PT90252B

PT90252B - Processo para a preparacao de um novo antibiotico polipeptidico com actividade anti-tumoral

Info

Publication number: PT90252B
Application number: PT90252A
Authority: PT
Inventors: Koji Tomita; Kin Sing Lam; Sandra June Hofstead; James Andrew Matson; Salvator Forenza; James Allen Bush
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1988-04-12
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1994-07-29
Also published as: DE68913063D1; JP2850132B2; JPH01317396A; DK174751B1; FI93969B; HK83195A; ES2061760T3; IE62912B1; PL161004B1; HUT50880A; PL278782A1; CY1849A; EP0337430A3; NO174474B; AU3272889A; EP0337430A2; IE891157L; CA1338262C; US5001112A; FI93969C

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM NOVO ANTIBIÓTICO POLIPEPTÍDICO

COM ACTIVIDADE ANTI-TUMORAL

Antecedentes da Invenção

A presente invenção refere-se a um atibiótico anti-tumoral designado por Kerdarcidin, à sua produção por Streptoalloteichus sp. Nov. estirpe L585-6, a composiçoes farmacêuticas que contêm este antibiótico e a um método para inibir o desenvolvimento tumor a 1 pelo referido antibiótico. A presente invenção também diz respeito a um microrganismo que produz Kedarcidin, o Streptoalloc h u s sp. Nov. estirpe L585-6, ATCC 53650.

Resumo da Invenção

A presente invenção proporciona um antibiótico anti-tumoral, o Kedarcidin, que é caracterizado do seguinte modo:

a) aspecto: solido côr de camurça;

b) peso molecular: 12 400 daltons, determinado por electroforese sobre gel de SDS - poliacrilamida, 17 000 pelo método de filtraçao por gel/HPLC;

.

c) espectro U.V. : substancialmente como representado na figura 1 ;

d) ponto isoe1éctrico : 3,65 e

e) compreende um polipéptido com a seguinte sequência de amjL noácidos :

X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-glyala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-serala- thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-alacys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glugly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-bly-tyr-valmet-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-alapro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyrgly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH; em que X representa um atõmo de hidrogénio ou um grupo escolhido entre os grupos H-ala-ser,

H-ser e H.

As características físico-químicas referidas anteriormente destinguem o antibiótico da presente invenção de qualquer outro antibiótico peptídico conhecido com actividade anti-tumoral tal co mo a neocarzinostativa, macromomicina , largomicina, actinoxantina e

AN-7D.

A presente invenção proporciona ainda um processo para a produção do antibiótico Kerdarcidin que consiste na cultura de uma estirpe produtora de Kedarcidin de Streptoalloteichus em um meio que contenha fontes assimiláveis de azoto e carbono sob condiçoes aeróbicas submersas e a recolha da referida proteina do caldo de fermentação.

Um outro aspecto da presente invenção proporciona uma estirpe que produz Kedarcidin de Streptoalloteichus sp. Nov. estirpe L 585-6, ATCC 53650.

3.

Ainda um outro aspecto da presente invenção consiste na prepara çao de composiçoes farmacêuticas que incorporam uma quantidade inibi^ dora de tumor do antibiótico Kedarcidin e com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Ainda mais um aspecto da presente invenção proporciona um método para inibição do desenvolvimento tumoral no hospedeiro mamífero que consiste na adminis traçao ao referido hospedeiro de uma quantid_a de inibidora de tumor do antibiótico Kedarcidin.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

A figura 1 representa um espectro de 0.V. do antibiótico Kedarcidin .

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO

Como sao aqui utilizadas as abreviaturas representam aminoacidos :

asx :	ácido aspartico +	asparagina
thr :	treonina
ser :	serina
glx :	ácido glutâmico +	glutamina
a s p :	ácido aspartico
a s n :	asparagina
glu :	ácido glutâmico
gin :	glutamina
pr o :	prolina
giy:	glicina
ala:	alanina

vai:	valina
met:	metionina
i 1 e :	isoleucina
leu:	leucina
tyr :	tirosina
phe :	fenilalanina
h i s :	histidina
1 y s :	lisina
arg :	arginina
c y s :	cisteína
trp:	triptofano

Organismo Produtor

A estirpe L585-6 foi isolada a partir de uma amostra de solo colhida no Estado de Maharastra, índia.

As características da estirpe L585-6 descrevem-se pormenorizadamente em seguida:

Morfologia:

A estirpe L585-6 e um organismo gram-positivo , filamentoso que forma substrato e micélio aéreo. 0 micélio do substrato penetra no agar e nao é fragmentado. Observam-se densos agregados globosos de hifas de 5 yim a 25 ^im de diâmetro em coalescência com hifas vegetativas. 0 micélio aereo e bem ramificado e desenvolve grande quaji tidade de hifas longas, direitas ou em espiral, em que se formam os esporos em cadeia contínua ou interrompida. Os tufos densos de cadeias de esporos, curtas e ramificadas, sao formados predominantemente em meio ISP η^θ 5. Ambos os tipos de esporos sao ovais a ci5.

líndricos curtos (de 0,4 a 0,6 por 1,0 a 2,0 ^im), imóveis e de superfície lisa.

Corpos incolores semelhantes a balões (de 5 jum a 20 de diâmetro) sao observados isolados em massa ao micélio aéreo após incubação durante 5 a 10 dias. Após uma incubaçao de 3 semanas ou mais estes corpos semelhantes a balões desenvolvem-se para grânulos esclerosados de cor castanha-amarelada (de 40 jum a 100 ^m de diâmetro) que estão cobertos com hifas aéreas mais alongadas.

