PT99118B - Processo de preparacao de protease de interleucina 1b,de inibidores da protease de interleucina 1b e de composicoes farmaceuticas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ÂMBITO TÉCNICO DO INVENTO

Este invento refere-se a uma enzima, protease de interleucina 1β (IL-lj8 pro), apresentando actividade biológica para clivar polipéptidos de percursor de interleucina 1β (IL-10) inactivos nos polipéptidos de IL-ljB madura activa. Mais especificamente, o invento refere-se a um polipéptido de IL-ljS pro isolado e seus derivados que são capazes de clivar uma sequência de aminoácidos particular, incluindo a sequência de aminoácidos do terminal N da IL-Ιβ humana. O presente invento ainda se refere a um grupo de compostos que podem inibir a actividade da IL-10 pro e, consequentemente, actuarem como antagonistas da IL-1.

SUMÁRIO DO INVENTO presente invento dirige-se a um polipéptido isolado possuindo actividade proteolítica para um sítio de clivagem específico da protease, no qual a actividade da protease é específica para um péptido substrato possuindo uma sequência de aminoácidos que compreende:

R*L — Asp — R‘2 ^3 na qual R-^ e R₃ são, independentemente um do outro, qualquer isómero D ou L de aminoácido, R₂ é Ala ou Gly, e na qual o sítio de clivagem específico da protease se encontra entre Asp e R₂· Preferivelmente, o péptido substrato tem um comprimento de, pelo menos, oito aminoácidos. 0 polipéptido isolado é denominado protease de interleucina 1β (IL-ljS pro) dado que cliva o polipéptido de precursor de IL-lj3 para originar o polipéptido de IL-1j8 madura num sítio de clivagen entre os resíduos de Asp 116 e de Ala 117.

presente invento compreende ainda um vector de expressão recombinante compreendendo uma sequência de ADN isolada tal como aqui descrita e uma célula hospedeira a qual compreende o vector de expressão recombinante.

presente invento também fornece compostos inibidores da

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IL-10 peptídica substituída compreendendo uma sequência de aminoácidos de 1 a 5 aminoácidos, possuindo um grupo protector do terminal N e um resíduo de Asp no terminal C ligado a um grupo que se despede electronegativo. Preferivelmente, a sequência de aminoácidos corresponde a, pelo menos, uma porção da sequência de aminoácidos Ala-Tyr-Val-His-Asp.

Os compostos inibidores do presente invento possuem a fórmula:

Z-Q₂”Asp-Q₁ na qual Z é um grupo protector do terminal N; Q₂ é 0 a 4 aminoácidos de modo que a sequência Q₂-Asp corresponde a, pelo menos, uma porção da sequência Ala-Tyr-Val-His-Asp, os resíduos 112 a 116 da listagem da sequência I.D. N² 3; e Q-^ compreende um grupo que se despede electronegativo. Z é preferivelmente alquilC^-Cg cetona, benzilo, acetilo, alcoxicarbonilo, benziloxicarbonilo ou alquilC-L-Cg carbonilo. Mais preferivelmente, Z é t-butoxicarbonilo (t-Boc), acetilcarbonilo ou benziloxicarbonilo (Cbz).

Q-L é preferivelmente alquiloC₁-C₃, uma aldeído diazometilcetona ou halometilcetona. Mais preferivelmente, é uma aldeído ou fluorometilcetona.

presente invento fornece ainda inibidores da IL-1/3 pro reversíveis e irreversíveis. Os inibidores irreversíveis são compostos inibidores compreendendo uma sequência de aminoácidos de 1 a 5 aminoácidos possuindo um grupo protector do terminal N e um resíduo de Asp no terminal C ligado a uma diazometilcetona ou a uma halometilcetona, na qual a sequência de aminoácido corresponde a, pelo menos, uma porção da sequência Ala-Tyr-Val-His-Asp, os resíduos 112 a 116 da Seq. I.D. N^a 3.

Os inibidores da IL-lj8 pro reversíveis são compostos compreendendo uma sequência de aminoácidos de 1 a 5 aminoácidos possuindo um grupo protector do terminal N e um resíduo de Asp no terminal C ligado a uma porção aldeído, na qual a sequência de aminoácidos corresponde a, pelo menos, uma porção da sequência Ala73 146

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-4-Tyr-Val-His-Asp, os resíduos 112 a 116 da Seq. I.D. N⁸ 3.

presente invento também proporciona um processo de inibição das acções fisiológicas da interleucina 1β num mamífero necessitando do referido tratamento, compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz dos compostos inibidores do presente invento.

O presente invento proporciona ainda uma composição farmacêutica compreendendo um portador fisiologicamente aceitável e um composto inibidor do presente invento.

O presente invento proporciona ainda um método de tratamento da inflamação associada com a doença auto-imune num mamífero necessitando do referido tratamento, compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade anti-inflamatória eficaz de um composto inibidor do presente invento.

presente invento compreende ainda um método para tratamento da artrite, um método para tratamento de uma doença auto-imune num indivíduo susceptível, um processo para melhorar a cura de uma ferida, e um processo para reduzir os efeitos colaterais nocivos do tratamento com radiações. Todos os processos compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma protease de IL-lj8 isolada ou de um seu derivado biologicamente activo num portador farmaceuticamente adequado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Nos desenhos que constituem uma parte desta descrição:

A figura 1 representa a sequência de ADN (Seq. I.D. N⁸ 1) e a sequência de aminoácidos correspondente (Seq. I.D. N⁸ 2) para um polipéptido apresentando actividade biológica de IL-10 pro e correspondendo à IL-ljS pro madura humana ou a um seu fragmento biologicamente activo.

A figura 2 é a sequência de aminoácidos da preIL-1/? (Seq.

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I.D. N² 3), tal como publicada por March et colab., Nature (Londres), 315(6021):641-647 (1985). Os resíduos de aminoácido estão numerados (por baixo da sequência), começando com o iniciador metionina.

A figura 3 representa uma análise por transferência de Western de produtos produzidos pela IL-lj8 pro na presença e na ausência do inibidor da pro IL-10 Boc-Asp-CH₂F. Os produtos foram submetidos a SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose, e sondados com um anticorpo produzido contra o terminal COOH da IL-10 madura. Faixa 3, preIL-1/3 incubada com 25 μΜ de inibidor; faixa 4, preIL-10 incubada com 10 μΜ de inibidor; faixa 5, preIL-10 incubada com 5 μΜ de inibidor; faixa 6, prelL-ljS incubada com 1 μΜ de inibidor.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

X· Protease da interleucina 16

Utilizando os procedimentos da reacção em cadeia de polimerase (PCR) e outras técnicas, isolou-se, purificou-se, caracterizou-se e foi expresso um polipéptido de IL-lj8 pro de mamífero e seus fragmentos activos.

A disponibilidade de quantidades abundantes de um enzima IL-ljS pro recombinante permitiu ainda conseguir compostos inibidores capazes de inibirem a actividade da IL-l/J pro e, consequentemente, actuarem como antagonistas da IL-1. Além disso, a utilização de IL-1/3 pro tem actividade agonista da IL-1. Assim, o invento refere-se a polipéptidos de IL-1/3 pro de mamífero, e seus derivados, análogos e variantes alélicas, possuindo actividade proteolítica para um péptido substrato possuindo uma sequência de aminoácidos que compreende:

R^ ^— Asp — R₂ — Rg na qual R-j^ e R₃ são, independentemente um do outro, qualquer isómero D ou L de aminoácido, R₂ é Ala ou Gly, e na qual o sítio de clivagem específico da protease se encontra entre Asp e R₂. Preferivelmente, o péptido substrato tem um comprimento de, pelo

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2108 menos, oito aminoácidos.

Mais preferivelmente, R₂ é Gly. A IL-1/3 pro de mamífero é preferivelmente uma IL-1/3 pro humana e apresenta especificidade de substrato para um péptido substrato possuindo a sequência de aminoácidos aqui descrita. Preferivelmente, o polipéptido de IL-1β pro humana ou um seu derivado, é um polipéptido apresentando actividade biológica que cliva o polipéptido de precursor de IL-l/S humana para produzir o polipéptido de IL-1/3 madura humana.

A IL-1/3 pro é ainda caracterizada pelo ADNc (Seq. I.D. N² 1) e pela sequência de aminoácidos (Seq. I.D. N² 2) na Figura 1. A IL-1β pro de comprimento total (precursora) compreende 404 aminoácidos. A IL—1/3 pro purificada inicia-se com a sequência Asn-Pro-Ala-Met-Pro começando com o aminoácido 120. Com base numa análise de massa molecular, o terminal C aproximado da IL-1/8 madura situa-se aproximadamente no aminoácido 297. Contudo, a determinação da massa molecular indica que o terminal C da enzima madura se situa desde, aproximadamente, o aminoácido 278 até, aproximadamente, ao aminoácido 315. 0 presente invento compreende um polipéptido de IL-1/3 pro isolado, ou um seu derivado, análogo ou variante alélica, exibindo actividade biológica para clivar proteoliticamente um polipéptido de precursor de IL-l/8 humana num sítio de clivagem entre os resíduos de Asp 116 e de Ala 117. Para os objectivos deste pedido, o termo IL-ljS pro” deverá englobar a sequência de aminoácidos representada na figura 1, mais todas as variantes alélicas, derivados, análogos e fragmentos desta sequência que exibam actividade biológica e IL-1/8 pro.

A actividade biológica de IL-1/8 pro é determinada, por exemplo, por ensaio da actividade de IL-1 com um polipéptido de percursor de IL-1/8. O precursor de IL-1/8 é inactivo, enquanto que a IL-1/3 madura é um polipéptido de IL-1 activa. Um processo para medição da actividade de IL-1/3 pro encontra-se descrito em Black e colab. II. Resumidamente, este processo fornece aproximadamente cinco microlitros de precursor de IL-1/3 (preIL-1/8) (10-50 /xg/ml preparados como descrito em Black e colab. I) incubados com 10 μΐ do polipéptido de IL-1/3 pro ou com

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outra substância suspeita de apresentar actividade biológica de IL—lg pro. A incubação prossegue durante aproximadamente uma hora a aproximadamente 37'C, e é concluída pela adição de 15 gl de tampão de amostra 2 X SDS seguida por ebulição durante cinco minutos. A amostra fervida é submetida a electroforese sobre gel de poliacrilamida-SDES e colocada para uma transferência de Western utilizando um anticorpo monoclonal específico para o terminal C da IL-1/3, tal como 16F5 descrito em Black e colab. I.

A figura 1 também representa uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de 404 aminoácidos apresentando actividade biológica de IL-lj8 pro. O presente invento ainda compreende uma sequência de ADN isolada codificando a IL-l/J pro ou um seu derivado, análogo ou variante alélica, exibindo actividade biológica para clivar proteoliticamente um polipéptido de precursor de IL-1β humano num sítio de clivagem entre os resíduos de Asp 116 e de Ala 117. A sequência de ADN isolada é seleccionada de entre o grupo constituído pelas sequências de nucleótidos da figura 1, iniciando-se no nucleótido 1 e prolongando-se até ao nucleótido 1232, iniciando-se no nucleótido 374 e prolongando-se até ao nucleótido 1232, iniciando-se no nucleótido 374 e prolongando-se até um nucleótido desde aproximadamente 851 a aproximadamente 962, sequências de ADN estas que hibridam de forma detectável com a sequência da figura 1 do nucleótido 1 ao nucleótido 1232, e codificam um polipéptido exibindo actividade biológica para clivar proteoliticamente um polipéptido de precursor de IL-10 humana num sítio de clivagem entre os resíduos de Asp 116 e de Ala 117, e sequências de ADN estas que, dada a degenerescência do código genético, codificam um polipéptido de IL-lj8 pro de mamífero codificado por qualquer uma das sequências ou inserções do ADN precedentes.

As sequências de ADN do invento que hibridam de forma detectável com a sequência de nucleótidos da figura 1, do nucleótido 1 ao nucleótido 856, hibridam sob condições de elevado ou forte rigor. As condições de elevado ou forte rigor compreendem, por exemplo, a hibridação durante toda a noite a cerca de 68°C numa solução de 6 X SSC, seguida pela lavagem a cerca de 68°C numa

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solução de 0,6 X SSC.

Os oligonucleótidos anti-sentido (podem ser sintetizados por técnicas de fosfodiéster convencionais, tais como por Synthecell, Rockville, MD) que são complementares a regiões únicas de, pelo menos, 18 bases no codão de iniciação (TACCGGCTGTTCCCAGGAC, Seq. I.D. N^a 4) ou (TACCTATTCTGGGCTCGA, Seq. I.D. N^a 5) complementares das bases 18-36 e 168 a 196, respectivamente, na figura 1, no terminal N da IL-10 pro madura (TTGGTCGATACGGGTGT, Seq. I.D. N^a 6) complementares das bases 374 a 392 na figura 1, no terminal C aproximado após clivagem pela protease (CACCACACCAAATTTCTA, Seq. I.D. N^a 7) complementar das bases 890 a 908 na figura 1, ou numa região imediatamente 5' em relação ao codão de terminação (ATGGAGAAGGGTCCTGTA, Seq. I.D. N^a 8) complementar das bases 1205 a 1229 na figura 1. A estrutura primária dos aminoácidos da Il-ΐβ pro ou de um seu fragmento activo pode ser modificada por formação de conjugados agregantes ou covalentes com outras porções químicas, tais como grupos glicosilo, lípidos, fosfatos, grupos acetilo e similares, ou por criação de mutantes ou derivados da sequência de aminoácidos. Os derivados covalentes da IL-lj8 pro são preparados por ligação de grupos funcionais particulares a cadeias laterais de aminoácidos da IL-lj8 pro ou ao terminal N ou terminal C do polipéptido de IL-Ιβ pro.

