JPH03198792A - ヒトエリスロポエチンの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、天然ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮ
Ａ　（配列）及びそれがら推定される該エリスロポエチ
ンのアミノ酸配列を知見したことに基づくものである。

本発明は上記知見に基づき、組換ＤＮＡ技術を利用した
、ヒトエリスロポエチンの生産に関するものである。

血球増生、即ち赤血球の産生は、人間が生きている限り
、細胞破壊を補うために継続して行なわれる。血球増生
は、循環を妨げる程多くはない充分な数の赤血球を、適
切な組織に酸素供給する血液中で利用可能にさせる、非
常に正確に制御された生物学的メカニズムである。赤血
球の産生は骨髄で行なわれ、ホルモン、即ちエリスロボ
エチンで制御されている。

エリスロボエチンは分子量約３４．０００ダルトンの酸
性糖蛋白質であって、組織が実在数の赤血球から充分な
酸素供給を受けている健康状態に体かある場合、血漿中
において極めて低濃度で存在している。この正常な低濃
度であっても、普通時間を経るにつれて減少する赤血球
の補充を促進するには充分である。

エリスロポエチンの循環量は、血球の循環による酸素輸
送量が減少する低酸素症状態下では増加する。低酸素症
は、出血による多量の血液の喪失、放射線への過度露出
による赤血球の破壊、高所もしくは長期の意識喪失によ
る酸素摂取量の減少又は各種貧血によって起こる可能性
がある。組織が低酸素ストレスを受けると、エリスロポ
エチンは、骨髄中の原始前駆細胞が、前赤芽球（前赤芽
球はひき続いて成熟し、ヘモグロビンを合成し、赤血球
として循環系に放出される）に変換されるのを促進する
ことにより、赤血球の産生を増大させる。

循環系の赤血球数が正常組織での酸素要求量よりも多い
場合は、循環系エリスロボエチンは減少する。

エリスロボエチンは赤血球形成過程で欠かせないもので
あるため、このホルモンは赤血球の産生能が低く又は欠
陥がある血液疾患の診断及び治療に有効に適用すること
ができる。

最近の研究により、各種の病態、疾患及び血液異常状態
において、エリスロボエチン治療の有効性を予想する基
礎が与えられた。

血漿又は尿から高収率でエリスロボエチンを得ようとす
る以前の試みは不成功に終った。複雑で高度な実験技術
が必要とされるが、一般には不純で不安定な微量のエリ
スロポエチン含有抽出物を集められるにしかすぎない。

米国特許第３．０３３．７５３号明細書には、ヒツジ血
漿からエリスロボエチンを部分的に精製するための方法
が記載されているが、低収率でエリスロボエチン含有粗
製固体抽出物が得られただけである。

尿からエリスロポエチンを単離する初期の試みでは、不
安定で生物学的に不活性なそのホルモン調製物が得られ
た。米国特許第３．８６５．８０１号明細書には、尿か
ら回収されたエリスロボエチン含有粗製物質の生物学的
活性を安定化させる方法が開示されている。得られるエ
リスロボエチン含有粗製物は、称するところでは、９０
％のエリスロボエチン活性を有しており、しかも安定で
ある。

再生不良性貧血患者の尿からヒトエリスロポエチンを精
製する別の方法が、ミャケら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル拳ケミストリイ、第２５２巻、第１５号、ｐ
ｐ　５５５８−５５６４　（１９７７年８月ＩＯ日）［
Ｍｉｙａｋｅ、　　　ｅｔ　　　ａｌ　、　、　　　１
．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　　Ｖｏｌ　　　２５２．
　　　Ｎ。

１５、　ｐｐ５５５８−５５６４］に記載されている。

この７エ程の操作には、イオン交換クロマトグラフィー
、エタノール沈澱、ゲル濾過及び吸着クロマトグラフィ
ーが含まれ、２１％の収率で、７０，４００単位／■の
比活性がある純粋なエリスロボエチン調製物が得られて
いる。

タケザワらの米国特許第４．３９７．８４０号明細書に
は、弱塩基性イオン交換物にて健康なヒトの尿試料から
「エリスロボエチン生成物」を製造する方法が記されて
おり、エリスロポエチン阻害効果のない低分子量生成物
が得られたと述べている。

１９８２年５月　６日に公開されたスギモトらによる英
国特許出願束２．０８５．８８７号明細書には、ハイブ
リッドヒトリンパ芽球細胞の産生方法が述べてあり、哺
乳類宿主増殖物力月０７細胞／　ｍｌとなった後、培地
に分配された細胞懸濁液１　ｍｌ当り　３〜４２０単位
のエリスロボエチン産生量があると報告されている。達
成されたとする最大の産生レベルでは、エリスロポエチ
ン産生速度は、イン・ビボ増殖系から細胞が移し変えら
れたイン・ビトロ培地において、４０〜４．０００単位
／１０６細胞／４８時間と計算された（対応する米国特
許第４．３７７、５１３号明細書も参照）。多数の提案
が新生物細胞をはじめとする組織源からエリスロポエチ
ンを単離するためになされたが、収率は極めて低かった
。

精製エリスロポエチンの取得のために利用される他の単
離技術としては、免疫学的操作がある。

エリスロボエチンに対する「モノクローナル」抗体を得
るために細胞融合とハイブリッド形成技術を用い、更に
ヒトエリスロポエチンの単離と定量化のためにこれらの
抗体を用いる試みが行なわれた。

ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、エリスロボ
エチンの定性及び定量のためのイムノアッセイに使用さ
れ、更にエリスロボエチンのアフィニティー精製におい
ても有用性を有する。しかしながら、詳細な分析、臨床
試験及び、例えば、疾患組織がエリスロボエチン産生を
になうことができない慢性腎疾患の治療のような、該物
質の潜在的に広範な治療用途にとって充分なだけ多量の
エリスロボエチンを哺乳類源から単離する目的には、前
記抗体を有効に活用することは難しいと考えられている
。したがって、哺乳類エリスロボエチンを充分に特定化
でき、しかも可能性のある診断及び臨床的用途のために
それを大量に供給する為には、大規模な哺乳類エリスロ
ボエチンの微生物による大規模な合成をもたらす組換え
操作の実用化を成功させる必要があると、当業者間では
考えられている。

ヒト及び他の哺乳類のエリスロボエチンをコードしてい
るＤＮＡ配列を実験的に単離する実質的な努力がこれま
でなされてきたが、誰もまだ成功していない。これは主
に、エリスロボエチンをコ０ −ドするＤＮＡ配列を従来の技術により単離することの
できるｃ　ＤＮＡライブラリーを構成し得るｌｌｌＲＮ
Ａに富む組織源、特にヒト組織源、の欠乏に起因するも
のである。更に、エリスロポエチンのアミノ酸残基連鎖
についてはほとんど未知であるため、例えばｃＤＮＡ特
にゲノムＤＮＡライブラリーのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリ
ダイゼーションスクリーニングにおいて安心して′直ち
に使用することができる長鎖ポリヌクレオチドプローブ
を調製することができないことによる。エリスロポエチ
ンのためのヒト遺伝子はヒトゲノム内で「単一の遺伝子
」として存在しているらしく、いかなる場合も、ヒトエ
リスロポエチンをコードする遺伝子物質はゲノムライブ
ラリーに存在する総ヒトゲノムＤＮＡの０．０ＯＮ５％
未満を構成するにしかすぎないと推定される。

現在までのところ、単離可能量の哺乳類エクス１ ０ボエチンの微生物発現における使用に適したＤＮＡ配
列を与える組換え関連方法において、最も成功した既知
報告例でも、目標にはほど遠いものであった。−例とし
て、ファーバーら＝　「エクスペリメンタル・ヘマトロ
ジー」、第１１巻、第１４増刊号、抄録１０１．１９８
３年［Ｆａｒｂｅｒ、　　＋ｔ　ａｌ、、　ＥＩＩＩＨ
ｅＩｌａｔｏｌ、、　　Ｉｌ、　　５ｕｐｐ、　　１４
．　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　　１０１（１９８３）コでは
、フェニルヒドラジン処理ヒヒの腎臓組織から＋１ｌＲ
ＮＡを抽出し、この１ＲＮＡをアフリカッメガエル（Ｘ
ｅｎｏｐｕｉ　１ａｅｖｉｓ）卵母細胞に注入したが、
それらの中に含まれるエリスロボエチンの生物学的性質
を示す「翻訳生成物」の混合体がイン・ビトロで産生ず
るのはむしろ一時的な結果であったと報告している。更
に最近において、ファーバーら＝　「ブラッド」、第６
２巻、第５号、第１増刊号、抄録３９２、第１２２ａ頁
、１９８３年［Ｆａ＋ｂｅ＋、　　ｅｌ　ａＢｌｏｏｄ
、６２．　Ｎｏ、５．　５ｕｐｐ、　Ｎｏ、Ｉ、　Ａｂ
ｓｔｒａｃｔ　３９２．ａｔ２ ｐａｇｅ　１２２ａ　（１９８３）］は、カエル卵母細
胞によるヒト腎臓ｍＲＮＡのイン・ビトロ翻訳について
報告した。その得られた翻訳生成混合体には、注入され
たｍＲＮＡＩ鱈当り、エリスロポエチン活性を有する翻
訳生成物が２２０　ｍＵ金含有れていると推定された。

エリスロボエチンをコードしている外来性ｍＲＮ　Ａの
このようなイン・ビトロ翻訳量が（従来報告された、必
要とする生成物へのヒビｍＲＮＡ翻訳量と比べて）著し
く低いと認められたが、この結果は、ヒト腎臓を、所望
の遺伝子が単離され得る豊富なヒト腎ｅＤＮＡライブラ
リーの構成を可能にするエリスロボエチン発現部位とし
てみなさせるものであると考えられた［ファーバー＝　
「クリニカル・リサーチ」、第３１巻、第４号、第７６
９人頁、１９８３年［Ｆａｒｂｅｒ、　　Ｃｌ１ｎ、　
　Ｒｅｓ、、　　３１（４）　、　７６９Ａ　（１９８
３１］　も参照］。

米国特許出願第５６１，０２４号及び第５１１２．１８
５号の３ 出願以後、大腸菌内で、ヒトエリスロポエチンｃＤＮＡ
とみなされていた物質のクローニングと発現に関する一
つの報告がなされた。簡単に言えば、多数のｃＤＮＡク
ローンが大腸菌プラスミドに挿入され、β−ラクタマー
ゼ融合生成物がヒトエリスロポエチンの非特異的「エピ
トープ」に対するモノクローナル抗体と免疫応答性を有
することに着目されたのである。リーーファン：　「プ
ロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ」　（米国）、第８１巻、第２７０８
−２７１２頁、１９８４年［Ｌｅｅ−Ｈｕａｎｇ、　　
Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ１Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　（Ｕ、
Ｓ、Ａ）、　８１．　ｐｐ２７０８−２７１２　（１９
８４）］参照。

本発明は、その対立遺伝子変異体をも含む天然エリスロ
ポエチンの一次構造形状（即ち、アミノ酸残基の連続配
列）の一部もしくは全部、及び−以上の生物学的性質（
例えば、免疫学的性質並び４ にイン・ビボ及びイン・ビトロでの生物学的活性）を有
する新規な精製単離されたポリペプチド生成物をはじめ
て提供するものである。これらのポリペプチドは、ゲノ
ムＤＮＡもしくはｃＤＮＡのクローニング又は遺伝子の
合成によって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは
真核宿主での発現生成物（例えば、細菌、酵母、及び哺
乳類の培養細胞による）であるということによっても独
特に特徴づけられる。を推動物（例えば、哺乳類及び鳥
類）細胞における微生物発現生成物は、自然の哺乳類細
胞環境又は血漿もしくは尿のような細胞外液におけるエ
リスロボエチンと関連性があるであろうヒト蛋白質又は
他の夾雑物とは全く関係がないということによって、更
に特徴づけられるかもしれない。典型的な酵母［例えば
、サツカロマイセス・セレビシェ（５ａｅｃａ＋ｏｍ７
ｃｅａｃｅ＋ｅｖｉｓｉａｅ）　］又は原核生物（例え
ば、大腸菌）５ を宿主細胞とする生成物は、いかなる哺乳類の蛋白質と
も関連性を有していない。使用する宿主によっては、本
発明のポリペプチドは哺乳類もしくは他の真核生物の炭
水化物によってグリコジル化され、あるいはグリコジル
化されないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた
、最初にメチオニンアミノ酸残基（１番目の位置）を含
んでいてもよい。

本発明の新規な糖蛋白質生成物には、その−以上の生物
学的性質が得られるのに充分な天然（例えばヒト）エリ
スロポエチンの複製である一次構造形状を有し、天然（
例えばヒト）エリスロボエチンのそれとは異なる平均的
炭水化物組成を有するものが含まれる。

本発明により得られるを推動物（例えば、ＣＯ３−１及
びＣＨ○）細胞は、イン・ビトロで継続した増殖が可能
であって、培地で増殖させた場合、６ それらの培地中にて、ラジオイムノアッセイにより４８
時間で１０６個の細胞当り　１００単位以上（好ましく
は５００単位以上、最も好ましくは１０００〜５０００
単位以上）のエリスロポエチンを産生ずることができる
、常に入手し得る最初の細胞である。

更に、本発明によって、初めて解明されたエリスロポエ
チンアミノ酸残基の連続配列の全体的もしくは部分的複
製である合成ポリペプチドが提供される。これらの配列
は、天然エリスロボエチンの一次、二次又は三次構造形
状特性を有しているため、治療及び免疫過程でエリスロ
ポエチンの生物学的活性なもしくは免疫学的な代用物と
して用いられるような、天然産物に共通した生物学的活
性及び（又は）免疫学的性質を有しているであろう。こ
れに付随して、標準的手段によって得られ、このような
ポリペプチドと免疫応答し、好ましくは天然エリスロポ
エチンとも免疫応答するモノク７ ０−ナル及びポリクローナル抗体が提供される。

本発明では、サル及びヒト種起源のクローンＤＮＡ配列
並びにそれから適切に誘導されたポリペプチド配列につ
いても解明しており、それらはそれぞれサル及びヒト種
起源エリスロボエチンの一次構造形状を表わしている。

更に本発明により、本発明のＤＮＡ配列を取り込んだ新
規な生物学的機能性のウィルス及び環状プラスミドＤＮ
Ａのベクター、並びにそのようなベクターにより安定に
トランスフォーメーション又はトランスフェクションが
なされた微生物（例えば、細菌、酵母及び哺乳類の細胞
）宿主生物も提供される。これに対応し、゛−−−−−
→千、このようなトランスフォーメーション又はトラン
スフェクションされた微生物宿主を培養増殖させ、増殖
培地、細胞ライセード又は細胞膜画８ 分から所望のポリペプチドを単離することからなる有用
なポリペプチドの新規製造方法が、本発明によって提供
される。

上記方法で得られる微生物発現ポリペプチドの単離精製
は、例えばプレパラティブ・クロマトグラフィー分離、
並びにモノクローナル及び（又は）ポリクローナル抗体
調製物を用いる免疫学的分離のような従来の手段によっ
て行なってもよい。

エリスロポエチンのアミノ酸残基配列が解明されたので
、本発明により、エリスロポエチンをコードするＤＮＡ
配列の全体的及び（又は）部分的製造がなされるが、そ
のＤＮＡ配列には、選ばれた非哺乳類宿主による発現に
「好適な」コードンの取り込み、制限エンドヌクレアー
ゼ酵素による開裂部位の具備及び容易に発現するベクタ
ーの構築を容易にする別の開始、終末又は中間ＤＮＡ配
列の具備というような有利な特性が備えられてい９ る。これに伴い、本発明は、−以上のアミノ酸残基の同
−性又は位置に関して天然型とは異なるが、天然型の一
部もしくは全部の性質を有しているエリスロボエチンボ
リペプチド類似体もしくは誘導体（即ち、エリスロポエ
チンの特定の残基を全てではないが有する削除類似体、
及び（又は）−以上の特定の残基が他の残基と置換され
た置換類似体、及び（又は）−以上のアミノ酸残基がポ
リペプチドの終末又は中間部位に付加された付加類似体
）の微生物発現をコードしているＤＮＡ配列の製造法（
並びにｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの部位特定突然変異誘
発による生成法）を提供する。

