JP3375614B2 - ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞の作製方法。 - Google Patents
ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞の作製方法。Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、天然ヒトエリスロ
ポエチンをコードするＤＮＡ（配列）及びそれから推定
される該エリスロポエチンのアミノ酸配列を知見したこ
とに基づくものである。 【０００２】本発明は上記知見に基づき、組換ＤＮＡ技
術を利用した、ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞
の作製方法に関するものである。 【０００３】 【従来の技術】血球増生、即ち赤血球の産生は、人間が
生きている限り、細胞破壊を補うために継続して行なわ
れる。血球増生は、循環を妨げる程多くはない充分な数
の赤血球を、適切な組織に酸素供給する血液中で利用可
能にさせる、非常に正確に制御された生物学的メカニズ
ムである。赤血球の産生は骨髄で行なわれ、ホルモン、
即ちエリスロポエチンで制御されている。 【０００４】エリスロポエチンは分子量約34,000ダルト
ンの酸性糖蛋白質であって、組織が実在数の赤血球から
充分な酸素供給を受けている健康状態に体がある場合、
血漿中において極めて低濃度で存在している。この正常
な低濃度であっても、普通時間を経るにつれて減少する
赤血球の補充を促進するには充分である。 【０００５】エリスロポエチンの循環量は、血球の循環
による酸素輸送量が減少する低酸素症状態下では増加す
る。低酸素症は、出血による多量の血液の喪失、放射線
への過度露出による赤血球の破壊、高所もしくは長期の
意識喪失による酸素摂取量の減少又は各種貧血によって
起こる可能性がある。組織が低酸素ストレスを受ける
と、エリスロポエチンは、骨髄中の原始前駆細胞が、前
赤芽球（前赤芽球はひき続いて成熟し、ヘモグロビンを
合成し、赤血球として循環系に放出される）に変換され
るのを促進することにより、赤血球の産生を増大させ
る。循環系の赤血球数が正常組織での酸素要求量よりも
多い場合は、循環系エリスロポエチンは減少する。 【０００６】エリスロポエチンは赤血球形成過程で欠か
せないものであるため、このホルモンは赤血球の産生能
が低く又は欠陥がある血液疾患の診断及び治療に有効に
適用することができる。 【０００７】最近の研究により、各種の病態、疾患及び
血液異常状態において、エリスロポエチン治療の有効性
を予想する基礎が与えられた。 【０００８】血漿又は尿から高収率でエリスロポエチン
を得ようとする以前の試みは不成功に終った。複雑で高
度な実験技術が必要とされるが、一般には不純で不安定
な微量のエリスロポエチン含有抽出物を集められるにし
かすぎない。 【０００９】米国特許第3,033,753 号明細書には、ヒツ
ジ血漿からエリスロポエチンを部分的に精製するための
方法が記載されているが、低収率でエリスロポエチン含
有粗製固体抽出物が得られただけである。 【００１０】尿からエリスロポエチンを単離する初期の
試みでは、不安定で生物学的に不活性なそのホルモン調
製物が得られた。米国特許第3,865,801 号明細書には、
尿から回収されたエリスロポエチン含有粗製物質の生物
学的活性を安定化させる方法が開示されている。得られ
るエリスロポエチン含有粗製物は、称するところでは、
90％のエリスロポエチン活性を有しており、しかも安定
である。 【００１１】再生不良性貧血患者の尿からヒトエリスロ
ポエチンを精製する別の方法が、ミヤケら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ、第252 巻、第
15号、pp 5558-5564（1977年 8月10日）［Miyake, et a
l., J.Biol.Chem., Vol 252,No.15, pp 5558-5564］に
記載されている。この７工程の操作には、イオン交換ク
ロマトグラフィー、エタノール沈澱、ゲル濾過及び吸着
クロマトグラフィーが含まれ、21％の収率で、70,400単
位／mgの比活性がある純粋なエリスロポエチン調製物が
得られている。 【００１２】タケザワらの米国特許第4,397,840 号明細
書には、弱塩基性イオン交換物にて健康なヒトの尿試料
から「エリスロポエチン生成物」を製造する方法が記さ
れており、エリスロポエチン阻害効果のない低分子量生
成物が得られたと述べている。 【００１３】1982年 5月 6日に公開されたスギモトらに
よる英国特許出願第2,085,887 号明細書には、ハイブリ
ッドヒトリンパ芽球細胞の産生方法が述べてあり、哺乳
類宿主増殖物が10７ 細胞／mlとなった後、培地に分配
された細胞懸濁液１ml当り 3〜420 単位のエリスロポエ
チン産生量があると報告されている。達成されたとする
最大の産生レベルでは、エリスロポエチン産生速度は、
イン・ビボ増殖系から細胞が移し変えられたイン・ビト
ロ培地において、40〜4,000 単位／10６ 細胞／48時間
と計算された（対応する米国特許第4,377,513 号明細書
も参照）。多数の提案が新生物細胞をはじめとする組織
源からエリスロポエチンを単離するためになされたが、
収率は極めて低かった。 【００１４】精製エリスロポエチンの取得のために利用
される他の単離技術としては、免疫学的操作がある。エ
リスロポエチンに対する「モノクローナル」抗体を得る
ために細胞融合とハイブリッド形成技術を用い、更にヒ
トエリスロポエチンの単離と定量化のためにこれらの抗
体を用いる試みが行なわれた。 【００１５】ポリクローナル及びモノクローナル抗体
は、エリスロポエチンの定性及び定量のためのイムノア
ッセイに使用され、更にエリスロポエチンのアフィニテ
ィー精製においても有用性を有する。しかしながら、詳
細な分析、臨床試験及び、例えば、疾患組織がエリスロ
ポエチン産生をになうことができない慢性腎疾患の治療
のような、該物質の潜在的に広範な治療用途にとって充
分なだけ多量のエリスロポエチンを哺乳類源から単離す
る目的には、前記抗体を有効に活用することは難しいと
考えられている。したがって、哺乳類エリスロポエチン
を充分に特定化でき、しかも可能性のある診断及び臨床
的用途のためにそれを大量に供給する為には、大規模な
哺乳類エリスロポエチンの微生物による大規模な合成を
もたらす組換え操作の実用化を成功させる必要がある
と、当業者間では考えられている。 【００１６】ヒト及び他の哺乳類のエリスロポエチンを
コードしているＤＮＡ配列を実験的に単離する実質的な
努力がこれまでなされてきたが、誰もまだ成功していな
い。これは主に、エリスロポエチンをコードするＤＮＡ
配列を従来の技術により単離することのできる cＤＮＡ
ライブラリーを構成し得る mＲＮＡに富む組織源、特に
ヒト組織源、の欠乏に起因するものである。更に、エリ
スロポエチンのアミノ酸残基連鎖についてはほとんど未
知であるため、例えば cＤＮＡ特にゲノムＤＮＡライブ
ラリーのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションスクリ
ーニングにおいて安心して直ちに使用することができる
長鎖ポリヌクレオチドプローブを調製することができな
いことによる。エリスロポエチンのためのヒト遺伝子は
ヒトゲノム内で「単一の遺伝子」として存在しているら
しく、いかなる場合も、ヒトエリスロポエチンをコード
する遺伝子物質はゲノムライブラリーに存在する総ヒト
ゲノムＤＮＡの 0.00005％未満を構成するにしかすぎな
いと推定される。 【００１７】現在までのところ、単離可能量の哺乳類エ
リスロポエチンの微生物発現における使用に適したＤＮ
Ａ配列を与える組換え関連方法において、最も成功した
既知報告例でも、目標にはほど遠いものであった。一例
として、ファーバーら：「エクスペリメンタル・ヘマト
ロジー」、第11巻、第14増刊号、抄録 101、1983年［Fa
rber, et al., Exp. Hematol.,11, Supp. 14, Abstract
101(1983)］では、フェニルヒドラジン処理ヒヒの腎臓
組織から mＲＮＡを抽出し、この mＲＮＡをアフリカツ
メガエル(Xenopus laevis)卵母細胞に注入したが、それ
らの中に含まれるエリスロポエチンの生物学的性質を示
す「翻訳生成物」の混合体がイン・ビトロで産生するの
はむしろ一時的な結果であったと報告している。更に最
近において、ファーバーら：「ブラッド」、第62巻、第
５号、第１増刊号、抄録 392、第122a頁、1983年［Farb
er, et al., Blood,62, No.5, Supp. No.1, Abstract 3
92, at page 122a (1983) ］は、カエル卵母細胞による
ヒト腎臓 mＲＮＡのイン・ビトロ翻訳について報告し
た。その得られた翻訳生成混合体には、注入された mＲ
ＮＡ 1μｇ当り、エリスロポエチン活性を有する翻訳生
成物が220 mU含有されていると推定された。エリスロポ
エチンをコードしている外来性 mＲＮＡのこのようなイ
ン・ビトロ翻訳量が（従来報告された、必要とする生成
物へのヒヒ mＲＮＡ翻訳量と比べて）著しく低いと認め
られたが、この結果は、ヒト腎臓を、所望の遺伝子が単
離され得る豊富なヒト腎 cＤＮＡライブラリーの構成を
可能にするエリスロポエチン発現部位としてみなさせる
ものであると考えられた［ファーバー：「クリニカル・
リサーチ」、第31巻、第４号、第769A頁、1983年［Farb
er, Clin. Res., 31(4) , 769A (1983) ］も参照］。 【００１８】米国特許出願第561,024 号及び第582,185
号の出願以後、大腸菌内で、ヒトエリスロポエチン cＤ
ＮＡとみなされていた物質のクローニングと発現に関す
る一つの報告がなされた。簡単に言えば、多数の cＤＮ
Ａクローンが大腸菌プラスミドに挿入され、β‐ラクタ
マーゼ融合生成物がヒトエリスロポエチンの非特異的
「エピトープ」に対するモノクローナル抗体と免疫応答
性を有することに着目されたのである。リー‐ファン：
「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ」（米国）、第81巻、第2708-271
2 頁、1984年［Lee-Huang, Proc. Nat. Acad. Sci. (U.
S.A), 81, pp2708-2712 (1984)］参照。 【００１９】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
エリスロポエチン産生哺乳動物細胞の作製方法を提供す
ることである。 【００２０】 【課題を解決するための手段】本発明は、下記の(1)か
ら(6)を提供する。 【００２１】(1) ヒトエリスロポエチンをコードする
ＤＮＡと、ヒトエリスロポエチンプロモーター以外の転
写制御配列との機能的結合を哺乳動物細胞中に生ぜしめ
る工程を含むことを特徴とする、ヒトエリスロポエチン
産生哺乳動物細胞の作製方法。 【００２２】(2) 前記ヒトエリスロポエチンをコード
するＤＮＡと、ヒトエリスロポエチンプロモーター以外
の転写制御配列との機能的結合の近傍に薬剤耐性遺伝子
をコードするＤＮＡ配列を配置し、薬剤の添加により遺
伝子増幅を生ぜしめる工程をさらに含むものである、
(1)に記載の方法。 【００２３】(3) 前記薬剤耐性遺伝子が、ジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子であり、前記薬剤がメトトレキセ
ートである、(2)に記載の方法。 【００２４】(4) 前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳
動物細胞が、ラジオイムノアッセイによる測定におい
て、１０6個の細胞あたり48時間に１００Ｕを超えるヒ
トエリスロポエチンを培地中に産生するものである、
(1)に記載の方法。 【００２５】(5) 前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳
動物細胞が、ラジオイムノアッセイによる測定におい
て、１０6個の細胞あたり48時間に５００Ｕを超えるヒ
トエリスロポエチンを培地中に産生するものである、
(1)に記載の方法。 【００２６】(6) 前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳
動物細胞が、ラジオイムノアッセイによる測定におい
て、１０6個の細胞あたり48時間に１０００Ｕを超える
ヒトエリスロポエチンを培地中に産生するものである、
(1)に記載の方法。 【００２７】 【発明の実施の形態】本発明は、その対立遺伝子変異体
をも含む天然エリスロポエチンの一次構造形状（即ち、
アミノ酸残基の連続配列）の一部もしくは全部、及び一
以上の生物学的性質（例えば、免疫学的性質並びにイン
・ビボ及びイン・ビトロでの生物学的活性）を有する新
規な精製単離されたポリペプチド生成物をはじめて提供
するものである。これらのポリペプチドは、ゲノムＤＮ
Ａもしくは cＤＮＡのクローニング又は遺伝子の合成に
よって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿
主での発現生成物（例えば、細菌、酵母、及び哺乳類の
培養細胞による）であるということによっても独特に特
徴づけられる。脊椎動物（例えば、哺乳類及び鳥類）細
胞における微生物発現生成物は、自然の哺乳類細胞環境
又は血漿もしくは尿のような細胞外液におけるエリスロ
ポエチンと関連性があるであろうヒト蛋白質又は他の夾
雑物とは全く関係がないということによって、更に特徴
づけられるかもしれない。典型的な酵母［例えば、サッ
カロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae
）］又は原核生物（例えば、大腸菌）を宿主細胞とす
る生成物は、いかなる哺乳類の蛋白質とも関連性を有し
ていない。使用する宿主によっては、本発明のポリペプ
チドは哺乳類もしくは他の真核生物の炭水化物によって
グリコシル化され、あるいはグリコシル化されないかも
しれない。本発明のポリペプチドはまた、最初にメチオ
ニンアミノ酸残基（１番目の位置）を含んでいてもよ
い。 【００２８】本発明の新規な糖蛋白質生成物には、その
一以上の生物学的性質が得られるのに充分な天然（例え
ばヒト）エリスロポエチンの複製である一次構造形状を
有し、天然（例えばヒト）エリスロポエチンのそれとは
異なる平均的炭水化物組成を有するものが含まれる。 【００２９】本発明により得られる脊椎動物（例えば、
ＣＯＳ−１及びＣＨＯ）細胞は、イン・ビトロで継続し
た増殖が可能であって、培地で増殖させた場合、それら
の培地中にて、ラジオイムノアッセイにより48時間で10
６ 個の細胞当り 100単位以上（好ましくは 500単位以
上、最も好ましくは1000〜5000単位以上）のエリスロポ
エチンを産生することができる、常に入手し得る最初の
細胞である。 【００３０】更に、本発明によって、初めて解明された
エリスロポエチンアミノ酸残基の連続配列の全体的もし
くは部分的複製である合成ポリペプチドが提供される。
これらの配列は、天然エリスロポエチンの一次、二次又
は三次構造形状特性を有しているため、治療及び免疫過
程でエリスロポエチンの生物学的活性なもしくは免疫学
的な代用物として用いられるような、天然産物に共通し
た生物学的活性及び（又は）免疫学的性質を有している
であろう。これに付随して、標準的手段によって得ら
れ、このようなポリペプチドと免疫応答し、好ましくは
天然エリスロポエチンとも免疫応答するモノクローナル
及びポリクローナル抗体が提供される。 【００３１】本発明では、サル及びヒト種起源のクロー
ンＤＮＡ配列並びにそれから適切に誘導されたポリペプ
チド配列についても解明しており、それらはそれぞれサ
ル及びヒト種起源エリスロポエチンの一次構造形状を表
わしている。 【００３２】更に本発明により、本発明のＤＮＡ配列を
取り込んだ新規な生物学的機能性のウィルス及び環状プ
ラスミドＤＮＡのベクター、並びにそのようなベクター
により安定にトランスフォーメーション又はトランスフ
ェクションがなされた微生物（例えば、細菌、酵母及び
哺乳類の細胞）宿主生物も提供される。これに対応し、
