た。水溶層では抗菌活性が全く表われなかったし、活性
が有機溶媒層に全て移動されたことが確認できた。溶出
液から得られた水溶性分画とメタノール分画に対して
１．０ｍｌずつを取った後、フェノール−サルファリッ
ク法（ｐｈｅｎｏｌ−ｓｕｌｆｕｒｉｃ ｍｅｔｈｏ
ｄ）を実施して２分画内の総当量を定量した。抽出液溶
液をＸＡＤ−７により溶出させた場合、水層での糖含量
は９７．０ｍｇ／Ｌと表われ、有機溶媒層では２．９ｍ
ｇ／Ｌの糖含量が測定された。すなわち、ＸＡＤ−７カ
ラムを用いて抽出物から９６％以上の糖を除去すること
ができた。

【００３８】

【表１】

【００３９】５）シリカカラムクロマトグラフィ ＸＡＤ−７を通過した有機溶媒分画を少量のメタノール
に溶かした後、十分な量のセライト（ｃｅｌｉｔｅ）
（Ｙａｋｕｒｉ，Ｊａｐａｎ）を注ぎ、減圧濃縮器でメ
タノールを全て除去して抽出物をセライトに吸着させ
た。カラムにグラスウールを詰めた後、その上にセライ
トを表面が水平となるようにパッキングを行った。シリ
カゲル（Ｃａｔ．Ｎｏ．１．０９３８５，Ｍｅｒｃｋ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）を高さ８．０ｃｍとなるように注いだ
後真空状態で２０分間圧力を加えて確実にパッキングし
た。減圧下で２００ｍｌのアセトンを注いで不純物を除
去した後、アスピレータ（吸引器）を用いて１２時間乾
燥させた。蘇葉抽出物が吸着されたセライトをシリカカ
ラム上に充填した後、減圧下でメタノールの比率が０％
から５０％まで段階的に増加したクロロホルム／メタノ
ール溶液を順に溶出させた後、チューブに受けた。各分
画をＴＬＣで確認した結果、６分画に分けることがで
き、このなかでＦｒ．５で高活性が観察された。

【００４０】６）予備ＴＬＣ（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ
ＴＬＣ） 活性分画を減圧濃縮した後、ＴＬＣ板（ＴＬＣ ｐｌａ
ｔｅ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．，１．０５７４４，Ｓｉｌｉｃ
ａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４，０．５ｍｍ，Ｍｅｒｃ
ｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の出発線上に吸着させ、ＭｅＯＨ
／ＣＨＣｌ₃／ＡｃＯＨ＝７：２：０．５に展開した。
板を２８０ｎｍで観察したとき、Ｒｆの値がそれぞれ
０．１１〜０．１５、０．１５〜０．２１、０．２２〜
０．３７、０．３７〜０．６４、０．６９〜０．７１で
ある五つのバンドを確認した後、スクレーパで掻いた。
掻き出したシリカはアセトンとクロロホルム／ＭｅＯＨ
（７：１，ｖ／ｖ）溶液で溶出して、吸着された物質を
分離した。抗菌活性を確認した結果、Ｒｆ値が０．１５
〜０．２１である分画（Ｆｒ．５−Ｍ）でのみ活性が表
われた。

【００４１】実施例４ ベルベリンの構造分析 クロマトグラフィの実施により活性成分が単一物質とし
て分離されることによりＥＳＩ−ＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓｓｐｅｃ
ｔｒｏｓｃｏｐｙ）とＮＭＲ（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇ
ｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によりその構造を決定
して、活性物質が図２の構造を有することを確認し、こ
の構造はイソキノリン系列のアルカロイド物質であるベ
ルベリンであると同定された。ＥＳＩ−ＭＳ測定で
［Ｍ］＋が３３６と観察され、１Ｈ−ＮＭＲ（図３、表
２）と１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図４、表３）で水素
と炭素の数を確認して、分子式がＣ₂₁Ｈ₂₁ＮＯ₃である
ことが分かった。以下、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ（図
５）、ＤＥＰＴ（図６）、ＨＭＱＣ（図７）、ＨＭＢＣ
（図８）などの２Ｄ−ＮＭＲ実験及びＦＴ−ＩＲ（図
９）スペクトルから物質の構造式が図２のようであるこ
とを確認し、このような結果はベルベリン標準物質のス
ペクトルと正確に一致した。

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】実施例５ 培地分散（Ｗｅｌｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）方法による
ヘリコバクターピロリ抗菌活性比較 前記実施例１及び２から得られた蘇葉抽出物とベルベリ
ンに対してヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を培
地分散（ｗｅｌｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）法により確認
した。まず滅菌されたシリンダをペトリ皿の適当な位置
に立てた後、２５ｍｌのブルセラ寒天培地を注いで固め
た。予め培養されたヘリコバクターピロリをブルセラブ
ロスに懸濁して吸光度（４５０ｎｍ）を１．２となるよ
うにした。菌懸濁液２００μｌを液体状態のソフト寒天
（０．８％）培地に添加し、これをすぐシリンダ板に注
いで均等に分散させた。この板を１０％の二酸化炭素イ
ンキュベータ（ＣＯ₂ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に入れて
培地を固めた後、シリンダをピンセットで除去し、各試
料をシリンダにより形成された培地に１７０μｌずつ加
えた。この板を３７℃、１０％ＣＯ₂の条件で７２時間
培養した後、形成されたクリアゾーンの大きさを測定し
て抗菌効果を比較した。