本発明のＤＮＡは、微生物宿主細胞における発現によっ
て、天然ヒトエリスロポエチンの生物学的性質を有する
ポリペプチド生成物を産生させることのできる配列であ
って、具体的には、表■にヒトＥＰＯポリペプチドとし
て示したアミノ酸配０ 列（−２７〜１６６又は　１〜１６６）をコードする塩
基配列を含むＤＮＡ配列（縮重を含む）であり、ゲノム
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び、一部又は全部が化学合成によ
るＤＮＡを含む。特に微生物宿主細胞が哺乳動物細胞で
ある場合、好ましくは、該塩基配列が前述の−２７〜１
６６のアミノ酸配列をコードするもの（例えば、表■に
示したゲノムＤＮＡ、及び表■′に示したイントロンを
含まないＤＮＡ配列を挙げることができる）を用いる。

本発明には、エリスロボエチン治療、具体的には貧血症
の状態及び最も具体的には慢性腎疾患を伴うような貧血
状態の治療に使用し得る、本発明のポリペプチド生成物
の治療上有効量と薬学上許容される希釈剤、及びアジュ
バント及び（又は）担体とからなる医薬組成物も含まれ
る。

本発明のポリペプチド生成物は、固体組織及び血液又は
尿のような液体試料中のエリスロボエチ１ ンの定性及び定量に有用な試薬とするために、検出可能
なマーカー物質と共有結合させて標識化してもよい（例
えば１２５Ｉで放射線標識化する。）。

本発明のＤＮＡ生成物もまた、（放射線標識及びビオチ
ンのような非同位元素標識のような）検出可能なマーカ
ーで標識化されていてもよ（、ヒト、サル及び他の哺乳
類種の染色体地図におけるエリスロポエチン遺伝子座及
び（又は）それに関連したすべての遺伝子群の座を決定
するために、ＤＮＡハイブリダイゼーション過程で用い
られてもよい。それらはまた、ＤＮＡレベルにおけるエ
リスロポエチン遺伝子の欠陥を見出すために用いること
ができ、更には隣接する遺伝子及びそれらの欠陥を見出
すための遺伝子マーカーとして用いることもできる。

本明細書で詳細に記するように、本発明では更に、マル
チブルー末鎖ポリヌクレオチドを含む不２ 均−な細胞もしくはウィルス試料において、配列未知の
特定の一重鎖ポリヌクレオチドを検出するための重要な
改良方法も提供するが、この方法は下記のとおりである
。

（ａ）−様に変異した塩基鎖を有する標識化−末鎖ポリ
ヌクレオチドプローブの混合体が調製される。このプロ
ーブの各々は、被検ポリヌクレオチドに独特である、と
推定される塩基配列に対して潜在特異的に相補的である
。

（ｂ）試料が固体基質に固定される。

（ｃ）前記基質が、該試料のポリヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションによらないで、ポリヌクレオチドが
更にそれと結合するのを抑制するように処理される。

（ｄ）処理済みの基質を、全体的に相補性のポリヌクレ
オチド間でのみハイブリッド形成し易い条件下で、−時
的に前記標識化プローブの混合体３ と接触させる。次いで ＋６）特定のポリヌクレオチドが、それと該標識化プロ
ーブ混合物内の全体的に相補的なプローブとのハイブリ
ッド形成反応の存在を確認することによって検出される
。これは標識化プローブの基質との非特異的結合に起因
する標識化物質の背景密度と比較して特定のポリヌクレ
オチド位置における基質上の標識化物質の密度が高いと
いうことにより証明される。

この操作は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＤ　
Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａハイブリッド形成において、１７〜２
０塩基を有する６４、１２８、２５６、５１２．１０２
４又はそれ以上の混合ポリヌクレオチドプローブを使用
することが指示された状況下で特に有効である。

以下に記すように、上記改良方法により、サル種起源の
エリスロポエチンをコードし、貧血サル４ 腎細胞ｍＲＮＡから誘導されたライブラリー内のｃＤＮ
Ａクローンを実際に同定することができた。

より具体的には、ヒトエリスロポエチンのフラクション
を配列決定して導かれたアミノ酸配列情報に基づ＜、１
２８種類の一様に変異した２０−ｍａｒプローブ混合体
が、コロニーハイブリダイゼーション操作で用いられ、
合計２０００００のコロニーの中から７つの「＋（陽性
）」エリスロボエチンｃＤＮＡクローンが同定された。

更に特記すべきは、本発明の改良方法を実施することに
より、ヒトゲノムライブラリーを構成する　１．５００
．０００のファージプラークのスクリーニングの中から
３つの陽性クローンを迅速に単離することができたこと
である。これは、ヒトエリスロポエチンの別の連続配列
のアミノ酸分析による第二の１２８種類の１７−ｍａｒ
プローブと一緒に上記した　Ｈ１１種類の２０−ｍａｒ
プローブ混合体を用いて実現されたものである。

５ 上記で説明した操作は、哺乳類ゲノムクローンを単離す
るためのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成過程において
、多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを使用した最
初の例であり、しかもｃＤＮＡクローンの単離において
３２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ混合体を使
用した最初の例である。

本発明によれば、ヒト及びサルの天然エリスロボエチン
（Ｅ　Ｐ　Ｏ）のポリペプチド配列の全部をコードして
いるＤＮＡ配列が単離され、特定化された。

サル種起源のＤＮＡは、化学的に誘導された貧血状態を
呈し、その血清が免疫学的測定によると正常なサル血清
と比べて高レベルのＥＰＯを含有するサルの腎組織から
得られたｍＲＮＡにより構成されたｅＤＮＡライブラリ
ーから単離された。

ＥＰＯをコードするＤＮＡを含む所望ｃＤＮＡり６ ローンの単離は、１２８種類が混合され、放射線標識化
された２０−ｍａｒのオリゴヌクレオチドプローブのプ
ールを用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡコロニハイプリダイゼー
ションにより実現されたが、２００、０００コロニーの
迅速なスクリーニングが必要とされた。オリゴヌクレオ
チドプローブの設計は、少量のヒトＥＰＯ試料の酵素的
切断とアミノ酸配列決定により得られたアミノ酸配列情
報に基づいた。

ヒト種起源のＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡライブラリーか
ら単離された。ＥＰＯをコードするＤＮＡを含むクロー
ンの単離は、　１２８種類が混合された２０−ｍａｒの
オリゴヌクレオチドプローブの上記プールと、別の酵素
によるヒトＥＰＯフラグメントから得られたアミノ酸配
列情報に基づ＜１２８種類の放射線標識化１７−ｍａｒ
プローブの第二のプールとを用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡプ
ラークハイブリダイ７ ゼーシヨンにより行なわれた。

陽性のコロニー及びプラークは、２０−ｍｅ＋プローブ
のプール内の１６塩基鎖サブセツトを用いたクローンＤ
ＮＡのジデオキシ配列法により確認され、選択されたク
ローンは、それによりコードされるＥＰＯポリペプチド
の一次構造形状を推定させるヌクレオチド配列分析に供
された。推定されたポリペプチド配列は互いに、またヒ
トＥＰＯフラグメントのアミノ酸分析により得られた部
分配列に対しても高度の相同性を示した。

選択された陽性のヒトゲノムクローンは、「シャトルＪ
　ＤＮＡベクターに挿入され、このベクターは大腸菌に
導入されて、培養哺乳類細胞をトランスフェクションす
るために増幅された。トランスフェクションされた前記
宿主細胞の培養増殖により、培養液１　ｍｌ当り３０Ｇ
ＯＵのＥＰＯを含有していると推定される培地上澄標品
が得られた。

８ 以下の諸例は本発明の説明のために掲げられており、特
にＥＰＯをコードするサルｅＤＮＡクローン及びヒトゲ
ノムクローンの同定に先立って実施される操作、この同
定のための操作、並びに配列決定、発現系の生成及びこ
の系におけるＥＰＯ発現の免疫学的確認に関するもので
ある。

更に具体的には、例１はヒトＥＰＯフラグメントのアミ
ノ酸配列及びこの配列に基づく放射線標識化プローブ混
合体の調製に関する。例２は一般に、陽性サルｃＤＮＡ
クローンの同定に必要な操作に関するものであり、この
ため動物の処置及び動物血清の予備的ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩ　Ａ）分析に関する情報が得られる。例３は
、ｃＤＮＡライブラリーの調製、陽性クローンのコロニ
ハイブリダイゼーションスクリーニングおよび確認、陽
性ｃＤＮＡクローンのＤ　Ｎ　Ａ配列並びにサルＥＰＯ
ポリペプチドー次構造形状（アミノ酸配９ 列）の情報に関する。例４は陽性ヒトゲノムクローンの
同定に必要な操作に関するものであり、このためゲノム
ライブラリー、プラークハイブリダイゼーション操作及
び陽性クローンの確認に関する情報が得られる。例５は
、陽性ゲノムクローンのＤＮＡ配列及びサルＥＰＯ鎖の
情報との違いも含めた、ヒトＥＰＯポリペプチドアミノ
酸配列の情報に関する。例６は、陽性サルｃＤＮＡクロ
ーンから得られたＥＰＯをコードするＤＮＡを取り込ん
だベクターの調製方法、Ｃ０８−１細胞をトランスフェ
クションするためのベクターの使用法及びトランスフェ
クションされた細胞の培養増殖法に関する。例７は、陽
性ヒトゲノムクローンから得られたＥＰＯをコードする
ＤＮＡを取り込んだベクターの調製方法、ｃｏｓ−ｉ細
胞をトランスフェクションするためのベクターの使用法
及びトランスフェクションされた細胞の培養増殖法に０ 関する。例８は、例６及び７におけるトランスフェクシ
ョンされた細胞の培養増殖により得られた培地上澄で実
施されたイムノアッセイに関する。

例９は、例６及び７における真核生物細胞発現によるＥ
ＰＯのイン・ビトロ及びイン・ビボ生物学的活性に関す
る。

例１Ｏは、チャイニーズハムスター卵巣（ｒＣＨＯＪ）
細胞によるサル種ＥＰＯ−ｃＤＮＡ及びヒト種ゲノムＤ
ＮＡについての哺乳類宿主発現系の調製並びにこれらの
発現系による生産物の免疫的および生物学的活性、およ
びこれらの生産物の特徴づけに関する。

例１１は、ヒト種ＥＰＯをコードする合成遺伝子（それ
らは大腸菌及び酵母での発現のための多数の優先コドン
を含むものである）の調製及びそれに基づく発現系に関
する。

例１２は、例１１の系における発現生成物の免疫学１ 的及び生物学的活性面に関する。

例　　　　１ Ａ、ヒトＥＰＯフラグメントのアミノ酸配列決定ヒトＥ
ＰＯを尿から単離し、トリプシン切断させて、約１００
〜１５０　ピコモル量の１７個に分断されたフラグメン
トとし、単離した。

フラグメントに任意に数字を付し、気相配列決定装置（
アプライド・バイオシステムス）を用いて微細配列順序
分析によりアミノ酸配列を分析し、以下の表Ｉに示した
配列情報を得た。表では、単一文字符号が用いられてお
り、「Ｘ」は明確に決定されなかった残基を表わす。

２ Ｔ　弘　ａ Ｔ　弘　ｂ Ｔり Ｔ／Ｊ Ｔ／＆ Ｔ／♂ Ｔ２／ Ｔ２夕 ｊ７ａ ２ｔｂ Ｔ、２・７ ２ｒ Ｔ　３′０ Ｔ３／ ３３ Ｔ　３　！ Ｊｒ 表　　Ｔ Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｒ Ｇ−に−Ｌ−Ｋ Ａ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｋ Ｖ−Ｌ−Ｅ−１ Ａ−Ｖ、−８−Ｇ−Ｌ−Ｒ Ｌ　　−Ｆ　　−Ｒ Ｋ−Ｌ−Ｆ−Ｒ Ｙ−Ｌ−Ｌ−’Ｅ−Ａ−Ｋ Ｌ−ｒ−Ｃ−Ｄ−８−Ｒ Ｌ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｅ−Ａ　　−Ｃ−Ｒ Ｔ−Ｉ−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｔ　−Ｆ　＝　ＲＥ−Ａ＝Ｉ−８
−Ｐ−Ｐ−Ｉ）＝４− Ａ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｒ Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｘ−１−Ｔ−Ｔ−Ｇ− Ｘ、、−Ａ−Ｅ−Ｈ−Ｘ−８−Ｌ− Ｎ−Ｅ−、Ｘ−Ｉ−Ｔ、−Ｖ−Ｐ Ｖ−Ｙ−８−Ｎ−Ｆ−Ｌ−Ｒ ３−’Ｌ−Ｔ−Ｔ−Ｌ−Ｌ’−Ｒ Ｖ−Ｎ−Ｆ−Ｙ’−Ａ−Ｗ　＝Ｋ Ｇ−Ｑ−Ａ−Ｌ−、Ｌ−Ｖ−Ｘ−８− ５−Ｑ−Ｐ−Ｗ−Ｅ−、Ｐ−Ｌ− Ｑ−Ｌ−Ｈ−Ｖ−Ｄ−Ｋ Ｂ、オリゴヌクレオチドプローブ混合体の設計と調製 表Ｉに示したアミノ酸配列に関し、混合プローブ操作が
ｃＤＮＡ及び（又は）ゲノムＤＮＡライブラリーでのＤ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作に適用し得るかにつ
いて確認する目的で、遺伝暗号の縮重関係を精査した。

この分析では、フラグメントＮαＴ３５の中に７つのア
ミノ酸残基（Ｖａ１人５ｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙ＋−Ａｌａ−
Ｔ＋ｐ−Ｌｙｓ　）が存在していたことが判明したが、
この鎖は２０塩基対について可能な１２８種類のＤＮＡ
鎖のうちの一つによりコードされているということによ
り独特に特徴づけることができる。　１２８種類の２０
塩基鎖オリゴヌクレオチドの第一の組は、したがって下
記表■に示した配列に従い、固体支持体上での標準ホス
ホアミデート法［例えば、ビューケージら；　「テトラ
ヘドロン・レターズ」、第２２巻、第１８５９−１８６
２頁、１９８１４ 年（Ｂｅａｕｃａｇｅ、　ｅｊ　ａ Ｔｅｌｒａｈｅｄ＋ｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２゜ｐ
ｐ１８５９−１８６２　（１９８１１）参照］により合
成される。

表　　　■ 残基　Ｖａｔ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　　Ａｌ
ａ３’　　　　ＣＡＡ　　　ＴＴＧ　　　ＡＡＧ　　　
　ＡＴＧ　　　　ＣＧ人Ｔ人ＡＡＴ Ｇ Ｃ Ｔｒｐ　　　Ｌロー ＡＣＣＴＴ−５’ 更に分析すると、フラグメントＮαＴ３８の中に、６つ
のアミノ酸残基（Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ）の存在が確認され、それに基づけば、下
記表■に示したように　１２８種類の混合オリゴヌクレ
オチドの１７−ｍａｒプローブのプールを調製すること
ができる。

５ 表　　　■ 残基　Ｇｌｎ　　Ｐ「ｏ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｌｅｕ３’　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＡＣＣＣＴＴ　Ｇ
ＧＡ　ＧＡ−５’ＣＴ　　　ＣＴ人 　　　Ｇ Ｃ オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（Ｎ　Ｅ　Ｎ）を用いて７５００〜８０００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ　（Ｉ　ＣＮ）の７−”Ｐ−ＡＴＰにより
５′末端で標識化した。

例　　　　２ Ａ、サルの処理操作 メスのカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏ１ｇｕ＋　ｍｏｎｋ
ｅｙ）カーファシキュラリアス（Ｍａｃａｃａ　ｔａｔ
ｃｉｃｕ（２，５〜３ｋｇ、ｌ、５〜２年齢）に１．３
及び５１２．５■／ｋｇの用量でｐＨ７，０の塩酸フェ
ニルヒジン溶液を皮下注射して処理した。ヘマトク６ マカ ａｒｉａｓ） 日目； ドラ リッ ト値をそれぞれ注射する前に測定した。７日目に、ある
いはへマドクリット値が初期値の２５％低下した際、塩
酸ケタミン２５■／ｋｇを投与して、血清及び腎臓を採
取した。採取物を直ちに液体窒素で凍結し、−７０℃で
保存した。

Ｂ、ＥＰＯのＲＩＡ 試料中のＥＰＯ定量のためのラジオイムノアッセイ操作
を以下の操作に従い実施した。

エリスロポエチンの標準（この標準は、ＣＡＴｌと呼ば
れる人尿由来のエリスロポエチンで、そのエリスロボエ
チン活性はエリスロボエチンの国際的標準であるＷＨＯ
ＩＲＰ　＃１に対し検定されているものである。なお、
この標準はシカゴ大学のゴールドワッサー（Ｄｒ、　Ｅ
、　Ｇｏｌｄｗａ＋５ｅｒ）より入手した。）又は未知
試料を３７℃で２時間抗血清と一緒にイン２５ キュベートした後、試験管を氷冷し、　　　■−標識化
エエクロボエチンを加え、管を１５時間以上７ ０℃でインキュベートした。各試験管には、希釈免疫血
清５更、１２５■−エリスロボエチンｔｏ、　（１００
ｃｐｍ、　トラシロール５成及びＥＰＯ標準もしくは未
知試料０〜２５０成からなり、残部が０．１％ＢＳＡ含
有ＰＢＳであるインキュベート混合物５００成が入って
いた。使用した抗血清は、ヒト尿エクスロボエチンの純
粋な１％標品で免疫されたウサギの第２回目採血液であ
った。試験のための最終的抗血清希釈液は、抗体−結合
１２５Ｉ−ＥＰＯが入力縁カウント数の１０〜２０％を
超えないように調整された。

