DK166457B1

DK166457B1 - Faktor viii proteiner, der mangler aminosyrer i b-omraadet, rekombinant dna, der koder for saadanne proteiner, mammal vaertscelle indeholdende saadant dna, fremgangsmaade til fremstilling af proteinerne og proteinernes anvendelse i farmaceutiske praeparater

Info

Publication number: DK166457B1
Application number: DK601786A
Authority: DK
Inventors: John J Toole Jr
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 1985-04-12
Filing date: 1986-12-12
Publication date: 1993-05-24
Also published as: ES553935A0; DE3683980D1; EP0218712A1; AU5753490A; CA1341174C; ES8801674A1; EP0218712B1; WO1986006101A1; US4868112A; EP0218712A4; DK601786D0; AU5772886A; JPH0788399B2; JPS62502941A; DK601786A; LU90458I2; AU629649B2; ATE72838T1; MX9203440A

Description

i DK 166457 B1 f

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendt prokoagulationspro- j teiner og hidtil ukendt nukleinsyrer, der koder for disse, hvilke nukleinsyrer ved ekspression resulterer i et aktivt prokoagulationsprotein, der har en human faktor VIII:C's aminosyresekvens, men mangler en eller 5 flere aminosyrer i området mellem Arg-759 og Ser-1709. Også fremgangsmåder til fremstilling af proteinerne samt deres anvendelse i farmaceutiske præparater beskrives.

Faktor VI11: C er det blodplasmaproteiri, som er defekt eller fraværende ved Hæmofilia A. Denne sygdom er en arvelig blødningslidelse, som 10 rammer ca. én ud af 20.000 mænd. Strukturen af faktor VIII;C er beskrevet i US-patentansøgning nr. 546.650, indleveret d. 28. oktober 1983, og US-patentansøgning nr. 644.036, indleveret d. 24. august 1984, hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning, samt i Nature, 312:306, 307, 326 og 342.

15 Opfindelsen adskiller sig fra den af Toole et al. i Nature, bind 312:342 (1984), side 342-47 beskrevne faktor VIII:C ved, at proteinerne j ifølge opfindelsen samtidig med, at de har lignende prokoagulati onsaktivitet som faktor VIII:C, har betydeligt lavere molekylvægt.

Et af problemerne, der for tiden optræder i forbindelse med anvend-20 el sen af human faktor VI11:C til behandling af hæmofili, skyldes dens antigenicitet. En betydelig procentdel af blødere har udviklet en immunreaktion over for faktor VIII:C, som anvendes til deres behandling. Ikke -bl ødere kan også udvikle eller erhverve hæmofili, når deres immunsystem bliver sensibiliseret over.for faktor VIII:C og producerer cirkule-25 rende antistoffer eller "inhibitorer" over for faktor VI11:C. I begge tilfælde er resultatet en neutralisation af al faktor VIII:C, som måtte være til stede i patienten, hvilket gør en behandling meget vanskelig.

Hidtil har den metode, der er blevet valgt til behandling af blødere med dette problem ved forekomst af alvorlige blødningsepisoder, bestået i 30 administrering af ikke-human faktor VI11:C, såsom behandlet svinefaktor VIII:C. Se Kernoff et al., Blood 63-31 (1984). Antistofferne, som neutraliserer størkningsevnen af human faktor VIII:G, vil imidlertid i varierende grad reagere med faktor VIII:C af andre arter, og svineprote-inet er i sig selv antigenisk, således at både den kort- og den lang-35 sigtede effektivitet af en sådan behandling vil variere.

Patienterne vil desuden hyppigt udvise modreaktioner over for infusion med svinefaktor VI11:C. Anvendelsen af svinefaktor VI11:C på trods af denne risiko har været berettiget p.g.a. manglen på pålidelige, virk 2 DK 166457 B1 somme alternativer. Kernoff, supra, s. 38. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer et alternativ til administreringen af svinefaktor VIII:C.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer aktive prokoagulationsproteiner, der har en human faktor VIII:C's aminosyresekvens, men mang-5 ler en eller flere aminosyrer i området mellem Arg-759 og Ser-1709, hvor aminosyrenummereringen er i forhold til Met-1 i human faktor VIII:C ledersekvensen.

Opfindelsen tilvejebringer desuden rekombinant DNA, der ved ekspression resulterer i et sådant aktivt prokoagulationsprotein, en ved 10 genteknik frembragt mammal værtscelle, der indeholder og er i stand til at udtrykke sådant DNA, samt en fremgangsmåde til fremstilling af prokoagulati onsproteinet ved dyrkning af en således frembragt mammal værtscelle under betingelser, der tillader ekspression af proteinet.

I et særligt aspekt tilvejebringer opfindelsen et farmaceutisk præ-15 parat omfattende et sterilt præparat indeholdende en virksom mængde af prokoagulationsproteinet i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer, specielt et præparat til behandling af Hæmofilia A.

De omhandlede proteiner kan skematisk illustreres ved formel (1): 20 A-X-B (1) hvori A betegner en polypeptidsekvens, der i det væsentlige duplikerer sekvensen Ala-20 til og med Arg-759, B betegner en polypeptidsekvens, der i det væsentlige duplikerer sekvensen Ser-1709 til og med C-termina-25 len Tyr-2351, og X betegner en polypeptidsekvens med indtil 949 aminosyrer, der i det væsentlige duplikerer aminosyresekvenserne i sekvensen Ser-760 til og med Arg-1708, men hvor en eller flere af aminosyrerne i sidstnævnte sekvens mangler. Aminoterminalen af område X er via en peptidbinding (betegnet i formel 1) covalent bundet til carboxytermi-30 nalen af A. Carboxyterminal en af område X er ligeledes bundet til ami-noterminalen af B. Nummereringen af aminosyrer refererer i hele beskrivelsen til nummereringen af aminosyrerne i tabel 1, hvor den første aminosyre, Met, af ledersekvensen betegnes som nr. 1. Proteinområdet X kan omfatte en kontinuert, men kortere sekvens udvalgt fra området Ser-760 35 til og med Arg-1708. Alternativt kan X omfatte to eller flere fra dette område udvalgte aminosyresekvenser, som er covalent bundet via en peptidbinding (idet der bibeholdes en stigende nummerorden af aminosyrer).

DK 166457 Bl 3

Tabel 1 DNA-sekvens, der koder for det komplette faktor VIII:C molekyle 5 · CAATTccccACTCGCTAAcrrccTTAAATccT<rrccAAACAAATTCccAcrrTrcArrAAATCACAAArr