【００４５】培地分散法による蘇葉抽出物と蘇葉抽出物
とベルベリンのヘリコバクターピロリに対する抗菌活性
結果を表４に示した。蘇葉抽出物は２．０ｍｇ／ｍｌと
２０．０ｍｇ／ｍｌの２濃度でブルセラブロスに溶かし
た後、フィルトレーションで除菌して使用し、ベルベリ
ンは２．０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶かし除菌し
て使用した。対照群でＤＭＳＯの抗菌活性の有無を確認
した。蘇葉抽出物は２．０ｍｇ／ｍｌの濃度ではクリア
ゾーンを形成することが全くできなかったが、２０．０
ｍｇ／ｍｌの濃度では１８ｍｍ程度のクリアゾーンを形
成して高い抗菌活性を表した。その有効成分であるベル
ベリンの場合は、２．０ｍｇ／ｍｌの濃度でクリアゾー
ンが２５ｍｍ程度と非常に高い活性を表わした。反面、
対照群であるＤＭＳＯはクリアゾーンを全く形成できな
かったので、ベルベリン活性に対する溶媒の影響がない
ことを確認した。

【００４６】

【表４】

【００４７】実施例６ 最小阻止濃度測定によるヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐ
ｙｌｏｒｉ）抗菌活性の比較 前記実施例１及び２から得られた蘇葉抽出物とベルベリ
ンに対してヘリコバクターピロリに対する抗菌活性を最
小阻止濃度（ＭＩＣ：Ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）測定により確認
した。

【００４８】各試料を２４培地板（ｗｅｌｌ ｐｌａｔ
ｅ）に２倍希釈法で希釈して９００μｌ／培地となるよ
うにした。２４時間培養したヘリコバクターピロリブロ
ス培養物から１．０ｍｌを取り、１０６ｃｆｕ／ｍｌの
濃度に希釈し各培地に１００μｌずつ添加した（ｔｏｔ
ａｌ ｖｏｌｕｍｅ，１．０ｍｌ）。板を１０％ＣＯ ₂
条件でシェーキング培養しながら時間別に標本を取り、
生菌数、ウレアーゼ活性、細胞懸濁度による最小阻止濃
度（ＭＩＣ）を測定した。

【００４９】１）生菌数の測定による最小阻止濃度（Ｍ
ＩＣ） 生菌数の測定は培養３６時間後に板から培地当たり１０
０μｌを取り１０３倍希釈した後、ブルセラ寒天板に塗
抹し、１０％ＣＯ₂インキュベータで３７℃、７２時間
培養した後、現れた菌の集落を計数した。

【００５０】２）ウレアーゼ活性測定による最小阻止濃
度（ＭＩＣ） ウレアーゼ活性の測定は培地当たり１００μｌを取り、
１．０ｍｌのウレアＲブロスに添加し、これを１０％Ｃ
Ｏ₂インキュベータで６時間培養した後、５６０ｎｍで
吸光度を測定した。

【００５１】３）細胞懸濁度の測定による最小阻止濃度
（ＭＩＣ） 細胞懸濁度の測定は、培養完了後、各培地からブロスを
全てエッペンドルフチューブに移し、再度培地に１．０
ｍｌの蒸留水で洗浄して加えた。チューブを１２，００
０×ｇで５分間遠心分離した後、上澄み液を捨て、細胞
ペレットを４００μｌの蒸留水に懸濁させた後、２００
μｌを取り、９６培地板に移し６６０ｎｍで吸光度を測
定した。

【００５２】ヘリコバクターピロリに対する蘇葉抽出物
とベルベリンの抗菌活性を生菌数の測定による最小阻止
濃度（ＭＩＣ）結果を表５に示した。蘇葉抽出物の場
合、１，０００μｇ／ｍｌ以上の濃度では２．０×１０
８ｃｆｕ／ｍｌのヘリコバクターピロリが完全に阻止さ
れることを確認し、ベルベリンの場合は２５μｇ／ｍｌ
以上の濃度でヘリコバクターピロリが完全に阻止される
ことを確認し、１２．５μｇ／ｍｌの濃度でも５０％以
上が阻止されることが分かった。

【００５３】

【表５】

【００５４】△対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）：２．０×１
０８ｃｆｕ／ｍｌ ＋＋：菌数が多くて計数不可 蘇葉抽出物とベルベリンによるヘリコバクターピロリウ
レアーゼ活性抑制程度による最小阻止濃度（ＭＩＣ）結
果を図１０に示した。同図に示すように、各素材のヘリ
コバクターピロリに対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決
定するため、ヘリコバクターピロリ培養６０時間後、ウ
レアーゼの活性をＲブロスにより測定した。