このようなトランスフォーメーション又はトランスフェ
クションされた微生物宿主を培養増殖させ、増殖培地、
細胞ライセート又は細胞膜画分から所望のポリペプチド
を単離することからなる有用なポリペプチドの新規製造
方法が、本発明によって提供される。 【００３３】上記方法で得られる微生物発現ポリペプチ
ドの単離精製は、例えばプレパラティブ・クロマトグラ
フィー分離、並びにモノクローナル及び（又は）ポリク
ローナル抗体調製物を用いる免疫学的分離のような従来
の手段によって行なってもよい。 【００３４】エリスロポエチンのアミノ酸残基配列が解
明されたので、本発明により、エリスロポエチンをコー
ドするＤＮＡ配列の全体的及び（又は）部分的製造がな
されるが、そのＤＮＡ配列には、選ばれた非哺乳類宿主
による発現に「好適な」コードンの取り込み、制限エン
ドヌクレアーゼ酵素による開裂部位の具備及び容易に発
現するベクターの構築を容易にする別の開始、終末又は
中間ＤＮＡ配列の具備というような有利な特性が備えら
れている。これに伴い、本発明は、一以上のアミノ酸残
基の同一性又は位置に関して天然型とは異なるが、天然
型の一部もしくは全部の性質を有しているエリスロポエ
チンポリペプチド類似体もしくは誘導体（即ち、エリス
ロポエチンのアミノ酸残基の１以上の欠失、及び／又は
エリスロポエチンの１以上の特定の残基の他の残基との
置換、及び／又は１以上のアミノ酸残基のエリスロポエ
チンポリペプチドの末端部への付加、及び／又は１以上
のアミノ酸残基のエリスロポエチンポリペプチドの中間
部位への挿入により得られるエリスロポエチンポリペプ
チド類似体もしくは誘導体）の微生物発現をコードして
いるＤＮＡ配列の製造法（並びに cＤＮＡ及びゲノムＤ
ＮＡの部位特定突然変異誘発による生成法）を提供す
る。 【００３５】本発明のＤＮＡは、微生物宿主細胞におけ
る発現によって、天然ヒトエリスロポエチンの生物学的
性質を有するポリペプチド生成物を産生させることので
きる配列であって、具体的には、表VII にヒトＥＰＯポ
リペプチドとして示したアミノ酸配列（−27〜166 又は
1〜166 ）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列（縮
重を含む）であり、ゲノムＤＮＡ、 cＤＮＡ、及び、一
部又は全部が化学合成によるＤＮＡを含む。特に微生物
宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、好ましくは、該塩
基配列が前述の−27〜166 のアミノ酸配列をコードする
もの（例えば、表VIに示したゲノムＤＮＡ、及び表VI′
に示したイントロンを含まないＤＮＡ配列を挙げること
ができる）を用いる。 【００３６】本発明には、エリスロポエチン治療、具体
的には貧血症の状態及び最も具体的には慢性腎疾患を伴
うような貧血状態の治療に使用し得る、本発明のポリペ
プチド生成物の治療上有効量と薬学上許容される希釈
剤、及びアジュバント及び（又は）担体とからなる医薬
組成物も含まれる。 【００３７】本発明のポリペプチド生成物は、固体組織
及び血液又は尿のような液体試料中のエリスロポエチン
の定性及び定量に有用な試薬とするために、検出可能な
マーカー物質と共有結合させて標識化してもよい（例え
ば１２５Ｉで放射線標識化する。）。本発明のＤＮＡ生
成物もまた、（放射線標識及びビオチンのような非同位
元素標識のような）検出可能なマーカーで標識化されて
いてもよく、ヒト、サル及び他の哺乳類種の染色体地図
におけるエリスロポエチン遺伝子座及び（又は）それに
関連したすべての遺伝子群の座を決定するために、ＤＮ
Ａハイブリダイゼーション過程で用いられてもよい。そ
れらはまた、ＤＮＡレベルにおけるエリスロポエチン遺
伝子の欠陥を見出すために用いることができ、更には隣
接する遺伝子及びそれらの欠陥を見出すための遺伝子マ
ーカーとして用いることもできる。 【００３８】本明細書で詳細に記するように、本発明で
は更に、マルチプル一本鎖ポリヌクレオチドを含む不均
一な細胞もしくはウィルス試料において、配列未知の特
定の一本鎖ポリヌクレオチドを検出するための重要な改
良方法も提供するが、この方法は下記のとおりである。 (a) 一様に変異した塩基鎖を有する標識化一本鎖ポリヌ
クレオチドプローブの混合体が調製される。このプロー
ブの各々は、被検ポリヌクレオチドに独特である、と推
定される塩基配列に対して潜在特異的に相補的である。 (b) 試料が固体基質に固定される。 (c) 前記基質が、該試料のポリヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションによらないで、ポリヌクレオチドが更
にそれと結合するのを抑制するように処理される。 (d) 処理済みの基質を、全体的に相補性のポリヌクレオ
チド間でのみハイブリッド形成し易い条件下で、一時的
に前記標識化プローブの混合体と接触させる。次いで (e) 特定のポリヌクレオチドが、それと該標識化プロー
ブ混合物内の全体的に相補的なプローブとのハイブリッ
ド形成反応の存在を確認することによって検出される。
これは標識化プローブの基質との非特異的結合に起因す
る標識化物質の背景密度と比較して特定のポリヌクレオ
チド位置における基質上の標識化物質の密度が高いとい
うことにより証明される。 【００３９】この操作は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／Ｒ
ＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形成において、17
〜20塩基を有する64、 128、 256、 512、1024又はそれ
以上の混合ポリヌクレオチドプローブを使用することが
指示された状況下で特に有効である。 【００４０】以下に記すように、上記改良方法により、
サル種起源のエリスロポエチンをコードし、貧血サル腎
細胞 mＲＮＡから誘導されたライブラリー内の cＤＮＡ
クローンを実際に同定することができた。より具体的に
は、ヒトエリスロポエチンのフラクションを配列決定し
て導かれたアミノ酸配列情報に基づく、 128種類の一様
に変異した20-merプローブ混合体が、コロニーハイブリ
ダイゼーション操作で用いられ、合計 200,000のコロニ
ーの中から７つの「＋（陽性）」エリスロポエチン cＤ
ＮＡクローンが同定された。更に特記すべきは、本発明
の改良方法を実施することにより、ヒトゲノムライブラ
リーを構成する 1,500,000のファージプラークのスクリ
ーニングの中から３つの陽性クローンを迅速に単離する
ことができたことである。これは、ヒトエリスロポエチ
ンの別の連続配列のアミノ酸分析による第二の 128種類
の17-merプローブと一緒に上記した 128種類の20-merプ
ローブ混合体を用いて実現されたものである。 【００４１】上記で説明した操作は、哺乳類ゲノムクロ
ーンを単離するためのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成
過程において、多数の混合オリゴヌクレオチドプローブ
を使用した最初の例であり、しかも cＤＮＡクローンの
単離において32種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ
混合体を使用した最初の例である。 【００４２】本発明によれば、ヒト及びサルの天然エリ
スロポエチン（ＥＰＯ）のポリペプチド配列の全部をコ
ードしているＤＮＡ配列が単離され、特定化された。 【００４３】サル種起源のＤＮＡは、化学的に誘導され
た貧血状態を呈し、その血清が免疫学的測定によると正
常なサル血清と比べて高レベルのＥＰＯを含有するサル
の腎組織から得られた mＲＮＡにより構成された cＤＮ
Ａライブラリーから単離された。ＥＰＯをコードするＤ
ＮＡを含む所望 cＤＮＡクローンの単離は、128 種類が
混合され、放射線標識化された20-merのオリゴヌクレオ
チドプローブのプールを用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡコロニ
ーハイブリダイゼーションにより実現されたが、200,00
0 コロニーの迅速なスクリーニングが必要とされた。オ
リゴヌクレオチドプローブの設計は、少量のヒトＥＰＯ
試料の酵素的切断とアミノ酸配列決定により得られたア
ミノ酸配列情報に基づいた。 【００４４】ヒト種起源のＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡラ
イブラリーから単離された。ＥＰＯをコードするＤＮＡ
を含むクローンの単離は、 128種類が混合された20-mer
のオリゴヌクレオチドプローブの上記プールと、別の酵
素によるヒトＥＰＯフラグメントから得られたアミノ酸
配列情報に基づく 128種類の放射線標識化17-merプロー
ブの第二のプールとを用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡプラーク
ハイブリダイゼーションにより行なわれた。 【００４５】陽性のコロニー及びプラークは、20-merプ
ローブのプール内の16塩基鎖サブセットを用いたクロー
ンＤＮＡのジデオキシ配列法により確認され、選択され
たクローンは、それによりコードされるＥＰＯポリペプ
チドの一次構造形状を推定させるヌクレオチド配列分析
に供された。推定されたポリペプチド配列は互いに、ま
たヒトＥＰＯフラグメントのアミノ酸分析により得られ
た部分配列に対しても高度の相同性を示した。 【００４６】選択された陽性のヒトゲノムクローンは、
「シャトル」ＤＮＡベクターに挿入され、このベクター
は大腸菌に導入されて、培養哺乳類細胞をトランスフェ
クションするために増幅された。トランスフェクション
された前記宿主細胞の培養増殖により、培養液１ml当り
3000ＵのＥＰＯを含有していると推定される培地上澄標
品が得られた。 【００４７】以下の諸例は本発明の説明のために掲げら
れており、特にＥＰＯをコードするサル cＤＮＡクロー
ン及びヒトゲノムクローンの同定に先立って実施される
操作、この同定のための操作、並びに配列決定、発現系
の生成及びこの系におけるＥＰＯ発現の免疫学的確認に
関するものである。 【００４８】更に具体的には、例１はヒトＥＰＯフラグ
メントのアミノ酸配列及びこの配列に基づく放射線標識
化プローブ混合体の調製に関する。例２は一般に、陽性
サルcＤＮＡクローンの同定に必要な操作に関するもの
であり、このため動物の処置及び動物血清の予備的ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）分析に関する情報が得られ
る。例３は、 cＤＮＡライブラリーの調製、陽性クロー
ンのコロニーハイブリダイゼーションスクリーニングお
よび確認、陽性 cＤＮＡクローンのＤＮＡ配列並びにサ
ルＥＰＯポリペプチド一次構造形状（アミノ酸配列）の
情報に関する。例４は陽性ヒトゲノムクローンの同定に
必要な操作に関するものであり、このためゲノムライブ
ラリー、プラークハイブリダイゼーション操作及び陽性
クローンの確認に関する情報が得られる。例５は、陽性
ゲノムクローンのＤＮＡ配列及びサルＥＰＯ鎖の情報と
の違いも含めた、ヒトＥＰＯポリペプチドアミノ酸配列
の情報に関する。例６は、陽性サル cＤＮＡクローンか
ら得られたＥＰＯをコードするＤＮＡを取り込んだベク
ターの調製方法、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクショ
ンするためのベクターの使用法及びトランスフェクショ
ンされた細胞の培養増殖法に関する。例７は、陽性ヒト
ゲノムクローンから得られたＥＰＯをコードするＤＮＡ
を取り込んだベクターの調製方法、ＣＯＳ−１細胞をト
ランスフェクションするためのベクターの使用法及びト
ランスフェクションされた細胞の培養増殖法に関する。
例８は、例６及び７におけるトランスフェクションされ
た細胞の培養増殖により得られた培地上澄で実施された
イムノアッセイに関する。例９は、例６及び７における
真核生物細胞発現によるＥＰＯのイン・ビトロ及びイン
・ビボ生物学的活性に関する。 【００４９】例１０は、チャイニーズハムスター卵巣
（「ＣＨＯ」）細胞によるサル種ＥＰＯ− cＤＮＡ及び
ヒト種ゲノムＤＮＡについての哺乳類宿主発現系の調製
並びにこれらの発現系による生産物の免疫的および生物
学的活性、およびこれらの生産物の特徴づけに関する。 【００５０】例１１は、ヒト種ＥＰＯ及びＥＰＯ類縁体
をコードする合成遺伝子（それらは大腸菌及び酵母での
発現のための多数の優先コドンを含むものである）の調
製及びそれに基づく発現系に関する。 【００５１】例１２は、例１１の系における発現生成物
の免疫学的及び生物学的活性面に関する。 【００５２】 【実施例】例 １ Ａ．ヒトＥＰＯフラグメントのアミノ酸配列決定 ヒトＥＰＯを尿から単離し、トリプシン切断させて、約
100〜150 ピコモル量の17個に分断されたフラグメント
とし、単離した。 【００５３】フラグメントに任意に数字を付し、気相配
列決定装置（アプライド・バイオシステムス）を用いて
微細配列順序分析によりアミノ酸配列を分析し、以下の
表Ｉに示した配列情報を得た。表では、単一文字符号が
用いられており、「Ｘ」は明確に決定されなかった残基
を表わす。 【表１】 【００５４】Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブ混合体の
設計と調製 表Ｉに示したアミノ酸配列に関し、混合プローブ操作が
cＤＮＡ及び（又は）ゲノムＤＮＡライブラリーでのＤ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作に適用し得るかにつ
いて確認する目的で、遺伝暗号の縮重関係を精査した。
この分析では、フラグメントNo.T35の中に７つのアミノ
酸残基（Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys）が存在してい
たことが判明したが、この鎖は20塩基対について可能な
128 種類のＤＮＡ鎖のうちの一つによりコードされてい
るということにより独特に特徴づけることができる。 1
28種類の20塩基鎖オリゴヌクレオチドの第一の組は、し
たがって下記表IIに示した配列に従い、固体支持体上で
の標準ホスホアミデート法［例えば、ビューケージら；
「テトラヘドロン・レターズ」、第22巻、第 1859-1862
頁、1981年（Beaucage, et al., Tetrahedron Letters,
22, pp1859-1862 (1981)）参照］により合成される。 【表２】【００５５】更に分析すると、フラグメントNo.T38の中
に、６つのアミノ酸残基（Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu ）
の存在が確認され、それに基づけば、下記表III に示し
たように 128種類の混合オリゴヌクレオチドの17-merプ
ローブのプールを調製することができる。 【表３】 【００５６】オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ4 ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＮ）を用いて7500〜8000Ci
／mmol（ＩＣＮ）のγ‐３２Ｐ−ＡＴＰにより 5′末端
で標識化した。 【００５７】例 ２ Ａ. サルの処理操作 メスのカニクイザル（Cynomolgus monkey ）マカカ・フ
ァシキュラリアス（Macaca fascicularias）(2.5〜3 k
g， 1.5〜2 年齢) に１、３及び５日目；12.5mg／kgの
用量でpH 7.0の塩酸フェニルヒドラジン溶液を皮下注射
して処理した。ヘマトクリット値をそれぞれ注射する前
に測定した。７日目に、あるいはヘマトクリット値が初
期値の25％低下した際、塩酸ケタミン25mg／kgを投与し
て、血清及び腎臓を採取した。採取物を直ちに液体窒素
で凍結し、−70℃で保存した。Ｂ．ＥＰＯのＲＩＡ 試料中のＥＰＯ定量のためのラジオイムノアッセイ操作
を以下の操作に従い実施した。 【００５８】エリスロポエチンの標準（この標準は、Ｃ
ＡＴ−１と呼ばれる人尿由来のエリスロポエチンで、そ
のエリスロポエチン活性はエリスロポエチンの国際的標
準であるWHO IRP #1に対し検定されているものである。
なお、この標準はシカゴ大学のゴールドワッサー(Dr.E.
