PL161004B1 - Sposób wytwarzania antybiotyku kedarcydyny PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania antybiotyku kedarcydyny o nastepujacej charakterystyce: (a) wyg- lad: jasnozólta, stala substancja; (b) ciezar czasteczkowy: 12.400 daltonów wedlug metody wykorzystujacej elektroforeze na zelu SDS-poliakryloamidowym, 17.000 wedlug metody opar- tej na filtracji molekularnej na zelu i HPLC; (c) widmo UV: jak pokazano na figurze, (d) punkt izoelektryczny: 3,65; (e) zawiera polipeptyd o nastepujacej sekwencji aminokwasów: X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-Ieu- ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly- phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala- ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu- phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr- ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met- pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr- ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr- gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH, w którym X oznacza grupe H-ala-ser, grupe H-ser lub atom wodoru, znamienny tym, ze szczep Streptoalloteichus wytwarzajacy kedarcyne hoduje sie w pozywce zawierajacej przyswajalne zródla wegla i azotu, w warunkach hodowli podpowierzchniowej, a nastepnie izoluje sie antybio- tyk z brzeczki fermentacyjnej. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antybiotyku kedarcydyny o działaniu przeciwnowotworowym przez Streptoalloteichus, korzystnie szczep L585-6.

Wynalazek dotyczy wytwarzania przeciwnowotworowego antybiotyku kedarcydyny o następującej charakteiystyce:

a) wygląd: jasnożółta stała substancja;

b) ciężar cząsteczkowy: 12.400 daltonów według metody wykorzystującej elektroforezę na żelu SDS-poliakryloamidowym, 17.000 według metody opartej na filtracji molekularnej na żelu i HPLC;

c) widmo UV: jak pokazano na figurze na rysunku;

d) punkt izoelektryczny: 3,65;

e) zawiera polipeptyd o następującej sekwencji aminokwasów: X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-glyphe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-alalleu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asnval-ala-glupherhisrasp-pherser-leurserrglyrgly-glu-gly-rhr-thrrserrvalrvalrval·argrargrseΓrpherthrrglytyr-valrmetr pΓOrasprglyrpΓOrglu-valrglyralarval-asp-cys-asp-thr-ala-pΓOrgly-glr-cyr-gln-ilervalrvalrglyr gly-asn-thrgly-glu-tyr-gly-asn-ala-alarile-seΓ-phergly-OH, w którym X oznacza grupę H-ala-ser lub H-ser albo atom wodoru.

Właściwości fizyko-chemiczne podane poniżej odróżniają antybiotyk wytwarzany sposobem według wynalazku od innych znanych antybiotyków peptydowych wykazujących aktywność przeciwnowotworową, takich jak neokarcynostatyna, makromomycyna, largomycyna, aktynoksantyna i AN-7D.

161 004

Sposób według wynalazku wytwarzania kedarcydyny polega na hodowaniu wytwarzającego kedarcydynę szczepu Streptoalloteichus w pożywce zawierającej przyswajalne źródła węgla i azotu, w warunkach hodowli podpowierczhniowej, a następnie na izolowaniu tego białka z brzeczki fermentacyjnej.

Wytwarzającym kedarcydynę szczepem jest Streptoalloteichus, korzystnie szczep L585-6, ATCC 53650.

Kompozycje farmaceutyczne zawierają hamującą wzrost nowotworu ilość antybiotyku kedarcydyny i dopuszczalny w farmacji nośnik.

Sposób hamowania wzrostu nowotworu u ssaków polega na podawaniu im hamującej nowotwór ilości antybiotyku kedarcydyny.

Na figurze na rysunku przedstawiono widmo UV kedarcydyny C39006. Współrzędnymi wykresu są absorbancja (Au) i długość fali (nm). W opisie stosowane są następujące skróty dla oznaczenia aminokwasów:

asx - kwas asparaginowy + asparagina thr - treonina ser - seryna glx - kwas glutaminowy + glutamina asp - kwas asparaginowy asn - asparagina glu - kwas glutaminowy gin - glutamina pro - prolina gly - glicyna ala - alanina val - walina met - metionina ile - izoleucyna leu - leucyna tyr - tyrozyna phe - fenyloalanina his - histydyna lys - lizyna arg - arginina cys - cysteina trp - tryptofan

Szczep L585-6 został wyizolowany z próbki gleby pobranej w stanie Maharastra w Indiach. Poniżej przedstawiono szczegółową charakterystykę szczepu L585-6.

Morfologia. Szczep L585-6 jest Gram-dodatnim, nitkowatym organizmem produkującym grzybnię wegetatywną i powietrzną. Grzybnia wegetatywna przenika w agar i nie jest rozczłonkowana. Obserwuje się kuliste, zwarte skupiska strzępków o średnicy 5-25 pm wraz ze zrośniętą grzybnią wegetatywną. Grzybnia powietrzna jest dobrze rozgałęziona i rozwinięta w proste, skręcone lub spiralne długie strzępki, w których zarodniki są sformowane w ciągły lub przerywany łańcuch. Zwarte kłębki rozgałęzionych krótkich łańcuchów tworzą się przede wszystkim w pożywce ISP No. 5. Oba typy zarodników są owalne do krótkich cylindrów (0,4-0,6 X 1,0-2,0 pm) i są one nieruchliwe i o gładkiej powierzchni.

Bezbarwne, podobne do baloników ciała (o średnicy 5-20 pm) są obserwowane pojedynczo lub w masie, w grzybni powietrznej po inkubowaniu w ciągu 5-10 dni. Po inkubowaniu w ciągu trzech tygodni lub dłużej te balono-podobne ciała przekształcają się w żółtobrązowe stwardniałe granulki (o średnicy 40-100pm), pokryte wydłużonymi strzępkami grzybni powietrznej.

Cechy hodowlane: Wzrost jest na ogół umiarkowany, ale bardzo ubogi na agarze Czapek'a sacharozowo-azotanowym, agarze owsianym i agarze skrobiowym z solami mineralnymi. Grzybnia powietrzna tworzy się na agarze tyrozynowym i agarze glicerynowo-asparaginowym, ale nie tworzy się na podłożu ISP nr nr 2, 3,4 i 6 oraz na agarze Bennetta. Barwa grzybni powietrznej jest żółtawobiała i tworzą się czarnawe melaminowe pigmenty na podłożach ISP nr 6 i 7. Inne znaczące pigmenty nie są wytwarzane.

