KR860001291B1

KR860001291B1 - A 53868인자 a의 제조방법

Info

Publication number: KR860001291B1
Application number: KR1019830004518A
Authority: KR
Inventors: 도일 존슨 로날드; 스토우퍼 고르디 로버트; 에밀 카스너 랄프; 한스 라슨 스테펜; 유진 오스 얼
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니; 아더 알·웨일
Priority date: 1982-09-27
Filing date: 1983-09-27
Publication date: 1986-09-10
Also published as: KR840006013A; JPS5998094A; PH18630A; ZA836996B; GR79046B; US4463092A; AU1956783A

Abstract

내용 없음.

Description

A 53868인자 A의 제조방법

제1도 A53868인자 A의 적외부 흡수스펙트럼(KBr 펠렛법)

본 발명은 면역 조절제로 유용한 신규 항생물질의 제조방법에 관한 것이다.

새로운 개선된 항생물질이 계속해서 요구되고 있다. 보다 우수한 항생물질이 인체 질병치료를 위해 요구되며, 수의 분야에서도 개선된 항생물질이 요구된다. 항생물질의 개선 목표로는 효력의 강화, 세균 억제 스펙트럼의 확장, 생체내 효율의 증가 및 약학적 특성의 개선(예. 경구 흡수율의 증가, 혈중 또는 조직 농도의 상승, 체내 반감기의 연장 및 배설경로 및 속도의 개선, 대사경로 또는 패턴의 변화)을 들 수 있다.

체내 방어시스템(면역계)은 매우 복잡하여 그 기전을 규명하는 것은 중요한 과제이다. 이 분야의 정보가 과거 십년 동안에 급속하게 증가되어 왔지만, 아직도 해결해야 할 문제가 많다. 면역계에서는 마크로파지(macrophage)가 중요한 역할을 한다. 이들 세포는 식세포작용을 나타내며(이들은 미생물 세포를 삼켜버릴 수 있다)분비성(이들은 체내를 통해 확산되는 화학적 시그날을 유리한다)이다. 마크로파지는 50가지 이상의 파괴적 또는 지시적 분비 생성물을 운반할 수 있으며(또는 최소한 운반을 가능케 한다). 종양세포를 완전히 파괴시킬 수도 있다. 따라서, 마크로파지세포 활성화에 의해 작용을 나타내는 면역조절제가 특히 효과적이다.

면역조절제에 관한[참고문헌으로는 에이치. 우메가와의 "Recent Studies on Antibiotics and Small Molecular Immunomodulators with Potential Usefulness in Treating Lung Cancer : Part II Small Molecular Weight Immnuomdulators Produced by Microorganisms", Inter, J. Clin. Pharmacol. Ther. and Toxicol. 20(1), 19∼23(1982)을 들 수 있다.

미합중국 특허 제4,331,591호는 α-아미노포스폰산의 펩타이드 유도체를 제조하는 화학적 방법을 기술하고 있다. 이 유도체는 페니실린, 세팔로스포린 및 D-사이클로세린 같은 항생물질의 활성을 강화시킨다. 그러나, 상기 특허의 화합물은 본 발명 화합물과 구조적 및 작용적으로 차이가 난다.

본 발명은 다음 구조식(1)을 갖는 N²-글리실-N-(1-메틸렌-2-포스포노에틸)로이신아미드인 항생물질 A53868인자 A로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.

항생물질 A53868인자 A는 포스포노-펩타이드 항생물질의 신규 형태중 하나이다. 여기에는 알라포스판린(L-알라닐-L-1-아미노에틸포스폰산)[Antimicrobial Agents and chemotherapy 18(6), 897∼905(1980)], FR-31564[ibid 19(6), 1013∼1023(1981)] 및 기타[유럽특허 제26-409 및 26-410 및 일본국 특허 J5 6051-494 및 J5 6154-294]가 포함된다.

본 발명은 일반식(2)의 화합물 및 그 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기식에서

R¹은 단백에서 통상 발견되는 α-아미노산 형태의 특성화그룹을 나타내며,

R²및 R³는 독립적으로 수소 또는 C₁∼C₃-알킬을 나타내고,

Z는 수소, C₁∼C₆-알킬, C₁∼C₆-알카노일, 페닐-C₁∼C₃-알킬, 페닐-(X)_m-C₁∼C₃-알카노일, 또는 아미노-보호그룹을 나타내며,

Z'는 수소 또는 C₁∼C₆-알킬을 나타내고,

X는 산소 또는 황이며,

m은 0 또는 1이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이며

단, R₂및 R₃가 모두 알킬인 경우에 이들은 동일해야 한다.

일반식(2)에서 n이 1이고, R₁,R₂,R₃,Z 및 Z'가 수소인 화합물이 상기 일반식(1)이 화합물이다.

일반식(3)의 화합물의 바람직한 경우는 Z'가 알킬일 때 Z 또한 알킬인 화합물이다.

또 다른 바람직한 일반식(2) 화합물은 일반식(1) 화합물의 유도체로써 일반식(2a)로 나타내지는 화합물 및 그의 염이다.

상기식에서

R¹은 단백에서 통상 발견되는 α-아미노산형태의 특성화그룹을 나타내며,

R²및 R³는 독립적으로 수소 또는 C₁∼C₃-알킬을 나타내고,

Z는 수소, C₁∼C₆-알킬, C₁∼C₆-알카노일, 페닐-C₁∼C₆-알킬, 페닐-(X)_m-C₁∼C₃-알카노일 또는 아미노-보호그룹을 나타내며,

Z'는 수소 또는 C₁∼C₆-알킬이고,

X는 산소 또는 황이며,

m은 0 또는 1이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이며

단, 1) R²및 R³가 모두 알킬인 경우, 서로 동일해야 하며,

2) n이 1인 경우, R¹,R²,R³,Z 또는 Z'중 하나는 수소가 아니어야 한다.

일반식(2) 화합물은 항생물질로써 및/또는 항생물질 중간체로써 유용하다. 본 발명은 일반식 화합물(2) 또는 그의 약학적으로 무독한 염을 포함하는 약한 조성물로 감염을 치료하는 방법 또한 제공한다.

본 발명은 또한 일반식(1),(2) 또는 (3) 화합물 및 그 염으로 마크로파지 세포를 활성화하여 면역계를 조절하는 방법 또한 제공한다.

상기식에서 R²및 R³는 전기한 바와 같다.

본 발명에 따라 A53868인자 A는, A53868인자 A를 생성하는 스트렙토마이세스 루리두스 NRRL 15101(기탁일 : 1983년 9월 13일, 기탁기관 : KFCC, 기탁번호 : KFCC-10057) 또는 그의 돌연변이체 또는 재조합체를 액침 호기성 발효 조건하에 동화가능한 탄소, 질소 및 무기염원을 함유한 배양배지 중에서 실질량의 항생물질 활성이 얻어질 때까지 배양시킴을 특징으로하여 제조한다.

A53868인자 A는 통상적인 기술에 의해 반응 혼합물로 부터 분리할 수 있다. 일반식(1)의 생성물은 통상적인 기술에 의해 더 반응시켜 상기 일반식(2)의 화합물을 제공할 수 있다. 이러한 방법의 예를 들면 다음과 같다.

R²,R³,Z 또는 Z'중 적어도 하나가 수소가 아닌 일반식(2a) 화합물을 유도체화한다.

일반식(1) 화합물을 용액상 펩타이드 합성법에 따라 반응시켜 R¹이 수소이며 Z 또는 Z'가 수소가 아닌 일반식(2a) 화합물을 생성한다.

일반식(1) 화합물을 로이신 아미노펩티다제와 반응시키거나 선택적 산 가수분해한 뒤, 통상적인 용액상 펩타이드 합성법에 의해 상기 일반식(2a) 화합물을 생성한다.

본 명세서에서 다음 약자가 사용되는데 거의 대부분은 공지되어 있다.

Ala-알라닌 Lys-리신

Arg-알기닌 Met-메티오닌

Asp-아스파르트산 Nle-노르로이신

Asx-아스파라긴 또는 아스파르트산 Nva-노르발린

Cys-시스테인 Pro-프롤린

Gln-글루타민 Phe-페닐알라닌

Glu-글루탐산 Ser-세린

Glx-글루타민 또는 글루탐산 Thr-트레오닌

Gly-글리신 Trp-트립토판

Hse-호모세린 Tyr-티로신

Ile-이소로이신 Val-발린

Leu-로이신

일반식(1) 및 (2)의 화합물에 공통적인 다음 부분에 관해 약자 LAPP(로이실아미노프로 페닐포스포네이트)를 사용한다.

상기식에서

R²및 R³는 독립적으로 수소 또는 C₁∼C₃-알킬이며,

단, R²및 R³가 모두 알킬인 경우 이들은 동일해야 한다.

본 발명은 화합물은 다음 일반식(2b) 및 그의 염으로 나타낼 수 있다.