Goldwasser)より入手した。）又は未知試料を37℃で２
時間抗血清と一緒にインキュベートした後、試験管を氷
冷し、１２５Ｉ‐標識化エリスロポエチンを加え、管を
15時間以上 0℃でインキュベートした。各試験管には、
希釈免疫血清50μｌ、１２５Ｉ‐エリスロポエチン10,0
00cpm.トラシロール５μｌ及びＥＰＯ標準もしくは未知
試料 0〜250 μｌからなり、残部が0.1%BSA含有ＰＢＳ
であるインキュベート混合物 500μｌが入っていた。使
用した抗血清は、ヒト尿エリスロポエチンの純粋な 1％
標品で免疫されたウサギの第２回目採血液であった。試
験のための最終的抗血清希釈液は、抗体‐結合１２５Ｉ
‐ＥＰＯが入力総カウント数の10〜20％を超えないよう
に調整された。一般に、これは１：50,000〜１：100,00
0 の最終的抗血清希釈液に相当した。 【００５９】抗体‐結合１２５Ｉ‐エリスロポエチン
は、スタフＡ (staph A) 150μｌの添加により沈澱し
た。40分間インキュベートした後、試料を遠心分離し、
ペレットを0.15M NaCl、2mM EDTA及び0.05％トリトンＸ
-100含有10mMトリス‐ＨＣｌ 0.75ml （pH 8.2）で二回
洗浄した。洗浄したペレットをガンマーカウンターで計
測し、１２５Ｉ‐エリスロポエチン結合体の％を求め
た。免疫前の血清のカウント数を、非特異的沈澱につい
て補正するため、全ての最終値から差し引いた。未知試
料のエリスロポエチン含量を標準曲線と比較して求め
た。 【００６０】上記操作を、未処理サル血清のみならず、
前記Ａ部で得られたサル血清にも適用した。正常血清値
を分析すると含有量は約36mU／mlであったが、処理サル
血清では含有量は1000〜1700mU／mlであった。 【００６１】例 ３ Ａ．サル cＤＮＡライブラリーの構築 メッセンジャーＲＮＡを、チャーグウィンら：「バイオ
ケミストリー」、第18巻、第5294頁、1979年［Chirgwi
n, et al., Biochemistry 18, p 5294 (1979)］のチオ
シアン酸グアニジウム法によって正常と貧血サル腎臓か
ら単離し、ポリ(A)+ mＲＮＡを、マニアティスら：
「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マ
ニュアル」（1982年、ニューヨーク州、ハーバー、コー
ルドスプリングス所在、コールドスプリングスハーバー
ラボラトリー）［Maniatis, et al., “Molecular Clon
ing, A Laboratory Manual"（Cold Springs Harbor Lab
oratory,Cold Springs Harbor, N.Y., 1982）］第 197-
198頁に記載されているように、オリゴ(dＴ)-セルロー
スカラムクロマトグラフィーで二回精製した。 cＤＮＡ
ライブラリーを、オカヤマら：「モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー」、第２巻、第161-170 頁、
1982年［Okayama,et al., Mol.and Cell. Biol., 2, pp
161-170 （1982）］の一般的方法の修正法により調整し
た。本発明での好ましい操作のキーポイントは以下のと
おりであった：(1) pUC8を唯一のベクターとして使用
し、ＰstＩで切断し、次いで60〜80塩基鎖のオリゴ dＴ
の尾部をつけた。(2) Ｈinc II切断によりベクターの一
端からオリゴ dＴ尾部を取り除いた、(3) 第一の鎖の合
成とオリゴ dＧの尾部づけを公表された方法により実施
した、(4) ＢamＨＩ切断によりベクターの一端からオリ
ゴ dＧ尾部を取り除いた、及び(5) ＤＮＡによるＲＮＡ
鎖の置換には、オリゴ dＧ尾部つきベクターよりも３倍
モル過剰の２つのリンカー（GATCTAAAGACCGTCCCCCCCCC
およびACGGTCTTTA）を用いた。Ｂ．サル cＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めのコロニーハイブリダイゼーション トランスフォー
メーションを受けた大腸菌を、50μｇ／mlのアンピシリ
ン含有栄養平板上に、10×10cmプレート当り9000コロニ
ーの密度で分散させた。ジーン・スクリーン・フィルタ
ー（Gene Screen filter）（ニューイングランド・ヌク
レア・カタログNo. NEF-972 ）をＢＨＩ‐ＣＡＭプレー
ト（バクト(Bacto) 脳心臓浸出液37ｇ／ｌ、カザミノ酸
2ｇ／ｌ及び寒天15ｇ／ｌ、クロラムフェニコール 500
μｇ／ml含有）にて予め湿潤させ、プレートからコロニ
ーを採取するのに用いた。コロニーを同一の培地で12時
間以上増殖させて、プラスミド複製数を増やした。増殖
したコロニー（コロニ・サイド・アップ）を、以下の溶
液でそれぞれ飽和された２枚のワットマン 3ＭＭ紙上に
フィルターを連続的におくことにより処理した： (1) ５分間は50mMグルコース‐25mMトリスＨＣｌ (pH
8.0)-10mM EDTA （pH 8.0）、(2) 10分間は 0.5M Ｎａ
ＯＨ、及び(3) ３分間は 1.0M トリスＨＣｌ（pH 7.5）
フィルターを次いで、80℃にて２時間減圧乾燥させた。 【００６２】フィルターを次に、プロティナーゼＫで消
化に付し、緩衝液Ｋ［ 0.1M トリスＨＣｌ（pH 8.0）‐
0.15M ＮａＣｌ‐10mM EDTA （pH 8.2）-0.2％ＳＤＳ］
中に該プロテアーゼ酵素50μｇ／mlを含む溶液で処理し
た。具体的には、この溶液 5mlを各フィルターに加え、
55℃で30分間消化処理し、しかる後溶液を除去した。 【００６３】フィルターを次いで、プレハイブリダイゼ
ーション緩衝液(5×SSPE-0.5% SDS-100 μｇ／mlSS大腸
菌 DNA-5×BFP) 4mlで処理した。プレハイブリダイゼー
ション処理を55℃で、おおむね４時間以上行ない、その
後、プレハイブリダイゼーション緩衝液を除去した。 【００６４】ハイブリッド形成操作を以下の方法で行な
った。各フィルターに、表IIの 128種類のプローブ配列
（ＥＰＶ混合体とされる全ての混合体）をそれぞれ0.02
5 ピコモル含有するハイブリダイゼーション緩衝液(5×
SSPE-0.5% SDS-酵母菌 tＲＮＡ 100μｇ／ml) ３mlを加
え、フィルターを48℃で20時間保持した。この温度は、
全てのプローブについて決定された計算解離温度（Ｔ
ｄ）の最低のものより２℃低かった。 【００６５】ハイブリッド形成後、フィルターを振盪器
にて10分間、室温で 6×SSC-0.1% SDSにより３回洗浄
し、ハイブリッド形成温度（48℃）にて２〜３回６×SS
C-1% SDSで洗浄した。 【００６６】フィルターのオートラジオグラフィーによ
り、スクリーニングされた 200,000コロニーの中から７
つの陽性クローンが見出された。 【００６７】推定されるサル cＤＮＡクローンの一つ
（クローン＃83）の最初の配列分析が、ウォレスら：
「ジーン」、第16巻、第21‐26頁、1981年［Wallace, e
t al., Gene,16, pp21-26 (1981)］の方法を修正して確
認のために行われた。即ち、サルcＤＮＡクローン＃83
からのプラスミドＤＮＡをＥcoＲＩで切断して直鎖状と
なし、沸騰水浴上で加熱して変性させた。ヌクレオチド
配列をサンガーら：「P.N.A.S.」（米国）、第74巻、第
5463-5467頁、1977年［Sanger, et al., P.N.A.S.(U.
S.A)、74, pp5463-5467 (1977)］のジデオキシ法で調べ
た。16の配列からなるＥＰＶプローブ混合体の一部を塩
基配列決定のプライマーとして用いた。Ｃ．サルＥＰＯ cＤＮＡ配列 クローン＃83のヌクレオチド配列分析をメッシング：
「メソッド・イン・エンザイモロジー」、第 101巻、第
20-78頁、1983年［Messing, Methodsin Enzymology, 1
01, pp20-78 (1983)］の方法に従って行なった。表IVに
示したのは、クローン＃83における約1600塩基対のＥco
ＲＩ／ＨinｄIII クローン化フラグメントの予備的な制
限酵素地図分析結果である。制限エンドヌクレアーゼ酵
素認識部位のおおよその位置は、該フラグメントの 5′
末端のＥcoＲＩ部位に対する 3′側の塩基数によって表
わされる。ヌクレオチドの配列決定は、重複するフラグ
メントを重ね合せるように、個々の制限フラグメントを
つなげることにより行なわれた。例えば、Ｃ113 の制限
フラグメント（111 のＳau3A／324 のＳmaＩ）における
ヌクレオチド分析で得られる配列情報とＣ73のフラグメ
ント（424 のＡluＩ／203 のＢstＥII）の逆方向配列決
定により得られる配列情報との重複である。 【表４】【００６８】約1342塩基対（ＥcoＲＩ部位の 3′側のＳ
au３Ａ部位からＨinｄIII 部位までの範囲内で）の配列
を決め、全ての解読可能な構造を分析して、表Ｖに示し
たＤＮＡ及びアミノ酸鎖の情報を解明することができ
た。表中、成熟ＥＰＯのアミノ末端と推定される最初の
アミノ酸残基（ヒューイック・エムら：「ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、第 256巻、第
7990-7997頁、1981年［Hewick,M.,et al.,J.Biol.Che
m., 256,7990-7997 (1981) ］の操作によりアミノ酸分
析が気相配列決定装置［アプライド・バイオシステム社
（Appllied Biosystems, Inc）］によって行なわれた成
熟ヒトエリスロポエチンの最初の20個のアミノ末端残基
配列分析と対比させて確認されるような）は、数値の＋
１で示されている。成熟蛋白質アミノ酸鎖において一番
目の残基である最初のアミノ末端アラニン残基の「上
流」に位置していてメチオニンを特定化するＡＴＧコド
ン（−27で示される）の存在は、成熟ＥＰＯが循環系に
入る前に切除される27のアミノ酸「リーダー」領域を含
む前駆体型として、ＥＰＯが細胞質中でまず発現される
可能性のあることを示している。ポリペプチド中の潜在
的グリコシル化部位は* で示されている。翻訳領域の分
子量は 21117ダルトンであり、成熟サルＥＰＯを構成す
るポリペプチドの165 残基の分子量は 18236ダルトンで
あった。 【表５】【００６９】 【表６】 【００７０】 【表７】【００７１】表Ｖのポリペプチド鎖は、例えばホップ
ら：「P.N.A.S.」（米国）、第78巻、第 3824-3828頁、
1981年［Hopp, et al., P.N.A.S.(U.S.A.)、78、pp3824
-3828(1981)］、カイトら：「ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー」、第157巻、第 105-132頁、1
982年［Kyte,et al.,J.Mol.Biol., 157、pp105-132 (19
82)］及び（又は）チューら：「バイオケミストリ
ー」、第13巻、第222-245 頁、1974年［Chou,et al.,Bi
ochem,13, pp222-245 (1974)］及び「アドバンシズ・イ
ン・エンザイモロジー」、第47巻、第 45-47頁、1978年
［Advances in Eyzymology, 47, pp45-47(1978) ］の方
法により、高度に親水性の領域及び（又は）潜在的に高
度な免疫原性領域を示す二次構造特性の存在に関する分
析に容易に付されるであろう。ホップらの方法によるコ
ンピューター補助分析は、カリフォルニア州、パロアル
ト、ユニバーシティアベニュ 124のインテリジェネティ
ックス社から入手可能なＰＥＰレファレンスのセクショ
ン６、７に示すプログラムにより実施可能である。 【００７２】例 ４ Ａ．ヒトゲノムライブラリー ローンら：「セル」、第15巻、第1157‐1174頁、1978年
［Lawn, et al,Cell］の方法により調製されたCh4Aファ
ージ担持ヒト胎児肝ゲノムライブラリーを得、プラーク
ハイブリダイゼーション分析で使用するために保存し
た。Ｂ．ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするため
のプラークハイブリダイゼーション操作 ファージ粒子を溶解し、ＤＮＡを、ジーンスクリーン・
プラス・フィルタ（ニューイングランド・ヌクレア・カ
タログNo.NEF-972）及びNZYAM プレート・（１リットル
につき、NaCl 5ｇ、MgCl２ -6Ｈ２ Ｏ 2ｇ、ＮＺ‐アミ
ンＡ10ｇ、酵母エキス5 ｇ、カザミノ酸 2ｇ、マルトー
ス 2ｇ、及び寒天15ｇ）を使用することを除いては、ウ
ー：「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、第68巻、
第389-395 頁、1979年［Woo, Methods In Enzymology,
68, pp389-395 (1979)］の方法により、フィルター（フ
ィルター当り50,000プラーク）に固定した。 【００７３】風乾したフィルターを80℃で１時間焼付
し、次いで例３のＢに記したように、プロティナーゼＫ
で消化した。プレハイブリダイゼーションを55℃で４時
間以上1M NaCl-1% SDS 緩衝液で行ない、しかる後緩衝
液を除去した。ハイブリッド形成及びハイブリッド後洗
浄を例３のＢに記したように行なった。ＥＰＶで示され
る 128種類の20-merプローブ混合体及びＥＰＱ混合体で
示される表III の128 種類の17-merプローブ混合体を用
いた。ハイブリッド形成は、ＥＰＶプローブ混合体を用
い、48℃で行なわれた。ＥＰＱプローブ混合体ハイブリ
ッド形成は46℃、即ち混合体中の最低の計算Ｔｄ値より
4℃低い温度、で行なわれた。再ハイブリッド形成のた
めのハイブリッド形成プローブの除去を、１×SSC-0.1%
SDSと一緒に２分間煮沸することにより行なった。フィ
ルターのオートラジオグラフィーにより、調べられた
1,500,000のファージプラーク中３つの陽性クローン
（いずれのプローブ混合体とも反応する）が見出され
た。ＥＰＯをコードしているような陽性クローンの確認
が、ＤＮＡシークエンシングと、例３のサル cＤＮＡと
のヘテロ二重鎖形成の電子顕微鏡写真による視覚化とに
よってなされた。この操作によっても、ゲノムＤＮＡ鎖
における多数のイントロンの存在が実証された。 【００７４】例 ５ （λｈＥ１で示される）陽性クローンの一つのヌクレオ
チド配列分析（前記サンガーらのジデオキシ法）を行な
ったが、これまでに得られた結果は表VIに示されてい
る。 【００７５】表VI中、最初のＤＮＡ配列は、ヒトＥＰＯ
遺伝子の翻訳部分の直前の非翻訳配列と思われる最前の
620塩基を示す。より具体的には、その配列は、リーダ
ー配列（「前配列」）における最初の４つのアミノ酸
（−27〜−24）をコードする翻訳ＤＮＡ領域（この領域
は、後述する表VII に示されるヒトＥＰＯゲノムＤＮＡ
とサルＥＰＯ cＤＮＡがコードするアミノ酸配列の間の
相同性等に基づいて決定された。）まで続く 5′末端遺
伝子からなっているようである。リーダーの始まりをコ
ードする遺伝子の前に位置する鎖中の４つの塩基対はま
だ明確には確認されなかったため、「Ｘ」で表わされて
いる。次いで、約 639塩基対（そのうち 439塩基対が配
列決定されたが、残りの 200塩基対は「I.S.」で表わさ
れている）からなるイントロンに続いており、翻訳され
るポリペプチドの残基−23として示されたグルタミン酸
コドンの直前に位置している。その直後に続くエキソン
鎖は、（成熟ヒトＥＰＯのアミノ酸鎖残基＋１として示
される）アラニン残基から、＋26のスレオニンを特定化
するコードンまでのアミノ酸残基をコードしていること
が判明し、しかる後具体的に示した 256塩基からなる第
二のイントロンに続いている。このイントロンの後、27
〜55のアミノ酸残基のエキソン配列が続き、その後 612
塩基対からなる第三のイントロンが始まる。次のエキソ
ンはヒトＥＰＯの56〜115 の残基をコードしており、次
いで特定化された 134塩基からなる第四のイントロンが
始まる。第四のイントロンに続くのは、第 116〜166 の
残基をコードするエキソンと「停止」コードン（ＴＧ
Ａ）である。最後に、表VIでは、ヒトＥＰＯ遺伝子の非
翻訳 3′領域と思われる 568塩基対鎖を明らかにしてい
るが、「Ｘ」で示される２つの塩基対はまだ明確には配
列決定されなかった。 【００７６】表VIはこのように、 166個の特定のアミノ
酸残基の成熟ヒトＥＰＯ（推定分子量＝18,399）の一次
構造形状（アミノ酸配列）を確認するのに役立つ。同表
中で同時に示されているのが、ヒト遺伝子オペロンのプ
ロモーター／オペレーター機能にとって重要な 5′−
3′ＤＮＡ鎖とともに、27残基のリーダー配列をコード
するＤＮＡ配列である。成熟ヒトＥＰＯポリペプチドの
潜在的グリコシル化部位は、表中に* で示されている。
表VIの特定のアミノ酸配列がヒトエリスロポエチンの自
然発生的対立遺伝型のそれを構成している可能性がある
ことに注意すべきである。この立場に関する支持が、残
基 126において表に示したセリンと対立するメチオニン
を有する多くのエリスロポエチン分子の発見に至った、
尿中ヒトエリスロポエチンの単離物を配列決定するとい
う長年の努力の結果の末に見出された。 【００７７】以下の表VII はヒトおよびサルのＥＰＯに
おけるポリペプチド配列の相同性の程度を示している。
表中の上部の連続列において、一文字の符号は残基−27
で始まるヒトＥＰＯについて推定翻訳されたポリペプチ
ド配列を示すために用いられており、下部の連続列は指
定の残基−27で始まるサルＥＰＯについて推定されたポ
リペプチド配列を示している。* は、配列相同性を強調
するために用いられている。推定されたヒトおよびサル
ＥＰＯ配列は、ヒトにおける部位 116に「付加的」リジ
ン（Ｋ）残基を示していることに注目すべきである。表
VIと相互に参照することにより、この残基が丁度ゲノム
配列において推定される mＲＮＡのスプライス部位にあ
ることが明らかとなる。ヒトポリペプチド配列における
リジン残基の存在は、下記例７でヒトゲノムＤＮＡによ