Características de cultura crescimento é geralmente moderado mas é muito fraco sobre um meio de nitrato agar-sacarose de Czapek, agar-farinha de aveia e amído-sais minerais-agar. 0 micélio aéreo forma-se sobre agar-timosina e agar asparagina-glicerol mas nao se forma em meio ISP n^ss 2, 3,4, e 6 e em agar de Bennett. A cor do micélio aereo é branca amare lada. Nos meios ISP 6 e 7 formam-se pigmentos melanoides escuros.

Nao se formam outros pigmentos diferentes. As caracteri tura da estirpe L585-6 estão representadas no Quadro I.

de cul f

9.

Utilização de:

Tolerância a:

Lisozima, 0,01% (v/v) NaCl, 1% - 4% (v/v)

5% pH, 5,0 - 11,0 4,5 e 12

Trealose + Raginose + D - Melezitose

Amido solúvel + Celulose

Dulcitol

Temperatura:

Intervalo de desenvolvimento 18°C-39°C Ausência de desenvolvimento 15°C e 41°C Desenvolvimento optimo 30°C e 35°C

Inocitol

D - Manitol

D - Sorbitol

Salicina

Glicerol

D - Arabinose

L - Arabinose

D - Xilose

D - Ribose * 1 - Negativo em caldo de nitrato - sacarose de Czapek e positivo em caldo de peptona-nitrato.

* 2 - Meio básico : meio de Pridham-Gottlieb (= Meio ISP n ² 9)

10.

zr

Quadro III

3jC

Caracteristicas fisiológicas adicionais da estirpe L585-6

Hidrólise de;

Adenina

Caseína

Esculina

Acido hipurico Hipoxantina

T i ro s ina

Ureia

Xan t i na

Sobrevivência a 50°C, 8 hr

Utilização de:

Benzoa to

Citrato

Muca to

Succinato

Tartarato

Ãcido de:

Glicerol + D-Arabinose + L-Arabinose + D-Xilose

- L-Ramnose + D-Glucose +

D-Manose

Lactose

Celobiose

- Melibiose

Trehalose Rafinose

D-Melezitose

- Inositol - D-Manitol + D-Sorbitol

- Eritritol

Adonitol

Metil- -glucosidoTestes descritos por Gordon et. Al

J.Gen.Microb., 109: 1978,

69-78 .

i

Química da parede celular teor da estirpe L585-6 na parede celular foi examinado, de acordo com os métodos descritos por Becker et Al. in Appl . Micróbio 1 , 13: 1965, 236 - 243, por Yamaguchi in J. Bac t eri ol., 89:

1965, 444-453, e por Lechevalier e Lechevalier in Biology of Actinomycetes and Related Organisms, 11: 1976, 78 - 92.

peptidoglicano da parede celular contém ácido meso-diaminopimélico. A totalidade dos açúcares celulares inclui a galactose, glucose e a ribose. Deste modo, a parede celular pertence ao tipo IIIc. Os fosfolípidos sao do tipo P-II contendo fosfatidi1etanolamina, fosfatidi 1 g 1 icero 1 e fosfatidilinositol . As menaquinonas prin. cipais sao a MK-9(H^) e a MK-9(H^). 0 teste de glicolato é negativo .

Taxonomia

Entre os genes de Actinomycetales com cadeias longas de esporos a Pseudonocardia , a Saccharopolyspora , a Actinopolyspora, a Streptomyces, a Actinomadura, a Glycomyces, a Nocardio psis e a Amycolata sao claramente diferentes da estirpe L585-6 pela química celular incluindo o tipo da parede celular, o perfil do açúcar celjj lar, fosfolípidos e menaquinona. 0 kibdelosporangium (por Shearer et Al.., Int. J. Syst. Bacteriol, 36: 1986, 47 - 54, o Kitasotospor ia (por Takahashi et Al., S. Gen. Appl, Microbiol., 30: 1984,

377 - 387, e o Amycolatopsis (pot Lechevalier et Al., Int. J. Syst. Bacteriol., 36: 1986, 29-37), estáo relacionados com a estirpe L585-6 na composição de fosfolípidos e menaquinona mas o Kibdelosporangio e o Amycolatopsis diferem da estirpe pela presença de arabinose no .

no açúcar da parede celular e Kitasatosporia pela presença de ambos » os ácidos LL- e meso-diaminopimelico na parede celular.

Além disso, o Kibdelosporan°io conporta o esporângio que envolve as hifas como um corpo com uma verdadeira membrana e o Ki tasatosporia forma esporos submersos. Estas estruturas únicas nao se observam na estirpe L585-6. Quimiota xonomicamente, o Streptoalloteicus (por Tomita et Al., Int. J. Syst. Bacteriol., 37: 1987,

211-213, o Ac tinosynnema (por Hasegawa et Al. Int. J. Syst. Bacteriol, 28: 1978, 304-310), e o Saccharothrix (por Labeda et Al.,

Int. J. Syst. Bacteriol., 34: 1984, 426-431, sao os mais relacionados com a estirpe L585-6.

Actinosynnema forma cadeias de esporos aéreos desde a extre midade de uma sinema.O Saccharothrix forma cadeias de elementos cocóides fragmentados no micélio vegetativo e no micélio aereo e nao forma cachos de cadeias de esporos curtas ramificadas ou grânulos esclerõticos. A morfologia das cadeias de elementos cocoi des no Saccharothris Australiensis e no S. Aerocolonigenes (por Labeda., Int. J. Syst. Bacteriol., 36: 1986, 109-110), estão relacionados com os de Nocardiopsis mas nao estão relacionados com qualquer espécie de Streptomyces. Deste modo, a estirpe L585-6 nao esta situada nem como Actinosynnema nem como Saccharothrix.