상기식에서

LAPP는 상기 일반식(4)이며,

R¹은 단백에서 통상 발견되는 α-아미노산의 특성화 그룹을 나타내고,

Z는 수소, C₁∼C₆-알킬, C₁∼C₆-알카노일, 페닐-C₁∼C₃-알킬, 페닐-(X)_m-C₁∼C₃-알카노일

또는 아미노보호그룹을 나타내며,

Z'는 수소 또는 C₁∼C₆-알킬이고,

X는 산소 또는 황이며,

m은 0 또는 1이고,

n은 0,1,2 또는 3이다.

"단백에서 통상 발견되는 아미노산 형태의 특성화그룹"이란 단백에 통상 존재하는 형태인 다음 일반식의 천연-알파 아미노산에 있어 잔기 R'을 말한다.

그러한 아미노산 및 상응하는 R¹그룹외 예는 다음과 같다 : 알라닌(R¹=메틸; 로이신(¹=이소부틸); 글루탐산(R¹=2-카복시에틸) 또한 R¹은 아미노질소에 연결되어(이와 동시에 질소에 부착된 수소 원자중 하나가 떨어져 나간다). 프롤린에서 보여지는 것과 같은 질소-함유환을 생성하는 잔기를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 "C₁∼C₆-알킬" 및 "C₁∼C₃-알킬"은 각각 탄소수 1 내지 6 또는 단소수 1 내지 3인 직쇄 또는 측쇄 알킬그룹을 의미한다. 여기에는 메틸, 에틸, 이소프로필, n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸, 3급-부틸, n-펜틸, 이소펜틸 등이 있다.

본 명세서에서 "C₁∼C₆-알카노일"은 단소수 1 내지 6의 카복실산으로 부터 유도된 아실잔기를 의미한다. 여기에서 알킬그룹은 직쇄, 측쇄 또는 환상일 수 있다. 그 예로는 아세틸, 프로피오닐, n-부티릴, 이소부티릴, n-발레릴 및 이소발레릴이 있다.

페닐-C₁∼C₃-알킬" 및 "페닐(X)_m-C₁∼C₃-알카노일"은 벤질, 펜에틸, 벤조일, 페닐-아세틸, 페닐프로피오닐, 페녹시아세틸 및 페닐티오-아세틸 같은 그룹을 말한다.

"아미노-보호그룹"은 이 분야에 공지되어 있다. 적절한 보호그룹의 예는 테오도라 더블류·그린, 존 와일리 및 선스의 "Protective Groups in Orgnaic Synthesis"(New York, 1981, chapter 7)에 실려 있다.

항생물질 A53868인자 A는 하나 이상의 인자로 이루어진 항생물질 복합체의 일부분이다. A53868복합체는 주인자 A 및 아직 특성화되지 않은 다른 인자를 함유한다.

발효분야 및 본 명세서에서 사용된 "복합체"는 함께 생성된 개별적인 항생물질 인자의 혼합물을 말한다. 발효에 의한 항생물질 생산에 익숙한 전문자라면 이해하듯이, 항생물질 복합체에 있어 생산된 개별 인자의 수효 및 비율은 사용된 발효조건에 따라 달라진다. A53868 복합체에 있어 인자 A가 주인자이다.

다음 단락은 A53868인자 A의 특성을 설명한다.

A53868인자 A는 무색무정형 물질로 그의 실험식은 C₁₁H₂₂N₃O₅P로 나타내지며 분자량은 약 307이다. A53868인자 A의 원소분석 결과 대략의 조성 백분율은 다음과 같다.

*회분은 인산염 형태임인 밝혀졌다.

고속-원자 충격법으로 실시한 A53868인자 A의 질량 스펙트럼메트리 결과는 다음과 같다 :

분자량=307

분자식=C₁₁H₂₂N₃O₅P

KBr 펠렛법에 의한 A53868인자 A(유리산)의 적외부 흡수 스펙트럼은 제1도와 같다. 흡수극대는 다음 주파수(cm^-1)에서 나타난다.

3368,3312 및 3300(브로드, 강), 3063(약), 2966(중정도 내지 약), 2833(매우 약), 2663(약), 1671(강), 1625(쇼울더), 1536(강), 1469(약), 1442(약), 1386(중정도 내지 약), 1340(매우 약), 1277(매우 약), 1240(쇼울더), 1207(강), 1157(매우 약), 1068(중), 1048(강), 918(중정도 내지 약), 797(중), 778(중) 및 625(약).

6N HCl로 가수분해한 A53868인자 A샘플의 아미노산 분석 결과는 다음과 같다

66% 수성 디메틸포름아미드 중 A53868인자 A의 전기 적정 결과 pka값이 8.2인 전적가능한 그룹(즉, 글리실 아미노그룹)이 존재함을 보여준다.

A53868인자 A는 물 및 디레틸설폭 사이드에 용해하며 대부분의 유기용매에는 불용성이다.

360MHz 장치를 사용한 DMSO-d₆에 용해한 A53868인자 A 샘플의 핵자기공명 스펙트로메트리 결과, A53868인자 A는 상기 일반식(1)로 보여진 구조를 가짐을 알 수 있다.

일반식(1) 및 (2) 화합물은 염을 생성할 수 있는데 이 또한 본 발명의 일부이다. 일반식(1) 및 (2) 화합물은 염을 생성할 수 있는 산작용기 및 산부가염을 생성할 수 있는 아미노그룹을 가지고 있다. 그러한 염은 예를 들어, 항생물질의 분리 및 정제에 유용하다. 또한 약학적으로 무독한 염은 특히 유용하다.

약학적으로 무독한 알칼리금속, 알칼리토금속 및 아민염 및 산부가염은 실제적으로 유용하다. 알칼리금속 및 알칼리토금속 염중 대표적이고 적절한 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 리튬, 세슘, 루비듐, 바륨, 칼슘 및 마그네슘염이 있다. 적절한 아민염에는 암모늄 및 1급, 2급 및 3급 C₁∼C₄-알킬암모늄 및 하이드록시-C₂∼C₄-알킬암모늄염 등이 포함된다. 아민염의 예로는 일반식(2) 화합물과 수산화암모늄, 메틸아민, 2급-부틸아민, 이소프로필아민, 디에틸아민, 사이클로헥실아민, 디-이소프로필아민, 디에틸아민, 사이클로헥실아민, 디-이소프로필아민, 사이클로헥실아민, 에단올아민, 트리에틸아민, 3-아미노-1-프로판올 등의 반응에 의해 생성된 염을 들 수 있다.

알칼리금속 및 알칼리토금속 양이온성 염은 양이온성 염의 제조에 통상 사용되는 방법에 따라 제조된다. 예를 들어 적절한 일반식(2) 화합물을 물같은 적절한 용매에 용해하고, 화학량론적 양의 원하는 무기염기를 함유하는 용액을 용액의 pH가 지나치게 높아지지 않도록 주의하며 가한다. 이와 같이 하여 생성된 염은 여과 또는 용매의 증발과 같은 통상적 방법으로 분리할 수 있다. 또는 용액 중의 일반식(2) 화합물을 적절한 이온교환수지상에 통과시킬 수도 있다.

유기아민과의 염을 마찬가지 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 기상 또는 액체 아민을 적절한 용매중 적절한 일반식(2) 화합물의 용액에 가하고, 용매 및 과량의 아민을 증발시켜 제거한다.

대표적인 산 부가염에는 염산, 황산, 인산, 아세트산, 석신산, 시트르산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 팔미트산, 콜산, 파모산, 뮤스산, D-글루탐산, d-캄포산, 글루타르산, 글리콜산, 프탈산, 타타르산, 라우르산, 스테아르산, 살리실산, 메단설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 벤조산, 신남산 등 같은 유기 및 무기산과의 표준반응에 의해 생성된 염이 포함된다.

일반식(1)의 신규 항생물질은 A53868인자 A를 생성하는 스트렙토 마이세스 루리두스 균주를 적절한 배지에서 액침 호기성 조건하에 실질적인 항생물질 활성이 얻어질 때까지 배양시키므로써 제조한다. 항생물질은 발효 분야에 인정된 여러가지 분리 및 정제방법을 사용하여 회수한다.

A53868인자 A의 제조에 유용한 신규 미생물은 아리조나 그랜드 캐넌의 바닥에서 그래니트 래피즈로부터 채취한 토양 샘플로 부터 분리되었다. 배양물 A53868로 불리는 이 미생물은 스트렙토-마이세스 루리두스균주로 분류된다. 이 분류는 이 종에 관해 발표된 기술[R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8th Ed, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, MD, 1974; E.B. Shirling and D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces," Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 18(2) : 142(1968); E. Kuster, "Simple Working Key for the Classification and Identification of Named Taxa Included in the International Streptomyces Project", ibid 22(3) : 134∼148(1972); H. Nonomura, "key for Classification and Indentification of 458 Species of the Streptomycetes Included in ISP," J. Ferment. Thchnol. 52(2) : 78∼92(1974); I.M.Szabo et al., "A Diagnostic Key for the Identification of "species" of Streptomyces and Streptoverticillum Included in the International Streptomyces Project, " Acta Botanica Academiae Scientiarium Hungaricae 21(3∼4, 387∼418(1975); and S.A. Waksman, "The Actinomycetes" Vol. II, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, MD, 1961, p. 236]과의 비교에 근거한 것이다.