Outros derivados da IL-1/3 pro dentro do âmbito deste invento incluem conjugados agregantes ou covalentes da IL-lj8 pro ou dos seus fragmentos com outras proteínas ou polipéptidos, tal como por síntese em cultura recombinante como fusões do terminal N ou do terminal C. Por exemplo, o polipéptido conjugado pode ser um sequência polipeptídica de sinal (ou de comando) na região do terminal N polipéptido da IL-1/3 pro o qual comanda, concomitantemente com a tradução ou após a tradução, a transferência do polipéptido de IL-10 pro do seu sítio de síntese para um sítio dentro ou fora da parede ou membrana celular (por ex., o comando do factor α de levedura). As fusões do polipéptido de IL-1/7 pro podem compreender polipéptidos adicionados para facilitar a purificação e identificação da IL-lj8 pro (por ex., poli-His). Além disso, a sequência de aminoácidos da IL-lj8 pro

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2108 -9pode ser ligada ao péptido Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (Hopp e colab., BioTechnoloqy 6:1224 (1988)), o qual é uma sequência altamente antigénica e proporciona um epítopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal específico para permitir a análise rápida e a purificação fácil do polipéptido recombinante expresso. Esta sequência de comando específica é clivada pela enteroquinase de mucosa de bovino no resíduo imediatamente a seguir ao emparelhamento Asp-Lys. Adicionalmente, os polipéptidos de fusão possuindo esta sequência de comando no seu terminal N podem ser resistentes à degradação em células hospedeiras de E. Coli.

O presente invento ainda inclui polipéptidos de IL-1/3 pro com ou sem glicosação de padrão nativo associada. A IL-1/3 pro expressa num sistema de expressão de mamífero ou levedura (por ex., células COS-7) pode ser semelhante ou significativamente diferente em massa molecular e padrão de glicosação do polipéptido de IL-1/3 pro humana nativa. Isto depende da escolha do sistema de expressão. A expressão de polipéptidos de IL-1/3 pro em sistemas de expressão bacterianos, tal como E. Coli proporciona moléculas não glicosadas.

Os análogos mutantes funcionais da IL-1/3 pro humana podem ser sintetizados, por exemplo com sítios de N-glicosação inactivados, por síntese de oligonucleótidos e ligação ou por técnicas de mutagénese específicas de sítio. Os derivados da IL-l/B pro podem ser expressos na forma de hidrato de carbono reduzido, homogéneo, utilizando sistemas de expressão de levedura. Os sítios de N-glicosação em polipéptidos eucariotas são caracterizados por um tripleto de aminoácidos Asn-Φ-Ω, no qual Φ é qualquer aminoácido excepto Pro e Ω é Ser ou Thr. Nesta sequência, os resíduos de hidrato de carbono estão covalentemente ligados à cadeia lateral Asn.

Os derivados ou análogos da IL-lj8 pro também podem ser obtidos por mutações da sequência de ADN da 11-1)3 pro. Um derivado mutante da 11-1/3 pro, tal como aqui referido, é um polipéptido substancialmente homólogo à IL-1/3 pro mas o qual possui uma

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sequência de aminoácidos diferente da 11-10 pro nativa por causa da delecção, inserção ou substituição.

A IL-10 pro é expressa a partir de um gene de mamífero, presumivelmente codificado por um ou mais genes de multi-exões. 0 presente invento ainda inclui construções de ARNm alternativas, as quais podem ser atribuídas a acontecimentos de união do ARNm diferentes após a transcrição, e as quais partilham regiões de identidade ou semelhança com os ADNc aqui descritos.

Os análogos bioequivalentes dos polipéptidos de IL-10 pro (definidos como os polipéptidos que apresentam actividade biológica da 11-10 pro) podem ser construídos, por exemplo, por execução de várias substituições de sequências de resíduos de aminoácido, ou por delecção de sequências ou resíduos terminais ou internos não necessários para a actividade biológica. Por exemplo, os resíduos de Cys podem sofrer delecção ou ser substituídos por outros aminoácidos para evitar a formação de pontes dissulfureto intramoleculares incorrectas após renaturação. Outras abordagens da mutagénese envolvem a modificação de resíduos de amino-ácidos dibásicos para aumentar a expressão em sistemas de leveduras nos quais está presente a actividade da protease KEX2.

Na generalidade, as substituições são feitas de forma conservativa por substituição com um aminoácido que possua características fisioquímicas semelhantes às do resíduo substituído. Substituições adicionais podem situar-se fora da sequência núcleo” necessária para a actividade biológica da IL-10 pro. Podem ser construídas subunidades da IL-10 pro por delecção de sequências ou resíduos terminais ou internos. O polipéptido resultante deve apresentar actividade biológica de IL-10 pro tal como aqui definida.

Os termos IL-10 pro, protease de 11-10 humana incluem, mas não estão limitados a análogos ou subunidades da IL-10 pro que sejam substancialmente semelhantes à IL-10 pro humana e/ou que exibam actividade biológica proteolítica específica do subs-

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trato associada com IL-Ιβ pro tal como aqui descrito.

termo substancialmente semelhante, quando utilizado para descrever sequências de aminoácidos, significa que uma sequência particular pode divergir de uma sequência de referência descrita por uma ou mais substituições, delecções ou adições. No entanto, o efeito final é a mesma actividade biológica de protease caracterí stica do polipéptido de IL-Ιβ pro humana de referência. Por exemplo, um derivado pode possuir uma sequência truncada compreendendo uma região do núcleo ou uma sequência de aminoácidos necessária para a actividade biológica de protease específica caracteristica da IL-1/3 pro. Os derivados da Il-ljS pro substancialmente semelhantes serão mais do que 30% semelhantes à sequência correspondente da IL-ljS pro humana e apresentarão actividade biológica de Il-lj8 pro. Os polipéptidos possuindo sequências de aminoácidos com graus de semelhança menores mas com actividade biológica comparável (incluindo especificidade de substrato) são considerados como sendo equivalentes. Mais preferivelmente, os polipéptidos derivados possuirão homologia da sequência de aminoácidos em relação ao polipéptido de iL-ljS pro humana superior a 80%.

A percentagem da semelhança pode ser determinada, por exemplo, por comparação da informação da sequência utilizando um programa de computador GAP, versão 6.0, disponível de University of Wisconsin Genetics Computer Group. O programa GAP utiliza o método do alinhamento de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol, 48:443 (1970)), tal como revisto por Smith e Waterman FAdv. Appl. Math., 2:482 (1981)]. Resumidamente, o programa GAP define a semelhança como o número de símbolos alinhados que são semelhantes, dividido pelo número total de símbolos na mais curta das duas sequências. Os parâmetros comuns preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação pesada para os aminoácidos [Ver, Schwartz e Dayhoff, ed. Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-58 (1979)]; (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo; e (3) nenhuma penalidade para os intervalos das extremidades.

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Biologicamente activo, tal como aqui utilizado, refere-se à actividade biológica de IL-10 pro para clivar uma sequência de aminoácidos particular na ligação peptídica entre o resíduo de Asp e um resíduo de Ala ou Gly.

Recombinante, tal como aqui utilizado, significa que um polipéptido deriva de sistemas de expressão recombinantes (por ex., microbianos ou de mamífero). Microbiano refere-se a sistemas de expressão de bactérias ou fungos (por ex., leveduras). Como um produto, microbiano recombinante define um polipéptido produzido num sistema de expressão microbiano, o qual é substancialmente isento de substâncias endógenas nativas. Os polipéptidos expressos na maior parte dos sistemas de expressão bacterianos (por ex., E. Coli) estarão isentos de glicanos. Os polipéptidos expressos numa levedura podem possuir um padrão de glicosação diferente daquele expresso nas células de mamífero.

A protease IL-ljS pro possui uma especificidade de substrato altamente limitada. 0 polipéptido de precursor de IL-ljS humano possui uma sequência de aminoácidos His-Asp-Ala-Pro nos resíduos 115-118. A IL-10 pro humana cliva esta sequência entre os resíduos 116 e 117 (Asp-Ala) para formar o polipéptido de IL-10 maduro humano. A alteração do Asp-116 por Ala num polipéptido de precursor de IL-ljS humana por mutagénese dirigida ao sítio evita a clivagem do derivado do polipéptido de IL-lj8 mutante.

A IL—1/3 pro humana isolada foi capaz de clivar no seu sítio específico no substrato mesmo quando a estrutura terciária do polipéptido de precursor de IL-1/3 substrato foi alterada por desnaturação do polipéptido substrato em água em ebulição. A IL-10 humana precursora foi desnaturada por ebulição de uma solução de precursor de IL-10 durante quinze minutos. A desnaturação teve pouco efeito sobre a capacidade da IL-ljS pro humana de clivar o precursor de IL-10 humana na IL-Ιβ madura. Assim, a estrutura terciária do polipéptido substrato não contribui significativamente para a recção com a enzima IL-l/S pro.

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A actividade biológica de 11-1)8 pro foi determinada por um ensaio de protease. Dado que a enzima IL-lj8 pro é sensível aos sais, as amostras possuindo uma concentração de sais superior a 50 mM foram inicialmente dessalifiçadas. As amostras podem ser dessalifiçadas, por exemplo, por aplicação de 100 μΐ de amostra a uma coluna Biogel P-6DG (Bio-Rad) de 1 ml pré-centrifugada, a qual estava equilibrada em Tris-HCl 10 mM, ditiotreitol 5 mM, pH 8,1, e por centrifugação durante 5 minutos a 1876 x g. O ensaio foi conduzido por incubação de uma mistura de cinco μΐ (30 ng) de precursor de IL-1/3 humano purificado e 10 μΐ da amostra a ser testada quanto à actividade biológica de protease da IL-1)S, durante 60 minutos a 37°C. A amostra de controlo foi incubada de forma semelhante para a ensaiar quanto a IL-1 endógena. A mistura da amostra de controlo continha 5 μΐ de Tris-HCl 10 mM, pH 8,1 e ditiotreitol 5 mM em vez do precursor da IL-lj8. As incubações da amostra de controlo foram concluídas pela adição de SDS (dodecilsulfato de sódio) em tampão de amostra, seguida por cinco minutos de ebulição.

Todas as misturas de ensaio incubadas foram submetidas a electroforese em geles de poliacrilamida a 14% SDS, com 0,75 mm de espessura, em tiras utilizando um sistema descontínuo, tal como aquele descrito em Laemmli, Nature. 277:680 (1970). As transferências de Western foram executadas após a electroforese por transferência das proteínas para nitrocelulose (Sartorius) e sondagem utilizando uma solução de 20 /ig/ml de anticorpo monoclonal específico para o terminal COOH da IL-l/?, purificado, (isto é, 16F5). A transferência foi revelada utilizando Reagente de Revelação da Cor de Peroxidase de Rábano Silvestre (Bio Rad). Cem ng de Il-lj8 madura purificada foram utilizados como um marcador de 17500 dalton de controlo na transferência de Western.

A enzima IL-ljS pro humana foi obtida e purificada a partir de células THP-1 disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC). Foram cultivados aproximadamente 120 litros de células e, de seguida, foram estimulados durante 16 horas com lipossacárido, hidroxi-ureia e sílica, tal como descrito em Matsushima, Biochemistrv. 25:3424 (1986). As células foram recolhidas por centrifu73 146

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gação, lavadas em solução salina equilibrada de Hank e, de seguida, centrifugadas. As células foram ressuspensas em Tris-HCl 10 mM, ditiotreitol 5 mM, pH 8,1, a uma densidade de 10⁸/ml. As células suspensas foram congeladas e descongeladas três vezes, e os lisados foram armazenados a -80°C até à sua utilização posterior. Antes da purificação, os lisados foram descongelados e, em seguida, centrifugados durante 20 minutos a 47800 x g a 4^eC. 0 sobrenadante foi retirado para purificação adicional. O processo de congelação-descongelação repetido quatro vezes libertou mais de 50% da actividade de IL-10 pro para o sobrenadante. Congelações-descongelações adicionais não aumentaram o rendimento do material solúvel.

O polipéptido IL-l/J pro humana foi purificado num processo de seis passos descrito abaixo. Todos os passos de cromatografia foram executados a 4°C utilizando um sistema FPLC de Pharmacia. Os geles de DEAE - Sephacel. Hydroxypatite e Blue Agarose foram pré-tratados com Triton X-100 a 0,1% e soro fetal de bovino a 10% para impedir a absorção não-específica de proteínas nos geles. Além disso, a coluna de Blue Agarose, foi lavada com ureia 8M para remover todo o corante - absorvido não covalentemente.

1. Aproximadamente 500-600 ml de sobrenadante do lisado foram diluídos a 1:2 em Tris-HCl 10 mM e ditiotreitol 5 mM, pH 8,1 (tampão A) para reduzir a força iónica do lisado para <20 mM. 0 pH foi ajustado até 8,1. 0 sobrenadante do lisado diluído foi aplicado a uma coluna de DEAE-Sephacel (20 x 4,4 cm, Pharmacia Fine Chemicals), equilibrada com o tampão A. 0 caudal era de 120 ml/hora. A coluna foi lavada com dois volumes de coluna do tampão A e, em seguida, foi eluida com um gradiente linear (3 volumes de coluna) de NaCl, variando desde 0 a 300 mM, em tampão A. Foram recolhidas fracções de quinze ml, analisadas quanto à actividade de IL-l/J pro e armazenadas para purificação posterior. A actividade de IL-10 pro foi eluida com NaCl entre 0,07 e 0,13 M. Este passo removeu 79% das proteínas contaminantes. A maior parte das proteínas contaminantes eluiu entre NaCl 0,15 e 0,25 M. Este passo foi ainda útil na remoção parcial de 11-10 madura endógena a qual eluiu com NaCl entre 0,06 e 0,11 M, e de IL-10 precursora

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Sterling-Immunex jss* 2108 -15endógena a qual eluiu com NaCl entre 0,12 e 0,18 M.