Streptoalloteichus hindustanos comporta cadeias de esporos em espiral longas de artroesporos, cadeia de esporos curtos ramificada e grânulos escleróticos no micélio aereo e o corpo globoso denso de hifas, assim como um corpo idêntico ao esporângio que envolve de um a quatro esporos com flagelos no micélio vegetativo A estirpe L585-6 forma todas as vesículas semelhantes a pequenos esporângios. Como o Steptoalloteichus a estirpe L585-6 forma um

13.

corpo semelhante a um balao que se desenvolve em grânulo esc lerótico. Esta estrutura tem sido observada em muitas espécies de

Steptomyces tais como a S.Kanamyceticus (por Shirling et Al. , Int.

J. Syst. Bacteriol., 22, 1972, 265-394), e a S. Roseicleroticus (Chainia Rubra) (por Shirling et Al., Int. J. Syst. Bacteriol., 22:

1972, 265-394).

Com base nas considerações acima referidas, a estirpe L585-6 é classificada no género Streptoalloteichus. A estirpe L585-6 difere do Streptoalloteichus Hindustanus pela ausência de capacidade para formar micélios aéreos em meio ISP n^as 2, 3 e 4 e ainda no agar de Bennet, a forraaçao de melanina, a ausência de hidrólise do amido , a ausência de desenvolvimento a 41°C e a capacidade para utilizar apenas D-ribose e D-glucose entre os 25 açucares testados. Portanto, a estirpe L585-6 é considerada como uma nova espécie do género Steptoalloteichus.

A cultura biologicamente pura da estirpe L585-6 que se determinou ser uma nova espécie do género Steptoalloteichus foi depositada na American Type Culture Collection (Rockville, MD) e adicionada à sua colecçao permanente de microrganismos como ATCC53650.

Produção de Antibióticos antibiótico anti-tumoral da presente invenção e produzido mediante cultura da estirpe L585-6 ou de um seu mutante sob condições de submersão em um meio nutriente aquoso. 0 organismo produtor desenvolve-se em um meio nutriente que contem uma fonte de .

carbono assimilável, por exemplo um hidrato de carbono assimilável. Os exemplos de fontes de carbono apropriadas incluem a cerelose e o glicerol. 0 meio nutriente deve também conter uma fonte de azoto assimilável tal como peixe, extracto de levedura ou sais de amó nio. Os sais inorgânicos, tais como o cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio, carbonato de cálcio, fosfatos, etc., sao adicionados, se necessário. 01igoelementos como cobre, manganês , ferro, zinco, etc., sao adicionados ao meio se se desejar ou poder estar presentes sob a forma de impurezas em outros constituintes do meio. A temperatura de incubaçao pode ser qualquer temperatura a qual a estirpe produtora seja capaz de se deseji volver, por exemplo compreendida entre 18°C e 39°C, mas de preferência a fermentação deverá conduzir-se a uma temperatura compreendida entre 25°C e 35°C, com maior preferência entre 27°C e os 32°C. Um Ph neutro é preferentemente utilizado no meio e a produção do antibiótico e geralmente realizada durante um periodo de 4 a 8 dias. Geralmente uma produção óptima e conseguida em cerca de 5 a 6 dias. Para a preparaçao de quantidades relativamente peque nas do antibiótico podem ser utilizados frascos de agitaçao e cultura de superfície, mas para a preparaçao de quantidades maiores preferem-se culturas aerobicas submersas e tanques estereis, Ouari do se quer realizar um tanque de fermentação e apropriado produzir um inoculo vegetativo no caldo nutriente mediante inoculação de e_s poros no caldo de cultura provenientes do organismo e quando o ijpó culo vegetativo activo recente se obteve transfere-se asséptica mente para o tanque de fermentação que contém o meio.

Deve fazer-se a agitaçao por meio de um agitador mecânico.

Podem também ser adicionados, se necessário, agentes anti-espuma

15.

/ tais como óleo de banha ou óleo de silicone.

A produção do antibiótico Kedarcidin no meio de fermentação pode ser facilmente controlada durante o desenvolvimento da fermentação por ensaios anti-microbianos utilizando-se o Bacillus Subtilis como organismo de ensaio ou pelo ensaio de citotoxicidade celular utilizando linhas de células de tumor murino (B16-F10) ou de tumor humano (p/ex. HCT-116.KB).

Deve entender-se que a presente invenção nao esta limitada a utilização da estirpe particularmente preferida L585-6 referida anteriormente ou a organismos que correspondem completamente a des. criçao anterior. Deve entender-se especialmente que se podem in — eluir outras estirpes que produzem Kedarcidin ou mutantes do refe rido organismo que podem ser produzidas por meios convencionais tais como radiaçao de raiox X, radiaçao ultra-violetas, tratamento com mostardas azotadas, contacto com fagos ou similares.

