HU194317B - Process for production of a 40926 antibioticum-complex and its clean components, pa, pb,a,b and b under o factor and medical compounds containing thereof - Google Patents

Process for production of a 40926 antibioticum-complex and its clean components, pa, pb,a,b and b under o factor and medical compounds containing thereof Download PDF

Info

Publication number
HU194317B
HU194317B HU853936A HU393685A HU194317B HU 194317 B HU194317 B HU 194317B HU 853936 A HU853936 A HU 853936A HU 393685 A HU393685 A HU 393685A HU 194317 B HU194317 B HU 194317B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibiotic
factor
following
nujol
ppm
Prior art date
Application number
HU853936A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT39480A (en
Inventor
Enrico Selva
Luciano Gastaldo
Grazia Beretta
Angelo Borghi
Beth P Goldstein
Vittorio Arioli
Giovanni Cassani
Francesco Parenti
Original Assignee
Lepetit Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lepetit Spa filed Critical Lepetit Spa
Publication of HUT39480A publication Critical patent/HUT39480A/hu
Publication of HU194317B publication Critical patent/HU194317B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/03—Actinomadura

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás új, A 40926 komplexnek elnevezett antibiotikum és összetevői, az A 40926 antibiotikum A faktor, az A 40926 antibiotikum B faktor, az A 40926 antibiotikum Βθ faktor, az A 40926 antibiotikum PA faktor és az X 40926 antibiotikum PB faktor előállítására - oly módon, hogy az új Actinomadura sp. ATCC 39727 törzset vagy annak egy A 40926-ot termelő mutánsát vagy variánsát tenyésztjük. A találmány tárgya továbbá az említett antibiotikumot hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása.
A találmány szerinti antibiotikumok glikopeptid típusúak és az antibiotikumok vankomicin csoportjába sorolhatók, amelyekre az acfl-D-alanil-D-alanin iránt megnyilvánuló kötő kapacitás jellemző.
Az A 40926 antibiotikum komplex és összetevői, az A 40926 antibiotikum A faktor, B faktor, Βθ faktor, PA faktor és PB faktor sókat képezhet; a sók ismert eljárások szerint állíthatók elő.
A leírásban és az igénypontokban az „A 40926 antibiotikum ’ kifejezés a kővetkező vegyületek valamelyikét jelenti: A 40926 antibiotikum komplex, A 40926 antibiotikum A faktor, A 40926 antibiotikum B faktor, A 40926 antibiotikum Βθ faktor, a 40926 antibiotikum PA faktor, A 40926 antibiotikum PB faktor, ezek egy sója vagy valamilyen keveréke. Az „A 40926 antibiotikuqi komplex , „A 40926 antibiotikuifl PA faktor , „A 40926 antibioti^pm PB faktor , „A 40926 antibiotikum A faktor , „A 40926 antibiotikum B faktor”, „A 40926 antibiotikum Bq faktor’ kifejezés, ha a biológiai tulajdonságokról beszélünk, magában foglalja a megfelelő, gyógyászati szempontból elfogadható sókat is.
Az A 40926 antibiotikumot egy talajból izolált Actinomadura törzzsel végzett fermentációval állítjuk elő: a törzset 1984. június 8-án egy nemzetközileg elismert gyűjteményben, az American Type Culture Collection-ben (ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok (helyeztük letébe, a Budapesti Szerződés szerint. A törzset a letétbe helyezéskor az ATCC 39727 hivatkozási számmal látták el.
Eredetileg azt gondoltuk, hogy a termeld törzs a Streptomyces genushoz tartozik, ezért kezdetben Streptomyces nov. spec. A 40926 jelöléssel láttuk el és így helyeztük letétbe az ATCC-ben, ahol azt az ATCC 39727 hivatkozási számmal látták el. További vizsgálatok - különösen azok, amelyek a sejtfal összetételére irányultak - arra a következtetésre indítottak bennünket, hogy az új törzs az Actinomadura genushoz tartozik. Ennek megfelelően az eredetileg Streptomyces sp. ATCC 39727-ként letétbe helyezett törzset Actinomadura sp. ATCC 39727 törzsként neveztük el.
Az A 40926 antibiotikum komplex, az A 40926 antibiotikum A faktor, B faktor, Βθ faktor, PA faktor, vagy PB faktor előállítása úgy történik, hogy egy annak termelésére képes Actinomadura sp. törzset azaz az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzset vagy ennek egy A 40926 antibiotikumot termelő variánsát vagy mutánsát - aerób körülmények között vizes táptalajban - amely asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat ét szervetlen sókat tartalmaz - tenyésztjük. A fermentációs iparban rendszerint alkalmazott táptalajok közül sok felhasználható, egyes táptalajokat azonban előnyben részesítünk. Kitüntetett szénfonás a glükóz, galaktóz, keményítő, kukoricaliszt atb. Kitüntetett nitrogénforrás az ammónia, a nitrátok, szójaliszt, pepton, húskivonat, élesztőkivonat, tripton, aminosavak stb. A táptalajban alkalmazható szervetlen sók azonosak azokkal a szokásosan alkalmazott oldható sokkal, amelyek képesek nátrium, kálium, vas, cink, kobalt, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, szulfát, foszfát, nitrát stb. ionok szolgáltatására.
Az antibiotikum-termelő törzset rendszerint rázólombikban előtenyésztjük, majd a tenyészetet üvegfermentorok beoltására használjuk fel, jelentősebb mennyiségű antibiotikum előállítására. Az elő-tenyésztéshez használt táptalaj azonos lehet azzal, amelyet nagyobb méretű fermentációkhoz alkalmazunk, de más táptalajok szintén alkalmazhatók. Az A 40926 antibiotikumot termelő törzs 20 és 40°C közötti hőmérsékleten, előnyösen 24 és 35°C között tenyészthető. A fermentáció alatt az antibiotikum termelést oly módon követhetjük, hogy pl. biológiai vizsgálatokkal vagy fékonyrétegkromatográfiásan (TCL) vagy nagynyomású folyadék kromatográfiásan (HPLC) meghatározzuk a fermentlé-minták vagy a micélium kivonat minták ’ antiblotikus aktivitását,
A vizsgálati organizmusként az A 40926 antibiotikumokra érzékeny organizmusokat használhatunk fel, amilyen a Bacillus subtilis és a Streptococcus aureus. A biológiai meghatározást előnyösen agardiffúziós módszerrel végezzük, agar lemezeken. A maximális antibiotikum termelés általában a fermentáció 2. és
5. napja között következik be.
Az A 40926 antibiotikumot az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs - vagy ennek egy A 40926antibiotikumot termelő mutánsa vagy variánsa tenyésztésével állítjuk elő. Az antibiotikum főtömegében a fermentlében fordul elő.
Az A 40926 antibiotikumot termelő Actinomadura sp. ATCC 39727 törzs jellemzését a következőkben adjuk meg:
Makroszkópos és mikroszkópos vizsgálat
A vegetatív micélium hajlékony, élágazó hifákból áll (átmérő kb. 0,8 jum), amely egyes táptalajokon - ezeket az I. Táblázatban csillaggal jelöljük - több napi növekedés után enyhe tendenciát mutat a pálcaalakú elemekké való fragmentálásra, míg glükóz-,, -aszparagin táptalajon kokkoid elemekké fragmentál.
Erre a törzsre egyes táptalajokon a vegetatív micéllurn borvörös színe jellemző.
A légmicélium csak néhány táptalajon van jelen. Közelebbről: az I. Táblázatban feltüntetettek közül csak zabliszt agaron és talaj agaron képződik. Ezeken a táptalajokon a légmicélium fehéres-szürke és spórahordozókat képez - amelyek sarló alakban rendeződnek el -, valamint rövid, kb. 10—20 spórából álló spirálokat. A spórák hengeresek és átlagos méretük 0,8 x 1,2 Mm.
A növekedési Jellemzők meghatározása
A tenyésztési jellemzők meghatározásához az Actlnomadura sp. ATCC 39727 törzset különböző, Shirling és Gottlieb által javasolt standard táptalajokon tenyésztjük (E. B. Shirling, D. Gottlieb, Method fór characterization of Streptomyces species, Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340, 1966), és ezek mellett néhány, Waksman által ajánlott közeget Is felhasználunk (S. A. Waksman, The Actinomycetes, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Vol. 2, 328-21
334.).
A szfnmeghatározást, ha ez szükségesnek bizonyult, Maerz és Paul módszerével végeztük (A. Máéra,
M. Reá Paul, A Dictionary of Color, 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company Inc., New York, 1950).
Az organizmus különböző szénforrások hasznosítására irányuló képességét a Shirling és Gottlieb által leírt módszerrel határoztuk meg.
A tenyésztési és fiziológiai jellemzőket, valamint a szénforrás hasznosítást az I., II. és III. Táblázatban mutatjuk be.
Az I. Táblázat elkészítéséhez a leolvasásokat 2 hetes, 28 0 C-on végzett inkubálás után hajtottuk végre.
/. Táblázat
Táptalaj
2. sz. táptalaj (élesztőkivonat-maláta agar)
3. sz. táptalaj (zabliszt-agar)
4. sz. táptalaj (szervetlen só-keményítő agar)
5. sz. táptalaj (glicerin-aszparagin agar)
6. sz. táptalaj* (pepton-élesztőkivonat-vas agar)
7. sz. táptalaj* (tirozin agar) Zabliszt agar*
Hickey-Tresner agar*
Czapek-f. glükóz agar
Glükóz-aszparagin agar’
Tápagar
Burgonyás agar* Bennet-f. agar* kaldummaiát agar Lefölözött tej agar Czapek szacharóz agar Tojásalbumin agar*
Jellemzők
Bőséges növekedés, kérges felülettel, 8/L/8, nyomokban borostyánszinű-rőzsaszmű oldható pigment Bőséges növekedés, sima felüfelület, ibolyaszínű, 55/E/4, nagyon gyér szürke légmicélium, lila oldható pigment-55/H/4
Mérsékelt növekedés, nagyon, sima és vékony felszín, luémszínű-10/D/2
Mérsékelt növekedés, sima és vékony felszín, 10/B/2 sárgabarack
Mérsékelt növekedés, enyhén kérges felület, 12/D/9 borostyánszínű
Bőséges növekedés, sima és vékony felszín, 13/K/12 borostyánszínű-bama Intenzív növekedés, sima felszín, 8L/L/7,légmicélium mérsékelten világos sárgásszürke: 44/B/2
Intenzív növekedés, ráncos felület, 13/K/12 borostyánkőszínű-barna
Mérsékelt növekedés, sima felület, 9/1/3 világossárga Gyér növekedés, krémszínű felszín, 9/E/ szalmasárga Intenzív növekedés, ráncos felület, világossárga: 1 l/C/7 Intenzív növekedés, ráncos felület, 8/L/9 borvörös Intenzív növekedés, kérges felület, 8/L/8 borvörös, 5/3/10 oldható, mély borostyán-rózsaszínű pigment Mérsékelt növekedés, sima felszín, 10/B/3 sárgabarack Intenzív növekedés, enyhén ráncos felület, 9/B/9 narancs Intenzív növekedés, ama felülettel, ÍO/B/6 sárgabarack Intenzív növekedés, sima felülettel, 52/B/3, 52/B/3 rózsaszínű oldható pigment nyomok
Sabouraud agar Talaj agar
Dextróz tritpon agar*
Burgonya szelet
Nincs növekedés Gyér növekedés, színtelen, fehéres-sárga légmicélium Mérsékelt növekedés, sima és vékony felület, 10/G/2 világossárga
Intenzív növekedés, narancsbarna, fehéres-szürke légmicélium nyomokban
II. Táblázat Fiziológiai Jellemzők
Vizsgálat
Keményítő hidrolízis HaS képződés
Tirozin reakció Kazein hidrolízis Kalciummalát hidrolízis
Zselatin folyósítás Lakmusz-tej koagulálás peptonizálás
Cellulóz bontás Nitrát redukció
Eredmények negatív
6. sz. táptalajon negatív, ólomacetátos szalagokkal pozitív pozitív pozitív negatív pozitív negatív pozitív negatív pozitív
III. Táblázat Szénforrás hasznosítás
Szénfonás arabinóz xilóz mannóz fruktóz raffinóz ramnóz glükóz laktóz galaktóz inozit szacharóz cellulóz szalicin mannit ribóz * = növekedés - = nincs növekedés
Növekedés
Kemotaxonómlai jellemzés
Sejtfal elemzés:
A sejtfalban jelenlévő aminosavak elemzését Becker és munkatársai módszereivel végeztük („Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates ’, Appl. Microbiol. 12, 421-423, 1964). A teljes sejt hidrolizátum elemzése mezo-diaminopimelinsav jelenlétére mutat.
A Kawamoto et al. módszerével (I. Kawamoto, T. Oka, T. Nara, „Cell-wall composition of Micromonospora olivoasterospora, Micjomonospora sagamiensis and related organisms’, J. Bact. 146, 527—534, 1981) előállított tiszta sejtfal elemzése glicin távollétére mutat.
Cukor elemzés:
A cukor-tartalom meghatározását Μ. P. Leche-31
194 317 vailer módszere szerint végezzük - „Identification of aerobic Actinomycetes of clinical importance”, J. Láb. Clin. Med. 71, 934-944, 1968 -, vékonyrétegkromatográfiás lemezek alkalmazásával, a J. L Staneck és G. D. Roberts által leírt módon) „Simplified approach to Identification of aerpbic Actinomyoetes by thin-layer chromatography , 28, 226231, 1974), a kővetkező oldószer-rendszer alkalmazásával (térf/térf.) : etilacetát : piridin : víz 100 : 35 : 25. A kapott eredmények arra mutatnak, hogy főleg glükóz és ribóz van jelen, és kisebb mennyiségben ugyancsak kimutatható volt a gal aktóz, mannóz és a maduróz.
Mikolsavak:
A mikolsavak jelenlétének kimutatására végzett vizsgálatot Minnikin és munkatársai (D. E. Minnikin, L. Alschamaony, M. Goodfellow: „Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin íayer chromatography analysis of whole organism methanolysates , J. Gén. Microbiol. 88, 200— 204, 1975), módszere szerint hajtottuk végre.
A vizsgálat eredménye negatív: mikolsavak nem találhatók.
A törzs azonosítása:
A >( törzset az „Actinomycetes, Actinomadura genus rendszertani helyre soroljuk be a következő ismérvek alapján: jelen van a mezo-diaminopimelinsav és a maduróz, nincs jelen a peptidoglukánban a glicin, hiányzik a mikolsav és mérsékelten hosszú spóraláncokat hordozó légmicélium képződik.
Más mikroorganizmusokhoz hasonlóan az A 40926 antibiotikumot termelő törzs jellemzői is változásoknak vannak kitéve. Például előállíthatjuk a törzs mesterséges variánsait és mutánsait, különböző ismert mutagénekkel — pl. UV-besugárzással, röntgensugárzással, nagyfrekvencíájú hullámokkal, radioaktív sugárzással -, vegyi anyagokkal - pl. salétromsavval, N-metil-N -nitro-N-nitrozo-guanidinnel - és más módon való kezeléssel. Valamennyi természetes és mesterséges variánst és mutáns, amely az Actinomadura genus speciesei közé tartozik és A 40926 antibiotikumot termel, egyenértékűnek tekintjük az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel és a találmány oltalmi körébe tartozónak jelentjük ki.