2. As fracções activas combinadas da coluna de DEAE foram diluídas em tampão de fosfato de potássio 50 mM, ditiotreitol 5 mM, pH 7,0 (tampão B). Uma coluna de 14 x 3 cm de Hydroxyapatite (HA Ultrogel, IBF Biotechnics) foi equilibrada com tampão B. As fracções diluídas foram aplicadas à coluna de Hydroxyapatite equilibrada a um caudal de 60 ml/hora. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de tampão Be, de seguida, foi eluída com um gradiente linear (4 volumes de coluna) de fosfato de potássio variando desde 50 a 200 mM. As fracções foram recolhidas como volumes de 10 ml, analisadas quanto à actividade de IL-lj8 pro, e armazenadas para purificação posterior. A IL-Ιβ pro eluiu com fosfato de potássio entre 0,085 e 0,113 M. Quarenta por cento dos polipéptidos contaminantes eluiram antes da protease e 40% eluiram depois da protease. Além disso, a IL-Ιβ madura endógena eluiu com fosfato de potássio entre 0,05 e 0,08 M.

3. Uma coluna de Blue Agarose de 20 x 1,6 cm (Gibco-BRL) foi equilibrada com o tampão A. As fracções da coluna de Hydroxyapatite com actividade foram diluídas a 1:3 em tampão A para reduzir a força iónica para 30 mM. Isto foi necessário a fim de permitir a ligação da IL-10 pro à coluna. As fracções diluídas foram aplicadas à coluna de Blue Agarose a um caudal de 30 ml/hora. A coluna foi lavada com três volumes de coluna do tampão A. As proteínas foram eluídas com cinco volumes de coluna de um gradiente linear de NaCl, variando desde 0,1 a 1 M em tampão A. Foram recolhidas fracções de dez ml, analisadas quanto à actividade de II-1β pro e armazenadas para purificação posterior. A IL-1/3 pro foi eluída com NaCl entre 0,5 e 0,68 M. Oitenta por cento das proteínas contaminantes foram removidas neste passo, com 20% eluindo precocemente e as restantes 60% permanecendo ligadas à coluna.

4. Uma coluna de Sephadex G-75 de 95 x 2,5 cm (Pharmacia Fine Chemicals) foi equilibrada em tampão A, e inicialmente calibrada com ferritina (MM 400 000), ovalbumina (MM 43 000), inibidor de tripsina de soja (MM 20 000) e DNP-ácido aspártico (MM 300). As fracções da coluna de Blue Agarose contendo actividade

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-16de protease foram reunidas e concentradas num aparelho para concentração Centriprep-10 (Amicon) até um volume de aproximadamente 2 ml e, de seguida, foram aplicadas à coluna de Sephadex G-75. As proteínas foram eluídas com tampão A a um caudal de 20 ml/hora. Foram recolhidas fracções de quatro ml, e as fracções contendo actividade de protease foram reunidas para purificação adicional. A actividade de IL-l/J pro eluiu com entre 196 e 220 ml. Esta posição é idêntica à posição de eluição do inibidor de tripsina de soja, o que sugere que a IL-ljS pro humana possui uma massa molecular de cerca de 20 000 dalton. Este passo removeu mais de 90% das proteínas contaminantes da preparação. Assim, pelo passo de Sephadex, mais de 99,8% dos contaminantes proteicos iniciais foram separados da IL-1/3 pro. No entanto, a análise da PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida) das fracções ainda revelou diversas bandas proteicas que não se correlacionavam com a actividade biológica de IL-1/3 pro.

5. As fracções da coluna de Sephadex que continham actividade de protease foram reunidas, e a combinação foi concentrada em aparelhos para concentração Centriprep 10 pré-tratados até um volume de 500 μΐ. Dado que a concentração proteica da combinação de Sephadex era baixa (<30 ^g/ml), o pré-tratamento dos Centripreps com albumina de soro bovino reduziu a perda de actividade de IL-l/J pro durante a concentração. A lavagem extensiva dos Centripreps tratados antes da utilização impediu a contaminação das amostras com albumina. 0 pré-tratamento foi conseguido por centrifugação de 15 ml de albumina de soro bovino (BSA) a 1% em Centripreps durante 30 minutos, decantação da solução remanescente e lavagem com Tris-HCL 10 mM. Uma coluna de cromatofocagem Mono P5/20 FPLC (Pharmacia Fine Chemical) foi equilibrada com tampão de Tris-acetato 25 mM e ditiotritol 5 mM, pH 8,3. A solução concentrada foi misturada (1:1 v/v) com 500 μΐ de Tris-acetato 25 mM e ditiotritol 5 mM, pH 8,3, e aplicada a uma coluna FPLC de Mono P5/20. As proteínas foram eluídas com Polybuffer 96:Polybuffer 74 (3:7), pH 5,0 (Pharmacia) a um caudal de 15 ml/hora. Foram recolhidas fracções de 1 ml e analisadas quanto ao pH e à actividade biológica de protease. Este passo de cromotofocagem aumentou a pureza da IL-1/3 pro em mais 100 vezes

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/

X Íf

e permitiu a visualização de uma única banda proteica que se correlacionou com a actividade biológica de IL-10 pro. A IL-10 pro eluiu para fora da coluna de cromatofocagem entre pH 6,95 e 6,70. As fracções foram concentradas em aparelhos para concentração Centricon 10 (Amicon) pré-tratados com BSA de 1 gl a 50 gl.

6. As fracções foram submetidas a electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), seguida por electro-transferência para papel de membrana de poli(diflureto de vinilo) (PVDF, Millipore Immobilin-P^R) a 300 mA durante 30 minutos. A membrana de PVDF foi corada com azul de Coomassie. Existiam cinco bandas principais com massas moleculares de aproximadamente 45 000, 43 000, 36 000, 22 000 e 18 000 dalton. A banda de 22 000 dalton correlacionou-se com a actividade de IL-10 pro e foi sequenciada.

A sequência do terminal N da banda de 22 000 dalton produziu uma sequência de aminoácidos aqui descrita. Um ADNc da IL-10 pro humana madura, ou um seu fragmento activo, foi clonado utilizando esta sequência de aminoácidos do terminal N e um procedimento de reacção em cadeia de polimerase (PCR) em três passos. No primeiro passo do processo de PCR foram concebidos, iniciadores da PCR completamente degenerados e foram preparados a partir da sequência de aminoácidos do terminal N. Os iniciadores degenerados foram utilizados para amplificar as sequências específicas da IL-ljS pro a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de ARNm de células THP-1. Foi construída uma biblioteca de ADNc de THP-1 de primeira cadeia iniciada aleatoriamente, de acordo com as instruções do fornecedor (Amersham). Uma amplificação iniciada por oligonucleótido mistos foi realizada de acordo com o processo descrito em Lee e colab., cDNA Cloning Using Degenerate Primers em PCR Protocols (Innis, Gelfand, Sninsky e White ed.) Academic Press, Inc. New York, págs. 46-53 1990. 0 iniciador #1 foi concebido para hibridar de modo cruzado com o ADN da IL-l/J pro (nucleótidos 1-17) e para conter um sítio de restricção Eco RI. O iniciador #1 possuia a sequência:

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5·-GTCGAATTCAA(T/C)CCNGCNATGCCNAC-3' (Seq. I.D. N^a. 9).

O iniciador #2 foi concebido para hibridar de modo cruzado com o ADN da IL-ljS pro (complementar aos nucleótidos 31-47) e para conter um sítio de restricção Xba I. O iniciador #2 possuia a sequência:

5'-GTCTCTAGAAG(T/C)TTNAC(A/G)TTNCC(T/C)TC-3' (Seq. I.D. N^ffl. 10).

A amplificação por PCR foi efectuada com plimerase de thermus aquatius (Perkin-Elmer Cetus) em 100 μΐ de tampão durante 30 ciclos tal como descrito em Lee e colab., abaixo. Foi obtido um fragmento amplificado de 63 pb a partir da amplificação por PCR. Este fragmento amplificado foi sub-clonado num vector pGem-4 (Promega). A análise da sequência do ADN de 10 isolados indicou que este fragmento codificou os primeiros 16 aminoácidos do terminal N da IL-lj8 pro tal como determinado por purificação e análise da sequência do terminal N.

segundo passo do processo de PCR preparou o iniciador #3 composto pelos nucleótipos 1-17 (Figura 1) e um sítio de restricção Not I e o iniciador #4 contendo 20 resíduos T e um sítio de restricção Not I. Os iniciadores #3 e #4 foram adicionados à biblioteca de ADNc de THP-l descrita anteriormente e amplificados por PCR durante 6 ciclos a 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. A análise de Southern do clone amplificado por PCR utilizando um vector de oligonucleotídicos de 17 bases (complementar aos nucleótidos 16-32 na Figura 1) encontrou uma banda de aproximadamente 1000 pb que também se verificou possuir actividade biológica de IL-1/3 pro. 0 ADN de 1000 pb foi purificado em gel, submetido a uma segunda série de PCR semelhante e subclonado num pGem-5 para sequenciação. A sequência de nucleótidos deste clone está representada na Figura 1.

No terceiro passo da clonagem por PCR, clones de IL-lj8 pro de comprimento total foram isolados a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de neutrófilos de sangue periférico.

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-19Verifiçámos que os neutrófilos expressavam ARNm de IL-10 pro. Isolaram-se dois clones (p48 e p214) com inserções específicas de IL-10 pro de 1367 e 1360 pares de bases, respectivamente. A sequência de ADN mostrada na Figura 1 é uma composição de todos os clones de IL-ljS pro. Verificou-se que os aminoácidos codificados por todos os clones de IL-lj8 pro eram idênticos.

ADNc da IL-ljS pro tem aproximadamante 1373 pares de bases de comprimento, incluindo um trecho de nucleótidos A correspondentes à cauda poli (A) do ARNm. Estes resíduos A são precedidos por dois sinais de poli-adenilação, AATAA, nos pares de bases 1316 e 1335. A sequência tem uma estrutura de leitura aberta de 404 aminoácidos, iniciando-se com um codão Met iniciador no nucleótido 18 e terminando com um codão de terminação no nucleótido 1230. A iniciação da tradução também podia começar com um codão Met na estrutura no nucleótido 66. Ambos os codões Met iniciadores possuem sequências de iniciação da tradução de Kozak consensuais. Os polipéptidos iniciados com o resíduo Met na posição 51 também têm actividade biológica.

A IL-10 pro é uma enzima citoplasmática. Como o aminoácido do terminal N da enzima purificada é Asn (120), a protease sofre processamento do terminal N originando a remoção de 119 aminoácidos ou de 69 aminoácidos se é utilizado o codão iniciador alternativo. A análise da delecção indicou que pelo menos 107 aminoácidos são removidos do terminal C. Contudo, parece que é necessário o terminal C completo para uma dobragem adequada da protease antes de aproximadamente 107 aminoácidos do terminal C poderem ser removidos a fim de assegurar a actividade biológica da protease.

A sequência de ADN mostrada na Figura 1 foi expressa numa célula de mamífero (por ex., células COS-7). Para a expressão em células de mamífero, foram preparados iniciadores oligonucleotídicos sintéticos para amplificar todo o domínio de codificação da TL-l/J pro. 0 iniciador 5' (5'-ATATCGGTACCGCCTCCAGCATGCCTCCGGCAATGCCCACATC-3 ^z) (Seq. I.D. n² 11)

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continha um sítio de restricção Asp 718 e um resíduo Met inicia dor fundido ao terminal N do enzima (nucleótidos 1-20).

O iniciador 3' (5·-CTGCTAGATCTGCCCGCAGACATTCATACAG-3') (Seq. I.D. N^B 12) contém um sítio de restricção Bgl II e é complementar aos nucleótidos 883-902 da Figura 1. 0 fragmento produzido por PCR foi ligado no vector de mamífero pDC303, tal como descrito em Mosley e colab., Cell. 59:335-348 (1989).

A IL-10 pro humana é preferivelmente produzida por técnicas de recombinação do ADN. Um sistema de expressão do ADN recombinante insere um clone que codifica o polipéptido de IL-10 pro humano, ou um seu derivado com actividade biológica, num vector de expressão. 0 vector de expressão é inserido numa célula hospedeira. A maquinaria de síntese proteica da célula hospedeira sintetiza o polipéptido de IL-10 pro humano recombinante.

As células hospedeiras adequadas para expressão de polipéptidos de IL-10 pro de mamífero ou seus derivados incluem células procariotas, de levedura ou eucariotas superiores sob o controlo de promotores apropriados. Os procariotas incluem organismos gram negativos ou gram positivos, por exemplo E. coli ou bacilos. Células hospedeiras procariotas adequadas para transformação incluem, por exemplo, E. coli. Bacillus subtilis. Salmonella Typhimurium, e várias outras espécies dentro dos géneros Pseudomonas. Streptomvces e Staphvlococcus. Células eucariotas superiores incluem linhas de células determinadas com origem em mamíferos como descrito abaixo. Os sistemas de tradução isentos de células também podem ser empregues para produzir polipéptidos de IL-10 pro de mamífero e seus derivados, utilizando ARN derivados das construções de ADN aqui descritas. Vectores de expressão e clonação apropriados para utilização com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e de mamífero, encontram-se descritos, por exemplo, em Pouwels e colab., Clonlnq Vectors: A Laboratory Manual. Elsevier, New York, (1985).

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Quando um polipéptido de IL-1/8 pro ou um seu derivado é expresso numa célula hospedeira de levedura, a sequência nucleotídica (por ex., o gene estrutural) que codifica na expressão um polipéptido de IL-1/3 pro ou um seu derivado pode incluir uma sequência de comando. A sequência de comando permite a segregação extra-celular melhorada do polipéptido traduzido por uma célula hospedeira de levedura.