161 004

Charakterystykę hodowlaną szczepu L585-6 przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1.

Charakterystyka hodowlana szczepu L585-6

Podłoże	Charakterystyka1
Agar sacharozowo-azotanowy (agar Czapek'a-Doxa)	2G - brak lub skąpy A - brak S - bezbarwna D - brak
Pożywka z tryptinem i wyciągiem drożdżowym (ISPNo. 1)	G - umiarkowany, nie zmętniały, klaczkowaty A - brak S - bezbarwna D - głęboko żółtawo-brązowy (75)'
Agar z wyciągiem drożdżowym i wyciągiem słodowym (ISP No. 2)	G - umiarkowany A - brak S - ciemna żółtawo-brązowa (78) D - głęboko żółtawo-brązowa (75)
Agar owsiany (ISP No. 3)	G - skąpy A - brak lub skąpa, biała S - bezbarwna D - brak
Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi (ISP No. 4)	G- skąpy A - brak lub skąpa biała S - bezbarwna D - brak
Agar gjicerynowo-asparaginowy (ISP No. 5)	G - umiarkowany A - umiarkowana, żółtawo-biała (92) S - bezbarwna D - brak
Agar peptonowo-żelazowy z wyciągiem drożdżowym (ISP No. 6)	G - umiarkowany A - brak S - jasnoszarawo-żółtawo-brązowa (79) D - brązowawo-czarny (65)
Agar tyrozynowy (ISP No. 7)	G - umiarkowany A - obfita, żółtawo-biała (92) S- czarna D - czarny
Agar gjukozowo-asparaginowy	G - ubogi A - brak S - ciemnopomarańczowo-żółta (72) D - brak
Agar Bennetta	G - umiarkowany A - brak lub skąpa biała S - ciemnoszarawożółtawo-brązowa (81) D - średnio żółtawo-brązowy (77)

'Obserwacje po inkubowaniu w ciągu trzech tygodni w temperaturze 28°C.

^SG - wzrost, A - grzybnia powietrzna, S - grzybnia wegetatywna, D - dyfundujący pigment.

'Barwa i numer w nawiasach podane są zgodnie z oznaczeniami ISCC-NBS.

Charakterystyka fizjologiczna. Optymalny wzrost obserwuje się w temperaturze 3O-35°C. Zakres wzrostu wynosi 18-39°C. Nie zachodzi wzrost w temperaturze 15°C i 41°C, brak również wzrostu na podłożach zawierających więcej niż 5% chlorku sodowego. Żelatyna jest upłynniana, natomiast skrobia nie ulega hydrolizie. Z testowanych 25 cukrów tylko D-ryboza i D-glukoza są wykorzystywane dla wzrostu. Charakterystykę fizjologiczną i przyswajanie węglowodanów przedstawiono w tabelach 2 i 3.

Tabela 2.

Charakterystyka fizjologiczna szczepu L585-6

Hydroliza:		Przyswajanie2
żelatyny	+	L-ramnozy	—
skrobii rozpuszczalnej	—	D-glukozy	+
skrobii ziemniaczanej	—	D-galaktozy	—
Koagulacja mleka	+	D-fruktozy	—
Peptonizacja mleka Wytwarzanie:	+	D-mannozy
reduktazy azotanowej	-lub	Sacharozy	—
	-t(w)1	Laktozy	—
tyrozynazy	+	Cellobiozy	—
Tolerancja na:		Melibiozy	—
lizozym, 0,01% (w/o)	+	Trehalozy	—
NaCl, 1-4% (w/o)	+	Rafinozy	—
5%	—	D-melecytozy	—
pH, 5,0-11,0	+	Skrobii rozpuszczalnej	—
4,5 i 12		Celulozy Dulcytolu Przyswajanie:2	—
Temperatura:		Inozytolu	—
zakres wzrostu 18-39°C		D-mannitolu	—
brak wzrostu I5°C i 41°C		D-sorbitolu	—
optymalny wzrost 3O-35°C		Salicyny Gliceryny D-arabinozy D-ksylozy D-rybozy	+

'Negatywny wynik w pożywce sacharozowo-azotanowej Czapek'a, pozytywny w pożywce peptonowo-azotanowej.

‘Podstawowe podłoże: podłoże Pridhama-GottJieba (ISP No. 9).

Tabela 3.

Dodatkowa charakterystyka' fizjologiczna szczepu L585-6

Hydroliza:	Kwas z:
adeniny	—	Gliceryny	—
kazeiny	+	D-arabinozy	—
kwasu hippurowego	+	L-arabinozy	—
hypoksantyny	—	D-ksylozy	—
tyrozyny	+	R-ramnozy	—
mocznika	—	D-glukozy	+
ksantyny	—	D-mannozy	—
Przeżycie w tempera-		Laktozy	—
turze 50°C, 8 godzin	—	Cellobiozy	—
Przyswajanie:		Melibiozy	—
benzoesanu	—	Trehalozy	—
cytrynianu	—	Rafinozy	—
śluzanu	—	D-melecytozy	—
bursztynianu	+	Inozytolu	—
winianu	—	D-mannitolu	—
	—	D-sorbitolu	—
		D-sorbitolu	—
		Erytrytolu	—
		Adonitolu Metylo-e-gluzyd

'Według testów opisanych przez Gordona i wsp. w J. Gen. Microb., 109, 69-78 (1978).

Chemia ściany komórkowej. Zawartość ściany komórkowej szczepu L-585-6 badano posługując się metodami opisanymi przez Beckera i wsp. w Appl. Microbiol., 13,236-243 (1965), Yamaguchi w J. Bacteriol., 89,444-453 (1965) i Lechevaliera i Lechevaliera w Biology of Actinomycetes and Related Organismus, 11, 78-92 (1976). Peptydoglikan ściany komórkowej zawiera kwas mezodwuaminopimelinowy, a jako cukry całej ściany - galaktozę, glukozę i rybozę. Tak więc, ściana

161 004 komórkowa należy do typu III_C. Fosfolipidy należą do typu P-II i zawierają fosfatydyloaminę, fosfatydyloglicerynę oraz fosfatydyloindozytol. Głównymi menachinonami są MK-9(Hą) i MK9(He). Test glikolanowy jest ujemny.

