NO164111B

NO164111B - Fremgangsmaate for fremstilling av et antibiotisk virksomta 40926-kompleks og dets rene faktorer pa, pb, a, b og bomikron.

Info

Publication number: NO164111B
Application number: NO854018A
Authority: NO
Inventors: Enrico Selva; Luciano Gastaldo; Grazia Beretta; Angelo Borghi; Beth P Goldstein; Vittorio Ariolo; Giovanni Cassani; Francesco Parenti
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1984-10-11
Filing date: 1985-10-10
Publication date: 1990-05-21
Also published as: IE852489L; JP2572937B2; ATE49215T1; EP0177882B1; FI81117B; CA1317900C; HU194317B; DK457385A; DK457385D0; IL76596A; JPH06225757A; MY100880A; AU599308B2; GB8425685D0; PT81288A; AU4819585A; DK161092B; FI853914L; PH23013A; PT81288B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling et nytt antiblotisk stoff vilkårlig betegnet antibiotikum A 40926-kompleks og dets, faktorer antibiotikum A

40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A

40926 faktor B0, antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB, ved dyrking av den nye stammen Actinomadura Sp. ATCC 39726.

De antibiotiske stoffene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er glykopeptldiske forbindelser som tilhører vancomyclnklassen av antibiotika som kan bindes til acyl-D-alanyl-D-alanin.

Antibiotikum A 40926-kompleks og dets faktorer antibiotikum A

40926 faktor A, faktor B, Faktor B0, faktor PA og faktor PB,

kan danne salter ifølge i og for seg kjente teknikker.

I foreliggende sammenheng representerer uttrykket "antibiotokum A 40926" som sådan en forbindelse valgt fra antibiotikum A 40926 kompleks, antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor B0, antibiotikum A 40926 faktor PA, antibiotikum 40926 faktor

PB, et salt derav eller enhver blanding derav. Når det

dreier seg om de biologiske egenskapene, vil uttrykket "antibiotikum A 40926 kompleks", "antibiotikum A 40926 faktor PA", "antibiotikum A 40926 faktor PB", "antibiotikum A 40926

faktor A", antibiotikum A 40926 faktor B", "antibiotikum A

49026 faktor Bq», også omfatte de tilsvarende farmasøytiske akseptable salter.

Antibiotikum A 40926 fremstilles ved dyrkning av en Actinomadura-stamme isolert fra en jordprøve og som den 8. juni 1984 ble deponert ved det internasjonalt anerkjente American Type Culture Collection (ATCC) -12301 Parklawn Drive, Rockvllle, Maryland 20852, USA, under betingelsene ifølge Budapest-traktaten. Stammen har blitt gitt aksesjonsnummeret

ATCC 39727.

Opprinnelig var det antatt at den produserende stammen tilhørte slekten Streptomyces og ble til å begynne med betegnet Streptomyces nov. sp. A 40926 og som sådan deponert hos APCC hvor den fikk aksesjonsmunneret ATCC 39727. Videre studier, spesielt på celleveggsammensetning, ledet til den konklusjon at den nye stammen tilhører slekten Actinomadura. Følgelig har den stammen som opprinnelig ble deponert som Streptomyces sp. ATCC 39727 fått den nye betegnelsen Actinomadura sp. ATCC 39727.

Fremstillingen av antibiotikum A 40926 kompleks, antibiotikum A 40926 faktor A, faktor B, faktor B0, faktor PA eller faktor PB, oppnås ved dyrking av en Actinomadura sp. som kan produsere den, dvs. Actinomadura sp. ATCC 39727, under aerobe betingelser i et vandig næringsmedium inneholdende assimiler-bare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotisk stoff betegnet antibiotikum A 40926 kompleks og dets ovennevnte faktorer, en blanding derav, og syreaddisjonssaltene derav, hvilke forbindelser har de i innledningen til krav 1 angitte egenskaper, og fremgangsmåten er kjennetegnet ved de trekk som fremgår fra karakteristikken i krav 1, med foretrukne trekk som angitt i krav 2-7.

Mange av de nærlngsmedier som vanligvis benyttes innen fermenteringsteknikken, kan anvendes i foreliggende fremgangsmåte, men spesielle media er imidlertid foretrukket. Foretrukne karbonkilder er glukose, mannose, galaktose, stivelse, maismel o.l. Foretrukne nitrogenkilder er ammoniakk, nitrater, soyamel, pepton, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, trypton, aminosyrer o.l. Blant de uorganiske saltene som kan inkorporeres i dyrkningsmediene, er de vanlige oppløselige saltene som kan gl natrium, kalium, jern, sink, kobolt, magnesium, kalsium, ammonium, klorid, karbonat, sulfat, fosfat, nitrat og lignende ioner.

Vanligvis blir den antibiotikum-produserende stammen fordyrket i en rysteflate, deretter anvendes kulturen for å inokulere fermentorbeholdere for fremstilling av vesentlige mengder av de antibiotiske stoffene. Mediet som benyttes for forkulturen, kan være den samme som det som anvendes for større fermenteringer, men andre media kan også anvendes. Den antibiotikum A 40926-produserende stamme kan dyrkes ved temperaturer mellom 20 og 40°C, fortrinnsvis mellom 24 og 35°C. Under fermenteringen kan den antibiotiske produksjon overvåkes ved å teste buljong- eller mycelieekstrakt-prøver med henblikk på antibiotisk aktivitet f.eks. ved bioanalyser eller TLC- eller HPLC-metoder.

Organismer som er følsomme overfor antibiotika A 40926 slik som Bacillus subtilis og S. Aureus, kan benyttes som testorganismer. Bioanalysen utføres hensiktsmessig ved agardiffusjonsmetoden på agarplater. Makslmun produksjon av antibiotisk aktivitet forekommer vanligvis mellom den andre og den femte fermenteringsdagen.

Antibiotikum A 40926 fremstilles ved dyrking av stammen Actinomadura sp. ATCC 39727, og finnes hovedsakelig i kulturmediene.

Karakteristika for Actinomadura sp. A 40926 ATCC 39727;

Makroskopisk og mikroskopisk undersøkelse

Det vegitative mycelium er sammensatt av buktede og for-grenede hyfer (diameter ca. 0,8 pm) som på noen medier, identifisert ved en stjerne i tabell I, har en liten tendens til å fragmenteres til stavlignende elementer etter flere dagers vekst, mens det på glukose-asparagin-medium frag-menterer til kokoidelementer.

Karakteristisk for denne stammen er burgunderfargen på det vegitative mycelium på noen media. Luftmyceliet er til stede bare i noen media; spesielt, blant de som er oppsummert i tabell I, er det til stede bare i hvetemelagar og jordagar. På disse media er luftmyceliet hvitt-grått, og danner sporoforer ordnet i haker og korte spiraler på omkring 10-20 sporer.

Sporene er sylindriske og har en gjennomsnittlig størrelse på 0,8 x 1,2 pm.

Bestemmelse av vektegenskaper

For undersøkelse av kulturegenskapene ble Atinomadura sp. ATCC 39727 dyrket på forskjellige standard media, foreslått av Shirling og Gottlieb, (Shirling E.B. og Gottlieb D. ,-1966 - Method for Characterizatlon of Streptomyces specles-Int. J. Syst. Bacteriol, 16, 313-340) med tilsetning av flere media anbefalt av Waksman (Waksman, S.P. 1961 - The Actinomycetes - The Williams and Wilkins Co., Baltimore; vol. 2, 328-334).

Fargebestemmelse ble foretatt der det var nødvendig ved fremgangsmåten ifølge Maerz og Paul (Maerz A. og M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2nd Edition McGraw-Hill Book Company, Inc. New York)..

Orgamismens evne til å utnytte forskjellige karbonkilder ble undersøkt ved metoden beskrevet av Shirling og Gottlieb.

Kulturegenskapene og de fysiologiske egenskaper og utnyttel-sen av karbonkilder er rapportert i tabellene I, II og III. Avlesningene i tabell.I ble tatt etter 2 ukers inkubering ved 28°C.

Utnyttelse av karbonkilder

K. lemotaksonomiske egenskaper

Cellevegganalyse:

Analysen av aminosyrer som er til stede i celleveggen, ble utført ifølge metodene beskrevet i arbeidet til Becker et al., "Rapid differensiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates", Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964). Analysen av hydrolysert hel celle viste tilstedeværelsen av meso-diaminopimelinsyre. Analysen av ren cellevegg oppnådd ved metoden til Cavamoto et al. (I. Kawamoto, T. Oka, og T. Nara, "Cell-wall composition of Miceomonospora olivoasterospora, Micromonospora sagamien-sis, and rélated organism"; J. of Bacteriology 146, 527-534

(1981) viste fravær av glycin.

Sukkeranalvse:

Analysen av sukkerinnhold ble utført ved metoden til M. P. Lechevalier, "Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance", J. Lab. Clin. Med. 71, 934-944 (1968) ved bruk av tynnsjiktskromatografi-celluloseark som beskrevet av J. L. Staneck og G.D. Roberts, "Simplified approach to Identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography", 28, 226- 231 (1974) med følgende opp-løsningsmiddelsystem: etylacetat-pyridin-vann (100:35:25 volumdeler). De oppnådde resultater viste tilstedeværelsen av hovedsakelig glukose og ribose mens mindre mengder av galactose, mannose og madrose (3-0-metyl-D-galaktose) også ble detektert.

Mycolsyrer:

En analyse for detektering av tilstedeværelsen av mycolsyrer ble utført ved å følge metoden til Minnikin et al. (D.E. Minnikin, L. Alshamaony og M. Goodfellow, "Differentiation of Mycobacterium, NocardHa and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole organism methanolysates", Journal of General Microbiology 88, 200-204, 1975). Resul-tatene fra analysen var negative: Mycolsyrer ble ikke funnet.