Alternativamente, numa célula hospedeira procariota, tal como E. coli. o polipéptido de IL-1/8 pro ou um seu derivado pode incluir um resíduo de metionina no terminal N para facilitar a expressão do polipéptido recombinante numa célula hospedeira procariota. A Met do terminal N pode ser clivada do polipéptido de IL-1/8 pro recombinante expresso ou de um seu derivado. Além disso, as células hospedeiras procariotas podem ser utilizadas para a expressão e o processamento de dissulfureto.

Os vectores de expressão recombinantes portadores da sequência nucleotídica do gene estrutural da IL-1/8 pro recombinante ou de um seu derivado são transfectados ou transformados numa cultura substancialmente homogénea de uma linha de células de mamífero ou microorganismos hospedeiras adequadas. Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem bactérias tais como E. coli. leveduras tais como S. cerevisiae. ou uma linha de células de mamífero tais como células de ovário de hamster chinês (CHO).

As células hospedeiras transformadas são células que foram transformadas ou transfectadas com sequências nucleotídicas do gene estrutural de IL-1/8 pro ou de um seu derivado. Os polipéptidos de IL-1/8 pro expressos estarão localizados dentro da célula hospedeira e/ou segregados para o sobrenadante da cultura, dependendo da natureza da célula hospedeira e da construção do gene inserido na célula hospedeira. Os vectores de expressão transfectados nas células hospedeiras procariotas geralmente compreendem um ou mais marcadores fenotípicos seleccionáveis. Um marcador fenotípico é, por exemplo, um gene codificando proteínas que conferem resistência a antibióticos ou que respondem a uma necessidade autotrófica e uma origem de replicação reconhecida pelo hospe73 146

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deiro para assegurara amplificação dentro do hospedeiro.

Outros vectores de expressão úteis para as células hospedeiras procariotas incluem um marcador selecoionável de origem bacteriana derivado de plasmídeos disponíveis comercialmente. Este marcador selecoionável pode compreender elementos genéticos do vector de clonação pBR322 (ATTC 37017). 0 pBR322 contém genes para a resistência à ampicilina e à tetraciclina e, deste modo, proporciona meios simples para a identificação das células transformadas. As secções do esqueleto do pBR322 são combinadas com um promotor apropriado e uma sequência do gene estrutural de IL-l/J pro. Outros vectores disponíveis comercialmente incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) e pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, EUA).

As sequências promotoras são comummente utilizadas para os vectores de expressão de célula hospedeira procariota recombinantes. As sequências promotoras comuns incluem /3-lactamase (penicilinase), sistema promotor de lactose (Chang e colab., Nature, 275:615, 1978; e Goeddel e colab., Nature, 281:544, 1979), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel e colab., Nucl. Acids Res, 8:4057, 1980; e EPA 36776) e promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pag. 412, 1982). Um sistema de expressão de célula hospedeira procariota particularmente útil emprega um promotor P^ de fago e uma sequência repressora termolábil cI875ts. Os vectores de plasmidícos disponíveis na American Type Culture Collection que incorporam derivados do promotor P_L incluem os plasmídeos pHUB2 (residente na estirpe de E. coli JMB9 (ATCC 37092) e pPLc28 (residente na E. coli RR1 (ATCC 53082)).

Os polipéptidos de IL-1/9 pro humanos e os polipéptidos derivados podem ser expressos em células hospedeiras de levedura, preferivelmente do género Saccharomvces (por ex., S. cerevisiae). Também podem ser empregues outros géneros de levedura, tais como Pichia ou Kluyveromvces. Os vectores de levedura conterão muitas vezes uma sequência de origem de replicação de um plasmídeo de levedura 2μ, uma sequência de replicação autónoma (ARS), uma

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região promotora, sequências para poli-adenilação e sequências para terminação da transcrição. Preferivelmente, os vectores de levadura incluem uma sequência de origem de replicação e um marcador seleccionável. As sequências promotoras adequadas para vectores de levedura incluem promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato-quinase [Hitzeman e colab., J. Biol. Chem., 255:2073 (1989)] ou outros enzimas glicolíticos [Hess e colab., J. Adv. Enzyme Reg.. 7:149 (1968); e Holland e colab., Biochem. 17:400, (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinasde. Outros promotores e vectores adequados para utilização na expressão de leveduras encontram-se descritos adicionalmente em Hitzeman, EP-A-73.657.

Os vectores de levedura podem ser construídos, por exemplo, utilizando sequências de ADN do pBR322 para selecção e replicação em E. coli (gene Amp^r e origem de replicação). Outras sequências de ADN de levedura que podem ser incluídas numa construção de expressão de levedura incluem um promotor ADH2 repressível pela glucose e um comando da segregação do factor a. 0 promotor ADH2 foi descrito por Russel e colab. Γ J. Biol. Chem.. 258:2674 (1982)] e Beier e colab. ΓNature. 300:724 (1982)]. A sequência de comando do factor a de levedura dirige a secreção de polipéptidos heterólogos. A sequência de comando do factor a encontra-se muitas vezes inserida entre a sequência promotora e a sequência do gene estrutural. [Ver, por ex., Kurjan e colab., Cell. 30:933, (1982); e Bitter e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 81:5330, (1984)]. A sequência de comando pode ser modificada perto da sua extremidade 3' a fim de conter um ou mais sítios de restricção. Isto facilitará a fusão de sequência de comando com o gene estrutural .

Os protocolos de transformação de leveduras são conhecidos dos peritos na arte. Um dos referidos protocolos encontra- -se descrito por Hinnen e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 75:1929 (1978). 0 protocolo de Hinnnen e colab. selecciona os r

-24Trp⁺ num meio selectivo, consistindo o referido em 0,67% de base azotada de levedura, 0,5% de ca2% de glucose, lO/xg/ml de adenina e 20 jig/ml de

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2108 transformantes meio selectivo saminoácidos, uracilo.

As células hospedeiras de leveduras transformadas pelos vectores contendo a sequência promotora ADH2 podem ser cultivados em termos da indução da expressão num meio rico. Um exemplo de um meio rico é aquele consistindo em 1% de extracto de levedura, 2% de peptona e 1% de glucose suplementado com 80 ^g/ml de adenina e 80 jug/ml de uracilo. A des-repressão do promotor ADH2 ocorre quando o meio fica esgotado em glucose.

Os sistemas de cultura de células hospedeiras de mamífero ou de insecto também podem ser empregues para expressar o polipéptido de IL-lj8 pro recombinante ou os seus derivados. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero, adequadas, incluem as linhas COS-7 de células de rim de macaco [Gluzman, Cell, 23:175 (1981)], células L, células C127, células 3T3, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa e linhas de células BHK. Os vectores de expressão de mamífero adequados incluem elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, uma sequência promotora, um intensificador ligado ao gene estrutural, outras sequências não transcritas flanqueadoras de 5' ou 3', tais como os sítios de ligação do ribossoma, um sítio de poli-adenilação, sítios aceitadores e dadores de união e sequências de terminação da transcrição.

As sequências de controlo da tradução e da transcrição em vectores de expressão de células hospedeiras de mamífero podem ser proporcionados por fontes virais. Por exemplo, as sequências intensificadoras e as sequências promotoras de células de mamífero comummente utilizadas são derivadas de Polioma, Adenovírus 2, Vírus Símio 40 (SV49) e citomegalovírus humano. As sequências de ADN derivadas do genoma virai de SV40, por exemplo, da origem de SV40, promotores precoces e tardios, intensificadores, de união, e sítios de poli-adenilação, podem ser utilizados para proporcionarem os outros elementos genéticos

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necessários para a expressão de uma sequência do gene estrutural numa célula hospedeira de mamífero. Os promotores virais precoces e tardios são particularmente úteis dado que são ambos facilmente obtidos a partir de um genoma virai como um fragmento o qual também pode conter uma origem de replicação virai [Fiers e colab., Nature. 273:113 (1978)]. Também podem ser utilizados fragmentos de SV40 menores ou maiores, desde gue esteja incluída a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende desde o sítio de Hind III até ao sítio de Bgll localizado no sítio de origem de replicação virai do SV40.

Além disso, podem ser utilizadas sequências promotoras de controlo e/ou de sinal de IL-10 pro genómicas de mamífero, desde que as referidas sequências de controlo sejam compatíveis com a célula hospedeira escolhida. Vectores ilustrativos podem ser construídos tal como descrito por Okayama e Berg ΓΜοΙ. Cell. Biol.. 3:280, (1983)].

Os polipéptidos de IL-10 pro humanos purificados ou os seus derivados são preparados por cultura das células hospedeiras transformadas sob as condições de cultura necessárias para expressar os polipéptidos de IL-10 pro ou os seus derivados. Os polipéptidos expressos são purificados a partir dos meios de cultura ou dos extractos celulares. Por exemplo, os sobrenadantes de células hospedeiras transformadas cultivadas podem segregar o polipéptido de IL-10 pro recombinante para os meios de cultura. 0 polipéptido de IL-10 pro ou o seu derivado é concentrado utilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Millipore Pellicon ou Amicon. Após o passo de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação. Por exemplo, uma matriz de purificação adequada é um inibidor da IL-10 pro ou uma molécula de anticorpo específica para um polipéptido de IL-10 pro ou um seu derivado e ligada a um suporte adequado. Alternativamente, pode ser empregue uma resina de permuta aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato possuindo grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser de acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos

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2108 habitualmente empregues na purificação de proteínas. Alternativamente, pode ser empregue um passo de permuta de cationica. Os permutadores catiónicos adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropilo ou carboximetilo. Os grupos sulfopropilo são preferidos.

Finalmente, um ou mais passos de cromatografia líquida de elevado rendimento de fase inversa (RP-HPLC) empregando meios de RP-HPLC hidrofóbicos, por ex., gel de sílica possuindo grupos metilo ou outros grupos alifáticos pendentes, podem ser empregues para purificação adicional de uma composição de polipéptido de IL-Ιβ pro. Alguns ou todos os passos de purificação precedentes, em várias combinações, também podem ser empregues para proporcionar uma proteína recombinante homogénea. Alternativamente, também podem ser empregues alguns ou todos os passos utilizados no processo de purificação aqui descrito.

polipéptido recombinante produzido em cultura bacteriana é geralmente isolado por ruptura inicial das células hospedeiras, extracção de um polipéptido insolúvel a partir das pelotas celulares ou de um polipéptido solúvel a partir do sobrenadante, seguida por um ou mais passos de concentração, separação por adição de sais, permuta iónica ou cromatografia por exclusão de tamanhos. Finalmente, a cromatografia líquida de elevado rendimento de fase inversa (RP-HPLC) pode ser empregue para os passos de purificação finais. As células microbianas podem ser rompidas por qualquer processo conveniente, incluindo ciclos de congelação-descongelação, sonicação, ruptura mecânica, ou utilização de agentes de lise celular.

As células hospedeiras de levedura transformadas expressam geralmente o polipéptido de IL-ljS pro como um polipéprito segregado. Isto simplifica a purificação. 0 polipéptido recombinante segregado a partir da fermentação de células hospedeiras de levedura pode ser purificado por procesos análogos aqueles descritos por Urdal e colab., [J. Chromatoq., 296:171 (1984)]. Urdal e colab. descrevem dois passos de HPLC de fase inversa, sequenciais, para a purificação de IL-2 humana

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recombinante numa coluna de HPCL preparativa

II. INIBIDORES DA PROTEÃSE DE INTERLEUCINA 16 isolamento e a caracterização da protease responsável pelo processamento do precursor de IL-l/J na sua forma biologicamente activa auxilia no planeamento de inibidores para o processamento de IL-1/8, dado que a disponibilidade de grandes quantidades de IL-1/3 pro serve como um veículo de selecção útil para se encontrarem compostos apresentando actividade antagonista da IL-l. Os referidos antagonistas da IL-1 ou inibidores da IL-1/8 pro são úteis para o tratamento da inflamação e da rejeição de transplantes.

Os inibidores do presente invento são compostos substituídos compreendendo uma sequência de aminoácidos de 1 a cerca de 5 resíduos de aminoácido, possuindo um grupo bloqueador do terminal N e um resíduo Asp no terminal C ligado a um grupo que se despede electronegativo, em que a sequência de aminoácidos corresponde a pelo menos uma porção da sequência Ala-Tyr-Val-His-Asp, sequência esta que representa a sequência dos resíduos 11 a 116 da pré IL-1/3.

A sequência de aminoácidos da pré IL-1/8 está apresentada na Seq. I.D. N^a 3 e na Figura 2 retirada de March, C.J. e colab., Nature (Londres), 315(6021):641-647 (1985). A IL-1/8 madura está representada pelos 153 resíduos de aminoácido do terminal C da pré IL-l/8. Assim, o terminal N da IL-1/8 é o resíduo de Ala na posição 117 da Seq. I.D. N² 3.

Os resíduos de aminoácido podem ser expressos pelo seu nome completo (por ex., alanina) ou pela designação de três letras (por ex., Ala). Este pedido utilizará a designação de três letras.

Os aminoácidos de ocorrência natural são os isómeros L e são, consequentemente, indicados sem qualquer designação isomérica (por ex., L ou D). Os isómeros D são, por conseguinte, indica73 146

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dos.

Tal como aqui utilizada, a frase corresponde a significa que a sequência particular de um composto inibidor pode diferir da sequência descrita por uma ou mais substituições conservativas desde que as referidas substituições não alterem materialmente a actividade inibidora dos compostos do presente invento.