Taksonomia. Wśród rodzaju Actinomycetales z długimi łańcuchami zarodników, Pseudonocardia, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Streptomyces, Actinomadura, Glycomyces, Nocardiopsis i Amycolata różnią się wyraźnie od szczepu L585-6 pod względem chemii komórki, w tym typem ściany komórkowej, zestawem cukrów w komórce, fosfolipidami i menachinonem. Kibdelosporangium (Shearer i wsp., Int. J. Syst. Bacteriol., 36,47-54,1986), Kitasatosporia (Takahasi i wsp., J. Gen. Appl. Microbiol., 30,377-387,1984), i Amycolatopsis (Lechevalier i wsp., Int. J. Syst. Bacteriol., 36, 29-37, 1986) są spokrewionione ze szczepem L585-6 ze względu na skład fosfolipidowy i menachinon, ale Kibdelosporangium i Amycolatopsis różnią się od szczepu stosowanego w sposobie według wynalazku obecnością arabinozy wśród cukrów ściany komórkowej, zaś Kitasatosporia obecnością kwasu LL- i mezodwuaminopimelinowego w ścianie komórki. Ponadto, Kibdelosporangium wykazuje tworzące strzępki podobne do zarodni ciało z prawdziwą błoną, a Kitasatosporia wytwarza podpowierzchniowe zarodniki. Takie unikalne struktury nie są obserwowane dla szczepu L585-6. Chemiotaksonomicznie, Streptoalloteichus (Tomita i wsp., Int. J. Syst. Bacteriol., 28, 304-310, 1978) oraz Saccharothrix (Labeda i wsp., Int. J. Syst. Bacteriol., 34, 426-431, 1984) są najbardziej spokrewnione ze szczepem L585-6. Actinosynnema wytwarza powietrzny łańcuch zarodników od .końca synnemy. Saccharothrix wytwarza łańcuchy rozczłonkowanych elementów ziarenkowatych, zarówno w grzybni wegetatywnej jak i powietrznej i nie wytwarza skupisk rozgałęzionych krótkich łańcuchów zarodników lub stwardniałych ziarn. Morfologia łańcuchów ziarenkowatych elementów u Saccharothrix australiensis i S. aerocolonigenes (Labeda, Int. J. Syst. Bacteriol., 36, 109-110, 1986) jest podobna do morfologii Nocardiopsis ale niepodobna dla żadnych gatunków Streptomyces. Stąd, szczep L585-6 nie jest zaklasyfikowany ani do Acitnosynnema ani do Saccharothrix.

Streptoalloteichus hindistanus wytwarzają długi spiralny zarodnikowy łańcuch artrosporów, rozgałęziony krótki łańcuch zarodników oraz stwadniałe granulki w grzybni powietrznej, a także kuliste skupiska strzępków i małe podobne do zarodni ciała otaczające 1-4 zarodników z rzęskami w grzybni wegetatywnej. Szczep L585-6 tworzy małe, podobne do zarodni pęcherzyki. Podobnie jak Streptoalloteichus, szczep L585-6 wytwarza podobne do baloników ciało, które przechodzi w stwardniałe granulki. Taką strukturę obserwuje się o wielu gatunków Streptomyces, takich jak S. kanamycetius (Shirling i wsp., Int. J. Syst. Bacteriol., 22, 256-394, 1972) i S. roseiscleroticus (Chainia rubra) (Shirling i wsp., Int. J. Syst. Bacteriol., 22, 265-394, 1972).

W oparciu o przedstawione powyżej porównawcze rozważania, szczep L585-6 został zaklasyfikowany do rodzaju Streptoalloteichus. Szczep L585-6 różni się od Streptoalloteichus hindustanus brakiem zdolności wytwarzania grzybni powietrznej na podłożach ISP No. 2,3 i 4 agarze Bennetta, wytwarzaniem melaniny, nie wywoływaniem hydrolizy skrobi, brakiem wzrostu w temperaturze 41 °C i zdolnością przyswajania jedynie D-rybozy i D-glukozy z 25 testowanych cukrów. Tak więc, szczep L585-6 jest uważany za nowy gatunek z rodzaju Streptoalloteichus.

Biologicznie czystą hodowlę szczepu L585-6, uznanego za nowy gatunek z rodzaju Streptoalloteichus, zdeponowano w American Type Culture Collection (Rockville, MD), jako część stałej kolekcji drobnoustrojów, pod numerem ATCC 53650.

Anybiotyk przeciwnowotworowy według wynalazku jest wytwarzany drogą hamowania szczepu L585-6 lub jego mutanta w warunkach hodowli podpowierzchniowej, w wodnej pożywce odżywczej. Wytwarzający organizm hoduje się w odżywczej pożywce zawierającej przyswajalne źródło węgla, np. przyswajalny węglowodan. Przykładem odpowiednich źródeł węgla są cereloza i gliceryna. Odżywcza pożywka powinna także zawierać przyswajalne źródło azotu, takie jak męczka rybna, wyciąg drożdżowy lub sole amoniowe. W razie potrzeby są dodawane sole nieorganiczne, takie jak chlorek sodowy, chlorek potasowy, siarczan magnezowy, węglan wapniowy, fosforany i inne. Pierwiastki śladowe, takie jak miedź, mangan, żelazo, cynk i inne są dodawane do pożywki lub mogą być obecne jako zanieczyszenia składników pożywki. Inkubowanie można prowadzić w dowolnej temperaturze, w której produkujący szczep jest zdolny do wzrostu, np. od 18°C do 39°C, ale korzystnie jest prowadzić fermentację w temperaturze 25-35°C, najbardziej korzystnie w zakresie 27-32°C. Korzystne jest prowadzenie fermentacji w obojętnym pH środowi161 004

Ί ska. Proces prowadzi się na ogół w ciągu 4-8 dni. Zwykle optimum wytwarzania osiąga się po około 5-6 dniach. Dla uzyskania stosunkowo małych ilości antybiotyku można wykorzystywać hodowlę powierzchniową w kolbach na trzęsawce, natomiast dla otrzymania większych ilości korzystna jest hodowla głębinowa w jałowych fermentorach. Dla hodowli w fermentorach pożądane jest przygotowanie wegetatywnego inokulum w odżywczej pożywce drogą zaszczepienia pożywki hodowlanej zarodnikami drobnoustroju. Gdy otrzyma się młode, aktywne inokulum wegetatywne, przenosi się je w warunkach jałowych do pożywki w fermentorze. Mieszać można za pomocą mieszadła wirnikowego. W razie potrzeby można dodawać olej wieprzowy lub silikonowy jako środek przeciwpienny.