一般に、これは１　：　５０，０００〜１　：　１Ｇ０
．０００の最終的抗血清希釈液に相当した。

２５− 抗体−結合　　■　エリスロボエチンは、スタフＡ　（
＋ｔａｐｈ　Ａ）　１５０Ｉ１１の添加により沈澱した
。４０分間インキュベートした後、試料を遠心分離し、
ペレットを０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ及
び０．０５％トリトンＸ−１００含有１０ｍＭトリス−
ＨＣｊ！　０．７５ｍ１　（ｐｎａ、　２）８ で二回洗浄した。洗浄したペレットをガンマ−カウンタ
ーで計測し　　１２５■−エリスロポエチン結合体の％
を求めた。免疫前の血清のカウント数を、非特異的沈澱
について補正するため、全ての最終値から差し引いた。

未知試料のエリスロボエチン含量を標準曲線と比較して
求めた。

上記操作を、未処理サル血清のみならず、前記Ａ部で得
られたサル血清にも適用した。正常血清値を分析すると
含有量は約３６ｍＵ／ｍｌであったが、処理サル血清で
は含有量は１０００〜１７００ｍＵ／ｍｌであった。

例　　　　３ Ａ、サルｃＤＮＡライブラリーの構築 メツセンジャーＲＮＡを、チャーブウィンら：「バイオ
ケミストリー」、第１８巻、第５２９４頁、１９７９年
［’Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　　ｅ）　ａｔ、、　　ＢＩｏ
ｃｂｅｍｉｓｌｔｙ　　１８ｐ　５２９４　（１９７９
）　］のチオシアン酸グアニジウム法９ によって正常と貧血サル腎臓から単離し、ポリ（Ａ）”
　　ｍＲＮＡを、マニアナイスら＝　［モレキュラー・
クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアルＪ　　（
１９８２年、ニューヨーク州、ハーバ−、コールトスプ
リンゲス所在、コールトスプリンゲスハーバ−ラボラト
リ−）　　［Ｍａｎｉａｌｉｓ、　ｅｊ　ａ“Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏ＋ａｌｏ
Ｂ　Ｍａｎｕａじ（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇｓ　　ｔ
ｌａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　　
Ｓｐ＋１ｎＨＨａｒｂｏｒ、　　Ｎ、Ｙ、、　　１９ｇ
２）コ第１９７−１９８頁に記載されているように、オ
リゴ（ｄＴ）−セルロースカラムクロマトグラフィーで
二回精製した。　ｃＤＮＡライブラリーを、オカヤマら
＝　「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
」、第２巻、第１６１１７０頁、１９８２年［Ｏｋａｙ
ａｍａ、ｅｌ　ａｔ、、　　Ｍｏｌ、ａｎｄ　ＣｅＢｉ
ｏｌ、、　　２．　　ｐｐ１６１−１７０　　（１９８
２）コの一般的方法の修正法により調整した。本発明で
の好ましい操作のキーポイントは以下のとおりであった
：（１）ｐＵＣ８０ を唯一のベクターとして使用し、Ｐｓｊｌで切断し、次
いで６０〜８０塩基鎖のオリゴｄＴの尾部をつけた。（
３Ｈｔｎｃｎ切断によりベクターの一端からオリゴｄＴ
尾部を取り除いた、（３）第一の鎖の合成とオリゴｄＧ
の尾部づけを公表された方法により実施した、＜４）　
Ｂ　ａｍＨＩ切断によりベクターの一端からオリゴｄＧ
尾部を取り除いた、及び（５）　Ｄ　Ｎ　ＡによるＲＮ
Ａ鎖の置換には、オリゴｄＧ尾部つきベクターよりも３
倍モル過剰の２つのリンカ−（ＧＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣ
ＣＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣおよびＡＣＧＧＴＣＴＴＴ＾
）を用いた。

トランスフォーメーションを受けた大腸菌を、５０ｐ９
／ｍ＋のアンピシリン含有栄養平板上に、１０ＸｉＯａ
ｎプレート当り９０００コロニーの密度で分散させた。

ジーン・スクリーン・フィルター（Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ１ Ｓｃｒｅｅｎ　ｆｉｌｔｅｒ）　（＝　ニーイングラン
ド・ヌクレア・カタログＮｃＬＮ　Ｅ　Ｆ　−９７２）
をＢＨＩ−ＣＡＭプレート（バクト（Ｂａｃｌｏ）脳心
臓浸出液３７ｇ／ρ、カザミノ酸２ｇ／ρ及び寒天１５
ｇ／ｆ１１クロラムフェニコール５００埒／ｍｌ含有）
にて予め湿潤させ、プレートからコロニーを採取するの
に用いた。コロニーを同一の培地で１２時間以上増殖さ
せて、プラスミド複製数を増やした。増殖したコロニー
（コロニ・サイド・アップ）を、以下の溶液でそれぞれ
飽和された２枚のワットマン　３ＭＭ紙上にフィルター
を連続的におくことにより処理した：（１）５分間は５
ｆ１ｍＭグルコースー２５ｍＭ）リスＨＣＪ（ｐＨ８，
０）　−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ８，０）、（２
）　１０分間は０．５ＭＮａＯＨ，及び（３）３分間は
１．θＭトリスＨＣＩ　　（９Ｈ７，５）フィルターを
次いで、８０℃にて２時間減圧乾燥させた。

２ フィルターを次に、プロテア−ゼにで消化に付し、緩衝
液Ｋ　［０，１Ｍ　）リスＨ］！　　（ｐＨ８，０）０
、１５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＲ−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　　（ｐ
Ｈ８，２）　−０，２％５ＤＳｌ中に該プロテアーゼ酵
素５０７１９　／　ｍｌを含む溶液で処理した。具体的
には、この溶液５ｍｌを各フィルターに加え、５５℃で
３０分間消化処理し、しかる後溶液を除去した。

フィルターを次いで、プレハイブリダイゼーション緩衝
液（５Ｘ　５ＳＰＥ−０，５％５ＤＳ−１００ＩＩＩ／
　ｍｌ　８３大腸菌ＤＮＡ−５ｘＢＦＰ）　４ｍｌで処
理した。プレハイブリダイゼーション処理を５５℃で、
おおむね４時間以上行ない、その後、プレハイブリダイ
ゼーション緩衝液を除去した。

ハイブリッド形成操作を以下の方法で行なった。

各フィルターに、表■の　１２８種類のプローブ配列（
ＥＰＶ混合体とされる全ての混合体）をそれぞれ０．０
２５　ピコモル含有するハイブリダイゼーショ３ ン緩衝液（５ｘ　５ＳＰＥ−０，５％５ＤＳ−酵母菌ｔ
ＲＮＡ　　１００１１９　／　ｍｌ　）　３’　ｍｌを
加え、フィルターを４８°Ｃで２０時間保持した。この
温度は、全てのプローブについて決定された計算解離温
度（Ｔｄ）の最低のものより２℃低かった。

ハイブリッド形成後、フィルターを振盪器にて１０分間
、室温でｉｉＸ　５ＳＣ−０，１％ＳＤＳにより３回洗
浄し、ハイブリッド形成温度（４８°Ｃ）にて２〜３回
６　ｘ　５ｓＣ−１％ＳＤＳで洗浄した。

フィルターのオートラジオグラフィーにより、スクリー
ニングされた２００．　ＯＮコロニーの中から７つの陽
性クローンが見出された。

推定されるサルｃＤＮＡクローンの一つ（クローン＃８
３）の最初の配列分析が、ウォレスら：　「ジーン」、
第１６巻、第２１−２６頁、１９８１年［Ｗａｌｌａｃ
ｅｅ＋　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、Ｉ６．　　ｐｐ２１−２６
　（１９８１）］の方法を修正して確認のために行われ
た。即ち、サルｃＤＮＡ４ クローン＃８３からのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで
切断して直鎖状となし、沸騰水浴上で加熱して変性させ
た。ヌクレオチド配列をサンガーら：ｒＰ、Ｎ、Ａ、ｓ
、Ｊ　　（米国）、第７４巻、第５４６３−５４６７頁
、１９７７年［Ｓａｎｇｅｒ、　　ａｔ　ａｔ、、　　
Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　（Ｕ、Ｓ、Ａ）、７４゜ｐｐ５４
６３−５４６７　（１９７７）コのジデオキシ法で調べ
た。

１６の配列からなるＥＰＶプローブ混合体の一部を塩基
配列決定のプライマーとして用いた。

Ｃ，サルＥＰＯｃＤＮＡ配列 クローン＃８３のヌクレオチド配列分析をメッシング：
　「メソッド・イン・エンザイモロジー」、第１０１巻
、第２０−７８頁、１９８３年［Ｍｅ＋＋ｉｎｇ、　Ｍ
ｅｌｈｏｄｉｉｎ　ＥｎＢｍｏｌｏｇｙ、　　１０１．
　　ｐｐ２０−７８　（１９８３）］の方法に従って行
なった。表■に示したのは、クローン＃８３における約
１６００塩基対のＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄ　ｍクローン
化フラグメントの予備的な制限酵素地図分析結果である
。制限エンドヌクレアーゼ酵素認識５ 部位のおおよその位置は、該フラグメントの５′末端の
ＥｃｏＲ１部位に対する３′側の塩基数によって表わさ
れる。ヌクレオチドの配列決定は、重複するフラグメン
トを重ね合せるように、個々の制限フラグメントをつな
げることにより行なわれた。

例えば、Ｃ１１３の制限フラグメント（１１１の５ａｕ
３Ａ／３２４のＳｍａＩ）におけるヌクレオチド分析で
得られる配列情報とＣ７３のフラグメント（４２４のＡ
ｌｕｌ／２０３のＢ＋１ＥＩＩ）ノ逆方向配列決定ニヨ
り得られる配列情報との重複である。

６ 」罰ｏｇＩ Ｓａｕ　３　Ａ 」二りよ り５ｔＥＩＩ Ｓｎ＋ａ　　］： １ＬＩ ５−ａｌ Ａｌｕ　Ｉ Ｐｉｔ　工 ｌｕｌ 工立ム゛工 Ａｌｕ工 １ｔｌＩ ｖｕＪＩ Ａｌｕ、Ｉ １ｕｒ Ａ、Ｉｕ：Ｉ １ｉａＪ Ｐｉ；ｔ、Ｉ Ａｌｕ　Ｉ Ａ　１．ｕ　−Ｉ Ｎｅｏ：ｌ ５ａｕＪ、Ａ ＩｕＩ Ａ１．ｕＪ Ａｌｕ　Ｉ ｓｔＩ ｓａ　Ｉ １ｕｌ ＨｉｎｄＩＩＩ Ａ、１ｕｌ Ｈｉｎｄ　ｌｌＩ ２〈 ■ ＩＩ／ ／１０ ＋２０３ ２４ｔ Ｊ７／ ７２ ４’２＜’ グλｔ グ３０ −ｔｔ ！４！ｔ Ｏ１ ｔ、ｏ４ｔ ｔｏ’ｊ ７１ｒ＋ｉ！ ７ｒ、Ｉ ７り２ ｒη７ ４ｔｉ り２７Ｔ タグｔ ｌＯ／４Ｌ １０７．２ ／／、／、！− ／、２．２Ｊ ／３０／ １３≠３ ／　３　ｒ、４ｔ １４ｔ≠り ｌ弘！Ｏ ／ｊｒｒｊ 約１３４２塩基対（ＥｃｏＲＩ部位の３′側の５ａｕ３
Ａ部位からＨｉｎｄ■部位までの範囲内で）の配列を決
め、全ての解読可能な構造を分析して、表Ｖに示したＤ
ＮＡ及びアミノ酸鎖の情報を解明することができた。表
中、成熟ＥＰＯのアミノ末端と推定される最初のアミノ
酸残基（ヒユーイック・エムら＝　「ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー」、第２５６巻、第　
７９９０−７９９７頁、１９８１年［Ｈｅｗｉｃｋ、Ｍ
、、ｅｔ　ａｌ、、１．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５
６．７９９０−７９９７　（１９８１）　］の操作によ
りアミノ酸分析が気相配列決定装置［アプライド・バイ
オシステム社（ＡｐｐＨｉｅｄ　Ｂｉｏｉｙ＋ｔｅｍｓ
、　　Ｉｎｃ）　］によって行なわれた成熟ヒトエリス
ロポエチンの最初の２０個のアミノ末端残基配列分析と
対比させて確認されるような）は、数値の＋１で示され
ている。成熟蛋白質アミノ酸鎖において一番目の残基で
ある最初のアミノ末端アラニン残基の「上流」に位置し
てい８ てメチオニンを特定化するＡＴＧコドン（−２７で示さ
れる）の存在は、成熟ＥＰＯが循環系に入る前に切除さ
れる２７のアミノ酸「リーダー」領域を含む前駆体型と
して、ＥＰＯが細胞質中でまず発現される可能性のある
ことを示している。ポリペプチド中の潜在的グリコジル
化部位は本で示されている。翻訳領域の分子量は２１１
１７ダルトンであり、成熟サルＥＰＯを構成するポリペ
プチドの１６５残基の分子量は１８２３６ダルトンであ
った。

９ 　５０ コロ　　し０ ５１ ２ 表Ｖのポリペプチド鎖は、例えばホップら：ｒＰ、Ｎ、
Ａ、ｓ、Ｊ　　（米国）、第７８巻、第３８２４−３８
２８頁、１９８１年［Ｈｏｐｐ、　　ｅｌ　ａｌ、、　
　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７８、ｐｐ３
Ｂ２４−３８２８　（１９８１）］　、カイトら＝　「
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、第
１５７巻、第　１０５−１３２頁、１９８２年［Ｋｙ＋
ｅ、ｅｌ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１Ｂｉｏｌ、、　　１５７
、ｐｐ１０５−１３２　（１９８２）コ及び（又は）チ
ューら：　「バイオケミストリー」、第１３巻、第２２
２−２４５頁、１９７４年［Ｃｈｏｕ、ｅｌ　ａｌ、、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３ｐｐ２２２−２４５　（１９７４
）］及び「アドバンシズ・イン・エンザイモロジー」、
第４７巻、第４５−４７頁、１９７８年［Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ　ｉｎ　Ｅｙｘｙｍｏｌｏｇｙ、　４７．ｐｐ４５
−４７（１９７８）］の方法により、高度に親水性の領
域及び（又は）潜在的に高度な免疫原性領域を示す二次
構造特性の存在に関する分析に容易に付されるであろう
。

ホップらの方法によるコンピューター補助分析は、カリ
フォルニア州、パロアルト、ユニバーシティ３ アベニュ　１２４のインテリジエネティックス社から入
手可能なＰＥＰレファレンスのセクション６．７に示す
プログラムにより実施可能である。

例　　　　４ Ａ、ヒトゲノムライブラリー ローンら＝　「セル」、第１５巻、第１１５７−１１７
４頁、１９７８年［Ｌａｗｎ、　　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１
ｌ］の方法により調製されたＣｈ４Ａファージデーヒト
胎児肝ゲノムライブラリーを得、プラークハイブリダイ
ゼーション分析で使用するために保存した。

ファージ粒子を溶解し、ＤＮＡを、シーンスクリーン・
プラス・フィルタにューイングランド・ヌクレア・カタ
ログｋ　ＮＥＦ−９７２）及びＮ２ＹＡＭプレート・　
（１リツトルにつき、ＮａＣｆ１５　ｇ　１ＭｇＣｊ２
２６Ｈ２０２ｇ　１Ｎ　Ｚ−アミンＡ１０ｇ、酵母エキ
ス５ｇ１力ザミノ酸２ｇ、マルトース２ｇｓ及び寒天１
５ｇ）を使用することを除いては、ウー：　「メソッズ
・イン・エンザイモロジー」、第６８巻、第３８９−３
９５頁、１９７９年［Ｗｏｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ
　ＥｎＢｍｏｌｏｇｙ。