Exemplos de substituições que não alteram materialmente a actividade inibidora são a substituição de Ala na posição 112 da Seq. I.D. N² 3 por Ser ou Gly; a substituição de Tyr na posição

113 da Seq. I.D. N² 3 por Phe; a substituição de Vai na posição

114 da Seq. I.D. por Leu, Ile ou Met; e a substituição de His na posição 115 da Seq. I.D. N^a 3 por Phe, Pro, um aminoácido carregado positivamente tal como Lys, Arg, His ou Tyr, ou a utilização de isómeros D.

resíduo de aminoácido no terminal C dos compostos inibidores do presente invento é o ácido aspártico (Asp). A Asp possui uma cadeia lateral de fórmula CH₂-COOH. Preferivelmente, o grupo carboxilo da cadeia lateral da Asp está protegido para facilitar a síntese dos compostos do presente invento.

Os grupos protectores da cadeia lateral da Asp incluem, por exemplo, uma porção benzilo, benzilo substituido, formilo, metilo ou t-butilo. Os substituintes benzilo aumentam a labilidade ácida da porção protectora da cadeia lateral da Asp. Benzilos substituídos de exemplo são 2,4,6-trimetilbenzilo e 4-metoxibenzilo.

Numa concretização preferida, a porção protectora da cadeia lateral de Asp está ligada à cadeia lateral da Asp por meio de uma ligação éster, ligação essa que é submetida a clivagem por enzimas esterase intracelulares de ocorrência natural. Desta forma, a Asp protegida com elevada solubilidade nos lípidos ganha acesso a uma célula e é clivada por uma esterase para originar uma Asp desprotegida, solúvel em água e carregada que permanece no citoplasma onde a IL-1/3 pro está predominantemente localizada.

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2108 -29Tal como aqui utilizada, a frase grupo bloqueador do terminal N refere-se a grupos químicos ligados ao grupo amino do resíduo de aminoácido do terminal N das sequências do presente invento. Os referidos grupos bloqueadores são bem conhecidos e são prontamente evidentes para os peritos na arte. The Peptides. ed. por Gross e Meienhofer, Academic Press, Nova Iorque, págs. 3-81 (1981). Os grupos bloqueadores do terminal N têm sido utilizados com outros tipos de inibidores da protease. Ver, por ex., Patentes dos E.U.A. N^as 4 652 552 e 4 636 492.

Tal como aqui utilizada, a frase grupo electronegativo que se despede refere-se a grupos químicos susceptíveis de ataque nucleofílico por um resíduo de aminoácido no sítio activo da enzima, modificando deste modo a IL-1/8 pro de forma que a IL-ip pro não possa interactuar com, e clivar, a pré IL-10.

Os compostos do presente invento inibem a actividade catalítica da IL-ljS pro duma forma reversível ou irreversível. Tal como aqui utilizado, irreversível significa a formação de uma ligação covalente entre a enzima e o inibidor.

A reversibilidade da actividade da IL-1/3 pro é uma função do grupo electronegativo que se despede. Quando o grupo electronegativo que se despede é uma diazoalquilcetona, a inibição da IL-1/3 pro é irreversível e o composto é um inibidor irreversível. Quando o grupo electronegativo que se despede é um aldeído, a inibição da IL-l/S pro é reversível e o composto é um inibidor reversível.

Os compostos do presente invento possuem a fórmula:

Z-Q₂~Asp-Q₁ na qual Z é um grupo bloqueador do terminal N; Q₂ é 0 a cerca de 4 aminoácidos, de modo que a sequência Q₂-Asp corresponde a pelo menos uma porção da sequência Ala-Tyr-Val-His-Asp, resíduos 112 a 116 da Seq. I.D. N^a 3; e

Q-]_ é um grupo electronegativo que se despede.

A?

-3073 146

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Numa concretização preferida, Z é alquilo ^ci“C₆, benzilo, acetilo, alcoxi C-L-Cg-carbonilo, benziloxicarbonilo ou alquil C-L-Cg-carbonilo. Tal como aqui utilizado, alquilo refere-se a cadeias lineares ou ramificadas possuindo 1 a 6 átomos de carbono, que podem estar opcionalmente substituídos tal como aqui definido. Grupos alquilo representativos incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, pentilo, hexilo e similares. Numa concretização mais preferida, Z é t-butoxicarbonilo (t-Boc), acetilo ou benziloxicarbonilo (Cbz).

Q₂ é preferivelmente um aminoácido. Preferivelmente, Q₂ é His, Phe, Pro ou Tyr. Mais preferivelmente, Q₂ é His ou Phe.

Q-L é preferivelmente um aldeído, uma diazoalquilcetona ou uma haloalquilcetona. Tal como aqui utilizado em referência a grupos electronegativos que se despedem, alquilo refere-se a radicais de cadeia linear ou ramificada possuindo l a 3 átomos de carbono, os quais podem estar opcionalmente substituidos tal como aqui definido. Grupos alquilo representativos incluem metilo, etilo, propilo e similares. Mais preferivelmente, Q-l é um aldeído ou uma fluorometil(CH₂F)cetona.

Os compostos do presente invento são preparados por técnicas correspondentes, na generalidade, aos processos conhecidos e prontamente evidentes para os peritos na arte. Ver, por ex. , Kettner, C.A. e colab., Arch. Biochem. Biophvs.. 162:56 (1974); Patente dos E.U.A. N^a 4 582 821; Patente dos E.U.A. N^H 4 644 055; Kettner, C.A. e colab., Arch. Biochem. Biophvs.. 165:739 (1974); Dakin, H.D. e West, R., J. Biol. Chem.. 78:91 (1928); Rasnick, D., Anal. Biochem.. 149:461 (1985).

Os compostos possuindo um grupo electronegativo que se despede fluorometilo são preferivelmente sintetizados pelo processo de Rasnick.

Os compostos possuindo um grupo electronegativo que se despede de haloalquilcetona, sem flúor, são sintetizados de acordo com o processo de Kettner. Um aminoácido ou péptido

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bloquado em N é feito reagir com N-metilmorfolina e um haloformato de alquilo, sem flúor, para originar um péptido-anidrido de ácido. 0 anidrido é feito reagir, de seguida, com um diazoalcano num solvente aprótico inerte para formar um péptido diazometanocetona. A diazometanocetona reage, em seguida, com uma solução anidra de HCl, HBr ou HI para produzir o aminoácido ou péptido desejado com aloalquilcetona no terminal C e bloquado em N.

Os compostos possuindo um grupo electronegativo que se despede de fluoroalquilcetona são sintetizados de acordo com o processo de Rasnick. Um péptido bloqueado em N é feito reagir com anidrido fluoroacético e uma trialquilamina num solvente orgânico para formar um péptido-anidrido. O anidrido é feito reagir, de seguida, com um catalisador tal como a 4-dimetilaminopiridina e a mistura reaccional é mantida a cerca de 25°C durante cerca de duas horas para permitir a libertação do C0₂· A mistura reaccional é, em seguida, extractada com um solvente orgânico e a fase orgânica é lavada e seca. 0 solvente orgânico é removido para formar um óleo, o qual é, então, aplicado a uma coluna de sílica-gel. 0 péptido-fluoroalquilcetona bloquado em N é, de seguida, eluído do gel e purificado.

Os compostos possuindo um grupo electronegativo que se despede de fluoroalquilcetona podem ser prolongados na direcção do terminal N por remoção do grupo bloqueador do terminal N e acoplamento do composto desprotegido com outros aminoácidos protegidos. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis. Spinger-Verlag, Berlin (1984). Alternativamente, os compostos desprotegidos são acetilados para produzir compostos possuindo um grupo protector do acetilo do terminal N. Stewart e colab., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984).

III. PROCESSOS DE TRATAMENTO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS presente invento fornece processos de utilização de composições terapêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de

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2108 —32— polipéptidos de IL-10 pro e seus derivados num diluente e portador adequado. Para uso terapêutico, a IL-lj8 pro, purificada, ou um seu derivado biologicamente activo, é administrada a um paciente, preferivelmente um humano, para tratamento duma forma apropriada da indicação. Assim, por exemplo, as composições de IL-ljS pro administradas para suprimir a auto-imunidade podem ser dadas por injecção em bólus, infusão contínua, libertação sustida a partir de implantes, ou por outra técnica adequada. Tipicamente, um agente terapêutico de IL-1/3 pro será administrado sob a forma de uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido purificado em conjunto com portadores, excipientes ou diluentes fisiologicamente aceitáveis. Os referidos portadores serão não tóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações empregues e podem conter qualquer um dos excipientes convencionais utilizados para preparar composições farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos inibidores do presente invento são úteis na inibição das acções fisiológicas da interleucina 1β por evitarem a formação da IL-10 biologicamente activa. A inibição da IL-10 pro resulta numa diminuição dos níveis da IL-lj8 activa e num aumento concomitante da pré IL-10, composto este que é biologicamente inactivo.

Os compostos inibidores do presente invento também são úteis no tratamento de estados disfuncionais, tal como a inflamação associada a doença auto-imune, muitas vezes medidas por actividade de IL-l/J aumentada.

Administraram-se aos mamíferos necessitando de tratamento para uma desordem inflamatória quantidades eficazes dos compostos inibidores deste invento sozinhas ou sob a forma de uma composição farmacêutica.

As composições farmacêuticas do presente invento incluem um ou mais dos compostos deste invento formulados em composições em conjunto com um ou mais portadores, veículos ou adjuvantes fisiologicamente aceitáveis, não tóxicos, os quais são aqui colectiva73 146

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mente designados como portadores, para injecção parentérica, para administração oral sob a forma sólida ou líquida, para administração rectal ou tópica, e similares.

A dose diária total dos compostos inibidores deste invento administrada a um hospedeiro em dose única ou em doses divididas pode estar em quantidades, por exemplo, de cerca de 0,1 mg a cerca de 160,0 mg por quilo de peso corporal. As composições de unidade de dosagem podem conter as referidas quantidades nos seus submúltiplos de forma a poderem ser utilizadas para perfazer a dose diária. Deverá ser compreendido, no entanto, que o nível de dose específico para qualquer doente em particular dependerá de uma variedade de factores incluindo peso corporal, estado geral, sexo, dieta, tempo e via de administração, taxas de absorção e de excreção, combinação com outras drogas e gravidade da doença em particular a ser tratada.

Os exemplos seguintes tem fins ilustrativos e de forma nenhuma são limitativos.

EXEMPLO

EXEMPLO 1: Especificidade de substrato da IL-10 pro

Este exemplo ilustra a gama de especificidade de substrato da enzima IL-10 pro humana, purificada, para clivar um grupo de sequências de aminoácidos. Foi preparada uma variedade de substratos peptídicos apresentando mudanças em aminoácidos individuais na região correspondente ao sítio de clivagem no precursor de IL-10 humana (His 115 a Pro 118). A reactividade dos substratos peptídicos foi expressa em relação ao péptido correspondente a Ala 112 até Ser 121 da sequência de precursor de IL-10.

Os péptidos substrato foram sintetizados pelo processo de fase sólida [Merrifield, J. Amer. Chem. Soc.. 86:304-05 (1964)] utilizando quer um sintetizador de péptidos Applied Biosystems 430A quer a abordagem manual do saco em T de Houghten íProc. Nat.

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Acad. Sei. USA. 82:5131-35 (1985)]. Foi utilizada a resina de 4-metilbenzidrilamina. Os péptidos substrato foram acetilados antes da clivagem a partir da resina, por HF líquido (0°C, 1 hora) na presença de anisolo como depurador (HF:anisolo, 9:1). Após evaporação do HF, as misturas de resina-péptido substrato foram lavadas com éter dietílico e extractadas com ácido acético a 15% (p/v), liofilizadas e purificadas por cromatografia líquida de elevado rendimento de fase inversa (RP-HPLC) numa coluna Vydac C18 de 2,2cm x 25 cm, Vydac C18. 0 ácido trifluoroacético (0,1%) em água foi o solvente A e o ácido trifluoroacético a 0,1% em acetonitrilo foi o solvente B, para as fases móveis.

Os péptidos substrato purificados foram caracterizados por análise dos aminoácidos utilizando um sistema Beckman 6300, RP-HPLC e espectrometria de massa. Os espectos de massa foram obtidos por bombardeamento de átomos rápidos num sistema VG Trio-2 com xénon como gás ionizante e glicerol/tioglicerol (1:1) como matriz da amostra, ou por espectrometria de massa de dessorção de plasma de ²5²cf _num espectrómetro de massa Bio-Ion 20 (ver Tsarbopoulos, Peptide Res. 2:258-66 (1989)). Em cada um dos casos, a massa do substrato peptídico observado correspondeu ao valor teórico.

As soluções peptídicas de concentração padrão foram preparadas por dissolução de cerca de 2-3 mg de substrato peptídico em água, carga da solução num cartucho Waters Sep-Pak 18 e lavagem, três vezes, com 5 ml de água. Os substratos peptídicos foram eluídos com acetonitrilo e, em seguida, foram evaporados até à secura. Cada substrato foi padronizado até 1 mM por análise dos aminoácidos antes da utilização.

Misturaram-se enzima IL-10 pro humana, purificada, (10 μΐ), substrato peptídico em água (10 μΐ) e tampão Tris 10 mM, pH 8,0, contendo 25% v/v de glicerol (10 μΐ) e as misturas foram incubadas a 37°C durante quatro horas. A reacção foi extinta pela adição de tampão HCl/glicina 1 M, pH 2,0 (10 μΐ). As amostras foram então analisadas utilizando RP-HPLC com uma coluna Vydac C18 (0,46 cm x 25 cm) e eluindo com um gradiente linear desde 100% de

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2108 ”³⁵” solvente A até 70% de solvente A/30% de solvente B, durante 30 minutos com um caudal de 1 ml/min. 0 eluente foi monitorizado quanto a um produto absorvente a 280 nm. Uma comparação entre a área do pico do péptido produto e a área do pico total do substrato e do produto forneceu o grau da clivagem peptídica, dado que a área sob os picos do substrato e do produto combinados foi constante e independente da quantidade de clivagem pela enzima IL-lj0 pro. As identidades dos picos dos produtos peptídicos foram confirmadas por análise dos aminoácidos e por espectrometria de massa.