Wytwarzanie kedarcydyny w pożywce fermentacyjnej można śledzić podczas procesu fermentacji za pomocą oznaczeń mikrobiologicznych z zastosowaniem Bacillus subtilis jako organizmu testowego, albo metodą badania cytotoksyczności dla komórek z zastosowaniem linii nowotworowych komórek myszy (B16-F10) lub ludzkich (np. HCT-116, KB).

Jest zrozumiałe, że wynalazek nie jest ograniczony do zastosowania szczególnie korzystnego szczepu L585-6, opisanego powyżej lub do drobnoustrojów odpowiadających w pełni powyższemu opisowi. W szczególności w zakres wynalazku wchodzą inne wytwarzające kedarcydynę szczepy lub ich mutanty, które można otrzymywać typowymi sposobami, takimi jak promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie nadfioletowe, traktowanie iperytem azotowym, działanie fagami, itp· . . .

Przeciwnowotworowe białko według wynalazku można izolować z brzeczki fermentacyjnej za pomocą znanych technik stosowanych do wyodrębniania białek, takich jak dializa, ultrafiltracja, filtracja żelowa, wytrącanie w punkcie izoelektrycznym, wysalanie, elektroforeza, chromatografia jonowymienna i chromatografia wykorzystująca powinowactwo. Na ogół stosuje się kombinację tych technik dla oczyszczania białka i uzyskania jednorodności. Proces izolowania i oczyszczania można kontrolować za pomocą oznaczeń mikrobiologicznych, takich jak aktywność wobec B. subtilis; oznaczania in vitro cytotoksyczności dla linii komórkowych nowotworu myszy lub ludzkiego; badania przeciwnowotworowego in vivo; albo za pomocą metod fizycznych, takich jak spektrofotometria UV lub HPLC. Na-schemacie I przedstawiono typowy przebieg izolacji i oczyszczania, który jednak ilustruje jedynie sposób według wynalazku. Specjaliści wiedzą, że można stosować różną kolejność i inne metody, pod warunkiem, że otrzymywane białko ma wysoką czystość i zatrzymuje aktywność biologiczną.

Schemat Izolacja I oczyszczanie białka

Brzęczku fermentacyjna

I - I

Grzybnia Przesącz wymiana Jon ona

Bufor

Bluat Eluat Bluat

Biufor IW KaCl

Bluat

Flltraoja na żelu

Eluat

Preparaty»na nymlana anionona

Oczyszczony roztnór białka lloflllaaoja

Oczyszczone białko

161 004

Zgodnie ze schematem, nierozpuszczalną masę usuwa się z brzeczki fermentacyjnej za pomocą typowych sposobów, np. wirowania lub sączenia. W przypadku sączenia korzystne jest stosowanie pomocy filtracyjnej, takiej jak ziemia okrzemkowa Dicalite. Przesącz poddaje się chromatografii anionowymiennej, stosując do elucji bufor o pH 7-8 i następnie tenże bufor zawierający chlorek sodowy. Odpowiednim kationowym buforem o tym pH jest np. chlorowodorek Tris. Frakcje eluowane buforem zawierającym chlorek sodowy zbiera się, zatęża i dalej oczyszcza za pomocą filtracji na żelu, stosując taki sam kationowy bufor. Frakcje zbiera się i bada na obecność aktywnego składnika. Dogodnym sposobem badania eluatów są oznaczenia aktywności wobec Bacillus subtilis. Frakcje dające strefy zahamowania łączy się, zatęża i dalej oczyszcza za pomocą chromatografii anionowymiennej, stosując jako eluent początkowo kationowy bufor o pH 7-8, a następnie eluując w liniowym gradiencie wzrastającej siły jonowej. Aktywne frakcje bada się na jednorodność za pomocą elektroforezy z wykorzystaniem dodecylosiarczanu sodowego i żelu poliakryloamidowego (SDS-PAGE), ogniskowania izoelektrycznego i HPLC. Jednorodne frakcje zbiera się i liofilizuje, uzyskując aktywne białko.

Kedarcydyna jest silnym przeciwnowotworowym antybiotykiem białkowym składającym się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego i niebiałkowego chromoforu. Chociaż próbki antybiotyku poddawane badaniom fizyko-chemicznym i testom biologicznym były uważane za jednorodne na podstawie elektroforezy na SDS-PAGE, ogniskowania izoelektrycznego oraz HPLC, to podczas ustalania sekwencji aminokwasów odkryto, że antybiotyk składa się z jednej głównej odmiany i dwóch mniejszych odmian. Odmiany różnią się początkową N-terminalną sekwencją aminokwasową w polipeptydzie, jak to opisano w dalszej części. Rozdzielanie i wyodrębnianie poszczególnych odmian nie jest wymagane dla uzyskania aktywności przeciwnowotworowej.

W zakres sposobu według wynalazku wchodzą także odmiany kedarcydyny, w których część peptydowa antybiotyku może być zmieniona za pomocą znanych technik otrzymywania fragmentów i pochodnych, np. przez odjęcie, dodanie lub zamianę pewnych aminokwasów w pierwotnej strukturze peptydu, bez znaczącej zmiany aktywności przeciwnowotworowej antybiotyku.