６８、　　ｐｐ３８９−３９５　（１９７９）コの方法
により、フィルター（フィルター当り５０．０００プラ
ーク）に固定した。

風乾したフィルターを８０℃で１時間焼付し、次いで例
３のＢに記したように、プロティナーゼにで消化した。

プレハイブリダイゼーションを５５°Ｃで４時間以上Ｉ
ＭＮａａ！−１％ＳＤＳ緩衝液で行ない、しかる後緩衝
液を除去した。ハイブリッド形成及びハイブリッド後洗
浄を例３のＢに記したように行なった。ＥＰＶで示され
る　１２８種類の２０−ｍａｒプローブ混合体及びＥＰ
Ｑ混合体で示される表■の１２８種類の１７−ｍａｒプ
ローブ混合体を用いた。ハイブリッド形成は、ＥＰｖプ
ローブ混合体を用い、４８℃で行なわれた。ＥＰＱプロ
ーブ混合混合体バイブ リ５ド形成は４６℃、即ち混合体中の最低の計算Ｔｄ値
より　４℃低い温度、で行なわれた。再ハイブリッド形
成のためのハイブリッド形成プローブの除去を、ｌ　ｘ
　５ＳＣ−０，Ｉ％ＳＤＳと一緒に２分間煮沸すること
により行なった。フィルターのオートラジオグラフィー
により、調べられた１、　５００．０００のファージプ
ラーク中３つの陽性クローン（いずれのプローブ混合体
とも反応する）が見出された。

ＥＰＯをコードしているような陽性クローンの確認が、
ＤＮＡシークエンシングと、例３のサルｃＤＮＡとのへ
テロ二重鎖形成の電子顕微鏡写真による視覚化とによっ
てなされた。この操作によっても、ゲノムＤＮＡ鎖にお
ける多数のイントロンの存在が実証された。

例　　　　５ （λｈＥ１で示される）陽性クローンの一つのヌクレオ
チド配列分析（前記サンガーらのジブ第６ キシ法）を行なったが、これまでに得られた結果は表■
に示されている。

表■中、最初のＤＮＡ配列は、ヒトＥＰＯ遺伝子の翻訳
部分の直前の非翻訳配列と思われる最前の６２０塩基を
示す。より具体的には、その配列は、リーダー配列（「
前配列」）における最初の４つのアミノ酸（−２７〜−
２４）をコードする翻訳ＤＮＡ領域（この領域は、後述
する表■に示されるヒトＥＰＯゲノムＤＮＡとサルＥＰ
ＯｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列の間の相同性等に
基づいて決定された。）まで続＜５′末端遺伝子からな
っているようである。リーダーの始まりをコードする遺
伝子の前に位置する鎖中の４つの塩基対はまだ明確には
確認されなかったため、「Ｘ」で表わされている。次い
で、約６３９塩基対（そのうち４３９塩基対が配列決定
されたが、残りの２００塩基対はｒ　Ｉ、　Ｓ、　Ｊで
表わされている）からなるイントロン７ に続いており、翻訳されるポリペプチドの残基２３とし
て示されたグルタミン酸コドンの直前に位置している。

その直後に続くエキソン鎖は、（成熟ヒトＥＰＯのアミ
ノ酸鎖残基＋１として示される）アラニン残基から、＋
２６のスレオニンを特定化するコードンまでのアミノ酸
残基をコードしていることが判明し、しかる後具体的に
示した２５６塩基からなる第二のイントロンに続いてい
る。このイントロンの後、２７〜５５のアミノ酸残基の
エキソン配列が続き、その後６１２塩基対からなる第三
のイントロンが始まる。次のエキソンはヒトＥＰＯの５
６〜１１５の残基をコードしており、次いで特定化され
た　１３４塩基からなる第四のイントロンが始まる。第
四のイントロンに続くのは、第１１６〜１６６の残基を
コードするエキソンと「停止」コードン（ＴＧＡ）であ
る。最後に、表■では、ヒトＥＰＯ遺伝子の非翻訳３′
領域と思われる　５６Ｂ塩基８ 封鎖を明らかにしているが、「Ｘ」で示される２つの塩
基対はまだ明確には配列決定されなかった。

表■はこのように、１６６個の特定のアミノ酸残基の成
熟ヒトＥＰＯ（推定分子量＝　１８．３９９）の−次構
造形状（アミノ酸配列）を確認するのに役立つ。同表中
で同時に示されているのが、ヒト遺伝子オペロンのプロ
モーター／オペレーター機能にとって重要な５’　−３
’　Ｄ　Ｎ　Ａ鎖とともに、２７残基のリーダー配列を
コードするＤＮＡ配列である。成熟ヒトＥＰＯポリペプ
チドの潜在的グリコジル化部位は、表中に＊で示されて
いる。表■の特定のアミノ酸配列がヒトエリスロポエチ
ンの自然発生的対立遺伝型のそれを構成している可能性
があることに注意すべきである。この立場に関する支持
が、残基１２６において表に示したセリンと対立するメ
チオニンを有する多くのエリスロボエチン分子の発見に
至った、尿中ヒトエリスロポエチンの９ 単離物を配列決定するという長年の努力の結果の末に見
出された。

以下の表■はヒトおよびサルのＥＰＯにおけるポリペプ
チド配列の相同性の程度を示している。

表中の上部の連続列において、−文字の符号は残基−２
７で始まるヒｌ−Ｅ　Ｐ　Ｏについて推定翻訳されたポ
リペプチド配列を示すために用いられており、下部の連
続列は指定の残基−２７で始まるサルＥＰＯについて推
定されたポリペプチド配列を示している。木は、配列相
同性を強調するために用いられている。推定されたヒト
およびサルＥＰＯ配列は、ヒトにおける部位１１６に「
付加的」リジン（Ｋ）残基を示していることに注目すべ
きである。

表■と相互に参照することにより、この残基が丁度ゲノ
ム配列において推定されるｍＲＮＡのスプライス部位に
あることが明らかとなる。ヒトポリペプチド配列におけ
るリジン残基の存在は、下記０ 例７でヒトゲノムＤＮＡによりトランスフォーメーショ
ンされたＣ０８−１細胞から単離されたｍＲＮ　Ａより
得られるヒト　ｃＤＮＡＤＮＡ−ンを配列決定すること
によっても更に確認された。尚、リーダー領域を含む前
駆体型のヒトＥＰＯをコードするイントロンを含まない
本発明のＤＮＡ配列を表■及び表■に基づいて作成し、
これをまとめて表■′に示す。

１ Ｇ２− Ｓ Ｇ３ Ｇ ６午 Ｇτ ｅｔＪ　　　　０１ω　　　　α← ψく　　−■　　ψく ＜＜　　　（（Ｊ　　　ｃｔＣ５ ０〕ｔ５ＯＬ−１）−ＯＬ−１ＣＪＯψく　。中口Φ市
　北冒　吋Ｈ二員　二；８ ｑ （ＪＩ− ■υ Ｈく ）υ 」Ｕ 口０ Ｉ−Ｉω く０ ０く −１０ 巳υ Ｏく ＋−ＩＯ （ＬＬＩ −田Ｏ ＋＋＠Ｏ く口 、−１＞（Ｊ −〇 Ｃ＋ＣＺ （ＬＩＬＩ Ｈく Ｃ＋− ψく くく ］〇 −く Ｏ 田０ Ｆ−１（Ｊ くｕ ）Ｏ Ｈく ＬＩ（ｊ ＯψＣ 曽飄く 」く 田Ｕ Ｏ くＣ コＣ Ｈく ｊｃｊ −く ０田０ ’、Ｑ　、−１（Ｊ くＯ ０ Ｈく 口Ｕ Ｕ −く ５０ ＞０ −＋０ ０ −１（Ｊ 〉０ ］〇 −く ５０ ＋−ＩＯ 工く 田〇 一→Ｏ Ｃ〇 −く ｒ、５０ ＞Ｏ ＋ｌｊ ５ｃｊ １０ −〇 くＯ フ０ 」０ ＋−４０ 〉ロ ーＩ（Ｊ コく −く Ｌ７１（Ｊ −く 工Ｏ ＋−Ｉｔ５ 田Ｈ 〉■ ＞Ｃ −＋０ Ｃ トＪＪ　（５ ＮＯＪ＋−。

τ工く シ、〇 一一ロ フロ 」Ｏ −１０ 巳Ｑ ］Ｏ 」Ｏ ＯＬ＋（ｊ ＩＧｊＣＪ ）Ｃ フＣ −く ３Ｃ コ０ 」Ｕ Ｕ 〉０ ０Ｇ１（（ ＋−ＩＬ＋■ く〇 一口 ＪＣ 川く α０ ψく くＣ ８ フロ 」Ｕ ＞ω ＋−Ｉｃｊ ｃｊ ｃ５ Ｈく ＬＩ（Ｊ αＣ ＋−Ｉｃｊ １−１（Ｊ 〉Ｃ フく Ｈく Ｉｃｊ 例 例３の操作で得たサルｃＤＮＡによりコードされるＥＰ
Ｏポリペプチド物質を単離可能な量で微生物合成するた
めに最初の試みとして選択された発現系は、哺乳類宿主
細胞のうちの一種（即ち、ＯＳ １細胞、Ａ、Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＣＲＬ１６５０）
であった。

その細胞は、大腸菌宿主（ｐＢＲ３２２由来ＤＮＡの存
在下にて）および哺乳類宿主（ＳＶ４０ウィルス由来Ｄ
ＮＡの存在下にて）内で自律的に複製することが可能な
「シャトル」ベクターによりトランスフェクションされ
た。

更に具体的には、発現ベクターは以下の操作により調製
された。例３のプラスミドクローン＃８３を大腸菌で増
殖させ、約１．４ｋｂのサルＥＰＯをコードするＤＮＡ
をＥｃｏＲＴおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断により単離した
。分別して単離されたのは、約４．０ｋｂのｐＢＲ３２
２由来ＨｉｎｄＩ［／Ｓａ■フラグメン トであった。約３０ｂｐのＥｃｏＲＩ　／５ａｌＩ　ｒ
リンカ−」フラグメントがＭ　１３ｍｐ　ｌ０ＲＦ　Ｄ
ＮＡ　　（Ｐ　７　ンドＬラボラトリーズ）から得られ
た。このリンカ−はＥｃｏＲＩ付着端を含んでおり、順
に５ｓｔＩ、Ｓ　ｍａ　Ｉ、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ
認識部位さらには５ａｌＩ付着端が続いている。上記３
つのフラグメントは約５．４ｋｂの中間プラスミド（ｒ
ｐＥＲ８Ｊ　）の形成のために連結されたが、このプラ
スミドにおいて、ＥＰＯＤＮＡは有効な制限エンドヌク
レアーゼ認識部位の「バンク」近傍の一端に位置してい
た。ｐＥＲ３を次いでＨｉｎｄ■および５ａｌｌで消化
すると、ＥＰＯＤＮＡおよびＥｃｏＲＩからＳ　ａｌ　
Ｉ　（Ｍ１３ｍｐ　１０）までのリンカ−が得られた。

１．４ｋｂのフラグメントを約４．ＯｋｂのｐＢＲ３２
２のＢａｍＨＩ／５ａｌＩおよび約ａｏｂｐの他の旧３
ＩＩｌｐ１０・Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ／ＢａｍＨＩ　　ＲＦ
７ラグメントリンカーと結合させた。Ｍ１３リンカ−フ
ラグメントは、１ ＨｉｎｄｌＩＩ付着端、それに続＜　ＰＳＩＩ、　５ａ
ｌＩ、ＸｈａＩに認識部位およびＢａｍＨＩ付着端とい
う特徴を有していた。結合生成物は、再び、制限部位バ
ンクをＥＰＯＤＮＡの近傍両端に有する有用な中間プラ
スミド（ｒ　ｐＢＲ−ＥＰＯＪ　）であった。

Ｃ０８−１細胞におけるＥＰＯＤＮＡ発現のために選択
されたベクター（ｒ　ｐＤｓＶＬＩＪ　）は大腸菌にて
選別および自律的に複製させられるよう予め調製された
。これらの特徴は、ｐＢＲ３２２ヌクレオチド２４４８
〜４３６２の領域に存在する複製起点とアンピシリン耐
性遺伝子ＤＮＡ鎖により付与される。この配列は、ベク
ターに取込まれる前に、ヌクレオチド２４４８に直接隣
接するようにＨｉｎｄＩ［認識部位を付与するリンカ−
を付加することにより構造的に変換された。選択された
ベクターの他の有用な特性としては、Ｃ０８−１細胞に
おいて自２ 律的に複製しうる能力と哺乳動物細胞中で機能するウィ
ルス性プロモーター配列の存在であった。

これらの特徴は、５ｖ４０ゲノムにおけるヌクレオチド
数５１７１〜２７０の３４３ｂｐ配列に存在する複製Ｄ
ＮＡ配列の起点および「後期遺伝子」ウィルス性プロモ
ーターＤＮＡ配列により示される。市販のリンカ−［コ
ラボレーティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｌｉｖ
ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　］を用いて唯一の制限部位（
ＢａｍＨＩ）をベクターにっけ、ウィルス性プロモータ
ー配列に直接接合させた。更にベクターには、「後期遺
伝子」ウィルスｍＲＮ　Ａポリアデニル化信号（通常、
転写ターミネ−ターされる）を有する　２３８塩基対配
列（ＳＶ４０のヌクレアーゼ２５３３〜２７７０に由来
する）が取込まれていた。このフラグメントは、ベクタ
ーにおいて、「後期遺伝子」ウィルス性プロモーターか
ら唯一のＢａｍＨ１部位までに対応し、適切に配向して
い３ た。更に、ベクターには、ウィルス性プロモーターとタ
ーミネータ−との間の配列において、唯一のＢａｍＨＩ
部位に挿入された遺伝子の潜在的転写に関与しない部位
に別の哺乳類遺伝子が存在していた［哺乳類遺伝子は、
ガッサーら：ｒＰ、ＮＡ、Ｓ、Ｊ　　（米国）、第７９
巻、第６５２２−６５２６頁、１９８２年（Ｇａｓｓｅ
ｒ、　ｅｌ　ａｌ、、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（Ｕ、Ｓ、
＾）、７９、ｐｐ６５２２−６５２６　（１９８２））
のように、プラスミドｐＭＧ１から単離された約２．５
００　ｂｐのマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ　Ｈ
Ｆ　Ｒ）小遺伝子からなっていた］。

ｐＤｓＶＬｌの構築について以下に補足説明を加える。

このプラスミドベクターは５０４９ｂｐから成り、４種
のＤＮＡフラグメントから合成により得られるものであ
る。これら４種のＤＮＡフラグメント及び合成リンカ−
はいずれも容易に入手可能なものであり、その塩基配列
もすでに決定されている。

４ 各ＤＮＡフラグメントは夫々次のように調製することが
できる。

（１）ヌクレオチド１−２５２０　＋ この２５２０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｐ＋ｔＩフラグメント
はｐ　Ｍ　Ｇ　１から得られ、マウスジヒドロ葉酸レダ
クターゼ小遺伝子をコードするものである。ｐＭＧｌは
スタンフォード大学のＤｒ、　Ｒ，Ｓｃｈｉｍｋｅから
入手したもので、このプラスミドは一般に入手可能なも
のである（前掲ガッサーら参照）。

（２）ヌクレオチド２５２１−２７８３　＋この２６３
ｂｐから成るＰｒｆＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、５
ｖ４０ゲノムのヌクレオチド数２５３３２７７０由来の
ＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩフラグメント（２３８ｂｐ）のＢ
Ｃ１Ｃ６位に合成リンカ−を付加してＰ＋ｌＩ部位に変
換することにより調製したものである。尚、ＳＶ４０及
びここで用いた合成リンカ−は市販されているものであ
る。

５ （３）ヌクレオチド２７８４−３１２９　：この３４６
ｂｐから成るＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｍフラグメントは、
ＳＶ４０ゲノムのヌクレオチド数５１７１２７０由来の
ＰｖｕＩＩ　−Ｈ１ｎｄｕフラグメント（３４３ｂｐ）
のＰｖｕｌＩ部位（ヌクレオチド数２７０）に、市販の
合成リンカ−を接合させてＢａｍＨＩ部位に変換するこ
とにより調製したものである。

（４）ヌクレオチド３１３０−５０４９　＋この１９２
０ｂｐから成るＨｉｎｄｌ［−ＥｃｏＲＩフラグメント
は、ｐＢＲ３２２のヌクレオチド数２４４１１−４３６
２領域のヌクレオチド数２４４８にＨｉｎｄ　ｍ認識部
位を付与する合成リンカ−を直接付加することによって
調製したものである。