TTACTTTTCTCCCCTCCICCCACCTAAACATATTnAGACAA6AATTAACCTTTTCCTTCTCCACTTeAACATTTCTACCAATAACTC

HET Cln II« Clu Lau Sar Thr Cya Ph« fh* Lau Cy« t«u Lau Ac* Phe Cy· Ph« 18

AIG CAA ATA CAC CTC TCC ACC TCC TTC TTT CTG TCC . CTT TTC CCA TTC TCC TTT

Sar Ala Thr Ac* Ar* Tyr Tyr Lau Gly Ala Val Clu Le« Ser Trp Aap Tyf LET 36

ACT CCC ACC AGA ACA TAC TA C CTC CCT CCA CTC CAA CTC TCA TGC CAC ΤΛΤ ATC

Gin Ser Asp L«i Cly Clu Leu Pro Val Asp · Ala Ar* fha Pro Pro Ar* Val Pro 54

CAA AGT GAT CTC CCT CAG CTG CCT CTC CAC CCA ACA TTT CCT CCT ACA CTG CCA

Lys Sar Ph« Pro Ph« Aan Thr S«r Val Val Tyr Ly« Lys Thr Lau Pha Val Clu 72

AAA TCT TTT CCA TTC AAC ACC TCA CTC CTC TAC AAA AAC ACT CTC TTT CTA CAA

Ph« Thr Val Hla l*u Ph« Aan II« Ala Lys Pro Ac* Pro Pro Trp MET Cly Leu 90

TTC ACG CTT CAC CTT TTC AAC ATC CCT AAC CCA ACC CCA CCC TCC ATC CCT CTG

L«u Cly Pro Thr II« Gin AU Clu Val Tyr Aap Thr Val Val Ile Thr L«o Ly« 103

CTA CCT CCT ACC ATC CAC CCT CAC CTT ΤΑΓ CAT ACA CTC CTC ATT ACA CTT AAC

A«n MET Ala Sar HU Pro Val Sar La« Hi« Ali Val Cly Val Sar Tyr Trp Ly* 12S

AAC ATC CCT TCC CAT CCT CTC ACT CTT CAT CCT GTT CCT CTA TCC TAC TGG AAΛ

Al«-. Sar Clu Cly Al« Clu Tyr A«p A«p CIn Thr Ser Cln Ar* Clu Ly* Clu Aap 144

CCT TCT CAC CCA CCT CAA TAT CAT CAT CAC ACC ACT CAA ACC CAC AAA CAA CAT

Aap Ly« V«1 Ph« Pro Gly Cly S«r Hl« The lyr Val Trp Cln Val Lau Ly* Clu 162

CAT AAA CTC TTC CCT CCT CCA ACC CAT ACA TAT CTC TCC CAC CTC CTC AAA CAC

Acn Cly Pro MET Ala S*c A*p Pro l«u Cy* Lau The Tyr Sar Tyr Le« Sar Kis

ΑΑΓ CCT CCA ATC CCC TCT CAC CCA CTC TCC CTT ACC TAC TCA TAT CTT TCT CAT

V*1 Asp L.« Val Ly. Asp Leu A»« Ser Cly Lau 11« Cly AU Le« Lau Val Cy« 198

CTC CAC CTC CTA AAA CAC TTC AAT TCA CCC CTC ATT CCA CCC CTA CTA CTA TCT

Ar, Clu Cly Sar Lau Al. Ly« Clu Ly« The Gtn The Uu His Ly« Phe Ha U« 21β

ACA CAA CCC ACT CTC CCC AAC CAA AAC ACA CAC ACC TTC CAL AAA ITT ATA CTA

U Fh« AU V*1 Ph. Arp Cl. Cl, l„ S.« Trp HU S« Ch, thr h,. A.« S«r 23«

CTT TTT CCT CTA TTT CAT CAA CCC AAA ACT ICC CAC TCA CAA A^A AAC AAC TCC

S 35 S is Ά iS Si Si Si Si is Si s s is £ £ £152 ; Si S? cct Si Si iS iS ?« SS £ £ £ in £ t« Si £ £ £ £ £ tcc Si Si iS S IS £ £ Si £ Si Si Si £ Si2 * a Si Si Si Si £ £ s? Si £ Si Si £ Si iii s s S- 4

Tabel Ί (fortsat) DK 166457 B1 II« Ser Pro II« The Ph« L«u The AU Cl., The leu Lcu H£T Mp Lcu C ly « 324

ATC TCC CCA ata ACT TTC CTT ACT CCT CAA ACA CTC TTC ATC CAC CTT

Ph«' Leu Lau Ph« Cy« Ui* II« Ser Ser Hl* C In Hl* Asp Cly HET Clu AU Tyt

TTC CIA CtC ITT TCT CAT ATC TCT TCC CAC CAA CAT CAT CCC ATC CAA CCT

Cl 360

Val Lys Val Asp S«r Cy* Pro Clu Clu Pro Gin Lcu Ar* HET Lyu As« Asn u

CTC AAA CTA CAC ACC TCT CCA CAC CAA CCC CAA CTA CCA ATC ΑΛΑ ΛΑΤ AAT

372

Clu Al*- Clu A*p Tyr A«p Asp Asp leu Thr Asp Ser Clu MET Asp Val Val Ar«

CAA CCC CAA CAC TAT CAT CAT CAT CTT ACT CAT TCT CAA ATC CAT C*C CTC AU

396

Ph« Asp Asp Asp Asn S«r Pro Ser Ph« II« Cln II« Ar* S«r V*1 Ala Ly* Ly«

ITT C AI CAT CAC AAC TCT CCX TCC TTT ATC CAA ATT CCC TCA CTT CCl AAC

414

Hl* Pro Ly« Thr Trp Val Hl* Tyr II« Aln Ala Clu Clu Clu Asp Trp Asp Tyr CAT CCT AAA ACT ICC CTA CAT TAC ATT CCT CCT CAA CAC CAC CAC TCC CAC. ϊΛί Λ22 AU Pro Leu Val L«u Als Pro Aap Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Cln Tyr L«u Asa CCT CCC TTA CTC CTC CCC CCC CAT CAC ACA ACT TAT AAA ACT CAA TAT TTC AAC.

Asn C ly Pro Gin Ar* Ile Cly Ar* Lya Tyr Ly* Lys Val Ar* Phe HKT Al* Tyr 450 ΛΑΤ CCC CCT CAC CCC ΛΙΤ CCT ACG AAC TAC ΛΛΛ ΛΛΛ CTC CCA TTT ATC CCA ΤΛ.

468

Thr Asp Clu Thr Ph« Lys Thr Ar* Ctu AU Ile Cln His Clu S«r Cly II«

Aa CAT CAA ACC TTT AAG ACT CCT CAA CCT ATT CAC CAT CAA TCA CCA ATC TTC

486

Cly Pro i* u L«u Tyr Cly Clu V«1 Cly Asp Thr L«u L«u Ile Ile Ph« Ly« A«n

CCA CCT TTA CTT TAT CCC CAA . CTT CCA CAC ACA CTC TTC ATT ATA TTT AAG AAT

Cln Al« S«r Ar* Pro Tyr A*n II« Tyr Pro Hl* Cly Ile Thr Asp Val- nr* Pro

CAA CCA ACC Aa CCA TAT AAC ATC TAC CCT CAC CCA ATC ACT CAT CTC CCT CCT

Leu Tyr Ser Ar* Ar* Leu Pro Ly* Cly Val Lys Kl* Leu Lys Asp Ph« Pto II« S22 ttc tat τα acc aca tta ca aaa cct cta aaa cat ttc aac cat ttt cca att

Lcu Pro Cly Clu Ile Ph« Ly* Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Clu Asp Cly Pro ^4®

CTC ca CCA CAA ATA TTC AAA TAT ΑΛΑ TCC ACA CTC ACT CTA CAA CAT CCC CCA

Thr Ly« Ser A*p Pro Ar* Cy« L«u Thr Ar* Tyr Tyr S«c S«r Phe Val A*n HET 558

ACT AAA TCA CAT CCT CCC TCC CtC ACC CCC TAT TAC TCT ACT TTC CTT AAT ATC

Clu Ar* Aap L«u Ala S«r Cly Lau IL« Cly Pro Uu Uu Ue Cy* Tyr Ly* Clu 576

CAC ACA CAT CTA CCT TCA CCA CTC ATT CCC CCT CTC CTC ATC TCC TAC ΛΛΛ C-AA

cqi

Ser Val A*p Cln Ar* Cly Asn Cln II« HIT Ser A*p Lys Ar* Asn Val Ile L«u

XCX CTA CAT CAA ACA CCA AAC CAC ΑΤΛ ATC TCA CAC AAC ACC MT CTC ATC- CTC

Ph« S«r Vnl Ph« A*p Clu A«n Af* Ser Trp Tyr L«u Thr Clu Asn Ile Cln Ar* 832

ΤΠΓ TCT CTA TTT CAT CAC AAC CCA ACC ICC T.\C CTC Aa CAC ΑΛΤ ΛΤΛ CAA CCC

Ph« Lcu Pro A«n Pro AU Cly Val Cli« Leu Clu Asp Pro Clu Phe dn Ala Ser 630

ttt ctc ccc aat ca CCT ca CTU CAC CTT CAC CAT CCA CAC ttc cm CCC TCC

Asn Ile HET Hl* S«r 11« A*n Cly Tyr V«I Ph« Asp Ur l«u Cln Leu S«r V.l 648

MC ATC ATC CAC ACC ATC MT CCC ΤΛΤ CTT TTT CAT ACT TTC CAC TTC Ta CTT

Tabel Ί (fortsat) 5 DK 166457 B1

Cy* Leu His Clu Val Ala Tyr Trp Tyr Ilt L«u S«r Ile Cly Al* Cln Thr Asp 666

TCT TTC CAT CAC CTC CCA TAC TCC TAC ATT CTA ACC ATT CCA CCA GU« ACT CAC

Pha. U Str Val Phe Pha Sar Cly‘ Tyt Tlir Phe Lys His Lys MET Val Tyr Clu

TTC CTT TCT CTC TTC TTC TCT CCA TAT ACC TTC AAA CAC ΛΛΑ ATC* CTC TAT CAA

Asp Thr Leu Thr Leu Pha Pre Pha Sar Cly Clu Thr Val Phe MET Ser MET Clu 702

CAC ACA CTC ACC CTA TTC CCA TTC TCA CCA CAA ACT CTC TTC ATC TCC ATC CAA

Aaa Pro Cly Leu Trp Ile Lau Cly Cys Als Asn Ser Asp Ph« Arg Asn Arg Cly 720

AAC CCA CCT CTA TCC ATT CTC CCG TCC CAC. AAC TCA CAC ΤΤΓ CCC AAC ACA CCC

738 MET The Al* Lau Lau Ly« Val Ser Ser Cya Asp Lya Asn Thr Cly Aap Tyr Tyr

ATC ACC CCC TTA CTC AAC CTT TCT ACT TCT C.\C AAC AAC ACT CCT CAT ΤΑΓ TAC

Clu Asp Sar Tyr Clu Aap II« Ser Als Tyr Leu Leu Sar Lys Asn Asa Ala Ile 756

CAC CAC ACT TAT CAA CAT ATT TCA CCA TAC TTC CTC AGT AAA AAC ΑΛΤ CCC ATT

Clu · Pro Arg Ser Ph« Ser Cln A«n Sar Arg His Pro Ser Thr Arg Cln Lys Gin 774

CAA CCA ACA ACC TTC TCC CAC AAT TCA ACA CAC CCT ACC ACT ACC CAA AAC CAA

Ph« Aan Al« Thr Thr lie Pro Clu Asn Asp 11« Clu Lys Thr Asp Pro Trp ?he 792

TTT AAT CCC ACC ACA ATT CCA CAA AAT CAC ΛΤΑ CAC AAC ACT CAC CCT TCC TIT

Al* His Arg Thr Pro MET Pro Lys II« Cln Asn Val Ser S«r Ser Asp Leu Leu 810 CCA CAC ACA ACA CCT AIG CCT AAA ATA CAA AAT CTC TCC TCT ACT CAT TTC TTC - MET L«u Lau Arg Cln Ser Pro Thr Pro Kis Cly Leu Sar Lau Ser Asp Leu Cln 828 .