Stosując standarowe, dobrze znane metody, oznaczono skład aminokwasowy oczyszczonego białka i przedstawiono go w tabeli 4.

Tabela 4.

Skład aminokwasowy kedarcydyny

	Wydajność	Reszty
nmoli	% molowych	(a)	(b)
asp	2,765	8,1	10,1	9.3 ( 6)
asn				( 3)
thr	3,18	9,3	11.6	10,6 (11)
ser	3,163	9,3	11,5	10,6 (12)
glu				( 4)
gin	1,928	5,7	7,0	6.5 ( 2)
pro	1,615	4,7	5,9	5,4 ( 4)
giy	5,529	16,2	20,1	18,5 (18)
ala	5,566	16,3	20,3	18,6 (18)
val	3,731	11	13,6	12,5 (13)
met	0,2873	0.8	1,1	1.0 ( 1)
ile	0,8531	2.5	3,1	2,9 ( 3)
leu	1,298	3,8	4,7	4,3 ( 4)
tyr	0,6274	1,8	2,3	2,1 ( 2)
phe	1,565	4,6	5,7	5.2 ( 5)
his	0,6235	1.8	2,3	2,1 ( 1)
lys	0,3196	0,9	U	U ( 0)
arg	1,001	2,9	3,7	3.3 ( 3)
cys	0	0	0	0 ( 4)
trp	0	0	0	0 ( 0)

(a) Ilość reszt w peptydzie przy przyjęciu, że jego ciężar cząsteczkowy wynosi 12.000.

(b) Ilość reszt w peptydzie przy przyjęciu, że całkowita ich ilość wynosi 114. Wartości w nawiasach wskazują ilość reszt w peptydzie oznaczoną na podstawie analizy sekwencji aminokwasowej.

161 004

Dla przeprowadzenia aminoterminalnej analizy sekwencyjnej kedarcydynę redukowano 2-merkaptoetanolem i następnie oczyszczano za pomocą elektroforezy na SDS-PAGE (15% akryloamidu) i odzyskiwano z żelów drogą elektroelucji.

W większości przypadków do enzymatycznego rozszczepiania stosowano kedarcydynę bez dalszego jej oczyszczania. Kedarcydynę redukowano roztworem 20 nM dwutiotreitolu w 100μ1 0,4 M buforu Tris · HC1 o pH 8,5, zawierającym 6 M chlorowodorku guanidyny i 0,1% soli sodowej czterooctanu etylenodwuaminy (NazEDTA), w ciągu 2 godzin w temperaturze 50°C, a następnie S-pirydyloetylowano w ciągu nocy w pokojowej temperaturze 4-winylopirydyną. Reakcję zatrzymywano poddając reakcji z 10pl 2-merkaptoetanolu w ciągu 1 godziny, w temperaturze 50°C. Reagenty usuwano drogą dializy wobec 5% (objętość na objętość) kwasu octowego, w ciągu 24 godzin. Zmodyfikowaną kedarcydynę suszono w zatężaczu odśrodkowym Speedvac (Savant Instruments).

Enzymatyczne rozszczepianie S-pirydyloetylowanej kedarcydyny enzymem ASP-N lub proteazą V8 S. aureus wykonywano w 40pl buforu 0,1 M Tris. kwas octowy o pH 8,0, zawierającego 0,7 M mocznika, w ciągu nocy w temperaturze 37°C, stosując stosunek enzymu do substratu wynoszący 1.100 (ASP-N) lub 1:10 (proteaza V8). Trawienie trypsyną prowadzono w 40pl buforu 0,1 M Tris-kwas octowy o pH 8,0, w temperaturze 37°C, w ciągu nocy, przy stosunku enzymu do substratu wynoszącym 1:20. Produkt trawienia enzymatycznego zakwaszano kwasem trójfluorooctowym (TFA) do pH 2,0 i rozdzielano stosując HPLC z odwróconą fazą.

Oczyszczanie enzymu prowadzono za pomocą HPLC z odwróconą fazą, wykorzystując układ rozdzielający Model 130 A (Applied Biosystems, Inc.) i prowadząc rozdział w temperaturze 40°C na kolumnie RP-300 (2,1 X 100 mm, Applied Biosystems, Inc.). Do elucji stosowano jako bufor wyjściowy 0,1% TFA w wodzie, a następnie w liniowym gradiencie zastępowano wodę acetonitrylem, kończąc elucję 60% acetonitrylem zawierającym 0,085% TFA. Peptydy zbierano ręcznie. Oznaczanie sekwencji aminokwasów wykonywano automatycznie na urządzeniu Model 475 A (Applied Biosystems, Inc.), stosując standarodowe techniki.

Główna odmiana polipeptydu składa się z 114 reszt aminokwasowych. Ustalono, że sekwencja aminokwasów jest następująca:

N-terminal

H-ala-ser-aIa-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leuala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-glyphe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-alaile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-gluphe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thrser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-metpro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thrala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thrgly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH

C-terminal

Zidentyfikowano dwie mniejsze odmiany: w jednej brak pierwszej alaniny w stosunku do głównej odmiany, zaś w drugiej brak dwóch pierwszych aminokwasów, to jest alaniny i seryny w stosunku do głównej odmiany.

Oznaczanie ciężaru cząsteczkowego.

(a) Metoda filtracji na żelu i HPLC.

Do oznaczania stosowano kolumnę TSK-G2000 SW (7,5 X 300 mm, LKB Produkter AB, Szwecja) i filtrację prowadzono stosując 50 mM bufor Tris · HC1 zawierający 0,5 M NaCl o pH 7,4, i szybkość przepływu 0,5 ml/min. Alternatywnie można używać kolumnę Waters Associates Protein Analysis Column 1-125, eluując 0,2 M Tris-octanem z szybkością przepływu 1 ml/min. Z krzywej porównawczej otrzymanej dla standardowych markerów ciężaru cząsteczkowego (Bio Rad Laboratories) ustalono, że ciężar cząsteczkowy wynosi 17.000 daltonów.

(b) Elektroforeza z zastosowaniem dodecylosiarczanu sodowego do żelu poliakryloamidowego.