Isolamento e purificação do antibiótico

A proteína anti-tumoral da presente invenção pode ser isolada do caldo de fermentação uti1izando-se metodologias de separa çao tais como diálise, ultrafiltraçao, filtraçao por gel, precipg taçao isoe 1ectrica , método de salmoura, electroforese, cromatogra fia de permuta ionica e cromatografia de afinidade. De um modo geral utiliza-se uma associaçao destas técnicas em sequência para purificar a proteína até se conseguir uma homegeneidade evidente. 0 processo de isolamento e purificação pode ser controlado e orientado por ensaios microbiológicos tais como os que utilizam B.Subtillis, ensaios de citotoxicidade contra

16.

linhas de células de cancro humano ou murino in vitro, ensaios antj. -tumorais in vivo ou por métodos físicos tais como as técnicas de U.V. ou de HPLC. 0 esquema I descreve uma sequência de isolamento e purificação típica. Esta sequência especial tem a finalidade de ilustrar apenas e nào deve ser considerada pelos técnicos de forma a que a utilização de sequências diferentes que usam outros métodos nao possam ser também utilizadas desde que se obtenha pro teina com um elevado grau de pureza e retendo esta as suas actividades biológicas.

Esquema I

Isolamento e purificação de proteína caldo de fermentação

Γ- I micélio filtrado permuta amiónica tampao | tampao + 1 M NAC1 eluente eluente eluente filtraçao por gel eluente permuta aniónica preparati va solução purificada de proteína liofilizaçao proteína purificada /

17.

-Τ'

Para se utilizar o esquema I, a massa insolúvel do caldo de fermentação completo e retirada sendo utilizado um método convencional tal como a centrifugação ou a filtraçao. Se o caldo deve ser filtrado pode utilizar-se vantajosamente um auxiliar de filtra, çao tal como a Dicalite. Em seguida, submete-se o filtrado a uma crornatografia de permuta anionica uti1izando-se como eluente um tampao catiónico com um intervalo de Ph entre 7 e 8 e em seguida o mesmo tampao contendo cloreto de sodio. Constitui um tampao catiónico apropriado para estes valores de pH, por exemplo o tris-HCl. A fracçao eluida com tampao contendo NaCl e recolhida, con. centrada e em seguida purificada por crornatografia de filtraçao por gel utilizano-seo mesmo tampao catiónico. As fracções sao re colhidas e analisadas para a detecção da presença do componente activo. Um sistema inicial conveniente para a monitorização do eluato e o ensaio sobre o Bacillus Subtilis. Aquelas fracções que exibirem zonas de inibição sao reunidas, concentradas e seguida mente purificadas por crornatografia de permuta aniónica utilizando-se como eluente inicial um tampao catiónico com cm pH de valores compreendidos entre 7 e 8 continuando com um gradiente linear de força iónica crescente. As fracções activas sao controladas para verificação da homogeneidade por técnicas de electroforese de gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS - PAGE), focagem isoeléctrica e HPLC. As fracções consideradas homogéneas sao reunidas e liofilizadas para fornecerem a proteina activa.

Antibiótico

Kedarcidin constitui um antibiótico anti-tumoral proteico potente composto por uma unica cadeia polipeptidica e um cromoforo

18.

nao proteico .

Ainda qye as amostras do antibiótico submetidas a caracterizaçao físico-química e a ensaios biológicos se tenham considerado homogéneas por meio de aplicaçao de SDS-PAGE, focagem isoeléctrica e HPLC durante as experiências de sequenciação, descobriu-se que o antibiótico era constituído por uma variante principal e uma ou duas variantes secundárias. As variantes diferem na sequência inicial de aminoácidas N-terminal do polipéptido como se descrevera a seguir;

Para a actividade anti-tumoral nao é exigida a separaçao ou isolamento das variantes individualizadas.

A presente invenção também abrange variantes de Kedarcidin em que a fracçao peptidica do antibiótico pode ser alterada por meio de técnicas conhecidas para se obterem fragmentos dos seus derivados, por meio de delecçao, adiçao ou substituição de certos aminoácidos na estrutura primária do péptido sem alteraçao substancial da actividade anti-tumoral do antibiótio como aqui se descreve.

Composição de aminoácidos

Mediante utilização de métodos convencionais bem conhecidos na especialidade, a composição de aminoácidos da proteina purificada foi determinada e encontra-se representada no Quadro VI.

19.

Composição em aminoácidos do Kedarcidin

Quadro IV

Rendimento

Resíduos

	nmol	mol!?	(a)	(b)
a s p	2,765	8,1	10,1	9,3	(6)
a s n					(3)
thr	3 , 18	9,3	11,6	10,6	(11)
ser	3 , 163	9,3	11,5	10,6	(12)
glu					(4)
gin	1,928	5,7	7,0	6,5	(2)
pro	1,615	4,7	5,9	5,4	(4)
giy	5,529	16,2	20,1	18,5	(18)
ala	5,566	16,3	20,3	18,6	(18)
vai	3,731	11	13,6	12,5	(13)
met	0,2873	0,8	1,1	1,0	(D
i le	0,8531	2,5	3,1	2,9	(3)
leu	1,298	3,8	4,7	4,3	(4)
tyr	0,6274	1,8	2,3	2,1	(2)
phe	1 , 565	4,6	5,7	5,2	(5)
h i s	0,6235	1,8	2,3	2,1	(D
1 y s	0,3196	0,9	1,2	1,1	(0)
arg	1,001	2,9	3,7	3,3	(3)
c y s	0	0	0	0	(4)
trp	0	0	0	0	(0)

(A)	Numero de de 12.000	residuos por péptido para o péptido.	considerando	um	peso molécular
(B)	Numero de	resíduos por péptido	considerando	um	total de	114
	resíduos.	Os valores entre parênteses indicam	o número	de re-
	siduos por	péptido determinado	por análise	da	sequência	de ami

noácidos.

20.

Sequência de aminoácidos

Para a análise de sequência de terminal amina, reduziu-se o Kedarcidin com 2-mercaptoetanol e purificou-se em seguida;por meio de SDS-PAGE (15% acrilamida) e recolheu-se dos geles por electroeluiçao ou electrocoloraçao.