atc ctc rrc cca cac act cct act cca cat ccg cta tcc ττλ tct cai ctc caa

AJA

Clu Ala Ly« Tyr Clu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro* Cly Aln Γ1« Asp Ser

CAA CCC AAA TAT CAC ACT TTT TCT CAT CAT CCA TCA CCT CCA CCA Λ7Λ CAC AGT

Asn Asn Sar Leu Ser Clu MET Thr His Phe Arg Pro Cln Leu His Uls Ser Cly 86*

AAT AAC ACC CTC TCT CAA ATC ACA CAC TTC ACC CCA CAC CTC CAT CAC ACT CCC

887

Aap MET Val Ph« Thr Pro Clu Ser Cly Leu Cln Lau Atc Le« Aan Clu Lys Leu

CAC ATC CTA TTT ACC CCT CAC TCA CCC CTC CAA TTA ACA ΤΤΛ AAT CAC ΛΛΛ CTC

Cly Thr Thr Al« Als Tlir Clu Leu Lys Lys Leu Asp The Lyj Val Sur Sar Thr 800

CCC ACA ACT CCA CCA ACA CAC TTC AAC AM CTT CAT TTC ΛΛΛ CTT TCT ACT ACA

Ser Asn Aan Lau II« S«r Thr Ile Pro Sar Asp Asn Lau Ala Ala Cly The Asp

TCA AAT AAT CTC ATT TCA ACA ATT CCA TCA CAC ΑΛΤ TTC CCA CCA CCT ACT CAT

Aan Thr Sar Ser Lau Cly Pro Fro Sar MET Pro Val His Tyr Asp Sar Cln Leu 936

AAT ACA AGT TCC TTA CCA CCC CCA ACT ATC CCA CTT CAT TAT CAT ACT CAA TTA

Asp Thr Thr Leu Pli« Cly Lys Lys Ser Sar Pr« Leu Thr Clu Ser Cly Cly Pro "6

CAT ICC ACT CTA ITT CCC AAA AAC TCA TCT CCC CTT ACT CAC TCT CCT CCA CCT

Lau Sar Lau Sar Clu Clu Asn Asn Asp Sar Lys Leu Leu Clu Sar Cly Ltu HET 972

CTC ACC TTC ACT CM CAA ΑΛΤ AAT CAT TCA AAC TTC TTA CAA TCA CCT TTA ATC

Asn Ser Cln Clu Sar Sar Trp Cly Ly« Asn Val S<*r Ser Thr Clu Ser Cly Arg 998

AAT ACC CM CM ACT TCA TCC CCA AAA AAT CTA TCC TCA ACA CAC ACT CCT ACC

Tabel 1 (fortsat) 6 DK 166457 B1

Le« ph« Lys C ly Lys Arg AU Hts Cly Pro Ala Le« »c« Thr Lys Asp Asn Al«1'008 ΤΤΛ rrr AAA ccc AAA aca cct CAT CCA CCT CCT TTC TTC ACT ΑΛΑ CAT ΑΛΤ ccc

Le« Ph« Ly« Val Ser 11« Ser Luu Leu Ly* Thr Ai.n Lys TUr Sur Aso A«n Ser

TTC ΑΛΛ CTT ACC ATC TCT TTC TTA AAC ACA AAC ΛΑΛ ACT TCC AAT ΑΛΤ TCA

Alu Thr Asn Arg Ly· Thr His II« Asp Cly Pro S«r Leu Leu II« Cl« A«n Ser 1.044

CCA ACT ΑΛΤ ACA - AAC ACT CAC ATT CAT CCC CCA TCA TTA ΠΑ ATT CAC AAT AGT

Pro S«r Val Trp Cln Asn Ile Luu Ciu Sur Asp Thr Clu Ph« Lys Lys Val Tlir 1,062

CCA TCA CTC TCC CAA AAT ATA TTA C AA ACT CAC ACT CAC TTT AAA AAA CTC ACA

Pro Luu 11* His Asp Arg MET Uu MET Asp· Lys Asn Aia The Ala Leu Arg Luu1'080

CCT TTC ATT CAT CAC ACA AIC CTT ATC CAC ΛΛΑ .VAT CCT ACA CCT TTC ACC CTA

Asn Kis MET Sur Asn Lys The Thr Ser Ser Lys Asn MET Clu MET Val Cln Cln l·'888

AAT CAT AIC TCA ΛΑΓ AAA ACT ACT TCA TCA AAA ACC ATC CAA ATC CTC CAA CAC

Ly» Lys Clu Cly Pro tie Pro Pro Asp Ala Cln Asn Pro Asp MET Ser Ph« Phc 1,116

AAA AAA CAC CCC CCC ATT CCA CCA CAT CCA CAA AAT CCA CAT AIC ICC TTC TTT

Lys MET L«u Ph« Leu Pro Clu Ser Ala Arg Trp TI« Cln Arg Thr His Cly Lys 1,134

AAC ATC CTA TTC TTC CCA CAA TCA CCA ACC TCC ΑΤΛ CAA ACC ACT CAT CCA AAG

A«n Sur Leu Asn Sut Cly Cln Cly Pro Sac Pro Lys Cln Lcu V*1 Sur Lcu C1/1.1S2

AAC TCT CTC AAC TCT CCC CAA CCC CCC AGT CCA AAC CAA TTA CTA TCC TTA CCA

Pro Clu Lys Sur V«1 Clu Cly Cln Asn Phc Luu Sur Clu Lys Aen Lys Val Val 1,170

CCA CAA AAA TCT CTC CAA CCT CAC AAT TTC TTC TCT CAC ΛΑΛ AAC AAA CTC CTA

Val Cly Lys Ciy Clu PI·« The Lys Asp Val Cly Luu Lys Clu HCT Val Ph« Pro l»!·88

CTA CCA AAC CCT CAA TIT ACA MG CAC CTA CCA CTC AAA CAC ATC CTT TTT CCA

Ser Ser Arg Asn Lcu Ph« Leu Thr Asn Leu Asp Aon Leu His Clu Asn Asn Thr 1,206

ACC ACC ACA AAC CTA TIT CTT ACT AAC TTC CAT AAT TTA CAT CAA MT AAT ACA

His Asn Cln Clu Lys Lys Ilo Cln Clu Clu il« Clu Lys Lys Clu Thr Luu Ile 1,224

CAC AAT CAA CAA ΛΑΑ AAA ATT CAC CAA CAA ATA CAA AAC AAC CAA ACA TTA ATC

Cln Clu Asn Val Val L«u Pro Cln II« His Thr Val Thr Cly Thr Lys Asn Ph« 1,242

CAA CAC AAT CTA CTT TTC CCT CAC ATA CAT ACA CTC ACT CCC Aa AAC AAT TTC

MET Lys Asn Luu Ph« Leu Leu Ser Thr Arg Cln Asn Vol Clu Cly S*r Tyr Clu 1,260

ATC AAC AAC CTT TTC TAA CTC ACC ACT ACC CAA MT CTA CAA CCT TCA ΤΛΤ CAC

Cly Als Tyr Ala Pro Val Leu Cln Asp Ph« Arg Ser Lou Asn Asp Ser Thr Asn 1,278

CCC CCA TAT Ca CCA CTA CTT CAA CAT TTT ACC TCA TTA AAT CAT TCA ACA AAT

Arg Thr Lys Lys Kis Thr Al« His Ph« Ser Lys Lys Cly Cl« clu Clu Asn Leu 1,296

ACA ACA AAC ΑΛΑ CAC ACA CCT CAT TTC TCA AAA AAA CCC CAC CAA CAA AAC TTC

Clu Cly Luu Cly Asn Cln Thr Lys Cin 11« Val Clu Lys Tyr AU Cys Thr Thr 1,314

CAA CCC TTC CCA AAT CAA ACC AAC CAA ATT CTA CAC AAA TAT CCA TCC ACC ACA

Arg II« Ser Pro Asn Thr Sur Cln Cln Asn Ph« Val Thr Cln Arn Sur Lys Arg 1,332

ACC ATA TCT CCT AAT ACA ACC CAC CAC AAT ITT CTC ACC CAA CCT ACT AAC ACA

DK 166457 B1

Tabel 1 (fortsat) 7 AL« l«u Ly·· Kln Ph« Ar»· Lcu Fro L«u Glu Cl« Thr C lu Leu Clu Lyn Arg IX· 1*350 CCT TTC AAA CAA TTC ACA CTC CCA CTA CAA CAA ACA CAA CTT CAA AAA ACC ΛΤΑ II·· Val Asp A*p Thr Ser Thr Clit Trp Ser ty* Asn MKT Ly* Ht· te« Thr Pro· 1*368