A találmány szerinti antibiotikumok kinyerését s termelő mikroorganizmus fermentlevéből ismert módon végezzük. Ezek a következőket foglalják magukban: oldószeres extrakció, kicsapás kicsapószerek hozzáadásával vagy az oldat pH-jának megváltoztatásával, megosztásos kromatográfia, fordított fázisú megosztásos kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, affinitáskromatográfia stb.
Kitüntetett eljárás az affinitáskromatográfia rögzített D-alanil-D-alaninon, amelyet fordítóit fázisú oszlopkromatográfia követ.
A találmány szerinti kinyerési eljárás szempontjából megfelelő rögzített D-alanil-D-alanin mátrixokat ismertet a 83112555 sz. európai szabadalmi bejelerv tés. A jelen eljárás esetében a kitüntetett mátrix a meghatározott pórusméretű keresztkötéses polidextránnal kapcsolt D-alanil-D-alanin.
A fermentlé közvetlenül szűrés után vagy előzetes tisztítási eljárás után vethető alá affinitáskromatográfiának. Az utóbbi esetben a teljes fermentációs közeget meglúgositjuk - a pH-t előnyösen 8,5 és
10,5 közé állítjuk be - a micéliumon adszorbeálódott antibiotikum oldatba vitelére, majd a fennentlevet szűrjük. A tiszta szürlet pH-ját 2,5-4,5-re állítjuk be és ismét szűrjük, szűrést elősegítő anyag jelenlétében. A szürletet elvetjük, míg a kinyert szűrőlepényt vízben szuszpendáljuk, a pH-t lúgosra állítjuk be - előnyösen 8 és 9 közé - , majd szűrjük a szuszpenziót. A szűrőlepényt ugyanilyen módon kezeljük, az A 40926 antibiotikumot tartalmazó szőrieteket pedig összegyűjtjük.
Ezeket a szikieteket vagy a szűrt fermentleveket ezután rögzített D-alanil-D-alaninon — oszlopban vagy szakaszosan — affinitáskromatográfiának vetjük alá.
Az antibiotikumnak az affinitást mutató mátrixhoz való kötését előnyösen kb. 7,0-8,0 pH-η végezzük és eluálását magasabb pH értékeken (előnyösen 9,0 és 10,5 között) végezzük, vizes bázis segítségével. Ez a vizes bázis lehet ammónia, egy illékony amin, egy alkáli- vagy alkálifém-hidroxid vagy egy lúgos pufferoldat, adott esetben egy poláris szerves oldószer — p. a következőkben meghatározandó poláris vízzel elegyedő oldószer - jelenlétében.
A szennyezéseket úgy távolítjuk el, hogy az oszlopot pH 4—8 vizes pufferrel öblítjük át, amely adott esetben sókat, karbamidot és/vagy vízzel elegyedő oldószereket tartalmaz. Ezután az A 40926 antibiotikumot az előbbi eluáló elegyekkel eluáljuk. A nyers antibiotikumot előnyösen úgy nyerjük ki, hogy az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókból a, vizet egy szerves oldószerrel - amely vízzel minimum azeotróp keverékek képzésére képes — végzett azeotróp desztillációval eltávolítjuk, majd a keresett termék kicsapására egy kicsapószert adagolunk.
A következőket jelöljük meg olyan oldószerek jellegzetes példáiként, amelyek vízzel minimum azeotróp elegyeket képesek alkotni: n-butanol, benzol, toluol, dibutiléter, széntetraklorid, kloroform, ciklohexán, 2,5-dimetíl-furán, hexán és m-xilol; az előnyben részesített oldószer az n-butanol.
Példák a kicsapószerekre: petroléter, rövidszénláncú alkil-éterek (pl. etiléter, propiléter és dibutiléter) és rövidszénláncú alkil-ketonok, pl. aceton.
Egy másik megoldás szerint az egyesített, antibiotikumot tartalmazó frakciókat kis térfogatra töményítjük be - előnyösen egy, az előbbiekben meghatározott szerves oldószerrel végzett azeotróp desztilláció segítségével — és a kapott vizes oldatot liofilizáljuk.
Ha az eluáláshoz alkalmazott vizes bázis nem illékony, kicsapás vagy fagyasztva-szárítás előtt szükségessé válhat a semlegesítés és a koncentrátum sómentesftése,
Egy egyszerű sómentesftési eljárás szerint az antibiotikumot tartalmazó vizes oldatot szilanizált szilikagél oszlopra visszük fel, az oszlopot desztillált vízzel mossuk és poláris, vízzel elegyedő oldószer és víz elegyével eluáljuk. A poláris, vízzel elegyedő oldószerek jellegzetes példái: vízben oldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, rövidszénláncú alkánkarbonsavak rövidszénláncú alkilészterei (pl. etilacetát), tetrahidrofurán, dioxán és dimetilformamid és ezek elegyek A kitüntetett poláris vízzel elegyedő oldószer az acetonitril .
Egy másik megoldás szerint a sómentesítést úgy hajthatjuk végre, hogy az antíbiotikurnotTartalrnaző
B, B«, PA és PB
Célszerű eliá oldatot felvisszük az előbbiekben ismertetett affinitás-oszlopra, ezt desztillált vízzel mossuk és egy illékony vizes bázissal eluálunk, amint ezt az affinitáskromatográfiával kapcsolatos elució esetében az előbbiekben leijük. Az Így kapott termék az A 40926 antibiotikum komplex. Ezt szükség esetén tovább tisztíthatjuk vagy megosztásnak vethetjük alá az A, aktor előállítására.
ást jelent a tiszta A 40926 antibiotikum komplex előállítására az előbbi módon kapott komplex további tisztítása egy affinitáskromatográfiás oszlopon. Általában az előbb említett stacionárius fázist (D-alanil-D-alanin) alkalmazzuk és a keresett antibiotikumot úgy eluáljuk, hogy az előbbiekben ismertetett, rögzített D-alaníl-D-alanin felhasználásán alapuló-affinitáskromatográfiás eljárást követjük. Kitüntetett rögzített D-alanil-D-alanin a Sepharose-epszilon-aminokaproil-D-alanil-D-alanin, előnyben részesítjük kiegyensúlyozó elegyként a pH 7-8-ra beállított, 2 M NaCl-ot tartalmazó 0,16%-os (tömeg/' térf.) ammóniát. Előnyben részesítjük továbbá a következő oldatok alkalmazását: átöblítő oldatként pH 8-9,5-re beállított 2 M NaCl-ot tartalmazó 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia-oldat; eluáló elegyként pH 10,5—12-re beállított, 2 M NaCl-ot tartalmazó 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia, mimelleh a leginkább kitüntetett eluáló elegy az előbbi összetételű oldat, pH 11,5-re beállítva.
Az A 40926 antibiotikum faktorokat - nevezetesen az A 40926 antibiotikum A faktort, az A 40926 antibiotikum B faktort, az A 40926 antibiotikum Bfl faktort, az A 40926 antibiotikum PA faktort es az A 40926 antibiotikum PB faktort — az A 40926 antibiotikum komplex vizes oldatából különítjük el oszlopkromatográfiával, előnyösen fordított fázisú oszlopkromatográfiával. A fordított fázisú oszlopkromatográfia esetében a kitüntetett stacionárius fázis a szilanizált szilikagél. Jó eredményeket kapunk azonban abban az esetben is, ha az oszlopkromatográfiát eredeti (funkcionálisan nem átalakított) polisztirol és akrilsav gyantákon hajtjuk végre. A kereskedelemben ezek a következő neveken szerezhetők be: Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7, és XAD-8) Rohm és Haas) vagy Diaion HP 20 (Mitsubishi).
Abban az esetben, ha a fordított fázisú tisztítási lépést stacionárius fázisként szilanizált szilikagélen hajtjuk végre, az oszlopot előzetesen - egy előnyös megoldás szerint - egy pH 4-9 közötti vizes pufferoldattal, előnyösen pH 5,5-6,5 puffer-oldattal hozzuk egyensúlyba, majd egy poláris, vízzel elegyedő oldószerrel (ugyanezzel a pufferoldattal képzett lineáris grádienselegyével) eluáljuk. Jellemző példák a poláris, vízzel elegyedő oldószerekre: vízben oldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, tetrahidrofurán, dioxán és dimetilformamid, illetőleg ezek elegyei. A kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer az acetonitril.
Az eluáit frakciók antibiotikum tartalmát a szokásos biológiai vizsgálatok segítségével — amilyen a pa-. pírkorong vagy az agardiffuziós vizsgálat - határozzuk meg, valamely érzékeny mikroorganizmussal. Az érzékeny mikroorganizmusok közé tartozik a Bacillus subtilis és a Streptococcus aureus.
A kromatográfia előnyösen követhető TLC vagy HPLC technikákkal is.
Előnyben részesített HPLC technika pl. egy fór· dftott fázisú HPLC eljárás, amelynek során a következő elemeket alkalmazzuk: porózus, gömbalakú átmérő előnyösen 5 gm átmérőjű -, C-18 alkil-csoportokkal funkcionalizált, szilanizált szilikagél részecskéket tartalmazó oszlop (ilyen töltet pl. az 5 gm Ultrasphere^ ODS Altex, Beckman . Co.), C-18 alkilcsoportokkal funkcionalizált szilikagélt tartalmazó előoszlop (ilyen töltet pí. az RP 18, Brownles Labs), és egy olyan eluálószer, amely egy poláris, vízzel elegyedő oldószer (pl. valamelyik előbbiekben említett oldószer (lineáris grádians elegye valamely vizes puffer-oldattal.
Ezt az oldatot előnyösen pH 5-7-re állítjuk be. Különösen kitüntetett eluálószer egy olyan oldat, amely 5-60% B eluálószert - lineáris grádiens eloszlásban - tartalmaz A eluálószerben. Ebben az esetben az A eluálószer pH 5-7-jű 10 : 90 acetonitril : vizes puffer elegy, és a B eluálószer pH 5-7-jú 70 : 30 acetonitril: vizes puffer elegy. Mint ez a szakember számára ismert, belső standardként számos, anyag használható.- Nagyon előnyös esetünkben a teikoplanin A2, 2. komponens (Gruppé Lepetit S. p. A.) alkalmazása, amelynek retenciós ideje ebben a HPLC rendszerben közel áll a találmány szerinti vegyületekéihez. Ezt a standard anyagot a 2121401 sz. brit szabadalmi bejelentés ismerteti és jellemzi.
A hasonló antibiotikus aktivitást mutató frakciókat összeöntjük és az előbbiekben leírt módon sómentesítjük. így lényegében tiszta A 40926 antibiotikumot A, B, Bfl, PA és PB faktorhoz juthatunk.
A lényegében tiszta A 40926 antibiotikum A faktort, A 40926 antibiotikum B faktort, A 40926 antibiotikum Bq faktort, A 40926 antibiotikum PA faktort és a 40926 antibiotikum PB faktort az ezeket tartalmazó frakciókból számos ismert eljárással nyerhet-, jük ki, amilyen pl. a Uofilizálás, kicsapás kicsapószerekkel vagy kicsapás a pH változtatásával, a vizes oldatban.
Egy kitüntetett eljárás abból áll, hogy olyan oldószert adagolunk, amely képes vízzel azeotróp elegyeket képezni, azeotróp desztillációval eltávolítjuk a vizet, majd egy - pl. az előbbiekben ismertetett kicsapószert adunk a maradékhoz és a képződött csapadékot szűréssel összegyűjtük.
Legalábbis bizonyos fermentációs körülmények között az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor az A 40926-ot termelő mikroorganizmus két fő antibiotikum terméke. Az A 40926 antibiotikum A és B faktor főként az A 40926 antibiotikum PA, illetőleg PB faktor átalakulási terméke és gyakran már jelen van a fermentlében.
Ténylegesen azt találtuk, hogy az A 40926 antibiotikum PA faktor átalakítható az A 40926 antibiotikum A faktorrá, az A 40926 antibiotikum PB faktor pedig A 40926 antibiotikum B faktorrá, bázisos kö-. rülmények alkalmazásával. Az A 40926 antibiotikum PA faktor és az A 40926 antibiotikum PB faktor pl. A 40926 antibiotikum A faktorrá, illetőleg B faktorrá alakítható át 0,5-107oos vizes ammóniával vagy más nukleofil bázissal - pl. egy szerves aminnai — szobahőmérsékleten, 8-24 órán át végzett kezeléssel.
Következésképp: ha egy fermentlevet, vagy egy A 40926 antibiotikumot vagy ennek koncentrátumát tartalmazó kivonatot bizonyos ideig bázisos körülmények között állni hagyunk (pl. egy nukleofil bázis vizes oldata hozzáadása után, pH 9 fölött, egy éjszakán át), olyan A 40926 antibiotikum komp-51
194 317 lexet kapunk, amely az A 40926 antibiotikum A és B faktorban feldúsult. Ha rövid az az idő, amelyen át a fermentlevet, kivonatot vagy koncentrátumát a bázisos környezetnek kitesszük, olyan A 40926 antibiotikum komplexet kapunk, amely az A 40926 antibiotikum PA és PB faktorban dúsult fel.
Ezért a kitüntetett eljárás az olyan A 40926 antibiotikum komplex előállítására, amely A és B faktorban feldúsult, abból áll, hogy az A 40926 antibiotikum komplex oldatát (amely főként A 40926 antibiotikum PA és PB faktort tartalmaz) szobahőmérsékleten 8-12 órán át állni hagyjuk egy vizes nukleofil bázisban - pl. vizes ammóniában -, majd az előbbiekben leírt módon izoláljuk a keresett antibiotikum komplexet.
Az A 40926 antibiotikumot tartalmazó oldatokra példák a fermentlevek, extraktumok és az affinitáskromatográfia során eluált frakciók.
Tiszta A 40926 antibiotikumot kaphatunk, ha a nyers komplexet az előbbiekben leírt módon, afflnitáskromatográfiával tisztítjuk.
Az így kapott termékre, amely a tiszta faktorokból leszármaztatható biológiai és fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkezik, a példákban mint A 40926 antibiotikum AB komplexre fogunk hivatkozni.
Egy kitüntetett eljárás egy A 40926 antibiotikum komplex készítmény PA és PB faktorban való dúsítására abból áll, hogy az affínitáskromatográfia során eluált frakciókat gyorsan semlegesítjük egy savval, előnyösen egy ásványi savval, pl. kénsavval vagy sósavval.
A tiszta A 40926 antibiotikum PA és PB faktor elkülönítését ebből a komplexből valamelyik, az előbbiekben ismertetett eljárás szerint végezhetjük.
Egy kitüntetett eljárás fordított fázisú folyadékkromatográfiát jelent, előnyösen saválló acél oszlopban, mérsékelt (5-50 bar) vagy magas (100-200 bar) nyomáson. A szilárd fázis lehet egy szilanizált szilikagél, szénhidrogén fázissal a 2.-18. szénatomon (előnyösen a C 18-on), vagy fenilcsoporttal, és az eluálószer egy előbbiekben meghatározott poláris, vízzel elegyedő oldószer és egy, a gyantával összeférhető ρΗ-jú) előnyösen pH 4—8) vizes puffer elegye.