例えば、上記マニアティスらの方法により、ＥＰＯをコ
ードするＤＮＡをＢａｍＨＩフラグメントとしてプラス
ミド　ｐＢＲ−ＥＰＯから単離し、ＢａｍＨＩで切断さ
れたプラスミドｐＤｓＶＬ１に６ 結合させた。制限酵素分析を行ない、２つの得られたク
ローンベクター（複製ベクターＨおよびＬ）が正確に配
向してＥＰＯ遺伝子が挿入されたことを確認した。プラ
スミドｐＤＳＶＬ−ＭｋＥを示した第２図参照。誤って
配向したＥＰＯ遺伝子を有するベクター（ベクターＦ、
Ｘおよ□びＧ）は、正確に配向したＥＰＯＤＮＡを有す
るベクターでトランスフォーメーションされた宿主のＥ
ＰＯ発現量を測定するためのトランスフェクション実験
において、ネガティブコントロールとして使用するため
に保存した。

キャリアＤＮＡ　（マウス肝および牌ＤＮＡ）と結合し
たベクターＨＳＬ、Ｆ、ＸおよびＧを用い、リン酸カル
シウム微細沈澱法により、二重６０＋ｎｍプレートをト
ランスフェクションした。二重６Ｇ＋ｎｍプレートはま
た、「にせ」のトランスフォーメーションのネガティブ
コントロールであるキャリアＤ７ ＮＡによってもトランスフェクションされた。５日後、
全ての培地について、天然ＥＰＯの免疫学的性質を有す
るポリペプチドの有無に関し試験した。

例　　　７ Ａ、Ｃ０８−１細胞を含む第−ＥＰＯ発現系ヒトゲノム
のＤＮＡ　　ＥＰＯクローンによりコードされたヒトＥ
ＰＯポリペプチド物質を単離可能な量で微生物合成する
最初の試みのために選択された系には、哺乳類宿主細胞
（即ち、ＣＯ５−１細胞、人、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、
　ＣＲＬ−１６５０）での発現が包含される。ヒｈＥＰ
ｏ遺伝子を、まず、大腸菌宿主（ｐＢＲ３２２由来ＤＮ
Ａの存在下にて）および哺乳類細胞系Ｃ０８−１（ＳＶ
４０由来ＤＮＡの存在下にて）内で自律的に複製するこ
とが可能な「シャトル」ベクターにてまずサブクローン
化した。ＥＰｏ遺伝子含有シャトルベクターを次いでＣ
Ｏ８８ １にトランスフェクションした。ＥＰＯポリペプチド物
質がトランスフェクションされた細胞から産生され、細
胞培地に分泌された。

更に具体的には、発現ベクターは以下の操作により調製
された。ラムダクローンλｈＥ１から単離され、ヒトゲ
ノムＥＰＯ遺伝子を含むＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉ
ｎｄｌ［Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化して、全ＥＰ
Ｏ遺伝子を含む５．６ｋｂＤＮＡフラグメントを単離し
た。このフラグメントを、同様に消化された細菌プラス
ミドｐＵＣ８［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社
（ＢｅｊｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ　　Ｉｎｃ、）］　と混合し、結合させて、
この制限フラグメントの簡便な供給源となる中間プラス
ミドｒ　ｐＵＣ８−ＨｕＥＪを得た。

Ｃ０８−１細胞におけるＥＰＯＤＮＡ発現のために選択
される　３３３８ｂｐから成るベクター（ｐｓＶ４ｓＥ
ｌ）を予め調製した。プラスミドｐｓＶ４ｓ１．１９ は３種のＤＮＡフラグメントから合成されており、各フ
ラグメントは市販のＤＮＡに入手容易な合成リンカ−を
付加して修飾したものである。このプラスミドは、大腸
菌における選択および自律的な複製をなすＤＮＡ配列を
含んでいた。これらの特徴は、細菌プラスミドｐＢＲ３
２２のヌクレオチド数２４４８〜４３６２領域に存在し
ている複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子ＤＮＡ配
列により付与される。この領域を、ヌクレオチド数２４
４８にＨｉｎｄｌｌｌ認識部位を付与するリンカ−を付
加することにより構造的に変換し、ｐｓＶ４３Ｅｔのヌ
クレオチド数１４２２−３３３８　（Ｈｉｎｄ　ｍ　−
Ｅ　ｃｏＲＩ　）領域とした。

このＨｉｎｄｌ［−ＥｃｏＲＩ領域は、カリフォルニア
大学のティジャン（Ｒ９Ｔｉｉａｎ）より分与を受けた
プラスミドｐｓＶＯ８（メイヤーら＝　「セル」、第２
５巻、第３７３−３８４頁、１９８１年［Ｍｙｅｒ３　
Ｒ，Ｍ、　、　ｅｌ　ａＣｅｌｌ、２５．　ｐｐ３７３
−３８４　（１９８１）］　）をＨｉｎｄＩ［およ０ びＥｃｏＲＩで消化することにより得た。得られたＨｉ
ｎｄｆｆｉリンカ一部分を含む該断片概略を以下に示す
。

ＨｉｎｄｌｌＩ ＥｃｏＲＩ リンカ一部分 （ｐＢＲ３２２由来） ←　　　ｐＢＲ３２２由来部分　　　　　　→ＡＧＣＴ
ＴＧＧＡＡＴＣ人・　・　　　　　　　　　　　　　・
　・　ＴＴＣＡ八ＧＡへＣＴＴＡＧＴ・　・　　　　　
　　　　　　・　・　ＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡ↑ ４４８ ↑ ３６２ 尚、該ＨｉｎｄＩ［−ＥｃｏＲＩ断片は、以下に述べる
ような方法によっても、調製することができる。まず、
ｐＢＲ３２２よりＳ）ａＮＩ−Ｂｇｌｌ断片（約９１４
　ｂｐ）を単離する。次に、ｐＢＲ３２２よりアンピシ
リン耐性遺伝子領域にかかる部分を含むＢｇｌＩ−Ｈｉ
ｎｄｍ断片（約９０８　ｂｐ）を単離する。最後に、以
下に示す配列［ｐＢＲ３２２のヌクレオチド数２４４８
か１ ら２５６７　（Ｓ　ｆａＮ　Ｉ部位）の配列に、更にＨ
ｉｎｄｕ部位を２４４８側に付加した配列コを有する１
２９　ｂｐのＤＮＡ断片を合成する。

これら３つのＤＮＡ断片を連結して得られたプラスミド
を、Ｈｉｎｄ　ｍおよびＥｃｏＲＩで消化することによ
り、唯一の大断片として該Ｈｉｎｄｌ［−ＥｃｏＲＩ断
片が得られる。

２ プラスミドｐｓＶ４Ｈ１は、ＣＯ３−１細胞においても
自律的に複製することができた。この特徴は、ＳＶ４０
のウィルス複製起点を含む３４３ｂｐのＨｉｎｄｍ−Ｐ
ｖｕＩＩフラグメント（ヌクレオチド数５１７１〜２７
０）にあった。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩ認識部
位をヌクレオチド数２７０に接合させるリンカ−１およ
び５ａｌＩ認識部位をヌクレオチド数５１７１に接合さ
せるリンカ−を付加することにより変換し、ｐＳｖ４Ｓ
Ｅｔノヌクレオチト数１−３５３（ＥＣＯＲ３ ｌ−８ａｌＩ）領域とした。ＳＶ４０由来の１０６３ｂ
ｐのＨｉｎｄＩ［Ｉ　−ＢｃｌＩフラグメント（ヌクレ
オチド数１７０８〜２７７０）を、！３ａｌＩ認識部位
をヌクレオチド２７７０に接合させるリンカ−を付加す
ることにより変換し、ｐｓＹ４３Ｅｌ　（７）ヌクレオ
チド数３５４−１４２１（ＳａｌＩ　−ＨｉｎｄＩ［）
領域とした。このフラグメント中には、唯一のＢａｍＨ
Ｉ認識配列も含まれていた。即ち、以上の３種のＤＮＡ
フラグメントから成るプラスミドｐｓＶ４ｓＥｌ　は、
ヒトＥＰＯ遺伝子が挿入されるＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄＩ［［認識部位、大腸菌内で複製および選択される配
列、並びにＣ０８−１細胞内で複製される配列を含んで
いた。

ＥＰＯ遺伝子をｐｓＶ４ｓＥＩに挿入するため、プラス
−ドｐＵｃ８−ＨｕＥをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ［
制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＥＰＯをコードする
５　６ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離した。ｐｓＶ４
ｓＥもＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、２
５１３ｂｐの４ 大フラグメントを単離したく全ての必要な機能を保有し
ている）。これらのフラグメントを混合連結して、最終
的ベクター「ｐｓＶｇＨｕ　ＥＰＯＪを得た（第３図参
照）。このベクターを大腸菌（ＨＢ１Ｇ１株）中で増殖
させ、ベクターＤＮＡを単離した。制限酵素分析を行な
い、ＥＰＯ遺伝子の挿入を確認した。

プラスミドｐｓＶｇＨｕＥＰＯＤＮＡを用いＣ０８−１
細胞においてヒトＥＰＯポリペプチド物質を発現させた
。更に具体的には、ｐｓＶｇＨｕＥＰｏ　ＤＮＡをキャ
リアＤＮＡとともに、Ｃ０８−１細胞の三重６０閣プレ
ートにトランスフェクションした。コントロールとして
、キャリアＤＮＡのみをＣ０８−１細胞にトランスフェ
クションした。細胞培養培地を５日後および７日後に採
取し、天然ヒトＥＰＯの免疫学的性質を有するポリペプ
チドの有無について試験した。

５ Ｂ、Ｃ０８−１細胞を含む第二ＥＰＯ発現系更に別の系
が、Ｃ０８−１細胞（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎ。

ＣＲＬ−１６５０）において、ヒトゲノムＤＮＡ　　Ｅ
ＰＯクローンによりコードされたヒトＥＰＯポリペプチ
ド物質の改良生産法を得るために設計された。

直前のシステムにおいて、ＥＰＯが、５．６ｋｂのＢａ
ｍＨＩからＨｉｎｄＩ［までの制限フラグメント中に存
在するそれ自身のプロモーターを用いて、Ｃ０８−１細
胞にて発現された。下記調製例では、ＥＰＯ遺伝子を、
ＳＶ４０後期プロモーターにより発現しつるように変換
させる。

更に具体的には、クローン化された５、　６ＫｂのＢａ
ｍＨＩからＨｉｎｄ　ｍまでのゲノムヒトＥＰＯ制限フ
ラグメントを以下の操作により変換した。前記プラスミ
ドｐＵＣ８−ＨｕＥをＢａｍＨＩおよびＢｔｌＥＩＩ制
限エンドヌクレアーゼで切断した。Ｂ＋ｔＥＩＩは、ペ
プチド前駆体をコードする開始ＡＴＧから５′方６ 向に４４塩基対であり、ＨｉｎｄＩ［Ｉ制限部位から３
′方向に約６８０塩基対である部位において、５．６ｋ
ｂＥＰＯ遺伝子を切断する。約４９００塩基対のフラグ
メントを単離した。５ａｌＩおよびＢａ１ＥＩＩ付着端
並びに内在ＢａｍＨＩ認識部位を有する合成リンカ−を
合成し、精製した。２つのフラグメントをＳａｌ工およ
びＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＢＲ３２２と混
合し、連結させて、中間プラスミドｐＢＲｇＨＥを得た
。ゲノムヒトＥＰＯ遺伝子は、アミノ末端をコードする
領域に近接したＢａｍＨＩ部位から３′方向に５３塩基
対である部位に一つのＡＴＧを含む完全な構造の遺伝子
を保有する４９００塩基対のＢａｍＨＩ切断フラグメン
トとして、それらから単離することができる。

このフラグメントを単離し、ＢａｍＨＩフラグメ７ ントとして、ＢａｍＨＩ切断発現ベクタープラスミドｐ
ＤＳＶＬｌに挿入した。得られるプラスミド、即ち第４
図に示すｐＤＳＶＬ　−ｇＨｕＥＰｏを用い、例６及び
７Ａに示したように、ＣＯ３−１細胞からＥＰＯポリペ
プチド物質を発現させた。

例　　　　８ 例６における６つのトランスフェクションされたＣＯ３
−１の増殖後の培地を、例２のＢに示した操作に従い、
ラジオイムノアッセイによって分析した。各試料を２５
０、１２５．５Ｇおよび２５成量で分析した。不正確な
ＥＰＯ遺伝子配向を有するベクターでトランスフェクシ
ョンされたにせの細胞増殖物の上澄は、明らかにＥＰＯ
免疫応答性に関し陰性であった。正確な配列のＥＰＯＤ
ＮＡを有するベクター（ＨおよびＬ）でトランスフェク
ションされたＣＯ３−１細胞の増殖物から得た２つの上
澄のそれぞれの試料に関し、抗体に対する８ １２５Ｉ−ＥＰＯ結合阻害率は７２〜８８％の範囲であ
り、全ての値が標準曲線の上位に位置していた。

培地上澄の正確なＥＰＯ濃度は、このため、信頼すべき
程度までには調べることができなかった。

しかしながら、最大量（２５０／１Ｉｊ２）の計算値か
ら控えめに推定すると、３００　ｍｕ／　ｍｌであった
。

例６の代表的培養液、並びに例７Ａで得た５日目および
７日目の培養液を、組換えサルおよびヒトｇｐｏ物質お
よび天然ヒ）ＥＰＯ標準と比較するために、ＲＩＡで試
験し、結果を第１図のグラフで示した。即ち、結果は予
期されたように、組換えサルＥＰＯは抗ヒトＥＰＯ抗体
と著しく競合したが、試験条件下では完全には結合を阻
害できないことを示した。組換えヒトＥＰＯに関する最
大の％阻害率はしかしながら、ヒトＥＰＯ標準の値と極
めて近似していた。用量応答曲線が平行関係であること
は、一般に免疫学的な配列（エピト９ −プ）の同一性を示唆している。サルＥＰＯ培養液の先
の評価をそれよりも高い希釈レベルで再度実施すると、
２．９１〜３．１２０／　ｍｌの範囲であった。

調べられたヒトＥＰＯ生産量は、５日間増殖試料が３９
２　ｍＵ／　ｍｌで、７日間増殖試料が５６７　ｍＵ／
　ｍｌであった。例７Ｂの発現系におけるＥＰＯ測定値
は同レベルかそれ以上であった。

例　　　９ 例６および７で得られた培養液を、ゴールドワッサーら
：「エンドクリノロジー」、第９７巻、第２号、第３１
５−３２３頁、１９７５年［Ｇｏｌｄｗａｓａｅｒ、ｅ
＋　ａｌ、。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　、　９７．２．　ｐｐ３
１５−３２３　（１９７５）］の方法によるＦ、ＰＯ活
性イン・ビトロ分析に供した。

被検培養液のサルＥＰＯ測定値は３．２〜４．３Ｕ／ｍ
ｌの範囲であった。ヒトＥＰＯ培養液もこのイン・ビト
ロ分析では活性を示し、この活性は抗ＥＰＯ抗体で中和
することができた。例６の組換えサル０ ＥＰＯ培養液も、コーラら：　「ネーチャー」、第１９
１巻、第　１０６５−１０６７頁、１９６１年［Ｃｏｔ
ｅｓ、　　ｅｔａｔ、、Ｎａｔｕｒｅ、　　１９１．　
ｐｐ１０６５−１０６７　（１９６１）］およびハモン
ドら：　「アナルス・オブーニューヨークアカデミー・
オブ・サイエンス」、第１４９巻、第５１６−５２７頁
、１９６８年［Ｈａｍｍｏｎｄ、　　ｅｌ　ａｌ、、　
　Ａｎｎ、　　ＮＹ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、　　
１４９．　ｐｐ、５１６−５２７　（１９６８）］の一
般的方法によるイン・ビボ生物学的活性分析に供したと
ころ、活性値は０．９４〜１．２４０／　ｍｌであった
。

例　　　１０ 前述の諸例において、組換えサルまたはヒトＥＰＯ物質
を、Ｃ０８−１細胞をトランスフェクションするのに用
いたベクターからつくった。これらのベクターは、細胞
内におけるＳＶ４０のＴ抗原とベクター上のＳＶ４０の
複製起点との存在によって、Ｃ０８−１細胞内で複製す
る。これらのベクターはＣＯ３−１細胞内で有効量のＥ
ＰＯを産１ 生するが、その発現はベクターが最終的に減少していく
ため、まさしく−時的である（７〜１４日）。

更にまた、少量のＣ０８−１のみが該ベクターでトラン
スフェクションされた。本例では、チャイニーズハムス
ターの卵巣（ＣＨＯ）ＤＨＦＲ細胞および選別可能なマ
ーカーＤＨＦＲを用いた発現系を述べている［関連する
発現系の議論については、いずれも米国特許第４．３９
９．２１６号並びに１９８４年８月２９日に公開された
欧州特許出願第１１、７０５８号、第１１７０５９号お
よび第１１７０５９号参照］。