ATT <.TC CAT CAC ACC TCA ACC CAC TCC TCC ΑΛΛ AAC ATC AAA CAT TTC ACC CCC

Ser Thr L«u Thr Cln Ilo . Asp Tyr Asn Glu Lys Cl« Ly* Cly Ala U« Thr Cln 1.336

ACC ACC CTC ACA CAC AIA CAC TAC AAT CAC AAC CAC AAA CCC CCC ATT ACT CAC

Ser Pro L«u Ser Asp Cy« Leu Thr Arg Ser Hl* S«r ti« Pro Cln Ala A*n Ar* l«<°*

TCT CCC TTA TCA CAT TCC CTT ACC ACC ACT CAT ACC ATC CCT CAA CCA AAT ACA

Ser Pro L«a Pro II« AU Lys Vsl Ser S« r Ph« Pro Ser Ila Arg Pro Ile Tyr 1**22

TCT CCA TTA CCC ATT CCA AAC CTA TCA TCA TTT CCA TCT ATT ACA CCT ATA TAT

le« Thr Arg Val Leu Ph· Cln Asp Asn Ser Ser His Lea Tro Al« Ala Ser Tyr 1***0

CTC ACC ACG CTC CTA TTC CAA CAC AAC TCT TCT CAT CTT CCA CCA CCA TCT TAT

Art ly« Lys Asp Ser Cly Val Cln Cl« Ser Ser His Ph« Le« Cln Cly Ala Lys 1**58

ACA AAC AAA CAT TCT CCC CTC CAA CAA ACC ACT CAT TTC TTA CAA CCA CCC AAA

Cy* Aan Asn L*u Ser l<u Al« Ile L«« Thr Leu Clu HET Thr Cly Asp Cln Arg *

AAA .UT AAC CTT TCT TTA CCC ATT CTA ACC TTC CAC ATC ACT CCT CAT CAA ACA

Cl« Val Cly Ser Le« Cly Thr Ser Al« Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys -Lys Val l.*9* ;

CAC CTT CCC TCC CTC CCC ACA ACT CCC ACA AAT TCA CTC ACA TAC AAC ΛΑΑ CTT

Cl« A*n Thr Vel Le« Pro Lys Pro Asp le« Pro Lys Thr Ser Cly Lyr V»1 i;l« l*512j

CAC AAC ACT CTT CTC CCC AAA CCA CAC TTC CCC AAA ACA TCT CCC AAA CTT CAA

L*u L«u Pro Lys Vel Hl« Ile Tyr Cln Lys A«p Leu Ph« Pro Thr Cl« Thr S«r 1*530

TTC CTT CCA AAA CTT CAC ATT TAT CAC AAC CAC CTA TTC CCT ACC CAA ACT ACC

1 ej O

Asn Cly S« r Pro Cly His L«u Asp Leu Val Cl« Cly Ser Leu Le« Cln Cly Thr '

AAT CCC TCT CCT CCC CAT CTC CAT CTC CTC CAA CCC ACC CTT CTT CAC CCA ACA

Cl« Cly Al« tie Ly* Trp Asn Cl« Ala Asn Arg Pro Cly Ly* V*1 Pro Ph« Le« l*S6fi

CAC CCA CCC . ATT AAC TCC AAT CAA CCA AAC ACA CCT CCA AAA CTT CCC TTT CTC

Arg V«l Al« Thr Clu S«r Ser Al* Ly* Thr Pro Ser Lys Le« Le« Asp Pro Le« 1*58*

ACA CTA CCA ACA CAA ACC TCT CCA AAC ACT CCC TCC AAC CTA TTC CAT CCT CTT

Al« Trp Asp Asn His Tyr Cly Thr Cln Ile Pro Ly* Cl« Clu Trp Ly« S«r Cln 1,602

CCT TCC CAT AAC CAC TAT CCT ACT CAC ΑΤΛ CCA AAA CAA CAC TCC ΛΛΛ TCC CAA

1 520

Cl« Lys S«r Pro Clu Ly* Thr Al* Ph« Lys Lys Ly* Asp Tl»r £1« L«u Sne Le« *

CAC AAC TCA CCA CAA AAA ACA CCT TTT AAC AAA AAC CAT ACC ATT TTC TCC CTC

1 S38 A«n Ala Cy* Clu Ser Asn His Ala II« Ala AU ti« A.-n Clu Cly Cln .'.sn Lys

AAC CCT TCT CAA ACC ΑΑΓ CAT CCA ATA CCA CCA ATA AAT CAC CCA CAA ΛΛΤ AAC

ir« Cl« IU Cl« Val Thr Trp Ala Lys Cln Cly Arg Thr Cl« Arg Le« Cy* Ser 1*656

CCC CAA ATA CAA CTC ACC TCC CCA AAC CAA CCT ACC ACT CAA AG« CTC TCC TIT

Cln Asn Pro Pro Ynt Uu Lys Arg His Cln At« Glu II* Thr Arg Thr IhC Lcu *·?74

CAA AAC CCA CCA CTC TIC AAA CCC CAT CAA CCC CAA ATA ACT CCT ACT ACT CTT

Tabel 1 (fortsat) 8 DK 166457 B1

Cln Ser A.p Cln Clu Clu Uc Asp Tyr Asp Asp Thr II- Ser Val Clu MET Ly* 1.692

CAC ICA CAT CAA CAC CAA ATT CAC TAT CAT CAT ACC ATA TCA CTT CAA ATC AAC

Ly. Clu Asp The A«p Ile Tyr Asp Cl« Asp Cl« Asn Cln Ser Pro Arg Ser Ph« 1.710

AAC CAA CAT TTT CAC ATT TAT CAT CAC CAT CAA AAT CAC ACC CCC CCC ACC ITT

Cln Ly. Ly. Thr Arg His Tyr Ph. Il« Ale Ala Val Clu Arg Leu Trp Asp Tyr 1.728

CAA AAC AAA ACA CCA CAC TAT TTT ATT GCT CCA CTC CAC ACC CTC TCC CAT TAT

Cly MET S«r S.r S.r Pro KU V«l Le« Arg Asn Arg Ala Cln S.c Cly S.r Vel 1.746

CCC ATC ACT ACC TCC CCA CAT CTT CTA ACA AAC ACC CCT CAC AGT CCC ACT CTC

Pro Cln Ph« Ly« Ly* Vel Vel Ph« Cln Clu Phc Thr Asp Cly Ser Ph« Thr Cln 1,764

CCT CAC TTC AAC AAA CTT CTT TTC CAC CAA TTT ACT CAT CCC TCC TTT ACT CAC

Pro Leu Tyr Arg Cly Clu L.u · Asn Clu KU Leu Cly L«u L«u Cly Pro Tyr 11« 1.782

CCC TTA TAC CCT CCA CAA CTA AAT CAA CAT TTC CCA CTC CTC CCC CCA TAT ATA

Arr Ale Clu V.l Clu Asp Asn II« MET Val Thr Phe Arg Asn Cln Ale S«r Arg 1,800 ACA CCA CAA CTT CAA CAT AAT ATC ATC CTA ACT TTC ACA AAT CAC CCC TCT CCT .

Pro Tyr Ser Ph* Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Clu Clu Asp Cln Arg Cln Cly 1,818

CCC TAT TCC TTC TAT TCT ACC CTT ATT TCT TAT CAC CAA CAT CAC ACC CAA CCA

Al* Clu Pro Arg Ly. Asn Ph« Vel Lys Pro A.n Clu Thr Ly. Thr Tyr Ph« Trp 1.836

CCA CAA CCT ACA _ AAA AAC TTT CTC AAC CCT AAT CAA ACC AAA ACT TAC TTT TCC

Ly. Vel Cln HU HU MET Ale Pro Thr Lys Asp Clu Ph« Asp c*· Lys Ale Trp 1.854,

AAA CTC CAA CAT CAT ATC CCA CCC ACT AAA CAT CAC TTT CAC TCC AAA CCC TCC

Ala lyr Phe Ser A.p Val A.p Leu Clu Lys Asp Val HU Ser Cly L«u Ile Cly 1.872

CCT ΤΑΓ TTC TCT CAT CTT CAC CTC CAA ΛΛΛ CAT CJC^ CAC TCA CCC CTC ATT CCA

Pro Leu Leu Vel Cys Hl* Thr Asn Thr L«u Asn Pro Ala His Cly Arg Cln Val 1.890

CCC CTT CTC CTC TCC CAC ACT AAC ACA CTC AAC CCT CCT CAT CCC ACA CAA CTC

The Val Clu Clu Phe Ala Leu Phe Ph* Thr tle Phc Asp Clu Thr Ly* Ser Trp 1.908

ACA CTA CAC CAA TTT CCT CTC TTT TTC ACC ATC TTT CAT CAC ACC AAA ACC TCC

Thy Phe Thr Clu A.n MET Clu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys A.u 11« Cln MET 1,926