Az eluciót a szokásos módon követjük, a homogén antibiotikum tartalmú frakciókat összeöntjük és az előbbiekben leírt módon kezeljük, a tiszta vegyületek elkülönítésére, amelyek az alábbi jellemzőkkel rendelkeznek.
Bonyolult HPLC elemzéssel kimutatható, hogy az A 40926 antibiotikum B faktor ténylegesen két, Βθ és Bt faktornak elnevezett komponens keveréke.
Az A 40926 antibiotikum Bo faktor - amely az A 40926 antibiotikum B faktornak kb. 90%-át alkot1a - azzal jellemezhető, hogy R+ értéke 1,22, a teiLoplanin A2 2. komponenséhez viszonyítva, a B. faktor fizikokémiai jellemzőivel kapcsolatban szereplő
D. pont szerinti, a következőkben leírt rendszerben: a B. faktor relatív R értéke pedig — ez az A 40926 antibiotikum B faktor kb. 10%-át képviseli — ugyanebben a rendszerben 1,27.
A tiszta A 40926 antibiotikum Βθ faktort az
A 40926 antibiotikum B faktor további tisztításával állítjuk elő, pl. oly módon, hogy megismételjük az elkülönítéshez alkalmazott fordított fázisú kromatográfiás eljárást.
Az A 40926 antibiotikum Βθ faktor fizikokémiai és biológiai jellemezői lényegében azonosak az
A 40926 antibiotikum Β faktoréival, azzal az eltéréssel, hogy az előbbiekben említett rendszerben végzett HPLC elemzés során csak egy csúcsot mutat (a teikoplanin A2 2. komponenshez viszonyított R. érték a leírt HPLC rendszerben 1,22).
Az A 40926 antibiotikum B faktor és az A 40926 antibiotikum Βθ faktor között fennálló, az előbbiekben részletezett hasonlóságok miatt a leírásban és az igénypontokban az A 40926 antibiotikum B faktor biológiai tulajdonságaira való utalásokat úgy kell érteni, hogy azok egyben az A 40926 antibiotikum Βθ faktorra is vonatkoznak - amely az A 40926 antibiotikum B faktor fő komponense (kb. 90%-át teszi ki) - és nagy mértékben hozzájárul annak biológiai tulajdonságaihoz.
Egy másik megoldás szerint a találmány szerinti antibiotikumok erős vagy gyenge anioncserélő gyanták - ideértve a funkcionalizált polisztirolt, aícrilvagy polidextrán mátrixokat — alkalmazásával különíthetők el a fermentléből vagy tisztíthatók tovább. A gyenge anioncserélők pl. a következő kereskedelmi neveken forgalomba hozott gyanták közül kerülnek^ ki: Dowex MWA-1 vagy WGR (Dow Chemical), Amberlite IRA-73 (Rohm és Haas), DEAE-Sephadex (Pharmacia). A találmány szerinti eljárásban használható erős anioncserélő gyanták pl. a következő kereskedelmi néven forgalomba hozott termékeket foglalják magukban: Dowex MSA-1, SBR, SBR-P (Dow Chemical), Amberlite IR-904 (Rohm és Haas (és OAE-Sephadex (Pharmacia).
A találmány szerinti antibiotikumoknak az eluálását ezekről a gyantákról elektrolitok — pl. nátriumvagy káliumklorid — vizes oldatainak lineáris gradiens elegyeivel végezzük, amelyeket vízzel vagy víz és egy szerves, vízzel elegyedő oldószer — pl. rövidszénláncú alkohol (pl. 1-4 szénatomos alkohol) vagy rövidszénláncú alkil-keton, pl. aceton — elegyeivel állítottunk elő.
Mint már említettük, a találmány szerinti antibiotikumok savas és bázisos funkciókkal rendelkeznek és a szokásos eljárások szerint sókat képeznek.
A találmány szerinti vegyületek jellegzetes, megfelelő savaddiciós sói a szerves és szervetlen savakkal a szokásos reakcióban képződő sókat foglalják magukban. A sóképzéshez pl. a következő savak alkalmazhatók: sósav, hidrogénbromid, kénsav, foszforsav, ecetsav, trifluorecetsav, triklórecetsav, borostyánkősav, citromsav, aszkorbinsav, tejsav, maleinsav, fumársav, palmitinsav, kólsav, pamoinsav, nyálkasav, glutaminsav, kámforsav, glutársav, glikolsav, ftálsav, borkősav, laurinsav, sztearinsav, szalicilsav,, metánszulfonsav, benzolszulfonsav, szorbinsav, pikrinsav, benzoesav, fahéjsav stb.
A sóképzéshez alkalmazható bázisok jellegzetes példái: alkálifém- vagy alkáliföldfém-hidroxiok (pl. nátrium-, kálium- és kalciumhirdoxid), ammónia, és szerves (alifás, alicíklusos vagy aromás (aminok, pl. metilamin, dimetilamin, trimetilamin és a pikolin._________ ________ _ __________
Á találmány szerinti szabad amino- vagy nem só formájú vegyületeknek a megfelelő addiciós sókká való átalakítása és a megfordított eljárás (azaz valamely, találmány szerinti vegyület addiciós sójának átalakítása a nem só formájú vagy szabad aminoalakká) a szakember számára kézenfekvő és a találmány kiterjed ezekre az eljárásokra.
Egy találmány szerinti vegyület pl. oly módon ala-62
194 317 kitható át a megfelelő sav- vagy bázis-addiciós sóvá, hogy a szabad alakot vizes oldószerben oldjuk és kis moláris feleslegben beadagoljuk a kiválasztott savat vagy bázist. A kapott oldatot vagy szuszpenziót ezután liofilizáljuk, a só kinyerésére.
Abbairaz esetben, ha a végtermék só nem oldható egy olyan oldószerben, amelyben a szabad forma oldható, úgy nyerjük ki, hogy a szabad forma szerves oldatához sztöchiometrikus mennyiségben hozzáadjuk a kiválasztott savat vagy bázist (vagy enyhe moláris felesleget veszünk), és a sót kiszűrjük.
A szabad forma oly módon állítható elő, hogy egy megfelelő sav- vagy bázis-addiciós sót vizes oldószerben oldunk és semlegesítünk, a szabad alak felszabadítására.
Ha a semlegesítés után sómentesítés válik szükségessé, egy szokásos sómentesítési eljárást alkalmazhatunk. Előnyösen alkalmazható pl. a szilanizált szilikagélen, nem funkcionalizált polisztritol, akrilsav és meghatározott pórusnagyságú polidextrán gyantán (ilyen pl. a Sephadex LH 20) vagy aktív szénen végzett oszlopkromatográfia. Miután a nem kívánt sókat egy vizes oldattal eluáltuk, a keresett terméket víz és egy poláris vagy apoiáris szerves oldószer elegyével (lineáris grádians vagy lépcsős gradians alkalmazása mellett) eluáljuk. Ilyen pl. az 50 : 50% acetonitril: víztől kb. 100% acetonitrilig terjedő rendszer.
Mint ez a szakember számára ismert, a sóképzés — akár gyógyászati szempontból elfogadható savakkal (bázisokkal), akár gyógyászati szempontból nem elfogadható savakkal (bázisokkal) felhasználható célszerű tisztítási technikaként is. Sóképzés és a só elkülönítése után egy A 40926 antibiotikum só alakja átalakítható a megfelelő szabad alakká vagy egy gyógyászati szempontból elfogadható sóvá.
Egyes esetekben egy találmány szerinti vegyület bázis addiciós sója oldhatóbb vízben és hidrofil oldószerekben.
Az A 40926 antibiotikum A faktor fizikokémiai jellemzői:
A) Az 1. ábrán bemutatott UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
a) 0.1NHCL
b) pH 7,38 foszfát puffét
c) 0,lN nátrium- vagy kálium·
281
300 (váll) hidroxid 300
d) metanol 282
e) pH 9,0 foszfát puffer 282
300 (váll)
B) A 2. ábrán bemutatott IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm’1 ):
3700-3100, 3100-2800 (nujol), 1655, 16201560, 1510, 1480-1410, (nujol), 1375 (nujol), 1320-1250, 1250-1190, 1100-950, 845 , 810,
720 (nujol).
C) A 3. ábrán bemutatott 1H NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-nél, DMSO-d6-ban (hexadeutoridímetilszulfoxid), belső standardként TMS-t (0,00 ppm), alkalmazva (delta » ppm), 0,86 (több t, 6H),
1,21 (kb. 11H), 1,43 (2H), 2,01 (2H), 2,31-2,34 (3H), 4-6,2 (kb. 16H), 6,2-8 (kb. 23H), 8,44,
70% pH 6,0-ra 30% beállítva 60% B eluálószer az A
9,22, 9,66 (széles sávok, mozgékony protonok).
2,5—4: inferferencia a H2O csúcsok hatására.
D) Retenciós idő (Rj 1,12 a teíkoplanín A2 2. komponenshez viszonyítva (Rt a 20,3 perc) fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve az elemzést:
oszlop: Ultrasphere ODS (5 gm), Altex (Beckman)
4,6 mm (i. d.) x 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 jum)
Az eluálószer:
CH3CN 10% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 90% beállítva B eluálószer:
CH3CN (2,5 g/l)NaH2PO4 ,H2O eluálás: lineáris grádiens, 5eluálószerben, 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
UV detektor: 256 nm belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppé Lepetit S. p. A.)
Ugyanilyen körülmények között a tesztoszteronhoz (Roussel Uclaf) viszonyított retenciós idő 0,60. 1
E) Az elem-analízis - miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában megszárítottuk (tömegveszteség 4,6%) - a következő közelítő (átlagos) százalékos összetételt mutatja: szén 55,82%, hidrogén 5,17%, nitrogén 6,31%, klór (összes) 4,24%, klór (ionos) 0,37%. Szervetlen maradék 9Ó0°C-on, levegőn: 1,2%.
F) Sav-bázis titrálási görbe 2-metoxi-etanol (MCS) : víz 4 : 1 arányú elegyében KOH-dal - HCl-felesleg hozzáadása után — végzett titrálás során. Ez 4 ionizálható funkció jelenlétére utal, amelyek pkj^cs értékei a következők: 4,6, 5,6, 7,2,
G) Rf érték 0,24 és Rf érték a teikoplanin A2 2. komponenséhez viszonyítva 0,70 a következő kromatográfiás rendszerekben:
5% (súly/térf.) vizes Na2SO4 70 acetonitril 30 szilanizált szilikagél (60 F2S4, Merck) lemezeket alkalmazva (rétegvastagság, 0,25 mm),
Előhívás:
- UV fény, Pauly reagenssel — azaz diazotált szulfanilsavval (J. Chromatog. 20, 171, 1965, Z. Physiol. Chem. 292, 99, 1953) - sárga szín,
- bioautográfia Bac. subtDis ATCC 6633 felhasználásával, minimális Davis táptalajon,
H) Molekulatömeg kb. 1716 a FAB-MS spektrumbój levezetve, amely 1717-nél mutatja az M * H csúcsot.
Az A 40926 antibiotikum B faktor fizikokémiai jellemzői
A) A 4. ábrán bemutatott UV abszorpciós spektrum a következő maximumokat mutatja:
lambda (nm)
a) 0,lN HC1 %2
b) pH 7,38 foszfát puffer
c) 0,lN nátrium- vagy káliumhidroxid
d) pH 9,0 foszfát-puffer
e) metanol
281
300 (váll.)
300
283
300 (váll.) 282
194 317
B) Az 5. ábrán bemutatott IR adszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm'1):
3700-3080, 3080-2700 (nujol), 1720-1625, 1625-1560, 15005, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1295, 1230, 1210, 1150, 1100-1040, 1030, 1015, 970, 890, 840, 810, 720 (nujol).
C) A 6. ábrán bemutatott 1H NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm) 270 MHznél, az 1H NMR spektrumot DMSO-d6-ban (hexadeuterodime tilszulfoxid) vettük fel, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t használva, delta (ppm), 0,85, (d, izopropil-metilek), 1,15 ) (b. 13H), 1,44 (kb. 2H), 2,02 (2H), 2,32-2,35 (3H), 4-6,1 (kb. 16H), 6,1-8 (kb. 23H), 8,52, 9,30, 9,68 (széles sávok, mozgékony protonok),
2,5-4 : interferencia a H2O csúcsok miatt).
D) Retenciós idő (Rt): 1,22 és 1,27 - a teikoplanin A2 2. komponenséhez képest (R^ = 20,3 perc) — fordított fázisú HPLC módszerrel a következő körülmények között végzett elemzés során: oszlop: Ultrasphere ODS (5 gm) Altex (Beckman)
4,6 mm (belső átmérő) + 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 gm),
Az eluálószer:
CH3CN 10% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 90% beállítva
B-eluálószer:
CH3CN 70% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 30% beállítva eluálás: lineárisan gradiens 5%-60% között (B eluálószer az A elzálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
UV detektor: 254 mm belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppé Lepetit S. p. A.)
E) Az elem-analízis - a minta előzetes, kb. 140°C-on közömbös atmoszférában közelítő (átlagos) százalékos összetételt mutatja: szén 54,09, hidrogén 5,13, nitrofén 6,34, klór) összes (4,12, Mór (ionos) 0,39%.
Szervetlen maradék 900°C-on levegőn végzett szárítás során: 5%.
F) Sav-bázis titrálás titrálási görbe 2-metoxi-etanol (MCS): víz 4 : 1 arányú elegyében: a HC1 felesleg hozzáadása után (pH 2,7) KOH-dal végzett titrálás 4 izonizálható funkció jelenlétére mutat, amelyek pk^jcg értékei a következők: 4,5, 5,6, 7,2,
9,2.
G) Az Rf érték 0,21 és a teikoplanin A2 2. komponenshez viszonyított Rr érték 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben:
5%-os (tömeg/térf.) vizes Na2 SO4 70, acetonitril 30, szilanizált szilikagél ) 60 F2J4 Merc - lemezek (rétegvastagság 0,25 mm).
Kimutatás:
-UV fény,
- Pauly reagenssel - diazotált szulfanilsav (J. Chromatog. 20, 171, 1965 és Z.' Physiol. Chem. 292, 99,1953) — sárga szín,
- bioautográfla Bac. subtilis ATCC 6633 felhasználásává, Davis-f. minimális táptalajon.
H) Molekulatömeg kb. 1730 a FAB-MS spektrum alapján, amely a M ♦ ET csúcsot 1731-nél mutatja.
Az A 40926 antibiotikum Bn faktor fizikokémiai jellemzői
A) A 4. ábrán bemutatott UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
a) 0.1N HC1
b) pH 7,38 foszfát puffer 901 300 (váll.)
c) 0,lN nátrium- vagy kálium-
hidroxid 300
d) pH 9,0 foszfát puffer 283
e) metanol 282
B) Az 5. ábrán bemutatott IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm’):
3700-3080, 3080-2700 (nujol), 1720-1625, 1625-1560, 1505, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1295, 1230, 1210, 1150, 1100-1040, 1030, 1015, 970, 890, 840, 810, 720 (nujol).