Próbkę białka i markerów ciężaru cząsteczkowego (Diversified Biotech, Maine) zmieszano z równą objętością Seprasolu (gotowy do użycia rozpuszczalnik białek zawierający sacharozę i

161 004 barwny znacznik) i ogrzewano całość w ciągu 3 minut w temperaturze 90°C, bezpośrednio przed elektroforezą. Elektroforezę prowadzono przy 3000 V w buforze Seprabuff (Tris-glicyna-SDS, pH 8,3) do momentu gdy barwny znacznik osiągnął dno. Żel zanurzono wtedy w roztworze barwiącym (1,25 g Comassie BB R-250, 92 ml kwasu octowego lodowatego w 908 ml wodnego roztworu metanolu) na okres co najmniej 10 godzin, po czym zanurzono w roztworze odbarwiającym (75 ml kwasu octowego i 50 ml metanolu w 875 ml wody), aż podstawa żelu stała się przezroczysta. Seprasol i Seprabuff otrzymano z Integrated Separation System, Massachusetts. Ciężar cząsteczkowy oznaczony tą metodą wynosi 12.400 daltonów.

Żel stosowany do ogniskowania przygotowywano mieszając poniższe składniki:

29,1% akryloamidu w wodzie 10 ml

0,0% N,N'-metylenobis-akryloamidu w wodzie 10 ml

Gliceryna 7 ml

1802 amfolina pH 1,5-4 3 ml

Woda do 60 ml

Otrzymany roztwór odgazowywano w ciągu 10 minut i dodano 1,5 ml 1% roztworu nadsiarczanu amonowego w wodzie oraz 10μ1 Ν,Ν,Ν',Ν'-czterometylenodwuaminy. Mieszaninę wlano do formy odlewniczej i zostawiono do polimeryzacji. Jako roztwory elektrodowe stosowano 1 M kwas fosforowy dla anody oraz 2% 1809 amfoliny o pH 6-8 dla katody. Doświadczenie z ogniskowaniem prowadzono przy stałej mocy 25 watów, w ciągu 2 godzin. Podane wartości procentowe oznaczają procenty wagowe w objętości. Stwierdzono, że punkt izoelektryczny wynosi 3,65, a odległość migracji od katody 6,25 cm.

Aktywność przeciwnowotworową białka oznaczano wobec wszczepianej białaczki P388 myszy. Myszom CDFi wszczepiano dootrzewnowno i dożylnie 10e komórek białaczki P388 otrzymanych od myszy dawców DBA/2, które były nosicielami tej wszczepionej białaczki. Myszy, którym wszczepiono białaczkę P388 dootrzewnowo traktowano dootrzewnowo albo roztworem chlorku sodowego (myszy kontrolne) albo odpowiednią dawką kedarcydyny raz dziennie przez pięć kolejnych dni, rozpoczynając od następnego dnia po zakażeniu. Myszy, którym białaczkę P388 wszczepiono dożylnie otrzymywały kedarcydynę dożylnie 1,3 i 5 dnia w zakażeniu. Zwierzęta obserwowano codziennie i zapisywano zgony. Rejestrowano zmiany ciężaru ciała (od dnia wszczepienia białaczki do dnia ostatniego traktowania) dla wszystkich grup, jako odzwierciedlające toksyczność leku. Przypadki występowania żywych myszy 5 dnia po wszczepieniu nowotworu rejestrowano jako dodatkową informację o toksyczności leku. Jeśli więcej niż jedna mysz padła w każdej grupie piątego dnia, przyjmowano że brak jest efektu terapeutycznego. Traktowane grupy składały się z 4 lub 6 zwierząt, grupy kontrolne z 10. Rejestrowano także ilość myszy, które przeżyły do 30 dnia, czyli ostatniego dnia eksperymentu. Dla każdej grupy po zakończeniu eksperymentu oznaczano średni czas przeżycia (MST) i wykorzystywano dla obliczenia %T/C, to znaczy stosunku MST traktowanej grupy do MST grupy kontrolnej pomnożonego przez 100. Wartość %T/C wynosząca 125 lub powyżej wskazuje na znaczącą aktywność przeciwnowotworową. Dane z doświadczeń in vitro przedstawiono w tabelach 5 i 6.

161 004

Tabela 5.

Aktywność przeciwnowotworowa wobec wszczepianej dootrzewnowo białaczki P388

Szarża	Dawka' rozcieńczenie lub mg/kg	Średni czas przeżycia (dni)	%T/C	Średnia zmiana ciężaru (g)	Ilość przeżytych myszy 5 dnia
D16F411	Rozc. 1- 40	7,0	74	-1,9	4/4
	Rozc. 1- 80	10,0	105	-1,2	4/4
	Rozc. 1160	12,5	132	-1,0	4/4
	Rozc. 1320	18,5	195	-1,9	4/4
	Kontrola	9,5	—	-0,2	10/10
D18F413	0,27	7,0	70	-1,9	4/6
	0,09	15,0	150	-0,8	6/6
	0,03	17,0	170	-1,7	6/6
	0,01	15,0	150	-0,3	6/6
D1864140	0,09	9,5	95	-1,3	6/6
	0,03	15,5	155	-U	6/6
	0,01	14,5	145	-0,5	6/6
	0,0033	14,0	140	-0,2	6/6
Kontrola		10,0	—	0	10X10

“Lek podawano dootrzewnowno w ciągu 5 kolejnych dni, rozpoczynając od następnego dnia po wszczepieniu i rozpuszczona próbki z szarży D18F4I3.

nowotworu.

“Zliofilizowana

Tabela 6.

Aktywność przeciwnowotworowa wobec wszczepionej dożylnie białaczki P388

Szarża	Dawka rozcieńczenie lub mg/kg	Średni czas przeżycia (dni)	%T/C	Średnia zmiana ciężaru (g)	Ilość przeżytych myszy 5 dnia
D18F413	0,32	6,0	75	-3,1	6/6
	0,16	7,5	94	-3,2	6/6
	0,08	11,0	138	-1,4	6/6
	0,04	12.5	156	-0,6	6/6
	0,02	10,0	125	-0,1	6/6
	0,01	8,0	100	1,2	6/6
D18F411	Rozc. 1- 25	7,0	88	-2,9	6/6
	Rozc. 1- 50	10,5	131	-1,6	6/6
	Rozc. 1-100	13,0	163	-1.2	6/6
	Rozc. 1200	9,5	119	-0,2	6/6
	Rozc. 1-400	9,0	113	0,5	6/6
	Rozc. 1800	8,0	100	0,8	6/6
	Kontrola	8,0	—	—	10/10

“Lek podawano dożylnie 1, 3 i 5 dnia po wszczepieniu nowotworu.