Para a maior parte das cisões enzimáticas utilizou-se o Kedarcidin sem outra purificação. 0 Kedarcidin foi reduzido com 20 mM de ditiotreitol em 100 ^il de tampao Tris-HCl, pH 8,5, contendo cloridrato de guanidina 5M, EDTA sódico a 0,1%, durante duas horas ã temperatura de 50°C e foi subsequentemente S-piridi1eti1ado com 100 mM de S-vivi 1 piridina durante a noite à temperatura ani biente. A reacçao foi interrompida mediante a adiçao de 10 Jil de 2-mercaptoetanol durante 1 hora a temperatura de 50°C. Retiraram-se os reagentes por meio de diálise contra acido acético a 5% (v/v) durante 24 horas e o Kedarcidin modificado foi subsequentemente seco com um concentrador de centrífuga Speedvac (Savant Instruments) .

A cisão enzimática do kedarcidin S-piridiletilado por ASP-N enzima ou com protease V8 de S, Aureus foi realizada em 40 jil de tampao Tris 0,1 M/acido acético, pH 8,0, contendo 0,7 M de ureia a temperatura de 37°C durante a noite utilizando uma proporção enzj^ ma/substrato de 1:100 (ASP-N) ou de 1:10 (protease V8). A diges tao com tripsina foi realizada em 40 jil de tampao Tris 0,lM/ácido acético, pH 8,0, a temperatura de 37°C durante a noite e uma proporção enzima/substracto de 1:20. Os digestos enzimaticos foram acidificados com ácido trifluoroacético (TFA) para um pH 2,0 e se parados por HPLC de fase inversa.

A purificação do péptido foi realizada por HPLC de fase inversa em um sistrma de separaçao Model 130A (Applied Biosystems, Inc.) e a temperatura de 40°C em uma coluna RP-300 (2,1x100 mm; Applied Biosystems, Inc.). Foram utilizados para a eluição gradientes de acetonitrilo lineares compostos por TFA a 0,1% em água como tampao inicial e TFA a 0_;085% contendo 60% de acetonitrilo como tampao limitante. Recolheram-se os péptidos manualmente. As determinações da sequência de aminoácídos foram realizadas em um sequenciador de am_i noácidos automático (Model 475A, Appleid Biosystems, Inc.) utilizaji do-se técnicas convencionais

A variante polipeptídica principal consistia em 114 resíduos de aminoácido, a sequência de aminoácidos foi determinada como sendo a seguinte:

N— Terminal:

H-ala-ser-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-g1y-OH.

C - Terminal

Foram identificadas duas variantes menores: numa delas faltava a primeira alanina da variante principal e na segunda faltavam os .

dois primeiros aminoácidos, isto e, alanina e serina variante principal.

presentes na

Determinação do peso molecular

A) Pelo método HPLC/filtraçao por gel.

Utilizando uma coluna TSK-G2000 SW (7,5x300 mm) (LKB Produkter AB, Suécia) realizou-se a filtraçao por gel usando tampao Tris-HC1 50 mM contendo cloreto de sódio 0,5Μ, pH 7,4, com um caudal de 0,5 ml/minuto.

Alternativamente pode utilizar-se uma Waters Associates Protein Analysis Column I - 125 com eluente constituído por acetato de Tris 0,2 M com um caudal de 1 ml/minuto. 0 peso molecular foi estimado como sendo de 17 000 daltons a partir da curva de referência obtida por indicadores de peso molecular padrão (Bio Rad Laboratories) .

B) Pelo método de electroforese de dodeci1-sulfato de sódio/gel de poliacrilamida.

Uma amostra da proteína e indicadores de peso molecular (adqu_i ridos a Divers^;fied Biotech, Maine) foram misturados com igual volume de Seprasol (líquido de solubilizaçao de proteína pronto a usar contendo sacarose e um agente corante indicador e aquecidos d_u rante 30 minutos à temperatura de 90°C imediatamente antes da electroforese. Desenvolveu-se a electroforese a 300v em Seprabuff (Tris23 .

-Glicina-SDS, pH 8,3) até que o agente corante alcançasse a extremidade do gel. Em seguida o gel foi imerso em uma solução de coloração (1,25 g de comassie BB R-250, 92 ml de ácido acético glacial em 908 ml de metanol aquoso) durante pelo menos 10 horas e em seguida numa solução descorante (75 ml de ácido acético e 50 ml de metanol em 875 ml de água) até que o último plano de gel ficasse transparente. Adquiriu-se o Seprasol e o Seprabuff Integrated Separation Systems, Massachusetts. 0 peso molecular foi avaliado como sendo de 12 400 daltons por meio deste método.

Focagem isoeléctrica gel utilizado para a focagem ê preparado pela mistura de:

acrilamida em água a 29,1% 10 ml Ν , N¹-metileno-bis-acri1amida em água a 0,9% 10 ml Glicerina 7 ml

Ampholine 1802, pH 2,5-4 3 ml Agua q.b.p . 60 ml

A solução resultante foi desgaseifiçada durante 10 minutos adj^ cionada em seguida com 1,5 ml de persulfato de amónio em água a 1% e 10 y-i 1 de Ν , Ν , Ν ' , N '-tetrametiletilenodiamina . A mistura foi vertida sobre o molde e deixada a polimerizar . As soluçoes dos eléctrodos utilizados foram ácido fosfórico IM no ânodo e Ampholi24.

ne 1809 a 2% pH 6-8, no cátodo. A experiencia de focagem foi realizada a uma potência constante de 25 watts durante 2 horas. A per_ centagem refere-se a peso por cento em volume. 0 ponto isoelectrico determinou-se como sendo de 3,65 e a distância de migraçao do cátodo de 6,25 cm.