【００５５】図１０に示すように、蘇葉抽出物の場合、
ウレアーゼ分析試験により測定された最小阻止濃度（Ｍ
ＩＣ）は２５０ｍｇ／ｍｌの濃度と決定され、これは以
前の実験結果である１００ｍｇ／ｍｌと違いを表す。こ
のことは、測定時、培養時間（４８ｈｒ ｖｓ．６０ｈ
ｒ）の違いと測定方法（Ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｃｏ
ｕｎｔｉｎｇ ｖｓ．ｕｒｅａｓｅ ａｓｓａｙ）によ
って違いを表すことで説明される。ベルベリンの最小阻
止濃度（ＭＩＣ）は１２．５μｇ／ｍｌと決定された。
ベルベリンに対する溶媒として使用されたＤＭＳＯも高
濃度では細胞成長に影響を及ぼすことが分かるが、分画
物の活性が依然として存在する低濃度では全く阻害効果
が表われないので、分画物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）の
決定には影響を及ぼさないことが分かる。

【００５６】そして、細胞懸濁度による最小阻止濃度
（ＭＩＣ）の決定は蘇葉抽出物とベルベリンにより培養
されて６０時間後に現われた増殖抑制程度を細胞懸濁度
により測定したもので、その結果は図１１に示されたと
おりである。蘇葉抽出物は０．５ｍｇ／ｍｌの濃度まで
は完全な抗菌活性を表し、２５０、１２５ｍｇ／ｍｌの
濃度ではそれぞれ５０、３０％の阻止率を表わした。こ
の結果は、以前に生菌数の測定により確認された最小阻
止濃度（ＭＩＣ）（１００μｇ／ｍｌ）と一致する結果
と考えられる。また、ベルベリンの最小阻止濃度（ＭＩ
Ｃ）は１２．５μｇ／ｍｌで、ウレアーゼ分析試験での
結果と同じに決定された。

【００５７】実施例７ ヘリコバクターピロリ胃内定着抑制効果 ヘリコバクターピロリの胃内定着抑制効果をつぎのよう
に予防治療の観点で確認した。

【００５８】Ａ．予防効果の測定 ＡＧＳ細胞（ＡＧＳ ｃｅｌｌ，１０６ｃｆｕ／ｗｅｌ
ｌ）を６−培地板に付着させた後、各素材とＲＰＭＩ
１６４０（１０％ ＦＢＳ）培地を入れ３時間インキュ
ベーションを行った。ヘリコバクターピロリを１０７細
胞／ウエル濃度で摂取し再び１時間インキュベーション
を行った。板シェーカーで３回ウォッシングした後、滅
菌蒸留水１．０ｍｌを入れ１時間反応してＡＧＳ細胞を
リシス（溶離）させた。細胞を収集して遠心分離した細
胞ペレットにウレアＲブロス１．０ｍｌを入れ、３７℃
で１時間反応させてＯ．Ｄ（５６０ｎｍ）を測定した。

【００５９】Ｂ．処理（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ） ＡＧＳ細胞（１０６細胞／ウエル）を６培地板に付着さ
せた後、ヘリコバクターピロリを１０７ｃｆｕ／ウエル
（０．１ｍｌ）接種して３時間インキュベーションを行
った。０．２ｍｌの素材と２．７ｍｌのＲＰＭＩ １６
４０（１０％ＦＢＳ）培地を入れ、１時間反応させた。
板シェーカーで３回ウォッシングした後、滅菌蒸留水
１．０ｍｌを入れ１時間ＡＧＳ細胞をリシス（溶離）さ
せた。細胞を収集して遠心分離したセルペレットにウレ
アＲブロス１．０ｍｌを入れ３７℃で１時間反応させて
Ｏ．Ｄ（５６０ｎｍ）を測定した。

【００６０】蘇葉抽出物をそれぞれヘリコバクターピロ
リ接種前と接種後にＡＧＳ細胞培地に添加し、その付着
阻害率を測定した結果を図１２に示した。同図に示すよ
うに、０．５％、１％、２％の添加時、濃度の異なる実
験群でヘリコバクターピロリ感染以前に蘇葉を投与した
群が感染以後に蘇葉を投与した群よりは高い活性を示す
ことが分かった。特に、予防と治療群とも２％では９８
％と８２％の高い阻害効果を示し、その以下の濃度では
活性に大きい違いがないことが示された。

【００６１】実施例８ ヘリコバクターピロリ感染により誘導されるインターロ
イキン−８生成抑制効果 ヘリコバクターピロリの感染により誘導される胃上皮細
胞でのインターロイキン−８の生成量の変化により蘇葉
抽出物の感染抑制効果を測定した。

【００６２】まず寒天培地で培養されたヘリコバクター
ピロリを１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、４℃、
９，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿された
細胞を１ｍｌのハンクス液 Ｆ１２培地に懸濁し、懸濁
液の少量を取り１：５０に希釈した後、６６０ｎｍで懸
濁度を測定して下記のように濃度を実験条件に合わせ
た。