Identitet av stammen:

Stammen ble henført til Actinomycetes-slekten Actinomadura p.g.a. tilstedeværelsen av meso-diaminopimelinsyre og madurose, mangelen på glycin i peptodoglykan, mangelen på mycolsyrer og dannelsen av luftmycelium med moderat lange sporekjeder.

Som med andre organismer er egenskapene til den A 40926-produserende stammen utsatt for variasjon. F.eks. kan kunstige varianter og mutanter av stammen oppnås ved behandling med forskjellige kjente mutagener, slik som UV-stråler, røntgenstråler, høyfrekvensbølger, radioaktive stråler og kjemikalier slik som salpetersyrling, N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin og mange andre.

Utvinningen av ■ de antibiotiske stoffene fremstilt Ifølge oppfinnelsen fra fermenteringsmediene av den produserende mikroorganismen, utføres ifølge i og for seg kjente teknikker som innbefatter ekstraksjon med oppløsningsmidler, utfelling ved tilsetning av ikke-oppløsningsmidler eller ved endring av oppløsningens pH-verdi, skillekromatografi, revers fase-skillekromatdgrafi, ioneutvekslingskromatografi, affinitetskromatografi o.l.

En foretrukken metode innbefatter en affinitetskromatografi på immobilisert D-alanyl-D-alanin fulgt av revers fase-kolonnekromatografi.

Immobiliserte D-alanyl-D-alanin-matriser egnet for foreliggende utvinningsprosess er beskrevet i europeisk patent-søknad 83112555. Den foretrukne matrisen i foreliggende fremgangsmåte er D-alanyl-D-alanin koblet med en kryssbundet polydekstran med regulerte porer.

Fermenteringsbuljongen kan utsettes for affinitetskromatografi direkte etter filtrering eller etter en innledende rensemetode. Denne sistnevnte metode innbefatter å gjøre hele fermenteringsmassen basisk, fortrinnsvis mellom pH 8,5 og 10,5, for å oppløseliggjøre det antibiotiske stoffet adsorbert på myceliet og deretter filtrering. Det klare filtratet bringes til pH 2,5-4,5 og filtreres på nytt i nærvær av et filterhjelpemiddel. Dette filtrat kasseres mens den oppnådde filterkaken suspenderes i vann, gjøres basisk, fortrinnsvis ved en pH-verdi mellom 8 og 9, og filtreres. Filterkaken utsettes på nytt for samme metode, mens filtratene, som inneholder antibiotikum A 40926, kombineres.

Disse filtratene eller de filtrerte fermenteringsbuljonene underkastes deretter en affinitetskromatografi på immobilisert D-alanyl-D-alanin, enten i kolonne eller satsvls.

Bindingen av det antibiotiske stoffet til affinitetsmatrisen foretas fortrinnsvis ved en pH-verdi på ca. 7,0-8,0, og dets eluering foretas ved mer basiske pH-verdier (fortrinnsvis mellom 9,0 og 10,5) ved hjelp av en vandig base. Denne vandige basen kan være ammoniakk, et flyktig amin, et alkali-eller alkalimétallhydroksyd eller en basisk bufret oppløs-ning eventuelt i nærvær av et polart organisk oppløsnings-middel, slik som et polart vannblandbart oppløsningsmiddel som definert nedenfor.

Etter fjerning av urenhetene ved skylling av kolonnen med vandig buffer pH 4-8, eventuelt inneholdende salter, urea og/eller vannblandbare' oppløsningsmidler, elueres antibiotikum A 40926 med den ovenfor nevnte elueringsblanding. Det urene antibiotiske stoffet utvinnes deretter fortrinnsvis ved fjerning av vann fra de kombinerte antibiotikumholdige fraksjoner ved azeotrop destillasjon med et organisk oppløsningsmiddel som kan danne minimum azeotrope blandinger med vann, fulgt av tilsetning av et ikke-oppløsningsmiddel for å utfelle det ønskede produkt.

Representative eksempler på organiske oppløsningsmidler som kan danne minimum azeotrope blandinger med vann er N-butanol, benzen, toluen, butyleter, karbontetraklorid, kloroform, cykloheksan, 2,5-dimetylfuran, heksan og m-xylen, Idet det foretrukne oppløsningsmiddel er n-butanol.

Eksempler på ikke-oppløsningsmldler er: petroleumeter, laverealkyletere slik som metyleter, propyleter og butyleter, og laverealkylketoner slik som aceton. Alternativt blir de kombinete antibiotikumholdige fraksjoner konsentrert til et lite volum, fortrinnsvis ved azeotrop destillasjon med et organisk oppløsningsmiddel som definert ovenfor, og den resulterende vandige oppløsning lyofillseres.

Dersom den vandige basen benyttet i elueringen er lkke-flyktlg, kan det være nødvendig å nøytralisere og avsalte konsentratet før utfelling eller frysetørking.

En hensiktsmessig avsaltningsmetode innbefatter anbringelse av den vandige oppløsning som inneholder antibiotikumet på en silanert sllisiumdioksydgelkolonne, vasking med destillert vann og eluering med en blanding av et polart vannblandbart oppløsningsmiddel og vann.

Representative eksempler på polare vannblandbare oppløsnings-mldler er: vannoppløsellge alkoholer (slik som metanol, etanol, lsopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, laverealkylalkanoater (slik som metylacetat), tetrahydrofuran, dioksan og dimetylformamid og blandinger derav, idet det foretrukne polare vannblandbare oppløsningsmiddel er acetonitril.

Avsalting kan alternativt utføres ved anbringelse av den antibiotikumholdige oppløsning på den ovenfor beskrevne affinitetskolonne, vasking med destillert vann og eluering med en flyktig, vandig base som beskrevet ovenfor for eluering i affinitetskromatografien. Det således oppnådde produkt er antibiotikum A 40926 kompleks. Om nødvendig kan det ytterligere renses, eller som sådan underkastes separe-ring av dets faktorer A, B, Bq, PA og PB.

En hensiktsmessig metode for oppnåelse av et rent antibiotikum A 40926 kompleks representeres ved en ytterligere rensing av komplekset som oppnådd ovenfor, på en afflnitets-kromatografikolonne. Den samme stasjonære fasen som ovenfor (immobilisert D-alanyl-D-alanin) blir vanligvis benyttet, og det ønskede antibiotiske stoff elueres ved å følge affinitet-skromatografimetoden på immobilisert D-alanyl-D-alanin som beskrevet ovenfor. En foretrukket immobilisert D-alanyl-D-alanin er sefarose-c—aminokaproyl-D-alanyl-D-alanin, en foretrukken ekvilibreringsblanding er 0,1656 (vekt/vol) ammoniakk inneholdende 2 M NaCl justert til pH 7-8, en foretrukket skylleoppløsning er 0,16 (vekt-vol.) ammoniakk inneholdende 2M NaCl justert til pH 8-9,5, en foretrukket elueringsblanding er 0,1656 (vekt/vol) ammoniakk inneholdende 2 M NaCl justert til pH 10,5-12, og en særlig foretrukket elueringsblanding er blandingen ovenfor Justert til pH 11,5.

De antibiotiske A 40926 faktorene, nemlig antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor B0, antibiotikum A40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB, isoleres fra en vandig oppløsning av antibiotikum A 40926 kompleks ved kolonnekromatografi og fortrinnsvis ved reversfase-kolonnekromatografi. Den foretrukne stasjonære fasen i tilfellet for reversfase-kolonnekromatografi er silanert silisiumdioksydgel. Gode resultater kan imidlertid også oppnås med kolonnekromatografI på ikke-funksjonalisert polystyren og akrylsyreharpikser slik som de som selges under varebetegnelsene "Amberlite XAD-2", "XAD-4", "XAD-7" og "XAD-8" eller "Dlaion HP 20". I tilfellet reversfase-rensetrinnet oppnås ved hjelp av en silanert silisiumdioksydgel soms stasjonær fase, blir kolonnen fortrinnsvis likevektslnnstilt på forhånd med en bufret, vandig oppløsning ved pH mellom 4 og 9, og fortrinnsvis mellom 5,5 og 6,5 og deretter eluert med en lineær gradient av et polart vannblandbart oppløsningsmiddel i den samme bufrede oppløsning. Representative, eksempler på polare vannblare oppløsningsmidler er: vannoppløselige alkoholer (slik som metanol, etanol, iso-propanol, n-butanol), aceton, acetonitril, tetrahydrofuran, dioksan og dimetylformamid, og blandinger derav, idet det foretrukne polare vannblandbare oppløsningsmiddel er acetonitril.

De eluerte fraksjonene analyseres med henblikk på deres antibiotiske innhold ved hjelp av de vanlige bioanalyser slik som papirskive- eller agardiffusjonsanalyser, på mottagelige mikroorganismer. Eksempler på mottagelige organismer er Bacillus subtilis og S. aureus. Kromatograflen overvåkes også hensiktsmessig ved TLC- eller HPLC-teknikker.

En foretrukket HPLC-teknikk er representert ved en revers fase-HPLC under anvendelse av en kolonne av porøse og sfæriske partikler av silanert silisiumdioksydgel funksjonalisert med C-18 alkylgrupper som har en diameter på fortrinnsvis 5 pm (slik som 5 pm "Ultrasphere ODS Altex", en for-kolonne som er en silisiumdioksydgel funksjonalisert med C-18 alkylgrupper (slik som RP 18") og et elueringsmiddel som er en lineær gradientblanding av et polart vannblandbart oppløsningsmiddel, slik som ett av de som er beskrevet ovenfor, i en vandig bufret oppløsning.

Denne oppløsning justeres fortrinnsvis til pH 5-7. Et særlig foretrukket elueringsmiddel er representert ved en lineær gradient fra 5 til b0% > av elueringsmiddel B i elueringsmiddel A, hvor elueringsmiddel A er en blanding av acetonitril/- vandig buffer, pH 5-7, 10:90 og elueringsmiddel B er en blanding av acetonitril/vandig buffer, pH 5-7, 70:30. Som kjent innen teknikken kan mange forbindelser anvendes som indre standarder. En meget hensiktsmessig standard er i dette tilfellet teicoplanin A2 komponent 2, som har retensjonstid nær forbindelsene i foreliggende oppfinnelse i dette HPLC-systemet. Denne standardforbindelsen er kjent, og er beskrevet i GB-A-2121401.