이 분류는 International Streptomyces Project(ISP) 권장법[E.B. Shirling and D. Gottlieb, "Methods of Characterization of Streptomyces Species," Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16(3), 313∼340(1966] 및 몇가지 보충시험에 근거한 것이다.

여과-멸균한 단소원을 최종 농도가 1.0%로 되도록 가한 ISP #9 배지를 사용하여 단소 이용도를 시험하였다. 배지를 고압멸균에 의해 살균한다. 30℃에서 14일간 배양한 후 결과를 판정한다.

세포벽을 구성하는 당류는 레케발리어의 방법(M.P. Lechevalier", Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera Workshop sponsored by the Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology, Dr. Thomas G. Pridham, Convenor; held at the Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ, 1971)을 변형시킨 방법을 사용하여 측정한다. 디아미노피멜산의 이성체는 베커 등의 방법[B. Becker et al., "Rapid Differentiation Between Nocardia and Streptomyces by, Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates", Appl. Microbiol 11.42] 423(1964)]에 따라 시험한다.

멜라닌-양 색소 생성(색소 생성능) 여부는 ISP#1(트립톤-효모추출물 육즙), ISP#6(펩톤-효모 추출물 철분 한천), ISP#7(티로신한천) 및 변형 ISP#7(티로신을 함유하지 않은 ISP#7)을 사용하여 시험한다.

전분 가수분해는 ISP#4(무기염류-전분 한천)판 상에서 요드에 의해 전분 존재를 조사하여 시험하다(D. J. Blazevic and G.M. Ederer, "Principles of Biochemical Testsin Diagnostic Microbiology, "John Wiley and Sons, New York, NY, 1975, p. 99).

온도 범위 및 NaCl 내성은 ISP#2 한천배지를 사용하여 시험한다. NaCl을 원하는 농도로 한천에 가해 NaCl 내성을 측정한다. 배지는 30℃에서 배양한다.

색의 분류는 ISCC-NBS Centroid Color Charts, Standard Sample No. 2106(U. S. Department of Commerce, National Bureau of Standards, Washington, D.C., 1958), Color Harmony Manual(4th Ed, Color Standards Dept., Container Corp, of America, IL. 1958)에 따른다.

[배양상의 특성]

A53868은 풍부한 기중 균사체를 생성하며 그 포자의 색은 적색(R) 계열이다. 트레스너 및 바쿠스시스템[Color Harmony Manual and H.D. Tresner, and E. J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy," Appl. Microbiol. 11, 335∼338(1956)]의 적색 계열중 가장 근사하게 부합되는 색은 5ca 황색을 띈 연 핑크 내지 4ec 희-황색을 띤 핑크색이다. ISCC-NBS 시스템에서 가장 근사하게 부합되는 색은 31. p.y 핑크, 황색을 띈 희미한 핑크색이다. 배양상의 이러한 특성은 오우트밀 한천(ISP No.3), 짜펙-용액 한천 및 도마토 페이스트-오우트밀 한천(TPO)상에서 나타난다. 무기염류-전부 한천(ISP No. 4)상에서 배양할 때 가장 분명히 알 수 있다.

콜로니의 뒷면에는 구별되는 어떤 색소도 생성되지 않는다. 뒷면의 색은 ISP No. 4상에서 증식시킬 때, 중정도의 오렌지 황색이다. 이 색은 다른 배지에서 증식시킬 때 그 음영 및 강도에 있어 변화된다. 융성 색소는 생성되지 않는다.

변이성을 보기 위해 배지상에 도말하였을 때, 배양물은 안정한 균질 콜로니 형태를 보인다. 기중균사를 갖고 있지 않은 변종이 관찰되는 경우도 있다. 이러한 배양상의 결과는 다음 표 I과 같다.

[표 1 A53868의 배양상 특성]

^aC=증식 R=뒷면 Am+기중균사체 Sp=응성 색소

[형태학적 특성]

배양물 A53368은 잘 발달된 단축성으로 분지된 바 세분화 기중 균사체를 생성한다. 포자체는 보통 길이이며 갈고리 모양으로 배연되고 그 열린 직경은 크다. 때로는 원시 나선형도 관찰되는데, 존재하는 경우에는 짧고 처밀하다. 포자체 형태학은 프리담의 Retinaculiaperti(RA) 절에 기술되어 있다.

이 형태학은 ISP No. 및 짜펙 용액 한천상에서 가장 잘 관찰된다. 성숙한 포자사슬은 일반적으로 사슬당 대략 10개의 포자를 함유한다. 포자의 형태는 구형 내지 타원형이나 주로 타원형이나, 포자의 크기는 광학현미경으로 Vickers Image Splitting Measuring Eyepiece를 사용하여 측정한다. 포자의 크기는 길이가 0.93∼1.85μM이고 폭은 0.62∼1.30μM이다. 평균 크기는 1.28μM×0.94μM이다. 포자의 표면은 매끄럽다.

[생리학적 특성]

가수분해한 전(Whole) 세포의 분석결과 LL DAP(디아미노피멜산)이 존재하며 메소 이성체는 존재하지 않음을 보여준다. 가수분해한 전 세포의 당류 분석결과 글루코스, 만노스 및 디보스의 존재를 확인할 수 있다. 이는 I형 세포벽 및 NC 또는 무-특성, 당류 패턴("Bergey's Hanual" 참조)을 나타낸다. 이러한 주세포벽 성분은 스트렙토마이세스 속임을 나타낸다.

A53868의 탄소 이용 패턴은 다음과 같다 : 증식하는데 L-아라비노스, D-글루코스, 셀로비오스, D-푸락토스, D-갈락로스, i-이노시톨, 락토스, D-말토스, D-리보스, 살리신, 나트륨 아세테이트, 나트륨시트레이트, 나트륨 석시네이트 및 D-크실로스를 사용할 수 있으며, D-아라비노스, 멜리비오스, D-만니톨, D-라피노스, L-람노스 및 슈크로스는 증식에 이용하지 못한다.

배양물 A53868은 젤라틴을 액화하며 전분을 가수분해한다. 나이트레이트를 환원시키지 못하며 탈지유를 가수분해하거나 펩톤화하지 못한다.

배양물 A53868은 NaCl에 대해 7%까지 견디며 10∼37℃에서 증식할 수 있다.

트립톤-효모 추출물 육즙(ISP No.1) 및 펩톤-효모 추출물-철분 한천(ISP No. 6) 및 티로신 한천(ISP No.7)상에서 증식시킬 때 멜라노이드 색소가 생성된다.

[종의 결정]

A53868의 배양, 형태학적 및 생리학적 특성을 유사한 종에 관한 기술과 비교한다. A53868 배양물과 유사성을 보이는 14가지의 스트랩토마이세스종을 자세히 비교 연구하여 A53868과 가장 유사한 2가지 종을 선택한다. 이들 두 가지 종은 다음과 같다 : 스트렙토마이세스 라벤도폴리아에(E.B. Shirling, et al., supra.p.339) 스트랩토마이세스 루리두스(E.B. shirling, et al., supra, p. 142)

이들 두 가지 배양물은 문헌에 적색(R) 계열에 속하며, RA(retinaculiaperti) 포자체 형태학을 보이며, 매끄러운(Sm) 포자-표면 구조를 나타내며, 멜라닌 양 색소를 생성하며 A53868에 매우 유사한 탄소 이용패턴 및 다른 특성을 보인다고 보고되어 있다. 이들은 모두 Approved List of Bacteriol Names[V.B.D.Skerman et al., Intern.Journal of Systematic Bacteroiol. 30(1), 225∼420(1980)]에 공인되어 있다.

이들 두 배양물과 A53868 배양물의 추가 비교는 다음과 같다 : 에스, 라벤도폴리아에 : 이 배양물은 A53868과 공토되는 많은 특성을 지니며, 차이는 몇 가지 안되나, 에스·루리두스와의 차이보다는 크다. 전반적형태학, 색소 생성, 용성 색소의 결여, 멜라닌 양 색소의 생성, 포자 괴색, 포자 표면 및 탄소 이용도는 모두 A53868과 유사하다. 그러나 에스, 라벤도폴리아에는 보다 긴 포자사슬, 보다 나선상인 포자체, 프락로스 이용능의 결여 및 짜펙용액 한천상에서의 보다 약한 증식도에서 A53868과 차이를 보인다.

에스·루리두스 : 이 배양물은 배양상, 형태학적 및 생리학적으로 A53868과 매우 유사하다. 두 배양물은 적색(R)계열에 속하며, 분명한 색소가 결여되어 있으며 매끈한 포자 표면과 함께 동일한 (RA) 포자체 형태학을 나타내며, 멜라닌 양 색소를 생성하며, 유사한 탄소 이용 패턴을 보인다. A53868과 에스·루리두스의 유사성과 차이는 다음 표 II와 같다. 표 III 및 IV는 A53868과 에스·루리두스의 보다 상세한 비교 결과를 나타낸다.