【００６３】細胞濃度（細胞集団）＝１６．９５×Ａ６
６０×（希釈因子）×１０８／ｍｌ ヘリコバクターピロリ＝１．０８４×１６．９５×５０
×１０８＝９．１８×１０８ ＡＧＳ培養液はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４群に分け２回繰り返
して処理した。Ａ群はＡＧＳのみを培養した群であり、
Ｂ群とＣ群はそれぞれＡＧＳに蘇葉抽出物とヘリコバク
ターピロリのみをそれぞれ処理した。Ｄ群は培地に溶か
した蘇葉抽出物を１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、
１時間後にヘリコバクターピロリ懸濁液１００μｌを
７．５×１０８ｃｆｕ／ｍｌで再び添加した。全群か
ら、培養後０、２、４、６、９時間にそれぞれ培地を取
り、４℃、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、そ
の上澄み液を取った後、エリザ法（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎ
ｅＴＭＨｕｍａｎ ＩＬ−８ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔ
ｄ．）でインターロイキン−８の量を測定した。

【００６４】 Ａ：対照群 Ｂ：蘇葉抽出物処理群 Ｃ：ヘリコバクターピロリ処理群 Ｄ：蘇葉抽出物＋ヘリコバクターピロリ処理群 １）サンプリング 板培地（Ｐｌａｔｅ ｗｅｌｌ）内の培地を収集した
後、４℃、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
上澄み液をエペンドルフチューブに移した後、−７０℃
で貯蔵した。

【００６５】２）標準溶液 ＲＤ５Ｐ（５×）２．０ｍｌをＤ．Ｗ．で５倍に希釈し
た後、５．０ｍｌを取り、ＩＬ−８標準溶液バイアルに
添加して２，０００ｐｇ／ｍｌのストック（ｓｔｏｃ
ｋ）を製造した。２倍希釈により８濃度の１００μｌ標
準溶液を準備した。

【００６６】３）分析試験（Ａｓｓａｙ） 分析希釈液（Ａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔ）（ＲＤ１−
８）１００μｌを板培地に入れ、５０μｌの標本と標準
溶液を添加した。共役（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）溶液１０
０μｌを加えた後、常温で２時間半の間シェーキングを
行った。板を４００μｌのウォッシング緩衝液で６回洗
浄し、これに試薬Ａと試薬Ｂをそれぞれ１：１で混ぜ合
わせた基質溶液２００μｌを添加した。板を３０分間定
置した後、色変化を観察しつつ４９２ｎｍで吸光度を観
察した。

【００６７】ヘリコバクターピロリが胃粘膜の上皮細胞
と相互作用するとき、多様なサイトカインの生成を促進
することになり、このなかでもＩＬ−８の分泌が最も著
しく現れる。そして、ＩＬ−８は胃炎の直接的な原因と
なる好中球又はマクロファージまで誘導することにな
る。したがって、ヘリコバクターピロリ感染により誘導
されるＩＬ−８の生成を抑制することが胃炎発生を抑制
するための１方法となり得る。

【００６８】図１３に培養時間による４群でのインター
ロイキン−８の生成量の変化を示した。ヘリコバクター
ピロリに感染されていない群（Ａ、Ｂ群）では、９時間
経過後にもインターロイキン−８の生成が殆どなかった
が、ヘリコバクターピロリ感染群（Ｃ群）では、６時間
経過時まで急に増加し、その以後におよそ２，５００ｐ
ｇ／ｍｌ水準でインターロイキン−８の量が維持され
た。反面、ＡＧＳを蘇葉抽出物とともに１時間培養した
後、ヘリコバクターピロリを感染させたとき（Ｄ群）、
インターロイキン−８の生成量は著しく減少して、培養
９時間後にも３００ｐｇ／ｍｌ程度とＣ群の１５％水準
に止まることが現れた。したがって、蘇葉抽出物がヘリ
コバクターピロリ感染により誘導、生成されるインター
ロイキン−８の生成量をおよそ８５％程度減少させるこ
とにより胃炎の発生率も減少させることを確認すること
ができた。

【００６９】実施例９ 動物実験によるヘリコバクターピロリ感染の予防と治療
効果の確認 ヘリコバクターピロリの感染に対する蘇葉抽出物の予防
と治療効果をマウスにより確認した。実験に使用された
ＢＡＬＢ／ｃマウスはマウスの胃腸管内に存在してウレ
アーゼ活性を表すヘリコバクターフェリス（Ｈｅｌｉｃ
ｏｂａｃｔｅｒｆｅｌｉｓ）が存在しないものだけを選
別して使用した。使用したＢＡＬＢ／ｃマウスは４週齢
の雌性で、予防と治療各群当たり４０匹を使用し、陽
性、陰性対照群には群当たり２０匹を使用した。マウス
は２５℃、５０％湿度、ＳＰＦ条件で飼育しながら実験
した。この際に、陰性対照群としては、ヘリコバクター
ピロリ懸濁液の代わりに７．５％重炭酸ナトリウム緩衝
液のみを０．５ｍｌずつ経口投与した１５匹のマウスを
使用し、陽性対照群としては、ヘリコバクターピロリを
７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液に２〜４×１０９ｃｆ
ｕ／ｍｌの濃度に懸濁して経口投与した１５匹のマウス
を使用した。