Actividade Biológica

Avaliou-se a actividade anti-tumoral da proteína sobre leucémia P388 murina transplantável, ratos CDF^ foram inoculados por via intraperitonea1 (ip.) ou por via endovenosa (iv.) com 10θ células de leucémia P388 obtidas de ratos dadores DBA/2 portadores desta leucemia murina transplantável. Os ratos foram tratados contra a leucémia P388 inoculada por ip. com solução de cloreto de sodio (ratos de controlo) ou com doses de Kedarcidin uma vez por dia durante cinco dias consecutivos iniciando-se este período um dia após a inoculação do tumor. Contra a leucémia P388 inoculada por via iv. os ratos receberam o Kedarcidin por via iv.no primeiro, terceiro e quinto dias a implantaçao.

Estes animais foram observados diariamente e as suas mortes foram registadas. As alterações do peso da massa corporal media (a partir do dia da implantaçao da leucemia ate ao ultimo dia de tratamento) foram determinadas para todos os grupos como um meio de reflexo da toxicidade do fármaco. A incidência de ratos vivos em cada grupo no quinto dia após a implantaçao do tumor foi regi£ tada como um meio adicional de avaliaçao da toxicidade do farmaco.

Se no quinto dia em cada grupo de tratamento tinha morrido mais

25.

do que um rato nao era considerado como resultado terapêutico sign_i ficativo. Os grupos de tratamento consistiam em 4 ou 6 ratos; os grupos de controlo compreendiam 10 ratos. Se no trigéssimo dia , o último dia das experências, existia algum sobrevivente o seu numero também era registado. No fim da experiência o tempo de sobrevivência medio (MST) para cada grupo foi determinado utilizando-se pa_ ra o cálculo da percentagem de T/C que consiste na relaçao entre o MST de um grupo tratado e o MST do grupo de controlo multiplicado por 100. Um valor em 7_a de T/C de 125 ou superior indica uma activj. dade anti-tumoral significativa. Os dados in vivo estão representados nos Quadros IV e V.

Quadro IV

Actividade anti-tumoral sobre leucemia P388 implantada por ip.

Dose a )

Lote	d i1 . ou mg/kg/inj.	tempo medio de sobrev. (d) ^T/C	Alterado peso medio	de (g)	N² de vivos no
D16F411	Dil. 1-40	7,0	74	-1,9		4/4
	Dil. 1-80	10,0	105	-1,2		4/4
	Dil. 1-160	12,5	132	-1,0		4/4
	Dil. 1-320	18,5	195	-1,9		4/4
	Controlo	9,5	—	0,2		10/10
D18F413	0,27	7,0	70	-1,9		4/6
	0,09	15,0	150	-0,8		6/6
	0,03	17,0	170	-1,7		6/6
	0,01	15,0	150	-0,3		6/6
D18G414^b)	0,09	9,5	95	-1,3		6/6
	0,03	15,5	155	-1,2		6/6
	0,01	14,5	145	-0,5		6/6
	0,0033	14,0	140	-0,2		6/6
Controlo		10,0	—	0		10/10

26.

fármaco administrado ip. uma vez por dia durante cinco dias consecutivos com inicio um dia apos a inoculação do tumor.

b) preparação liofilizada e reconstituída da mesma amostra representada pelo lote D18F413

Quadro V

Actividade anti-tumoral sobre leucemia P388 implantada por i.v.

Lote	d i1: ou mg/kg/in i.	tempo medio de sobrev. (d)
D18F413	0,32	6,0
	0,16	7,5
	0,08	11,0
	0,04	12,5
	0,02	10,0
	0,01	8,0
D16F411	Dil. 1-25	7,0
	Dil. 1-50	10,5
	Dil. 1-100	13,0
	Dil. 1-200	9,5
	Dil. 1-400	9,0
	Dil. 1-800	8,0
	Controlo	8,0

Alteraçao de N^e de ratos %T/C peso médio (g) vivos η o 5 ^s d i a

75	-3,1	6/6
94	-3,2	6/6
138	-1,4	6/6
156	-0,6	6/6
125	0,1	6/6
100	1,2	6/6
88	-2,9	6/6
131	-1,6	6/6
163	-1,2	6/6
119	-0,2	6/6
113	0,5	6/6
100	0,8	6/6
___	___	10/10

a) fármaco admininstrado por i.v. nos l^s, 3^S e 5^S dias implantação do tumor.

apos a .

Kedarcidin foi também avaliado sobre melanoma murino B16 implantado por via intraperitonea1 com 0,5 ml de tumor brei a 10%.

Para cada valor da dose foram utilizados 10 ratos. 0 fármaco foi administrado por via i. p. uma vez por dia durante nove dias consecutivos, iniciando-se o tratamento um dia após a implantaçao do tumor.

Foram registados os numeros de ratos vivos nos 10² e 60^a dias correspondendo este ultimo ao final da experiência. Os resultados do teste estão representados no Quadro VI. Os valores da % de T/C de 125 ou superiores indicam uma actividade anti-tumoral significativa .

Quadro VI

Actividade anti-tumoral de Kedarcidin sobre melanoma B16 implantado por i.p.