TAG TTC ACT CAA AAT ATC CAA ACA AAC TCC ACC CCT CCC TCC AAT ATC CAC ATC

Cl« A.p Pro Thr Phe Lys Clu Aen Thr Arg Phc His Ala II« A«n Cly Tyr U« 1.¾44

CAA CAT CCC ACT ΓΓΓ AAA CAC AAT TAT CCC TTC CAT CCA ATC AAT CCC TAC ATA

HET A.p Thr Leu Pro Cly Leu Val MET Al« Cln Asp Cln Arg Ile Arg Trp Tyr 1.962

ATC CAT ACA CTA CCT CCC TTA CTA ATC CCT CAC CAT CAA ACC ATT CCA TCC TAT

Leu Leu Ser MET Cly Ser A*n Clu Asn liv «Is Ser I!« Hl« Fh« Ser Cly HU 1.980

CTC CTC ACC ATC CCC ACC AAT CAA AAC ATC CAT TCT ATT CAT TTC ACT CCA CAT

Vel Ph* Thr Val Arg Ly.n Lys Clu Clu Tyr Lys HET AU Leu Tyr Aen Leu Tyr 1.998

jjg txc ACT CTA CCA AAA AAA CAC CAC lAT ΑΛΑ ATC CCA CTC TAC AAT CTC TAT

Pro Cly Vel Phe Clu Thr Vel Clu MET Len Pro S«r lys Ala Cly II« Trp Arg 2,016

CCA CCT CTT TTT CAC ACA CTC CAA ATC TTA CCA ICC AAA CCT CCA ATT TCC CCC

Tabel 1 (fortsat) 9 DK 166457 B1 VMl Cl« Cv* t«u lie Cly Clu HU Leu III* Ala Uly MCT Ser Tl.c Leu Ph« l«. 2'034

CK CM KC CTT ATT CCC CAC CAT CTA CAT CCT O« AtC ACC ACA ΟΓΓ ΠΤ CTC

i·, i Tyr s«r A«n Ly* Cy* Clu Thr Pro L.u Cly HET Al* Ser Cly Hl* II« Arg *,0S2

CTC TAC ACC aAT AAC TCT CAC ACT CCC CTC CCA ATC CCT TCT CCA CAC ATT ACA

A.O Ph« Cln Ile Thr AU Ser Cly Cl n Tyr Cly Cln Trp AU Pro ty* Uu Al« 2'070 cat rrr cac att aca cct tca cca caa ταγ cca cac tcc ccc cca aac ctc ccc 2 088

Ar* Uu Hl* Tyr Ser Cly See TU Asa AU Trp Ser Thr Ly* Clu Pro Pli« S*r *

ACA CTT CAT TAT TCC CCA TCA ATC AAT CCC TCC ACC ACC AAC CAC CCC TIT TCT

Tro tic Lya Val A*p Uu L«u Al« Pro MET II« II« Hl* Cly II« Ly* Thr Cln

TCC ATC AAC CTC CAT CTC TTG CCA CCA ATC ATT AIT CAC CCC ATC AAC ACC CAC

Cly Al« Arg Glo Ly* Ph« S«r S«r Le« Tyr IL« Ser. Cla Ph« II« 11« ΗΕΓ Tyr

CCT CCC CCT CAC AAC TTC TCC ACC CTC TAC ATC TCT CAC ΤΓΤ ATC ATC ATC TAT

S«r Uu A*p Cly Ly* Ly* Trp Cln Thr Tyr Arg Cly A*n S«r Thr Cly Thr L«u

ACT CTT CAT CCC AAC AAC TCC CAC ACT TAT ' CCA CCA AAT TCC ACT CCA ACC TT A

ΗΕΓ V«l ?h« Ph« Cly Asn V*1 Asp S«r S«r Cly ti« Ly* Hl« Asn li« Phc Asn 2,160 atc ctc ttc rrr ccc aat er c cat tca tct ccc ata aaa cac aat att tit aac 2 178 !

Pro Pro II« II« AU Arg Tyr II« Arg L«u Hi* Pro Thr Hi* Tyr Ser 11« Arg *

CCX CCA ATT ATT CCT CCA TAC ATC CCT TIC CAC CCA ACT CAT TAT ACC ATT CCC

2 196 S«r Thr Leu Arg MET Clu Uu MET Cly Cy* Asp. Lcu As« Sur Cy* S«r MET Pro *

ACC ACT CTT CCC AIG CAC TTC ATC CCC TCT CAT ΤΤΛ AAT ACT TCC ACC ATC CCA

2 214 1

Uu Cly HET Clu S«r Lys Al* II« Ser Asp Al* Cln tic Thr Al* S«r S«c Tyr *

TTG CCA ATC CAC ACT AAA CCA ATA TCA CAI CCA CAC ATT ACT CCT TCA TCC TAC

2 232

Ph« Thr A«n MET Ph« Al* Thr Trp S«r Pt o Ser Ly* Al* Arg L«u Hl* Leu Cln rrr acc aat atc rrr ccc acc tcc tct cct tca am cct cca err cac ctc caa

Cly Arg S«r Asn Al* Trp Arg Pro Cln V*1 Asn Asn Pro Lys Clu Trp Leu Cln 2*250

CCC ACC ACT AAT CCC TCC ACA CCT CAC CTC MT AAT CCA AM CAC TCC CTC CM

2 268 V«1 A*P Ph« Cln Ly« Thr MET Ly« V*1 Thr Cly V«1 Thr Thr Cln Cly Vsl Lys * CTC CAC TTC CAC AAC ACA ATC AAA CTC ACA CCA CTA ACT ACT CAC CCA CTA ΛΛΑ 2 286 S«c L«u L«u Thr S«r MET Tyr V«l Lys Clu Ph« Leu II« Sor S«r Ser Cln Asp *

TCT CTC CTT ACC ACC ATC TAT CTC MC CAC TTC CTC ATC TCC ACC ACT CM CAT

Cly His Cln Trp Thr L«u Ph« Ph« Cln Asn Cly Lys Val lys V*l Ph« Cln Cly 2,306

CCC CAT CAC TCC ACT CIC ΤΤΓ ITT CAC MT CCC AM CTA MC CTT ΓΓΤ CAC CCA

2 322

Asn Cln Asp Ser Ph« Thr Pro V«l V*t Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu L«u Thr *

MT CAA CAC TCC TTC ACA CCT CTC CTC MC TCT CTA CAC CCA CCC ΤΓΑ CTC ACT

Arg Tyr L«u Arg ti« His Pro Cl« S«r Trp V*1 His Cln Ile AU Leu Arg MKT 2,340

CCC TAC CTT CCA ATT CAC CCC CAC ACT TCC CIC CAC CAC ATT CCC CTC ACC ATC

Clu V«1 L«u Cly Cys C.lu AU Cln Asp L«u Tyr End 2,352

CAC CTT CTC CCC TCC CAC CCA CAC CAC CTC TAC TCA CCCTCCCCACTCCATCCCACCTCCCACTC

cccTCACcrcTccaccrcAccrccACcccArcTCTCccTcccTcccTrccTTCTACCTTTCTCCTAMTCCTACCACACACTCccTTC

AACCCTCCTCAATTAACTATCATCAjCTCCTCCAIT IC 11 ICCTCCCCCCCCACCACCCTCCATCCATTTTMCrTMCTCTTACCTATT

rrcTccAccTccTccacA

10 DK 166457 B1

Eksempelvis indeholder en forbindelse ifølge opfindelsen et område X, der omfatter aminosyresekvensen Ser-760 til Pro-1000 efterfulgt af aminosyresekvensen Asp-1582 til Arg-1708. Denne forbindelse omfatter således polypeptidsekvensen Ala-20 til Pro-1000, som via en peptidbinding 5 er covalent bundet til aminosyrerne Asp-1582 til Tyr-2351. En anden forbindelse indeholder fx. et område X, der omfatter aminosyresekvensen Ser-760 til Thr-778 efterfulgt af sekvensen Pro-1659 til Arg-1708. Denne forbindelse omfatter således polypeptidsekvensen Ala-20 til Thr-778, der via en peptidbinding er covalent bundet til sekvensen Pro-1659 til og 10 med Tyr-2351. Endnu en forbindelse indeholder fx. et område X, der omfatter aminosyresekvensen Ser-760 til Thr-778 efterfulgt af sekvensen Glu-1694 til Arg-1708. Denne forbindelse omfatter således polypeptidsekvensen Ala-20 til Thr-778, der via en peptidbinding er covalent bundet til aminosyrerne Glu-1694 til og med Tyr-2351.

15 Disse som eksempler anførte forbindelser er afbildet skematisk i tabel 2.

Den ved X repræsenterede aminosyresekvens bør udvælges således, at den i det væsentlige ikke reducerer molekylets prokoagulationsaktivitet, hvilken aktivitet bekvemt kan undersøges ved hjælp af konventionelle me-20 toder. Forbindelse (2) i tabel 2 er en for tiden foretrukket udførelsesform.

Prokoagulationsproteinet kan fremstilles ved hjælp af passende værtsceller transformeret med faktor VIII:C DNA, som er blevet specifikt forandret under anvendelse af en hvilken som helst af de forskellige om-25 råde-specifikke mutagenese-teknikker, som vil være kendte for fagmanden inden for rekombinant-DNA-teknikken.

Udgangsmaterialerne kan være en DNA-sekvens, der koder for det komplette faktor VIII:C molekyle, fx. komplet human faktor VI11:C, som vist i tabel 1, en afkortet version af denne sekvens, eller den kan omfatte 30 segmenter af denne DNA-sekvens, så længe udgangsmaterialerne i det mindste indeholder tilstrækkeligt DNA til at kode for aminosyresekvenserne af det ønskede polypeptid.