[표 II A53868 및 에스·루리두스 배양물의 비교]

[표 III A53868 배양물 및 에스·루리두스에 의한 탄소 화합물의 이용]

^a-=이용하지 못함

^bND=실시하지 않음

+=이용함

±=이용이 확실치 않음

[표 VI A53868 및 에스·루리두스의 비교]

^aND=실시하지 않음

상기 비교 결과 A53868은 에스·루리두스와 매우 유사함을 알 수 있다. 따라서 배양물 A3868은 스트랩토마이세스 루리두스에 속하는 균주로 분료된다(Krasilnikov, Korenyako, Meksina, Valedinskaya and Veselov Waksman, 1961). 이 분류는 발표된 기술과의 비교에 근거한 것이며 실험실적 비교에 직접 근거한 것은 아니다.

A53868인자 A의 제조에 유용한 스트랩토마이세스 루리두스 배양물은 기탁 기관에 기탁되어(Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604) 저장 배양물 컬렉션의 일부를 이루며, NRRL 15101로 이용할 수 있다.

다른 미생물의 경우와 마찬가지로, A53868-인자 A-생성 배양물, 스트랩토마이세스 루리두스 NRRL 15101(기탁번호 : KFCC-10057)도 변이를 일으킨다. 예를들어 자외선, X-선, 고주파, 방사선 및 화학물질 같은 여러 가지의 공지된 돌연변이 유발제로 처리하므로써 NRRL 15101 균주의 변종, 제조합체 및 돌연변이체를 수득할 수 있다. A53868인자 A를 생성하는 스트랩토마이세스 루리두스 NRRL 15101(기탁번호 : KFCC-10057)의 모든 자연적 및 유도변종, 돌연변이체 및 제조합체를 사용할 수도 있다.

스트랩토마이세스 루리두스 NRRL 15101(기탁번호 : KFCC-10057)을 증식시키는데 사용되는 베지는 여러 가지 일 수 있다. 생산의 경제성 최적 수율 및 생성물 분리 용이성을 고려할 때 몇 가지 배지가 바람직하다. 즉, 대규모 발효에서 바람직한 탄소원은 용성 전분이며, 글루코스, 전분, 덱스트린, 글리세롤 등도 사용할 수 있다. 바람직한 질소원 카세인의 췌장 분해물이나 카세인의 효소 가수분해물, 대두 밀의 효소 분해물, 산가수분해된 카세인 등을 사용할 수도 있다. 배지에 글리신 및 로이신을 가해 강화시키는 것 또한 유리하다.

배지에 혼합될 수 있는 영양 무기염류는 칼슈, 칼륨, 암모늄, 염화물, 황산염, 질산염, 인산염 등을 생성할 수 있는 용성 염류이다.

미생물의 증식 및 발육을 위해 필요한 필수 미량원소 또는 배지에 포함되어야 한다. 그런 미량원소는 통상적으로 배지의 다른 성분중 불순물로써 미생물의 증식 요구도를 만족시키기에 충분한양 존재한다.

대규모 발효에서 거품이 문제가 된다면, 폴리프로필렌 글리콜 같은 소포제를 소량(예, 0.2ml/ℓ) 가하는 것이 필요할 수도 있다.

실질량의 A53868인자 A를 제조하려면, 액침 호기성 탱크 발효법이 바람직하다. 진탕-플라스크 배양에 의해선 소량의 A53868인자 A를 수득할 수 있다. 통상적으로 큰 탱크를 미생물 포자로 접종하는 경우에 접하게 되는 항생물질 생성의 시간적 지연 때문에 증식성 접종물을 사용하는 것이 바람직하다. 증식성 접종물은 소량의 배양배지를 미생물의 포자형 또는 균사체 단편으로 접종하여 새로운 왕성하게 증식되는 배양물을 수득하므로써 제조한다. 증식성 접종물을 대규모 탱크로 옮긴다.

A53868인자 A생성 미생물은 약 10°내지 37℃에서 증식할 수 있으며, A53868인자 A 생성의 최적 온도는 약 28°내지 30℃이다.

액침 호기성 배양법의 경우에 통상적이듯이, 멸균한 공기를 배지 중에 분산시킨다. A53868인자 A의 효과적인 생산을 위해선 용존 산소 수준을 공기포화도(30℃, 대기압)의 30% 이상으로 유지시켜야 한다.

탱크 발효의 경우, 발효 배지의 pH를 약 6.5 내지 7.4로 유지시키는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어, 수산화나트륨 또는 염산을 적당량 가해 이루어질 수 있다.

발효 중에 육즙 또는 균사체 고체 추출물의 샘플에 대해 항생물질에 감수성을 보이는 것으로 공지된 미생물에 대한 항생물질 활성을 시험하면서 A53868인자 A의 생산을 모니터한다. 이 항생물질 시험에 유용한 검정 미생물로는 마이크로코커스 루테우스가 있다. 생물학적 검정은 평판 한천상 페이파-디스크 검정법에 의해 바람직하다. 수행된다.

액침 호기성 발효 조건하에 생산된 A53868인자 A를 발효분야에 공지된 방법에 의해 발효배지로 부터 회수 있다. A53868인자 A생성 미생물의 발효 중에 생산된 항생물질은 일반적으로 육즙 중에 존재한다. 따라서 A-53868인자 A의 최대회수는 여과에 의해 균사체 괴를 제거하므로써 달성된다. 여과한 육즙은 여러가지 기술로 정제하여 A53868 복합체를 생성할 수 있다. 바람직한 방법은 탄소 칼럼상에 흡착시키고 용출하여 A53868 복합체를 생성하는 것이다.

A53868 복합체를 흡착 및 추출 과정에 따라 더 정제하고 분리하여 개별적인 A53868인자 A를 생성한다. A53868 복합체 및 A53868인자 A의 정제에 유용한 흡착 물질에는 다음이 포함된다 : 1) 고도의 다공성 중합체(Diaion HP-20); 2) 세파덱스 A25 및 G-50; 바이오-겔 P-2 및 P-10; 3) 음 이온교환수지 a) 강염기성; 폴리스티렌, 바이오라드 AGl & 2, 바이오-렉스, 도웩스 1 및 2, 앰버리트 IRA 400,401,410; b) 중정도의 염기성;에폭시폴리아민 바이오렉스 5 및 듀올라이트 A30B; c) 약 염기성; 폴리스티렌 또는 페놀성 폴리아민 바이오-라드 AG 3, 듀올라이트 A-6, A-7, 앰버리트 IRA 68, IR-45, IR-4B; 4) 실리카겔; 5) 플로리실; 6) 중합체성 흡착제(XAC-2 및 4); 7) 역상 수지, 실리카겔/C₁₈및 실리카겔/C₈; 8) 탄소; 9) DEAE 셀루로스, DEAE 세파덱스; 10) 폴라아미드; 11) 알루미나; 12) 마이크로셀룰로스, 공급원 : 바이오-라드 및 바이오-겔 수지, Bio Rad Laboratories, Richmond, CA; 앰버리트 및 XAD수지 Rohm and Hass Co, Philadelphia, PA; 듀올라이트수지-Diamond Shamrock Chemical Co, Redwood City, CA; 세파덱스 지-Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden; 도웩스 수지-Dow Chemical Co., Midland, MI; 다이아이온-Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan; XAD 수지, 실리카겔/C₁₈및 실리카겔/C₈-E. Merck; Darmsted, Germany.

상기 일반식(2a) 화합물은 일반식(1) 화합물로부터 펩타이드 합성의 통상적인 방법에 의해 제조한다. 이 방법을 한 아미노산의 카복실 작용기와 다른 아미노산의 아미노 작용기를 반응시켜 아미드 결합을 생성하므로써 아미노산 또는 있타이드 프래그먼트를 커플링시키는 것이다. 커플링을 효과적으로 수행하기 위해선 1) 반응에 직접 참여하지 않는 모든 반응성 작용기는 적절한 차단 그룹에 의해 불활성화시키고, 2) 커플링시킬 카복실 작용기는 커플링되기에 적합하도록 활성화시키는 것이 바람직하다. 원하는 펩타이드 생성물을 엄으려면 이러한 과정 모두에서 반응 서열 및 반응조건을 주의하여 선택하고 특이적 차단그룹을 이용해야 한다. 본 발명 화합물을 생성하는데 사용되며 특별히 선택된 보호그룹 및 또는 활성화 작용기를 갖고 있는 각각의 아미노산은 펩타이드 분야에 공지된 기술을 이용하여 제조한다.

일반식(2a) 화합물의 합성의 각 단계에서 선택된 조합의 차단그룹을 사용한다. 이러한 특별한 조합이 가장 원활한 작용을 나타낸다는 것이 입증되어 왔다. 일반식(2a) 화합물의 합성에서 다른 조합도 사용 가능하나 만족도가 떨어진다. 예를 들어, 벤질옥시카보닐(CBZ), t-부틸옥시 카보닐(BOC), t-아밀옥시 카보닐(AOC), P-메톡시벤질옥시카보닐(MBOC), 아다만틸 옥시카보닐(AdOC) 및 이소보르닐옥시카보닐 등을 일반식(2a) 화합물의 합성에서 아미노-차단 그룹으로 사용할 수 있는데, 티로실 잔기의 하이드록실 보호그룹으로는 P-니트로벤질(PNB), P-메톡시벤질(PMB) 등과 같은 그룹을 사용할 수도 있으나 벤질(BZl)을 일반적으로 사용한다.