ウルラウブら：　「プロシーデインゲス・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ」（米国）、第
７７巻、第４４６１頁、１９８０年［Ｕ＋１ａｕｂｅ＋
　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　Ｖｏｌ、７７゜４４６１（１
９８０）コに示されたＣＨｏ　ＤＨＦＲ細胞（ＤｕＸ−
Ｂｌｌ）ＣＨＯＫｌ細胞は、構造遺伝子の突然変異によ
ってジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（ＤＨＦ２ Ｒ）を欠如しており、このため培地中にグリシン、ヒポ
キサンチンおよびチミジンの存在を要求する。

プラスミドｐＤｓＶＬ−１１ｋＥ　（例６）またはプラ
スミドｐＤｓＶＬ−ｇＨｕＥＰｏ　（例７Ｂ）を、６０
＋ｎｍ培養プレート中のヒポキサンチン、チミジンおよ
びグリシン含有培地で増殖するＣＨＯＤＨＦＲ細胞内に
、キャリアＤＮＡと一緒にトランスフェクションした。

プラスミドｐｓＹｇＨｕＥＰｏ　　（例７Ａ）を、細菌
プラスミドベクターｐＢＲ３２２でクローン化されたマ
ウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子含有プラスミドｐ
ＭＧ２と混合した。

ｐ　Ｍ　Ｇ　２は、Ｇａｒｔｅｒ　Ｃ，Ｓ、ｅｌ　ａｌ
、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａ１ｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ
、７９．　　ｐ　６５２２−６５２６　（１９８２）に
その調製方法が記載されているｐＭｇ２と同一のプラス
ミドである。本プラスミドは、前述の文献の著者の１人
であるＤｒ、　５ｃｈｉＩｌｌｋｅ　Ｒ，Ｄ、より、分
与を受けた。本願出願時点で、［１ｒ、　Ｓ（ｈｉｍｋ
ｅは、希望者に対３ し本プラスミドを分譲している。従って、本プラスミド
の入手については、Ｄｒ、Ｓｃｈｉｍｋｅから分譲を受
ける事により可能である。また、以下に述べるように当
該文献に従い、調製することもできる。

ｐＭｇ２は、マウス染色体ｄｈｌｔ遺伝子の５′上流領
域の後に、マウスｄｈｆｒ遺伝子ｃＤＮＡを接続し、更
にｃＤＮＡの３′非翻訳領域中に、マウス染色体ｄｈｆ
ｒ遺伝子３′下流領域を挿入した約４．３Ｋｂのいわゆ
るｒ　ｄｈｆｒ　ｍ１ｎｉ遺伝子」を含むプラスミドで
ある。まず、マウス染色体ｄｈｆｒ遺伝子の５′上流〜
エクソンＩ、ＩＩまでの領域を持つプラスミドｐＤＲ３
４（Ｃｒｏｕ＋ｅ　Ｇ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、　　１．Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ。

幻げユｐ７８８７−７Ｎ？　（１９８２））より、１．
ＯＫｂのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩ断片（５′上流領域とエ
クソンＩの一部を含む）を単離した。また、マウスｄｈ
！ｒ遺伝子ｃ　ＤＮＡを含−むプラスミドｐ　Ｄ　ＨＦ
　ＲＩＩ　（ＣｈａｎｇＡ、　Ｃ０Ｙ、　ｅｊ　ａｌ、
　Ｎａｔｕｒｅ　２７５．　ｐ６１７−６２４（１９７
８））より、４ ０、ｌ９ＫｂのＴａｑＩ断片及び１．３ＫｂのＴａｑＩ
−ＰｓｔＩ断片（両断片は、ｃＤＮＡ中における連続し
た断片である。）を単離した。１．　ＯＫｂのＥｃｏＲ
ＩＴａｑＩ断片のＴａｑＩ部位は、エクソンエ中に単一
に存在する認識部位であり、ｃＤＮＡ中の最初のＴ　ａ
ｑ　Ｉ部位に相当する。

これらの３つの断片は、ＥｅｏＲＩ−ＴａｑＩ断片（１
，０Ｋｂ）、ＴａｑＩ断片（０，１９Ｋｂ）、ＴａｑＩ
−ＰｒｔＩ断片（１，３ｋｂ）の順に正しく並ぶよう連
結し、ＴａｑＩ断片が正方向に入っている方のＥｃｏＲ
ＩＰｓｔＩ断片（２，４９Ｋｂ）をｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲＩＰ＋ｔＩ断片（大きい方）に挿入し、ｐＭｇ　１
を得た。

次に、マウス染色体ｄｈｆ＋遺伝子の最終エクソンと２
．７Ｋｂの３′下流領域を持つプラスミドｐＤＨＦＲｇ
ｌ　（Ｎｕｎｂｅｒｇ　］、Ｈ，ｅ＋　ａｌ、Ｃｅ１ｌ
、　１９ｐ３５５−３６４　（１９８０）　）より、１
ｌｌＫｂのＢｇｌＩＩ断片（７５ ウス染色体ｄｈｆｒ遺伝子３′下流領域）を単離した。

このＢｇｌＩ［断片（１，８ｋｂ）を、ｐＭｇｌの２番
目のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＭｇ２を得た。

プラスミド混合体およびキャリアＤＮＡをＣｌ０ＤＨＦ
Ｒ細胞にトランスフェクションした（一つのプラスミド
を獲得した細胞は一般に第二のプラスミドをも獲得する
）。３日後、細胞を、ヒボキサンチンおよびチミジン欠
如培地の数個の１００ｍｍ培養プレートに、トリプシン
処理して分散させた。

Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺伝子で安定的にトランスフォーメーショ
ンされその結果ＥＰＯ遺伝子によってもトランスフォー
メーションされたそれらの細胞のみがこの培地で生存す
る。７〜２１日後、生存する細胞のコロニーが明確にな
った。これらのトランスフォーマントコロニーは、トリ
プシン処理で分散された後、ヒボキサンチンおよびチミ
ジン欠如培地中で継続して増殖することができ、新種の
細胞株６ （例えば、ＣＨＯｐＤｓＶＬ−ＭｋＥＰＯ，ＣＨＯｐｓ
ＶｇＨｕＥＰＯ及びＣＨＯ−ｐＤｓＶＬ−ｇＨｕＥＰＯ
）が得られた。

上記細胞株の培養液を、組換えサルまたはヒトＥＰＯの
有無についてＲＩＡで分析した。

ＣＨＯｐＤｓＶＬ−ＭｋＥＰＯ株培地は、プラスミドｐ
ＤｓＶＬＭｋＥＰＯでトランスフェクションされたＣ０
８−１細胞から得たＥＰＯと同様の免疫学的性質を有す
るＥＰＯを含有していた。代表的な６５時間培養液は０
．６０Ｕ／ｍｌのサルＥＰＯを含有していた。

ＣＨＯｐｓＶｇＨｕＥＰｏおよびＣＨＯｐＤｓＶＬ−ｇ
ＨｕＥＰＯの培養液は、プラスミドｐｓＶｇＨｕＥＰｏ
またはｐＤｓＶＬ−ｇＨｕｌｌ：ＰＯでトランスフェク
ションされたＣ０８−１細胞から得たものと同様の免疫
学的性質を有する組換えヒトＥＰＯを含有していた。Ｒ
ＩＡにより測定すると、代表的なＣＨＯｐｓＶｇＨｕＥ
Ｐｏの３日間培養液は２．９９　Ｕ／　ｍｌのヒトＥＰ
Ｏを含有し、ＣＨＯｐＤＳＶＬ−ｇＨｕＲＰＯの５．５
日間試料は１８．２Ｕ／ｍｌのヒトＥＰＯ７ を有していた。

前記細胞株から得られるＥＰＯ量は、遺伝子を増幅させ
て産生能の高い新規細胞株をつくることによって増加さ
せることができる。ＤＨＦＲ遺伝子によりコードされた
産物たるジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ
）は、薬物メソトレキセーｌ−（ＭＴＸ）で阻害するこ
とができる。更に具体的には、ヒボキサンチンおよびチ
ミジン欠如培地で増殖した細胞は、ＭＴＸにより阻害さ
れまたは殺される。適切な条件下（例えば最低のＭＴＸ
濃度）では、ＭＴＸに耐性でかつＭＴＸ存在下でも増殖
可能な細胞を得ることができる。これらの細胞は、ＤＨ
ＦＲ遺伝子数が増加し、その結果Ｄ　ＨＦ　Ｒ酵素量が
増加することにより、ＭＴＸ耐性であることが判明する
。残存した細胞を次いで、徐々に濃度を高めてＭＴＸで
処理してもよく、これにより更に多量のＤ　ＨＦ　Ｒ遺
伝子を含む細胞株８ が得られる。ＤＨＦＲ遺伝子と一緒に発現ベクター上に
乗せられ、またはＤＨＦＲ遺伝子とともにトランスフォ
ーメーションされた「パラセンジャー遺伝子」　（例え
ばＥＰＯ）は、それらの遺伝子コピー数の増加がしばし
ば見出されている。

この増幅系の実施例として、細胞株Ｃｌｌ０　ｐＤｓＶ
ＬＭｋＥＰＯを徐々に増加させたＭＴＸ濃度（ＯｎＭ　
　３（ｌｎＭ及び１０１００ｎに供した。各増加段階か
ら得た代表的な６５時間培地試料をＲＩＡ分析すると、
それぞれ０．６０．２．４５及び６．１０　Ｕ／　ｍｌ
含有していた。

細胞株ＣＩＯｐＤｓＶＬ−ｇＨｕＥＰｏを、３０ｎＭ、
　５０ｎＭ、　１１００ｎ、　２００　ｎＭ、　　１μ
Ｍ及び５μＭにＭＴＸ濃度を増加させて試験に供した。

１０１００ｎ　Ｔ　Ｘ段階から得た代表的な３日間培地
試料は、ＲＩＡで調べると、３０８９±１２９　Ｕ／ｍ
ｌのヒトＥＰＯを含有していた。

１００　ｎＭおよび１μＭＭＴＸ段階から得た代表的な
４８時間培地試料は、ＲＩＡで調べると（３回分析９ の平均）、それぞれ４６Ｇおよび１３５２　Ｕ／　ｍｌ
のヒトＥＰＯを含有していた。これらの操作では、１×
１０６個の細胞を６０＋ｎｍ培養皿中の培地５　ｍｌに
接種した。２４時間後、培地を除去し、無血清培地（０
，１ｍＭの非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンが添加
された高グルコースＤＭＥＭ）５ｍｌで置き換えた。

ＥＰＯを無血清培地で４８時間蓄積させた。培地をＲＩ
Ａ分析用に集め、細胞をトリプシン処理し、計数した。

１００　ｎＭおよびｌμＭＭＴＸで増殖した細胞に関す
る４６７　Ｕ／ｍｌおよび１３５２　Ｕ／　ｍｌの平均
ＲＩＡ値から、それぞれ実際の収量２３３５　Ｕ／プレ
ートおよび６７５０　Ｕ／プレートが求められた。−プ
レート当りの平均細胞数はそれぞれ１．９４Ｘ　１０６
および３．１２Ｘ１０６であった。これらの培養条件下
での有効産生速度は、したがって、１２６４および２１
１ｉ７　Ｕ／１０６細胞／４８時間であった。

直上に記載した培養細胞は、遺伝的に不均一な００ 群である。標準的スクリーニング操作が、最大産生能を
有するおおむね均一なりローンを単離するために用いら
れている。米国食品薬局（Ｕ、　Ｓ、　Ｆｏｏｄａｎ＋
Ｉ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、薬品
および生物学センター（Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｄｒｕｇ
ｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）　、生物学研究調査
庁（（ｌｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗ）、１９８４年６月１日、［
生物の産生に用いられる株化細胞の特徴において考慮す
べき点（Ｐｏｉｎｔｓ　ｔｏ　Ｃｏｎ５ｉｄｅｒ　ｉｎ
　ｔｈｅ　Ｃｈａｒａｃｌｅ＋１ｘａｊｉｏｎｏｆ　Ｃ
ｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　Ｕａｅｄ　ｔｏ　Ｐｒｏｄｕｃｅ
　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）　］のセクションＡ１パート２
参照。

前記ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞系の生産性は、適切な細胞培
養技術により改善することができる。哺乳類培養細胞の
増殖には、成長培地に血清の存在を要する。血清を含有
しない培地でＣＨＯ細胞からエリスロボエチンを産生ず
る方法は、培地からのエリスロボエチンの精製を著しく
容易化するも０１ のである。下記方法によれば、産生に充分な多量の無血
清培地において、経済的にエリスロボエチンを産生させ
ることができる。

標準的細胞培養条件下で増殖させたＣｌｌ０　ｐＤＳＶ
Ｌ−ｇＨｕＥＰＯ細胞株を用い、スピナー細胞培養フラ
スコに接種する。この細胞を、５％胎児牛血清、Ｌグル
タミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加さ
れた高グルコースＤＭＥＭおよびＨａｍ’　ｓＦ　１２
の５０−５０混合物、０．０５ｍＭ非必須アミノ酸並び
に適当な濃度のメソトレキセートからなる培地が入った
スピナー細胞培養フラスコ内で、懸濁液細胞系として増
殖させる。懸濁細胞培養では、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞を
容易に多量に増殖させることができる。懸濁液中で増殖
したＣＨＯ細胞を用い、培地２００ｍ１が入った８５０
ノのローラー瓶に１．５ＸＩＱ７個の生育細胞の初期接
種密度で、ローラー瓶に接種する。細胞を３日間にわた
り、付着０２ 細胞系として一面に拡がるまで増殖させる。この増殖相
に使用される培地は、懸濁増殖に用いられたものと同様
である。３日の増殖期間の最後に、血清含有培地を除去
し、Ｉ　Ｑ　Ｏｍｌの無血清培地、即ち０．０５ｍＭ非
必須アミノ酸およびＬ−グルタミンが添加された高グル
コースＤＭＥＭおよびＨａｍ’　ｓ　Ｆ１２の５０−５
０混合物で置き換える。ローラー瓶をローラー瓶インキ
ュベーターに１〜３時間戻し、培地を再び除去し、新し
い無血清培地１００ｍ１で置き換える。無血清培地を１
〜３時間インキュベートすると、汚染血清蛋白質濃度が
減少する。ローラー瓶を７日間インキュベーターに戻し
、その間にエリスロボエチンが無血清培地中で蓄積する
。７日間の産生期の最後に、培養済み培地を除去し、第
二の産生サイクルのために新しい無血清培地で置き換え
る。この産生系の実施例では、代表的な７日間無血清培
地試料は、ＲＩＡによると、３８９２０３ ±４０９　Ｕ／ｍｌのヒトエリスロポエチンを含有して
いた。０．９〜ｔ、ａｘｔｏ５細胞／ノ細胞／網胞密度
に基づけば、各８５０ノのローラー瓶は０，７５〜１．
５×Ｉ０８個の細胞を含有しており、したがって７日間
の１００ｍ１の培養についてのＥＰＯ産生速度は７５０
〜１４７０　Ｕ／１０６細胞／４８時間であった。

１０ｎＭ　ＭＴＸで処理された細胞株Ｃｌｌ０　ｐＤｓ
ＶＬ−ＭｋＥＰＯの培養液をＲＩＡイン・ビトロおよび
イン・ビボＥＰＯ活性分析に供した。培養済み培地試料
は、ＲＩＡで測定すると４１．２±１．４υ／ｍｌ、イ
ン・ビトロ生物学的活性分析で測定すると４１．２±０
．０６４Ｕ／ｍ１およびイン・ビボ生物学的活性分析で
測定すると４２．５±５Ｕ／ｍｌ、のＭｋＥＰＯを含有
していた。

ポリペプチド生成物のアミノ酸の配列を調べるとＥＰＯ
生成物の存在が示されており、基本的な種では推定アミ
ノ末端アラニンに隣接する「リーダー」配列の３残基分
を有していた。これは、０４ ＣＨＯ細胞内でのポリペプチドの膜処理が不正確である
ことの結果なのか、あるいはヒトＥＰＯと比較したサル
ＥＰＯアミノ末端構造の違いを反映しているのかはまだ
わかっていない。

細胞株Ｃ）ｌＯｐＤＳＶＬ−ｇＨｕＥＰｏの培養液を３
つの分析に供した。５．５日目の試料は、培地中に組換
えヒトＥＰＯを、ＲＩＡ分析で１８．２　Ｕ／　ｍｌ　
、イン・ビトロ分析で１５．８±４．６Ｕ／ｍ！および
イン・ビボ分析で１６．８±３．ＯＵ／ｍｌ含有してい
た。