C) A 6. ábrán szemléltetett 1 H-NMR spektrum a következő jel-csoportokat (ppm) mutatja a 270 MHz tartományban (az ’H NMR spektrumot DMSO-d6-ban (dimetilszulfoxid, hexadeutere) vettük fel, belső standardként TMS-t — 0,00 ppm — használva): delta, ppm: 0,85 (d, izopropil-metilek) 1,15 (kb. 13H), 1,44 (kb. 2H), 2,02 (2H), 232-2,35 (3H), 4-6,1 (kb. 16H), 6,1 - 8 (kb. 23H), 8,52, 9,30, 9,68 (széles sávok, mozgékony protonok), 2,5-4 : interferencia a H2O csúcsok miatt.
D) Retenciós idő (Rt) 1,22 a teikoplanin A2 2. komponenshez viszonyítva (Rt = 20,3 perc) fordított fázisú HPLC technikával a Következő körülmények között végzett elemzés során:
oszlop: Ultrasphere ODS (5 gm) Altex (Beckman)
4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP (5 gm)
Az eluálószer:
CH3CN 10%pH6-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2) 90% beállítva,
B eluálószer:
CH3CN 70% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2) ( 30% beállítva eluálás: lineáris grádiens, 5%—60% között (B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplanin A2 2, komponens (Gruppé Lepetit S. p. A.)
E) Az elem-analízis - miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (tömegveszteség 9,6%) - a következő közelítő (átlagos) százalékos összetételt mutatja:
szén 54,09%, hidrogén 5,13%, nitrogén 6,34%, klór (összes) 4,12%, klór (ionos) 0,39%.
Szervetlen maradék 900°C-on levegőn végzett izzitásután:5%.____
F) Á sav-bázis titrálási görbe 4 : 1 arányú 2-metoxi-etanol (MCS) - viz elegyben - HC1 felesleg hozzá* adása után KOH-dal végzett titrálással - 4 ionizálható funkció jelenlétére mutat, amelyek pkMpc értékei a következők: 4,5, 5,6,7,2, 9,2.
G) Az Rf érték 0,21 és a teikoplanin Á2 2. komponenshez viszonyított R^ érték 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben:
5%-os (tömeg/térf.) Na2SO4 70, acetonitril 30, szilanizált szilikagél - 60 F2J4 Merc — lemezeket használva (rétegvastagság 0,25 mm),
Kimutatás:
— UV fény,
- Pauly reagenssel — diazotált szulfanilsav (J. Chromatog. 20, 171,1965 és Z. Physiol. Chem. 292,99,1953) - sárga szín, — bioautográfia Bac. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis - f. minimális táptalajon.
H) A molekulatömeg kb. 1730 az FAB-MS spektrum alapján, amely szerint az M ♦ H csúcs 1731-nél helyezkedik el.
Az A 40926 antibiotikum PA faktor fiziokémioi jellemzői:
A) A 7. ábrán szemléltetett UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
lambdamax (nm)
a) 0.1N HC1 282
b) O,1N KOH 300
c) pH 7,38 foszfát puffer 282
300 (váll.)
d) pH 9,0 foszfát puffer 283
B) A 8. ábrán szemléltetett IR ab 300 (váll.)
B) A 8. ábrán szemléltetett IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm'*):
3700-3100, 3000-2800 (nujol), 1760-1710, 1655, 1620—1550, 1505, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1260, 1250-950, 845/805, 720 (nujol).
C) A 9. ábrán szemléltetett 1 H-NMR spektrum a következő jel-csoportokat (ppm-ben) mutatja 270 MHz-nél 1H-NMR módszerrel felvéve, DMSO-drban (hexadeutero-dimetilszulfoxid), belső standardként TMS-t (0,00 ppm) alkalmazva:
delta, ppm: 0,86 (CH3-dublettek), 1,15-1,22 (m, (CH2) ), 1,41 (m, (CH2)), 2,01 (s, CH3), 2,01 (m, ?CH2)), 2,28 (s, N-CH3), 4,26-5,96 (széles, peptid és aromás metilek), 6,33-7,73 (széles, aromás CH csoportok és peptid NH csoportok).
D) Retenciós idő (RJ 1,15 a teikoplanin A2 2. komponenshez viszonyítva (R* = 20,3 perc) fordított fázisú HPLC módszerrel a Következő körülmények között végzett elemzés során:
oszlop: Ultrasphere ODS (5 gm) Altex (Beckman),
4,6 ram (belső átmérő) x 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 gm),
A eluálószer:
CH3CN 10% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 90% beállítva,
B eluálószer:
CH3CN 70% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2P04 . H2O 30% beállítva e' lálás: lineáris grádiens 5%—60% között (B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplain A2 2. komponens (Gruppé Lepetit S. p. A.)
E) A teikoplanin A2 2. komponenshez viszonyítva az Rf érték 0,62 a következő kromatográfiás rendszerben:
5%-os (tömeg/térf.) vizes Na2SO4 70, acetonitril 30, szilanizált szilikagél — 60 F2«4 Merc — lemezeket alkalmazva (rétegvastagság 0,25 mm),
Kimutatás:
- UV fény,
- Pauly reagenssel - diazotált szulfanilsav (J, Chromatog. 20,171,1965 és Z. Physiol.
Chem. 292,99,1953) - sárga szín, — bioautográfia Bac. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimális táptalajon.
F) Molekulatömeg kb. 1758 az FAB-MS spektrum alapján, amelyen számos csúcs látható, a legintenzívebb 1761-bél. A FAB-MS elemzés műveleti körülményei a következők:
berendezés: VG Mód ZAB SE, FAB ágyúval — Ion Tech - ellátva körülmények: pozitív FAB, Xe gyorsító feszültség 8 kV mátrix : tioglicerin-glicerin 1 : 1 térf./térf.).
Az A 40926 antibiotikum PB faktor fizikokémiai jellemzői:
A) A 10. ábrán szemléltetett UV abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
lambdamax (nm)
a) 0,lNHCl 282
b) 0,lN káliumhidroxid 300
c) pH 7,38 foszfát puffer 282
d) pH 9,0 foszfát puffer 282
300 (váll.)
B) A 11. ábrán szemléltetett IR abszorpciós spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm1):
3700-3100, 3000-2800 (nujol), 1760-1710, 1655, 1620-1560, 1605, 1480-1420 (nujol), 1375 (nujol), 1320-1270, 1230-1190, 1150, 1120-920, 845, 810, 720 (nujol).
C.l) A 12. ábrán szemléltetett 1 H-NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) a 270 MHz tartományban DMSO-d6-ban (hexadeutero-dimetilszulfoxid-, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t használva: delta, ppm-ben: 0,84 (d, izopropil-metilek), 1,17 (m, (CH2) ), 1,43 ím, (CH2), 1,99 (s, CH3), 2,01 (m, (Cfl/fí, 2,31 (s, N-CH3), 2,79 (dd, C-H), 3,70 (m, C-H), 4,06 - 6,02 (széles, peptid és aromás CH-csoportok), 6,45-7,74 (széles, aromás CH-csoportok és peptid NH-csoportok) 8,19-9,99 (széles, peptid NH-csoportok és fenolos OH-csoportok).
C.2) A 13. ábrán szemléltetett 1 H-NMR spektrum a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-nél (DMSCfd6 * CF3COOD>ben belső standardként (0,00 ppm) TMS-t használva: delta, ppm-ben:
0,84 (d, izopropil-metilek), 1,13 (m, (CH2) ), 1,40 (m, (CH2)), 1,98 (s, CH3), 2,00 (m, (CH?), 2,92 (dd, C-H), 3,29 - 3,71 (m, cukor C-H-csoportok), 4,07-6,09 (s és m, peptid és aromás CH-csoportok (6,45 - 7,83 (s és m, aromás CH-csoportok és peptid NH-csoportok) 8,17-10,38 peptid NH-csoportok, fenolos OH-csoportok).
D)A retenciós idő (R0 1,27 és 1,32 a teikoplanin A2 2. komponenshez (R. = 20,3 perc) viszonyítva, a fordított fázisú HPLC technikával a következő körülmények között végzett elemzés során: oszlop: Ultrasphere ODS (5 gm) Altex (Beckman)
4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 gm),
Az eluálószer:
CH3CN 10% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 90% beállítva
B eluálószer;
CH3CN 70% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 30% beállítva, eluálás: lineáris grádiens 5% — 60% között (B eluálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppé Lepetit S. p. A.).
E) Az R érték a teikoplanin A2 2. komponenshez viszonyítva 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben :
5%-os (tömeg/térf.) vizes Na2SO4 70, acetonitril 30, szilanizált szilikagél (60 F254 Merck) lemezek alkalmazásával (rétegvastagság 0,25 mm),
Kimutatás:
- UV fény,
- Pauly reagenssel - diazotált szulfanílsav (J. Chromatog. 20, 171, 1965 és Z. Physiol. Chem. 292, 99, 1953) — sárga szín, — bioautográfia Bac. subtilis ATCC 6633 alkalmazásával, minimális Davis-f. táptalajon.
F) A molekulatömeg kb. 1772 az FAB-MS spektrum alapján, amelyen számos csúcs látható, a legintenzívebb csúcs 1776-nál. Az FAB-MS elemzés műveleti körülményei a következők:
berendezés: VG Mód. ZAB, FAB ágyúval (Ion Tech.) ellátva körülmények: pozitív FAB, Xe gyorsító feszültség 8 KV mátrix: tioglicerln-glicerin 1 :1 (térf./térf.).
A találmány szerinti vegyületek antibakteriális aktivitása in vitro a standard hígítási próbák segítségével mutatható ki, különböző mikroorganizmusok alkalmazásával.
Az MIC (minimális gátló koncentráció (meghatározásához alkalmazott táptalajok és tenyésztési körülmények a következők: Isosensitest húsleves (Oxoid) — 24 óra a Staphylococcus törzsek, a Strept. faecalis és a Gram-negatív baktériumok (E. coli, Pseudomonas, Proteus) esetében: Todd-Hewitt húsleves (Difco) — 24 óra más Streptococcus törzsek esetében: GC alap-húsleves (Difco) - 1% Isovitalex (BBL) - 48 óra, CO2-ben dúsított atmoszféra a Neisseria gonorrhoeae esetében, GB alap-agar (Difco) ♦ 1% Isovitalex + 0,001% hemin - 24 óra a Haemophilus influenzáé esetében, AC húsleves (Difco) - 24 óra, anaerób atmoszféra a Clostridiüm perfringens esetében, Wilkins-Chalgren agar (1.: T.
D. Wilkins és S. Chalgren, Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926, 1976) - 48 óra, anaerób atmoszféra a többi anaerób esetében (Clostr. difficile, Propionbacterium acnes, Bacteroides fragilis), PPLO húsleves (Difco) - 10% lószérum + 1% glukóz - 48 óra a Mycoplasma gallisepticum esetében, élesztő nitrogén alapleves (Difco) - 24 óra a Candida albicans esetében._A Candida albicans kivételével (30°C) az ínkú hálást 37°C-on végezzük. Áz inokulumok a következők: 1% (térf./térf.) a 48 órás leves-tenyészetből a M. gallisepticum esetében: kb. 10**-10* telepképző egység (ml a többi, leves-higításos MIC meghatározás esetében, kb. 10*—105 baktérium/folt (többhelyes inokulátonal beoltva) az agar-higítáaos MIC meghatározás esetében (H. influenzáé, C. difficile, P. acnes, B. fragilis).
IV. Táblázat
A 40926 antibiotikum
Törzs A B faki PA :or, MíC(g( PB íM) —
1. 0,13 0,13 0,5 1
2. 0,13 0,13 0,5 1
3. 0,25 0,13 2 2
4. 4 4
5. 0,06 0,06
6. 0,063 0,063 0,06 0,03
7. 0,063 0,063 0,06 0,03
8. 0,13 0,13 0,06 0,13
9. 0,016 0,016 0,008 0,008
10. 0,25 0,13 0,25 0,13
11. 0,03 0,016 0,03 0,03
12. 1 0,5 4. . 2
13. 64 64 64 64
14. 128 f. 128 f. 128 f. 128 f.
15. 128 f. 128 f. 128 f. 128 f.
16. 128 f. 128 f. 128f. 128 f.
17. 64 64 64 64
18. 128 f. 128 f.
19. 64 64 128 64
Jelmagyarázat:
1. : Staph. aureus ATCC 6538
2. : Staph. aureus Tour (LI65) 10* tke/ml
3. : Staph. aureus Tour (LI65) 106 tke/ml
4. : Staph. epidermidis ATCC 12228
5. : Strept. mitis L 796 (klinikai izolátum)
6. : Strept. pyogenes C203
7. : Strept. pneumoniae US41
8. : Strept. faecalis ATCC 7080
9. : Clostr. perfringens ISS 30543
10. : Clostr. difficile ATCC 9689
11. : Propion. acne ATCC 6919
12. : Neisseria gonorrhoeae L 997 (klinikai izolátum)
13. : Haemophilus influenzáé ATCC 19418
14. : Proteus vulgáris X19H ATCC 881
15. : Escherichia coli SKF 12140
16. : Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
17. : Bacteroides fragilis ATCC 23745
18. : Candida albicans SKF 2270
19. : Mycoplasma gallisepticum Weybridge tke/ml = telepképző egység/ml f.=felett
-101
194 317
V. Táblázat
N. gonorrhoeae törzsekre kifejtett baktericid hatás^
N. gonorrhoeae A 40926 anti- Spectinomycin törzs_ biotikum törzs____
MIC/ MBC MIC MBC (48 h) (24 h) (48 h) (24 h) pg/ml pg/ml
LlOOf 1 1 16 32
L 1004 1 0,5 16 32
L 1007 2 2 16 16
(CTC 6820) L1596^ 2 2 128f 128f
L1601~ l 1 16 16
L 1605^ 2 2 32 32
MIC = minimális gátló koncentráció
MBC = minimális baktericid koncentráció az a legalacsonyabb koncentráció, amely mellett a kiindulási inokulum 99,9%-a a jelzett időn belül elpusztul).
♦ = klinikai izolátum ++ = klinikai izolátum, spectinomycin-rezisztens «+ = klinikai izolátum, penicillin-rezisztens f. »felett
A találmány szerinti vegyületek antibiotikus aktivitását in vivő kísérletekkel is igazoltuk, amelyeket lényegében a Pallanza és munkatársai (J. Antimicrob. Chemother. 11, 419, 1983) által leírt módon végeztünk. A kísérleti fertőzést úgy idéztük elő egerekben, hogy intraperitoneálisan S. pyogenes C 203 szuszpenziót viszünk be. Az inokulumot úgy választjuk meg, hogy a nem-kezeit állatok 48 órán belül pusztuljanak el vérmérgezésben. Az állatokat kb. 30 perccel a fertőzést követően kezeltük szubkután a vizsgálandó vegyülettel.
Az EDj0 értéket a 10. napon számítottuk ki, Spearman és Karther módszerével (D. J. Finney, Statistical Methods in Biologlcal Assay, Griffin, p. 254, 1952) minden egyes dózisra, a százalékos túlélés alapján. Az előbbi körülmények között az EDjo érték az A 40926 antibiotikum A faktor esetében 0,47 mg/kg, az A 40926 antibiotikum B faktor esetében 0,33 mg/kg, az A 40926 antibiotikum PA faktor esetében 0,54 mg/kg és az A 40926 antibiotikum PB faktor esetében 0,31 mg/kg.