Fraksjoner med lignende antibiotisk innhold kombineres og avsaltes som beskrevet ovenfor for oppnåelse av vesentlig ren antibiotikum A 40926 faktor A, faktor B, faktor B0, faktor PA og faktor PB.

Vesentlig ren antibiotikum A 40926 faktor A og antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor B0, antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor BP oppnås fra de fraksjoner som inneholder dem ved en rekke forskjellige kjente teknikker slik som lyofilisering, utfelling med ikke-oppløsningsmidler eller utfelling ved endring av pH-verdien til den vandige oppløsningen.

En hensiktsmessig metode innbefatter tilsetning av et oppløsningsmiddel som kan danne azeotrope blandinger med vann, fjerning av vann ved azeotrop destillasjon og deretter oppsamling ved filtrering av bunnfallet oppnådd etter tilsetning av et ikke-oppløsningsmiddel lik dem som er beskrevet ovenfor.

Antibiotikum A 40926 faktorer PA og PB er, i det minste under visse fermenteringsbetingelser, hovedantibiotikum-produktene av den A 40926- produserende mikroorganisme. Antibiotikum A 40926 faktorer A og B er hovedsakelig transformasjons-produkter av antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB, respektivt, og er ofte allerede til stede i fermenteringsmediet.

Det er faktisk funnet at antibiotikum A 40926 faktor PA kan omdannes til antibiotikum A 40926 faktor A og antibiotikum A 40926 faktor PB kari omdannes til antibiotikum A 40926 faktor B under basiske betingelser. F.eks. blir antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB omdannet til antibiotikum A 40926 faktor A og faktor B, respektivt, ved behandling med 0,5-1056 vandig ammoniakk, eller en annen nukleofil base slik som et organisk amin ved romtemperatur i 8-24 timer.

Når fermenteringsmediet eller et antibiotikum A 40926-holdig ekstrakt eller konsentrat derav hensettes i en viss tid under basiske betingelser (f.eks. vandig oppløsning av en nukleofil base, ved en pH > 9 natten over, vil følgelig et antibiotikum A 40926 kompleks oppnås, og er anriket på antibiotikum A 40926 faktor A og faktor B. Dersom eksponeringsperioden til fermenteringsmediet, ekstraktet eller konsentratet derav, for et basisk miljø er kort, oppnås et antibiotikum A 40926 kompleks som er anriket på antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB.

En foretrukket metode for oppnåelse av et antibiotikum A 40926 kompleks anriket på faktor A og faktor B, innbefatter derfor hensettelse av en oppløsning av antibiotikum A 40926 kompleks (som hovedsakelig inneholder antibiotikum A 40926 faktorer PA og PB) ved romtemperatur i 8-12 timer i en vandig nukleofil base, slik som vandig ammoniakk, og deretter isolering av det ønskede antibiotiske kompleks som beskrevet ovenfor.

Eksempler på A 40926-holdige oppløsninger er fermenterings-media, ekstrakter og fraksjoner eluert ved affinitetskromatografi .

Rent antibiotikum A 40926 kan oppnås ved ytterligere rensing av det urene kompleks ved affinitetskromatografi som beskrevet ovenfor. Det således oppnådde produkt som er I besittelse av biologiske og fysikalsk-kjemlske egenskaper som kan avledes fra de rene faktorer deri, vil i eksemplene bli referert til antibiotikum A 40926 kompleks AB.

En foretrukken metode for anriking med henblikk på faktorer PA og PB av et antibiotikum A 40926 kompleks-preparat, innbefatter hurtig nøytralisering av fraksjonene eluert ved affinitetskromatografi med en syre, fortrinnsvis en mineralsyre slik som svovelsyre eller saltsyre.

Isoleringen av rene antibiotikum A 40926 faktorer PA og PB fra dette kompleks kan oppnås ifølge en av de ovenfor angitte metoder.

En foretrukket metode omfatter reversfase-væskekromatografi, fortrinnsvis i rustfrie stålkolonner under moderate trykk (5-50 bar) eller ved høyt trykk (100-200 bar). Den faste fasen kan være en silanert silisiumdioksydgel med en hydrokarbon-fase med (2-18) karbonatomer, (mest foretrukket C18) eller fenylgruppe, og elueringsmlddelet er en blanding av et polart vannblandbart oppløsningsmiddel som definert ovenfor og en vandig buffer ved en pH-verdi som er forenlig med harpiksen (fortrinnsvis pH 4-8).

Elueringen overvåkes som vanlig, idet fraksjoner som har homogent antibiotisk innhold kombineres og behandles som beskrevet ovenfor for å isolere de rene forbindelsene som har de nedenfor angitte karakteristika.

Sofistikert HPLC-analyse er vist at antibiotikum A 40926 faktor B faktisk er en blanding av to faktorer betegnet faktor B0 og faktor B1. Antibiotikum A 40926 faktor B0 som representerer omkring 9056 av antibiotikum A 40926 faktor B, er den faktor som har en R^-verdi på 1,22 1 forhold til teicoplanin A2 komponent 2 i systemet beskrevet nedenfor under punkt D angående de fysikalsk-kjemiske egenskapene til faktor B, mens faktor B^ som representerer omkring 1056 av antibiotikum A 40926 faktor B, er den som har en relativt R^-verdi på 1,27 i det samme systemet.

Ren antibiotikum A 40926 faktor Bq oppnås ved ytterligere rensing av antibiotikum A 40926 faktor B f.eks. ved å gjenta reversfase-kromatografimetoden benyttet for dens isolering. De fysikalsk-kjemiske og biologiske egenskapene til antibiotikum A 40926 faktor Bq er vesentlig identiske med de til antibiotikum A 40926 faktor med unntagelse for at ved HPLC-analysen 1 et system lik den ovenfor angitte har den bare en topp (Rt 1,22 i forhold til teicoplanln A2 komponent 2 i det beskrevne HPLC—systemet).

P.g.a. de ovenfor angitte likheter mellom antibiotikum A 40926 faktor B og antibiotikum A 40926 faktor B0 i foreliggende sammenheng, skal henvisningen til de biologiske egenskapene til antibiotikum A 40926 faktor B også forstås som henvisning til antibiotikum A 40926 faktor Bq som er hovedkomponenten (ca. 90%) i antibiotikum A 40926 faktor B og hovedsakelig bidrar til dens biologiske egenskaper.

De antibiotiske stoffene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan alternativt Isoleres fra fermenteringsbuljongen eller ytterligere renses ved hjelp av sterke eller svake anlonharpikser Inkludert funksjonallserte polystyren-, akryl- eller polydekstran-matrlser. Eksempler på svake anion-utveksllngsharplkser er de som selges under følgende varebetegnelser:"Dowex MWA-1" eller "WGR", "Amberlite IRA-•73", "DEAE-Sephadex". Eksempler på sterke anionutveksler-harpikser som kan benyttes ifølge oppfinnelsen, innbefatter de som selges under følgende varebetegnelser: "Dowex MSA-1", "SBR", "SBR-P", "Amberlite IR-904" og "QAE-Sephadex".

Eluerlngen av de antibiotiske stoffene fremstilt i foreliggende oppfinnelse fra harpiksene utføres ved hjelp av lineærgradlent-blandlnger av vandig oppløsning av elektrolyt-ter slik som natrium- eller kaliumhydroklorider, i vann eller blandinger av vann og et organisk vannblandbart oppløsnings-middel slik som en laverealkohol (f.eks. ( C-^- C^ )alkanol) eller laveralkylketoner (f.eks. aceton).

Som allerede nevnt er de antibiotiske stoffene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse i besittelse av sure og basiske funksjoner og kan danne salter ifølge konvensjonelle metoder. Representative og egnede syreaddisjonssalter av de fremstilte forbindelsene i foreliggende oppfinnelse innbefatter de salter som er dannet ved standard omsetning med både organiske og uorganiske syrer slik som f.eks. saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, trifltior-eddiksyre, trikloreddiksyre, ravsyre, sitronsyre, askorbin-syre, melkesyre, maleinsyre, fumarsyre, palmitinsyre, kolinsyre, pamoinsyre, slimsyre, glutaminsyre, kamforsyre, glutarsyre, glycolsyre, ftalsyre, vissyre, laurinsyre, stearinsyre, salicylsyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, pikrinsyre, benzosyre, kanelsyre og lignende syrer, Representative eksempler på basene er: alkalimetall-eller Jordalkalimetallhydroksyd slik som natrium-, kalium- og kalsiumhydroksyd; ammoniakk og organiske aminer, alifatiske, alicykllske eller aromatiske slik som metylamin, dimetylamin, trimetylamin og picolin.

Omdannelsen av de frie amino- eller ikke-saltforbindelsene til de tilsvarende addisjonssalter og omvendt, dvs. omdannelsen av et syreaddisjonssalt av en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen til ikke-salt- eller fri aminoform omfattes av foreliggende oppfinnelse. F.eks. kan en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen omdannes til det tilsvarende syre- eller baseaddlsjonssalt ved oppløsning av ikke-saltformen i et vandig oppløsningsmiddel og tilsetning av et lite, molart overskudd av den valgte syren eller basen. Den resulterende oppløsning eller suspensjon lyofiliseres deretter for å utvinne det ønskede saltet.