徐々に１００　ｎＭのＭＴＸまで増加させて得たＣＩＯ
ｐＤｓＣｌｏｐＤｓＶＬ−細胞の培養液を３つの分析に
供した。

３日間の試料は、組換えヒトＥＰＯをＲＩＡで３０８９
±１２９　Ｕ／ｍｌ、イン・ビトロ分析で２５８９±７
１．５Ｕ／ｍｌおよびイン争ビボ分析で２０４０±１６
０　Ｕ／ｍ＋含有していた。この生成物のアミノ酸配列
は表■に示したアミノ末端と一致している。

１０ｎＭのＭＴＸ中、プラスミドｐＤｓＶＬ−ＭｋＥで
トラ０５ ンスフエクションされたＣＨＯ細胞培養済み培地をプー
ルし、数日間にわたりＭＴＸを透析除去すると、２２１
±５．　Ｉ　Ｕ／ｍｌ　（ＥＰＯ−ＣＣＭ）のＥＰＯ活
性がある培地が得られた。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスのへ
マドクリット値に及ぼすＥＰＯ−ＣＣＵのイン・ビボ効
果を調べるため、以下の実験を行なった。トランスフェ
クションしてないＣＨＯ細胞の細胞培養済み培地（ＣＣ
Ｍ）およびＥＰＯ−ＣＣＭをＰ　Ｂ　’Ｓ　テ調製した
。

ＣＣＭをコントロール群（マウス３匹）に用い、２つの
用量のＥＰ（１−ＣＣＶ（４単位（Ｕ））の注射および
４４単位（Ｕ）の注射）を実験群（１群２匹）に用いた
。５週間の間、７匹のマウスを週３回腹腔内注射した。

８回目の注射後における、コントロール群の平均へマド
クリット値は５０．４％、４Ｕ群は５５．１％、および
４４Ｕ群は６７．９％であった。

哺乳類細胞の発現生成物は、エタノール勾配をかけ、好
ましくはｐＨ７でＨＰＬＣ（Ｃ４）に付す　０６ ことにより、培地から実質的に精製された形で容易に単
離回収することができる。

予備実験を行ない、ＣＨＯ細胞におけるヒトＥＰＯ遺伝
子発現調整培地から得られる組換え糖蛋白質生成物を、
ウェスタン・プロット分析および５ＤＳ−ＰＡＧＥによ
ってヒト尿ＥＰＯ単離物と比較して、その特徴を調べた
。組換えＣＨＯ生成物および尿抽出生成物を（両者から
炭水化物を全て除去するため）エンドグリコシダーゼＦ
酵素（ＥＣ３，２，１）処理して比較した結果、本質的
に同一の分子量を有する実質的均一な生成物を得た。

例　　　１１ 本例は、表■に示したヒト種ＥＰＯ配列をコードし、大
腸菌および酵母菌［サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓ
、　　ｃ＋ｒｅｖｉ＋１ａｅ）］細胞での発現における
それぞれの「優先」コドンを取込んでいる２つの構造遺
伝子ヌクレオチド塩基集合体の全体的　０７ 製造に関する。簡単に言うと、用いられたプロトコール
は、アルドンらの開示（１９８３年１１月２４日にＷｏ
　８３１０４０５３として公開）に掲載されているもの
とほぼ同じであった。遺伝子はまず成分オリゴヌクレオ
チドを組み立ててマルチプル・ジュープレックスとし、
これを次いで３つの別個のセクションに組み立てるよう
に設計した。これらのセクションは、容易に増幅するよ
うに設計してあり、増幅系から除いてから順番に、ある
いは多数フラグメントの結合により、適切な発現ベクタ
ーに構築された。

下記表■〜ＸＩＶは、いかなるリーダーまたはプレ配列
も欠如しているが、−１位に第一のメチオニン塩基を有
するヒトＥＰＯ翻訳生成物をコードする合成遺伝子の設
計と組立体を示している。更に遺伝子は実質的部分に大
腸菌の優先コドンを取込んでおり、このためその構築は
［Ｅ　ＣＥ　Ｐ　ＯＪ遺伝子と呼ばれる。

　０８ 表ＶＣＩｒ ＥＣＥＰＯセクション１　オリゴヌクレＸチドＡＡＴｒ
ＣＴＡＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＧｌ：ＧＴＡＡＴＡＡＡＡ
ＴＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴＡ丁丁ＡＣＣＣ丁ＣＡＴＧＧ
ＴＴＴＣ丁ＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＧＴＣＴＧ
ＡＴＣＴＧＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡ
ＣＡＣＧＣＧこＣＧＣＡＧＴＣＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧ
ＡＡＣＧＴＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧ
ＴＡＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧ
ＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴ
ＴＴＣＡＧ口Ｔ丁ＣＴＴＴＡＧＡＣＣＡＣ丁ＧＧＴＴＧ
丁ＧＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧ
ＴＧ丁ＴＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡＴＴｒＧＡＡＣＣＡＡ
ＡＡＣＡＴＴＡＣＧＧ丁ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣ
ＣＧＴＡＡＴＧＴＴＴＴＣＧＴＴ表　ｒｘ ＡＡＴＴＬ、ＧＧＴＡＣＣＡＧ八ＣＡＣＣＡＡへＧ丁に
ＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣ；ＴＧＴＣ丁ＧこＴＡＣＣＧＴＡ
ＡＣＴＴＣＴＡＣＧＣＴＴＧＳ八八ＡＣＧＴＡ丁ＴＴＣ
ＣＡＴＡＣＧ丁ＴＴへへＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧ八Ａ
ＧＴＴＧこＴＬＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＴへＡＡＧ丁ＣＣ
ＡＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧこ丁ＴＧＴＴＧへＣＣＡＡＣ
ＴＴＧｗＣＡＧＧＳ丁ＣＴＧＧこ’＝ＣＴＧこＴＧＡＧ
ＣＧＧこＣＴＣＧＣ丁Ｃ’ＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧ八Ｃ
ＣＣへＧＡＧＣ：Ｃ丁（Ｊ、ＡＣＴＧＣＧＴＧＣ；ＣＣ
ＡＧＣ”Ｃ，ＱＧこＡＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣにＣＡ
Ｇ丁ＡＣＡＣＴＧこ丁ＧＧＴＡＡＡＣＴＣＣＴ、ＣＴＣ
ＡＧＣＣＧＴ丁ＴＣＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＡＣ；ＧＡ
Ｇ丁ＴＴＡＣＣＡＧＧＣ；ＡＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＴ
ＧＣＡＴＧＴＴＧＡＣＧＣＴＴＴＧ丁ＣＡＡＣＡＴＧＣ
ハＧＣＴＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＧ丁ＡＴＣＴＧＣ
，：ＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡ
ＧＧＣＣＡＧＡ’ｉＡＣ丁２ −１０ｇ　− −１７０〜 一１１１ ＸＥＩＩ （；ＴＣｒＡＧＡＧＡＣ １１３ 次　　ＸＩＩ εＣＥＰＯセクション　】 ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴ（ＪＧＡＣＴＡＣＴＣ丁ＧＣＡ
ＣＧＣＡＧＣＡＧＡＧ丁ＡＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴ
ＧＣ［ＪＧＣ丁Ｃ丁ＧＧＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＡＧ
ＧＧＡ丁ＡＧＣＣＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧ
ＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡ丁ＧＣＴＧＣ
ＡＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣ八ＴＣＣＧＧＣＧ
ＧＡＧＡＧＣ丁ＧＣＡＣｅＧ［：ＴＧＣＧＴＡＣＣＡ丁
ＣＡＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＡ丁ＧＧ丁ＡＣＧＣＡ
ＧＣＧＧ丁ＧＣＴＧ八丁ＡＣＣ丁ＴＣＣＧＣＡＡＡＣＴ
ＧＴＴＴＣＧＡＴＡＣＡＣＧＡＡＡＣＡＧＴＴ丁ＧＣＧ
ＧＡＡＧＧ丁ＴＧＴＡＴＡＣＴ（：ＴＡＡＣＴＴＣＣ丁
ＧＣＧＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＡＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡ
ＡＧＴＴＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＡＡＡＣ丁ＧＴＡＴＡＣ
ＴＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＣＡＴＧＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴ
ＡＴＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＣＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＣ
ＣＧＣ工ＡＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＡ丁ＴＡＧＣＧＧＴＣ
ＡＣＣＡＧ丁八Ｃ一１１２ 表ＸＺＶ ＥＣＥＰＯ遺伝子 ハ１ハ１５只ＣＣＧＣ　　ＴＴＣＧＴＡＣＧＧＣ　　Ａ
ＴＧＡＣＣＡＣ丁Ｇ　　ＧＣＧＡＴＴＡＴＣＡ　　ＧＣ
丁更に具体的には、表■は、ヒト種ポリペプチドのアミ
ノ末端残基をコードするセクション１のＥＣＥＰＯの遺
伝子を得るために用いられるオリゴヌクレオチドを示し
ている。オリゴヌクレオチドは二重鎖（１と２．３と４
等）として組立てられ、二重鎖は次いで結合され、表■
のようなＥＣＥＰＯセクション１が得られた。組立てら
れたセクションは末端ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ付着端
をそれぞれ含み、ＥｃｏＲＩ付着端の「下流」にはＸｂ
ａＩ制限酵素認識部位が存在し、ＢａｍＨＩ付着端の「
上流」にはＫ　ｐｎ　Ｉ認識部位が存在していることに
注目されたい。セクション１は、このセクションの配列
の確認のために用いられるＭ１３ファージベクターを用
いて、容易に増幅させることができた。

いくつかの困難な点が、大腸菌由来ＲＦ　　ＤＮＡから
ＸｂａＩ／ＫｐｎＩフラグメントとしてセクションを単
離する上で現われたが、それはおそらく宿１５ 生白でＫ　ｐｎ　Ｉ認識部位塩基がメチル化されるため
であろう。−本鎖ファージＤＮＡがしたがって単離され
、プライマー・エクステンション法によりイン・ビトロ
で二重鏡型とされ、しかる後所望の二重鎖フラグメント
が容易に単離された。

ＥＣＥＰＯ遺伝子セクション２および３（表ＸＩおよび
ＸＩ）を、表ＸおよびＸＩ［のオリゴヌクレオチドから
それぞれ同様の方法で調製した。各セクションは配列の
確認に用いられるＭ１３ベクターで増幅され、ファージ
ＤＮＡから単離された。表ＸＩから明らかなように、Ｅ
ＣＥＰＯセクション２はＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ付
着端から構成されており、ＫｐｎＩ　／　ＢｇｌＩＩフ
ラグメントとして単離することができた。同様に、ＥＣ
ＥＰＯセクション３をＢａｍＨＩおよびＳ　ａｌ　Ｉ付
着端から調製し、ＢｇｌＩＩ／５ｉｌｌフラグメントと
してファージＲＦＤＮＡから単離することができた。こ
のように調１６ 製された３つのセクションは、大腸菌翻訳開始のアミノ
末端メチオニンコドン（Ａ　Ｔ　Ｇ）を含み、完全なヒ
トＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ連鎖（表ＸＩ
Ｖ）として容易に組立てすることができる。開始ＡＴＧ
の「上流」には、大腸菌の高度な発現ＯＭＰ−ｆ遺伝子
におけるリポソーム結合部位配列を実質的に複製する一
連の塩基対が存在していることにも注目されたい。

適切な発現ベクターを用いてＥＣＥＰＯを運搬すること
ができる。特定のベクターとして、チャールズ・エフ・
モーリス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｆ、　Ｍｏｒｒｉｓ）によ
り１９８４年８月　６日に出願され、同時に係属中の米
国特許出願第６３６，７２７号（公開された欧州特許出
願Ｎα１３６．４９０）に記載された、プラスミドｐｃ
ＦＭ４１４　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，４００７６）の誘
導体である「温度感受性」プラスミドｐＣＦＭ５３６を
ＥＣＥＰＯ遺伝子発現用に選択した。より具体的にはｐ
ＣＦＭ５３６をＸｂａＩおよ１７ びＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、大フラグメントを単離し
て、ＥＣＥＰＯ遺伝子と２つの部分で結合させるのに用
いた。セクション１　（ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ）　、２（
ＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ）および３　（ＢｇｌＩＩ／５ａ
ｌＩ）をＭｌａ内で正確な順序で予め組立てておき、Ｅ
ＰＯ遺伝子をそれから一本のＸｂａＩ／ＨｉｎｄｎＩフ
ラグメントとして単離した。このフラグメントは、Ｍ１
３ｍｐ９ファージ由来の５ａｌｌからＨｉｎｄＩ［［ま
での部位のポリリンカーの部分を有していた。得られた
発現プラスミドｐ５３６による発現の制御はラムダＰＬ
プロモーターによりなされたが、このプロモーター自体
、Ｃリプレッサー遺伝子（例え８５７ ば、大腸菌株Ｋ１２ΔＨ１ｒｐから得られる）の支配下
にある。

酵母菌の優先コードンを取込んだ合成遺伝子（ｒｓｃＥ
ＰＯＪ　）　＜７）構造は、以下の表ｘ　ｖ　−Ｘ　Ｘ
Ｉに示したとおりである。ｇｃＥｐｏ遺伝子の場合と同
様１８ に、完全な構築には３組のオリゴヌクレオチド（表Ｘ■
、Ｘ■およびＸＩＸ）形成が含まれており、これを二重
鎖に形成し、各セクション（表ＸＶＩ、Ｘ■およびＸＸ
）に組立てた。合成は、ＳＣＥＰＯおよびＥＣＥＰＯの
構造においていくらか適合性のある（ｓｏｂ−ｏｐｔｉ
ｍａｌ）コードン（即ち、各遺伝子におけるセクション
２のオリゴヌクレオチド１〜６と同様に、各遺伝子のセ
クション１のオリゴヌクレオチド７〜１２が一致する）
を用いることにより、部分的に容易化されたことに注目
されたい。

１　１　９ 次　　　ＸＶｒＩ 八ＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧ丁ＧＴ
ＴＡＡＣＣＴ丁ＧＧＴＧ丁ＣＴＧＧ丁ＡＣＣＧＴＡＡＣ
ＴＴＣ丁ＡＣＧＣ丁丁ＧＧＡＡＡＣＧＴＡ丁丁ＴＣＣＡ
ＴＡＣＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴ
ＴＧＧｒＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧ丁ＣＣＡＡ
ＡＣＴＴＣμＩ’ｌ．Ｃ’ＴＣＣ丁ＴＧ丁丁ＧＡＣＣＡ
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ＡＣＧＧ７２７ 表　　Ｘ’／ ＳＣ＝＝Ｏセクション　１　オリゴヌクレオ八ＡＴＴＣ
ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＣ：Ａ
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ＧＴＡＣＣＧｒＡＡＴＧＴＴＴＴＣＧＴＴ表　　ＸＶＩ ＋２０　　一 表　　ＸＶＩＩＩ −　１２２　　一 表　　ＸＩＸ ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣ丁丁ＴＧＡＣＴＡＣＴ丁ＴＧ丁Ｔ
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ＧＡＧＡＧＣＴＴ丁ＧＧＧＴＧＣ丁ＣＡＡＡＡＧＧＡＡ
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ＡＣＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＣ丁ＡＣＡＣＴ２３ 表　　ＸＸｌ ５ＣＥＦ、Ｏ遺伝子 よく ×× ＴＡＣＡ丁ＴＧＴＴＴ　　ＣＡＧＣＴ 匹 −１２＋− 組立てられた５ＣＥＰＯセクシヨンがＭ１３にて配列決
定され、セクション１．２および３はＨｉｎｄｌｌＩ／
ＫｐｎＩ、　ＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩおよびＢｇｌＩＩ／
５ａｌＩフラグメントしてファージから単離可能であっ
た。