【００７０】１）予防効果 マウスに蘇葉熱水抽出物を飲用水に１ｍｇ／ｍｌの濃度
で混合して一日に１匹当たり１０ｍｌずつ１４日間投与
した後、７．５％重炭酸ナトリウム緩衝液に懸濁した２
〜４×１０９ｃｆｕ／ｍｌのヘリコバクターピロリ菌液
を２日間マウス当たり０．５ｍｌずつ６回にわたり感染
させた。感染６週後、各実験群の胃を摘出し、胃組織内
のヘリコバクターピロリ生菌数とウレアーゼ活性有無を
測定することで、ヘリコバクターピロリ感染に対する予
防効果を確認した。

【００７１】２）治療効果 ヘリコバクターピロリを７．５％重炭酸ナトリウム緩衝
液に２〜４×１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度に懸濁し、この
菌液を２日間マウスに０．５ｍｌずつ６回にわたり感染
させた。ヘリコバクターピロリがマウスの胃内に完全に
定着した感染６週後、蘇葉熱水抽出物を飲用水に１ｍｇ
／ｍｌの濃度で混合して１匹当たり１日に１０ｍｌずつ
３週間投与した。投与後、各実験群の胃を摘出し、胃組
織内のヘリコバクターピロリ生菌数とウレアーゼ活性を
測定することで、ヘリコバクターピロリ感染に対する治
療効果を確認した。

【００７２】３）胃組織内のヘリコバクターピロリ生菌
数とウレアーゼ活性の測定 摘出した胃組織は、胃内固形分を除去した後、迅速に２
等分して１／２は１０％馬血清の添加されたブルセラブ
ロスに浸漬させた後、均質化してブルセラ寒天板に分散
させておいた。板は湿度の高い１０％ＣＯ₂培養器で３
７℃で５〜７日間培養した後、現れたコロニーを確認し
てヘリコバクターピロリの存在有無を確認する。残りの
１／２はウレアブロスに浸漬させ、湿度の高い１０％Ｃ
Ｏ₂培養器で３７℃で５日間培養しつつ色の変化を観察
してヘリコバクターピロリの存在有無を判断した。

【００７３】ヘリコバクターピロリの感染に対する蘇葉
熱水抽出物の予防と治療効果を下記の表６に示した。陰
性対照群の場合、感染６週後にもヘリコバクターピロリ
は全く感染しておらず、陽性対照群の場合は、感染６週
後に１００％ヘリコバクターピロリ感染率を示した。し
かし、蘇葉熱水抽出物をまず投与してヘリコバクターピ
ロリの感染を予防した場合、ヘリコバクターピロリのウ
レアーゼ活性の測定結果とウレアーゼ活性測定の結果、
それぞれ９２．５％と８７．５％の予防率を示した。

【００７４】また、ヘリコバクターピロリをまず感染さ
せた後、選択された乳酸菌を投与した治療の側面におい
て、蘇葉熱水抽出物を投与した場合、生菌数とウレアー
ゼ活性の測定結果、それぞれ８２．５％と８０．０％の
治療率を示した。

【００７５】したがって、ヘリコバクターピロリの感染
に対して蘇葉熱水抽出物を使用すると、高い予防、治療
効果が得られることを確認した。

【００７６】

【表６】

【００７７】実施例１０ 熱、ｐＨ及び消化酵素に対する安定性 蘇葉抽出物が実際胃内でヘリコバクターピロリを阻害す
るためには、胃内の消化酵素及び胃酸による酸性条件で
安定性を維持しなければならない。また、発酵乳のよう
な低酸性条件の食品への利用性を高めるためには、製品
自体が低酸性条件で素材の活性が長時間維持されなけれ
ばならない。また、食品又は薬品の製造工程上加わる熱
処理条件でもその活性が維持されなければならない。し
たがって、蘇葉抽出物に対して熱、ｐＨ、消化酵素に対
する安定性を確認した。

【００７８】１）熱安定性 蘇葉抽出物を５ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶解し五つ
のキャップチューブ（ｃａｐ ｔｕｂｅ）に移した。熱
処理を行わない対照群を除くそれぞれのキャップチュー
ブを６０、８０及び１００℃で１時間ずつ、１２１℃で
１５分間処理し、各サンプルを０．４５μｍ濾過膜で除
菌した。除菌されたサンプルをディスク分散テスト（ｄ
ｉｓｃ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）を用いて抗ヘ
リコバクターピロリ活性を測定した。