りトランスフォーメーションされたＣＯＳ−１細胞から
単離された mＲＮＡより得られるヒト cＤＮＡ鎖クロー
ンを配列決定することによっても更に確認された。尚、
リーダー領域を含む前駆体型のヒトＥＰＯをコードする
イントロンを含まない本発明のＤＮＡ配列を表VI及び表
VII に基づいて作成し、これをまとめて表VI′に示す。 【表８】【００７８】 【表９】 【００７９】 【表１０】【００８０】 【表１１】 【００８１】 【表１２】【００８２】 【表１３】 【００８３】 【表１４】【００８４】 【表１５】 【００８５】例 ６ 例３の操作で得たサル cＤＮＡによりコードされるＥＰ
Ｏポリペプチド物質を単離可能な量で微生物合成するた
めに最初の試みとして選択された発現系は、哺乳類宿主
細胞のうちの一種（即ち、ＣＯＳ−１細胞、A.T.C.C. N
o.CRL-1650）であった。その細胞は、大腸菌宿主(pＢＲ
322 由来ＤＮＡの存在下にて) および哺乳類宿主（ＳＶ
40ウィルス由来ＤＮＡの存在下にて）内で自律的に複製
することが可能な「シャトル」ベクターによりトランス
フェクションされた。 【００８６】更に具体的には、発現ベクターは以下の操
作により調製された。例３のプラスミドクローン＃83を
大腸菌で増殖させ、約1.4kb のサルＥＰＯをコードする
ＤＮＡをＥcoＲＩおよびＨinｄIII 切断により単離し
た。分別して単離されたのは、約4.0 kbの pＢＲ322 由
来ＨinｄIII ／ＳalＩフラグメントであった。約30bpの
ＥcoＲＩ／ＳalＩ「リンカー」フラグメントがＭ13mp 1
0RF DNA （ＰアンドＬラボラトリーズ）から得られた。
このリンカーはＥcoＲＩ付着端を含んでおり、順にＳst
Ｉ、ＳmaＩ、ＢamＨＩおよびＸbaＩ認識部位さらにはＳ
alＩ付着端が続いている。上記３つのフラグメントは約
5.4kb の中間プラスミド（「pERS」）の形成のために連
結されたが、このプラスミドにおいて、ＥＰＯ ＤＮＡ
は有効な制限エンドヌクレアーゼ認識部位の「バンク」
近傍の一端に位置していた。pERSを次いでＨinｄIII お
よびＳalＩで消化すると、ＥＰＯ ＤＮＡおよびＥcoＲ
ＩからＳalＩ（Ｍ13mp 10 ）までのリンカーが得られ
た。1.4kb のフラグメントを約4.0kb の pＢＲ322 のＢ
amＨＩ／ＳalＩおよび約30bpの他のM13mp10・ＨinｄIII
／ＢamＨＩ ＲＦフラグメントリンカーと結合させた。
Ｍ13リンカーフラグメントは、ＨinｄIII 付着端、それ
に続くＰstＩ、ＳalＩ、ＸbaＩに認識部位およびＢamＨ
Ｉ付着端という特徴を有していた。結合生成物は、再
び、制限部位バンクをＥＰＯ ＤＮＡの近傍両端に有す
る有用な中間プラスミド（「 pＢＲ‐ＥＰＯ」）であっ
た。 【００８７】ＣＯＳ−１細胞におけるＥＰＯ ＤＮＡ発
現のために選択されたベクター（「pDSVL1」）は大腸菌
にて選別および自律的に複製させられるよう予め調製さ
れた。これらの特徴は、 pＢＲ322 ヌクレオチド2448〜
4362の領域に存在する複製起点とアンピシリン耐性遺伝
子ＤＮＡ鎖により付与される。この配列は、ベクターに
取込まれる前に、ヌクレオチド2448に直接隣接するよう
にＨinｄIII 認識部位を付与するリンカーを付加するこ
とにより構造的に変換された。選択されたベクターの他
の有用な特性としては、ＣＯＳ−１細胞において自律的
に複製しうる能力と哺乳動物細胞中で機能するウィルス
性プロモーター配列の存在であった。これらの特徴は、
ＳＶ40ゲノムにおけるヌクレオチド数5171〜270 の343b
p 配列に存在する複製ＤＮＡ配列の起点および「後期遺
伝子」ウィルス性プロモーターＤＮＡ配列により示され
る。市販のリンカー［コラボレーティブ・リサーチ（Co
llaborative Research）］を用いて唯一の制限部位（Ｂ
amＨＩ）をベクターにつけ、ウィルス性プロモーター配
列に直接接合させた。更にベクターには、「後期遺伝
子」ウィルス mＲＮＡポリアデニル化信号（通常、転写
ターミネターと称される）を有する 238塩基対配列（Ｓ
Ｖ40のヌクオレチド数2533〜2770に由来する）が取込ま
れていた。このフラグメントは、ベクターにおいて、
「後期遺伝子」ウィルス性プロモーターから唯一のＢam
ＨＩ部位までに対応し、適切に配向していた。更に、ベ
クターには、ウィルス性プロモーターとターミネーター
との間の配列において、唯一のＢamＨＩ部位に挿入され
た遺伝子の潜在的転写に関与しない部位に別の哺乳類遺
伝子が存在していた［哺乳類遺伝子は、ガッサーら：
「P.N.A.S.」（米国）、第79巻、第 6522-6526頁、1982
年（Gasser, et al., P.N.A.S.(U.S.A)、79、pp6522-65
26 (1982)）のように、プラスミド pＭＧ−１から単離
された約2,500 bpのマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）小遺伝子からなっていた］。 【００８８】pDSVL1の構築について以下に補足説明を加
える。 【００８９】このプラスミドベクターは 5049bp から成
り、４種のＤＮＡフラグメントから合成により得られる
ものである。これら４種のＤＮＡフラグメント及び合成
リンカーはいずれも容易に入手可能なものであり、その
塩基配列もすでに決定されている。 【００９０】各ＤＮＡフラグメントは夫々次のように調
製することができる。 (1) ヌクレオチド１−2520：この2520bpのＥcoＲＩ−Ｐ
stＩフラグメントはｐＭＧ１から得られ、マウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼ小遺伝子をコードするものである。
ｐＭＧ１はスタンフォード大学のDr.R.Schimkeから入手
したもので、このプラスミドは一般に入手可能なもので
ある（前掲ガッサーら参照）。 (2) ヌクレオチド2521−2783：この263bp から成るＰst
Ｉ−ＢamＨＩフラグメントは、ＳＶ40ゲノムのヌクレオ
チド数2533−2770由来のＢamＨＩ−ＢclＩフラグメント
(238bp) のＢclＩ部位に合成リンカーを付加してＰstＩ
部位に変換することにより調製したものである。尚、Ｓ
Ｖ40及びここで用いた合成リンカーは市販されているも
のである。 (3) ヌクレオチド2784−3129：この346bp から成るＢam
ＨＩ−ＨinｄIII フラグメントは、ＳＶ40ゲノムのヌク
レオチド数5171−270 由来のＰvuII−ＨinｄIII フラグ
メント(343bp) のＰvuII部位（ヌクレオチド数 270）
に、市販の合成リンカーを接合させてＢamＨＩ部位に変
換することにより調製したものである。 (4) ヌクレオチド3130−5049：この1920bpから成るＨin
ｄIII −ＥcoＲＩフラグメントは、pBR322のヌクレオチ
ド数2448−4362領域のヌクレオチド数2448にＨinｄIII
認識部位を付与する合成リンカーを直接付加することに
よって調製したものである。 【００９１】例えば、上記マニアティスらの方法によ
り、ＥＰＯをコードするＤＮＡをＢamＨＩフラグメント
としてプラスミド pＢＲ‐ＥＰＯから単離し、ＢamＨＩ
で切断されたプラスミド pＤＳＶＬ１に結合させた。制
限酵素分析を行ない、２つの得られたクローンベクター
（複製ベクターＨおよびＬ）が正確に配向してＥＰＯ遺
伝子が挿入されたことを確認した。プラスミド pＤＳＶ
Ｌ‐ＭｋＥを示した第２図参照。誤って配向したＥＰＯ
遺伝子を有するベクター（ベクターＦ，ＸおよびＧ）
は、正確に配向したＥＰＯ ＤＮＡを有するベクターで
トランスフォーメーションされた宿主のＥＰＯ発現量を
測定するためのトランスフェクション実験において、ネ
ガティブコントロールとして使用するために保存した。 【００９２】キャリアＤＮＡ（マウス肝および脾ＤＮ
Ａ）と結合したベクターＨ、Ｌ、Ｆ、ＸおよびＧを用
い、リン酸カルシウム微細沈澱法により、二重60mmプレ
ートをトランスフェクションした。二重60mmプレートは
また、「にせ」のトランスフォーメーションのネガティ
ブコントロールであるキャリアＤＮＡによってもトラン
スフェクションされた。５日後、全ての培地について、
天然ＥＰＯの免疫学的性質を有するポリペプチドの有無
に関し試験した。 【００９３】例 ７ Ａ．ＣＯＳ−１細胞を含む第一ＥＰＯ発現系 ヒトゲノムのＤＮＡ ＥＰＯクローンによりコードされ
たヒトＥＰＯポリペプチド物質を単離可能な量で微生物
合成する最初の試みのために選択された系には、哺乳類
宿主細胞（即ち、ＣＯＳ−１細胞、A.T.C.C. No.CRL-16
50）での発現が包含される。ヒトＥＰＯ遺伝子を、ま
ず、大腸菌宿主(pＢＲ322 由来ＤＮＡの存在下にて) お
よび哺乳類細胞系ＣＯＳ−１（ＳＶ40由来ＤＮＡの存在
下にて）内で自律的に複製することが可能な「シャト
ル」ベクターにてまずサブクローン化した。ＥＰＯ遺伝
子含有シャトルベクターを次いでＣＯＳ−１にトランス
フェクションした。ＥＰＯポリペプチド物質がトランス
フェクションされた細胞から産生され、細胞培地に分泌
された。 【００９４】更に具体的には、発現ベクターは以下の操
作により調製された。ラムダクローンλｈＥ１から単離
され、ヒトゲノムＥＰＯ遺伝子を含むＤＮＡをＢamＨＩ
およびＨinｄIII 制限エンドヌクレアーゼで消化して、
全ＥＰＯ遺伝子を含む5.6kbＤＮＡフラグメントを単離
した。このフラグメントを、同様に消化された細菌プラ
スミド pＵＣ8 ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
社(Bethesda ResearchLaboratories, Inc.)］と混合
し、結合させて、この制限フラグメントの簡便な供給源
となる中間プラスミド「pUC8-HuE」を得た。 【００９５】ＣＯＳ−１細胞におけるＥＰＯ ＤＮＡ発
現のために選択される 3338bp から成るベクター（pSV4
SEt ）を予め調製した。プラスミドpSV4SEt は３種のＤ
ＮＡフラグメントから合成されており、各フラグメント
は市販のＤＮＡに入手容易な合成リンカーを付加して修
飾したものである。このプラスミドは、大腸菌における
選択および自律的な複製をなすＤＮＡ配列を含んでい
た。これらの特徴は、細菌プラスミドpBR322のヌクレオ
チド数2448〜4362領域に存在している複製起点およびア
ンピシリン耐性遺伝子ＤＮＡ配列により付与される。こ
の領域を、ヌクレオチド数2448にＨinｄIII 認識部位を
付与するリンカーを付加することにより構造的に変換
し、pSV4SEt のヌクレオチド数1422‐3338（ＨinｄIII
‐ＥcoＲＩ）領域とした。このＨinｄIII ‐ＥcoＲＩ領
域は、カリフォルニア大学のティジャン(R.Tjian) より
分与を受けたプラスミド pＳＶ08（メイヤーら：「セ
ル」、第25巻、第373-384 頁、1981年［Myers,R.M., et
al.,Cell, 25, pp373-384 (1981)］）をＨinｄIII お
よびＥcoＲＩで消化することにより得た。得られたＨin
ｄIII リンカー部分を含む該断片概略を以下に示す。 【化１】 【００９６】尚、該ＨinｄIII ‐ＥcoＲＩ断片は、以下
に述べるような方法によっても、調製することができ
る。まず、pBR322よりＳfaＮＩ−ＢglＩ断片（約914 b
p）を単離する。次に、pBR322よりアンピシリン耐性遺
伝子領域にかかる部分を含むＢglＩ−ＨinｄIII 断片
（約908 bp）を単離する。最後に、以下に示す配列［pB
R322のヌクレオチド数2448から2567（ＳfaＮＩ部位）の
配列に、更にＨinｄIII 部位を2448側に付加した配列］
を有する129 bpのＤＮＡ断片を合成する。 【００９７】これら３つのＤＮＡ断片を連結して得られ
たプラスミドを、ＨinｄIII およびＥcoＲＩで消化する
ことにより、唯一の大断片として該ＨinｄIII ‐ＥcoＲ
Ｉ断片が得られる。 【化２】 【００９８】プラスミドpSV4SEt は、ＣＯＳ−１細胞に
おいても自律的に複製することができた。この特徴は、
ＳＶ40のウィルス複製起点を含む343bp のＨinｄIII ‐
ＰvuIIフラグメント（ヌクレオチド数5171〜270 ）にあ
った。このフラグメントを、ＥcoＲＩ認識部位をヌクレ
オチド数270に接合させるリンカー、およびＳalＩ認識
部位をヌクレオチド数5171に接合させるリンカーを付加
することにより変換し、pSV4SEt のヌクレオチド数 1-3
53（ＥcoＲＩ‐ＳalＩ）領域とした。ＳＶ40由来の1063
bpのＨinｄIII ‐ＢclＩフラグメント（ヌクレオチド数
1708〜2770）を、ＳalＩ認識部位をヌクレオチド2770に
接合させるリンカーを付加することにより変換し、pSV4
SEt のヌクレオチド数354-1421（ＳalＩ‐ＨinｄIII ）
領域とした。このフラグメント中には、唯一のＢamＨＩ
認識配列も含まれていた。即ち、以上の３種のＤＮＡフ
ラグメントから成るプラスミドpSV4SEt は、ヒトＥＰＯ
遺伝子が挿入されるＢamＨＩおよびＨinｄIII 認識部
位、大腸菌内で複製および選択される配列、並びにＣＯ
Ｓ−１細胞内で複製される配列を含んでいた。 【００９９】ＥＰＯ遺伝子をpSV4SEt に挿入するため、
プラスミドpUC8-HuEをＢamＨＩおよびＨinｄIII制限エ
ンドヌクレアーゼで消化し、ＥＰＯをコードする5.6kb
のＤＮＡフラグメントを単離した。pSV4SEt もＢamＨＩ
およびＨinｄIII で切断し、2513bpの大フラグメントを
単離した（全ての必要な機能を保有している）。これら
のフラグメントを混合連結して、最終的ベクター「pSVg
Hu EPO」を得た（第３図参照）。このベクターを大腸菌
（ＨＢ101 株）中で増殖させ、ベクターＤＮＡを単離し
た。制限酵素分析を行ない、ＥＰＯ遺伝子の挿入を確認
した。 【０１００】プラスミドpSVgHuEPO DNA を用いＣＯＳ−
１細胞においてヒトＥＰＯポリペプチド物質を発現させ
た。更に具体的には、pSVgHuEPO DNA をキャリアＤＮＡ
とともに、ＣＯＳ−１細胞の三重60mmプレートにトラン
スフェクションした。コントロールとして、キャリアＤ
ＮＡのみをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションし
た。細胞培養培地を５日後および７日後に採取し、天然
ヒトＥＰＯの免疫学的性質を有するポリペプチドの有無
について試験した。Ｂ．ＣＯＳ−１細胞を含む第二ＥＰＯ発現系 更に別の系が、ＣＯＳ−１細胞（A.T.C.C. No.CRL-165
0）において、ヒトゲノムＤＮＡ ＥＰＯクローンによ
りコードされたヒトＥＰＯポリペプチド物質の改良生産
法を得るために設計された。 【０１０１】直前のシステムにおいて、ＥＰＯが、5.6k
b のＢamＨＩからＨinｄIII までの制限フラグメント中
に存在するそれ自身のプロモーターを用いて、ＣＯＳ−
１細胞にて発現された。下記調製例では、ＥＰＯ遺伝子
を、ＳＶ40後期プロモーターにより発現しうるように変
換させる。 【０１０２】更に具体的には、クローン化された 5.6kb
のＢamＨＩからＨinｄIII までのゲノムヒトＥＰＯ制限
フラグメントを以下の操作により変換した。前記プラス
ミドpUC8-HuEをＢamＨＩおよびＢstE II制限エンドヌク
レアーゼで切断した。ＢstEIIは、ペプチド前駆体をコ
ードする開始ＡＴＧから 5′方向に44塩基対であり、Ｈ
inｄIII 制限部位から 3′方向に約 680塩基対である部
位において、5.6kb ＥＰＯ遺伝子を切断する。約4900塩
基対のフラグメントを単離した。ＳalＩおよびＢstE II
付着端並びに内在ＢamＨＩ認識部位を有する合成リンカ
ー 【化３】 【０１０３】を合成し、精製した。２つのフラグメント
をＳalＩおよびＢamＨＩで切断されたプラスミドpBR322
と混合し、連結させて、中間プラスミド pＢＲｇＨＥを
得た。ゲノムヒトＥＰＯ遺伝子は、アミノ末端をコード
する領域に近接したＢamＨＩ部位から 3′方向に53塩基
対である部位に一つのＡＴＧを含む完全な構造の遺伝子
を保有する4900塩基対のＢamＨＩ切断フラグメントとし
て、それらから単離することができる。 【０１０４】このフラグメントを単離し、ＢamＨＩフラ
グメントとして、ＢamＨＩ切断発現ベクタープラスミド
ｐＤＳＶＬ１に挿入した。得られるプラスミド、即ち第
４図に示すｐＤＳＶＬ‐ｇＨｕＥＰＯを用い、例６及び
７Ａに示したように、ＣＯＳ−１細胞からＥＰＯポリペ
プチド物質を発現させた。 【０１０５】例 ８ 例６における６つのトランスフェクションされたＣＯＳ
−１の増殖後の培地を、例２のＢに示した操作に従い、
ラジオイムノアッセイによって分析した。各試料を 25
0、 125、50および25μｌ量で分析した。不正確なＥＰ
Ｏ遺伝子配向を有するベクターでトランスフェクション
されたにせの細胞増殖物の上澄は、明らかにＥＰＯ免疫
応答性に関し陰性であった。正確な配列のＥＰＯ ＤＮ
Ａを有するベクター（ＨおよびＬ）でトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ−１細胞の増殖物から得た２つの上澄
のそれぞれの試料に関し、抗体に対する１２５Ｉ‐ＥＰ
Ｏ結合阻害率は72〜88％の範囲であり、全ての値が標準
曲線の上位に位置していた。培地上澄の正確なＥＰＯ濃
度は、このため、信頼すべき程度までには調べることが
できなかった。しかしながら、最大量(250μｌ) の計算
値から控えめに推定すると、300 mU／mlであった。 【０１０６】例６の代表的培養液、並びに例７Ａで得た
５日目および７日目の培養液を、組換えサルおよびヒト
ＥＰＯ物質および天然ヒトＥＰＯ標準と比較するため
に、ＲＩＡで試験し、結果を第１図のグラフで示した。
即ち、結果は予期されたように、組換えサルＥＰＯは抗
ヒトＥＰＯ抗体と著しく競合したが、試験条件下では完
全には結合を阻害できないことを示した。組換えヒトＥ
ＰＯに関する最大の％阻害率はしかしながら、ヒトＥＰ
Ｏ標準の値と極めて近似していた。用量応答曲線が平行
関係であることは、一般に免疫学的な配列（エピトー
プ）の同一性を示唆している。サルＥＰＯ培養液の先の
評価をそれよりも高い希釈レベルで再度実施すると、2.