I tilfelle saltforbindelsen er uoppløselig i et oppløsnings-middel hvor ikke-saltformen er oppløselig, utvinnes det ved filtrering fra den organiske oppløsning av Ikke-saltformen etter tilsetning av den støkiometrlske mengde eller et lite, molart overskudd av den valgte syren eller basen. Ikke-saltformen kan fremstilles fra et tilsvarende surt eller basisk salt oppløst i et vandig oppløsningmiddel som deretter nøytraliseres til den frie ikke-saltformen. Når avsalting etter nøytralisering er nødvendig, kan det benyttes en vanlig avsaltingmetode. F.eks. kan kolonnekromatografi på silanert silisiumdioksydgel, ikke-funksjonalisert polystyren, akryl-harpikser og polydekstranharpikser med regulert porestørrelse (slik som "Sephadex LH 20" eller aktivert karbon, hensiktsmessig benyttes. Etter eluering av de uønskede saltene med en vandig oppløsning, elueres det ønskede produktet ved hjelp av en lineær gradient eller en trinnvis-gradient av en blanding av vann og et polart eller apolart organisk oppløsnings-middel, slik som acetonitril/vann fra 50:50 til ca. 100$ acetonitril.

Som kjent på området kan saltdannelsen enten med farmasøytisk akseptable syrer (baser) eller ikke-farmasøytisk akseptable syrer (baser) anvendes som en hensiktsmessig renseteknikk. Etter dannelsen og isoleringen kan saltformen av et A 40926 antibiotikum omdannes til det tilsvarende ikke-salt eller til et farmasøytisk akseptabelt salt.

I noen tilfeller er baseaddisjonssaltet av en forbindelse Ifølge oppfinnelsen mer oppløselig i vann og hydrofile oppløsningsmldler.

Fysikalsk- kjemiske egenskaper til antibiotikum A 40926 faktor A

A) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum som er vist på fig. 1 i de medfølgende tegninger, og viser følgende absorpsjonsmaksima: B) infrarødt absorpsjonsspektrum som er vist på fig. 2 i de medfølgende tegninger og viser følgende absorpsjonsmaksima (cm-1): 3700-3100, 3100-2800 (nujol); 1655; 1620-1560; 1510; 1480-1410 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1259; 1250-1190; 1100-950; 845; 810; 720 (nujol), C) <1>H-NMR-spektrum som er vist på fig. 3 og viser følgende signalgrupper (i ppm) ved 270 MHz registrert i DMS0 dfc (heksadeuterodimetylsulfoksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S = ppm): § 0,86 (t's, 6E); 1,21 (~llH); 1,43 (2H); 2,01 (2H); 2,31-2,34 (3fi); 4-6,2 (~16H); 6,2-8 (~23H): 8,44, 9,22, 9,66 (brede bånd, mobile protoner) 2,5-4: interferens fra I^O-topper, D) retensjonstid (Rt) på 1,22 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (Rt = 20,3 min), analysert ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: Kolonne: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 (l.d. ) x 250 mm under de samme betingelsene er retensjonstiden i forhold til testosteron (Roussel Uclaf) 0,60, E) elementanalyse, etter at prøven på forhånd er tørket ved ca. 140°C under inert atmosfære (aw 4,6$) som indikerer følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (i gjennomsnitt): karbon 55,82$; hydrogen 5,17$, nitrogen 6,31$; klor (totalt) 4,24$; klor (ionisk) 0,37$; uorganisk rest ved 900°C i luft: 1,2$; F) syre-base-titreringsprof11 i 2-metoksyetanol (MCS):vann, 4:1 ved titrering med KOH etter tilsetning av et overskudd av HC1 hvilket Indikerer 4 ioniserbare funksjoner med følgende pk^g: 4,6, 5,6, 7,2, 9,2; G) Rf-verdi på 0,24 og en Rf-verdi i forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 på 0,70 i følgende kromatografiske system:

ved bruk av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater

(sjikttykkelse 0,25 mm)

visualisering:

U.V.-lys

Gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfanilsyre

(J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99

(1953))

bioautografi ved bruk av B. substilis ATCC 6633 på

minimalt Davis medium;

H) molekylvekt på ca. 1760 fra et FAB-MS-spektrum som viser M+H<+> toppen ved 1717. Fvsikalsk- k. lemlske egenskaper til antibiotikum A 40926 faktor B A) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum, som er vist på fig. 4 i de medfølgende tegninger, og viser følgende absorpsjonsmaksima: B) Infrarødt absorpsjonsspektrum. som er vist på fig. 5 i de medfølgende tegninger og viser følgende absorpsjonsmaksima (cm-<1>): 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol). C) ^-H-NMR-spektrum vist på fig. 6 viser følgende signalgrupper i. ppm i 270 MHz 1H-NMR registrert i DMSO d6 (heksadeuterodlmetylsulfoksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S = ppm): S 0,85 (d, isopropyl CH3's); 1,15 (~13H); 1,44 (~2H); 2,02 (2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 (x:16H); 6,1-8 (~23H); 8,52, 9,30, 9 ,68 (brede bånd; mobile protoner) 2,5-4 interferens fra H2O-topper; D) retensjonstider (R<*>) på 1,2 og 1,27 1 forhold til telcoplanin Å£ komponent 2 (R-^ = 20,3 min.) analysert ved reversfase-HPLC under følgende betingelser:

U. V.- detektor: 254 nm

i ndre standard: Teicoplanin Ag komponent 2 (Gruppo

Lepetit, S.p.A.)

E) elementanalyse, etter at prøven på forhånd var blitt tørket ved ca. 140°C under inert atmosfære (Aw 9,6$) indikerer følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (gjennomsnitt): karbon 54,09$; hydrogen 5,13$; nitrogen 6,34$; klor (totalt) 4,12$; klor (ionisk) 0,39$. Uorganisk rest ved 900°C i luften: 5$; F) syre-base-titreringsprofil i 2-metoksyetanol (MCS):vann, 4:1 ved titrering med KOH etter tilsetning av et overskudd HC1 (pH 2,7) hvilket indikerer fire ioniserbare funksjoner som har følgende pkrøcs* 4,5, 5,6, 7,2, 9,2; G) Rf-verdl på 0,21 og en Rf-verdi i forhold til teicoplanin Ag komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system:

ved bruk av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater

(sjikttykkelse 0,25 mm)

visualisering:

U.V.-lys

Gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfanylsyre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99

(1953))

bioautografi ved bruk av B. subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis-medium;

H) molekylvekt på ca. 1730 avledet fra et FAB-MS-spektrum som viser M+S+ toppen ved 1731. Fysikalsk- k. lemiske egenskaper til antibiotikum A 40926 faktor B0 A) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum som er vist på fig. 4 i den medfølgende tegning og viser følgende absorpsjonsmaksima: x

B) Infrarød absorpsjonsspektrum som vist på fig. 5 i medfølgende tegninger viser følgende absorpsjonsmaksima (cm" <1>): 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625-1560; 1505; 1460

(nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040;

1030; 1015; 970; 890; 810; 720 (nujol);

<1>H-NMR-spektrum som vist på fig. 6 viser følgende slgnal-

grupper (i ppm) i 270 MHz ^-H-NMR-registrert i DMS0 d6 (heksadeuterodimetylsulfoksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S 0 ppm):

S 0,85 (d, isopropyl CH3<*>s); 1,15 (~13H); 1,44 (~2H); 2,02

(2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 (~16H); 6,1-8 (23E); 8,52, 9,30,

9,68

(brede bånd, mobile protoner)

2,5-4 interferens fra HgO-topper;

D) retensjonstid (Et) på 1,22 1 forhold til teicoplanin Ag komponent 2 (R-t = 20,3 min.) analysert ved revers fase-HPLC under følgende betingelser: E) elementanalyse etter at prøven på forhånd var tørket ved ca. 140°C under inert atmosfære (aw 9,6$) indikerer følgende omtrentlige prosentsammensetning (gjennomsnitt): karbon 54,09$, hydrogen 5,13$; nitrogen 6,34$; klor (totalt) 4,12$; klor (ionisk) 0,39$. Uorganisk rest ved 900°C i luften: 5$; F) syre-base-titreringsprofil i 2-metoksyetanol (MCS):vann, 4:1 ved,titrering med KOH etter tilsetning av et overskudd av HC1 indikerer fire ioniserbare funksjoner med følgende pkMCS: 4,5, 5,6, 7,2, 9,2; G) Rf-verdi på 0,21 og en Rf-verdi i forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system:

ved anvendelse av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater (sjikttykkelse 0,25 mm)

visualisering:

- U.V. lys

gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfonylsyre (J. Chromatog. 20, 171 (1965 ), Z. Physiol. Chem. 292, 99,

(1953)) - bioautografi ved bruk av B. subtills ATCC 6633 på minimal Davis-medium; H) molekylvekt på 1730 avledet fra et FAB-MS-spektrum som viser M+H<+> toppen ved 1731. Fysikalsk- k. lemlske egenskaper for antibiotikum A 40926 faktor PA A) Ultrafiolett absorpsjonspektrum vist på fig. 7 i de medfølgende tegninger viser følgende absorpsjonsmaksima: B) infrarødt absorpsjonsspektrum vist på fig- 8 i de medfølgende tegninger viser følgende absorpsjonsmasima (cm-1): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1760-1710; 1655; 1620-1550, 1460 (nujol) 1375 (nujol); 1260, 1250-950; 805; 720 (nujol); C) <1>H-NMR-spektrum som er vist på fig. 9, viser følgende signalgrupper (i ppm) i 270 MHz 1H-NMR registrert i DMSO d6 (heksadeuterodimetylsulf oksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S=ppm): 0,86, d<*>s (CH3); 1,15-1,22, m(CH2)n; <1,>41, m (CH2); 2,01, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,28, s (N.-CH3); 4,26-5,96, br (peptidiske og aromatiske CH'er) 6,33-7,73 br aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); D) retensjonstid (Rt) på 1,15 i forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 (R-t = 20,3 min.) analysert ved revers fase-HPLC under følgende betingelser: E) Rf-verdi i forhold til teicoplanin Ag komponent 2 på 0,62 i følgende kromatografiske system:

ved bruk av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater

(sjikttykkel.se 0,25 mm)

visualisering:

- U.V.lys

gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfanylsyre (J. Chromatog. 20, 171 (2965), Z. Physiol. Chem. 292, 99,