A Tabela 1 mostra as reactividades relativas de uma série de oito substratos peptídicos que foram submetidos a digestão pela enzima IL-10 pro purificada.

TABELA 1

Péptido Sequência

Ala-Tyr-Val-HisAsp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (Seq. I.D. N^a 13)

Reactividade relativa, em relação ao Péptido 1

1,00

Ala-Tyr-Val-His- <0,01

Asn-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (Seq. I.D. N^a 14)

Ala-Tyr-Val-His- <0,05

Glu-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (Seq. I.D. N^a 15)

Ala-Tyr-Val-His- <0,01 (D-Asp)-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (Seq. I.D. N^a 16)

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2108 -36TABELA 1 (cont.)

Péptido Seauência

Reactividade relativa , em relação ao Péptido 1

Ala-Tyr-Val-His- 3,40

Asp-Gly-Pro-Val-Arg-Ser (Seq. I.D. N² 17)

Ala-Tyr-Val-His- <0,05

Asp-Val-Pro-Val-Arg-Ser (Seq. I.D. N^a 18)

Ala-Tyr-Val-Phe- 0,05

Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (Seq. I.D. N² 19)

Ala-Tyr-Val-His- 0,47

Asp-Ala-Ala-Val-Arg-Ser (Seq. I.D. N² 20) sítio de clivagem pode ser descrito com os resíduos de aminoácido correspondentes de precursor de IL-ljS humana, como se segue:

P2 PI PI^/P2^/

His-Asp-Ala-Pro

A mudança do resíduo de ácido L-aspártico do péptido 1 para asparagina (péptido 2), ácido glutâmico (péptido 3) ou D-aspartato (péptido 4) apresenta um efeito profundo sobre a capacidade da IL-Ιβ pro para clivar o substrato. Estes dados determinam a necessidade de um resíduo de L-aspartato na posição PI para que esta enzima seja capaz de clivar um substrato. Os péptidos 5 e 6 representam mudanças na posição PI' do sítio de clivagem da IL-l/J precursora humana. A substituição da alanina por glicina (péptido 5) resulta num substrato que é 3,4 vezes mais reactivo do que o péptido 1. No entanto, a mudança do mesmo

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resíduo por valina (pé- ptido 6) impede efectivamente a clivagem proteolítica. O facto de que, com um resíduo de glicina em Pl' o péptido ser clivado mais prontamente sugere que o resíduo de alanina no polipéptido de precursor de IL-ljS humana não é crítico para a ligação ao substrato, enquanto que o resultado com um resíduo de valina na posição Pl* indica uma tolerância estereoquímica baixa na posição Pl*. Assim, parece improvável que o enzima IL-ljS pro ou os seus derivados clivem em qualquer outro local que não entre os resíduos Asp-Gly e Asp-Ala.

Os péptidos 7 e 8 representam mudanças nos sítios P2 e P2', respectivamente. A mudança da prolina do péptido para uma alanina originou um substrato que ainda era clivado pela IL-Ιβ pro humana mas apenas com metade da eficiência do péptido com a sequência nativa da IL-1/3 humana. Foi obtido um resultado semelhante quando a histidina do péptido 1 foi substituída por uma fenilalanina. Estes dados sugerem por fenilalanina. Estes dados sugerem que a enzima IL-10 pro humana tolera substituições conservativas de ambos os resíduos e que as posições P2 e P2* não são tão vitais para a actividade como os aminoácidos nas posições Pl e Pl*.

EXEMPLO 2: Efeito do Comprimento do Substrato

Este exemplo ilustra o efeito do comprimento do péptido substrato sobre a capacidade da enzima IL-ljS pro humana para clivar substratos peptídicos. A experiência foi conduzida como descrito no Exemplo 1. Foram preparados cinco péptidos substrato correspondendo à sequência de aminoácidos do sítio de clivagem da IL-1/3 pro no precursor de IL-1/ϊ humana. Os resultados estão apresentados na Tabela 2, abaixo:

(segue Tabela)

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Tabela 2

Péotido	Sequência Reactividade Relativa. <	sm relação
1	Ala-Tyr-Val-His-	ao PéDtido 1	1,00
9	Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser- (Seq. I.D. N2. 13) Glu-Ala-Tyr-Val-		0,74
10	His-Asp-Ala-Pro(Seq. I.D. N2. 21) Tyr-Val-His-Asp-		2,40
11	Ala-Pro-Val-Arg(Seq. I.D. N2. 22) Val-His-Asp-Ala-	Não	clivado
12	Pro-Vai- (Seq. I.D. N2. 23) His-Asp-Ala-Pro-	Não	clivado
	(Seq. I.D. N2. 24)

O péptido de oito aminoácidos (Ac-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-NH₂) é clivado mais eficientemente enquanto que os péptidos de quatro e seis aminoácidos não são clivados. Assim a IL-lj8 pro apresenta um número mínimo de resíduos de aminoácido necessário para a clivagem do péptido substrato.

Exemplo 3: Síntese de Inibidores da Protease de IL-liS

A. Síntese de Boc-Asp-C^F.

Uma suspensão de Boc-Asp-OH (8,11 mmol) e anidrido fluoroacético (16,2 mmol) em benzeno (30 ml) foi tratada com trietilamina (16,2 mmol), à temperatura ambiente. Foi adicionado o catalisador 4-dimetilaminopiridina (0,41 mmol) à solução, e a reacção foi agitada durante cerca de 2 h à temperatura ambiente. Foram adicionados cerca de 100 ml de benzeno à mistura reaccional. A solução orgânica foi lavada com HCl IN (2 x 50 ml), NaHCO₃ saturado (2 x 50 ml), e NaCl saturado (2 x 50 ml), seguindo-se secagem sobre MgSO^ anidro. 0 solvente foi, em seguida, removido por evaporação sob pressão reduzida. 0 óleo resultante foi aplicado a uma coluna de 2,5 x 80 cm de sílica-gel (60-200 mesh). O

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-39composto do título eluiu com metanol a 2% em clorofórmio.

B. Síntese de Boc-His-Asp-CH₂F, Boc-Tvr-Asp-CHF e Boc-Phe-Asp-CH₂F.

Boc-Asp-CH₂F, preparado de acordo com o processo do Exemplo 3A, anterior, pode ser dissolvido em ácido trifluoroacético (TFA) e a mistura agitada durante cerca de 5 minutos a cerca de 23°C. De seguida, pode ser adicionado éter frio à mistura. 0 éter é evapoporado e é adicionado tolueno para evaporar o TFA residual. O péptido desprotegido (H-Asp-CH₂F) é obtido como um sal de TFA. 0 péptido desprotegido pode, então, ser acoplado a um aminoácido protegido (isto é, Boc-HisOH, Boc-ProOH, Boc-TyrOH, Boc-PheOH) utilizando um processo de anidrido simétrico, comum, empregando diciclo-hexilcarbodiimida como um reagente de acoplamento. Bodanszky, supra.

C. Síntese de Ac-His-Asp-CH₂F, Ac-Pro-Asp-CH₂F, Ac-Tvr-Asp-CH₂F e Ac-Phe-Asp-CHgF.

Os grupos protectores Boc podem ser removidos dos compostos preparados de acordo com o processo do Exemplo 3B utilizando ácido trifluoroacético como descrito anteriormente. Cada composto desprotegido pode, então, ser acetilado com anidrido acético e diisopropilamina (DIAE), de acordo com técnicas padrão. Stuart e colab., supra.

D. Sintese de Cbz-His-Asp-CH₂F, Cbz-Pro-Asp-CH₂F, Cbz-Tyr—Asp-CH₂ e Cbz-Phe-Asp-CH₂F.

grupo protector Boc pode ser removido de Boc-Asp-CH₂F, preparado de acordo com o processo do Exemplo 3A, utilizando TFA como descrito acima. Aminoácidos protegidos com benziloxicarbonilo (isto é, Cbz-His-OH, Cbz-Phe-OH, Cbz-Tyr-OH, Cbz-Pro-OH), disponíveis em fontes comerciais (Bachem, Philadelphia, PA) podem, então, ser acoplados ao Asp desprotegido utilizando um processo de acoplamento de anidrido simétrico. Bodanszky, supra.

Exemplo 4: Inibição da Actividade de IL-lff pro

O Boc-Asp-CH₂F foi testado quanto à sua capacidade para inibir a degradação catalisada pela IL-10 pro da pré-IL-lj8, utilizan73 146

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-40··*£ ,-χ . ...u·

W do um processo de ensaio in vitro. Black e colab., J. Biol. Chem., 263(19): 9437 (1988). Os resultados deste estudo encontram-se apresentados na Figura 3. 0 Boc-Asp-CH₂F foi preparado de acordo com o processo do Exemplo IA.

A. Produção de pré-IL-lff

O polipéptido de precursor de pré-IL-ljS foi obtido a partir de E. coli utilizando técnicas comuns de ADN recombinante. Black, supra. A pré-IL-ljS recombinante foi expressa em E. coli sob o controlo do promotor P_L de fago e do repressor termolábil cI857^-^s. Utilizando técnicas comum de recombinação do ADN, foi construído o pLNIL-l/JF por ligação dos segmentos de ADN seguintes: (1) 6160 pares de bases do pLNIL-10 (12) digerido com Nco I/Hind III contendo o vector (conferindo resistência à ampicilina), os codões 134-269 e as regiões não codificadoras 3' de HuIL-10? (2) oligonucleótidos sintéticos complementares codificando os resíduos 1-6 da IL-Ιβ e as extremidades complementares de Nco I e Sst I; e (3) um fragmento de restrição de Sst I/Hind III de 380 pares de bases do plasmídeo IL-10-6(1) codificando os resíduos 7-133. A mistura de ligação foi transformada no hospedeiro resistente à tetraciclina RRI: pRK248cl^ts (12), e os plasmídeos correctamente montados foram identificados por análise de restrição do ADN isolado de transformantes resistentes à ampicilina e à tetraciclina. Os transformantes contendo o pLNIL-ljSF foram testados quanto à produção de pré-IL-10 por análise por SDS-PAGE das culturas cultivadas em meio de super-indução até Αρθθ de 0,5 e desreprimidas durante 1-20 h por elevação da temperatura de 30° para 42°C. Uma proteína de 31000 dalton foi evidente em amostras de culturas contendo o pLNIL-l/3F, mas não em culturas de controlo sem a região de codificação de IL-10. A análise por imunotransferência pontual (imuno-dot blot) com um anticorpo monoclonal anti-IL-lj8 (MAb) e IL-ljS madura recombinante, purificada, como padrão indicou que as culturas continham aproximadamente 2,5-5,0 ^g/ml de pré-IL-1/3.

B. Extracção da pré-IL-16 a partir de E. coli.

Ressupenderam-se pelotas de células de 2,5 litros de cultura

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2108 -41de E. coli transferida em 20 ml de tampão Tris-HCl 30mM (pH 9,5) contendo ácido etilenodiaminotetraacético 5mM (EDTA), 500 Mg/ml de lisozima, e fenilmetanossulfonilo 1 mM (PMSF). As suspensões celulares foram homogenizadas utilizando um homogeneizador Polytron (Brinkmann Instruments), rapidamente congeladas num banho de gelo seco/metanol e, em seguida, descongeladas. Em seguida, 200 ml de tampão Tris-HCl 30 mM (pH 8,0) contendo NaCl 150 mM e PMSF 1 mM, foram adicionados às suspensões, as quais foram, seguidamente, homogenizadas até ser obtido um homogeneizado uniforme. As suspensões foram incubadas durante 30 minutos a 4°C, e de seguida centrifugadas a 4°C durante 60 minutos a 3800 x g. As fracções do sobrenadante foram cuidadosamente decantadas e filtradas para remover qualquer matéria em partículas. As pelotas foram re-extractadas em 200 ml de tampão Tris-HCl 30 mM (pH 8,0) contendo NaCl 150 mM, ureia 8 M, e PMSF 1 mM. Dado que ambos os extractos de Tris e de ureia continham quantidades sustanciais de pré-IL-10, ambos foram purificados como descrito abaixo.

C. Purificação da pré-IL-16

Todos os processos cromatográficos foram realizados a 4°C. Todas as fracções foram analisadas quanto à concentração proteica e a condutividade foi medida quando apropriado. Após cada passo cromatográfico, as fracções foram analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio, SDS-PAGE (com um gradiente de poliacrilamida de 10-20%), seguida por coloração de prata e por transferência de Western utilizando um MAb produzido contra a IL-1/8 madura, purificada.

Os extractos foram diluídos a 1:4 em H₂0, o pH foi ajustado até 8,1, e o material foi carregado a 100 ml/h num coluna Q-Sepharose de 25 x 2,5 cm. Para o extracto de Tris, a coluna foi equilibrada em Tris-HCl 10 mM (pH 8,1). Para o extracto de ureia, a coluna foi equilibrada em Tris-HCl 10 mM (pH 8,1), ureia 2 M. As colunas foram lavadas com 8 volumes de coluna de Tris-HCl 10 mM (pH 8,1), e as proteínas ligadas eluiram com um gradiente linear (três volumes de coluna) variando de NAC1 0 até 1,5 M em Tris-HCl 10 mM (pH 8,1). As fracções de 7,5 ml foram recolhidas e armazenadas a 4°C até ao passo seguinte da purificação.

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As fracções de Q-Sepharose contendo a pré-IL-1/3 (tal como determinado por análise por transferência de Western) foram combinadas e diluídas a 1:10 em Tris-HCl 10 mM (pH 8,1). A coluna foi lavada com 4 volumes de coluna do tampão de partida.