A közelítő akut toxicitást egérben (i. p.) a szakember számára ismert módszerekkel értékeljük. Azt találtuk, hogy az A 40926 antibiotikum közelítő LDjo értéke 100 mg/kg-nál nagyobb egérben, szubkután bevitel esetén.
Az A 40926 antibiotikum komplex és A, B, Βθ, PA és PB faktorai aktívak olyan Gram-pozitív baxtériumokkal szemben, amelyek számos, széles körben elterjedt fertőzés kórokozói. Mivel ezek a patogének növekvő mértékben válnak ellenállóvá a szokásos terápiás kezeléssel szemben, még mindig jelentős igény áll fenn új antibiotikumok iránt.
Mint már említettük, a találmány szerinti antibiotikumok jelentős aktivitást mutatnak Neisserla törzsekkel — pl. Neisserla gonorrhoeae-vel — szemben, míg Gram-negatív baktériumokkal szemben gyakorlatilag inaktívak.
Ismeretes, hogy az utóbbi 15-20 évben állandóan emelkedett a gonorrhoea gyakorisága.
A fertőzés ellenőrzése jelenleg nehézségekkel jár, mivel magas az újrafertőzés aránya. Ez összefügg a fertőzött egyének viselkedésével is, akik nem fordítanak kellő gondot arra, hogy a fertőzés fennállásának teljes időtartama alatt elkerüljék a betegség átadását. Másrészt növekvő mértékű a kórokozó organizmus ellenállása az általánosan alkalmazott antibiotikumokkal szemben, úgyhogy új antibiotikum kombinációk és hosszabb kezelés bevezetése válik szükségessé. Ezért egyre nagyobb szükség van új antibiotikumokra, amelyek hatásosak lehetnek a gonococcusos fertőzésekkel, és különösen a Neisseria gonorThoeae-fertőzésekkel szemben, és a kezelés korlátozott számú bevitelből állhat vagy éppen egyszeri dózis bevitelével végezhető.
Az anti bakteriális kezelés céljából az A 40926 antibiotikum komplex, valamelyik faktora (A, B, B0, PA vagy PB), ezek nem toxikus, gyógyászati szempontból elfogadható sói vagy ezek keverékei különböző úton - pl. helyileg vagy parenterálisan vihetők be. Általában a parenterális bevitel a kitüntetett adagolási mód.
Az injekciós készítmények szuszpenziók, oldatok vagy emulziók alakjában készíthetők ki olajos vagy vizes hordozókkal, és hatásfokozó anyagokat (így szuszpendáló, stabilizáló és/vagy diszpergáló anyagokat) tartalmazhatnak.
Egy másik megoldás szerint az aktív komponens poralakú lehet és az injekciós készítmény a beadagolás alkalmával alakítható ki, megfelelő hordozónak
- pl. steril víznek - a porhoz való hozzáadásával.
A beviteli módtól függően ezek a vegyületek különböző adagolási alakokban készíthetők ki.
Egyes esetekben a találmány szerinti vegyületek orális bevitel céljából bélben oldódó adagolási alakban készíthetők ki, a szakember számára ismert módon 0. pl.: Remington s Pharmaceutical Sciences,
15. ED., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, p. 1614).
Különösen abban az esetben lehet erről szó, ha konkrétan arra van szükség, hogy az antimikrobális anyag a bél-szakaszban szívódjék fel, és változás nélkül haladjon át a gyomor-szakaszon.
A beviendő aktív komponens mennyisége különböző tényezőktől függ, amilyen a kezelendő beteg méretei és állapota, a bevitel módja és gyakorisága és a szóbanforgó kórokozó.
A találmány szerinti antibiotikumok - nevezetesen az A 40926 antibiotikum komplex: A, B, Βθ, PA és PB faktorai és ezek gyógyászati szempontból elfogadható sói — általában hatékonyak kb. 0,5 — 50 mg aktív komponens/kg testsúly napi dózisban, amelyet a nap folyamán 1-4 alkalommal, elosztva viszünk be.
Különösen előnyösek azok a készítmények, amelyeket egység-adagolási alakban készítünk ki. Ezek kb. 100-kb. 5000 mg/egység mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak.
A gonorrhoea egyszeri dózissal való kezelés esetében azonban magasabb minimális dózisokat kell alkalmaznunk az A 40926 antibiotikum komplexből vagy az A, B, Bq, PA vagy PB faktorból (ennek értéke általában 0,5—50 mg/kg) annak érdekében, hogy a gyógyszer hatásos vérszintjét tarthassuk fenn, hosszabb Időn át. A gonorrhoea kezelésében ezenkívül előnyösen alkalmazható egy nyújtott hall
-111 tású parenterális adagolási forma. A nyújtott hatástartamú készítményeket különböző mechanizmusok és módszerek alapján állíthatjuk elő, mint ez a szakember számára ismert.
Az A 40926 antibiotikum komplexet, ennek A, B, Bn, PA vagy PB faktorát tartalmazó nyújtott hatású készítmény az antibiotikumot vízben oldhatatlan alakban tartalmazza, vizes vagy olajos közegben.
Ezek az alakok (azaz az oldhatatlan só vagy a szabad sav) ténylegesen nagyon lassan szabadulnak fel intramuszkuláris bevitel során, alacsony vízoldhatóságuk miatt. így tartós vérszintek érhetők el az antibiotikumokból.
Gyógyszerkészítmények előállítása:
Intnimuszkuldris injekció alakjában bevihető egység-adagolási készítményt áüítunk elő oly módon, hogy 1000 mg A 40926 antibiotikum A faktort 5 ml 8%-os propilénglikolos steril oldatban (USP) szuszpendálunk.
Intramuszkuláris injekció alakjában bevihető egység-adagolási készítményt állítunk elő oly módon, hogy 500 mg A 40926 antibiotikum B faktort 5 ml steril, 8%-os propilénglikolos oldatban (USP) szuszpendálunk.
Intramuszkuláris injekció alakjában bevihető egység-adagolási készítményt állítunk elő oly módon, hogy 2000 mg A 40926 antibiotikum B faktor nátriumsót 5 ml steril injekciós vízben szuszpendálunk.
A találmány szerinti antibiotikumok ezenkívül hasznosak a Clostridium difficile növekedésének elnyomásában, amely a bélben pszeudomembrán kolitiszt okoz. Az antibiotikum oly módon használható fel a pszeudomembrán kolitisz kezelésében, hogy az antibiotikumból vagy egy gyógyászati szempontból elfogadható sójából orális bevitelre gyógyászati szempontból elfogadható, hatásos dózist tartalmazó adagolási formát állítunk elő. Ilyen felhasználás céljából az antibiotikum zselatin kapszulákban vagy folyékony szuszpenzióban vihető be.
Gyógyszerként való alkalmasságukon kívül a találmány szerinti vegyületek állati növekedést gyorsító anyagokként is felhasználhatók.
Erre a célra egy vagy több, találmány szerinti ve'· gyületet egy megfelelő takarmányban orálisan viszünk be. A pontos koncentrációt annak figyelembe vételével határozzuk meg, hogy annak az aktív anyagot a növekedést gyorsító tényleges mennyiségben kell biztosítania, normális mennyiségű takarmány elfogyasztása esetén.
A találmány szerinti aktív vegyületeknek az állati takarmányhoz való hozzáadását előnyösen úgy végezzük, hogy megfelelő takarmány premixet készítünk, amely az aktív vegyületeket hatásos mennyiségben tartalmazza és a premixet bevisszük a teljes takarmányba.
Egy másik megoldás szerint egy közti koncentrátumot vagy takarmány adalékot — amely az aktív komponenst tartalmazza - keverhetünk a takarmányba.
Az ilyen takarmány premixek és teljes takarmányok előállítási és adagolási módjával kapcsolatban kézikönyvekre utalunk (1. pl.: Applied Animál Nutritíon, W. H. Freedman Co., San Fracisco, USA, 1969 vagy Livestock Feeds and Feeding, O and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977)
A következő példák részletesebben megvilágítják a találmányt. A termékek fizikai-kémiai állandói megegyeznek a fentiekben megadottakkal.
1. példa
Fermentáció az Actinomadura sp, ATCC 39727 törzzsel
Az A 40926 antibiotikumot termelő törzs ÍActinomadura sp. ATCC 39727) zabliszt agaron (ferde agar, kémcsőben (2-3 héten át 28°C-on tenyésztett kultúráját használjuk fel egy 500 ml-es Erlenmeyer lombik beoltására, amely 100 ml következő összetételű táptalajt tartalmaz:
0,5% húskivonat
0,5% éleszt ő-autolizátum
0,5% pepton
0,3% kazein-hidrolizátum
2% glükóz
0,15% NaCl (pH sterilezés előtt 7,5).
A lombikot 28°C-on forgó rázógépen (200 ford./ perc) kb. 72 órán át inkubáljuk, majd a tenyészetet fermentorba visszük át, amely az előbbi táptalajból 4 litert tartalmaz. Ezt a kultúrát 28°C-on kb. 72 órán át tenyésztjük kb. 2 liter/perc levegő-bevezetéssel és kb. 900 ford./perc kevertetési sebességgel. Ezután a tenyészetetet ugyanilyen táptalaj beoltására használjuk fel, 200 literes fermentorban. A fermentort 100 liter/perc steril levegő bevezetésével levegőztetjük és 250 ford./perc sebességgel kevertetjük, kb. 28 C-on. Az antibiotikum-termelést a papírkorongos agardiffúziós módszerrel követjük, teszt-organizmusként Bac. subtilíst használva, minimális táptalajon. A maximális aktivitást 72-96 óra után érjük el.
2. példa
Az A 40926 antibiotikum kinyerése A) A fermentlevet 4°C-ra hűtjük le, pH-ját 9,5-re állítjuk be és kevertetjük. Kb. 1 óra elteltével szűrjük és a szürlet pH-ját vizes ásványi savval kb. 3,5-re állítjuk be. Az elegyet 4°C-on 30 percen át ke ver tértjük, majd szűrési segédanyaggal (Hyflo-Flo-Ma^j szűrjük. A tiszta szürletet elvetjük és a szűrőlepényt ionmentesített vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzió pH-ját kb. 8,5-re állítjuk be, kevertetjük, majd szűrjük. A kinyert szűrőlepényt ugyanennek az eljárásnak, vetjük alá. Az egyesített szürletek az A 40926 antibiotikumot tartalmazzák.
Β) Az 1. példa szerint kapott fermentléhez (szűrés és a tiszta szürlet pH-jának kb. 8,5-re való beállítása után), vagy a 2.A) példa szerint kapott egyesített szürlethez 2 liter duzzasztott módosított mátrixot (D-ala-D-ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose) adunk. Egy éjjelen át szobahőmérsékleten való kevertetés után a gyantát szűréssel kinyerjük és egymás után kb. 2x10 liter pH 7,5 0,45 mM HCl-trisz-pufferrel) trisz = 2-amino-2-hidroximetil-l,3-propándiol (amely 5%/tömeg/térf.) NaCl-t tartalmaz, majd 4x20 liter desztillált vízzel mossuk.
Az A 40926 antibiotikumot 2x20 liter 1%-os (tömeg/térf.) ammóniumhidroxiddal eluáljuk a gyantáról. Az eluátumokat egy éjjelen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd kis térfogatra (kb. 2,45 liter) töményítjük be. A vizet n-butanoüal végzett azeotróp desztillációval távolítjuk el. A maradékhoz petrolétert adunk és így 2,4 g nyers A 40926 antibiotikumot csapunk ki.
-121
194 317
3. példa
Az A 40926 antibiotikum komplex AB faktor tisztítása
750 mg nyers A 40926 antibiotikum komplexet, amelyet lényegében a 2. példa szerinti eljárást követve kaptunk, és amelynek HPLC titere 70%, 400 ml PH 7,5-re beállított vízben oldunk és az oldatot szüljük. A szürletet ezután affinitáskromatográfiának vetjük alá D-ala-D-ala-epszilon-aminokaproil-Sepharose oszlopon (50 ml duzzasztott gyanta, ágy-magasság 5 cm). Az oszlopot, amelyet HCl-val pH-7,5-re beállított 0,16%-os beállított 0,16%-os (tömeg/térf.), 2 M NaCl-t tartalmazó ammóniával egyensúlyozunk ki, egymást követően a következő három pufferoldattal fejlesztjük ki:
Apuffer: HCl-val pH 7,5-re beállított, 2M NaCl-t tartalmazó 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia (2,6 oszlop-töltet térfogat):
B puffét: HCl-val pH 9,5-re beállított, 2M NaCl-t tartalmazó 0,16%-os (tömeg/térf) ammónia (16 oszlop-töltet térfogat),
C puffer: pH 11,4%-os (tömeg/térf.) vizes ammónia (2,6 oszlop-töltet térfogat).
A C puffer az A 40926 antibiotikum AB faktort egy frakcióban oldja le. Ennek az eluált frakciónak a pH-ját 7,0-ra állítjuk be és felvisszük ugyanerre az affinitás-oszlopra, amelyet 10 mM pH 7,0 trisz-HCl pufferrel kezeltünk, az oszlopot a teljes sómentesítésig desztillált vízzel mossuk. Az antibiotikumot ezután 2 oszlop-töltet térfogatnyi pH 11,0-es, 3%-os (tömeg/térf.) vizes ammóniával eluáljuk.
Az eluált frakciókat kis térfogatú vizes keverékké töményítjük be, majd fagyasztva szárítjuk. 374 mg tiszta A 40926 antibiotikum AB frakciót kapunk.
4. példa
Az A 40926 antibiotikum A és B faktor szétválasztása
3,3 g, a 2. példa szerint előállított A 40926 antibiotikum AB faktort 0,5 liter vízben szuszpendálunk, a szuszpenziót kevertetjük, majd szüljük. A tiszta szürletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (200 g, töltet-magasság 18 cm, szilanizált szilikagél részecskeméret 0,20—0,07 mm szita lyukbőségnek megfelelő, Merck Inc.), amelyet előzetesen A oldattal hoztunk egyensúlyba (0,001M vizes EDTA-nátriumsó oldat, NaOH-dal pH 6,0-ra állítva, amely 0,25% (tömeg/térf.) NaH2PO4-H2O-t és 2,5%-os (tömeg/térf.) NaCl-t tartalmaz. Az oszlopot 0%40% (térf./térf.) lineáris acetonitrű gradiens mellett (A oldatban) eluáljuk: összesen kb. 7 liter térfogattal, kb. 48 óra alatt. Kb. 15,5 ml-es frakciókat szedünk, amelyeket Bac. subtilis-szel végzett biológiai vizsgálatnak vetünk alá és HPLC-vel határozunk meg. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat összeöntjük. A 310—350. és a 348-365. sz. frakció tartalmazza az A 40926 antibiotikum A faktornak, illetőleg A 40926 antibiotikum B faktornak nevezett anyagokat.