【００７９】２）ｐＨ安定性 蘇葉抽出物７０ｍｇを、ｐＨをそれぞれ２．０、３．
０、４．０、５．０に調製した酢酸ナトリウム緩衝液と
ｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液６．０ｍｌに溶かした後、酢
酸と水酸化ナトリウムにてそれぞれのｐＨを合わせ、最
終容積が７．０ｍｌとなるようにした。緩衝溶液を３７
℃で２時間反応させた後、各サンプルを酢酸と水酸化ナ
トリウムでｐＨ７に中和させて容積が１０．０ｍｌとな
るようにした。濾過膜にて除菌した後、ディスク分散テ
ストにより活性の変化を測定した。

【００８０】３）胃液安定性 胃液は４人の成人からそれぞれ食事後３０、６０、９
０、１２０分後、そして空腹状態で採取し冷凍させたも
のを解凍して使用した。胃液４００μｌの入ったテスト
チューブに１００ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶かした
素材５０μｌを添加した。対照群は胃液の代わりにＰＢ
Ｓ緩衝液を使用した。各テストチューブを３７℃の水浴
で３０分間反応させた後、５％炭酸ナトリウムでｐＨ７
に合わせた（最終容積、５００μｌ）。各サンプルに対
する活性変化をディスク分散テストで測定した。

【００８１】蘇葉抽出物をそれぞれの熱処理条件に置い
た場合、図１４に示すように、ヘリコバクターピロリに
対する抗菌活性は対照群と比較して、変化がないものと
して現れた。特に、１２１℃、１５分の殺菌条件でも活
性は全然減少しなかったので、蘇葉の活性は製品の生産
工程上の加熱処理条件により影響を受けないことを確認
した。

【００８２】また、ｐＨ安定性の場合、ｐＨ２〜５の条
件で蘇葉抽出物の活性をｐＨ７の条件で対照群と比較し
た結果、図１５に示すように、蘇葉抽出物のヘリコバク
ターピロリに対する抗菌活性は全てのｐＨ条件で安定し
た。

【００８３】胃液に対する蘇葉抽出物の安定性を各胃液
サンプルと素材を３０分間反応させた後、ヘリコバクタ
ーピロリに対する抗菌活性を確認した。表７に示すよう
に、蘇葉抽出物の抗菌活性は胃液により全然影響を受け
ないことが分かり、このことは、実際の胃腸環境でも蘇
葉抽出物がヘリコバクターピロリの増殖を抑制すること
ができることを意味する。

【００８４】

【表７】

【００８５】実施例１１ 乳酸菌に対する影響 蘇葉抽出物を発酵乳に添加する場合、蘇葉抽出物が有す
る抗菌活性が乳酸菌の生育には影響を及ぼさず、一方ヘ
リコバクターピロリにのみ選択的に作用できなければな
らない。

【００８６】発酵乳の種菌として使用されるラクトバシ
ルス（乳酸菌）、ストレプトコッカス（連鎖球菌）、ビ
フィドバクテリウムに対する蘇葉抽出物の影響をつぎの
ように確認した。まず、ラクトバシルスアシドフィラ
ス、ラクトバシルスカセイ、ストレプトコッカスサーモ
フィルス、ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を１２％スキム
ミルクに接種し３７℃で９時間混合培養した。培養の完
了後、それぞれの選択培地を用いて初期生菌数を測定し
た。蘇葉抽出物は減圧濃縮して６０ｂｒｉｘ°の濃縮液
を製造した後、１．０％（ｖ／ｖ）の濃度で乳酸菌培養
液に添加した。蘇葉抽出物が添加された乳酸菌培養液を
１０日間４℃で冷蔵保管しながら２日間隔で各乳酸菌に
対する選択培地を用いて生菌数を測定した。各乳酸菌に
対する生菌数の測定条件は表８のようである。

【００８７】

【表８】

【００８８】乳酸菌培養液の初期生菌数はラクトバシル
ス５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ、ビフィドバクテリウム３×
１０６ｃｆｕ／ｍｌ、エス．サームフィリウス３．０×
１０９ｃｆｕ／ｍｌであり、６０ｂｒｉｘ°蘇葉抽出物
１．０％（ｖ／ｖ）を乳酸菌培養液に添加し１０日間冷
蔵保管した後にも、それぞれの乳酸菌数が初期生菌数を
そのまま維持していることを確認した。したがって、蘇
葉抽出物のヘリコバクターピロリに対する抗菌活性は乳
酸菌の影響がなく、ただヘリコバクターピロリに対して
のみ選択性を持っていることを確認した。

【００８９】実施例１２ 蘇葉抽出物を用いる発酵乳の製造 脱脂粉乳で無脂乳固形分含有量を８〜２０重量％に調整
した原料乳を７２〜７５℃で１５秒間殺菌した。殺菌さ
れた原料乳を一定温度に冷却した後、ラクトバシルスカ
セイＨＹ ２７８２を１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種
し、培養液がｐＨ４〜５となるまで３７℃で培養し冷却
させた。シロップは果汁濃縮液０．１〜５０重量％、食
餌繊維０．１〜２０重量％、ブドウ糖０．５〜３０重量
％、オリゴ糖０．１〜１５重量、カルシウム０．００１
〜１０重量％、ビタミン０．０００１〜５重量％、蘇葉
抽出物０．１〜５重量％などを溶かして製造し殺菌して
から冷却した。こうして製造されたシロップを前記培養
液と一定割合で混合、撹拌して均質化した後、容器に包
装して発酵乳を製造した。製造された発酵乳は官能検査
の結果、風味、物性、全体的な味において良好な結果を
示した。