Dose (mg/kg/dose)	MST (d)	%T/C	Alteração de N° de ratos peso médio (g) vivos no 5^a dia
0,256	16,0	97	-2,7	9/10
0,128	24,5	148	-1,3	10/10
0,064	26,5	161	0,3	10/10
0,032	31,5	191	1,0	10/10
0,016	32,5	197	0,6	10/10
0,008	34,0	206	0,6	9/10
0,004	27,0	164	0,3	10/10 (1)
0,002	21,5	130	0	10/10
Controlo	16,5	-	1,3
* Numero entre	parênteses	= número	de murganho vivos no	60^a dia

após a implantação do tumor.

.

Os resultados dos testes apresentados nos Quadros IV, V e VI, demonstram que o antibiótico Kedarcidin constitui um produto poten te exibindo actividade anti-tumoral in vivo reprodutível sobre a leucemia P388 e o melanoma B16 murinos.

A actividade observada foi manifestada pelo aumento do tempo de vida sobre o melanoma B16 implantado por via i.p. e sobre a leu cémia P388 implantada quer por via i.p., quer por via i.v., sendo esta última a forma da doença mais difícil de tratar eficazmente devido a sua natureza disseminada.

Kedarcidin também foi avaliado contra o melanoma B16 implaji tado por via subcutânea, tumor de pulmão murino M5076 e leucemia P388 implantada por via intra-craneana mas não exibiu uma actividade significativa nestes modelos animais.

A presente invenção inclui no seu âmbito composiçoes farmacê_u ticas que contêm uma quantidade eficaz inibidora de tumor do antibiótico da presente invenção em associaçao com um veiculo inerte aceitável em farmácia ou um diluente. Estas composiçoes podem também conter outros agentes anti-tumorais activos e podem ser apresentadas sob qualquer forma farmacêutica apropriada a via de administraçao que se deseja. Exemplos destas composiçoes incluem composiçoes sólidas para administraçao oral tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós e grânulos, composiçoes líquidas para adm j_ nistração oral tais como soluçoes, suspensões, xaropes e elixires e preparações para administraçao parenterica tais como soluçoes estereis , suspensões ou emulsões.

.

Também podem ser preparadas sob a forma de composiçoes solidas estereis, para serem dissolvidas em água estéril, solução fisiológica de cloreto de sódio,ou qualquer outro meio injectável estéril, imediatamente antes da injecçao.

Para a utilização como agente anti-tumoral as doses e regimes óptimos para um dado mamífero hospedeiro podem ser facilmente dete_r minados pelos técnicos. Evidentemente que será correcto que a dose real utilizada varie de acordo com a fórmula da composição em causa, a vida de administraçao e o local particular, hospedeiro e doença a tratar. Muitos factores que alteram a acçao do farmaco têm de ser considerados incluindo a idade, o peso, o sexo, o regime alimentar, o tempo de administraçao, a via de administraçao, a taxa de escreçao, a c tndição do doente, as associações de fármacos, as reacçoes de sensibilidade e a gravidade da doença.

A presente invenção é ilustrada pelos exemplos que se seguem, que nao sao construídos com qualquer intenção de limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplo 1

Preparaçao de. cultura vegetativa de Steptoa 11 oteichus estirpe L585-6

A estirpe L585-6 de Steptoalloteichus sp. (ATCC-5365O) foi man tida e transferida para tubos de ensaio com lâminas (slants) de agar/extracto de malte de levedura constituído por:

30.

dextrose extracto de levedura extracto de malte CaCO^

Agar

Água destilada

4,0 g

10,0 g

1.5 g 15 g litro

Cada tubo com lâmina (slant) de agar transferido foi incubado à temperatura de 28°C durante duas semanas. A cultura vegetativa foi preparada mediante transferência da superfície de crescimento da lâmina de cultura para um Balao Enlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de meio estéril constituído por:

CeréLose (Corn Products) 30 g

Pharmamedia (Traders Oil Mill Co.) 10 g

Nutrisoy (Archer Daniels Midland Co.) 10 g

CaCO^ 3 g

Água destilada q.b.p. 1 litro

Esta cultura vegetativa foi incubada a temperatura de 28°C durante 72 horas num agitador rotativo ajustado para 250 rotaçoes /m nuto .

Exemplo 2

Fermentação em frascos com agitaçao

Inocularam-se 5 ml da cultura vegetativa obtida de acordo com o processo descrito no exemplo 1, em balões Erlenmeyer contendo cada um 100 ml de um meio que consistia em:

.

Glicerol		30	g
Pharmamedia		10	σ o
Destilados solúveis (Nutrition	Products Co)	15	g
Farinha de peixe (Menhaden)		10	g
CaCO^		6	g
Agua destilada	q.b.p.	1	litro

A cultura de produção doi incubada a temperatura de 28°C num agitador rotativo ajustado para 250 rotaçoes/minuto. A produção do antibiótico proteico foi controlada por ensaio microbiano utilizaji do-se o B.subtilis e os ensaios de citotoxicidade in vitro utilizaram uma linha de células de melanoma B16-F10 murino e linhas de células de tumor humano.

A produção óptima foi, de um modo geral, alcançada entre 144 e

168 horas.

Exemplo 3

Fermentação em tanques

Inocularam-se 25 ml da cultura vegetativa obtida de acordo com o processo descrito no Exemplo 1, num frasco vitro de 2 litros que continha 500 ml do mesmo meio vegetativo. A segunda cultura de sementeira foi ainda incubada a temperatura de 28°C durante 72 horas num agitador rotativo com uma velocidade de agitaçao de 250 rotaçoes/minuto. Inocularam-se 500 ml da segunda cultura de sementeira, num fermentador New Brunswick Microgen (volume nominal de 16 litros) contendo 10 litros de meio de produção com uma composição igual a indicada no Exemplo 2. A fermentação foi realizada a temperatura de .