91〜3.12 U／mlの範囲であった。調べられたヒトＥＰＯ
生産量は、５日間増殖試料が392 mU／mlで、７日間増殖
試料が567 mU／mlであった。例７Ｂの発現系におけるＥ
ＰＯ測定値は同レベルかそれ以上であった。 【０１０７】例 ９ 例６および７で得られた培養液を、ゴールドワッサー
ら：「エンドクリノロジー」、第97巻、第２号、第 315
-323頁、1975年［Goldwasser,et al., Endocrinology
, 97, 2, pp 315-323 (1975)］の方法によるＥＰＯ活
性イン・ビトロ分析に供した。被検培養液のサルＥＰＯ
測定値は 3.2〜4.3 U/mlの範囲であった。ヒトＥＰＯ培
養液もこのイン・ビトロ分析では活性を示し、この活性
は抗ＥＰＯ抗体で中和することができた。例６の組換え
サルＥＰＯ培養液も、コーツら：「ネーチャー」、第 1
91巻、第 1065-1067頁、1961年［Cotes, et al.,Natur
e, 191,pp1065-1067 (1961)］およびハモンドら：「ア
ナルス・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイ
エンス」、第 149巻、第516-527 頁、1968年［Hammond,
et al., Ann, N.Y. Acad. Sci., 149, pp.516-527 (19
68) ］の一般的方法によるイン・ビボ生物学的活性分析
に供したところ、活性値は0.94〜1.24 U／mlであった。 【０１０８】例 １０ 前述の諸例において、組換えサルまたはヒトＥＰＯ物質
を、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションするのに用
いたベクターからつくった。これらのベクターは、細胞
内におけるＳＶ40のＴ抗原とベクター上のＳＶ40の複製
起点との存在によって、ＣＯＳ−１細胞内で複製する。
これらのベクターはＣＯＳ−１細胞内で有効量のＥＰＯ
を産生するが、その発現はベクターが最終的に減少して
いくため、まさしく一時的である（７〜14日）。更にま
た、少量のＣＯＳ−１のみが該ベクターでトランスフェ
クションされた。本例では、チャイニーズハムスターの
卵巣（ＣＨＯ）ＤＨＦＲ- 細胞および選別可能なマーカ
ーＤＨＦＲを用いた発現系を述べている［関連する発現
系の議論については、いずれも米国特許第4,399,216 号
並びに1984年 8月29日に公開された欧州特許出願第1170
58号、第117059号および第117060号参照］。 【０１０９】ウルラウブら：「プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ」
（米国）、第77巻、第4461頁、1980年［Urlaub, et a
l., Proc. Nat. Acad. Sci.(U.S.A.) Vol.77, 4461(198
0)］に示されたＣＨＯ ＤＨＦＲ- 細胞(DuX-Bll)CHO K
1 細胞は、構造遺伝子の突然変異によってジヒドロ葉酸
レダクターゼ酵素（ＤＨＦＲ）を欠如しており、このた
め培地中にグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンの
存在を要求する。プラスミド pDSVL-MkE（例６）または
プラスミドpDSVL-gHuEPO（例７Ｂ）を、60mm培養プレー
ト中のヒポキサンチン、チミジンおよびグリシン含有培
地で増殖するＣＨＯ ＤＨＦＲ- 細胞内に、キャリアＤ
ＮＡと一緒にトランスフェクションした。プラスミドpS
VgHuEPO （例７Ａ）を、細菌プラスミドベクター pＢＲ
322 でクローン化されたマウスジヒドロ葉酸レダクター
ゼ遺伝子含有プラスミドｐＭＧ２と混合した。 【０１１０】ｐＭＧ２は、Gasser C.S.et al, Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA,79, p 6522-6526 (1982)にその調
製方法が記載されているｐＭｇ２と同一のプラスミドで
ある。本プラスミドは、前述の文献の著者の１人である
Dr. Schimke R.D.より、分与を受けた。本願出願時点
で、Dr.Schimkeは、希望者に対し本プラスミドを分譲し
ている。従って、本プラスミドの入手については、Dr.S
chimkeから分譲を受ける事により可能である。また、以
下に述べるように当該文献に従い、調製することもでき
る。 【０１１１】ｐＭｇ２は、マウス染色体dhfr遺伝子の
５′上流領域の後に、マウスdhfr遺伝子ｃＤＮＡを接続
し、更にｃＤＮＡの３′非翻訳領域中に、マウス染色体
dhfr遺伝子３′下流領域を挿入した約4.3 kbのいわゆる
「dhfr mini 遺伝子」を含むプラスミドである。まず、
マウス染色体dhfr遺伝子の５′上流〜エクソンＩ，IIま
での領域を持つプラスミドｐＤＲ34（Crouse G.F.et a
l, J.Biol.Chem. 257, p7887-7897(1982)）より、1.0kb
のＥcoＲＩ−ＴaqＩ断片（５′上流領域とエクソンＩ
の一部を含む）を単離した。また、マウスdhfr遺伝子ｃ
ＤＮＡを含むプラスミドｐＤＨＦＲll（Chang A.C.Y.et
al, Nature 275, p617-624(1978)）より、0.19kbのＴa
qＩ断片及び1.3kb のＴaqＩ−ＰstＩ断片（両断片は、
ｃＤＮＡ中における連続した断片である。）を単離し
た。1.0kb のＥcoＲＩ−ＴaqＩ断片のＴaqＩ部位は、エ
クソンＩ中に単一に存在する認識部位であり、ｃＤＮＡ
中の最初のＴaqＩ部位に相当する。 【０１１２】これらの３つの断片は、ＥcoＲＩ−ＴaqＩ
断片（1.0 kb）、ＴaqＩ断片(0.19kb)、ＴaqＩ−ＰstＩ
断片（1.3 kb）の順に正しく並ぶよう連結し、ＴaqＩ断
片が正方向に入っている方のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片（2.
49kb）をｐＢＲ 322のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片（大きい
方）に挿入し、ｐＭｇ１を得た。 【０１１３】次に、マウス染色体dhfr遺伝子の最終エク
ソンと2.7kb の３′下流領域を持つプラスミドｐＤＨＦ
Ｒｇ１（Nunberg J.H.et al,Cell, 19, p355-364(198
0)）より、1.8kb のＢglII断片（マウス染色体dhfr遺伝
子３′下流領域）を単離した。このＢglII断片（1.8 k
b）を、ｐＭｇ１の２番目のＢglII部位に挿入し、ｐＭ
ｇ２を得た。 【０１１４】プラスミド混合体およびキャリアＤＮＡを
CHO DHFR- 細胞にトランスフェクションした（一つのプ
ラスミドを獲得した細胞は一般に第二のプラスミドをも
獲得する）。３日後、細胞を、ヒポキサンチンおよびチ
ミジン欠如培地の数個の 100mm培養プレートに、トリプ
シン処理して分散させた。ＤＨＦＲ遺伝子で安定的にト
ランスフォーメーションされその結果ＥＰＯ遺伝子によ
ってもトランスフォーメーションされたそれらの細胞の
みがこの培地で生存する。 7〜21日後、生存する細胞の
コロニーが明確になった。これらのトランスフォーマン
トコロニーは、トリプシン処理で分散された後、ヒポキ
サンチンおよびチミジン欠如培地中で継続して増殖する
ことができ、新種の細胞株（例えば、CHO pDSVL-MkEPO,
CHO pSVgHuEPO及びCHO-pDSVL-gHuEPO）が得られた。 【０１１５】上記細胞株の培養液を、組換えサルまたは
ヒトＥＰＯの有無についてＲＩＡで分析した。 【０１１６】CHO pDSVL-MkEPO 株培地は、プラスミドpD
SVL-MkEPO でトランスフェクションされたＣＯＳ−１細
胞から得たＥＰＯと同様の免疫学的性質を有するＥＰＯ
を含有していた。代表的な65時間培養液は0.60 U／mlの
サルＥＰＯを含有していた。 【０１１７】CHO pSVgHuEPO およびCHO pDSVL-gHuEPOの
培養液は、プラスミドpSVgHuEPO またはpDSVL-gHuEPOで
トランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞から得たも
のと同様の免疫学的性質を有する組換えヒトＥＰＯを含
有していた。ＲＩＡにより測定すると、代表的なCHO pS
VgHuEPO の３日間培養液は2.99 U／mlのヒトＥＰＯを含
有し、CHO pDSVL-gHuEPOの 5.5日間試料は18.2 U／mlの
ヒトＥＰＯを有していた。 【０１１８】前記細胞株から得られるＥＰＯ量は、遺伝
子を増幅させて産生能の高い新規細胞株をつくることに
よって増加させることができる。ＤＨＦＲ遺伝子により
コードされた産物たるジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素
（ＤＨＦＲ）は、薬物メソトレキセート（ＭＴＸ）で阻
害することができる。更に具体的には、ヒポキサンチン
およびチミジン欠如培地で増殖した細胞は、ＭＴＸによ
り阻害されまたは殺される。適切な条件下（例えば最低
のＭＴＸ濃度）では、ＭＴＸに耐性でかつＭＴＸ存在下
でも増殖可能な細胞を得ることができる。これらの細胞
は、ＤＨＦＲ遺伝子数が増加し、その結果ＤＨＦＲ酵素
量が増加することにより、ＭＴＸ耐性であることが判明
する。残存した細胞を次いで、徐々に濃度を高めてＭＴ
Ｘで処理してもよく、これにより更に多量のＤＨＦＲ遺
伝子を含む細胞株が得られる。ＤＨＦＲ遺伝子と一緒に
発現ベクター上に乗せられ、またはＤＨＦＲ遺伝子とと
もにトランスフォーメーションされた「パッセンジャー
遺伝子」（例えばＥＰＯ）は、それらの遺伝子コピー数
の増加がしばしば見出されている。 【０１１９】この増幅系の実施例として、細胞株CHO pD
SVL-MkEPO を徐々に増加させたＭＴＸ濃度（0nM, 30nM
及び 100nM）に供した。各増加段階から得た代表的な65
時間培地試料をＲＩＡ分析すると、それぞれ0.60，2.45
及び6.10 U／ml含有していた。 【０１２０】細胞株CHO pDSVL-gHuEPOを、30nM、50nM、
100 nM、200 nM、 1μM 及び 5μMにＭＴＸ濃度を増加
させて試験に供した。100nM ＭＴＸ段階から得た代表的
な３日間培地試料は、ＲＩＡで調べると、3089±129 U/
mlのヒトＥＰＯを含有していた。100 nMおよび 1μM Ｍ
ＴＸ段階から得た代表的な48時間培地試料は、ＲＩＡで
調べると（３回分析の平均）、それぞれ 466および1352
U／mlのヒトＥＰＯを含有していた。これらの操作で
は、１×10６ 個の細胞を60mm培養皿中の培地５mlに接
種した。24時間後、培地を除去し、無血清培地（0.1 mM
の非必須アミノ酸およびＬ‐グルタミンが添加された高
グルコースＤＭＥＭ）５mlで置き換えた。ＥＰＯを無血
清培地で48時間蓄積させた。培地をＲＩＡ分析用に集
め、細胞をトリプシン処理し、計数した。100 nMおよび
1μM ＭＴＸで増殖した細胞に関する467 U/mlおよび13
52 U／mlの平均ＲＩＡ値から、それぞれ実際の収量2335
U／プレートおよび6750 U／プレートが求められた。一
プレート当りの平均細胞数はそれぞれ1.94×10６ およ
び3.12×10６ であった。これらの培養条件下での有効
産生速度は、したがって、1264および2167 U／10６ 細
胞／48時間であった。 【０１２１】直上に記載した培養細胞は、遺伝的に不均
一な群である。標準的スクリーニング操作が、最大産生
能を有するおおむね均一なクローンを単離するために用
いられている。米国食品薬局（U.S.Foodand Drug Admin
istration ）、薬品および生物学センター（Center for
Drugs and Biologics）、生物学研究調査庁（Officeof
Biologics Research Review ）、1984年 6月 1日、
「生物の産生に用いられる株化細胞の特徴において考慮
すべき点（Points to Consider in the Characterizat
ion of Cell Lines Used to Produce Biologics）］の
セクションＡ、パート２参照。 【０１２２】前記ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞系の生産性は、
適切な細胞培養技術により改善することができる。哺乳
類培養細胞の増殖には、成長培地に血清の存在を要す
る。血清を含有しない培地でＣＨＯ細胞からエリスロポ
エチンを産生する方法は、培地からのエリスロポエチン
の精製を著しく容易化するものである。下記方法によれ
ば、産生に充分な多量の無血清培地において、経済的に
エリスロポエチンを産生させることができる。 【０１２３】標準的細胞培養条件下で増殖させたCHO pD
SVL-gHuEPO細胞株を用い、スピナー細胞培養フラスコに
接種する。この細胞を、 5％胎児牛血清、Ｌ‐グルタミ
ン、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された
高グルコースＤＭＥＭおよびＨam′s Ｆ12の50‐50混合
物、0.05mM非必須アミノ酸並びに適当な濃度のメソトレ