J o u, DK 166457 B1 O 00 CO r-l in co cn c ra

E

I - ~ ^ +J 00 00 00 — ω ο ο Ο ω ^ Φ i" t" r- *2 J3 -n Q t-l fH iH £ ro 2 tn tp O’ ® +j o

U U n > -C

ί ί *? <u c o f f f 11 r CN O' Ν' λ i,, u co in «τι <D ro a> in vo vo a _ 5 ιΗ τΗ Ή a o 3 n 2, ω « U -Η n r ω o “· .E ·$ 7.7 « 2 IS ' '"X, "·χ, _ a) > S 2 "X- ""1, +3 E ® Γ' o r- γ·~ i_ =j “ ^ ή i-ι t" r»* 0) p .

X cn OMU wCa5 s-ι u Λ jC > — ί 5* ** %* c *£ £ f f f f i js o o o o "v ro j_ VO VO Ό VO J > Q) r— r- r- r" ro i.

S Φ fl) « o C g w w cn cn E §) c w w w w TJ c = c — c

t- fD

n a> 5 ® ® M C +± --K -·—» —* CL c m -t rH ^ g.!™ in in in = +j m n co n c i '-2 , CN CN iS m Q) y U M 5-1 s- - I >1 >1 >1 ni in' +3 i Mt I i

d> co in σν C

Ό w tn vo vo _iT2 C £ iHrHt-4 “i 0) 7) O CU 0 3 =J_ = s_ > 01 M iH >* Η1’ 0 <0(0 ^r2o

M- d) ^ w _n ro o X

ro III *- C Tj må) ill a ·- -^ f L. — ^ 3 E a)

o—.— ro ro H

£· ro in o æ oo Λ>(ϋ

com o r- r- ' -2 TJ

«" .E ™ a> S = ‘ _ c U 0 5-15-1 os: d> J? >i U JZ JZ ® d> £> α^όι OiHEh coo 1 t t f f IIΪ oooo _ a ® ω CN CN CN CN Cro>* C « <0 <0 «J 8ηι-2ίυ c _u _ι _i _j «(Ud)..

o <u 75 75 75 75 _ -a roen £ < ^ 2, jr - .. <u > -n > CM Ό r CO — <u _ c £ s_ U «-Sk

Tj ’ή E o. ·· O) 2 “ λ £ i S - * p ^ co p -C — < .E ·+5 ro hU-^<f->,HCNr0 (oh- 12 DK 166457 B1

Prokoagulationsproteinerne ifølge opfindelsen har ud over, at de mangler et betydeligt aminosyresegment af human faktor VIII:C, også færre potentielle N-glycosyleringssteder end human faktor VIII. Fortrinsvis er i det mindste ét N-glycosyleringssted blevet deleteret. Mere fore-5 trukket er 18 af de 25 potentielle N-glycosyleringssteder ikke til stede i molekylet. I en endnu mere foretrukket udførelsesform er indtil 19 af de 25 potentielle N-glycosyleringssteder blevet fjernet. Selvom det ikke ønskes at være begrænset af nogen teori, antages det i øjeblikket, at de antistoffer mod faktor VIII:C, som er rettet mod antigeniske determinan-10 ter indeholdt i det ifølge opfindelsen deleterede proteinsegment, dvs. i selve aminossyresegmentet eller i carbohydratdelen af det glycosylerede protein, ikke vil neutralisere prokoagulationsproteinerne ifølge opfindelsen. Det antages desuden, at den kendsgerning, at prokoagulanterne ifølge opfindelsen mangler en stor del af stederne for ikke-human glyco-15 sylering via de ikke-humane pattedyrsceller eller andre celler, som anvendes til fremstilling af proteinerne, ligeledes reducerer antigenici-teten af dette protein og formindsker sandsynligheden for, at der udvikles antistoffer mod prokoagul anterne. Dette kan bevirke en nemmere behandling af patienter med behov for prokoagulationsterapi.

20 Det forventes, at forbindelserne ifølge opfindelsen vil kunne frem stilles ved rekombinant-DNA-teknikker med meget lavere omkostninger end der er mulighed for ved fremstilling af human faktor VIII. Værtsorganismerne vil kunne fremstille og udtrykke de betydeligt enklere molekyler - ifølge opfindelsen på en mere effektiv måde.

25 Forbindelserne ifølge opfindelsen kan formuleres til farmaceutisk acceptable præparater sammen med parenteralt acceptable bærere og exci-pienser iht. inden for området kendte procedurer.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, som er egnede til parenteral administrering, kan hensigtsmæssigt omfatte et sterilt, lyo-30 fil i seret præparat af proteinet, som kan rekonstitueres ved tilsætning af en steril opløsning til fremstilling af opløsninger, der fortrinsvis er isotoniske med modtagerens blod. Præparaterne kan præsenteres i enheds- eller multi-dosisbeholdere, fx. i lukkede ampuller eller hætteglas. De anvendes analogt med human faktor VIII, med passende indstillet 35 styrke.

En fremgangsmåde, ved hvilken disse proteiner kan udtrykkes, er ved anvendelse af DNA, som er blevet fremstillet ved overskæring af en uforkortet faktor VIII:C DNA med de passende restriktionsenzymer til fjer- 13 DK 166457 B1 nelse af en del af den DNA-sekvens, der koder for aminosyrerne 760 til 1708 af human faktor VIII:C. Den overskårne DNA ligeres dernæst med et oligonukleotid, som resekterer den overskårne DNA og opretholder den korrekte translati onslæseramme.

5 Fremstillingen af cDNA'en er detaljeret beskrevet i US-patentansøg- ning nr. 546.650 og US-patentansøgning nr. 644.086, supra. En p$P64-re-kombinant-klon indeholdende den i tabel 1 afbildede nukleotidsekvens, betegnet pSP64-VIII, er deponeret hos The American Type Culture Collection under accessionsnummeret ATCC 39812.

10 Restriktionsendonukleaser anvendes til opnåelse af en spaltning af human faktor VIII:C cDNA, herefter kaldet DNA-kildesekvens, på passende steder i nukleotidsekvensen. Medmindre andet er anført, anvendes re-striktionsendonukleaser under de betingelser og på den måde, der anbefales af de kommercielle leverandører. De i det foreliggende udvalgte re-15 striktionsendonukleaser er af en sådan art, at de vil gøre det muligt med betydelig specificitet at udskære sekvenser, der koder for den del af faktor VIII:C molekylet, der ønskes udskåret. BamHI og SacI er specielt nyttige endonukleaser. Fagmanden vil imidlertid være i stand til at anvende andre restriktionsendonukleaser, som er udvalgt ved konven-20 tionelle udvælgelsesmetoder. Antallet af deleterede nukleotider kan variere, men der bør drages omsorg for at sikre, at læserammen af den endelige cDNA-sekvens ikke bliver påvirket.

De resulterende DNA-fragmenter renses dernæst under anvendelse af konventionelle teknikker såsom de af Mani atis et al. i Molecular 25 Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning, og Proc. Natl. Acad.

Sci., 76:615-619 (1979), beskrevne. Den rensede DNA ligeres dernæst til dannelse af den sekvens, der koder for polypeptidet ifølge den foretrukne udførelsesform af opfindelsen. Om nødvendigt eller ønskeligt kan li-30 geringen ske i et oligonukleotid, der resekterer den overskårne DNA og opretholder den korrekte translationslæseramme under anvendelse af standard! igeringsbetingel ser. Ligeringsreaktioner udføres som beskrevet af Maniatis et al., supra, pp. 2453-6, under anvendelse af den på side 246 i denne henvisning beskrevne puffer, og under anvendelse af en DNA-kon-35 centration på 1-100 ug/ml, ved en temperatur på 23°C for stumpendet DNA, og 16°C for DNA med "klæbrig" eller komplementær ende. Følgende dobbeltstrengede oligonukleotid kan anvendes, når der foreligger en BamHI/-Sacl-deletion såsom beskrevet ovenfor: DK 166457 B1 14 5'P-CATGGACCG-3' 3-TCGAGTACCTGGCCTAG 5' , 5 men der kan vælges andre oligonukleotider af fagmanden i afhængighed af de gennemførte del etioner og reaktionsbetingelserne.

DNA-sekvenserne, der koder for de hidtil ukendte prokoagulationspo-lypeptider, kan ud over ved andre metoder fås ud fra sekvensen af human faktor VIII:C DNA under anvendelse af oligonukleotid-formidlet dele-10 tionsmutagenese, der ofte betegnes som "loopout"-mutagenese, som fx. beskrevet i Y. Morinaga et al., Biotechnology, 2:636-639 (1984).

De nye DNA-sekvenser, som indeholder de forskellige deletioner, kan dernæst introduceres i passende vektorer for ekspression i pattedyrscel ler. Den af de forbigående transficerede eller stabilt transformerede 15 værtsceller frembragte prokoagulationsaktivitet kan måles ved hjælp af standardanalyser for blodplasmaprøver. De heri beskrevne eukaryotiske cel!eekspressionsvektorer kan syntetiseres ved hjælp af for fagmanden velkendte teknikker. Vektorernes komponenter såsom de bakterielle repli-koner, udvælgelsesgener, forstærkere, promotorer, og lignende kan opnås 20 fra naturlige kilder eller syntetiseres ved hjælp af kendte procedurer.