(1953)) - bioautografi ved bruk av B. subtllis ATCC 6633 på minimalt Davis- medium; F) molekylvekt på ca. 1758 avledet fra et FAB-MS-spektrum som viser en samling topper som har den mest intense toppen ved 1761. De operative betingelser for FAB-MS-analysen var følgende: Fysikalsk- kjemiske egenskaper til antibiotikum A 40926 faktor PB A) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum, vist på fig. 10 i de medfølgende tegninger, viser følgende absorpsjonsmakslma: B) infrarødt absorpsjonsspektrum som vist på fig. 11 i de medfølgende tegninger, viser følgende absorpsjonsmaksima (cm"1): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1760-1710; 1955; 1620-1560; 1605; 1480-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1270; 1230-1190; 1150, 1120-920; 845; 810; 720 (nujol);

Cl) <i>H-NME-spektrum vist på fig. 12 viser følgende signalgrupper (i ppm) ved 270 MHz i DMS0 d^, (heksadeuterodimetylsulfoksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S=ppm) multiplisitet; (attribusjon): 0,84, d (isopropyl CH3'er); 1,17, m (CH2)n; 1,43, m (CH2), 1,99, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,31, s (N-CH3); 2,79, dd (C-H); 3,70, m (C-H); 4,06-6,02, br (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,74, br (aromatiske CH'er og peptidiske NH<*>er); 8,19-9,99, br (peptidiske NH'er og fenoliske 0H'er); C..2) iH-NMR-spektrum vist på fig. 13 viser følgende signalgrupper (i ppm) ved 270 MHz i DMSO d^ pluss CF3C00D ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S=ppm) multiplisetet; (attribusjon): 0,84, d (isopropyl CH3'er); 1,13, m (CH2)n; 1,40, m (CH2); l,98,s (CH3); 2,00, m (CH2); 2,92, dd (C-H); 3,29-3,71, m (sukker C-H'er); 4,07-6,09, s og m (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,83, s og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er)8,17-10,38 (peptidiske NH'er, fenoliske 0H'er). D) retensjonstider (Rt) på 1,27 og 1,32 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (Rt= 20,3 min) analysert ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: E) Rf-verdi i forhold til teicoplanin Ag komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system:

ved bruk av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater (sjikttykkelse 0,25 mm);

visualisering:

- U.V.lys

gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfanilsyre (J: Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99,

(1953)) - bioautografi ved bruk av B. subtilis ATCC 6633 på minimalt Davles- medium. F) molekylvekt på ca. 1772 utledet fra et FAB-MS-spektrum som viser en opphopning av topper som har den mest intense toppen ved 1776.. De operative betingelser for FAB-MS analysen, var følgende:

Den antlbakterlelle aktiviteten til forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan demonstreres In vitro ved hjelp av standard fortynnlngstester på forskjellige mikroorganismekulturer.

Rulturmedla og vekstbetingelser for MIC (minimal inhiberende konsentrasjon)-bestemmelser var som følger: Isosensitest-medium (oksoid), 24 timer, for stafylokokker, Strep. faecalis og gram-negative bakterier (Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus); Todd-Hewitt-medium (Difco), 24 timer for andre streptokokk-arter; GC-basismedium (Difco) + 1$ Isovitalex (BBL), 48 timer, COg-anriket atmosfære for Neisseria gonorrhoeae; GB-basisagar (Difco) + 1$ Isovitalex + 0,001$ hemin, 24 timer for Haemophilus influenzae; AC-medium (Difco), 24 timer, anaerob atmosfære for Clostridium perfringens; Wilkings-Chalgren-agar (ref.: T. D. Wilkins & S. Chalgren, 1976, Antlmicrob. Ag. Chemother. 10, 926), 48 timer, anaerob atmosfære for de andre anaerobene (C. difficile, Proplonibacterlum acnes, Bacteroides fragills); PPLO-medium (Difco) + 10$ hesteserum + 1$ glukose, 48 timer for Mycoplasma galllsepticum; gjær-nitrogen-basismedium (Difco), 24 timer for Candida albicans. Med unntagelse for C. albicans (30°C), ble Inkubasjon foretatt ved 37°C. Podnings-midler var som følger: 1$ (v/v) av en 48 timers medlumkultur for M. galllsepticum; ca. 10<4->10<5> kolonidannende enheter/ml for andre mediumfortynnings-MIC'er; ca. 10<4->10<5> bakterier/- flekk (podet med en flerpunkt-inokulator) for agar- Den antimikrobielle aktiviteten til forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse bekreftes også i in vivo forsøk utført vesentlig som beskrevet av R. Pallanza & Al., J. Antimicrob. Chemother. 11, 419 (1983). Den eksperimentelle infeksjon ble indusert i mus ved intraperitoneal administrasjon av en suspensjon av S. pyogenes C 203. Podnings-midler eller inocula hadde blitt justert slik at de ubehand-lede dyrene døde av blodforgiftning 1 løpet av 48 timer. Dyr ble behandlet subkutant med testforbindelsen ca. 30 min. etter infeksjon. EDsrj-verdien ble beregnet på den tiende dagen ved metoden ifølge Spearman & Karber (D.J. Finney "Statistical Methods of Biological Assay", Griffin, side 524, 1952) på basis av den prosentvise overlevelse ved hver dose. I betingelsene angitt ovenfor var ED5Q-verdien for antibiotikum A 40926 faktor A 0,47 mg/kg, for antibiotikum A 40926 faktor B 0,33 mg/kg, for antibiotikum A 40926 faktor PA 0,54 mg/kg og for antibiotikum A 40926 faktor PB 0,31 mg/kg.

Den omtrentlige akutte toksisitet i mus (i.p.) ble bestemt ifølge kjente metoder. Den omtrentlige LDsø-verdi for antibiotikum A 40926 ble funnet å være høyere enn 100 mg/kg 1 mus ved subkutan administrasjon i mus.

Antibiotikum A 40926 kompleks og dets faktorer A, B, Bq, PA og PB er aktive mot gram-positive bakterier som er ansvarlige for mange vidt utbredte infeksjoner. P.g.a. den økende resistens til disse patogenene overfor vanlige terapeutiske behandlinger, er behovet for nye antibiotiske stoffer fremdeles stort. Som allerede angitt, er de antibiotiske stoffene i foreliggende oppfinnelse i besittelse av god aktivitet mot Neisseria-stammer slik som Neisseria gonorrhoeae, mens de er praktisk talt inaktive mot andre gram-negative bakterier.

Det er kjent at forekomsten av gonorrhoeae har steget jevnt i de siste 15-20 år. Kontrollen med infeksjonen er for tiden vanskelig p.g.a. det høye antall re-infeksjoner som også har sammenheng med oppførselen til de Infiserte individer som Ikke utvider den nødvendige forsiktighet når det gjelder å unngå overføring av sykdommen under hele varigheten av infeksjonen. På den annen side er det en økende resistens hos den kausative organismen overfor de vanlige benyttede antibiotika slik at nye forbindelser av antibiotika og lengre behandlinger blir nødvendig. Det er derfor et økende behov for nye antibiotiske stoffer som kan være effektive når det gjelder å helbrede gonokokkiske infeksjoner og spesielt Neisseria gonorrhoeae-infeksjoner med et begrenset antall administrasjoner eller endog en enkelt administrasjonsdose.

For antibakterlell behandling kan generelt antibiotikum A 40926 kompleks, en av dets faktorer A, B, B, PA og PB samt de ikke-toksiske farmasøytisk akseptable saltene derav eller blanding derav, administreres på forskjellig måte slik som topisk eller parenteralt. Den parenterale administrasjon er vanligvis den foretrukne administrasjonsmåten. Preparater for injeksjon kan ha slike former som suspensjoner, oppløsninger eller emulsjoner i oljeholdige eller vandige bærere, og kan inneholde hjelpemidler slik som suspensjonsmidler, stabiliseringsmidler og/eller dispergeringsmidler. Den aktive bestanddel kan alternativt være i pulverform for rekonstitue-ring ved tidspunktet for avlevering når en egnet bærer, slik som sterilt vann, tilsettes dertil. Avhengig av administrasjonsmåten kan disse forbindelsene formuleres i forskjellige doseringsformer.

I noen tilfeller er det mulig å formulere forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen i enterisk belagte doseringsformer for oral administrasjon som kan fremstilles på kjent måte (se f.eks. "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. utgave, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, side 1614). Dette kan spesielt være tilfelle når absorpsjon av det antimikrobielle stoff i tarmkanalen er særlig ønsket med uendret passasje gjennom magen.

Mengden av aktiv forbindelse som skal administreres, avhenger av forskjellige faktorer slik som størrelse og tilstand til det individ som skal behandles, administrasjonsmåte og-frekvens samt det involverte kausative middel.

De antibiotiske stoffene fremstilt ifølge oppfinnelsen, nemlig antibiotikum A 40926 kompleks, dets faktorer A, PA, B, Bq og PB, og de fysiologisk akseptable saltene derav, er vanligvis effektive ved en daglig dose på mellom ca. 0,5 og 50 mg aktiv bestanddel pr. kilo pasient-legemsvekt, eventuelt oppdelt i en til fire administrasjoner pr. dag. Særlig ønskede preparater er de som er fremstilt i doseringsenheter inneholdende fra ca. 100 til ca. 5000 mg pr. enhet.

Benyttet ved enkeltdosebehandlIng av gonore før imidlertid høyere minimumdoser av antibiotikum A 40926 kompleks, dets faktorer A, PA, B, Bq eller PB, vanligvis varierende mellom 0,5 og 50 mg/kg, benyttes for å opprettholde et effektivt blodnivå av legemiddelet over en lengre tidsperiode.

Videre, ved behandling av gonore blir en parenteral doseringsform med vedvarende virkning fortrinnsvis benyttet. Preparater med vedvarende virkning kan fremstilles basert på forskjellige mekanismer og metoder som kjent innen teknikken.