キセートからなる培地が入ったスピナー細胞培養フラス
コ内で、懸濁液細胞系として増殖させる。懸濁細胞培養
では、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞を容易に多量に増殖させる
ことができる。懸濁液中で増殖したＣＨＯ細胞を用い、
培地 200mlが入った 850cm２ のローラー瓶に 1.5×10
７ 個の生育細胞の初期接種密度で、ローラー瓶に接種
する。細胞を３日間にわたり、付着細胞系として一面に
拡がるまで増殖させる。この増殖相に使用される培地
は、懸濁増殖に用いられたものと同様である。３日の増
殖期間の最後に、血清含有培地を除去し、 100mlの無血
清培地、即ち0.05mM非必須アミノ酸およびＬ‐グルタミ
ンが添加された高グルコースＤＭＥＭおよびＨam′s Ｆ
12の50‐50混合物で置き換える。ローラー瓶をローラー
瓶インキュベーターに１〜３時間戻し、培地を再び除去
し、新しい無血清培地 100mlで置き換える。無血清培地
を１〜３時間インキュベートすると、汚染血清蛋白質濃
度が減少する。ローラー瓶を７日間インキュベーターに
戻し、その間にエリスロポエチンが無血清培地中で蓄積
する。７日間の産生期の最後に、培養済み培地を除去
し、第二の産生サイクルのために新しい無血清培地で置
き換える。この産生系の実施例では、代表的な７日間無
血清培地試料は、ＲＩＡによると、3892±409 U/mlのヒ
トエリスロポエチンを含有していた。 0.9〜 1.8×10５
細胞／cm２ の推定細胞密度に基づけば、各 850cm２
のローラー瓶は0.75〜 1.5×10 8 個の細胞を含有してお
り、したがって７日間の100 mlの培養についてのＥＰＯ
産生速度は 750〜1470 U／10６ 細胞／48時間であっ
た。 【０１２４】10nM MTXで処理された細胞株CHO pDSVL-Mk
EPO の培養液をＲＩＡイン・ビトロおよびイン・ビボＥ
ＰＯ活性分析に供した。培養済み培地試料は、ＲＩＡで
測定すると41.2±1.4 U/ml、イン・ビトロ生物学的活性
分析で測定すると41.2±0.064 U/mlおよびイン・ビボ生
物学的活性分析で測定すると42.5±5 U/ml、のＭｋＥＰ
Ｏを含有していた。ポリペプチド生成物のアミノ酸の配
列を調べるとＥＰＯ生成物の存在が示されており、基本
的な種では推定アミノ末端アラニンに隣接する「リーダ
ー」配列の３残基分を有していた。これは、ＣＨＯ細胞
内でのポリペプチドの膜処理が不正確であることの結果
なのか、あるいはヒトＥＰＯと比較したサルＥＰＯアミ
ノ末端構造の違いを反映しているのかはまだわかってい
ない。 【０１２５】細胞株CHO pDSVL-gHuEPOの培養液を３つの
分析に供した。 5.5日目の試料は、培地中に組換えヒト
ＥＰＯを、ＲＩＡ分析で18.2 U／ml、イン・ビトロ分析
で15.8±4.6 U/mlおよびイン・ビボ分析で16.8±3.0 U/
ml含有していた。 【０１２６】徐々に100 nMのＭＴＸまで増加させて得た
CHO pDSVL-gHuEPO細胞の培養液を３つの分析に供した。
３日間の試料は、組換えヒトＥＰＯをＲＩＡで3089±12
9 U/ml、イン・ビトロ分析で2589±71.5U/mlおよびイン
・ビボ分析で2040±160 U/ml含有していた。この生成物
のアミノ酸配列は表VIに示したアミノ末端と一致してい
る。 【０１２７】10nMのＭＴＸ中、プラスミドpDSVL-MkE で
トランスフェクションされたＣＨＯ細胞培養済み培地を
プールし、数日間にわたりＭＴＸを透析除去すると、 2
21±5.1 U/ml(EPO-CCM) のＥＰＯ活性がある培地が得ら
れた。正常BALB/cマウスのヘマトクリット値に及ぼすEP
O-CCM のイン・ビボ効果を調べるため、以下の実験を行
なった。トランスフェクションしてないＣＨＯ細胞の細
胞培養済み培地（ＣＣＭ）およびEPO-CCM をＰＢＳで調
製した。ＣＣＭをコントロール群（マウス３匹）に用
い、２つの用量の EPO-CCM(4単位 (Ｕ))の注射および44
単位（Ｕ）の注射）を実験群（１群２匹）に用いた。５
週間の間、７匹のマウスを週３回腹腔内注射した。８回
目の注射後における、コントロール群の平均ヘマトクリ
ット値は50.4％、 4Ｕ群は55.1％、および44Ｕ群は67.9
％であった。 【０１２８】哺乳類細胞の発現生成物は、エタノール勾
配をかけ、好ましくはpH 7でＨＰＬＣ（Ｃ４ ）に付す
ことにより、培地から実質的に精製された形で容易に単
離回収することができる。 【０１２９】予備実験を行ない、ＣＯＳ−１およびＣＨ
Ｏ細胞におけるヒトＥＰＯ遺伝子発現調整培地から得ら
れる組換え糖蛋白質生成物を、ウェスタン・ブロット分
析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによってヒト尿ＥＰＯ単離物
と比較して、その特徴を調べた。これらの研究では、Ｃ
ＨＯ由来ＥＰＯ物質はＣＯＳ−１発現生成物よりもやや
高分子量であったが、この生成物はプールされたヒト尿
抽出物よりもわずかに大きいことが判明した。全ての生
成物はやや不均一であった。シアル酸を除去するための
ノイラミニダーゼ酵素処理により、ほぼ同じ分子量であ
るにもかかわらず、いずれも得られたアシアロヒト尿抽
出物よりも大であるＣＯＳ−１およびＣＨＯ組換え生成
物が得られた。組換えＣＨＯ生成物および尿抽出物生成
物を（両者から炭水化物を全て除去するため）エンドグ
リコシダーゼＦ酵素（ＥＣ 3.2.1）処理して、本質的に
同一の分子量を有する実質的均一生成物を得た。 【０１３０】精製されたヒト尿ＥＰＯおよび本発明によ
る組換え型のＣＨＯ細胞産生ＥＰＯを、ネッサーら：
「アナリチカル・バイオケミストリー」、第 142巻、第
58-67頁、1984年［Nesser, et al., Anal. Biochem.,
142,58-67(1984)］の加水分解方法を用いて修正したレ
ディーンら：「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、
第83巻（Ｄ部）、第139-191 頁、1982年［Ledeen, et a
l., Methods in Enzymology, 83 (Part D), 139-191
(1982) ］の方法により炭水化物分析に供した。尿単離
物について実験的に求めた炭水化物組成値（生成物中の
炭水化物モル比で示される）は次のとおりであった：ヘ
キソース1.73、N-アセチルグルコサミン1 、N-アセチル
ニューラミン酸0.93、フコース 0、およびN-アセチルガ
ラクトサミン0。組換え生成物（100 nMのＭＴＸを含むC
HO pDSVL-gHuEPOの３日間培地から得たもの）の値は次
のとうりであった：ヘキソース15.09 、N-アセチルグル
コサミン1 、N-アセチルニューラミン酸 0.998、フコー
ス0、およびN-アセチルガラクトサミン 0。これらの値
は、上記ウェスタンおよびＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析ともに
一致している。 【０１３１】例 １１ 本例は、表VIに示したヒト種ＥＰＯ配列をコードし、大
腸菌および酵母菌［サッカロマイセス・セレビシエ (S.
cerevisiae)］細胞での発現におけるそれぞれの「優
先」コドンを取込んでいる２つの構造遺伝子ヌクレオチ
ド塩基集合体の全体的製造に関する。また、ヒトＥＰＯ
類縁体をコードする遺伝子の構造についても述べられて
いる。簡単に言うと、用いられたプロトコールは、アル
トンらの開示（1983年11月24日にWO 83/04053 として公
開）に掲載されているものとほぼ同じであった。遺伝子
はまず成分オリゴヌクレオチドを組み立ててマルチプル
・ジュープレックスとし、これを次いで３つの別個のセ
クションに組み立てるように設計した。これらのセクシ
ョンは、容易に増幅するように設計してあり、増幅系か
ら除いてから順番に、あるいは多数フラグメントの結合
により、適切な発現ベクターに構築された。 【０１３２】下記表VIII〜XIV は、いかなるリーダーま
たはプレ配列も欠如しているが、−１位に第一のメチオ
ニン塩基を有するヒトＥＰＯ翻訳生成物をコードする合
成遺伝子の設計と組立体を示している。更に遺伝子は実
質的部分に大腸菌の優先コドンを取込んでおり、このた
めその構築は「ＥＣＥＰＯ」遺伝子と呼ばれる。 【表１６】 【０１３３】 【表１７】 【０１３４】 【表１８】【０１３５】 【表１９】 【０１３６】 【表２０】【０１３７】 【表２１】 【０１３８】 【表２２】【０１３９】更に具体的には、表VIIIは、ヒト種ポリペ
プチドのアミノ末端残基をコードするセクション１のＥ
ＣＥＰＯの遺伝子を得るために用いられるオリゴヌクレ
オチドを示している。オリゴヌクレオチドは二重鎖（１
と２、３と４等）として組立てられ、二重鎖は次いで結
合され、表IXのようなＥＣＥＰＯセクション１が得られ
た。組立てられたセクションは末端ＥcoＲＩ及びＢamＨ
Ｉ付着端をそれぞれ含み、ＥcoＲＩ付着端の「下流」に
はＸbaＩ制限酵素認識部位が存在し、ＢamＨＩ付着端の
「上流」にはＫpnＩ認識部位が存在していることに注目
されたい。セクション１は、このセクションの配列の確
認のために用いられるＭ13ファージベクターを用いて、
容易に増幅させることができた。いくつかの困難な点
が、大腸菌由来ＲＦ ＤＮＡからＸbaＩ／ＫpnＩフラグ
メントとしてセクションを単離する上で現われたが、そ
れはおそらく宿主内でＫpnＩ認識部位塩基がメチル化さ
れるためであろう。一本鎖ファージＤＮＡがしたがって
単離され、プライマー・エクステンション法によりイン
・ビトロで二重鎖型とされ、しかる後所望の二重鎖フラ
グメントが容易に単離された。 【０１４０】ＥＣＥＰＯ遺伝子セクション２および３
（表XIおよびXIII）を、表ＸおよびXII のオリゴヌクレ
オチドからそれぞれ同様の方法で調製した。各セクショ
ンは配列の確認に用いられるＭ13ベクターで増幅され、
ファージＤＮＡから単離された。表XIから明らかなよう
に、ＥＣＥＰＯセクション２はＥcoＲＩおよびＢamＨＩ
付着端から構成されており、ＫpnＩ／ＢglIIフラグメン
トとして単離することができた。同様に、ＥＣＥＰＯセ
クション３をＢamＨＩおよびＳalＩ付着端から調製し、
ＢglII／ＳalＩフラグメントとしてファージＲＦＤＮＡ
から単離することができた。このように調製された３つ
のセクションは、大腸菌翻訳開始のアミノ末端メチオニ
ンコドン（ＡＴＧ）を含み、完全なヒトＥＰＯポリペプ
チドをコードするＤＮＡ連鎖（表 XIV）として容易に組
立てすることができる。開始ＡＴＧの「上流」には、大
腸菌の高度な発現ＯＭＰ−ｆ遺伝子におけるリボソーム
結合部位配列を実質的に複製する一連の塩基対が存在し
ていることにも注目されたい。 【０１４１】適切な発現ベクターを用いてＥＣＥＰＯを
運搬することができる。特定のベクターとして、チャー
ルズ・エフ・モーリス(Charles F. Morris) により1984
年 8月 6日に出願され、同時に係属中の米国特許出願第
636,727 号（公開された欧州特許出願No. 136,490 ）に
記載された、プラスミドpCFM414(A.T.C.C.40076)の誘導
体である「温度感受性」プラスミドpCFM536 をＥＣＥＰ
Ｏ遺伝子発現用に選択した。より具体的にはpCFM536 を
ＸbaＩおよびＨinｄIII で消化し、大フラグメントを単
離して、ＥＣＥＰＯ遺伝子と２つの部分で結合させるの
に用いた。セクション１（ＸbaＩ／ＫpnＩ）、２（Ｋpn
Ｉ／ＢglII）および３（ＢglII／ＳalＩ）をＭ13内で正
確な順序で予め組立てておき、ＥＰＯ遺伝子をそれから
一本のＸbaＩ／ＨinｄIII フラグメントとして単離し
た。このフラグメントは、Ｍ13mp 9ファージ由来のＳal
ＩからＨinｄIII までの部位のポリリンカーの部分を有
していた。得られた発現プラスミドp536による発現の制
御はラムダＰＬ プロモーターによりなされたが、この
プロモーター自体、ＣＩ８５７リプレッサー遺伝子（例
えば、大腸菌株Ｋ１２ΔＨｔｒｐ から得られる）の支
配下にある。 【０１４２】上記合成ＥＣＥＰＯ遺伝子は、下記のよう
な［Ａsn２ 、des-Ｐro２ 〜Ｉle６］ｈＥＰＯおよび
［Ｈis７ ］ｈＥＰＯのようなエリスロポエチン類縁体
をコードするように様々に変更してもよい。Ａ．［Ａsn ２ 、des-Ｐro ２ 〜Ｉle ６ ］ｈＥＰＯ ＸbaＩ〜ＨinｄIII 挿入体として、表 XIVのＥＣＥＰＯ
合成遺伝子を担持するプラスミド 536をＨinｄIII およ
びＸhoＩで消化した。後者のエンドヌクレアーゼは、Ａ
sp８ をコードするコードンの最後の塩基からＡrg１０
コードンの二番目の塩基までの唯一の６塩基対認識部位
においてＥＣＥＰＯ遺伝子を切断する。ＸbaＩ／ＸhoＩ
「リンカー」配列を製造したが、それは次の配列を有し
ていた。 【化４】 【０１４３】ＸbaＩ／ＸhoＩリンカーおよびＸhoＩ／Ｈ
inｄIII ECEPO 遺伝子鎖フラグメントを、チャールズ・
エフ・モーリス(Charles F. Morris) により1984年 8月
6日に出願され、同時に係属中の米国特許出願第636,72
7 号明細書に記載された、プラスミド pCFM414（A.T.C.