Kedarcydynę badano także na aktywność wobec czerniaka B16 myszy wszczepianego dootrzewnowo. Dla każdej wielkości dawki stosowano 10 myszy. Lek podawano dootrzewnowo raz dziennie w ciągu dziewięciu kolejnych dni, rozpoczynając jeden dzień po wszczepieniu nowotworu. Rejestrowano liczbę myszy, które przeżyły dnia dziesiątego i do końca doświadczenia, to znaczy do sześćdziesiątego dnia. Wyniki przedstawiono w tabeli 7. Wartości %T/C wynoszącej 125 lub większe wskazują na znaczącą aktywność przeciwnowotworową.

161 004

Tabela 7.

Aktywność przeciwnowotworowa kedarcydyny wobec wszczepianego dootrzewnowo czerniaka B16

Dawka (mg/kg)	MST (dni)	%T/C	Średnia zmiana ciężaru (g)	Ilość myszy przeżytych 5 dnia (60)'
0,256	16,0	97	-2.7	9/10
0.128	24,5	148	-1.3	10/10
0,064	26,5	161	0,3	10/10
0,032	31,5	191	1,0	10/10
0,016	32,5	197	0,6	10/10
0,008	34,0	206	0,6	9/10
0,004	27,0	164	0,3	10/10/1/
0,002	21,5	130	0	10/10
Kontrola	16,5	—	1,3

'Liczba w nawiasach oznacza ilość żywych myszy po 60 dniach od wszczepienia nowotworu.

Wyniki testów przedstawione w tabelach 5, 6 i 7 wykazują, że antybiotyk kedarcydyny jest silnie działającą substancją, dającą powtarzalne in vivo działanie przeciwnowotworowe wobec białaczki P388 myszy i czerniaka B16 myszy. Obserwowana aktywność wyrażała się w przedłużeniu życia w przypadku wszczepianego dootrzewnowo czerniaka B16 oraz wobec wszczepianej zarówno dootrzewnowo jak i dożylnie białaczki P388, przy czym ta ostatnia jest trudniejszą do skutecznego leczenia postacią chroby ze względu na jej rozsiany charakter. Kedarcydynę testowano również wobec wszczepianego podskórnie czeraniaka B16, nowotworu M5076 płuc u myszy i wszczepianej wewnątrzczaszkowo białaczki P388, ale na tych modelach zwierzęcych nie uzyskano znaczącej aktywności.

W zakres wynalazku wchodzą kompozycje farmaceutyczne zawierające hamującą skutecznie nowotwór ilość antybiotyku według wynalazku w kombinacji z obojętnym, dopuszczalnym w farmacji nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Takie kompozycje mogą także zawierać inne aktywne czynniki przeciwnowotworowe i mogą mieć postać dowolnych postaci farmaceutycznych odpowiednich dla pożądanej drogi podawania. Przykładem takich kompozycji są stałe preparaty do podawania doustnego, takie jak tabletki, kapsułki, pigułki, proszki i granulki; ciekłe preparaty, takie jak roztwory, zawiesiny, syropy, eliksiry i preparaty do podawania pozajelitowego, takie jak sterylne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Mogą być także wytwarzane w postaci jałowych stałych kompozycji do rozpuszczania w jałowej wodzie, soli fizjologicznej lub w innych jałowych rozpuszczalnikach do iniekcji, bezpośrednio przed użyciem.

Optymalne dawki i reżim podawania dla danego ssaka przy stosowaniu jako czynnika przeciwrakowego mogą być łatwo ustalone przez specjalistów. Należy oczywiście brać pod uwagę, że dawka może być różna w zależności od kontrolowanej konkretnej kompozycji, pacjenta i charakteru choroby. Należy także brać pod uwagę wiele czynników wpływających na działanie leku, takich jak wiek, ciężar, płeć, dieta, czas podawania, drogę podawania, szybkość wydalania, stan pacjenta, kombinację leków, wrażliwość na lek i stopień choroby.

Wynalazek jest zilustrowany poniżej przedstawionymi przykładami.

Przykład I. Przygotowanie hodowli wegetatywnej Streptoalloteichus, szczep L585-6.

Streptoalloteichus sp. szczep L585-6 (ATCC 53650) był przetrzymywany i przenoszony do testowych probówek na skosy agaru zawierającego wyciąg drożdżowy i słodowy, o następującym składzie:

dekstroza	4,0 g
wyciąg drożdżowy	4,0 g
wyciąg słodowy	10,0g
węglan wapniowy	l,5g
agar	15,0g
woda destylowana	do 1 litra

161 004

Po każdym przeniesieniu skoksy agarowe inkubowano w temperaturze 28°C w ciągu dwóch tygodni. Hodowlę wegetatywną przygotowywano przenosząc wzrost powierzchniowy z hodowli na skosach do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml zawierającej 100 ml jałowego podłoża o składzie:

cereloza (Corn Products)	30 g
Pharmamedia (Traders Oil Oil Mili Co.)	10g
CaCO3	3g
woda destylowana do	1 litra
Powyższą hodowlę wegetatywną inkubowano	w temperaturze 28°C w ciągu 72 godzin, na
trzęsawce obrotowej przy 250 obrotach/minutę.
Przykład II. Fermentacja w kolbach na trzęsawce. Pięć mililitrów hodowli wegetatywnej z przykładu I stosowano do szczepienia kolb Erlen-
meyera o pojemności 500 ml zawierających po 100 ml pożywki pordukcyjnej o następującym
składzie:
gliceryna	30g
Pharmamedia	Wg
rozpuszczalnepozostałościpodestylacjialkoholu
(Nutrition Product Co.)	15g
mączka rybna (Menhaden)	Wg
CaCCb	6g
woda destylowana do	1 litra.