A solução de Tris-HCl foi aplicada a uma coluna de 20 x 5 cm de fenil-Sepharose CL-4B que tinha sido equilibrada em tampão Tris-HCl 10 mM (pH 8,1) contendo (NH₄)₂SO₄ 0,2 Μ. A coluna foi lavada com 3 volumes de coluna do tampão de partida e, em seguida, o material foi eluído inicialmente com 4 volumes de coluna de um gradiente linear decrescente de (NH₄)₂SO₄, produzido com soluções 0,2 e 0 M em tampão Tris-HCl 10 mM (pH 8,1). Finalmente, o material foi eluído com 2 volumes de coluna de Tris-HCl 10 mM (pH 8,1). As fracções contendo pré-IL-10 parcialmente purificada foram combinadas, dialisadas contra PBS e armazenadas a -70°C até à utilização.

D. Tratamento Proteolítico da pré-IL-lB

Foram misturados 5 μΐ da pré-IL-ljS (cerca de 50 /xg/ml em PBS) com 10 μΐ de IL-1/3 pro purificada (15-75 Mg/ml em PBS) e incubados a 37°C durante 30 minutos. A incubação foi terminada por colocação das amostras em gelo seco ou pela adição de tampão de amostra de SDS. Em seguida, foi adicionado PMSF até uma concentração de 1 mM, e as amostras foram dialisadas contra água. Após a diálise, as amostras foram concentradas até à secura num aparelho para concentração Speed-Vac e dissolvidas em tampão de amostra de SDS.

E. Análise por transferência de Western dos Produtos Proteolíticos

A SDS-PAGE foi realizada com geles de poliacrilamida a 12%. Os geles foram colocados em tampão de transferência (glicina 0,192 M, Tris-HCl 0,025 M (pH 8,3), metanol a 20% v/v), e a proteína foi, de seguida, submetida a electroforese em nitrocelulose (Sartorius) num aparelho de transferência Hoeffer (1 h à voltagem máxima). A nitrocelulose foi subsequentemente colocada em fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4 (PBS) contendo 3% de albumina de soro bovino, durante pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente.

-43Utilizou-se um MAb específico para a IL-1/3 ma

146

Sterlíng-Immunex

2108

pará sondar a transferência. 0 MAb foi adicionado até uma concentração de 9 Mg/ml, e a incubação continuou durante 30 minutos. A transferência foi, então, lavada três vezes com PBS e foi revelada com uma solução obtida por mistura de 6 mg de reagente de revelação de peroxidase de rábano silvestre (Bio-Rad) dissolvidos em 2 ml de metanol e peróxido de hidrogénio (60 μΐ diluídos em 10 ml de solução salina tamponada com Tris).

Os dados mostram que o Boc-Asp-CH₂F inibe completamente a produção da IL-lj8 madura a partir da pré-IL-lj8 numa concentração de 5 μΜ e inibe parcialmente a produção da IL-1/3 madura numa concentração de 1 μΜ.

Exemplo 5: Actividade biológica da IL-lfl pro quando transfectada para células COS-7

Inseriu-se um ADNC correspondendo aos aminoácidos 120 a 404

I num vector de expressão de célula de mamífero (pDC303). Este plasmídeo foi co-transfectado em células COS-7 (rim de macaco) com um segundo plasmídeo de expressão de mamífero contendo um ADNc codificando o precursor de IL-l/J. Após dois dias, as células foram radio-marcadas com 35g _{e as} proteínas específicas da IL-1/3 foram imunoprecipitadas a partir de lisados celulares. Os imunoprecipitados foram analisados por SDS-PAGE e auto-radiografia. Verificou-se que as células COS-7 transfectadas podem processar o precursor de IL-1/3 em IL-1/8 madura apenas se as células forem co-transfectadas com plasmídeo codificando a IL-l/S pro. As células co-transfectadas com um plasmídeo de controlo ou células falsamente transfectadas não apresentavam qualquer processamento da IL-l/J precursora. Assim, a IL-ljS pro, sem os 119 aminoácidos do terminal N permite que as células processem o precursor de IL-1/3 na forma madura desta proteína.

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a.l:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1659 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples

146

Sterling-Immunex

2108

(D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID N^s 1

AAAAGGAGAG AAAAGCCTAA AAGAGAGTGG GTAGATGGCC GACAAGGTCC TGAAGGAGAA 60

GAGAAAGCTG TTTATCCGTT CCATGGGTGA AGGTACAATA AATGGCTTAA GGTAGAAGGT 120

GAAGGAAATA CTGGATGAAT TATTACAGAC AAGGGTGCTG AACAAGGAAG AGATGGAGAA 180

AGTAAAACGT GAAAATGCTA CAGTTTATAG AAAAGAAGAA CGCTTATGGA TAAGACCCGA 240

GCTTTGATTG ACTCCGTTAT TCCGAAAGGG GCACAGGCAT GCCAAATTTG CATCACATAC 300

CGGATAAGTG AAAGTGATAA TTTGTGAAGA AGACAGTTAC CTGGCAGGGA CGCTGGGACT 360

CTCAGCAGAT CAAACATCTG GAAATTACCT TAATTGAGGA AAGAAAGAAA ATTATGCAAG 420

ACTCTCAAGG AGTACTTTCT TCCTTTCCAG CTCCTCAGGC AGTGCAGGAC AACCCAGCTA 480

TGCCCACAGG GAACGGAAGA GTGAATCCTC AGGCTCAGAA GGGAATGTCA AGCTTTGCTC 540

CCTAGAAGAA GCTCAAAGGA TATGGAAACA AAAGTCGGCA GTTAAGTAGA ACAGGAGAGA 600

TTTATCCAAT AATGGACAAG TCAAGCCGCA CACGTCTTGC TCTCATTATC TGCAATGAAG 660

AATTTGACAG TAGAGTGAAG AATGTTTGAG TAATTCCTAG AAGAACTGGA GCTGAGGTTG 720

ACATCACAGG CATGACAATG CTGCTACAAA ATCTGGGGTA CAGCGTAAAA TAAATTTGGA 780

AAAAGGGATG TGAAAAAAAA TCTCACTGCT TCGGACATGA CTACAGAGCT GGAGGCATTT 840

GCACACCGCC CAGAGCACAA GTATATGAGG GCGGACCTCT GACAGCACGT TCCTGGTGTT 900

CATGTCTCAT GGTATTCGGG AAGGCATTTG TGGGAAGAAA CACTCTGAGG AAGAAAATAT 960

ACACAAGTCC CAGATATACT ACAACTCAAT GCAATCTTTA ACATGTTGAA TACCAAGAAC 1020

TGCCCAAGTT TGAAGGACAG AACAGGAGAA TAAGAAACCG AAGGTGATCA TCATCCAGGC 1080

CTGCCGTGGT GACAGCCCTG GTGTGGTGTG GTTTAAAGAT TCAGTAGGAA GATTGGGAAA 1140

AAAGGTTTCT GGAAACCTAT CTTTACCAAC TACAGAAGAG TTTGAGGATG ATGCTATTAA 1200

GAAAGCCCAC ATAGAGAAGA AACTAAATAG TTGAGATTTT ATCGCTTTCT GCTCTTCCAC 1260

ACCAGATAAT GTTTCTTGGA GACATCCCAC AATGGGCTCT GTTTTTATTG AGGTGGTAAC 1320

CAAGGAGAAG GGAAGACTCA TTGAACATAT GCAAGAATAT GCCTGTTCCT GTGATGTGGA 1380

GGAAATTTTC CGCAAGGTTC GATTTGGAGA GAAGTTTGAG ATTAGCTTCA TTTGAGCAGC 1440

CAGATGGTAG AGCGCAGATG CCCACCACTG AAAGAGTGAC TTTGACAAGA TGTTTCTACC 1500

TCGTTCCCAG GACATTAAAA TAAGGAAACT GTATGAATGT CTGCGGGCAG GAAGTGAAGA 1560

GATCGTTCTG TAAAAGGTTT TTGGAATTAT GTCTGCTGAA TAATAAACTT TTTTTGAAAT 1620

AATAAATCTG GTAGAAAAAT GAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1659

146

Sterling-Immunex

2108 -45-

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N². 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 404 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 2

Met

Ala

Asp

Lys

Val

Leu

Lys

Glu

Lys

Arg

Lys

Leu

Phe

Ile

Arg

Ser

1

5

10

15

Met

Gly

Glu

Gly

Thr

Ile

Asn

Gly

Leu

Leu

Asp

Glu

Leu

Leu

Gin

Thr

20

25

30

Arg

Val

Leu

Asn

Lys

Glu

Glu

Met

Glu

Lys

Val

Lys

Arg

Glu

Asn

Ala

35

40

45

Thr

Val

Met

Asp

Lys

Thr

Arg

Ala

Leu

Ile

Asp

Ser

Val

Ile

Pro

Lys

50

55

60

Gly

Ala

Gin

Ala

Cys

Gin

Ile

Cyc

Ile

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Glu

Asp

65

70

75

80

Ser

Tyr

Leu

Ala

Gly

Thr

Leu

Gly

Leu

Ser

Ala

Asp

Gin

Thr

Ser

Gly

85

90

95

Asn

Tyr

Leu

Asn

Met

Gin

Asp

Ser

Gin

Gly

Val

Leu

Ser

Ser

Phe

Pro

100

105

110

Ala

Pro

Gin

Ala

Val

Gin

Asp

Asn

Pro

Ala

Met

Pro

Thr

Ser

Ser

Gly

115

120

125

Ser

Glu

Gly

Asn

Val

Lys

Leu

Cys

Ser

Leu

Glu

Glu

Ala

Gin

Arg

Ile

130

135

140

Trp

Lys

Gin

Lys

Ser

Ala

Glu

Ile

Tyr

Pro

Ile

Met

Asp

Lys

Ser

Ser

145

150

155

160

Arg

Thr

Arg

Leu

Ala

Leu

Ile

Ile

Cys

Asn

Glu

Glu

Phe

Asp

Ser

Ile

165

170

175

Pro

Arg

Arg

Thr

Gly

Ala

Glu

Val

Asp

Ile

Thr

Gly

Met

Thr

Met

Leu

180

185

190

Leu

Gin

Asn

Leu

Gly

Tyr

Ser

Val

Asp

Val

Lys

Lys

Asn

Leu

Thr

Ala

195

200

205

Ser

Asp

Met

Thr

Thr

Glu

Leu

Glu

Ala

Phe

Ala

His

Arg

Pro

Glu

His

210

215

220

Lys

Thr

Ser

Asp

Ser

Thr

Phe

Leu

Val

Phe

Met

Ser

His

Gly

Ile

Arg

225

230

235

240

146

Sterling-Immunex

2108

Glu Gly Ile Cys Gly Lys Lys His Ser Glu Gin Vai Pro

Asp Ile 255

Leu

245

250

Gin

Leu

Asn

Ala

Ile

Phe

Asn

Met

Leu

Asn

Thr

Lys

Asn

Cys

Pro

Ser

260

265

270

Leu

Lys

Asp

Lys

Pro

Lys

Vai

Ile

Ile

Ile

Gin

Ala

Cys

Arg

Gly

Asp

275

280

285

Ser

Pro

Gly

Vai

Vai

Trp

Phe

Lys

Asp

Ser

Vai

Gly

Vai

Ser

Gly

Asn

290

295

300

Leu

Ser

Leu

Pro

Thr

Thr

Glu

Glu

Phe

Glu

Asp

Asp

Ala

Ile

Lys

Lys

305

310

315

320

Ala

His

Ile

Glu

Lys

Asp

Phe

Ile

Ala

Phe

Cys

Ser

Ser

Thr

Pro

Asp

325

330

335

Asn

Vai

Ser

Trp

Arg

His

Pro

Thr

Met

Gly

Ser

Vai

Phe

Ile

Gly

Arg

340

345

350

Leu

Ile

Glu

His

Met

Gin

Glu

Tyr

Ala

Cys

Ser

Cys

Asp

Vai

Glu

Glu

355

360

365

Ile

Phe

Arg

Lys

Vai

Arg

Phe

Ser

Phe

Glu

Gin

Pro

Asp

Gly

Arg

Ala

370

375

380

Gin

Met

Pro

Thr

Thr

Glu

Arg

Vai

Thr

Leu

Thr

Arg

Cys

Phe

Tyr

Leu

385

390

395

400

Phe

Pro

Gly

His

(2)

INFORMAÇÃO

PARA A !