C.40076 ）の誘導体であるプラスミドpCFM526 のＸbaＩ
およびＨinｄIII 切断により得られる大フラグメントに
挿入し、所望の類似体のＭet−１型の大腸菌発現をコー
ドするプラスミド担持ＤＮＡ配列を得た。Ｂ．［Ｈis ７ ］ｈＥＰＯ プラスミド 536を、前記ＡのようにＨinｄIII およびＸ
hoＩで切断した。ＸbaＩ／ＸhoＩリンカーを製造した
が、それは次の配列を有していた。 【化５】 【０１４４】リンカーおよびＸhoＩ／ＨinｄIII ECEPO
配列フラグメントを次いでpCFM526に挿入し、所望の類
縁体のＭet−１型の大腸菌発現をコードするプラスミド
担持ＤＮＡ配列を得た。 【０１４５】酵母菌の優先コドンを取込んだ合成遺伝子
（「SCEPO 」）の構造は、以下の表XV〜XXI に示したと
おりである。ECEPO 遺伝子の場合と同様に、完全な構築
には３組のオリゴヌクレオチド（表XV、XVIIおよびXIX
）形成が含まれており、これを二重鎖に形成し、各セ
クション（表 XVI、XVIII およびXX）に組立てた。合成
は、SCEPO およびECEPO の構造においていくらか適合性
のある(sub-optimal) コドン（即ち、各遺伝子における
セクション２のオリゴヌクレオチド１〜６と同様に、各
遺伝子のセクション１のオリゴヌクレオチド 7〜12が一
致する）を用いることにより、部分的に容易化されたこ
とに注目されたい。 【表２３】【０１４６】 【表２４】 【０１４７】 【表２５】【０１４８】 【表２６】 【０１４９】 【表２７】【０１５０】 【表２８】 【０１５１】 【表２９】 【０１５２】組立てられたＳＣＥＰＯセクションがＭ13
にて配列決定され、セクション１、２および３はＨinｄ
III ／ＫpnＩ、ＫpnＩ／ＢglIIおよびＢglII／ＳalＩフ
ラグメントしてファージから単離可能であった。 【０１５３】ＳＣＥＰＯ遺伝子生成物にとり現在好まし
い発現系は、グランド・エー・ビッターにより1983年4
月22日に出願され、同時に欧州特許出願第0123,294号と
して1984年10月31日に公開された、係属中の米国特許出
願第487,753 号明細書に記載されているようなサッカロ
マイセス・セレビシエのα‐因子分泌に基づく分泌系で
ある。簡単に言えば、この系は、酵母α‐因子遺伝子生
成物のリーダー配列をコードするＤＮＡが、発現すべき
外来性遺伝子の暗号領域の 5′側に直接位置している構
造からなる。その結果、翻訳された遺伝子生成物は、余
剰生成物の分泌時に、内在酵母酵素によって「切離され
る」リーダーまたはシグナル配列を含んでいる。この構
築ではα‐因子翻訳開始（ＡＴＧ）コードンを利用して
いるため、ＳＣＥＰＯ遺伝子の−１位にそのようなコー
ドンを付与する必要がなかった。表XXI から明らかにな
るであろうように、アラニン（+1）暗号配列は、α‐因
子プロモーターに続くα‐因子リーダーの最初の80残基
のＤＮＡを含むプラスミドに直接挿入されるリンカー配
列の後にきている。SCEPO 遺伝子発現のための特定の好
ましい構築においては、前記SCEPO セクションフラグメ
ントおよびプラスミド pαＣ３のＨinｄIII ／ＳalＩ消
化による大フラグメントからなる４部分の結合が行なわ
れる。得られるプラスミド pαＣ３／SCEPO から、α‐
因子プロモーター、リーダー配列およびSCEPO 遺伝子を
ＢamＨＩ消化により単離し、ＢamＨＩ消化プラスミド p
ＹＥと連結させて、発現プラスミド pYE／SCEPO を形成
した。 【０１５４】例 １２ 本例は、例１１の発現系における、合成ECEPO およびSC
EPO 遺伝子の組換え生成物の発現に関する。 【０１５５】大腸菌宿主細胞に用いられる発現系におい
て、例１１のプラスミド p536 を、ＣＩ８５７遺伝子を
有する適切なプラスミド pMW1 で予めトランスフォーメ
ーションされたＡＭ7 大腸菌細胞に移入させた。ＬＢブ
ロス（アンピシリン50μｇ／mlおよびカナマイシン５μ
ｇ／ml、好ましくは 10mM MgSO４ も添加）中の培養細
胞を28℃に維持し、 OD. 600＝0.1 となるまで培養細胞
が増殖してから、培養温度を42℃に上げてＥＰＯ発現を
誘導した。約40 OD.まで増殖した細胞は、約５mg/OD.リ
ットルのＥＰＯ生成物（ゲルで評価）を産生した。 【０１５６】細胞を採取し、分離し、フレンチプレス
（10000psi）で破壊し、リゾチームおよびＮＰ‐40界面
活性剤で処理した。24000 xg遠心分離で得たペレットを
塩酸グアニジンで溶解し、Ｃ４ （バイダック、Ｖyda
c）リバース・フェース（ReversePhase ）ＨＰＬＣ（エ
タノール 0〜80％、50mM ＮＨ4 Ａｃ、pH 4.5）により
一工程で更に精製した。分離した蛋白質は95％以上純粋
な生成物であり、得られた生成物は、約３：１の量比
で、二つの異なるアミノ末端 A-P-P-R……および P-P-R
……を有していた。ｈＥＰＯおよび［ desＡla１ ］ｈ
ＥＰＯ生成物についての後者の観察は、宿主細胞におけ
るアミノ末端「プロセッシング」が、末端メチオニンお
よびある場合には開始アラニンを除去するように作用す
ることを示している。単離物のラジオイムノアッセイ活
性は150000〜160000 U／mgであり、イン・ビトロ分析活
性では 30000〜62000 U/mgであり、更にイン・ビボ分析
活性では約 120〜720 U/mgであった（参考のために、各
分析におけるヒト尿単離物標準は70000 U/mgである）。
イン・ビボ分析における組換え生成物の用量応答曲線
は、ヒト尿ＥＰＯ標準のものとは著しく異なっていた。 【０１５７】例１１のＡおよびＢで形成されたＥＰＯ類
似プラスミドを、 pＭＷ１でトランスフォーメーション
されたＡＭ7 大腸菌細胞にそれぞれ移入させ、細胞を上
記のように培養した。精製単離物をＲＩＡおよびイン・
ビトロ分析で試験した。［Ａsn２ 、des-Ｐro２ 〜Ｉle
６ ］ｈＥＰＯ発現生成物のＲＩＡおよびイン・ビトロ
分析値はそれぞれ約11000 U/mgおよび6000 U／mg蛋白質
であったが、［Ｈis７］ｈＥＰＯの分析値はそれぞれ約
41000 U/mgおよび14000 U/mg蛋白質であって、類似生成
物が分析によると「親」発現生成物の 1/4〜1/10「活
性」であることが示された。 【０１５８】サッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞に
用いられる発現系において、プラスミド pYE／SCEPO を
二つの異なる株、即ち、YSDP4 （遺伝子型α pep4-3 tr
p1）およびＲＫ81（遺伝子型ααpep4-3 trp1 ）に移入
させた。トランスフォーメーションされたYSDP4 宿主
を、カザミノ酸が 0.5％添加されたpH 6.5のＳＤ培地
［ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー所在、
コールドスプリングハーバーラボラトリー、「酵母遺伝
学の方法(Methods in Yeast Genetics) 、第62頁、1983
年］で30℃にて増殖させた。細胞が36 OD.まで増殖した
ときに採取した培地は、ＥＰＯ生成物を約244 U/ml（Ｒ
ＩＡで97μｇ／OD・リットル）含有していた。6.5 OD.
または60 OD.まで増殖した形質転換ＲＫ81細胞は、約80
〜90 U／mlのＥＰＯ濃度（ＲＩＡで34μｇ／OD・リット
ル）の培地を与えた。予備分析では、発現系により得ら
れる生成物は極めて不均一であったが、それはおそらく
発現される蛋白質のグリコシル化が様々であり、関連す
る炭水化物の中でマンノース含量が比較的高かったため
であろう。 【０１５９】ＨＢ 101大腸菌細胞に含まれるプラスミド
ＰαＣ３ および pＹＥを、1984年9月27日に米国特許庁
施行規則に従い、それぞれ受託番号A.T.C.C. No.39881
およびA.T.C.C.No.39882として、メリーランド州、ロッ
クビル、パークローン・ドライブ12301 のアメリカン・
タイプ、カルチャー・コレクション（American Type Cu
lture Collection）に寄託した。ＡＭ7 細胞中のプラス
ミド pCFM 526 、ＪＭ103 細胞中のpCFM 536およびＪＭ
103細胞のpMW1を同様に、それぞれ A.T.C.C. No.3993
2、No.39934および No.39933 として、1984年11月21日
に寄託した。サッカロマイセス・セレビシエ株YSPD4 お
よびＲＫ81をそれぞれA.T.C.C. No.20734 およびNo.207
33として1984年11月21日に寄託した。 【０１６０】前述のように、本発明の組換え体由来生成
物は、天然源からのＥＰＯ単離物のイン・ビトロ生物学
的活性を様々な程度で保有しており、したがって赤血球
形成細胞の増殖に用いられる培地において、ＥＰＯ単離
物に対する代替物としての利用性を有するものと考えら
れる。同様に、本発明のポリペプチド生成物が天然ＥＰ
Ｏ単離物のイン・ビボ活性を有する範囲内において、そ
れらはヒトをはじめとする哺乳動物におけるエリスロポ
エチン治療処置に用いるのに極めて好適であり、イン・
ビボでのＥＰＯに起因する効果、例えば、網状赤血球応
答の刺激、鉄動態効果の促進（例えばプラズマ鉄回転効
果および骨髄通過時間効果）、赤血球質量変化、ヘモグ
ロビン合成促進および例１０に示した哺乳動物における
ヘマトクリット値の増加などのあらゆる効果を促進させ
る。本発明の生成物で治療可能なヒトの分類の中には、
一般に輸血を要する患者、外傷者などの外科患者、透析
患者などの腎疾患患者並びに血友病、鎌型赤血球病及び
生理学的貧血などのような各種血液組成に影響を及ぼす
疾患の患者が含まれる。ＥＰＯ治療の採用による輸血治
療の必要性の最小化は感染物質による感染の抑制につな
がると期待される。本発明の生成物は、組換え法により
生産されたものであるため、発熱物質、天然阻害物質等
が混入しておらず、このため天然由来生成物と比べ、高
い総合的な治療効果を発揮すると予想される。本発明の
生成物によるエリスロポエチン治療は、低酸素環境条件
下にある個体において酸素供給能を高め、更には可能性
として有益な心臓脈管系効果をもたらすと期待される。 【０１６１】本発明のポリペプチド生成物を投与するた
めの好ましい方法は、非経口投与（例えば、静注、筋
注、皮下注または腹腔内注）であり、投与される組成物
には、治療有効量の生成物が、許容される希釈剤、担体
および／またはアジュバントとともに通常含有されてい
る。有効量は治療条件によって実質上変動すると思われ
るが、治療量は実際には活性物質の7U〜7000 U／kg体重
の範囲内であると予想される。ヒト血清アルブミンのよ
うな標準的希釈剤が本発明の医薬組成物用として考えら
れ、生理的食塩水のような標準的担体が同様に考えられ
る。 【０１６２】本発明の組成物に使用するのに好適なアジ
ュバント物質には、テストステロン、前駆細胞刺激剤、
インシュリン様成長因子、プロスタグランジン類、セロ
トニン、サイクリックＡＭＰ、プロラクチンおよびトリ
ヨードチロニンのように赤血球生成刺激効果に関して独
立に注目される化合物、並びにメテノレン、スタノゾロ
ールおよびナンドロロンのように、再生不良性貧血の治
療に一般に用いられる薬物が含まれる。 【０１６３】更にアジュバントとして考えられるものに
は、アドレナリン作動性物質、甲状線ホルモン、男性ホ
ルモンおよびＢＰＡのように、エリスロポエチンまたは
アシアロ‐ＥＰＯの効果を高めること、あるいは補強す
ること、が報告された物質並びに「肝造血因子」と目さ
れる化合物類、「エリスロトロピン類」（Erythrotropi
ns）および「エリスロジェニン類」(erythrogenins) が
挙げられる。 【０１６４】本発明ポリペプチドの診断的用途も同様に
広範であり、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ等の各種イムノア
ッセイ技術、並びに各種のイン・ビトロおよびイン・ビ
ボ活性分析において標識および未標識型での使用が挙げ
られる。 【０１６５】本発明の他の面によれば、ここに記載され
た、ヒトおよびサルＥＰＯポリペプチドをコードするク
ローンＤＮＡ配列は、天然生成物の単離物についての数
10年間にわたる分析にもかかわらず今まで利用できなか
った哺乳類エリスロポエチンアミノ酸配列に関し、それ
らが与える情報において極めて価値が高い。このＤＮＡ
配列はまた、各種組換え技術によって大量のエリスロポ
エチンを微生物合成するのに役立つ生成物としても極め
て価値がある。即ち、本明細書で示したＤＮＡ配列は、
新規でかつ有用なウィルス性および環状プラスミドＤＮ
Ａベクター、新規でかつ有用なトランスフォーメーショ
ンおよびトランスフェクションされた原核ならびに真核
宿主細胞（培地で増殖される細菌、酵母細胞および哺乳
類細胞が含まれる）およびＥＰＯ、並びにＥＰＯ生成物
の発現が可能な微生物宿主細胞の新規でかつ有用な培養
増殖方法を得る上で有益である。本発明のＤＮＡ配列
は、ここに具体的に説明したヒトおよびサル種以外の哺
乳動物種におけるＥＰＯおよび関連蛋白質をコードする
cＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列を単離する上で、標識
化プローブとして使用するのに極めて適した物質でもあ
る。本発明のＤＮＡ配列が、各種の別の蛋白質合成方法
において（例えば昆虫の細胞）、あるいはヒトおよび他
の哺乳動物の遺伝子治療において使用される範囲は計算
できない。本発明のＤＮＡ配列は、エリスロポエチンお
よびエリスロポエチン生成物を大量に産生する真核「宿
主」として機能する遺伝子変異哺乳動物種を得る上で有
用であると予想される。一般的には、パーミターら：
「サイエンス」、第222 巻、第4625号、第 809-814頁、
1983年［Palmiter, et al., Science, 222(4625), 809-
814(1983)］参照。 【０１６６】この観点からすれば、したがって、特定の
実施例の開示は本発明の範囲を制限するものでないこと
は明白であり、多数の改変および変更が当業者において
考えられる。一例として、実施例で得られるＤＮＡ配列
は cＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列を含み、それは本発
明がＤＮＡ配列の製造に必要なアミノ酸配列情報を提供
するためのものだからであるが、本発明にはＥＰＯアミ
ノ酸配列の情報に基づいて調製されるような合成ＤＮＡ
配列も含まれる。 【０１６７】同様の意味で、前記諸例は、細菌性プラス
ミドおよびウィルス性ゲノム起源のハイブリッドベクタ
ーに挿入されたＤＮＡの哺乳動物細胞発現に関し、ＥＰ
Ｏ生成物を微生物発現させる発明を説明するものである
が、広範な発現系が本発明の概念の中に含まれる。特
に、培養された各種細菌、酵母菌及び哺乳動物細胞に適
用される均一源からのベクターを含む発現系、及びベク
ターを含まない発現系（例えば、リン酸カルシウムでト
ランスフェクションされた細胞）が含まれる。 【０１６８】本発明のハイブリッド形成改良方法は、実
際には上記ＤＮＡ／ＤＮＡスクリーニングに用いられた
が、これはＲＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＤＮＡスクリ
ーニングにて同様に適用可能である。ここに説明したよ
うな混合プローブ技術は、一般に、より迅速にかつ信頼
をもってポリヌクレオチドを単離できるハイブリッド形
成過程において多くの改良点を有している。これらの多
数の個々の操作上の改良点としては、改良されたコロニ
ー移転および保存方法、および同様のフィルターで再プ
ローブ化でき、フィルターの繰返し使用が可能で、新規
なプロテアーゼ処理の適用を可能にするジーンスクリー
ン(Gene Screen) およびジーンスクリーン・プラス（Ge
ne Screen Plus）のようなナイロン基質フィルターの使
用［例えば、タウブら：「アナリテイカル・バイオケミ
ストリー」、第126 巻、第 222-230頁、1982年［Taub,
et al., Anal. Biochem., 126, pp222-230 (1982)］と
比較されたい］、多数の混合プローブ（例えば、32種類
を超える数）のそれぞれの極めて低い濃度（0.025 ピコ
モルのオーダー）での使用、および、用いられる全ての
混合プローブの中の最低の計算解離温度に非常に近い厳
格なる温度下での（即ち、それより４℃以内、好ましく
は２℃以内での）ハイブリダイゼーションおよびポスト
ハイブリダイゼーション工程の実施、が挙げられる。こ
れらの改良点を組合わせると、それらの実施によるもの
とは予想できない程の結果が得られる。このことは、比
較的低めの充分量なるメッセンジャーＲＮＡ種に cＤＮ
Ａスクリーンを用いると好結果が得られたと今までに報
告されたプローブ数の４倍量を含む混合プローブ操作
を、 1,500,000のファージプラークのゲノムライブラリ
ースクリーニングにおいて唯一の遺伝子配列を単離する
のに適用して成功した、という事実により詳細に説明さ