Hodowlę produkcyjną inkubowano w temperaturze 28°C na trzęsawce obrotowej przy 250 obrotach/minutę. Wytwarzanie antybiotyku białkowego kontrolowano za pomocą oznaczeń mikrobiologicznych wobec B. subtilis i badania in vitro cytotoksyczności z zastosowaniem linii komórkowej B16-F10 czerniaka myszy oraz linii komórkowej nowotworu ludzkiego. Optymalne wytwarzanie osiągano na ogół w 144-168 godzinie.

Przykład III. Fermentacja w fermentorach.

Porcją 25 ml hodowli wegetatywnej z przykładu I szczepiono 500 ml pożywki wegetatywnej w kolbie Vitro o pojemności 2 litry. Tę hodowlę posiewową inkubowano w temperaturze 28°C w ciągu 72 godzin na trzęsawce obrotowej przy 250 obrotach/minutę. Porcją 500 ml powyższej hodowli posiewowej szczepiono w fermentorze Brunswick Microgen (pojemność nominalna 16 litrów) 10 litrów pożywki produkcyjnej o składzie podanym w przykładzie II. Fermentację prowadzono w temperaturze 28°C, napowietrzając jedną objętością/minutę i mieszając z szybkością 250 obrotów/minutę. Wytwarzanie kedarcydyny śledzono za pomocą odpowiednich oznaczeń biologicznych in vitro.

Przykład IV. Izolowanie i oczyszczanie kedarcydyny.

101 surowej brzeczki fermentacyjnej zmieszano z 6 litrami ziemi okrzemkowej Dicalite i otrzymaną rzadką zawiesinę przesączono przez warstwę tej ziemi. Osad odrzucono, a przesącz pompowano przez pakunek jonowymienny Zeta Prep 250 QAF (LKB-Produkter AB, Szwecja) z szybkością 30 ml/minutę. Ładunek uprzednio równoważono 2 litrami 50 mM buforu Tris · HC1 o pH 7,4. Wyciek zebrano, a pakunek przemyto 1 litrem 50 mM buforu Tris · HC1 o pH, a następnie eluowano 500 ml 50 mM buforu Tris · HC1 zawierającego 0,5 mola NaCl (pH 7,4). Eluat zebrano i zatężono z 500 ml do 100 ml stosując standardowe urządzenie do ultrafiltracji Amicon wyposażone w membranę Amicon YM5. Zatężony roztwór przesączono przez kolumnę do filtracji żelowej (5X 100 cm) załadowaną 1400 ml żelu Ultrogel AcA54 (LKB-Produkter AB, Szwecja) w równej objętości 50 mM buforu Tris · HC1. Ultrogel równoważono 5 litrami 50 mM buforu Tris · HC1 o pH 7,4. Załadowaną kolumnę eluowano 2 litrami 50mM buforu Tris· o pH 7,4 z szybkością 60 ml/min. Po zejściu początkowych 450 ml eluatu zbierano frakcje po 10 ml, badając każdą wobec B. subtilis. Frakcje dające strefy zahamowania (83-133) zebrano i zatężono do 100 ml za pomocą ultrafiltracji. Zatężony roztwór przepuszczono przez kolumnę jonowymienną (2,5 X 15 cm) wypełnioną 70 ml preparatu DFAF Trisacryl (LKB-Produkter AB, Szwecja) w równej objętości 50 mM Tris · HC1 buforu. Złoże Trisacrylu równoważono 10 objętościami kolumny 50 mM buforu Tris'HCl. Załadowaną kolumnę najpierw eluowano 10 objętościami kolumny 50 mM buforu Tris · HC1, a następnie w liniowym gradiencie wzrastającego stężenia NaCI eluowano 300 ml 50 mM

161 004 buforu Tris · HC1, rozpoczynając od samego buforu, a następnie dodając 0,1 mola/godzinę NaCI do uzyskania jego stężenia wynoszącego 0,5 mola. Eluowanie prowadzono z szybkością 60 ml/godzinę. Wsztyskie 47 frakcji po 5 ml zebrano i zbadano wobec B. Subtilis. Aktywne frakcje 25-37 zebrano i poddano analitycznej filtracji żelowej i HPLC, stosując kolumnę Waters Protein Analysis column 1125, 0,2 M octan Tris, pH 7,0, szybkość przepływu 1 ml/minutę i detektor UV przy 260 nm. W tych warunkach stwierdzono obecność pojedynczego piku o czasie retencji wynoszącym 8,3 min. Zebrane frakcje uznano za na podstawie el^k^tr^<^f<^^^^^ na SDS-PAGE, w uprzednio opisanych warunkach. Stężenie składnika aktywnego określono na 4,25mg/ml na podstawie liofilizacji 10 ml próbki i odliczenia ciężaru buforu.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania antybiotyku kedarcydyny o następującej charakterystyce: (a) wygląd: jasnożółta, stała substancja; (b) ciężar cząsteczkowy: 12.400 daltonów według metody wykorzystującej elektroforezę na żelu SDS-poliakryloamidowym, 17.000 według metody opartej na filtracji molekularnej na żelu i HPLC; (c) widmo UV: jak pokazano na figurze, (d) punkt izoelektryczny: 3,65; (e) zawiera polipeptyd o następującej sekwencji aminokwasów:

   X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leuala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-glyphe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gin-cys-alaile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-gluphe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thrser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-metpro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp~cys-asp-thrala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gły-gly-asn-thrgly-glu-tyr-gly-i&>n-ala-ala-ile-ser-phe-gJy-OH, w którym X oznacza grupę H-ala-ser, grupę H-ser lub atom wodoru, znamienny tym, że szczep Streptoalloteichus wytwarzający kedarcynę hoduje się w pożywce zawierającej przyswajalne źródła węgla i azotu, w warunkach hodowli podpowierzchniowej, a następnie izoluje się antybiotyk z brzeczki fermentacyjnej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep produkujący antybiotyk stosuje się szczep L585-6, ATTC 53650.