En foretrukken metode for fremstilling av et preparat med vedvarende virkning og inneholdende antibiotikum A 40926 kompleks, dets faktorer A, B, Bq, PA og PB innebærer bruken av en vannuoppløselig form av dette antibiotikum suspendert i et vandig eller oljeholdig medium. Disse former, dvs. enten som et uoppløselig salt eller som den frie syren, blir således frigjort meget langsomt ved intramuskulær Injeksjon p.g.a. deres lave vannoppløselighet og gir derved vedvarende blodnivåer av det antibiotiske stoff.

Fremstilling av farmasøytiske preparater:

En enhetsdoseringsform fra lntramuskulær injeksjon f rem-stilles med 5 ml steril suspensjon TJSP inneholdende 8% propylenglykol og 1000 mg antibiotikum A 40926 faktor B.

En enhetsdoseringsform for intramuskulær injeksjon fremstilles med 2000 mg antibiotikum A 40926 faktor B natriumsalt suspendert i 5 ml sterilt vann for injeksjon.

Videre er de ifølge oppfinnelsen fremstilte antibiotika nyttige for å undertrykke veksten av Clostridium difficile som forårsaker pseudomembrankolitt 1 tarmen. Antibiotikumet kan anvendes ved behandling av pseudomembrankolitt ved oral administrasjon av en effektiv dose av antibiotikumet eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, fremstilt i en farma-søytisk akseptabel doseringsform. For slik anvendelse kan antibiotikumet administreres i gelatinkapsler eller i flytende suspensjon.

Foruten deres aktivitet som legemidler kan forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen benyttes som vekstfremmende midler for dyr. For dette formål administreres en eller flere av forbindelsene i foreliggende oppfinnelse oralt i et egnet for. Den eksakte konsentrasjon som benyttes, er den som skal til for å gi det aktive middelet i en vekstfremmende effektiv mengde når normale mengder f dr konsumeres.

Tilsetningen av de aktive forbindelsene i foreliggende oppfinnelse til dyrefSr oppnås fortrinnsvis ved fremstilling av en passende f5r-forblanding inneholdende de aktive forbindelsene i en effektiv mengde og inkorporering av forblandingen i den komplette rasjon. Alternativt kan et intermediært konsentrat eller forsupplement inneholdende den aktive bestanddel innblandes i fdret.

Måten slike f5r-forblandinger og komplette rasjoner kan fremstilles og administreres på, er beskrevet i litteraturen (slik som Applied Animal Nutrition", w.H. Freedman and Co., S. San Francisco, USA, 1969 eller "Livestock Feeds and Feeding" 0 and B books, Corvallls, Oregon, USA, 1977).

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1; Fermentering av Actinomadura sp. ATCC 39727

En kultur av antibiotikum A 40926-produserende stamme (Actinomadura sp. ATCC 39727) dyrkes på hvetemel-stråagar i 2-3 uker ved 28°C og benyttes for å inokulere en 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml medium sammensatt av 0,5$ kjøttekstrakt, 0,5$ autorisert gjær, 0,5$ pepton, 0,3$ hydrolysert kasein, 2$ glukose, 0,15$ NaCl (pH 7,5 før sterilisering).

Kolben inkuberes ved 28°C på en roterende rysteinnretning ved 200 omdr./min. i ca. 72 timer og deretter overføres kulturen til en fermentor inneholdende 4 liter av det ovenfor angitte medium. Denne kulturen dyrkes ved 28°C i ca. 72 timer med luftstrøm på omkring 2 liter pr. minutt og omrøring ved ca. 900 omdr./min. Deretter anvendes den for å inokulere en 200 liters fermentor med det samme mediet. Denne fermentoren beluftes med 100 liter pr. minutt av steril luft, og omrøres ved 250 omdr./min. ved ca. 28°C. Produksjonen av antibiotikum overvåkes ved hjelp av papir-skive-agardiffusjonsmetoden ved bruk av B. subtilis på et minimalt medium som testorganisme. Den maksimale aktiviteten oppnås etter 72-76 timer.

Eksempel 2: Utvinning av antibiotikum A 40926

A) Fermenteringsbuljongen avkjøles til 4°C, bringes til pH 9,5 og omrøres. Etter ca. 1 time filtreres den, og filtratet justeres til en pH-verdi på ca. 3,5 med en vandig mineralsyre. Blandingen omrøres i 30 min. ved 4°C og filtreres deretter med ("Hyflo-FloMa") filterhjelpemiddel.

Det klare filtratet kasseres, og filterkaken suspenderes i deionisert vann, justeres til en pH-verdi på ca. 8,5, omrøres og blir deretter filtrert. Den utvunnede kaken utsettes for den samme prosedyren. De kombinerte filtratene inneholder antibiotikum A 40926. B) Svellet D-ala-D-ala-c-aminokaproyl-sepharose-modifisert matrise (2 liter) tilsettes til fermenteringsbuljongen oppnådd ifølge eksempel 1 (etter filtrering derav og bringing av pH-verdien for det klare filtratet til ca. 8,5) eller til det kombinerte filtratet oppnådd ifølge det ovenfor angitte eksempel 2A. Etter omrøring natten over ved romtemperatur gjenvinnes harpiksen ved filtrering og vaskes I rekkefølge med ca. 2 x 10 liter 0,45 mM HCl-Tris-buf f er pH 7,5 (TEIS = 2-amino-2-hydroksymetyl-l,3-propandiol) som inneholder 5$ (vekt/vol) NaCl og deretter med destillert vann (4 x 20 liter).

A 40926-antibiotikumet elueres fra harpiksen med .1$ (vekt/- vol ) ammoniakkhydrat (2 x 20 1). Eluatene hensettes natten over ved romtemperatur og konsentreres deretter til et lite volum (ca. 2,5 liter). Vann elimineres ved azeotrop destillasjon med n-butanol. Petroleumeter tilsettes deretter, og dette gir utfelling av 3,4 g urent antibiotikum A 40926 kompleks.

Eksempel 3: Rensing av antibiotikum A 40926 kompleks AB

Urent antibiotikum A 40926 kompleks oppnådd vesentlig ifølge metoden i ovenstående eksempel 2, (750 mg; H.PLC titer 70$) oppløses i 400 ml vann, justeres til pH 7,5 og filtreres. Filtratet underkastes deretter affinitetskromatografi på en D-ala-D-ala-c-aminokaproyl-sepharose-kolonne (50 ml svellet harpiks; sjikthøyde lik 5 cm). Kolonnen, likevektinnstilt med 0,16$ (vekt/vol) ammoniakk inneholdende 2 M NaCl justert til pH 7,5 med HC1, utvikles i rekkefølge med følgende tre bufferoppløsninger:

Buffer C eluerer antibiotikum A 40926 kompleks AB i en enkelt fraksjon. Denne eluerte fraksjon justeres til pH 7,0 og påføres på nytt på den samme affinitetskolonnen bufret med 10 mM Tris-HCl pH 7,0. Kolonnen vaskes med destillert vann inntil avsalting er fullstendig. Antibiotikumet elueres deretter med 2 kolonnesjiktvolumer med 0,39$ (vekt/vol) vandig ammoniakk pH 11,0.

De eluerte fraksjonene konsentreres til en liten, vandig blanding og blir deretter frysetørket. Rent antibiotikum A 40926 kompleks AB (374 mg) oppnås.

Eksempel 4: Isolering av antibiotikum A 40926 faktor A og B

A) Antibiotikum A 40926 kompleks som oppnådd i eksempel 2 (3,3 g) eller antibiotikum A 40926 kompleks AB som oppnådd i eksempel 3 (2,3 g), suspenderes i 0,5 liter vann, omrøres og filtreres deretter. Det klare filtratet anbringes på en silanert silisiumdioksydgelkolonne (200 g), sjikthøyde 18 cm, silanert silikagel 60; 70-230 mesh, Merck Inc.) på forhånd likevektsinnstilt med oppløsning A (0,001 M vandig natrium

EDTA inneholdende 0,25$ (vekt/vol) NaH2P04.H20 og 2,5$ (vekt/vol) NaCl -justert til pH 6,0 med NaOH. Kolonnen elueres med en lineær gradient fra 0$ til 40$ (v/v) acetonitril i oppløsning A med et totalt volum på ca. 7 liter i ca.a 48 timer. Fraksjoner på ca. 15,5 ml oppsamles og analyseres ved bioanalyse på Bacillus subtilis og analyseres ved hjelp av HPLC. Fraksjoner som har et innbyrdes lignende antibiotisk innhold, kombineres. Fraksjoner nr. 310-330 og nr. 348-365 Inneholdt de antibiotiske stoffene betegnet henholdsvis A 40926 faktor A og A 40926 faktor B. B) De kombinerte fraksjonene inneholdende de enkelte A 40926 faktorer A og B konsentreres under redusert trykk for å fjerne acetonitril, fortynnes med vann (ca. 2 ganger volumet til de innledende oppløsninger) og anbringes på en silanert silisiumdioksydgelkolonne av den ovenfor beskrevne type (volum for svellet matrise: 50 ml, sjikthøyde 15 cm). Kolonnen vaskes med deionisert vann inntil avsalting er fullstendig og utvikles til slutt med acetonltril/vann 60:40 (v/v).

De eluerte fraksjonene konsentreres under redusert trykk, og restene frysetørkes for oppnåelse av 134 mg antibiotikum A 40926 faktor A fra den første gruppen av eliierte fraksjoner (fraksjoner 310-330 ovenfor) og 206 mg av A 40926 faktor B fra den andre gruppen av eluerte fraksjoner (fraksjoner 348-365, ovenfor ).