일반식(2a) 화합물의 제조에 사용되는 카복실 차단그룹은 메틸, 에틸, 벤질, P-니트로벤질, P-메톡시벤질, 2,2,2-트리클로로에틸 등의 전형적인 에스테르 생성그룹 중 하나이다.

일반식(2a) 화합물의 제조에서 적절히 보호된 N-차단 아미노산 또는 펩타이드 프래그먼트와 적절히 보호된 카복사 차단 아미노산 또는 펩타이드 프래그먼트의 커플링은 아미노산 또는 펩타이드 프래그먼트의 유리 카복실 작용기를 커플링 반응에 활성을 나타내도록 하는 과정을 포함한다. 이는 몇가지 공지 기술 중 하나를 사용하여 이루어질 수 있다. 그러한 활성화 기술 중 하나로 카복실 작용기의 혼합무수물로의 전환이 있다. 유리카복실기를 다른 산, 대표적으로는 카본산의 유도체(예, 산클로라이드)와의 반응에 의해 활성화시킨다. 혼합 무수물을 생성하는데 사용되는 산 클로라이드의 예는 에틸 클로로포르메이트, 페닐 클로로포르메이트, 2급-부틸 클로로포르메이트, 이소부틸 클로로포르메이트, 피발로일 클로라이드 등이며 이 중에서 이소부틸 클로로포르메이트가 바람직하다.

커플링반응을 수행하기 위해 카복실 작용기를 활성화시키는 다른 방법으로는 그의 활성 에스테르 유도체로 전환시키는 방법이 있다. 그러한 활성 에스테르의 예로는 2,4,5-트리클로로페닐 에스테르, 펜타클로로페닐 에스테르, P-니트로페닐 에스테르가 있다. 사용할 수 있는 또 다른 커플링법은 공지된 아지드 커플링법이다.

일반식(2a) 화합물의 제조에 사용되는 합성연쇄과정 중 특정한 위치에서 선택된 차단그룹의 분해가 필요하다. 펩타이드 합성에 통상적인 기술을 가진 자라면 대표적인 보호그룹 중에서 생성물이 선택적으로 분해되어 아미노산 또는 펩타이드 래그먼트상에 존재하는 보호그룹 중 하나 이상(그러나 모두는 아님)이 제거될 수 있다는 의미에서 적합한 그룹을 쉽게 선택할 수 있다. 이러한 기술은 펩타이드 분야에 공지되어 있다. 선택적 분해에 이용할 수 있는 기술의 보다 충분한 논의는 문헌에 기술되어 있다[Schroder and Lubke, The Peptides, Volume I, Academic Press, New York, (1965), 특히 page 72∼75의 표].

알칼리 비누화에 의해 카복실 보호그룹을 분해할 수 있다. 보호된 카복실그룹을 탈에스테르화 하는 데 일반적으로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬 등 같은 알카리금속 수산화물을 사용한 비교적 강알칼리성 조건을 사용한다. 비누화가 이루어지는 반응조건은 이 분야에 공지되어 있다. 카복실 차단 그룹은 또한 탄소성 팔라듐 같은 촉매 존재하의 가수분해를 포함한 촉매적 가수소분해에 의해 제거할 수 있다. 또한 카복실 차단그룹이 P-니트로벤질 또는 2,2,2-트리클로로 에틸인 경우에 탈차단은 아연 및 염산 존재하의 환원에 의해 이루어질 수 있다.

아미노 차단그룹은 보호된 아미노산 또는 펩타이드를 포름산, 트리플루오로아세트산(TFA), P-톨루엔설폰산(TSA), 벤젠설폰산(BSA), 나프탈렌설폰산 등 같은 산으로 처리하므로써 제거되며 그 결과 각각의 산부가염 생성물이 생성된다. 아미노 차단그룹의 분해는 또한 차단된 아미노산 또는 펩타이드를 HBr 또는 HCl과 아세트산의 혼합물로 처리하여 상응하는 하이드로브로마이드 또는 하이드로클로라이드 산부 가염을 생성하므로써 이루어질 수 있다. 사용되는 실제의 방법 또는 시약은 특이적 탈차단 반응에 포함되는 물질의 화학적 또는 물리적 특성에 관계된다.

n이 0이며 Z가 수소인 일반식(2) 화합물, H-LAPP 화합물은 특히 유용한 중간체이다. 이들 화합물은 일반식(1) 화합물로부터 글리실그룹을 제거하므로써 제조된다. 글리실그룹은 로이신 아미노펩티다제(lap) 또는 선택적 산 가수분해에 의해 선택적으로 제거되어 H-LAPP 중간체가 생성된다.

일반식(2a) 화합물의 제조를 위한 일반적 연쇄과정은 다음과 같다. 연쇄과정에서 "AA"는 아미노산 잔기를 나타내며 GLAPP는 A53868인자 A를 나타낸다.

상기 과정에 의해 일반식(2a) 화합물을 제조하는데 C-말단 반응제로써 목적 최종 생성물의 LAPP 그룹을 함유하는 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.

대표적인 일반식(2) 화합물의 예는 다음과 같다 :

본 발명은 일반식(1),(2) 및 화합물로 이루어지는 조성물을 사용하여 면역계를 조절하는 방법에도 관한 것이다. 일반식(3) 화합물은 이 분야에 공지되어 있으나[Hendlin et al., Science 166, (1969)], 그의 면역 조절 활성은 아직까지 밝혀지지 않고 있다. R²및 R³가 수소인 일반식(3) 화합물은 항생물질 포스포 마이신이다.

본 발명의 일반식(1),(2) 및 (3) 화합물은 그의 마크로파지 활성화능을 시험하는 시험관내 및 생체내 시험과 실험실적 세포내 감염시킨 동물에 대한 생체내 시험에서 면역조절 활성을 나타낸다. 이 방법을 위해 일반식(1) 및 (2) 화합물이 바람직하다. 그러나 관련된 포스폰산 항생물질인 알라포스핀 및 포스미도 마이신은 시험관내 시험에서 면역조절활성을 나타내지 않는다.

본 발명에 따른 일반식(1),(2) 및 (3) 화합물의 마크로파지 활성화에 대한 활성은 공지 방법으로 측정되어 왔다.

그중 한 방법으로 본 화합물의 쥐 마크로파지 활성화능을 시험관내 시험으로 측정하였다. 복강 마크로파지를 일반식(1),(2) 또는 (3) 화합물에 노출시키고 이와 동시에 타겟세포를 가한다. 이들 처리한 마크로파지의 종양 세포독성을 48시간 후에 트리판 블로 판정법으로 조사한다. 조성물 매개성 마크로파지 활성화에 기인한 p815 세포의 증식억제율(%)을 완충액에 노출시킨 마크로파지 존재하에 증식시킨 p815 세포의 증식도와 비교하여 계산한다. 그 시험 결과는 다음 표 I 및 II와 같다.

[표 I] 화합물(1)에 의한 마크로파지 매개 종양 세포독성의 유도

^aNT=시험하지 않음

[표 II]포스포마이신에 의한 마크로파지 매개 종양 세포독성의 유도

다른 방법으로 조성물처리 마우스로 부터 복강 세척에 의해 복강 마크로파지를 3, 5 또는 10일 후에 수득하여 플라스틱상에 부착시켜 정제한다. 16-㎜ 웰(well) 중 대략 4×10⁵마크로파지를 20% 송아지 태자혈청을 보충한 Roswell Park Memorial Institute 1, 640 Medium 2㎖에 함유된 4×10⁴p815 세포로 처리한다.

배양물을 습도 조절 5% CO₂-공기 배양기 중에서 37℃로 유지시키고, 48시간 후에 혈구계로 생세포수를 측정하여 세포독성을 평가한다. 각 그룹에 대해 3배수 배양물을 유지시키고; 평균 세포수 및 표준오차를 계산한다. 이러한 조건하에 트리스 완충화 염수로 처리한 정상 BALB/C 마우스의 경우에는 생세포수 측정 및 백혈병 세포의 DNA 합성에 의해 판정할 때 p815 타겟세포의 증식에 아무런 영향도 없었다. 마크로파지의 타겟세포에 대한 비율은 각 실험초기에 대략 10:1이다. 조성물 매개 마크로파지 활성화에 기인한 p.815 세포의 증식 억제율은 완충액 처리동물로부터 얻은 마크로파지 존재하에 증식시킨 p.815 세포와 비교하여 계산한다. 그 결과는 다음 표 III과 같다.