C com arejamento de um volume/minuto e uma agitaçao de 250 rotações/ minuto.

A produção do antibiótico Kedarcidin foi controlada por bioens a i o s i n vitro apropriados.

Exemplo 4

Isolamento e purificação de Kedarcidin

Misturaram-se 10 litros de caldo de fermentação bruto com 6 litros de Dicalite e a pasta espessa resultante foi filtrada sobre uma placa de Dicalite.

Rejeitaram-se os produtos insolúveis e o filtrado foi bombado através de um cartucho de permuta iónica Zeta Prep. 250 QAE (LKB-Produkter. AB, Suécia) com uma velocidade de 30 ml/minuto.

cartucho tinha sido previamente equilibrado com 2 litros de tampao Tris-HCl + 50 mM de pH 7,4.

Recolheu-se o efluente. 0 cartucho foi lavado com 1 litro de tampao 50 mM Tris-HCl de pH 7,4 e em seguida eluído com 500 ml de tampao 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 contendo 0,5 mole de cloreto de sódio.

eluato foi recolhido e concentrado de 500 ml para 100 ml utilizar^ do-se uma célula de u1trafi1traçao padrao Amicon equipada com uma membrana Amicon YM5. A solução concentrada foi percolada através de uma coluna de filtraçao por gel (5 x 100 cm) contendo 1400 ml de Ultrogel AcA54 (LKB-Produkter AB, Suécia) em um volume igual de tam pao 50 mM Tris-HCl. 0 leito de Ultrogel tinha sido equilibrado com 5 litros de tampao 50 mM Tris-HCl de pH 7,4. A coluna carregada foi eluída com 2 litros de tampao 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, a 60 ml/minuto.

/ .

Após uma aliquota inicial de 450 ml, recolheram-se fracções de 10 ml e cada fracçao foi analisada com B.Subtilis: As fracções que apresentaram zonas de inibição (fracções 83-133) foram reunidas e a seguir foram concentradas até um volume de 100 ml por ultrafiltra_ çao. A solução concentrada foi filtrada através de uma coluna de permuta iónica (de 2,5 x 15 cm) compactada com uma pasta de 70 ml de DEAE Trisacryl (LKB-Produkter AB, Suécia) em um volume igual de tampao 50 mM Tris-HCl. 0 leito de Trisacryl tinha sido equilibrado com 10 volumes de coluna de tampao 50 mM Tris-HCl. A coluna carregada foi inicialmente eluida com 10 volumes de coluna de tampao 50 mM Tris-HCl, seguido de 300 ml de gradiente linear (coeficiente angular= 0,1 M/h) de tampao a 100% de 50 mM Tris-HCl para tampao a 100% de mM Tris-HCl contendo NaCl 0,5 M com um caudal de 60 ml/h.

Recolheu-se um total de 47 fracções de 5 ml e analisaram-se contra B.Subtilis . As fracções activas, 25 - 37, foram reunidas e submetidas a HPLC/filtraçao por gel analítica utilizando-se uma coluna Waters Protein Analysis I - 125, acetato de Tris 0,2 M pH 7,0 a um caudal de 1 ml/min. como eluente e um detector U.V. a 260 nm. Sob estas condiçoes o cromatograma exibiu um único pico com um tempo de retenção de 8,3 minutos. As fracções reunidas foram também consideradas como homogéneas por análise de focagem isoelétrica e SDS-PAGE utilizando-se as condiçoes descritas anteriormente.

A concentração do componente activo foi avaliada como sendo de 4,25 mg/ml por liofilizaçao de uma aliquota de 10 ml e correcçao pa^ ra o peso do tampao.

.=•34

Claims

1, dico com

Processo para a preparação de um antibiótico polipeptí-

as características seguintes: a) aspecto: sólido de cor camurça b) peso molecular: 12.400 daltons

determinado pelo método de electroforese de gel de SDS-poliacriiamida; e 17.000 determinado pelo método de filtração/HPLC por gel;

c) espectro de UV: substancialmente como se representa a seguir:

• «J c

--3 5 :si’i;ctro no ultravioleta do antibiótico <

-O o

I (flV) VIDNVAHOSSV (d) ponto esoeléctrico 3,65; e (e) comportando um polipéptido com a sequência de aminoácidos como segue:

X-ala-sia-val-ser-val-ser-prc-ala-thr-gly-ieuala-asp-gly-ala-thr-val-thr-vai-ser-ala-ser-glyphe-ala-thr-ser-thr-s e r- ala-thr-ala-leu-gin-cys-ala ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-giuphe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-glv-thr-t hrser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-t hr-gly-tyr-vai-metpro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thrala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn.-thrgly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH;

na qual X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo escolhido entre K-ala-ser e H-ser, caracterizado pelo facto:

a. de se cultivar uma estirpe de Streptoalloteichus, produtora do antibiótico, em um meio contendo fontes de carbono e de azoto assimiláveis sob condições aeróbias submersas; e

b. de se recolher o antibiótico do meio de cultura.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a estirpe produtora citada antes ser a estirpe L585-6, com o número de aceitação na ATCC 53650.

3.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas que inibem o desenvolvimento de um tumor sensível ao antibiótico polipeptídico em um hospedeiro mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade inibidora do tumor eficaz do referido antibiótico polipeptídico, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

4.- Cultura biologicamente pura, caracterizado pelo facto de conter o microrganismo Strep-oalloteicnus sp. nov., Estirpe L535-6,