Eksempel 5: Isolering av antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB

Ved i det vesentlige å følge metoden i eksempel 2A og de første trinnene i metoden i eksempel 2B, elueres antibiotikumet bundet til harpiksen med 1$ (vekt/vol) ammoniakkhydrat (2 x 20 liter). Eluatene justeres til p.H 7,8 med svovelsyre, og konsentreres til et lite volum under vakuum ved azeotrop destillasjon med n-butanol for oppnåelse av et vandig konsentrat som deretter filtreres på papir. Det oppnådde filtrat inneholder antibiotikum A 40926 faktor PA, A 40926 faktor PB og mindre mengder A 40926 faktor A og faktor B (HPLC). En prøve (10 ml) av dette vandige konsentrat Inneholdende ca. 50 mg/ml rent antibiotikum A 40926 kompleks (HPLC-analyse) filtreres på et filter med porestørrelse 5 pm ("Acrodisc", Gelman Science Inc.) og anbringes deretter på en rustfri stålkolonne (diameter lik 2 cm) inneholdende 20 g av en oktadecylsilyl-reversfase-sil 1 siumdioksydgel. ( "Lichrisorb RP 18", Merck, Inc.; partikkelstørrelse 10 pm). Silisiumdiok-sydgelen pakkes deretter under moderat trykk (nominelt trykk ca. 14 bar)i en rustfri stålkolonne i et Chromatospac Modulprep-apparat /Yoben Yvon, Frankrike) og llkevekts-innstilles med en blanding bestående av acetonitril og 18 mM natriumfosfatbuffer pH 6,0, 25:75 (v/v). Eluerlngen utføres ved bruk av den samme oppløsningsmlddelblanding som benyttes for likevektsinnstillingen ved en strømningshastighet på ca. 10,5 ml/min. Eluatet overvåkes ved bioanalyse på Bacillus subtil is og ved HPLC. De fraksjoner som har innbyrdes likt antibiotisk innhold, kombineres og de homogene fraksjonene fra fem kromatografiske gjennomkjøringer konsentreres for å inndampe det organiske oppløsningsmiddelet.

Den resulterende oppløsning fortynnes med vandig 1 M natriumklorid to ganger det opprinnelige volum og anbringes på en silanert silislumdioksydgelkolonne (50 g) sjikthøyde 5 cm, silanert silikagel 60, Merck Inc.), likevektsinnstilt med vann.

Kolonnen vaskes med deionisert vann inntil avsalting er fullstendig (Intet AgCl-bunnfal1 i eluatene etter tilsetning av vandig AgNOQ) og elueres deretter med acetonitril:vann 1:1 (v/v). Eluatene som har innbyrdes likt antibiotisk innhold (HPCL-analysen) kombinerer, konsentreres til et lite volum ved azeotrop destillasjon med n-butanol for oppnåelse av en vandig fase som deretter frysetørkes. Utbytter:

Eksempel 6: Alternativ metode for isolering av antibiotikum A 40926 faktor B

Det kombinerte konsentrat fra to fremstillinger oppnådd ifølge eksempel 2 (det siste trinnet) filtreres, og filtratet anbringes på en kromatografisk kolonne med silanert silisiumdioksydgel (400 g, sjikthøyde 30 cm, silikagel 60, 70-230 mesh, Merck Inc.) på forhånd likevektsinnstilt med vann.

Kolonnen skyldes med vann (6 liter) og det adsorberte antibiotikum elueres med acetonltril/vann 1 overensstemmelse med følgende sekvens:

2.7 1 5$ (v/v) acetonitril i vann

1,6 1 10$ (v/v) acetonitril i vann

2,97 1 15$ (v/v) acetonitril i vann

3,15 1 20$ (v/v) acetonitril i vann.

Fraksjoner på ca. 18 ml oppsamles. Aktiviteten til de eluerte fraksjonene testes ved papir-skive-bioanalyse på mottagelige mikroorganismer slik som B. subtilis og analyseres ved HPLC. Fraksjoner med innbyrdes likt antibiotisk innhold kombineres (fraksjoner 472-526) og konsentreres under redusert trykk, n-butanol tilsettes til dette konsentrat for å azeotropisk måte å fjerne vann. Den butanoliske oppløsning som er tilbake, blir i sin tur konsentrert til et lite volum for å utfelle antibiotikum A 40926 faktor B (1,4 g). Dette produkt vaskes med petroleumeter under omrøring og oppsamles ved filtrering (tre ganger). Ved tørking under vakuum oppnås 760 mg A 40926 faktor B.

Ved på nytt å underkaste antibiotikum A 40926 faktor B for den ovenfor beskrevne kolonnekromatografi oppnås et produkt (340 mg) av antibiotikum A 40926 faktor B0 som har de samme fysikalsk-kjemiske egenskapene som rapportert ovenfor for antibiotikum A 40926 faktor B med unntagelse for at det viser kun en topp ved HPLC-analyse, nemlig toppen med retensjonstid på 1,22 i forhold til teicoplanin Ag komponent 2.

Eksempel 7: Omdannelse av antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB til antibiotikum A 40926 faktor A og faktor B. respektivt

Antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB (50 mg) oppløses separat i 2,5 ml vandig 1$ (vekt/vol) NH4OH og de resulterende oppløsninger holdes i ca. 24 timer ved romtemperatur under omrøring. Antibiotikum A 40926 faktor A oppnås fra oppløsningen opprinnelig inneholdende antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor B oppnås fra oppløsningen opprinnelig inneholdende antibiotikum A 40926 faktor PB ved fjerning av vann ved azeotrop destillasjon med n-butanol, utfelling med etyleter og oppsamling av bunnfallet ved filtrering. Utbytte ca. 75$.

Fremstilling av D- ala- D- ala- sepharose

Aktivert CH-sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) (1 g) svelles i 15 min. i en mM iskald saltsyre, og vaskes med den samme oppløsningen. Den oppnådde gel (ca. 3 ml) blandes med en oppløsning av D-alanyl-D-alanin (30 mg) i 0,5 M natriumklorid og 0,1 M natriumbikarbonat-buffer ved pH 8. Blandingen snus oppned i en time ved romtemperatur.

Etter at koblingsreaksjonen er fullført vaskes ligand-overskuddet av med bufferen. De ubundede aktiverte gruppene i dekstranbæreren blokkeres ved å behandle dem med en 1 mM etanolaminhydroklorid ved pH 9 1 en time.

Deretter utvinnes den sephadex-c-aminokaproyl-D-alanyl-D-alanin-modifiserte matrisen ved filtrering og vaskes grundig skiftevis med 0,5M natriumklorld og 0,1 M natriumacetat pH 4, og med 0,5 M natriumklorld og 0,1 Tris(hydroksymetyl)amino-metan-buffer pH 8 (fire ganger).

Claims

1. Fremgansmåte for fremstilling av et antibiotisk stoff betegnet antibiotikum A 40926 kompleks og dets faktorer antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor B0, antibiotikum A 40926 faktor PA, antibiotikum A 40926 faktor PB, en blanding derav og syreaddisjonssaltene derav, hvilke forbindelser har følgende egenskaper: Antibiotikum A 40926 faktor A i ikke-saltformen: A) ultrafiolett absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsjonsmaksima: B) infrarødt absorpsjonsspektrum viser følgende absorpsjonsmaksima (cm-<!>):

3700-3100, 3100-2800 (nujol); 1655; 1620-1560; 1510; 1480-1410 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1259; 1250-1190; 1100-950;

845; 810; 720 (nujol), C) ^H-NMR-spektrum som viser følgende signalgrupper (i ppm) ved 270 MHz registrert i DMSO d^, (heksadeuterodimetylsulfoksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S = ppm): $ 0,86 (t's, 6H); 1,21 (~11H); 1,43 (2H); 2,01 (2H);