Se Kaufman et al., J. Hol. Bio!., Γ59:51-521 (1982); Kaufman, Proc.

Natl. Acad. Sci., 82:689-693 (1985).

Etablerede cellelinier, inklusive transformerede cellelinier, er egnede som værter. Normale di pi oide celler, cel.lestammer hidrørende fra 25 in vitro dyrkning af primært væv, samt primære eksplantater (inklusive forholdsvis udifferentierede celler såsom haematopoietiske stamceller) er også egnede. Kandidatceller behøver ikke at være genotypisk mangelfulde i udvælgelsesgenet, så længe udvælgelsesgenet har dominant virkning.

30 Værtscellerne vil fortrinsvis være etablerede pattedyrscellelinier.

For en stabil integration af vektor-DNA'en i kromosom DNA og for en efterfølgende forstærkning af den integrerede vektor-DNA foretrækkes for tiden CHO (kinesisk hamster-ovarie) -celler. Se US-patentskrift nr. 4.399.216. Alternativt kan vektor-DNA'en omfatte hele svinepapillomavi-35 rus-genomet eller dele deraf (Lusky et al., Cell, 36:391-401 (1984)) og være indeholdt i cellelinier såsom C127 museceller som et stabilt epi-somelement. Andre anvendelige pattedyrscellelinier omfatter HeLa, COS-1 abeceller, melanoma-cellelinier såsom Bowes celler, muse-L-929-celler, 15 DK 166457 B1 3T3-linier opnået fra Swiss, Balb-c- eller NIH-mus, BHK- eller HaK-ham-stercellelinier o.l.

Stabile transformanter screenes dernæst for ekspression af prokoa-gulationsproduktet ved immunologiske eller enzymatiske standardanalyser.

5 Tilstedeværelse af DNA'en, der koder for prokoagulationsproteinerne, kan påvises ved standard procedurer såsom Southern blottingteknik. Forbigående ekspression af prokoagulationsgenerne i de følgende dage efter introduktion af ekspressionsvektor-DNA'en i egnede værtsceller såsom COS-1 abeceller, måles uden udvælgelse ved hjælp af enzymatisk eller immunolo-10 gi sk analyse af proteinerne i dyrkningsmediet.

En bedre forståelse af den foreliggende opfindelse vil kunne fås ud fra de følgende illustrerende udførelsesformer, der kun skal tjene som eksempler og ikke som en begrænsning af den foreliggende opfindelses ånd og rammer som beskrevet i kravene.

15

Eksempel I

10 ug plasmid pACE, et pSP64 (Promega Biotec, Madison, Wis.) derivat, indeholdende nukleotiderne 562-7269 af human faktor VIII:C cDNA (nukleotid 1 er A'et i ATG-initiatormethioninkodonet) underkastedes del-20 vis BamHI-nedbrydning i 100 ul indeholdende 50 mM Tris. HC1 (pH 8,0), 50 mM MgClg og 2,4 enheder BamHI (New England Biolabs) i 30 minutter ved 37°C. Reaktionen afsluttedes ved tilsætning af 20 mM EDTA, og der eks-traheredes én gang med phenol og én gang med chloroform, og fældedes med ethanol og pelletiseredes ved centrifugering. DNA'en genopløstes og 25 spaltedes fuldstændigt i 50 ul under anvendelse af 40 enheder SacI i 1 1/2 time ved 37°C. DNA'en underkastedes dernæst elektroforese gennem en forpufret 0,6% agarosegel. Fra gelen udvandtes et 8,1 kb fragment svarende til det partielle BamHI-SacI-fragment af pACE, som kun manglede den sekvens, der svarer til nukleotiderne 2992-4774 af faktor VIII:C 30 sekvensen, under anvendelse af den i Proc. Nat. Acad. Sci., 76:615-619 (1979) beskrevne gi aspul verteknik. Den rensede DNA ligeredes med 100 pmol af følgende dobbeltstrengede oligonukleotid: 5'P-CATGGACCG-3' 35 3'-TCGAGTACCTGGCCTAG 5' under anvendelse af standard ligeringsbetingelser. Den fjernede DNA-sekvens repræsenterer udeladelsen af en sekvens på 584 aminosyrer begynd- DK 166457 B1 16 ende med aminosyre 998 og fortsættende til og med 1581. Det indføjede oligonukleotid koder imidlertid for aminosyrer svarende til 998-1000.

Derfor indeholder polypeptidet, der kodes for, deletion af 581 aminosyrer.

5 Dernæst anvendtes DNA til transformering af egnede E. coli bakte rier, og DNA fra flere forskellige ampici11in-resistente transformanter analyseredes ved restriktionskortlægning til identifikation af et plasmid, der rummede den ønskede SacI-BamHI udeladelsesmutant. DNA fra dette plasmid underkastedes fuldstændig nedbrydning med Kpnl, som kun spalter 10 plasmidet ved nukleotid 1816 af faktor VIII:C kodningssekvensen. Denne DNA ligeredes med et Kpnl DNA fragment indeholdende nukleotider 1-1815 af faktor VIII:C DNA og et syntetisk Sall-sted ved nukleotiderne -11 til -5, og anvendtes dernæst til transformering af passende E. coli bakterier.

15 Plasmid-DNA isoleredes og orienteredes ved restriktionskortlægning for at identificere et plasmid, pBSdK, der indeholdt den korrekte 5' til 3' orientering af KpnI-indskuddet. Sal I-nedbrydning, som udskærer hele polypeptid-kodningsområdet fra plasmidet, gennemførtes, og der udførtes elektroforese af DNA'en gennem en forpufret 0,6% agarosegel. 5,3 Kb Sall 20 fragmentet udvandtes fra gelen som beskrevet ovenfor. Dette DNA-fragment ligeredes med Xhol-skåret pXMT2 DNA til opnåelse af plasmid pDGR-2. pXMT2 er et plasmid, som er i stand til at udtrykke heterologe gener, når den introduceres i pattedyrsceller såsom C0S-1 nyrecellelinien fra afrikansk grøn abe, og er et derivat af de i Kaufman, supra, pp. 689-93, 25 beskrevne ekspressionsvektorer. Ekspressionselementerne er de samme, som er beskrevet i forbindelse med plasmid pQ2, med undtagelse af, at de indeholder en deletion af den sene adenovirus-hovedpromotor, der strækker sig fra -45 til +156 med hensyn til transkriptionsstartstedet af den sene adenovirus-hovedpromotor. mRNA-ekspression i pXMT drives af den sene 30 SV40-promotor. Den bakterielle replikon er imidlertid blevet erstattet for at gøre bakterier, der indeholder vektoren, resistente over for am-picillin frem for tetracyclin. pXMT2 indeholder et enkelt Xho I sted i en position, der tillader ekspression af indføjet cDNA fra den sene SV40-promotor. Dette Xho I sted er bekvemt til indføjning af faktor 35 VIII:C cDNA konstruktioner, da disse er flankeret af Sall-steder.

Restriktionskortlægning af transformanter identificerede et plasmid, pDGR-2, der indeholdt den korrekte 5' til 3' orientering af poly-peptidkodningssekvensen i forhold til transkriptionsretningen fra den 17 DK 166457 B1 sene SV40-promotor. pDGR-2 er deponeret hos The American Type Culture Collection under accessionsnummeret 53100.

Eksempel 2 5 Andre hidtil ukendte prokoagulationsproteiner kan opnås fra kon struktioner, der blev produceret ved oligonukleotid-formidlet deletions-mutagenese, fx. under anvendelse af den i Morinaga et al., supra, beskrevne "loopouf'-mutageneseteknik. Del etionsmutagenesen udførtes under anvendelse af ekspressionsplasmid pDGR-2 eller et hvilket 10 som helst andet passende plasmid eller en passende bakteriofagvektor.

Andre metoder til oligonukleotid-formidlet mutagenese, ved hvilke der anvendes enkeltstrenget DNA, som er fremstillet med M13 vektorer o.l., er også egnede. Se Zoller et al., Nucl. Acids Res., H): 6487-6500 (1982). Eksempelvis kan disse deletioner frembringes under anvendelse af 15 oligonukleotiderne

(A) 5' AAAAGCAATTTAATGCCACCCCACCAGTCTTGAAACGCCA

(B) 5' AAAAGCAATTTAATGCCACCGAAGATTTTGACATTTATGA

20 til fremkaldelse af deletioner i faktor VIII:C cDNA fra nukleotider (A) 2334 til 4974 eller (B) 2332 til 5079. De proteiner, som disse konstruktioner koder for, indeholder del etioner af (A) 880 og (B) 915 aminosyrer i forhold til faktor VIII:C.

De deleterede konstruktioner testes direkte eller efter subkloning 25 i passende ekspressionsvektorer for at bestemme, om de nye proteiner besidder prokoagulationsaktivitet. Prokoagulationsaktivitet undersøgtes som beskrevet i eksemplerne 3 og 4.