【００９０】実施例１３ 蘇葉抽出物を用いる胃潰瘍予防、治療用飲料の製造 蘇葉抽出物１４重量％、ナツメのエキス１．５重量％、
当帰（馬芹）濃縮液７重量％に液状果糖７．４重量％を
混合し、これに精製水を添加、混合してドリンク用瓶に
充填し９０〜９５℃で殺菌した後、室温で冷却して飲料
を製造した。

【００９１】実施例１４ 蘇葉抽出物を用いる胃潰瘍予防、治療用生薬製剤の製造 蘇葉抽出物０．０１〜３０重量％に栄養補助成分（ビタ
ミンＢ₁、Ｂ₂、Ｂ₅、Ｂ₆、Ｅ及び酢酸エステル、ニコチ
ン酸アミド）、オリゴ糖、５０％エタノールを助成分の
５〜１０％となるように添加して高速回転混合器で混合
した。前記混合物に滅菌精製水１０重量％を添加、混合
し、直径１〜２ｍｍの顆粒状に成形した。前記成形され
た顆粒は４０〜５０℃の真空乾燥機で乾燥させた後、１
２〜１４メッシュを通過させて均一に顆粒を製造した。
このように製造された顆粒は適量ずつ押出成形されて錠
剤又は粉末となるか、硬質カプセルに充填されて硬質カ
プセル製品に製造できる。

【００９２】実施例１５ ベルベリンを用いる胃潰瘍予防、治療用生薬製剤の製造 蘇葉抽出物から得られたベルベリン０．００１〜１０重
量％に栄養補助成分（ビタミンＢ₁、Ｂ₂、Ｂ₅、Ｂ₆、Ｅ
及び酢酸エステル、ニコチン酸アミド）、オリゴ糖、５
０％エタノールを助成分の５〜１０％となるように添加
して高速回転混合器で混合した。前記混合物に滅菌精製
水１０重量％を添加、混合し、直径１〜２ｍｍの顆粒状
に成形した。前記成形された顆粒は４０〜５０℃の真空
乾燥機で乾燥させた後、１２〜１４メッシュを通過させ
て均一に顆粒を製造した。この製造された顆粒は適量ず
つ押出成形されて錠剤又は粉末となるか、硬質カプセル
に充填されて硬質カプセル製品に製造できる。

【００９３】

【発明の効果】以上説明したように、本発明は胃潰瘍の
予防及び治療に効果がある蘇葉抽出物とその用途及びそ
れからベルベリンを得る工程に関するもので、生薬素材
である蘇葉に対しておよそ５〜２０倍重量の水を添加し
た後、８０〜１２０℃で６〜１５時間熱水抽出した後、
その濾液を４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮して製造した
熱水抽出物と、前記生薬素材添加量に対しておよそ５〜
１０倍重量の５０〜７０％のエタノールを添加した後、
５０〜９０℃で４〜８時間抽出し、その濾液を４０〜７
０ｃｍＨｇで減圧濃縮して製造した溶媒抽出物の１種以
上を含むことを特徴として、ヘリコバクターピロリに対
する抗菌活性及びヘリコバクターピロリウレアーゼ活性
抑制効果、胃上皮細胞定着性抑制効果、インターロイキ
ン−８精製抑制効果を有する。

【００９４】また、本発明のベルベリンは前記蘇葉抽出
物からクロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテ
ル、酢酸エチルの有機溶媒を用いて得た水溶層をＸＡＤ
−７、シリカカラムクロマトグラフィにより分画し、予
備ＴＬＣで分離してなったもので、前記蘇葉抽出物の主
要有効成分としてベルベリンを容易に得ることができる
効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 蘇葉抽出物からクロマトグラフィによるベル
ベリンの分離過程を示す図

【図２】 ベルベリンの化学構造を示す図

【図３】 分離された活性物質の１Ｈ−ＮＭＲスペクト
ルを示す図

【図４】 分離された活性物質の１３Ｃ−ＮＭＲスペク
トルを示す図

【図５】 分離された活性物質の１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ
（２Ｄ ＮＭＲ）スペクトルを示す図