５ＣＥＰＯ遺伝子生成物にとり現在好ましい発現系は、
グランド・ニー・ビッタ−により１９８３年４月２２日
に出願され、同時に欧州特許出願第０１２３、２９４号
として１９８４年ＩＯ月３１日に公開された、係属中の
米国特許出願第４８７．７５３号明細書に記載されてい
るようなサツカロマイセス・セレビシェのα−因子分泌
に基づく分泌系である。簡単に言えば、この系は、酵母
α−因子遺伝子生成物のリーダー配列をコードするＤＮ
Ａが、発現すべき外来性遺伝子の暗号領域の５′側に直
接位置している構造からなる。その結果、翻訳された遺
伝子生成物は、余剰生成物の分泌時に、内在酵母酵素に
よ２６ って「切離される」リーダーまたはシグナル配列を含ん
でいる。この構築ではα−因子翻訳開始（ＡＴＧ）コー
ドンを利用しているため、５ＣＥＰＯ遺伝子の一１位に
そのようなコードンを付与する必要がなかった。表ＸＸ
Ｉから明らかになるであろうように、アラニン（＋１）
暗号配列は、α−因子プロモーターに続くα−因子リー
ダーの最初の８０残基のＤＮＡを含むプラスミドに直接
挿入されるリンカ−配列の後にきている。５ＣＥＰＯ遺
伝子発現のための特定の好ましい構築においては、前記
５ＣＥＰＯセクシヨンフラグメントおよびプラスミドｐ
ａ　Ｃ３のＨｉｎｄ　ｍｌ　Ｓ　ａｔ　Ｉ消化による大
フラグメントからなる４部分の結合が行なわれる。得ら
れるプラスミドｐαＣ３／５ＣＥＰＯから、α−因子プ
ロモーター　リーダー配列および５ＣＥＰＯ遺伝子をＢ
ａｍＨＩ消化により単離し、ＢａｍＨＩ消化プラスミド
ｐＹＥと連結させて、発現プラスミドｐＹＥ／２７ ＳＣＥＰＯを形成した。

例　　　１２ 本例は、例１１の発現系における、合成ＥＣＥＰＯおよ
び５ＣＥＰＯ遺伝子の組換え生成物の発現に関する。

大腸菌宿主細胞に用いられる発現系において、例１１の
プラスミドｐ５３Ｇを、Ｃｌ８５７遺伝子を有する適切
なプラスミドｐＭＷｌで予めトランスフォーメーション
されたＡＭ７大腸菌細胞に移入させた。

ＬＢブロス（アンピシリン５０　Ｎ／　ｍｌおよびカナ
マイシン５１１９Ｉ／　ｍｌ　、好ましくは１０ｍ１Ｊ
　Ｍｇ５ｏ４も添加）中の培養細胞を２８℃に維持し、
Ｏ，Ｄ、　６００＝　０．１となるまで培養細胞が増殖
してから、培養温度を４２℃に上げてＥＰＯ発現を誘導
した。約４００．Ｄ、まで増殖した細胞は、約５■１０
Ｄ、リットルのＥＰＯ生成物（ゲルで評価）を産生じた
。

細胞を採取し、分離し、フレンチプレス（１００００２
８ ｐｓｉ）で破壊し、リゾチームおよびＮＰ−４０界面活
性剤で処理した。２４０００　ｘｇ遠心分離で得たペレ
ットを塩酸グアニジンで溶解し、Ｃ４（バイダック、Ｖ
　ｙｄａｃ）リバース・フェース（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐ
ｈａｓｅ　）ＨＰＬＣ（１タノ一ルθ〜８０％、５０ｍ
ＭＮ　Ｈ４Ａ　ｃ　１ｐＨ４，５）により一工程で更に
精製した。分離した蛋白質は９５％以上純粋な生成物で
あり、得られた生成物は、約３：１の量比で、二つの異
なるアミノ末端Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｒ・・・・・・およびＰ−
Ｐ−Ｒ・・・・・・を有していた。ｈＥＰＯおよび［：
　ｄｅ＋Ａｌａ１］　ｈ、　Ｅ　Ｐ　Ｏ生成物について
の後者の観察は、宿主細胞におけるアミノ末端「プロセ
ッシング」が、末端メチオニンおよびある場合には開始
アラニンを除去するように作用することを示している。

単離物のラジオイムノアッセイ活性は１５００００〜１
６００ＨＵ／■であり、イン・ビトロ分析活性では３０
０００〜６２０ＨＵ／■であり、更にイン・ビボ分析活
性では約１２０〜７２０２９ Ｕ／■であった（参考のために、各分析におけるヒト尿
単離物標準は７００００　Ｕ／■である）。イン・ビボ
分析における組換え生成物の用量応答曲線は、ヒト尿Ｅ
ＰＯ標準のものとは著しく異なっていた。

サツカロマイセス・セレビシェ宿主細胞に用いられる発
現系において、プラスミドｐＹＥ／５ＣＥＰＯを二つの
異なる株、即ち、ＹＳＤＰ４　　（遺伝子型α凹４−３
　ｊｒｐｌ）およびＲＫ８１（遺伝子型ａ　ａ　　ｐｅ
ｐ４−３ｔｒｐｌ）に移入させた。トランスフォーメー
ションされたＹＳＤＰ４宿主を、カザミノ酸が０．５％
添加されたｐＨ６，５のＳＤ培地［ニューヨーク州、コ
ールドスプリングハーバ−所在、コールドスプリングハ
ーバ−ラボラトリ−［酵母遺伝学の方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ａ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第６２頁
、１９８３年］で３０℃にて増殖させた。細胞が３６０
．Ｄ、　　まで増殖したときに採取した培地は、ＥＰＯ
生成物を約２４４　Ｕ／ｍｌ　（ＲＩ　Ａで９７／１１
ｇ１０Ｄ−リットル）含有し３０ ていた。６．５０．Ｄ、または６００．Ｄ、　　まで増
殖した形質転換ＲＫ　８１細胞は、約８０〜９０　Ｕ／
　ｍｌのＥＰＯ濃度（ＲＩ　Ａで３４ＩＩ！ｇ１０Ｄ・
リットル）の培地を与えた。予備分析では、発現系によ
り得られる生成物は極めて不均一であったが、それはお
そらく発現される蛋白質のグリコジル化が様々であり、
関連する炭水化物の中でマンノース含量が比較的高かっ
たためであろう。

ＨＢＩＯＩ大腸菌細胞に含まれるプラスミドＰαＣ３お
よびｐＹＥを、１９８４年９月２７日に米国特許庁施行
規則に従い、それぞれ受託番号Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎ
ｏ。

３９８８１およびＡ、　Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　３９８８
２として、メリーランド州、ロックビル、パークローン
・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ、カルチャ
ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託した。ＡＭ
７細胞中のプラスミドｐＣＦＭ　５２６、ＪＭ１０３細
胞中のｐＣＦＭ　５３６およびＪＭ１０３細胞の３１ ｐＭＷｌを同様に、それぞれＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ
、　３９９３２、Ｎ。

３９９３４およびＮｏ、　３９９３３　として、１９８
４年１１月２１日に寄託した。サツカロマイセス・セレ
ビシェ株ＹＳＰＤ４およびＲＫＩＩＩをそれぞれＡ、　
Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　２０７３４およびＮｏ、　２０
７３３として１９８４年１１月２１日に寄託した。

前述のように、本発明の組換え体由来生成物は、天然源
からのＥＰＯ単離物のイン・ビトロ生物学的活性を様々
な程度で保有しており、したがって赤血球形成細胞の増
殖に用いられる培地において、ＥＰＯ単離物に対する代
替物としての利用性を有するものと考えられる。同様に
、本発明のポリペプチド生成物が天然ＥＰＯ単離物のイ
ン・ビル活性を有する範囲内において、それらはヒトを
はじめとする哺乳動物におけるエリスロポエチン治療処
置に用いるのに極めて好適であり、イン・ビルでのＥＰ
Ｏに起因する効果、例えば、網状赤血球応答の刺激、鉄
動態効果の促進（例えばプラズマ３２ 鉄回転効果および骨髄通過時間効果）、赤血球質量変化
、ヘモグロビン合成促進および例１０に示した哺乳動物
におけるヘマトクリット値の増加などのあらゆる効果を
促進させる。本発明の生成物で治療可能なヒトの分類の
中には、一般に輸血を要する患者、外傷者などの外科患
者、透析患者などの腎疾患患者並びに血友病、鎌型赤血
球病及び生理学的貧血などのような各種血液組成に影響
を及ぼす疾患の患者が含まれる。ＥＰＯ治療の採用によ
る輸血治療の必要性の最小化は感染物質による感染の抑
制につながると期待される。本発明の生成物は、組換え
法により生産されたものであるため、発熱物質、天然阻
害物質等が混入しておらず、このため天然由来生成物と
比べ、高い総合的な治療効果を発揮すると予想される。

本発明の生成物によるエリスロポエチン治療は、低酸素
環境条件下にある個体において酸素供給能を高め、更に
は３３ 可能性として有益な心臓脈管系効果をもたらすと期待さ
れる。

本発明のポリペプチド生成物を投与するための好ましい
方法は、非経口投与（例えば、静注、筋注、皮下性また
は腹腔内性）であり、投与される組成物には、治療有効
量の生成物が、許容される希釈剤、担体および／または
アジュバントとともに通常含有されている。有効量は治
療条件によって実質上変動すると思われるが、治療量は
実際には活性物質の７Ｕ〜７０００　Ｕ／ｋｇ体重の範
囲内であると予想される。ヒト血清アルブミンのような
標準的希釈剤が本発明の医薬組成物用として考えられ、
生理的食塩水のような標準的担体が同様に考えられる。

本発明の組成物に使用するのに好適なアジュバント物質
には、テストステロン、前駆細胞刺激剤、インシュリン
様成長因子、プロスタグランジン類、３４ セロトニン、サイクリックＡＭＰ、プロラクチンおよび
トリョードチロニンのように赤血球生成刺激効果に関し
て独立に注目される化合物、並びにメテルン、スタノゾ
ロールおよびナンドロロンのように、再生不良性貧血の
治療に一般に用いられる薬物が含まれる。

更にアジュバントとして考えられるものには、アドレナ
リン作動性物質、甲状腺ホルモン、男性ホルモンおよび
ＢＰＡのように、エリスロポエチンまたはアシアロ−Ｅ
ＰＯの効果を高めること、あるいは補強すること、が報
告された物質並びに「肝造血因子」と目される化合物類
、「エリスロトロピン類Ｊ　　（Ｅｒｙｌｈｒｏｆｒｏ
ｐｉｎｓ）および「エリスロジェニン類Ｊ　　（ｅｒｙ
ｌｈｒｏｇｅｎｉｎ＋）が挙げられる。

本発明ポリペプチドの診断的用途も同様に広範であり、
ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ等の各種イムノアッセイ技術、
並びに各種のイン・ビトロおよび３５ イン・ビル活性分析において標識および未標識型での使
用が挙げられる。

本発明の他の面によれば、ここに記載された、ヒトおよ
びサルＥＰＯポリペプチドをコードするクローンＤＮＡ
配列は、天然生成物の単離物についての数１０年間にわ
たる分析にもかかわらず今まで利用できなかった哺乳類
エリスロボエチンアミノ酸配列に関し、それらが与える
情報において極めて価値が高い。このＤＮＡ配列はまた
、各種組換え技術によって大量のエリスロボエチンを微
生物合成するのに役立つ生成物としても極めて価値があ
る。即ち、本明細書で示したＤＮＡ配列は、新規でかつ
有用なウィルス性および環状プラスミドＤＮＡベクター
、新規でかつ有用なトランスフォーメーションおよびト
ランスフェクションされた原核ならびに真核宿主細胞（
培地で増殖される細菌、酵母細胞および哺乳類細胞が含
まれる）お３６ よびＥＰＯｌ並びにＥＰＯ生成物の発現が可能な微生物
宿主細胞の新規でかつ有用な培養増殖方法を得る上で有
益である。本発明のＤＮＡ配列は、ここに具体的に説明
したヒトおよびサル種以外の哺乳動物種におけるＥＰＯ
および関連蛋白質をコードする　ｃＤＮＡおよびゲノム
ＤＮＡ配列を単離する上で、標識化プローブとして使用
するのに極めて適した物質でもある。本発明のＤＮＡ配
列が、各種の別の蛋白質合成方法において（例えば昆虫
の細胞）、あるいはヒトおよび他の哺乳動物の遺伝子治
療において使用される範囲は計算できない。

本発明のＤＮＡ配列は、エリスロポエチンおよびエリス
ロポエチン生成物を大量に産生ずる真核「宿主」として
機能する遺伝子変異哺乳動物種を得る上で有用であると
予想される。一般的には、パーミターら：　「サイエン
ス」、第２２２巻、第４６２５号、第８０９−８１４頁
、　１９８３年［Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　　ｅ１３７ ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２２（４６２５）、　
８０９−８１４　（１９８３）］参照。

この観点からすれば、したがって、特定の実施例の開示
は本発明の範囲を制限するものでないことは明白であり
、多数の改変および変更が当業者において考えられる。

−例として、実施例で得られるＤＮＡ配列はｃＤＮＡお
よびゲノムＤＮＡ配列を含み、それは本発明がＤＮＡ配
列の製造に必要なアミノ酸配列情報を提供するためのも
のだからであるが、本発明にはＥＰＯアミノ酸配列配列
報に基づいて調製されるような合成りＮＡ配列も含まれ
る。

同様の意味で、前記諸例は、細菌性プラスミドおよびウ
ィルス性ゲノム起源のハイブリッドベクターに挿入され
たＤＮＡの哺乳動物細胞発現に関し、ＥＰ○生成物を微
生物発現させる発明を説明するものであるが、広範な発
現系が本発明の概念３８ の中に含まれる。特に、培養された各種細菌、酵母菌及
び哺乳動物細胞に適用される均−源からのベクターを含
む発現系、及びベクターを含まない発現系（例えば、リ
ン酸カルシウムでトランスフェクションされた細胞）が
含まれる。

本発明のハイブリッド形成改良方法は、実際には上記Ｄ
　Ｎ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａスクリーニングに用いられたが、
これはＲＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＤＮＡスクリーニ
ングにて同様に適用可能である。ここに説明したような
混合プローブ技術は、一般に、より迅速にかつ信頼をも
ってポリヌクレオチドを単離できるハイブリッド形成過
程において多くの改良点を有している。これらの多数の
個々の操作上の改良点としては、改良されたコロニー移
転および保存方法、および同様のフィルターで再プロー
ブ化でき、フィルターの繰返し使用が可能で、新規なプ
ロテアーゼ処理の適用を可能にするジー３９ ンスクリーン（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ）およびシーン
スクリーン・プラス（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕ
ｓ）のようなナイロン基質フィルターの使用［例えば、
タウブら：「アナリテイカル・バイオケミストリー」、
第１２６巻、第２２２−２３０頁、１９８２年［Ｔａｕ
ｂ、　　ｅｊ　ａＡｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　
　１２６．　　ｐｐ２２２−２３０　　（１９８２）］
　と比較されたい］、多数の混合プローブ（例えば、３
２種類を超える数）のそれぞれの極めて低い濃度（０，
０２５ピコモルのオーダー）での使用、および、用いら
れる全ての混合プローブの中の最低の計算解離温度に非
常に近い厳格なる温度下での（即ち、それより４℃以内
、好ましくは２℃以内での）ハイブリダイゼーションお
よびボストハイプリダイゼーション工程の実施、が挙げ
られる。これらの改良点を組合わせると、それらの実施
によるものとは予想できない程の結果が得られる。この
ことは、比較的低めの充分量なるメツセンジャーＲＮ４
０ Ａ種に　ｃＤＮＡスクリーンを用いると好結果が得られ
たと今までに報告されたプローブ数の４倍量を含む混合
プローブ操作を、１．５００．０［ＩＯのファージプラ
ークのゲノムライブラリースクリーニングにおいて唯一
の遺伝子配列を単離するのに適用して成功した、という
事実により詳細に説明される。

この偉業は、アンダーソンらの、「混合プローブスクリ
ーニング法は相当するＲＮＡの遺伝子が利用できない限
り、哺乳類蛋白質遺伝子を単離するのは実際上不可能で
ある」との論評の公開と実質上同時に行なわれたもので
ある。

（アンダーソンら：　ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ　Ｊ　、米国、
第８０巻第６８３８−６８４２頁、１９８３年）

【図面の簡単な説明】

第１図はラジオイムノアッセイによる組換えヒト及びサ
ルＥＰＯの活性を示したものである。 第２図、第３図及び第４図は、夫々、ベクター４１ ｐＤＳＶＬ−ＭｋＥ、　　ｐｓＶｇＨｕＥＰｏ及びｐＤ
　　Ｓ　Ｖ　Ｌ ｇＨｕＥＰｏを示したものである。 玉盾汲又：　午り＞−７４ン゛工〉、イ〉コー市０レテ
ッハ。 　４２ Ｆ／Ｇ、４

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む
   ゲノムＤＮＡを含有するベクターにより形質転換されて
   いる哺乳動物細胞を培養し、ヒトエリスロポエチン活性
   を有する糖タンパク質を培地中に産生させることを特徴
   とするヒトエリスロポエチン活性を有する糖タンパク質
   の生産方法。 【遺伝子配列があります】
2. （２）哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞の形質転換体であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。