Az A 40926 antibiotikum A faktort, illetőleg az A 40926 antibiotikum B faktort tartalmazó összeöntött frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük, az acetonitrű eltávolítására, vízzel hígítjuk (kb. a kiindulási oldat-térfogat kétszeresére) és az előbbiekben leírt típusú szilanizált szilikagél oszlopra visszük fel (a duzzasztott mátrix térfogata: 50 ml, töltet magasság 15 cm). Az oszlopot a teljes sómentesítésig ionmentesített vízzel mossuk és végül 60 :40 acetonltifl : víz eleggyel fejlesztjük ki.
Az eluált frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük és a maradékot fagyasztva szárítjuk. Az eluált frakciók első csoportjából (az előbbi 310330. frakció) 134 mg A 40926 antibiotikum A faktort, míg az eluált frakciók második csoportjából (az előbbi 348-365. frakció) 206 mg A 40926 antibiotikum B faktort kapunk.
5. példa
Az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor elkülönítése
Lényegében először a 2.A) példa szerinti eljárást, majd a 2.B) példa első lépését követve a gyantához kötött antibiotikumot 2x20 liter 1%-os (tömeg/térf.) ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumok pH-ját kénsawal 7,8-re állítjuk be és vákuumban n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be. A kapott , vizes koncentrátumokat papíron szüljük. A kapott szürlet az A 40926 antibiotikum PA faktort, az A 40926 antibiotikum PB faktort és kisebb mennyiségben az A 40926 antibiotikum A faktort és B faktort tartalmazza (HPLC). Ebből a vizes koncentrá tűmből egy 10 ml térfogatú mintát - amely kb. 50 mg/ml tiszta A 40926 antibiotikum komplexet tartalmaz (HPLC) — 5 mikron pórusnagyságú szűrőn szűrünk (Acrodisc®, Gelman Science Inc.), majd felvisszük a szürletet egy saválló acél oszlopra (átmérő 2 cm), amely 20 g oktadecil-szilil-szilikagélt (Lichrisorb RP 18, Merck Inc., részecskenagyság 10 pm) tartalmaz, fordított fázisban. A szilikagélt ezután mérsékelt nyomáson (névleges nyomás kb. 14 bar) betöltjük a Chromatospac Modulprep készülék (Yoben Yvon, Franciaország) saválló acél oszlopába és 25 : 75 (térf./térf.) arányú acetonitril: pH 6,10 18 mM nátríumfoszfát puffer elegyével kiegyensúlyozzuk. Az eluálást ugyanazzal az oldószereleggyel végezzük, amelyet az ekvflibráláshoz felhasználtunk, áramlási sebesség kb. 10,5 ml/perc. Az eluátumot Bac. subtilis-szel végzett biológiai vizsgálattal és HPLC technikával elemezzük meg.
A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat egyesítjük és a kromatográfiás futtatás homogén frakcióját a szerves oldószer ledesztillálásával betöményitjük.
A kapott oldatot IM vizes nátriumklorid oldattal az eredeti térfogat kétszeresére hígítjuk és felvísszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (50 g, töltet-magasság 5 cm, szilanizált szilikagél 60, Merck Inc.), amelyet vízzel hoztunk egyensúlyba.
Az oszlopot a teljes sómentesítésig (vizes AgNO3 hozzáadása után nem keletkezik AgCl csapadék az eluátumokban (ionmentesített vízzel mossuk, majd 1 : 1 acetonitrű : víz eleggyel eluáljuk. Az azonos antibiotikumokat tartalmazó eluátum-frakciókat HPLC elemzés szerint összeöntjük, n-butanoHaí végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra betöményitjük és a kapott vizes fázist fagyasztva szárítjuk. Kitermelés:
A 40926 antibiotikum PA faktor: 55 mg A 40926 antibiotikum PB faktor: 51 mg A 40926 antibiotikum A faktor: 38 mg A 40926 antibiotikum Βθ faktor: 33 mg
-131
194 317
6. példa
Alternatív eljárás az A 40926 antibiotikum B faktor elkülönítésére
A 2. A és B. példa szerinti eljárás utolsó lépésben nyert koncentrátumokat szüljük és a szürletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (400 g, töltet-magasság 30 cm, részecskeméret 0,20—0,07 szitalyukbőségnek megfelelő, Merck Inc.), amelyet előzetesen vízzel hoztunk egyensúlyba.
Az oszlopot 6 liter vízzel öblítjük át és az adszorbeálódott antibiotikum acetonitril : víz eleggyel oldjuk le a következő séma szerint:
2,7 liter 5% (térf./térf.) acetonitril vízben
1,6 liter 10% ,, „ „
2,97 liter 15%
3,15 liter 20% „ „ „
Kb. 18 ml-es frakciókat szedünk.
Az eluált frakciók aktivitását papírkorongos biológiai vizsgálattal határozzuk meg — érzékeny mikroorganizmusokkal, pl. Bac. subtíÜs-szel — és HPCLvel elemezzük ezeket. A hasonló antibiotikum tartalmú frakciókat összeöntjük (472.-526. frakció) és csökkentett nyomáson betöményítjük. Ehhez a koncentrátumhoz n-butanolt adunk a víz azeotrópos eltávolítása érdekében. A visszamaradó butanolos oldatot ezután kis térfogatra töményítjük be, az A 40926 antibiotikum B faktor kicsapására (1,4 g). Ezt a terméket petroléterrel mossuk, kevertetés közben és szűréssel összegyűjtük (háromszor). Vákuumban való szárítással 760 mg A 40926 antibiotikum B faktort kapunk.
Az A 40926 antibiotikum B faktort az előbbi oszlopkromatográflás kezelésnek vetjük alá. így 540 mg A 40926 antibiotikum Βθ faktort kapunk, amelynek fizikokémíai jellemzői azonosak az előbbiekben az A 40926 antibiotikum B faktorral kapcsolatban megadottakkal, azzal a különbséggel, hogy a HPLC elemzés során csak 1 csúcsot mutat, nevezetesen azt a csúcsot, amelyhez 1,22 retenciós idő tartozik, a teikoplanin A2 2. komponenséhez viszonyítva.
7. példa
Az A 40926 antibiotikum PA faktor és az A 40926 antibiotikum PB faktor átalakítása A 40926 antibiotikum A faktorrá, illetőleg B faktorrá mg A 40926 antibiotikum PA faktort és 50 mg A 40926 antibiotikum PB faktort külön-külön feloldunk 2,5 ml 1%-os (tömeg/térf.) vizes ammóniumhidroxidban és a kapott oldatokat kb. 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, kevertetés mellett. A vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval eltávolítjuk, majd a terméket etiléterrel kicsapjuk és a csapadékot szűréssel összegyűjtük (kitermelés kb. 75%). Az eredetileg az A 40926 antibiotikum PA faktort tartalmazó oldatból kapjuk az A 40926 antibiotikum A faktort és az eredetileg az A 40926 antibiotikum PB faktort tartalmazó oldatból az A 40926 antibiotikum B faktort.
A D-ala-D-ala-Sepharose előállítása g aktivált CH-Sepharose 4B-t (Pharmacia Fine Chemicals) 15 percen át jéghideg 1 mM sósavban duzzasztónk és ugyanezzel az oldattal mosunk. A kapott gélt (kb. 3 ml) 30 mg D-alanll-D-alanfl 0,5 M nátriumklorid 0,1 M nátrfumhldrogénkarbonát pufferrel (pH 8) elkészített oldatában szuszpendáljuk.
A keveréket 1 órán át szobahőmérsékleten tikrázógépen rázatjuk.
A kapcsolási reakció befejeződése után a ligandum feleslegét a puffer-oldattal kimossuk. A dextrán hordozó meg nem kötött aktivált csoportjait oly módon blokkoljuk, hogy pH 9-en 1 órán át 1 M etanolamin-hidrokloridda] kezeljük az elegyet'.
Ezután a Sephadex-epazflon-amlnokaproil-D-alaníl-D-alanin módosított mátrixot szűréssel kinyerjük és a· iposan mossuk, felváltva, pH 4 0,5 M nátriumklorid-0,1 M nátriumacetát pufferrel, illetőleg 0,5 M nátriumklorid-0,1 M trisz(hidroximetil)-aminometán (pH 8) pufferrel (négyszer).
8. példa Sóképzés
Az A 40926 antibiotikum A, PA, B és PB faktorának Na-sóvá, illetve HCl-as sóvá történő átalakítását ismert módon NaOH-dal, illetve sósavval végeztük. A sók 180°C fölötti hőmérsékleten bomlanak.
Az alábbi táblázat tartalmazza a sók elemanalízise során nyert értékeket és a 140°C hőmérsékletre való melegítés esetén mért tömegcsökkenést.
C% H% N% Cl% Na% tömegcsökkenés%
A faktor Na-só PA faktor 50.71 5.05 5.80 3.60 1.20 10.20
Na-só B faktor 49.05 5.02 5.47 3.45 1.13 13.30
Na-só 51.20 5.21 5.65 3.44 3.75 9.80
PB faktor Na-só A faktor 49.51 5.06 5.45 3.46 3.36 12.80
.HQ B faktor 47.65 5.86 5.41 5.12 — 15.40
.Ha 47.70 5.68 5.40 5.18 - 15.00
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (14)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás A 40926 antibiotikum komplex, az A 40926 antibiotikum A faktor, az A 40926 antibiotikum B faktor, az A 40926 antibiotikum Bn faktor, az A 40926 antibiotikum PA faktor, az A 40926 antibiotikum PB faktor, valamint ezek keverékei és addiciós sói előállítására, amelyek a következő tulajdonságokkal rendelkeznek :
    A 40926 antibiotikum A faktor szabad alakban: A)UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
    ^^“max (nm)
    a) 0,1 N HQ 2§r
    a) 0,1 N HQ b) pH 7,38 foszfát puffer wr j 281 300 (váll) c) 0,1 N nátrium- vagy kálium- hldroxld 300 d) metanol 282 e) pH 9,0 foszfát puffer 282 300 (váll)
    B) IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximuokat mutatja (cm'1 ): 3700-3100 , 3100-2800 (nujol), 1655, 16201560, 1480-1410 (nujol), 1375 (nujol), 132014
    -141
    194 317
    1250, 1250-1190, 1100-950,845,810,720 (nuί°1),
    C) * H-NMR spektrum, amely a következő jelcsoportokat (ppm-ben) mutatja 270 MHz-nél DMSO-deban (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta = ppm),
    0,86 (triplettek, 6H), 1,21 (-11H), 1,43 (2H), 2,01 (2H), 2,31-2,34 (3H), 4-6,2 (-16H), 6,28 (-23H), 8,44, 9,22, 9,66 (széles sávok, mozgé, kony protonok),
  2. 2,5—4: Interferencia a H2 O csúcsokkal,
    D) retenciós idő (R.) 1,12 a teikoplanin A2 2. komponenséhez viszonyítva (R. = 20,3 perc) fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve az elemzést:
    oszlop: Ultrasphere ODS (5 μτη) Altex (Beckman) 4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP (5 μτη)
    Az eluálószer ch3cn (2,5 g/1) NaH2PO4 ,H2O B eluálószer:
    10% pH 6-ra 90% beállítva ch3cn (2,5 g/l)NaH2PO4
    H,0
    70% pH 6,0-ra 30% beállítva eluálás: 5%—60% lineáris gradiens (B eluálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
    UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.), ugyanilyen körülmények között a tesztoszteronhoz (Roussel Uclaf) viszonyított retenciós idő
    0,60,
    E) elemanalízis, miután a mintát előzetesen kb. 140eC-on közömbös atmoszférában szárítottuk (tömegveszteség 4,6%), amely a következő közelítő (százalékos) összetételt mutatja (átlag): szén 55,82, hidrogén 5,17, nitrogén 6,31, klór (összes) 4,24%, klór (ionos) 037%, szervetlen maradék 900°C-on levegőn való izzítás után: 1,2%.
    F) sav-bázis titrálási görbe: 4 : 1 arányú 2-metoxi-etanol (MCS) : víz elegyben, HC1 fölösleg hozzáadása után KOH-dal végzett titrálással felvéve, amely a következő pk^re értékekkel rendelkező négy izonizálható funkció jelenlétére mutat: 4,6,5,6,7,2,9,2,
    G) az Rr érték 0,24 és, a teikoplanin A2 2. komponenséhez viszonyítva 0,70 értékű Rf a következő kromatográfiás rendszerben:
    5% (tömeg/térf.) vizes Na2 SO4 70, acetonitril 30, szilanizáit szilikagél (60, F2Í4, Merck) lemezeket a’kamazva (rétegvastagság 0,25 mm) előhívás:
    — UV fény,
    - sárga szín Pauly reagenssel, azaz diazotált szulfanllsawal (J. Chromatogr. 20, 171, 1965 és Z. Physlol. Chem. 292,99,1953),
    - bioautográfla Bac. subtüis ATCC 6633 felhasználásával, Davis-f. minimális táptalajon,
    H) molekulatömeg kb. 1716 az FAB-MS spektrum alapján, amely szerint az M4f csúcs 1717-nél helyezkedik el,
    A 40926 antibiotikum B faktor, szabad alakban: A)UV abszorpciós spektrum, amely a következő
    abszorpciós maximumokat mutatja: lambda (nm) a) 0,1 N HQ b) pH 7,38 foszfát puffer 281 c) 0,1 N nátrium- vagy káliumhidroxid 300 (váll) 300 d) pH 9,0 foszfát puffer 283 e) metanol 300 (váll) 282
    B) IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja: (cm'1): 3700-3080, 3080-2700 (nujol), 1720-1625, 1625-1560, 1505, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1295, 1230, 1210, 1150, 1100-1040, 1030, 1015, 970, 890, 810,720 (nujol),
    C) 1H-NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-nél, DMSO-deban (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS alkalmazásával (delta = ppm):
    0,85 (d, izopropfl-metilek), 1,15 (-13H), 1,44 (-2H), 2,02 (2H), 2,32-2,35) (3H), 4-6,1 (-16H), 6,1—8 (-23H), 8,52, 9,30,9,68 (széles sávok, mozgékony protonok),
    2,5-4: interferencia a H2 O csúcsok hatására,
    D) retenciós idő (R.) 1,22 és 1,27 a teikoplanin A? 2. komponenséhez viszonyítva (R. = 203 péíc) fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között vizsgálva:
    oszlop: Ultrasphere ODS (5 μτη) Altex (Beckman) 4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 μτη), x A eluálószer:
    CH3 10% pH 6-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2 O 90% beállítva,
    B eluálószer:
    -CH3CN 70% pH 6,0-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 30% beállítva eluálás: 5%-60% lineáris grádiens (B eluálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
    UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.),
    E) elemanalízis, miután a mintát előzetesen kb.