【図６】 分離された活性物質のＤＥＰＴ（２Ｄ ＮＭ
Ｒ）スペクトルを示す図

【図７】 分離された活性物質のＨＭＱＣ（２Ｄ ＮＭ
Ｒ）スペクトルを示す図

【図８】 分離された活性物質のＨＭＢＣ（２Ｄ ＮＭ
Ｒ）スペクトルを示す図

【図９】 分離された活性物質のＦＴ−ＩＲスペクトル
を示す図

【図１０】 蘇葉抽出物とベルベリンのヘリコバクター
ピロリウレアーゼ活性抑制効果を示す図

【図１１】 細胞懸濁度測定による蘇葉抽出物とベルベ
リンのヘリコバクターピロリ増殖抑制効果の比較を示す
図

【図１２】 ヘリコバクターピロリ胃上皮細胞付着に対
する蘇葉抽出物の抑制効果を示す図

【図１３】 ヘリコバクターピロリ感染により誘導生成
されるＩＬ−８に対する蘇葉抽出物の生成抑制効果を示
す図

【図１４】 蘇葉抽出物の熱安定性を示す図

【図１５】 蘇葉抽出物のｐＨ安定性を示す図

【図１６】 ラクトバシルスの生育に対する蘇葉抽出物
の影響を示す図

【図１７】 ビフィドバクテリウムの生育に対する蘇葉
抽出物の影響を示す図

【図１８】 ストレプトコッカスサーモフィルスの生育
に対する蘇葉抽出物の影響を示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/4741 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 1/04 Ｃ０７Ｄ 455/03 31/04 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｐ // Ｃ０７Ｄ 455/03 Ｆ (72)発明者 許▲詰▼成 大韓民国 忠清南道 天安市 新富洞 大 林ハンスプアパート 304−305 (72)発明者 白永振 大韓民国 ソウル市 瑞草区 瑞草３洞 1481−14 賢英ビラ ガ洞 302

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘリコバクターピロリに対する抗菌活性
   及びヘリコバクターピロリウレアーゼ活性抑制効果、胃
   上皮細胞定着性抑制効果、インターロイキン−８生成抑
   制効果を有するように、生薬素材である蘇葉を熱水抽出
   し濃縮して製造した熱水抽出物と、前記生薬素材である
   蘇葉を溶媒抽出し濃縮して製造した溶媒抽出物との中で
   １種以上を含むことを特徴とする胃潰瘍予防及び治療効
   果を有する蘇葉抽出物。
2. 【請求項２】 前記熱水抽出物が、前記蘇葉に一定量の
   水を添加し、高温で一定時間熱水抽出した後、その濾液
   を減圧濃縮することで製造されることを特徴とする請求
   項１記載の胃潰瘍予防及び治療効果を有する蘇葉抽出
   物。
3. 【請求項３】 水が蘇葉の重量に対しておよそ５〜２０
   倍添加され、８０〜１２０℃で６〜１５時間熱水抽出さ
   れ、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮することで製造され
   ることを特徴とする請求項２記載の胃潰瘍予防及び治療
   効果を有する蘇葉抽出物。
4. 【請求項４】 前記溶媒抽出物が、前記蘇葉に一定量の
   エタノールを添加し、高温で一定時間抽出した後、その
   濾液を減圧濃縮することで製造されることを特徴とする
   請求項１記載の胃潰瘍予防及び治療効果を有する蘇葉抽
   出物。
5. 【請求項５】 エタノールが蘇葉の重量に対しておよそ
   ５〜２０倍添加され、５０〜９０℃で４〜８時間抽出
   し、４０〜７０ｃｍＨｇで減圧濃縮することで製造され
   ることを特徴とする請求項４記載の胃潰瘍予防及び治療
   効果を有する蘇葉抽出物。
6. 【請求項６】 請求項１の蘇葉抽出物を有効成分として
   含有することを特徴とする胃潰瘍予防及び治療効果を有
   する発酵乳。
7. 【請求項７】 請求項１の蘇葉抽出物を有効成分として
   含有することを特徴とする胃潰瘍予防及び治療効果を有
   する飲料。
8. 【請求項８】 請求項１の蘇葉抽出物を有効成分として
   含有し、これに薬剤学的に許容される賦形剤及び補助剤
   を混合し薬剤学的に許容される方法で剤形化した胃潰瘍
   予防及び治療効果を有する薬学製剤。
9. 【請求項９】 蘇葉抽出物に蒸留水（水）と有機溶媒を
   混合した後、有機溶媒層を除去し、水溶層をＸＡＤ−７
   カラムクロマトグラフィに入れ、アセトンとメタノール
   を加えて有機溶媒溶出液を得、前記有機溶媒溶出液から
   シリカカラムクロマトグラフィにより分画液を得、前記
   分画液を予備ＴＬＣによりベルベリンを分離することを
   特徴とする蘇葉抽出物から胃潰瘍予防及び治療効果を有
   するベルベリンを抽出する方法。
10. 【請求項１０】 前記有機溶媒がクロロホルム、ジクロ
    ロメタン、ジエチルエーテル、及び酢酸エチルからなる
    群から選択されることを特徴とする請求項９記載の蘇葉
    抽出物から胃潰瘍予防及び治療効果を有するベルベリン
    を抽出する方法。
11. 【請求項１１】 請求項９のベルベリン抽出方法により
    得られたベルベリンを有効成分として含有し、これに薬
    剤学的に許容される賦形剤及び補助剤を混合して薬剤学
    的に許容される方法で剤形化した胃潰瘍予防及び治療効
    果を有する薬学製剤。