SEQ :

ID N

a. 3

• •

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 269 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ÍX) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N² . 3:

Met	Ala	Glu	Vai	Pro	Glu	Leu	Ala
1				5
Gly	Asn	Glu	Asp	Asp	Leu	Phe	Phe
			20
Lys	Cys	Ser	Phe	Gin	Asp	Leu	Asp
		35					40
Gin	Leu	Arg	lie	Ser	Asp	His	His
	50					55

Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
10	15
Glu	Ala	Asp	Gly	Pro	Lys	Gin	Met
25					30
Leu	Cys	Pro	Leu	Asp	Gly	Gly	lie
				45
Tyr	Ser	Lys	Gly	Phe	Arg	Gin	Ala
			60

146

Sterling-Immunex

2108

Ala

Ser

Vai

Vai

Vai

Ala

Met

Asp

Lys

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Vai

Pro

65

70

75

80

Cys

Pro

Gin

Thr

Phe

Gin

Glu

Asn

Asp

Leu

Ser

Thr

Phe

Phe

Pro

Phe

85

90

95

lie

Phe

Glu

Glu

Glu

Pro

lie

Phe

Phe

Asp

Thr

Trp

Asp

Asn

Glu

Ala

100

105

110

Tyr

Vai

His

Asp

Ala

Pro

Vai

Arg

Ser

Leu

Asn

Cys

Thr

Leu

Arg

Asp

115

120

125

Ser

Gin

GIn

Lys

Ser

Leu

Vai

Met

Ser

Gly

Pro

Tyr

Glu

Leu

Lys

Ala

130

135

140

Leu

His

Leu

GIn

Gly

GIn

Asp

Met

Glu

GIn

GIn

Vai

Vai

Phe

Ser

Met

145

150

155

160

Ser

Phe

Vai

GIn

Gly

Glu

Glu

Ser

Asn

Asp

Lys

lie

Pro

Vai

Ala

Leu

165

170

175

Gly

Leu

Lys

Glu

Lys

Asn

Leu

Tyr

Leu

Ser

Cys

Vai

Leu

Lys

Asp

Asp

180

185

190

Lys

Pro

Thr

Leu

GIn

Leu

Glu

Ser

Vai

Asp

Pro

Lys

Asn

Tyr

Pro

Lys

195

200

205

Lys

Lys

Met

Glu

Lys

Arg

Phe

Vai

Phe

Asn

Lys

Ile

Glu

Ile

Asn

Asn

210

215

220

Lys

Leu

Glu

Phe

Glu

Ser

Ala

Gin

Phe

Pro

Asn

Trp

Tyr

Ile

Ser

Thr

225

230

235

240

Ser

Gin

Ala

Glu

Asn

Met

Pro

Vai

Phe

Leu

Gly

Gly

Thr

Lys

Gly

Gly

245

250

225

Gin

Asp

Ile

Thr

Asp

Phe

Thr

Met

Gin

Phe

Vai

Ser

Ser

260

265

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^{2 * *}. 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 4: TACCGGCTGT TCCAGGAC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N⁵. 5:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases

146

Sterling-Immunex

2108

(B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 5: TACCTATTCT GGGCTCGA 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° . 6: TTGGTCGATA CGGGTGT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 7: CACCACACCA AATTTCTA 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 8: ATGGAGAAGG GTCCTGTA 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 9:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

146

Sterling-Immunex

2108 —49—

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a . 9: GTCGAATTCA AYCCNGCNAT GCCNAC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^s. 10: GTCTCTAGAA GYTTNACRTT NCCYTC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a . 11 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^s. 11: ATATCGGTAC CGCCTCCAGC ATGCCTCCGG CAATGCCCAC ATC 43 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a . 12:

CTGCTAGATC TGCCCGCAGA CATTCATACA G 31

146

Sterling-Immunex

2108

-50(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a . 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a.

Ala Tyr Vai His Asp Ala Pro Vai Arg Ser 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a.

Ala Tyr Vai His Asn Ala Pro Vai Arg Ser 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 15:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a.

Ala Tyr Vai His Glu Ala Pro Vai Arg Ser 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 16:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ÍX) CARACTERÍSTICAS:

(B) LOCALIZAÇÃO : 4

13:

14:

15:

146

Sterling-Immunex

2108 e

-51(C) PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO: Xaa = D-Asp (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 16:

Ala Tyr Vai His Xaa Ala Pro Vai Arg Ser

10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 17:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^B. 17:

Ala Tyr Vai His Asp Gly Pro Vai Arg Ser

10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 18:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 18:

Ala Tyr Vai His Asp Vai Pro Vai Arg Ser

10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 19:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^fi. 19:

Ala Tyr Vai Phe Asp Ala Pro Vai Arg Ser

10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^s . 20:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido

146

Sterlíng-Immunex

2108

4-52(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 20:

Ala Tyr Vai His Asp Ala Ala Vai Arg Ser

10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N² . 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 21:

Glu Ala Tyr Vai His Asp Ala Pro Vai Arg Ser Leu 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 22:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N². 22:

Tyr Vai His Asp Ala Pro Vai Arg

5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 23:

Vai His Asp Ala Pro Vai

5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^a. 24:

-5373 146

Sterling-Immunex

2108 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: Iinear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a.

His Asp Ala Pro

Claims (11)

1. REIVINDICACOES

   1 - Processo de preparação de um polipéptido isolado apresentando actividade de protease em relação a um sítio de clivagem da protease específico, sendo a actividade da protease específica para um péptido substrato, possuindo uma sequência de aminoácidos compreendendo:

   R^_ Asp ^3 na qual R^, R₂ e R₃ são, independentemente um do outro, qualquer isómero D ou L de aminoácido, R₂ é Ala ou Gly, e estando o sítio de clivagem da protease específico entre Asp e R₂, caracterizado por compreender a extracção do polipéptido de células contendo o polipéptido e a purificação do polipéptido extraído.
2. 2 - Processo de preparação de um polipéptido de IL-10 pro isolado apresentando actividade de IL-ljS pro e que é codificado por uma sequência de ADN a qual compreende:

   a. uma inserção de ADN seleccionada de entre o grupo constituído pelas sequências de nucleótidos (segue Sequência)

   73 146

   Sterling-Immunex

   2108

   2ε

   Hat Ala Aap ly» Vai Lm ly» Glu lya Ar, ly» Lm Ph» Xla Ar, »«r ^n,t «y ^{ele el}X Thr 21» Ms «y Us 33

   ATO «oc «Μ AM erc CTO AM GM AM ASA AM CTO TTT A3X CSX TCC AIS «ST GAA «CX ACA AZA AAJ OGC ΤΣΑ *3

   Lm Aap Glu 1« Lm Gin Thr Ax, Vai Im Aan ly» W“ °ί“ H«t d» Lr» Vai tar» Ar, 41« Aan Ala Thr Vai *4

   Cia GAT GAA TTA TTA CM ACA ACC CTC CTG AAC AAC GAA GM ATO GM AAA «ZA AAA CGT CAA AAT «CX ACA CTT 1(7

   Hat Aap ir· Thr Ar, Ala Lm Zl» Aap Tar Vai XI· Pra Xy» «ly Ala «U AU Cpa «ia Ua cy» XI· Thr Tyr 73

   ATG CAT AM ACC CCA CCT TTG ATT CAC TCC «XT ATT CO8 AAA «OG CO OG 4CA T«C OA ATT TOC ATC ACA ZAC 343

   Xla Cy» 41« <i« Aap Tar Tyr Lm Ala Gly Thr Lm «ly Lm »ar Ala Aap «la Thr Tar «ly Aan Tyr Lm Aan 100

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   Hat «la Aap Tar «la «ly Vai Lm Tar Tar Pb» Pr» Ala Pr» «la Ala Vai «la Aap Aaa Pr» Ala Hat Pr» Thr 131

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   Tar pha βία Ola Pra Aap Oly Ar, Ala Ola Hat Pra Thr Thr «1« Ax, Vai Thr Lau Thr Ax, Cy» Pha lyr Lm 400

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   TTC CCA GGA CAT XAA AAXAAfiaAAACTGTAJCAATGTCTGCGGGOiGGAAGTGAAGAGATCGTTCXCXAAAAGCTrnTGGAAXTATCTCXGCT 1311

   1174 «AA27AZAAACTTnTI7GAAAZAATAAATCIGCTAGAAAAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAA—3

   73 146

   Ster1ing-Immunex

   2108

   -56iniciando-se no nucleótido 1 e estendendo-se até ao nucleótido 1232, iniciando-se no nucleótido 374 e estendendo-se até ao nucleótido 1232, e iniciando-se no nucleótido 374 e estendendo-se até um nucleótido entre cerca do 851 e cerca do 962;

   b. sequências de ADN, as quais se hibridam, de forma detectável, com uma ou mais das inserções de ADN precedentes e as quais codificam ou expressam um polipéptido exibindo actividade biológica para clivar proteoliticamente o polipéptido de precursor de IL-10 humana num sítio de clivagem entre os resíduos Asp 116 e Ala 117; e

   c. sequências de ADN as quais, dada a degenerescência do código genético, codificam um polipéptido da IL-10 pro de mamífero codificado por qualquer uma das sequências e inserções de ADN precedentes, caracterizado por compreender os passos de:

   i) ligar operativamente um vector à referida sequência de ADN, codificando o referido vector uma sequência de controlo da expressão, para formar uma molécula de ADN recombinante;

   ii) transformar uma célula hospedeira apropriada com a referida molécula de ADN recombinante;

   iii) cultivar o referido hospedeiro; e iv) recolher o referido polipéptido.
3. 3 - Processo de preparação de uma sequência de ADN isolada codificando uma enzima IL-10 pro de mamífero, caracterizado por compreender proporcionar uma sequência de ADN iniciadora específica para uma enzima de IL-10 pro e a amplificação das sequências específicas de IL-10 pro.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a sequência de ADN compreender:

   a. uma inserção de ADN seleccionada de entre o grupo constituído pelas sequências de nucleótidos apresentada na reivindicação 2, iniciando-se no nucleótido 1 e estendendo-se até ao nucleótido 1232, iniciando-se no nucleótido 374 e estendendo-se até ao nucleótido 1232, e iniciando-se no nucleótido 374 e estendendo-se até um nucleótido entre cerca do 851 e cerca do 962;

   b. sequências de ADN, as quais se hibridam, de forma

   73 146

   Sterling-Immunex

   2108

   -57detectável, com uma ou mais das inserções de ADN precedentes e que codificam ou expressam um polipéptido exibindo actividade biológica para clivar proteoliticamente o polipéptido de precursor da IL-1/3 humana num sítio de clivagem entre os resíduos Asp 116 e Ala 117; e

   c. sequências de ADN as quais, dada a degenerescência do código genético, codificam um polipéptido da IL-Ιβ pro de mamífero codificado por qualquer uma das sequências e inserções de ADN precedentes.
5. 5 - Processo de preparação de um vector de expressão recombinante compreendendo uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender a ligação operativa da sequência de ADN de acordo com a reivindicação 3 a um vector que codifica uma sequência de controlo da expressão.
6. 6 - Processo para a preparação de uma enzima de IL-lj8 pro de mamífero ou de um seu análogo ou derivado, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira adequada, compreendendo um vector de acordo com a reivindicação 5, sob condições promotoras da expressão.
7. 7 - Processo de preparação de um oligonucleótido anti-sentido compreendendo uma sequência de pelo menos 15 nucleótidos complementares a uma sequência de ADNc de IL-1/3 pro, inibindo o referido oligonucleótido anti-sentido a tradução do ARNrn da IL-ljS pro, caracterizado por compreender:

   i) ligar um nucleósido protegido a uma resina polimérica quimicamente inerte;

   ii) desproteger o nucleósido ligado;

   iii) acoplar o nucleósido desprotegido a um segundo nucleósido protegido:

   iv) repetir os passos (ii) e (iii) até se obter um oligonucleótido com a sequência desejada; e

   v) clivar o oligonucleótido anti-sentido da resina.
8. 8 - Processo de preparação de um composto compreendendo uma sequência de aminoácidos com 1 a cerca de 5 resíduos de amino73 146

   Sterling-Immunex

   2108 ácido possuindo um grupo bloqueador do terminal N e um resíduo Asp no terminal c ligado a um grupo que se despede electronegativo, correspondendo a referida sequência de aminoácidos substan— cialmente a, pelo menos, uma porção da sequência Ala-Tyr-Val-HisAsp, resíduos 112 a 116 da seguinte sequência:

   Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu 10 Ala Met Met Ala Tyr Tyr Ser Gly Asn Glu Asp 20 Asp Leu Phe Phe Glu Asp Gly Pro Lys 30 Gin Met Lys Cys Ser Phe Gin Asp Leu Asp 40 His Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile Gin Leu 50 Arg Ile Ser Asp Bis Tyr Ser Lys Gly 60 Phe Arg Gin Ala Ala Ser Val Val Val Ala 70 Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro 80 Cys Pro Gin Thr Phe Gin Glu Asn Asp Leu 90 Asp Ser Thr Phe Phe Pro Phe Ile Pbe Glu Glu 100 Glu Pro Ile Phe Phe Thr Trp Asp Asn 110 Glu Ala Tyr Val Bis Asp Ala Pro Val Arg 120 Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gin 130 Gin Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr 140 Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gin Gly Gin 150 Asp Met Glu Gin Gin Val Val Phe Ser Met 160 Ser Phe Val Gin Gly Glu Glu Ser Asn Asp 170 Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu 180 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys 190 Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gin Leu Glu Ser 200 Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys 210 Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile 220 Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser 230 Ala Gin Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr 240 Ser Gin Gin Asp Ala Ile Glu Thr 260 Asn Asp Met Phe Pro Thr Val Met Phe Gin Leu 250 Phe Gly Gly Val Ser Thr Ser 269 Lys Gly Gly

   73 146

   Sterling-Immunex

   2108 -59caracterizado por compreender:

   i) proporcionar um péptido bloqueado em N, possuindo um resíduo Asp no terminal C ligado a um grupo que se despede electronegativo;

   ii) remover o grupo bloqueador do terminal N;

   iii) acoplar o péptido não bloqueado a um segundo péptido bloqueado em N; e iv) repetir os passos (ii) e (iii) até se obter o composto com a sequência desejada.
9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o composto possuir a fórmula:

   Z—Qg-Asp—Qj na qual Z é um grupo protector do terminal N; Q₂ é 0 a 4 aminoácidos, de modo que a sequência Q₂-Asp corresponde substancialmente a pelo menos uma porção da sequência Ala-Tyr-Val-His-Asp, resíduos 112 a 116 da sequência representada na reivindicação 8, e Qj é um grupo que se despede electronegativo.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o composto ser seleccionado de entre o grupo constituído por Boc-Asp-CH2F, Boc-His-Asp-CH2F, Boc-Phe-Asp-CH2F, Boc-Pro-AspCH2F, Boc-Tyr-Asp-CH2F, Ac-His-Asp-CH2F, Ac-Phe-Asp-CH2F, Ac-ProAsp-CH2F, Ac-Tyr-Asp-CH2F, Cb3-His-Asp-CH2F, Cb3-Phe-Asp-CH2F, Cb3-Pro-Asp-CH2F e Cb3-Tyr-Asp-CH2F, no qual Boc é t-butiloxicarbonilo, Ac é acetilo e Cb₃ é benziloxicarbonilo.
11. 11 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar um portador fisiologicamente aceitável com um composto de acordo com a reivindicação 9.