    140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (tömegveszteség 9,6%) a következő közelítő százalékos összetételt (átlag) mutatja: szén 54,09, hidrogén 5,13, nitrogén 634, klór (összes) 4,12%, klór (ionos) 039%, szervetlen maradék 900eC-on levegőn való izzitás után: 5%,
    F) sav-bázis titrálási görbe, 4 : 1 arányú 2-metoxi-etanol (MCS) : víz elegyben felvéve, HC1 felesleg (pH 2,7) hozzáadását követő KOH-os titrálással a következő pkwpg értékekkel rendelkező négy funkció jelenlétére mutat:
    4,5,5,6,7,2,9,2,
    G) Rr érték 0,21, és a teikoplanin A7 7 komponenséhez viszonyított Rf érték 0,53 a Következő kromatográfiás rendszerben:
    5%-os (tömeg/térf.) vizes Na2 S04 70, acetonitril 30, szilanizáit szilikagél (60 FJJ4 Merevlemezeket alkalmazva (rétegvastagság 0,25 mm), előhívás:
    -151
    194 317
    UV fény,
    - sárga szín a Pauly reagenssel, azaz diazotált szulfanflsawal (J. Chromatog. 20, 171, 1965 és Z. Physiol. Chem. 292,99,1953),
    - bioautográfia Bac. subtflis ATCC 6633 alkalmazásával, minimális Davis-f. táptalajon,
    H)Molekulatömeg kb. 1730 az FAB-MS spektrum alapján, amely az M+H* csúcsot 1731-nél mutatja,
    A 40926 antibiotikum Bq faktor, szabad alakban:
    A) UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
    lambda (nm)
    a) 0,1 N HC1 2§F
    b) pH 7,38 foszfát puffer 281
    300 (váll)
    c) 0,1 N nátrium- vagy káliumhidroxid 300
    d) pH 9,0 foszfát puffer 283
    300 (váll)
    e) metanol 282
    B) IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm1): 3700-3080, 3080-2700 (nujol), 1720-1625, 1625-1560, 1505, 1460 (nujol), 1375 (nujoí), 1295, 1230, 1210, 1150, 1100-1040, 1030, 1015,970, 890, 840, 810, 720 (nujol),
    C) 'H-NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-nél, DMSO-d<sban (hexadeutero-dimetíl-szulfoxld) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta = ppm):
    0,85 (d, izopropil-metilek), 1,15 (-13H), 1,44 (2H), 2,02 (2H0, 2,32-2,35 (3H0, 4-6,1 (-16H), 6,1-9 (-23H), 8,52, 9,30,9,68 (széles sávok,mozgékony protonok) 2,5—4: interferencia a H2O csúcsok miatt,
    D) retenciós idő (Rj 1,22 a teikoplanin A2 2. komponenséhez képest (Rx = 203 perc) fordított fázisú HPLC-vei a következő körülmények között végezve az elemzést:
    oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm)
    A eluálószer
    CH3CH 10% pH 6-ra (2,5 g/l)NaH2PO4 . H2O 90% beállítva
    B eluálószer:
    ClbCH 70% pH 6-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 30% beállítva eluálás: 5%—60% lineáris grádiens (B eluálószer
    A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
    UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.),
    E) elemanalízis, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (tömegveszteség 9,6%), a következő közelítő százalékos összetételt (átlagban) mutatja: szén 54,09%, hidrogén 5,13%, nitrogén 634%, klór (összes) 4,12%, klór (ionos) 039%, szervetlen maradék 9006C-on levegőn izzítva: 5%.
    F) sav-bázis titrálási görbe 4 : 1 arányú 2-metoxl-etanol (MCS) : víz elegyben felvéve, HCl-felesleg hozzáadása után KOH-os títrálással négy ionizálható funkció jelenlétére mutat, amelyek séhez viszonyított Rf érték 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben:
    5%-os (tömeg/térf.) Na2SO4 70, acetonitrü 30, szilanizált szflikagél (60 F2’4 Merck) lemezeket alkalmazva (rétegvastagság: 035 mm), előhívás:
    - UV fény,
    - sárga szín Pauly-reagenssel, azaz diazotált szulfanilsawal (J. Chromatog. 20, 171, 1965 és Z. Physiol. Chem. 292,99,1953), ,
    - bioautográfia Bac. subtflis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimális táptalajon,
    H)molekulatömeg kb. 1730, az FAB-MS spektrum alapján, amely az M+H csúcsot 1731-nél mutatja,
    A 40926 antibiotikum PA faktor szabad alakban: ·
    A) UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat adja:
    lambda (nm)
    a) 0,1 N HC1 28?
    b) 0,1 N KOH 300
    c) pH 7,38 foszfát puffer 282
    300 (váll)
    d) pH 9,0 foszfát puffer 283
    300 (váll),
    B) 1R abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm*1): 3700-3100, 3000-2800 (nujol), 1760-1710, 1655, 1620-1550, 1505, 1460 (nujol), 13675 (nujol), 1260, 1250-950, 845, 805, 720 (nujol),
    C) ’ H-NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben), 270 MHz-nél, DMSO-l^ban )hexadeutero-dimetfl-szulfoxid) feltéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta, ppm):
    0,86 (dublettek, CH3), 1,15-1,22 (m, (CH2)O, 1,41 (m, CH2), 2,01 (s, CH3), 2,01 (m, CH/J, 2,28 (s, N-CH3), 4,26-5,96 (széles, peptid és aromás CH csoportok), 633—7,73 (aromás CH csoportok és peptid NH csoportok),
    D) retenciós idő (R3 1,15 a teikoplanin A^ 2. komponenséhez képest (Rj = 20,3 perc) fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve az elemzést:
    oszlop: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm),
    A eluálószer:
    CH3CN (2,5 g/1) NaH2PO4 ,H2O B eluálószer:
    10%pH6,0-ra 90% beállítva
    CH3CN 70%pH6,0-ra (2,5 g/1) NaH2P04 . H2 0 30% beállítva eluálás: 5%-60% lineáris grádiens (B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
    UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.),
    E) Rf érték a teikoplanin A2 2. komponenshez viszonyítva 0,62 a következő kromatográfiás rendszerben:
    5%-os (tömeg/térf.) vizes Na2 S04 70, acetonitrü 30, szilanizált szflikagél (60 F2S4 Merck) lemezeket alkalmazva (rétegvastagság 0,25 mm), előhívás:
    -161
    194 317
    - UV fény,
    - sárga szín Pauly reagenssel, azaz diazotált szulfanflsawal (J. Chromatog. 20, 171, 1965 és Z. Physiol. Chem. 292,99,1953),
    - bioautográfla Bac. subtflis ATCC 6633 alkalmazásával, Davis-f. minimális táptalajon,
    F) molekulatömeg kb. 1758 az FAB-MS spektrum alapján, amely görbe-sereget mutat és a legintenzívebb csúcs 1761-nél látható, az FAB-MS elemzés műveleti körülményei a következők: berendezés: VG Mód ZAB SE, FAB ágyúval (Ion Tech) ellátva, körülmények: pozitív FAB, Xe, gyorsítófeszültség: 8 KV, mátrix: tiogllcerin-gjicerin 1 :1 (térf./térf.),
    A40926 antibiotikum PB faktor, szabad alakban:
    A)UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
    lambdamax(nm)
    a) 0,1 N HC1 282
    b) 0,1 N káliumhidroxid 300
    c) pH 87,38 foszfát puffer 282
    300 (váll)
    d) pH 9,0 foszfát puffer 282
    300 (váll)
    B)IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm'1): 3700-3100, 3000-2800 (nujol), 1760-1710, 1655, 1620-1560, 1605, 1480-1420 (nujol), 1320-1270, 1230-1190, 1150, 1120-920,845, 810, 720 (nujol),
    C.l) 1 H-NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 MHz-nél, DMSO-d6-ban (hexadeutero-dimetil-szulfoxld) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta = ppm):
    0,84 (d, izopropfl-metflek), 1,17 (m, (CH2) ), 1,43 (m, CHj), 1,99 (s, CH3), 2,01 (m, CH,), 231 (s, N-CH3), 2,79 (duplett-duplett, CH), 3,70 (m, CH), 4,06-6,02 (széles, peptid és aromás CH csoportok), 6,45—7,74 (széles, aromás CH és pepiid NH csoportok), 8,19—9,99 (széles, peptid NH és fenolos OH csoportok),
    C.2) 1H-NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270 NHz-nél, DMSO-d6-ban (hexadeutero-dimetil-szulfoxld) + CF3-COODben, felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva, (delta = ppm):
    0,84 (d, izopropfl-metilek), 1,13 (m, (CH2)O, 1,40 (m, CH,), 1,98 (s, CH3), 2,00 (m, CH,T, 2,92 (duplett-duplett, CH), 3,29-3,71 (m, cukor CH csoportok), 4,07—6,09 (s és m, peptid és aromás CH csoportok), 6,45-7,83 (s és m, aromás CH és peptid NH csoportok), 8,17—10,38 (peptid NH és fenolos CH csoportok),
    D)retenclós Idő (Rj 1,27 és 1,32 a teikoplanin A, 2. komponenshez viszonyítva (R? - 203 perc) fordított fázisú HPLC-vei a következő körülmények között végzett elemzés során:
    4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 jum)
    A eluálószer:
    CH3CN 10%pH6,0-ra (2,5 g/1) NaH, PO4 . Η, O 90% beállítva
    B eluálószer:
    CHSCN 70%pH6,0-ra (2,5 g/1) NaH,PO4 . H, 0 30% beállítva eluálás: lineáris grádiens (5%-60% B eluálószer A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
    UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppo Lepetít S. p. A.),
    E) A teikoplanin A2 2. komponenséhez viszonyított Rf érték 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben:
    5%-os (tömeg/térf.) vizes Na2SO4 70, acetonitril 30, szílanizált szflikagél (60 F2S4 Merevlemezeket alkalmazva (rétegvastagság 0,25 mm), előhívás:
    - UV fény,
    - sárga szín Pauly reagenssel, azaz diazotált sZulfanflsawal (J. Chromatogr. 20, 171, 1965 és Z. Physiol. Chem. 292,99,1953),
    - bioautográfla Bac. subtflis ATCC 6633 alkalmazásával Davis-f. miminális táptalajon,
    F) molekulatömeg kb. 1772 az FAB-MS spektrum alapján, amelyen több csúcs látható, a legintenzívebb 1776-nál, a FAB-MS elemzés műveleti körülményei a következők:
    berendezés: VG Mód ZAB SE, FAB ágyúval (Ion Tech) ellátva körülmények:
    pozitív FAB, Xe, gyorsító feszültség 8 KV, mátrix: tíoglicerin-glicerin 1 (l)térf. (térf.) — azzal jellemezve, hogy az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzset vagy annak egy A 40926 antibiotikumot termelő mutánsát vagy variánsát süllyesztett aerób körülmények között tenyésztjük asszimilálható szén- és nitrogénfonás és szervetlen sók jelenlétében, az antibiotikumot a fermentléből kinyerjük és az egyes komponenseket kívánt esetben elkülönítjük, és kívánt esetben a kapott vegyületet sóvá alakítjuk. (Elsőbbsége: 1985.10.10.)
    2. Eljárás A 40926 antibiotikum komplex, az
    A 40926 antibiotikum A faktor, az A 40926 antibiotikum B faktor, valamint ezek keverékei és addlciós sói előállítására, amelyek a következő tulajdonságokkal rendelkeznek:
    A 40926 antibiotikum A faktor szabad alakban:
    A)UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
    lambdamax<nm)
    a) 0,1 N HC1 281
    b) pH 7,38 foszfát puffer 281
    300 (váll)
    c) 0,1 N nátrium- vagy káliumhidroxid 300
    d) metanol 282
    e) pH 9,0 foszfát puffer 282
    B) IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm1): 3700-3100, 3100-2800 (nujol), 1655, 16201560, 1510, 1480-1410 (nujol), 1375 (nujol), 1320-1250, 1250-1190, 1100-950, 845 , 810, 720 (nujol),
    C) 1 H-NMR spektrum, amely a következő jelcsoportokat (ppm-ben) mutatja 270 MHz-nél DMSO-de bán (hexadeutero-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS-t alkalmazva (delta = ppm):
    -171
    194 317
    0,86 (trfplettek, 6H), 1,21 (11H), 1,43 (2H), 2,01 (2H), 231-2,34 (3H), 4-6,2 (16H), 6,28 (23H), 8,44, 9,22, 9,66 (széles sávok, mozgékony protonok),
    2,5-4: Interferencia a HaO csúcsokkal.
    D) retenciós idő (R ) 1,12 a teikoplanin Aa 2. komponenséhez viszonyítva (Rt = 203 perc) fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között végezve az elemzést:
    oszlop: Ultrasphere ODS (5 μτη) Altex (Beckman)
    4,6 mm (belső átmérő) x 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP (5 /an),
    A eluálószer:
    CH3CN 10%pH60ra (2,5 g/1) NaH2 PO4 . Ha O 90% beállítva,
    B eluálószer:
    CH3CN 70% pH 6-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H2O 30% beállítva, eluálás: 5%-6O% lineáris grádiens (B elulálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
    UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplain A2 2. komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.) ugyanilyen körülmények között a tesztoszteronhoz (Roussel Uclaf) viszonyított retenciós idő 0,60,
    E) elernanalízis, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (tömegveszteség: 4,6%), amely a következő közelítő (százalékos) összetételt mutatja (átlag): szén 55,82, hidrogén 5,17, nitrogén 6,31, klór (összes) 4,24%, klór (ionos) 0,37%, szervetlen maradék 900°C-on levegőn való izzítás után: 1,2%.
    F) sav-bázis titrálási görbe 4 : 1 arányú 2-metoxietanol (MCS): vízelegyben, HC1 fölösleg hozzáadása után KOH-dal végzett titrálással felvéve, amely a következő pkj^pg értékekkel rendelkező négy izonizálható funkció jelenlétére mutat:
    4,6,5,6,7,2,9,2.