2,31-2,34 (3H); 4-6,2 (~16H); 6,2-8 (~23H): 8,44, 9,22, 9,66 (brede bånd, mobile protoner) 2,5-4: interferens fra HgO-topper, D) retensjonstid (Rt) på 1,22 i forhold til teicoplanin Ag komponent 2 (R-^ = 20,3 min), analysert ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: under de samme betingelsene er retensjonstiden i forhold til testosteron (Roussel Uclaf) 0,60, E) elementanalyse, etter at prøven på forhånd er tørket ved ca. 140°C under inert atmosfære (aw 4,6$) som indikerer følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (i gjennomsnitt): karbon 55,82$; hydrogen 5,17$, nitrogen 6,31$; klor (totalt) 4,24$; klor (ionisk) 0,37$; uorganisk rest ved 900°C i luft: 1,2$; F) syre-base-titreringsprofil i 2-metoksyetanol (MCS):-vann, 4:1 ved titrer ing med KOH etter tilsetning av et overskudd av HC1 hvilket indikerer 4 ioniserbare funksjoner med følgende pk^g1 4>6» 5»6> 7.2, 9,2; G) Rf-verdi på 0,24 og en Rf-verdi I forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 på 0,70 1 følgende kromatografiske system: ved bruk av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater (sjikttykkelse 0,25 mm) visualisering: U.V.-lys gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfanilsyre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - bioautografi ved bruk av B. substilis ATCC 6633 på minimalt Davi s-medium; H) molekylvekt på ca. 1760 fra et FAB-MS-spektrum som viser M+H<+> toppen ved 1717; Antibiotikum A 40926 faktor B i ikke-saltformen: A) ultrafiolett absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsj onsmaksima: B) infrarødt absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsjonsmaksima (cm-<1>): 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol), C) ^H-NMR-spektrum som viser følgende signalgrupper i ppm i 270 MHz 1H-NMR registrert i DMSO d6 (heksadeuterodimetylsulf oksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (5 = ppm ): S 0,85 (d, isopropyl CH3's); 1,15 (~13H); 1,44 (~2H); 2,02 (2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 (~16H); 6,1-8 (~23H); 8,52, 9,30, 9,68 (brede bånd; mobile protoner) 2,5-4 interferens fra HgO-topper; D) retensjonstider (R<1>) på 1,2 og 1,27 i forhold til teicoplanin Ag komponent 2 (R^ = 20,3 min.) analysert ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: E) elementæranalyse, etter at prøven på forhånd var blitt tørket ved ca. 140°C under inert atmosfære (aw 9,6$) indikerer følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (gjennomsnitt): karbon 54,09$; hydrogen 5,13$; nitrogen 6,34$; klor (totalt) 4,12$; klor (ionisk) 0,39$; uorganisk rest ved 900°C i luften: 5$; F) syre-base-titreringsprofil i 2-metoksyetanol (MCS):vann, 4:1 ved titrering med KOH etter tilsetning av et overskudd HC1 (pH 2,7) hvilket indikerer fire ioniserbare funksjoner som har følgende pkrøcg: 4,5, 5,6, 7,2, 9,2. G) Rf-verdi på 0,21 og en Rf-verdi i forhold til teicoplanin Ag komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: ved bruk av silanert silisiumdioksydgel 60 Fgg4 Merck-plater (sjikttykkelse 0,25 mm), visualisering: U.V.-lys gul farge med Pauly-reagens, dvsi diazotert sulfanylsyre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - bioautografi ved bruk av B. subtilis ATCC 6633 på minimalt DavIs-medium; H) molekylvekt på ca. 1730 avledet fra et FAB-MS-spektrum som viser M+S<+> toppen ved 1731, Antibiotikum A 40926 faktor Bq 1 ikke-saltformen: A) ultrafiolett absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsjonsmaksima: B) infrarød absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsjonsmaksima (cm-<1>): 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625-1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 810; 720 (nujol), C) <1->H-NMR-spektrum som viser følgende signalgrupper (i ppm) i 270 MHz %-NMR-registrert i DMSO dfc (heksadeuterodlmetylsulfoksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm ), (§ 0 ppm): S 0,85 (d, isopropyl CH3<*>s); 1,15 (~13H); 1,44 (~2H); 2,02 (2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 (~16H); 6,1-8 (23H); 8,52, 9,30, 9,68 (brede bånd, mobile protoner) 2,5-4 Interferens fra H20-topper; D) retensjonstld (Rt) på 1,22 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (R^" 20,3 min.) analysert ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: E) elementanalyse etter at prøven på forhånd var tørket ved ca. 140°C under inert atmosfære (aw 9,6$) indikerer følgende omtrentlige prosentsammensetning (gjennomsnitt): karbon 54,09$, hydrogen 5,13$; nitrogen 6,34$; klor (totalt) 4,12$; klor (ionlsk) 0,39$; uorganisk rest ved 900°C i luften: 5$; F) syre-base-titreringsprof11 i 2-metoksyetanol (MCS):vann, 4:1 ved titrering med KOH etter tilsetning av et overskudd av HC1 indikerer fire ioniserbare funksjoner med følgende pkMCS: 4,5, 5,6, 7,2, 9,2; G) Rf-verdi på 0.21 og en Rf-verdi i forhold til Teicoplanin Ag komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: ved anvendelse av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater (sj" ikttykkelse 0,25 mm) visualisering: . - TJ.V. lys gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfonylsyre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292., 99, : (1953)). bioautografi ved bruk av B. subtilis ATCC 6633 på minimal Davis-medium; H) molekylvekt på 1730 avledet fra et FAB-MS-spektrum som viser M+H<+> toppen ved 1731, Antibiotikum A 40926 faktor PA i ikke-saltformen: A) ultrafiolett absorpsjonspektrum som viser følgende absorps j* ohsmaksima: B) infrarødt absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsjonsmaksima (cm--*):

3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1760-1710; 1655; 1620-1550, 1460 (nujol) 1375 (nujol); 1260, 1250-950; 805; 720 (nujol); C) -^H-NMR-spektrum som viser følgende signalgrupper (i ppm) i 270 MHz 1H-NMR registrert i DMSO d^ (heksadeuterodimetylsulfoksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0;00 ppm), (S=ppm):

0,86, d's (CH3); 1,15-1,22, m(CH2)n; <1>.41, m (CH2); 2,01, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,28, s (N-CH3); 4,26-5,96, br (peptidiske og aromatiske CH'er) 6,33-7,73 br (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); br = bred d =» dublett dd = dublett i d\ibletter m = multiplet s = singlet t = triplet D) retensjonstid (Rt) på 1,15 i forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 (Rt = 20,3 min.) analysert ved revers fase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 mm (i.d. ) x 250 mm E) Rf-verdi i forhold til teicoplanin Ag komponent 2 på 0,62 i følgende kromatografiske system: ved bruk av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater (sjikttykkel.se 0,25 mm) visualisering: - U.V.lys gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfanylsyre (J. Chromatog. 20, 171 (2965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)) - bioautografi ved bruk av B. subtil is ATCC 6633 på minimalt Davis-medium; F) molekylvekt på ca. 1758 avledet fra et FAB-MS-spektrum som viser en samling topper som har den mest intense toppen ved 1761; de operative betingelser for FAB-MS-analysen var følgende: Antibiotikum A 40926 faktor PB. i ikke-saltformen: A) ultrafiolett absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsj onsmaksima: B) infrarødt absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsjonsmaksima (cm--<1->):

3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1760-1710; 1955; 1620-1560;

1605; 1480-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1270; 1230-1190;

1150, 1120-920; 845; 810; 720 (nujol); Cl) ^H-NMB-spektrum som viser følgende signalgrupper (i ppm) ved 270 MHz i DMS0 db (heksadeuterodimetyl sulf oksyd) ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S=ppm) multiplisitet; (attribusjon): 0,84, d (isopropyl CH3'er); 1,17, m (CH2)n; 1,43, m (CH2), 1,99, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,31, s (N-CH3); 2,79, dd (C-H); 3,70, m (C-H); 4,06-6,02, br (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,74, br (aromatiske CH<*>er og peptidiske NH'er); 8,19-9,99, br (peptidiske NH'er og fenoliske 0H'er); C.2) ■'•H-NMR-spektrum som viser følgende signalgrupper (1 ppm) ved 270 MHz 1 DMS0 d6 pluss CF3C00D ved bruk av TMS som indre standard (0,00 ppm), (S=ppm) multiplisetet; (attribusjon): 0,84, d (isopropyl CH3'er); 1,13, m (CH2)n; 1,40, m (CH2); l,98,s (CH3); 2,00, m (CH2); 2,92, dd (C-H); 3,29-3,71, m (sukker C-H'er); 4,07-6,09, s og m (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,83, s og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er)8,17-10,38 (peptidiske NH'er, fenoliske 0H'er); D) retensjonstider (Rt) på 1,27 og 1,32 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (Rt= 20,3 min) analysert ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: TJ. V. detektor: 254 nm indre standard: Teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepeptit S.p.A.); E) Rf-verdi i forhold til Teicoplanin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: ved bruk av silanert silisiumdioksydgel 60 F254 Merck-plater (sjikttykkelse 0,25 mm), visualisering: - TJ.V.lys gul farge med Pauly-reagens, dvs. diazotert sulfanilsyre (J: Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)) bioautografi ved bruk av B. subtil is ATCC 6633 på minimalt Davies-medium; F) molekylvekt på ca. 1772 utledet fra et FAB-MS-spektrum som viser en opphopning av topper som har den mest intense toppen- ved 1776; de operative betingelser for FAB-MS analysen var følgende: instrument: VG Mod ZAB SE utstyrt med FAB gun Ion Tech betingelser: positiv FAB, XE akselerasjonsspenning, 8 KV matrise: tioglycerol-glycerol 1/1 (v/v), karakterisert ved at man dyrker stammen Actinomadura sp. ATCC 39727 ved en temperatur mellom 20 og 40°C, under submerse aerobe betingelser i nærvær av assimi-lerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter, utvinner og isolerer nevnte antibiotikum fra fermenteringsmediene og, om nødvendig, omdanner det til det ønskede salt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den anvendte temperaturen er mellom 24 og 35°C.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at utvinningen og isoleringen av de antibiotiske stoffene oppnås ved å underkaste den filtrerte fermenteringsmediet for en affinitetskromatografi på immobilisert D-alanyl-D-alanin fulgt av skille-, reversfase-eller ioneutvekslingskromatografi.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at utvinningen av de antibiotiske stoffene innbefatter: a) affinitetskromatografering på immobilisert D-alanyl-D-alanin av fermenteringsmediet, b) hurtig nøytralisering av de kombinerte antibiotikumholdige eluerte fraksjoner, og c) eventuell isolering av antibiotikum A 40926 faktorer PA, PB, A, B og Bq ved hjelp av reversfase-væskekromatografi på silanert silisiumdioksydgel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av en forbindelse valgt fra antibiotikum A40926 kompleks, antibiotikum A 40926 faktor .A, faktor B og faktor B0, karakterisert ved at man a) hever pH i fermenteringsmassen til en verdi mellom 8,5 og 10,5, b) filtrerer, c) surgjør til en pH-verdi mellom 2,5-4,5, d) filtrerer og kasserer filtratet, e) suspenderer filterkaken i vann og hever pH til en verdi mellom 8 og 9, f) etter utvinning av det urene antibiotikum A 40926 kompleks ved filtrering, utsetter det for affinitetskromatografi på immobilisert D-alanyl-D-alanln, g) eventuelt isolerer antibiotikum A 40926 faktor A og faktor B ved hjelp av skille-, reversfase- eller ioneutvekslingskromatografi, og h) underkaster antibiotikum A 40926 faktor B for en ytterligere affinitetskromatografi når antibiotikum A 40926 faktor Bq er ønsket.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den kromatografiske teknikken som anvendes, er reversfase-kromatografi og at den stasjonære fasen velges- fra silanert silisiumdioksydgel og ikke-funksjonaliserte polystyrenharpikser.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den stasjonære fasen er silanert silisiumdioksydgel som på forhånd er 1ikevektsinnsti1t med en bufret oppløsning ved en pH-verdi mellom 4 og 9, og at elueringsmiddelet er en lineær gradientblanding av et polart, vannblandbart oppløsningsmiddel i den samme bufrede oppløs-ning.