[표 III] 화합물(1)을 사용한 생체내 마크로파지 활성화

또한 일반식(1),(2) 및 (3) 화합물은 정상 및 면역 억제된 동물을 세포내 감염물에 의해 감염시킨 시험(여기서 주 세포 면역성은 활성화 마크로파지이다)에서 효과적인 면역 조절제로 밝혀졌다. 세포내 감염은 다음과 같은 세균, 진균, 리케챠, 원생동물 및 바이러스에 의해 야기시킬 수 있다:

마이코박테리움 튜버큘로시스 레지오넬라

부르셀라 톡소플라스마 곤디이

살모넬라 타이피 베스노이티아 젤리소니

리스테리아 모노시토제네스 플라스모디움 버게이

히스토플라스마 캡슐라툼 레이쉬마니아시스 및

칸디다 알비칸스 헤르페스 심플렉스

클라미디아에

한 시험에서 화합물(1)에 의한 전처리는 치명적 리스테리아 모노시토제네스 EGD감염물에 대해 마우스를 보호하는데 매우 효과적이었다. 그 시험에서 18 내지 20g 나가는 CD₁마우스를 시험 화합물로 비경구적으로 전처리한 지1, 3 및 5일 후에 리스테리아 모노시토제네스 EGD 5×10₅생세포를 함유하는 0.1㎖로 외측 꼬리정맥을 정맥내 감염시킨다. 시험 화합물을 파이로젠을 제거한 물에 용해한 용액 0.25㎖를 복강내 투여한다. 시험농도 각각에 대해 10마리씩의 마우스를 사용한다. 10마리의 대조 마우스를 0.25㎖의 파이로젠을 함유하지 않은 물로 감염시키기 1,3 및 5일 전에 복강내 처리한다. 마우스를 케이지에 수용하고 물을 주고 매일 먹이를 준다. 살아있는 마우스의 수를 매일 15일간 계속하여 센다. 제14일에 살아있는 모든 시험동물은 임의적으로 생존 기간 15일이라 정한다. 각 그룹에 대해 평균 생존 시간을 계산하고 대조군과 처리 마우스군의 차이에 대해 표준 "T" 시험에 의해 유의성을 결정한다.

화합물(1)은 내독소에 관한 리멀루스(Limulus) 분해질(lysate) 시험에서 음성을 나타내며 표준 한천 희석 시험에서 엘·모노시토제네스 EDG에 대한 특이적 시험관애 항균활성을 나타내지 못한다.

리스테리아 모노시토제네스에 대해 생체내 시험 결과는 다음 표 VI와 같다.

[표 VI] 리스테리아 모노시토제네스 마우스 감염에 대한 화합물(1) 전처리의 보효 효과

*"T" 시험에 의할 때 비처리 대조군과 유의적으로 차이난다. p≤0.05

다른 시험에서 감염전 화합물(1)에 의한 처리는 마우스를 치명적 칸디다 알비칸스 A26 감염으로 부터 보호하는데 상당히 효과적임이 밝혀졌다. 이 시험에서 18 내지 20g 나가는 CD₁마우스를 칸디다 알비칸스 A265×10⁶생세포로 정맥내 감염시키기 1,3일 및 5일 전에 시험 화합물을 복강내 또는 피하로 전 처리한다. 시험 화합물을 파이로젠을 제거한 물에 용해하여 그 용액 0.2㎖를 투여한다. 각 시험 농도에 대해 10마리의 마우스를 사용한다. 대조로써 10마리의 마우스를 감염시키기 1,3 및 5일 전에 0.25㎖의 파이로젠을 제거한 물을 복강내 또는 피하로 처리한다. 감염시키기 전 24시간 동안 400R에 노출시킨 X-선 조사 마우스 또는 감염시키기 1,3 및 5일 전에 50㎎/㎏의 사이클로포스파미드로 복강내 처리한 마우스를 사용하여 시험 화합물의 면역조절 효과를 조사한다. 마우스를 케이지에 수용하고, 급수하고 매일 사료를 준다. 살아 있는 마우스의 수를 매일 센다. 감염시킨 뒤 18일간 생준하는 정상 마우스를 생존시간 19일이라 정한다. 감염시킨 뒤 12일간 생존하는 X-선 조사 또는 사이클로포스파미드 처리 마우스를 임의로 생존시간 13일이라 정한다. 각 그룹에 대해 평균 생존 시간을 계산한다. 처리군 및 비처리군 사이의 차이에 대해 "T" 시험에 의해 유의성을 조사한다. 화합물(1)은 표준한천 희석법에서 시이·알비칸스 A26에 대한 시험관내 항진균 활성을 나타내지 않는다.

칸디다 알비칸스에 대한 생체내 시험 결과는 다음 표 V~VII와 같다.

[표 V] 정상 마우스에서 칸디다 알비칸스 감염에 대한 화합물(1) 전처리의 보호 효과

*"T" 시험에 의할 때, 비처리 대조와 유의적으로 차이난다. p≤0.05

[표 VI] 사이클로포스파미드 전처리 마우스에서 칸디다 알비칸스 감염에 대한 화합물(1) 전처리의 보호 효과

*"T" 시험에 의할 때, 비처리대조와의 차이는 유의적이다. p≤0.05

[표 VIII] X-선 조사 마우스에서 칸디다 알비칸스 감염에 대한 화합물(1) 전처리의 보호 효과

*"T" 시험에 의할 때, 비처리대조와 유의적으로 차이난다. p≤0.05

본 발명에 따른 일반식(1), (2) 및 (3) 화합물은 또한 인체 및 동물에서 면역 결핍증을 바로 잡을 수 있는 능력을 갖고 있으므로 치료제로 유용하다. 따라서, 일반식(1), (2) 및 (3) 화합물은 치료적 복수용도를 갖는 것으로 간주된다. 본 화합물은 세포 면역성의 치료학적 자극에 강화시키거나 도와 주므로써 체내의 총체적 면역성을 높이는데 유용하다. 이들은 따라서 진균성 또는 마이코플라스마성 감염증, 결핵, 나병, 급만성 바이러스 감염증 등과 같은 만성감염증을 포함한 질병의 치료에 생체내로 유용하다. 한 응용으로, 일반식(1), (2) 및 (3)의 면역조절성 화합물을 다른 항미생물제 또는 항생물질 한 가지 이상과 조합하여 투여할 수 있다. 그와 같은 조합은 미생물 감염의 억제 및 또는 치료에 예방적으로 또는 치료적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 화합물은 세포 면역성이 문제가 되는 경우, 특히 디 조오지 증후군(흉선의 선척적 결여)에서와 같이 면역성이 결핍된 경우에 유용하다. 이들은 전신 홍반성 낭창, 류마티스성 관절염 등의 유해한 항체가 존재하는 자가면역 질환에 치료제로 사용할 수 있다. 또한 본 화합물은 신형성(neoplasia) 또는 기관이식 같은 면역반응이 비정상적인 상태의 치료에 유용하다. 면역조절 유효량의 본 화합물을 단독으로 투여하거나 외과적 제거와 같은 다른 치료법과의 병용은 그러한 상태(특히 신형성)의 치료에 도움이 된다.

본 발명의 한 가지 면은 면역조절이 요구되는 인체 또는 동물에게 본 화합물 중 한 가지의 면역조절 유효량과 바람직하게는 약학 담체를 함께 투여함을 특징으로 하여 대상의 면역계를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 "조절한다"라는 용어는 화합물이 면역계로 하여금 정상, 균형 상태를 유지하도록 한다는 것을 의미한다. 본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 일반식(1), (2) 또는 (3)의 화합물 유효량을 감염되었거나 감수성을 나타내는 온혈 동물에게 비경구로 투여한다.

면역계의 조절에 효과적인 용량은 투여화합물, 면역계가 반응해야 할 감염의 정도 및 대상 동물의 연령, 체중 및 상태에 따라 달라진다. 비경구적 보호를 위해 요구되는 총 용량은 일반적으로 약 5 내지 약 100㎎/㎏이며 바람직하게는 약 10 내지 약 50㎎/㎏이다.

본 발명은 또한 세포내 감염을 억제하기 위해 면역계를 조절하는데 유용한 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 일반식(1) 또는 (2) 화합물과 적절한 담체로 이루어진다. 조성물은 약학 분야에 공지된 방법에 의해 비경구 투여용으로 제형화할 수 있다.

본 화합물을 함유하는 효과적인 주사용 조성물은 현락제 또는 용액형태일 수 있다. 적절한 제형의 제조에서 일반적으로 산부 가염의 수용성이 유리염기보다 크다고 알려져 있다. 마찬가지로 염기는 중성 또해 염기성 용액보다는 희산 또는 산성 용액에 대는 용해성이 크다.

용액 형태에서 본 화합물은 생리학적으로 무독한 담체에 용해되어 있다. 그런 담체는 적절한 용매, 벤질 알콜같은 보존제, 필요하면 및 환충제를 포함한다. 유용한 용매에는 물 및 수성 알콜, 글리콜 및 디에틸 카보네이트 같은 카보네이트 에스테트가 포함된다. 그런 수용액은 일반적으로 50%(V/V) 이하의 유기용매를 함유한다.

주사용 현탁 조성물은 담체로써, 보조제 존재 또는 부재하에 액체 현탁 매질을 필요로 한다. 현탁화 매질의 예로는 수성 폴리비닐피롤리돈, 식물유 또는 고도로 정제된 광유 같은 불활성유 또는 수성 카복시메틸셀룰로스가 있다.

생리학적으로 무독한 보조제가 화합물을 현탁 조성물 중에 현탁된 상태로 유지시키기 위해 필요하다. 보조제는 카복시메틸셀룰로스 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트 같은 절증제 중에서 선택할 수 있다. 여러 가지의 계면활성제 또한 현탁화제로 유용하다. 레시틴, 알킬패놀 폴리에틸렌 옥 사이드 부가생성물, 나프탈렌설포네이트, 알킬벤젠설포네이트 및 폴리옥시에틸렌솔비탄 에스테르가 유용한 현탁화제이다.