Eksempel 3 30 Ekspression af prokoagulationsmolekyler i COS-abeceller

Ekspressionsplasmiderne, som indeholdt de i eksempel 1 eller 2 fremstillede, modificerede cDNA'er og uforkortet cDNA, pKMT-VIII, introduceredes i COS-1 celler via DEAE-dextran transfektionsforskriften. Som-payrac og Dana, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:7575-7578 (1981). Konditione-35 rede medier høstedes 48 timer efter transfektion og undersøgtes for akti vi tetet af faktor VIII-type som beskrevet i Toole et al., Nature, 312:342-347 (1984). Resultatet af forsøget er sammenfattet i tabel 3.

Begge pi asmider, som indeholdt de modificerede cDNA'er, gav prokoagula- DK 166457 B1 18 tionsaktivitet, og desuden var aktiviteten større end den, der opnåedes ved anvendelse af cDNA af vild type. Fra disse data konkluderedes det, at fjernelse af indtil 880 aminosyrer (95.000 dalton) i et defineret område af human faktor VIII ikke ødelægger cofaktoraktivitet. Desuden bi-5 beholder disse forkortede prokoagulationsproteiner deres evne til at blive aktiveret af thrombin.

Tabel 3: Ekspression af forkortede faktor VIII molekyler 10 Plasmid Antal deleterede Kromogen- Cl otek- aminosyrer aktivitet aktivitet (rnllml’1) -Ila +IIa (fold)

No DNA - 0 15 pKMT-VIII - 15:1 - 450 pDGR-2 581 114 250 5750 (23 x) pLA-2 880 162 330 9240 (28 x) 20 De anførte pi asmider transficeredes i COS-celler og 48 timer efter transfektion udtoges det konditionerede medium til analyse ved hjælp af Kabi Coatest faktor VIII:C metoden (kromogen aktivitet) og ved hjælp af ét-trins aktiveret delvis thromboplastintids (APTT) koagulationsanalysen (Clotek-aktivitet) under anvendelse af plasma, der mangler faktor 25 VIII:C, som beskrevet (Toole, Nature, (1984)). Til thrombin (Ila) aktivering forbehandledes prøver i 1-10 minutter med 0,2 enheder/ml thrombin (Ila) ved stuetemperatur. Aktiveringskoefficienter er anført i parentes. Aktiviteten af medier fra transfektion af den vilde type (pKMT-VIII) var for lav til en direkte måling af Clotek-aktivitet før thrombin-aktive-30 ring. Af andre forsøg, hvor aktiviteten af den vilde type af faktor VIII blev koncentreret, fremgik det, at den var ca. 30 fold aktiverbar.

Eksempel 4

Ekspression af prokoagulationsmolekyler i CHO-celler 35 A) Ekspression af pDGR-2

Prokoagulationsekspressionsvektoren, der indeholdt en deletion (i forhold til faktor VIII:C cDNA'en) af 581 aminosyrer (pDGR-2), transfi- DK 166457 B1 19 ceredes med plasmid pAdD26SV(A)nr.3 (10 ug pDGR-2:1 ug pAdD26SV(A)nr.3) ved CaPO^ copræcipitation i celler (DUKX-B11), der manglede CHO DHFR, og transformanterne isoleredes og dyrkedes i stigende koncentrationer af MTX som beskrevet af Kaufman et al., (1985). En transformant, betegnet 5 01, udviste de følgende aktiviteter som en funktion af resistens over for forøgede koncentrationer af MTX.

uM MTX mEnheder/ml/dag/106 celler* 10 0 1 ,46 0,02 322 0,1 499 15 B) Ekspression af pLA-2

Prokoagulationsekspressionsvektoren, der indeholdt en deletion af 880 aminosyrer (pLA-2), introduceredes i celler (DUKX-B11, Chasin og Ur-laub, PNAS 77:4216-4220, (1980)), der manglede CHO DHFR, ved protoplasmafusion som beskrevet (Sandri-Goldin et al., Mol. Cell. Biol., 1:743-20 752). Efter fusionen sattes til hver plade frisk medium indeholdende 100 ug/ml kanamycin og 10 ug/ml af hhv. thymidin, adenosin, deoxyadenosin, penicillin og streptomycin samt 10% dialyseret kalvefosterserum. Kanamy-cinet indbefattedes for at forebygge væksten af eventuelle bakterier, som var undsluppet omdannelse til protoplaster. Fire dage senere subdyr-25 kedes cellerne 1:15 i alpha-medium med 10% dialyseret kalvefosterserum, penicillin og streptomycin, men uden nukleosider. Kolonier optrådte efter 10-12 dage efter subdyrkning af cellerne i selektive medier. En gruppe af B-transformanter forenedes og dyrkedes i sekventielt forøgede koncentrationer af MTX, begyndende med 0,02 uM og med trinvis forøgelse 30 til 0,1, 0,2 og 1,0 um MTX. Resultater af aktiviteten af faktor VIII-ty-pe i celler, der var resistente over for forøgede koncentrationer af MTX, er vist nedenfor.

35 DK 166457 B1 20 uM MTX mEnheder/ml/dag/106 celler* 0 16 0,02 530 5 0,2 1170 1,0 1890 * Faktor VIII aktivitet bestemtes ved Kabi Coatest faktor VIII:C 10 metoden (kromogen aktivitet).

Forsøgsrapport

Deletion af 41 aminosyrer i B-området af human faktor VIII:C

Restriktionsenzymet Mlul genkender DNA-sekvensen ACGCGT, der koder 15 for en threonin og en arginin. Positionsdirigeret DNA-medieret mutagene-se anvendtes til indføring af et Mlul-restriktionssted ved 80 kDa spaltningsstedet (1667) og 73 kDa thrombin-spaltningsstedet (1708). Deletionen frembragtes derefter ved anvendelse af disse Mlul-restriktionsste- der. Mlul 80 kDa og Mlul 73 kDa blev nedbrudt med Mlul og Xbal og lige-20 ret. Den resulterende konstruktion deleterer 41 aminosyrer af syreområdet i den humane faktor VIII:C's B-område (se nedenfor; aminosyrernes nummerering er som i tabel 1).

Arg His Thr Arg Ser Phe 25 1664 1665 1666 1708 1709 1710 (gammel

Gin)

Den af denne DNA-konstruktion udtrykte deletionsmutant giver ca. en 30-30 fold aktivering med thrombin ved den i eksempel 3 beskrevne koagulationsanalyse.

Claims

1. Rekombinant DNA, der ved ekspression resulterer i et aktivt prokoagulationsprotein, der har en human faktor VIII:C's aminosyrese- 5 kvens, men mangler en eller flere aminosyrer i området mellem Arg-759 og Ser-1709, hvor aminosyrenummereringen er i forhold til Met-1 i human faktor VIII:C ledersekvensen.

2. Rekombinant DNA ifølge krav 1, der koder for et faktor VIII:C 10 protein, som mangler området mellem Pro-1000 og Asp-1582.

3. Rekombinant DNA ifølge krav 1, der koder for et faktor VIII:C protein, som mangler området mellem Thr-778 og Pro-1659.

4. Rekombinant DNA ifølge krav 1, der koder for et faktor VIII:C protein, som mangler området mellem Thr-778 og Glu-1694.

5. Mammal værtscelle frembragt ved genteknik, hvilken indeholder og er i stand til at udtrykke DNA ifølge et hvilket som helst af kravene 20 1-4.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et aktivt prokoagulationsprotein, der har en human faktor VI11:0's aminosyresekvens, bortset fra, at det mangler en del af eller hele området mellem Arg-759 og Ser-1709, 25 hvilken fremgangsmåde omfatter, at man tilvejebringer en ved genteknik frembragt mammal værtscelle ifølge krav 5 og dyrker værtscellen under betingelser, der tillader ekspression af proteinet.

7. Aktivt prokoagulationsprotein, der har en human faktor

30 VIII:C's aminosyresekvens, men mangler en eller flere aminosyrer i området mellem Arg-759 og Ser-1709, hvor aminosyrenummereringen er i forhold til Met-1 i human faktor VIII:C ledersekvensen.

8. Aktivt prokoagulationsprotein, der har en peptidsekvens fra en 35 human faktor VIII:C, bortset fra, at det mangler et peptidområde, hvilket område er: DK 166457 B1 a) området mellem Pro-1000 og Asp-1582, eller b) området mellem Thr-778 og Pro-1659, eller c) området mellem Thr-778 og GIu-1694.

9. Farmaceutisk præparat omfattende et sterilt præparat indehold ende en virksom mængde af proteinet ifølge krav 7 eller 8, i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.

10. Farmaceutisk præparat til behandling af Hæmofilia A omfattende 10 et sterilt præparat indeholdende en virksom mængde af et protein ifølge krav 7 eller 8, i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.

11. Farmaceutisk præparat omfattende et sterilt præparat indeholdende en virksom mængde af et præparat fremstillet ved fremgangsmåden 15 ifølge krav 6, i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.

12. Farmaceutisk præparat til behandling af Hæmofilia A omfattende et sterilt præparat indeholdende en virksom mængde af et protein fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 6, i blanding med en farmaceutisk 20 acceptabel bærer.

13. Anvendelse af et protein ifølge krav 7 eller 8, eventuelt i kombination med en farmaceutisk acceptabel bærer, til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af Hæmofilia A. 25 30