    G) az Rr érték 0,24 és, a teikoplanin A2 2 komponenséhez viszonyítva 0,70 értékű Rf a következő kromatográfiás rendszerben:
    5% (tömeg/térf.) vizes Na2 S04 70, acetonitril 30, szilanizált szilikagél (60, F2S4, Merck) lemezeket alkalmazva (rétegvastagság 0,25 mm), előhívás:
    - UV fény,
    - sárga szín Pauly-reagenssel, azaz dlazotált szulfanil savval (J. Chromatogr. 20, 171, 1965, és Z. physiol. Chem. 292,99,1953),
    - bioautográfla Bac. subtflis ATCC 6633 felhasználásával, Davis-f. minimális táptalajban,
    H) molekulatömeg kb. 1716 az FAB-MS spektrum alapján, amely szerint az M+Hn csúcs 1717-nél helyezkedik el,
    A 40926 antibiotikum B faktor, szabad alakban: A)UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
    lambdamax (nm)
    a) 0,1 N Hd 282
    b) p 738 foszfát puffer 281
    300 (váll)
    c) 0,1 N nátrium- vagy káliumhidroxid 300
    d) pH 9,0 foszfát puffer 283
    300 (váll)
    e) metanol 282
    B) IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm*1): 3700-3080, 3080-2700 (nujol), 1720-1625, 1625-1560, 1505, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1295, 1230, 1210, 1150, 1100-1040, 1030, 1015,970,890,840, 810, 720 (nujol),
    C) 1H-NMR spektrum, amely a következő jel-csoportokat mutatja (ppm-ben) 270MHz-nél,DMSO-dg-ban (hexadeutro-dimetilszulfoxid) felvéve, belső standardként (0,00 ppm) TMS alkalmazásával, (delta = ppm):
    0,85 (d, izopropfl-metilek), 1,15 (-13H), 1,44 (-2H), 2,02 (2H), 2,32-2,35 (3H), 4-6,1 (-16H), 6,1-8 (-23H), 8,52, 9,30, 9,68 (széles sávok, mozgékony protonok),
    2,5-4: interferencia a H2O csúcsok hatására,
    D) retenciós idő (R.) 1,22 és 1,27 a teikoplanin A2 2. komponenséhez viszonyítva (Rt = 203 perc) fordított fázisú HPLC-vel a következő körülmények között vizsgálva:
    oszlop: Ultrasphere ODS (5 prn) Altex (Beckman)
    4,6 mm (belső átmérő) . 250 mm, elő-oszlop: Brownlee Labs RP 18 (5 pm),
    A eluálószer:
    CH3 10% pH 6-ra (2,5 g/1) NaH2P04 . H20 90% beállítva,
    B eluálószer:
    CH3CN 70% pH 6-ra (2,5 g/1) NaH2PO4 . H20 beállítva, eluálás: 5%-60% lineáris grádiens (B eluálószer az A eluálószerben), 40 perc alatt, áramlási sebesség: 1,8 ml/perc,
    UV detektor: 254 nm, belső standard: teikoplanin A2 2. komponens (Gruppo Lepetit S. p. A.),
    E) elemanalízis, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (tömegveszteség 9,6%) a következő közelítő százalékos összetételt (átlag) mutatja:
    szén 54,09, hidrogén 5,13, nitrogén 634, klór (összes) 4,12%, klór (ionos) 0,39%, szervetlen maradék 900°C-on levegőn való izzítás után: 5%,
    F) sav-gázis titrálási görbe: 4 : 1 arányú 2-metoxi-etanol (MCS) : víz elegyben felvéve, Hd felesleg (pH 2,7) hozzáadását követő KOH-os titrálással a következő pkMrs értékekkel rendelkező négy funkció jelenlétére mutat:
    4,5,5,6,7,2,9,2,
    G) Rf érték 0,21, és a teikoplanin Aa 2. komponenséhez viszonyított Rf érték 0,53 a következő kromatográfiás rendszerben:
    5%-os (tömeg/térf.) vizes Na2 SO4 70, acetonitril 30,’ szilanizált szilikagél (60 F2S4 Merck) lemezeket alkalmazva (rétegvastagság 0,25 mm), előhívás:
    - UV fény,
    - sárga szín a Pauly reagenssel, azaz dlazotált szulfanflsawal (J. Chromatog. 20, 171, 1965 és Z. Physiol, Chem. 292, 99, 1953),
    - bioautográfla Bac. subtflis ATCC 6633 alkalmazásával, minimális Davis-f. táptalajon,
    H) molekulatömeg kb. 1J3Ö az FAB-MS spektrum alapján, amely az M+H csúcsot 1731-nél mutatja:
    - azzal jellemezve, hogy az Actinomadura
    -181
    194 317 sp. ATCC 39727 törzset vagy annak egy A 40926 antibiotikumot termelő mutánsát vagy variánsát süllyesztett aerób körülmények között tenyésztjük assdmiálható szén- és nitrogénforrás és szervetlen' sók jelenlétében, az antibiotikumot a fennentléből kinyerjük, és az egyes komponenseket kívánt esetben elkülönítjük, és kívánt esetben a kapott vegyületet sóvá alakítjuk. (Elsőbbsége: 1984. 10. 11.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a törzset 20°C és 40°C közötti hőmérsékleten tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1985. 10.
    10.)
  4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a törzset 20°C és 40°C közötti hőmérsékleten tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1984. 10, Π.) .
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás a z z a 1 j e 11 e m e z v e, hogy a tenyésztést 24°C és 35°C közötti hőmérsékleten végezzük. (Elsőbbsége: 1985,
    10.10.)
  6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 24°C és 35°C közötti hőmérsékleten végezzük. (Elsőbbsége: 1984.
    10.11.)
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antibiotikumok kinyerését és elkülönítését úgy végezzük, hogy a szűrt fermentlevet affinitás-kromatográfiának vetjük alá rögzített D-alanil-D-alaninon, majd megosztási, fordított fázisú vagy ioncserélő kromatográflát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985. 10.10.)
  8. 8. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antibiotikumok kinyerését és elkülönítését úgy végezzük, hogy a szűrt fermentievet affinitás-kromatográfiának vetjük alá rögzített D-alaníl-D-alanínon, majd megosztási, fordított fázisú vagy ioncserélő kromatográfiai alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 10.11.)
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antibiotikumok kinyerésére
    a) a fermentlevet affinitáskromatográfiának vetjük alá rögzített D-alanil-D-alanínon,
    b) az antibiotikumot tartalmazó egyesített eluált frakciókat gyorsan semlegesítjük és
    c) kívánt esetben fordított fázisú folyadékkromatográfiával szflanizált szilikagélen elkülönítjük az
    A 40926 antibiotikum PB, PA, A, B és Βθ faktorát (Elsőbbsége: 1985. 10.10.)
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A 40926 g antibiotikum A faktor, B faktor és Βθ faktor kinyerésére azzal jellemezve, hogy
    a) a fermentlevet pH 8,5 és 10,5 közötti értékre megjúgosítjuk,
    b) szüljük,
    c) a tiszta szürlet pH-ját 2,5-4,5 közötti értékre
    10 állítjuk be,
    d) az elegyet szüljük és a szűrletet elvetjük,
    e) a szűrőlepényt vízben szuszpendáljuk és pH-ját 8 és 9 közé állítjuk be,
    f) a nyers A 40926 antibiotikumot szűréssel kinyerjük és affinitáskromatográfiának vetjük alá rögzí’ö tett D-alanfl-D-alaninon,
    g) megosztási, fordított fázisú vagy Ioncserélő kromatográ fia segítségével elkülönítjük az A 40926 antibiotikum A faktort és B faktort és
    h) az. A 40926 antibiotikum B faktort további affl2q nitáskromatográfiás kezelésnek vetjük alá, így
    A 40926 antibiotikum Βθ faktort ldnyeijük. (Elsőbbsége: 1985. 10.10.)
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy fordított fázisú kromatográflát alkalmazunk és stacionárius fázisként szilinlzált szi25 likagél vagy funkcionálisan nem átalakított polisztirol gyantát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985 10.
    10.)
  12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a stacionárium fázisként alkalmazott szilanizált szflikagélt pH 4-9 közötti puffer30 oldatta] előzetesen kiegyensúlyozzuk és eluálószer ként egy poláris vízzel elegyedő oldószernek ugyanezzel a pufferoldattal képezett lineáris grádiens elegyét használjuk fel. (Elsőbbsége: 1085. 10.10.)
  13. 13. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására „c azzal jellemezve, hogy egy, az 1. Igénypont szerint előállított vegyületet gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokkal keveijük össze. (Elsőbbsége: 1985.10.10.)
  14. 14. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy egy, a 2. igény4Q pont szerint előállított vegyületet gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokkal keveijük össze, (Elsőbbsége: 1984. 10.11.)
HU853936A 1984-10-11 1985-10-10 Process for production of a 40926 antibioticum-complex and its clean components, pa, pb,a,b and b under o factor and medical compounds containing thereof HU194317B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB848425685A GB8425685D0 (en) 1984-10-11 1984-10-11 Antibiotic a 40926 complex

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT39480A HUT39480A (en) 1986-09-29
HU194317B true HU194317B (en) 1988-01-28

Family

ID=10568022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU853936A HU194317B (en) 1984-10-11 1985-10-10 Process for production of a 40926 antibioticum-complex and its clean components, pa, pb,a,b and b under o factor and medical compounds containing thereof

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4935238A (hu)
EP (1) EP0177882B1 (hu)
JP (2) JPH0637508B2 (hu)
KR (1) KR940009280B1 (hu)
AT (1) ATE49215T1 (hu)
AU (1) AU599308B2 (hu)
CA (1) CA1317900C (hu)
DE (1) DE3575145D1 (hu)
DK (1) DK161092C (hu)
ES (1) ES8609352A1 (hu)
FI (1) FI81117C (hu)
GB (1) GB8425685D0 (hu)
GR (1) GR852442B (hu)
HU (1) HU194317B (hu)
IE (1) IE58708B1 (hu)
IL (1) IL76596A (hu)
MY (1) MY100880A (hu)
NO (1) NO164111C (hu)
NZ (1) NZ213775A (hu)
PH (1) PH23013A (hu)
PT (1) PT81288B (hu)
ZA (1) ZA857697B (hu)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8531846D0 (en) * 1985-12-30 1986-02-05 Lepetit Spa Antibiotic a 40926 mannosyl aglycon
GB8608809D0 (en) * 1986-04-11 1986-05-14 Lepetit Spa Antibiotic
GB8608798D0 (en) * 1986-04-11 1986-05-14 Lepetit Spa Recovery of glycopeptide antibiotics from aqueous solutions
DK363587A (da) * 1986-07-30 1988-01-31 Smithkline Beckman Corp Antibiotika og fremstilling heraf under anvendelseaf actinomadura parvosata
GB8621912D0 (en) * 1986-09-11 1986-10-15 Lepetit Spa Increasing ratio of components of anti-biotic complex
GR871488B (en) * 1986-10-10 1987-11-12 Lepetit Spa New antibiotics
US5135857A (en) * 1987-07-03 1992-08-04 Gruppo Lepetit S.P.A. Process for the preparation of de-mannosyl teicoplanin derivatives
PH27266A (en) * 1989-03-14 1993-05-04 Fujisawa Pharmaceutical Co WS7622, A,B,C and D substances and pharmaceutical composition containing same
CA2095725A1 (en) * 1990-12-05 1992-06-06 Adriano Malabarba 38-decarboxy-38-hydroxymethyl derivatives of teicoplanin antibiotics and a process for preparing them
US5606036A (en) * 1991-03-27 1997-02-25 Gruppo Lepetit Spa Antibiotic A 40926 ester derivatives
CA2099866C (en) 1991-03-27 2002-07-09 Rolf H. Hermann Antibiotic a 40926 ester derivatives
US5750509A (en) * 1991-07-29 1998-05-12 Gruppo Lepetit S.P.A. Amide derivatives of antibiotic A 40926
ES2224173T3 (es) * 1995-07-05 2005-03-01 Aventis Bulk S.P.A. Purificacion de antibioticos dalbaheptidos por enfoque isoelectrico.
JP2000508671A (ja) 1996-04-23 2000-07-11 バイオサーチ・イタリア・ソチエタ・ペル・アチオニ 抗生物質ａ４０９２６のアミド誘導体の改善された化学的製造法
EP1413626A1 (en) * 2002-10-23 2004-04-28 Vicuron Pharmaceuticals, Inc. Genes and proteins for the biosynthesis of the glycopeptide antibiotic A40926
US20060074014A1 (en) * 2002-11-18 2006-04-06 Vicuron Pharmaceuticals Inc. Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections
AU2003294262B2 (en) 2002-11-18 2007-08-23 Vicuron Pharmaceuticals Inc. Methods of administering dalbavancin for treatment of bacterial infections
US7119061B2 (en) * 2002-11-18 2006-10-10 Vicuron Pharmaceuticals, Inc. Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections
CN110183519B (zh) * 2019-05-06 2023-04-11 大邦(湖南)生物制药有限公司 一种达巴万星关键中间体a40926的分离纯化方法
CN110156876A (zh) * 2019-05-25 2019-08-23 聊城大学 一种适合工业化生产的高纯度a40926b0制备方法
EA202290040A1 (ru) * 2019-06-13 2022-03-05 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способы удаления нежелательных компонентов в многостадийных хроматографических процессах
CN110940763B (zh) * 2019-12-19 2022-07-26 宜昌东阳光生化制药有限公司 分离纯化达巴万星前体a40926的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4195079A (en) * 1979-01-31 1980-03-25 Pfizer Inc. New polycyclic ether antibiotic
CA1183789A (en) * 1981-08-04 1985-03-12 Kiyoshi Isono Antibiotic 76-11, process for the production thereof, anticoccidiosis agent and domestic animals growth accelerator comprising the same as an effective ingredient
US4578271A (en) * 1982-05-24 1986-03-25 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Biologically active WS 6049 substances, a process for the production thereof and their pharmaceutical compositions
GR78648B (hu) * 1982-07-26 1984-09-27 Bristol Myers Co

Also Published As

Publication number Publication date
EP0177882A3 (en) 1987-05-27
IL76596A0 (en) 1986-02-28
DK161092B (da) 1991-05-27
US4935238A (en) 1990-06-19
ES8609352A1 (es) 1986-09-01
AU599308B2 (en) 1990-07-19
GB8425685D0 (en) 1984-11-14
PT81288B (pt) 1987-10-20
FI853914L (fi) 1986-04-12
DK457385D0 (da) 1985-10-08
ZA857697B (en) 1986-07-30
PT81288A (en) 1985-11-01
ATE49215T1 (de) 1990-01-15
DE3575145D1 (de) 1990-02-08
EP0177882A2 (en) 1986-04-16
DK161092C (da) 1991-11-18
JPH06225757A (ja) 1994-08-16
IE58708B1 (en) 1993-11-03
PH23013A (en) 1989-03-03
CA1317900C (en) 1993-05-18
NZ213775A (en) 1989-03-29
FI81117B (fi) 1990-05-31
EP0177882B1 (en) 1990-01-03
NO164111C (no) 1990-08-29
NO854018L (no) 1986-04-14
GR852442B (hu) 1986-02-03
FI853914A0 (fi) 1985-10-08
IE852489L (en) 1986-04-11
NO164111B (no) 1990-05-21
MY100880A (en) 1991-05-16
AU4819585A (en) 1986-04-17
ES547766A0 (es) 1986-09-01
HUT39480A (en) 1986-09-29
KR860003342A (ko) 1986-05-23
IL76596A (en) 1992-05-25
JP2572937B2 (ja) 1997-01-16
FI81117C (fi) 1990-09-10
KR940009280B1 (ko) 1994-10-06
JPH0637508B2 (ja) 1994-05-18
DK457385A (da) 1986-04-12
JPS61148188A (ja) 1986-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU194317B (en) Process for production of a 40926 antibioticum-complex and its clean components, pa, pb,a,b and b under o factor and medical compounds containing thereof
CS228909B2 (en) Method of preparing antibioticum a-4696 in complex form, or in the form of factor b1,b2,b3,c1a,c3 and e1
US4868171A (en) Antibiotic A 40926 N-acylaminoglucuronyl aglycons and antiobiotic A 40926 aglycon
HU201099B (en) Process for producing a 40926 antibiotic mannosylaglycon and pharmaceutical compositions comprising same
US5322777A (en) Antibiotic GE 2270
US4918054A (en) Antibiotics called `chloropolysporins B and C`, a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use
JPH08112090A (ja) キブデロスポランギウム・アリダムｓｋ＆ｆ−ａａｄ−６０９
EP0675900B1 (en) Antibiotics ge 37468 a, b and c
US4804534A (en) Antibiotic A 42867 and the addition salts thereof
AU629851B2 (en) Antibiotic ge 2270
US5610143A (en) Antibiotics GE 37468 A, B and C
NZ227946A (en) Actinomadura strain atcc 39727 useful for producing antibiotic a 40926

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: BIOSEARCH ITALIA S.P.A., IT

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: VICURON PHARMACEUTICALS INC., US