액체 현탁화 매질의 친수성 밀도 및 표면 장력을 변화시키는 여러 가지의 물질이 개별적 경우에 주사용 현탁제를 제조하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 실리콘 소포제. 솔비톨 및 당류는 유용한 현탁화제일 수 있다.

일반식(1) 및 (2) 화합물의 제조를 보다 상세히 설명하기 위해 다음 실시예가 제공된다.

[실시예 1]

화합물(1)의 제법

A. A53868의 진탕 플라스크 발효

스트렙토마이세스 루리두스 NRRL 15101(기탁번호 : KFCC-10057)의 동결 건조된 펠렛을 1 내지 2㎖의 멸균수에 용해시킨다. 이 용액을 다음 조성을 갖는 사면한천에 접종시킨다:

성분 량(%) 성분 량(%)

소고기 육즙 0.05 용성 육류 펩톤^b0.5

글루코즈 1.25 블랙 스트랩 당밀 0.25

옥수수 전분 0.5 MgSO₄, 7H₂O 0.025

감자 덱스트린 0.5 짜펙 무기물 원액 0.2

효모 추출물 0.05 탈이온수 적당량을 가해 1ℓ로 한다.

카제인^a의 효소적 가수분해물 0.03

멸균전 pH는 5N NaOH로 7.5로 조절하고 멸균 후 pH는 6.8이다.

^aNZ아민 A(Humko Sheffield Chemical, Lyndhust, NJ)

^dO.M.펩톤 (Amber Laboratories, Juneau, WI 53039)

^c짜펙 무기물 원액은 다음 조성을 갖는다:

KCl 10%

MgSO₄·7H₂O 10%

FeSO₄·7H₂O 2%(농염산 2㎖중에 용해된)

탈이온수 적당량을 가해 1ℓ로 한다.

접종된 사면한천을 30℃에서 약 7 내지 14일간 배양한다. 성숙된 사면 배양물에 멸균 증류수(10㎖)를 붓고 멸균 피펫으로 긁어 포자를 흐트러뜨린다. 생성된 포자현탁액 중 일부(0.5㎖)를 다음 조성을 갖는 증식 배지 50㎖에 접종시킨다:

성분 량(%) 성분 량(%)

글루코즈 1.5 옥수수 침지약 0.1

감자 덱스트린 2.0 CaCO₂0.2

대두 그리트 1.5 냉수돗물 적당량을 가해 1ℓ로 한다.

효모 추출물 1.0

멸균전 pH. 5N NaOH로 약 5.6 내지 6.5로 조절하고 멸균 후 pH는 6.5 내지 6.7이다.

접종시킨 증식배지를 250rpm으로 2인치(5.08㎝) 괘도를 선회하는 회전 진탕기상의 250㎖ 삼각플라스크중 30℃에서 약 40시간 동안 배양식시킨다.

증식성 배양은 액체 질소 중에 보관한 사면 한천 배양물 또는 그의 동결건조 펠릿에 의해 만족스럽게 시작되었다.

배양시킨 증식배지 (0.8 내지 2% V/V)를 다음 조성을 갖는 제조배지 50㎖에 접종시킨다:

성분 량(%) 성분 량(%)

용성 전분 3.0 암모늄 몰리브데이트 0.01

카제인의 췌장 소화물 1.0 CaCO₃0.2

MgSO₄·7H₂O 0.05 짜펙 무기물 원액 0.2(2㎖/ℓ)

K₂HPO₄0.05 탈이온수 적당량을 가해 1ℓ로 한다.

^a사면한천배지(c) 참조

접종시킨 제조배지를 250rpm의 2인치 회전 진탕기상의 250㎖ 삼각삼각플라스크 중 30℃에서 3 내지 5일간 배양시킨다.

B. A53868의 탱크 발효

대량의 접종물을 얻기 위해서는 상기 기술된 바와 같이 제조된 배양시킨 증식배지 10㎖를 증식배지 조성과 동일한 조성을 갖는 제2단계의 증식성 성장배지 400㎖에 접종시킨다. 이 제2단계 배지를 250rpm의 2인치 회전 진탕기상의 2ℓ 플라스크 중 30℃에서 48시간 동안 배양시킨다.

따라서 제조된 배양된 제2단계 증식배지(2ℓ)를 A항과 동일한 조성을 갖는 멸균 제조배지 100ℓ에 접종시킨다. 접종된 제조배지를 165ℓ 발효탱크 중 30℃ 온도에서 약 4내지 6일간 발효시킨다. 발효배지를 통상의 교반기로 교반하고 용해된 산소 농도가 대기압에서의 공기 포화도의 30% 이상을 유지하기에 충분한 속도로 멸균 공기 통기시킨다.

c. 화합물(1)의 분리

B항에서 기술된 바와 같이 수득된 발효액(200㎖)을 여과 보조제(2%, Hyflo, Johns-Manville Products Corp.)를 사용하여 여과한다. 균사체를 경사시키고 여과한 발효액을 16ℓ 다이아미온 HP-20컬럼(Mitsubishi Ind)에 흡착시킨다. 컬럼을 아세토니트림 : 물(1:9) 150ℓ로 용출하여 4ℓ획분을 모은다. 화합물(1)의 용출을 HPLC 분석법으로 모니터 한다. 이 분석법에서는 본 화합물은 다음 조건하에서 5.1분 후에 1/4"-X 30-㎝ Zarbax ODS(Dupont, 12μ) 컬럼으로 부터 용출된다:

유출속도=2.0㎖/분

검출=UV, 250㎚에서

감도=0.16흡광도 단위 전 스케일

용출용매=0.1% 인산 완충액 중의 8% CH₃CN, pH=3

목적하는 획분을 진공 중에서 농축시켜 아세토니트릴을 제거하고 조생성물 167g(건조된 분취물의 중량으로 계산)을 함유하는 수용액을 얻는다.

조생성물 100g 수용액 중 일부를 21 HP-20 컬럼에 넣는다. 컬럼을 10% NaCl(4ℓ)를 함유하는 물로 세척한 후 아세토니트릴 : 물(1 : 9)로 용출하여 200㎖ 획분을 모은다. 획분을 HPLC 분석법으로 분석한다. 활성 획분을 합하여 진공하에서 농축시켜 아세토니트릴을 제거하고 조생성물 약 15g을 함유하는 수용성 농축물을 추가로 얻는다.

수용성 농축물 중의 일부(8 내지 10g) 또는 처음의 HP-20 조생성물 수용액을 1981년 9월 1일 특허된 아보트 등의 미합중국 특허 제4287120호(실시예 6~7 참조)에 기술된 바와 같이 제조된 2ℓ LP-1/C₁₈예비 역상 HPLC 컬럼에 넣는다. 컬럼을 물(2ℓ)로 세척한 후 아세토니트릴 : 물(5 : 95) 용액과 0.1% 아세트산(pH=3)으로 120㎖/분의 유출 속도로 용출하여 80㎖ 획분을 모은 후 HPLC 분석한다. 용출과정을 254㎚에서 UV로 모니터한다. 목적하는 획분을 합하여 동결 건조하여 보다 정제된 생성물(2 내지 4g)을 얻는다.

이 생성물을 다음과 같이 더욱 정제한다 : 일부의 생성물(1g)을 1ℓ Zorbax ODS(12μ) 예비 HPLC 역상 컬럼상에서 아세토니트릴 : 물(5:95) 용액 및 0.1% 아세트산(pH=3)으로 50㎖/분의 유출속도로 용출하여 크로마토그라피하여 25㎖ 획분을 모은다. 254㎚에서 UV로 용출을 모니터하고 225㎚에서 HPLC형분석으로 획분을 분석한다. 목적하는 획분을 합하여 동결 건조시켜 정제 물질(85 내지 95%순도) 200 내지 500㎎을 얻는다.

200ℓ발효액으로부터 이 물질의 총 수득량은 5 내지 6g이다.

정제물질에 대해 리물루스 변형세포 분해질(LAL)을 사용한 내독소 시험을 행한다. 이 시험이 양성이면, 내독소를 제거하기 위해 이 물질을 Zeta por 여과기(AMF CUNO, Meriden, CT)에 1㎎/㎖로 통과시켜 물중으로 여과한다. 여액을 동결 건조시켜 내독소를 함유하지 않는 정제된 화합물(1)을 총 3 내지 5.6g 수득한다.

또한 내독소는 발열물질을 함유하지 않는 멸균 수중으로 공동 섬유 번들 투석하여 제거한다. 이 물질(약 500㎎)을 물(5㎖)에 용해시킨다. 이 용액을 5,000달톤의 분자량 차단장치가 부착된 44-섬유 스펙트라 Por HF 공동 섬유 번들(Spectrum Medical Industries, Inc., New York, NY)에 통과시켜 연속적으로 회전시킨다. 공동-섬유 번들은 300㎖의 발열물질을 함유하지 않는 멸균수로 충진된 플리커 공동-섬유 번들 투석장치(Corning Glass Works, Corning, NY)중에 장치한다. 농축물을 FMI 펌프(model RP, Fluid Metering Co., Oyster Bay, NY)를 사용하여 1㎖/분의 속도로 공동-섬유 변들에 통과시켜 연속적으로 회전시킨다.

D. 화합물(1)의 특성

형태 : 무색, 무정형

실험식 : C₁₁H₁₂N₃O₅P

분자량 : 약 307

원소분석 :

*회분은 인산염으로 밝혀졌다.

고속원자 충격법에 따른 질량 스펙트럼 분석 결과:

분자량=307

분자식=C₁₁H₂₂N₃O₅P

KBr 펠렛법에 의한 적외부 흡수 스펙트럼(유리산)은 다음 주파수(㎝^-1)에서 흡수 극대가 나타난다 :

3368, 3312 및 3300(브로드, 강), 3063(약), 2966(중정도 내지 약), 2833(매우 약), 2663(약), 1671(강), 1625(쇼울더), 1536(강), 1469(약), 1442(약), 1380(중정도 내지 약), 1340(매우 약), 1277(매우 약), 1240(쇼울더), 1207(강), 1157(매우 약), 1068(중), 1408(강), 918(중정도 내지 약), 797(중), 778(중) 및 625(약).

아미노산분석(6N HCl로 가수분해한 샘플)

전기적정(66% 수성 디메틸 포름아미드) : pka 8.2(글리실 아미노그룹)

용해도 : 물 및 디메틸설폭 사이드에 용해하며 거의 모든 유기용매에는 불응성이다.

핵자기 공명 스펙트럼(360㎒, DMSO-d^b에 용해한 샘플) : 일반식(1)로 보여지는 구조를 나타낸다.

[실시예 2]

제조 실예 1의 방법을 사용하여 단 LP-1/C₁₈정제 칼럼 대신에 다음 과정에 따라서 화합물(1)을 제조한다:

HP-20 단계로 부터의 조 생성물(180~200g/200ℓ 발효)을 메탄올(6~8ℓ)중에서 30분 교반한 뒤 여과한다. 미용해 고체를 메탄올 중에서 다시 교반하여 여과한다. 두 가지 메탄올 추출물을 합하여 2ℓ로 농축한다. 이 농축물을 10배량의 에틸 아세테이트에 가하고, 생성된 침전을 여과에 의해 제거하고, 건조시켜 72 내지 80g의 조생성물을 수득한다.

이러한 방법으로 수득한 생성물(100g)을 물(400~500㎖)에 용해한다. 이 용액에 농 NH₄OH를 가해 pH10으로 조절한다. 생성된 용액을 2ℓ 이온 교환 칼럼(아세테이트 형태의 AGl-×4, 100~200메쉬, 도웩스, 물로 충진 및 세척됨)상에 20㎖/분 속도로 적용시킨다. 칼럼을 물(4ℓ)로 세척하고 0.25% 빙초산으로 용출시키고, 1ℓ의 용적을 갖는 분획을 수집한다. 분획을 1/4"×15㎝ 조르박스 ODS(6μ) 칼럼상 분석용 HPLC에 의해 모니터하고, 0.1% 인산염 완충액중의 0.5% 아세토니트릴(pH3)로 용출시킨다. 원하는 분획을 합해, 농축 및 동결 건조시켜 보다 순수한(80 내지 %90순도) 생성물 15.5g을 생성한다.

이 생성물은 제조 실시예 1에서와 같이, 조르박스 ODS(12μ)제조용 HPLC에 의해 더 정제하는데 단 0.025%펜타플루오로 프로피온산을 함유한 아세토니트릴 : 물(5:95) 용매계로 용출시킨다.

[실시예 3]

H-LAPP의 제조

화합물(1)은 로이신 아미노 펩티다제(Sigma Chemical Co., St Louis, Mo)와 pH7.5, 실온에서 2시간 반응시킨다. 반응의 진행은 HPLC로 모니터한다. 화합물(1)이 충분히 반응하였을 때, 조르박스 ODS 칼럼상 0.1M 인산염 완충액중 7.5% CH₃CN(pH 3.5) 및 물을 사용한 HPLC에 의해 반응을 완결지어 N-(1-메틸렌-2-포스포노에틸)로 이신아미드[H-LAPP]를 20% 수율로 수득한다.

분자량=250

분자식=C₉H₁₉N₂O₄P

[실시예 4]

Ala-Gly-LAPP의 제조

화합물(1)을 알라닌과 이소부틸 클로로-포르메이트의 혼합 무수물과 표준 방법에 따라 반응시켜 Ala-Gly-LAPP를 생성한다.

[실시예 5]

Trp-LAPP의 제조

H-LAPP를 트립토판의 N-하이드록시석시나이드 에스테르와 표준 방법에 의해 반응시켜 Trp-LAPP를 생성한다.

[실시예 6]

Ile-Gly-LAPP의 제조

Ala-Gly-LAPP를 이소로이신의 이소부틸 클로로포르메이트와의 혼합 무수물과 표준 방법에 따라 반응시켜 Ile-Gly-LAPP를 생성한다.

[실시예 7]

CH₃-CO-NH-GLAPP의 제조

화합물(1)(GLAPP) 100㎎을 2.5㎖의 피리딘에 용해한다. 여기에 1㎖의 아세트산 무수물을 가하고 혼합물을 실온에서 3시간 교반한다. 혼합물을 질소하에 1㎖로 농축하고, 2㎖의 물을 가하고, 이 용액을 동결건조시킨다. 표제 생성물 115㎎을 수득한다.

고속 원자 충격법에 따른 질량 스펙트럼 분석 결과:

m/z

M+H 350(단일 아실화를 시사한다)

M+Na 372

M+K 388

분자량=349

[실시예 8]

GLAPP-모노 및 디메틸 포스포노 에스테르의 제조

화합물(1) (GLAPP)100㎎을 3㎖의 메탄올에 용해한다. 여기에 0.5㎖의 1N 염산을 교반하면서 가한 뒤, 디에틸에테르 중 1㎖의 증류 디아조메탄을 교반하며 가한다. 이 혼합물을 3시간 교반한 뒤 밤새 정치시킨다. 메탄올을 질소하에 제거하고, 10㎖의 증류수를 가하고 동결 건조시킨다. R²및 R³가 메틸이거나 R²및 R³중 하나는 메틸이고 나머지는 수소인 일반식(1) 화합물 75㎎을 수득한다.

고속원자 충격법에 따른 질량 스펙트럼 분석 결과 :

m/z

M+H 336

M+H 322

분자량 모노메틸=321

분자량 디메틸=335

Claims

A53868인자 A를 생산하는 스트렙토마이세스 루리두스 NRRL 15101(기탁번호 : KFCC-10057) 또는 그의 돌연변이체 또는 재조합체를 탄소, 질소 및 무기염의 동화 가능한 공급원을 함유하는 배지중에서 액침호기성 발효조건하에 실질량의 항생물질 활성이 생성될 때까지 배양시킴을 특징으로 하여 A53868인자 A를 제조하는 방법.
제1항에 있어서 스트렙토마이세스 루리두스 NRRL 15101(기탁번호:KFCC-10057)을 배양함을 특징으로 하는 방법.
제1 또는 2항에 있어서 A53868인자 A를 분리하는 추가 단계를 포함하는 방법.
제3항에 있어서, A53868인자 A를 로이신 아미노 펩티다제와 반응시키거나 선택적 산 가수분해시킨 뒤, 통상적인 용액상 펩타이드 합성법에 의해 일반식(2a) 화합물 및 그의 염을 제공하는 추가 단계를 포함하는 방법.

상기식에서 R¹은 단백에서 통상 발견되는 α-아미노산 형태의 특성화 그룹을 나타내며, R²및 R³는 독립적으로, 수소 또는 C₁-C₃-알킬을 나타내고, Z는 수소, C₁~C₆-알킬, C₁~C₆-알카노일, 페닐-C₁~C₃-알킬, 페닐-(X)m-C₁~C₃-알카노일 또는 아미노 보호그룹을 나타내며, Z'는 수소 또는 C₁~C₆-알킬을 나타내고, X는 산소 또는 황이며, m은 0 또는 1이고, n은 0, 1, 2 또는 3이며, 단, 1) R²및 R³가 모두 알킬인 경우에는 동일해야 하고, 2) n이 1인 경우에는 R¹, R², R³, Z 또는 Z'중 하나는 수소가 아니어야 한다.
제3항에 있어서, A53868인자 A를 통상적인 용액상 펩타이드 합성법에 의해 반응시켜 R¹이 수소이며 Z 또는 Z'가 수소가 아닌 제4항에서 정의된 일반식(2a) 화합물을 제공하는 추가 단계를 포함하는 방법.
제3, 4 또는 5항에 있어서, R², R³, Z 또는 Z'중 적어도 하나가 수소가 아닌 일반식(2a) 화합물을 유도체화 하는 추가 단계를 포함하는 방법.
제1, 3, 4, 5 또는 6항 중 어느 하나에 있어서 염이 약학적으로 무독한 염인 방법.
제7항에 있어서 포스포네이트 염이 모노나트륨염, 디나트륨염, 모노암모늄염, 디암모늄염 또는 모노사이클로헥실 암모늄염인 방법.
제7항에 있어서 아민염이 하이드로클로라이드인 방법.