れる。この偉業は、アンダーソンらの、「混合プローブ
スクリーニング法は相当するＲＮＡの遺伝子が利用でき
ない限り、哺乳類蛋白質遺伝子を単離するのは実際上不
可能である」との論評の公開と実質上同時に行なわれた
ものである。（アンダーソンら：「P.N.A.S 」、米国、
第80巻 第6838-6842 頁、1983年） 【０１６９】 【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kirin-Amgen Inc. <120> Process for preparing mammalian cells capable of producing human erythropoietin <130> PA01-261 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
ポエチンをコードするＤＮＡ（配列）及びそれから推定
される該エリスロポエチンのアミノ酸配列を知見したこ
とに基づくものである。 【０００２】本発明は上記知見に基づき、組換ＤＮＡ技
術を利用した、ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞
の作製方法に関するものである。 【０００３】 【従来の技術】血球増生、即ち赤血球の産生は、人間が
生きている限り、細胞破壊を補うために継続して行なわ
れる。血球増生は、循環を妨げる程多くはない充分な数
の赤血球を、適切な組織に酸素供給する血液中で利用可
能にさせる、非常に正確に制御された生物学的メカニズ
ムである。赤血球の産生は骨髄で行なわれ、ホルモン、
即ちエリスロポエチンで制御されている。 【０００４】エリスロポエチンは分子量約34,000ダルト
ンの酸性糖蛋白質であって、組織が実在数の赤血球から
充分な酸素供給を受けている健康状態に体がある場合、
血漿中において極めて低濃度で存在している。この正常
な低濃度であっても、普通時間を経るにつれて減少する
赤血球の補充を促進するには充分である。 【０００５】エリスロポエチンの循環量は、血球の循環
による酸素輸送量が減少する低酸素症状態下では増加す
る。低酸素症は、出血による多量の血液の喪失、放射線
への過度露出による赤血球の破壊、高所もしくは長期の
意識喪失による酸素摂取量の減少又は各種貧血によって
起こる可能性がある。組織が低酸素ストレスを受ける
と、エリスロポエチンは、骨髄中の原始前駆細胞が、前
赤芽球（前赤芽球はひき続いて成熟し、ヘモグロビンを
合成し、赤血球として循環系に放出される）に変換され
るのを促進することにより、赤血球の産生を増大させ
る。循環系の赤血球数が正常組織での酸素要求量よりも
多い場合は、循環系エリスロポエチンは減少する。 【０００６】エリスロポエチンは赤血球形成過程で欠か
せないものであるため、このホルモンは赤血球の産生能
が低く又は欠陥がある血液疾患の診断及び治療に有効に
適用することができる。 【０００７】最近の研究により、各種の病態、疾患及び
血液異常状態において、エリスロポエチン治療の有効性
を予想する基礎が与えられた。 【０００８】血漿又は尿から高収率でエリスロポエチン
を得ようとする以前の試みは不成功に終った。複雑で高
度な実験技術が必要とされるが、一般には不純で不安定
な微量のエリスロポエチン含有抽出物を集められるにし
かすぎない。 【０００９】米国特許第3,033,753 号明細書には、ヒツ
ジ血漿からエリスロポエチンを部分的に精製するための
方法が記載されているが、低収率でエリスロポエチン含
有粗製固体抽出物が得られただけである。 【００１０】尿からエリスロポエチンを単離する初期の
試みでは、不安定で生物学的に不活性なそのホルモン調
製物が得られた。米国特許第3,865,801 号明細書には、
尿から回収されたエリスロポエチン含有粗製物質の生物
学的活性を安定化させる方法が開示されている。得られ
るエリスロポエチン含有粗製物は、称するところでは、
90％のエリスロポエチン活性を有しており、しかも安定
である。 【００１１】再生不良性貧血患者の尿からヒトエリスロ
ポエチンを精製する別の方法が、ミヤケら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ、第252 巻、第
15号、pp 5558-5564（1977年 8月10日）［Miyake, et a
l., J.Biol.Chem., Vol 252,No.15, pp 5558-5564］に
記載されている。この７工程の操作には、イオン交換ク
ロマトグラフィー、エタノール沈澱、ゲル濾過及び吸着
クロマトグラフィーが含まれ、21％の収率で、70,400単
位／mgの比活性がある純粋なエリスロポエチン調製物が
得られている。 【００１２】タケザワらの米国特許第4,397,840 号明細
書には、弱塩基性イオン交換物にて健康なヒトの尿試料
から「エリスロポエチン生成物」を製造する方法が記さ
れており、エリスロポエチン阻害効果のない低分子量生
成物が得られたと述べている。 【００１３】1982年 5月 6日に公開されたスギモトらに
よる英国特許出願第2,085,887 号明細書には、ハイブリ
ッドヒトリンパ芽球細胞の産生方法が述べてあり、哺乳
類宿主増殖物が10７ 細胞／mlとなった後、培地に分配
された細胞懸濁液１ml当り 3〜420 単位のエリスロポエ
チン産生量があると報告されている。達成されたとする
最大の産生レベルでは、エリスロポエチン産生速度は、
イン・ビボ増殖系から細胞が移し変えられたイン・ビト
ロ培地において、40〜4,000 単位／10６ 細胞／48時間
と計算された（対応する米国特許第4,377,513 号明細書
も参照）。多数の提案が新生物細胞をはじめとする組織
源からエリスロポエチンを単離するためになされたが、
収率は極めて低かった。 【００１４】精製エリスロポエチンの取得のために利用
される他の単離技術としては、免疫学的操作がある。エ
リスロポエチンに対する「モノクローナル」抗体を得る
ために細胞融合とハイブリッド形成技術を用い、更にヒ
トエリスロポエチンの単離と定量化のためにこれらの抗
体を用いる試みが行なわれた。 【００１５】ポリクローナル及びモノクローナル抗体
は、エリスロポエチンの定性及び定量のためのイムノア
ッセイに使用され、更にエリスロポエチンのアフィニテ
ィー精製においても有用性を有する。しかしながら、詳
細な分析、臨床試験及び、例えば、疾患組織がエリスロ
ポエチン産生をになうことができない慢性腎疾患の治療
のような、該物質の潜在的に広範な治療用途にとって充
分なだけ多量のエリスロポエチンを哺乳類源から単離す
る目的には、前記抗体を有効に活用することは難しいと
考えられている。したがって、哺乳類エリスロポエチン
を充分に特定化でき、しかも可能性のある診断及び臨床
的用途のためにそれを大量に供給する為には、大規模な
哺乳類エリスロポエチンの微生物による大規模な合成を
もたらす組換え操作の実用化を成功させる必要がある
と、当業者間では考えられている。 【００１６】ヒト及び他の哺乳類のエリスロポエチンを
コードしているＤＮＡ配列を実験的に単離する実質的な
努力がこれまでなされてきたが、誰もまだ成功していな
い。これは主に、エリスロポエチンをコードするＤＮＡ
配列を従来の技術により単離することのできる cＤＮＡ
ライブラリーを構成し得る mＲＮＡに富む組織源、特に
ヒト組織源、の欠乏に起因するものである。更に、エリ
スロポエチンのアミノ酸残基連鎖についてはほとんど未
知であるため、例えば cＤＮＡ特にゲノムＤＮＡライブ
ラリーのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションスクリ
ーニングにおいて安心して直ちに使用することができる
長鎖ポリヌクレオチドプローブを調製することができな
いことによる。エリスロポエチンのためのヒト遺伝子は
ヒトゲノム内で「単一の遺伝子」として存在しているら
しく、いかなる場合も、ヒトエリスロポエチンをコード
する遺伝子物質はゲノムライブラリーに存在する総ヒト
ゲノムＤＮＡの 0.00005％未満を構成するにしかすぎな
いと推定される。 【００１７】現在までのところ、単離可能量の哺乳類エ
リスロポエチンの微生物発現における使用に適したＤＮ
Ａ配列を与える組換え関連方法において、最も成功した
既知報告例でも、目標にはほど遠いものであった。一例
として、ファーバーら：「エクスペリメンタル・ヘマト
ロジー」、第11巻、第14増刊号、抄録 101、1983年［Fa
rber, et al., Exp. Hematol.,11, Supp. 14, Abstract
101(1983)］では、フェニルヒドラジン処理ヒヒの腎臓
組織から mＲＮＡを抽出し、この mＲＮＡをアフリカツ
メガエル(Xenopus laevis)卵母細胞に注入したが、それ
らの中に含まれるエリスロポエチンの生物学的性質を示
す「翻訳生成物」の混合体がイン・ビトロで産生するの
はむしろ一時的な結果であったと報告している。更に最
近において、ファーバーら：「ブラッド」、第62巻、第
５号、第１増刊号、抄録 392、第122a頁、1983年［Farb
er, et al., Blood,62, No.5, Supp. No.1, Abstract 3
92, at page 122a (1983) ］は、カエル卵母細胞による
ヒト腎臓 mＲＮＡのイン・ビトロ翻訳について報告し
た。その得られた翻訳生成混合体には、注入された mＲ
ＮＡ 1μｇ当り、エリスロポエチン活性を有する翻訳生
成物が220 mU含有されていると推定された。エリスロポ
エチンをコードしている外来性 mＲＮＡのこのようなイ
ン・ビトロ翻訳量が（従来報告された、必要とする生成
物へのヒヒ mＲＮＡ翻訳量と比べて）著しく低いと認め
られたが、この結果は、ヒト腎臓を、所望の遺伝子が単
離され得る豊富なヒト腎 cＤＮＡライブラリーの構成を
可能にするエリスロポエチン発現部位としてみなさせる
ものであると考えられた［ファーバー：「クリニカル・
リサーチ」、第31巻、第４号、第769A頁、1983年［Farb
er, Clin. Res., 31(4) , 769A (1983) ］も参照］。 【００１８】米国特許出願第561,024 号及び第582,185
号の出願以後、大腸菌内で、ヒトエリスロポエチン cＤ
ＮＡとみなされていた物質のクローニングと発現に関す
る一つの報告がなされた。簡単に言えば、多数の cＤＮ
Ａクローンが大腸菌プラスミドに挿入され、β‐ラクタ
マーゼ融合生成物がヒトエリスロポエチンの非特異的
「エピトープ」に対するモノクローナル抗体と免疫応答
性を有することに着目されたのである。リー‐ファン：
「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ」（米国）、第81巻、第2708-271
2 頁、1984年［Lee-Huang, Proc. Nat. Acad. Sci. (U.
S.A), 81, pp2708-2712 (1984)］参照。 【００１９】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
エリスロポエチン産生哺乳動物細胞の作製方法を提供す
ることである。 【００２０】 【課題を解決するための手段】本発明は、下記の(1)か
ら(6)を提供する。 【００２１】(1) ヒトエリスロポエチンをコードする
ＤＮＡと、ヒトエリスロポエチンプロモーター以外の転
写制御配列との機能的結合を哺乳動物細胞中に生ぜしめ
る工程を含むことを特徴とする、ヒトエリスロポエチン
産生哺乳動物細胞の作製方法。 【００２２】(2) 前記ヒトエリスロポエチンをコード
するＤＮＡと、ヒトエリスロポエチンプロモーター以外
の転写制御配列との機能的結合の近傍に薬剤耐性遺伝子
をコードするＤＮＡ配列を配置し、薬剤の添加により遺
伝子増幅を生ぜしめる工程をさらに含むものである、
(1)に記載の方法。 【００２３】(3) 前記薬剤耐性遺伝子が、ジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子であり、前記薬剤がメトトレキセ
ートである、(2)に記載の方法。 【００２４】(4) 前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳
動物細胞が、ラジオイムノアッセイによる測定におい
て、１０6個の細胞あたり48時間に１００Ｕを超えるヒ
トエリスロポエチンを培地中に産生するものである、
(1)に記載の方法。 【００２５】(5) 前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳
動物細胞が、ラジオイムノアッセイによる測定におい
て、１０6個の細胞あたり48時間に５００Ｕを超えるヒ
トエリスロポエチンを培地中に産生するものである、
(1)に記載の方法。 【００２６】(6) 前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳
動物細胞が、ラジオイムノアッセイによる測定におい
て、１０6個の細胞あたり48時間に１０００Ｕを超える
ヒトエリスロポエチンを培地中に産生するものである、
(1)に記載の方法。 【００２７】 【発明の実施の形態】本発明は、その対立遺伝子変異体
をも含む天然エリスロポエチンの一次構造形状（即ち、
アミノ酸残基の連続配列）の一部もしくは全部、及び一
以上の生物学的性質（例えば、免疫学的性質並びにイン
・ビボ及びイン・ビトロでの生物学的活性）を有する新
規な精製単離されたポリペプチド生成物をはじめて提供
するものである。これらのポリペプチドは、ゲノムＤＮ
Ａもしくは cＤＮＡのクローニング又は遺伝子の合成に
よって得られる外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿
主での発現生成物（例えば、細菌、酵母、及び哺乳類の
培養細胞による）であるということによっても独特に特
徴づけられる。脊椎動物（例えば、哺乳類及び鳥類）細
胞における微生物発現生成物は、自然の哺乳類細胞環境
又は血漿もしくは尿のような細胞外液におけるエリスロ
ポエチンと関連性があるであろうヒト蛋白質又は他の夾
雑物とは全く関係がないということによって、更に特徴
づけられるかもしれない。典型的な酵母［例えば、サッ
カロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae
）］又は原核生物（例えば、大腸菌）を宿主細胞とす
る生成物は、いかなる哺乳類の蛋白質とも関連性を有し
ていない。使用する宿主によっては、本発明のポリペプ
チドは哺乳類もしくは他の真核生物の炭水化物によって
グリコシル化され、あるいはグリコシル化されないかも
しれない。本発明のポリペプチドはまた、最初にメチオ
ニンアミノ酸残基（１番目の位置）を含んでいてもよ
い。 【００２８】本発明の新規な糖蛋白質生成物には、その
一以上の生物学的性質が得られるのに充分な天然（例え
ばヒト）エリスロポエチンの複製である一次構造形状を
有し、天然（例えばヒト）エリスロポエチンのそれとは
異なる平均的炭水化物組成を有するものが含まれる。 【００２９】本発明により得られる脊椎動物（例えば、
ＣＯＳ−１及びＣＨＯ）細胞は、イン・ビトロで継続し
た増殖が可能であって、培地で増殖させた場合、それら
の培地中にて、ラジオイムノアッセイにより48時間で10
６ 個の細胞当り 100単位以上（好ましくは 500単位以
上、最も好ましくは1000〜5000単位以上）のエリスロポ
エチンを産生することができる、常に入手し得る最初の
細胞である。 【００３０】更に、本発明によって、初めて解明された
エリスロポエチンアミノ酸残基の連続配列の全体的もし
くは部分的複製である合成ポリペプチドが提供される。
これらの配列は、天然エリスロポエチンの一次、二次又
は三次構造形状特性を有しているため、治療及び免疫過
程でエリスロポエチンの生物学的活性なもしくは免疫学
的な代用物として用いられるような、天然産物に共通し
た生物学的活性及び（又は）免疫学的性質を有している
であろう。これに付随して、標準的手段によって得ら
れ、このようなポリペプチドと免疫応答し、好ましくは
天然エリスロポエチンとも免疫応答するモノクローナル
及びポリクローナル抗体が提供される。 【００３１】本発明では、サル及びヒト種起源のクロー
ンＤＮＡ配列並びにそれから適切に誘導されたポリペプ
チド配列についても解明しており、それらはそれぞれサ
ル及びヒト種起源エリスロポエチンの一次構造形状を表
わしている。 【００３２】更に本発明により、本発明のＤＮＡ配列を
取り込んだ新規な生物学的機能性のウィルス及び環状プ
ラスミドＤＮＡのベクター、並びにそのようなベクター
により安定にトランスフォーメーション又はトランスフ
ェクションがなされた微生物（例えば、細菌、酵母及び
哺乳類の細胞）宿主生物も提供される。これに対応し、
このようなトランスフォーメーション又はトランスフェ
クションされた微生物宿主を培養増殖させ、増殖培地、
細胞ライセート又は細胞膜画分から所望のポリペプチド
を単離することからなる有用なポリペプチドの新規製造
方法が、本発明によって提供される。 【００３３】上記方法で得られる微生物発現ポリペプチ
ドの単離精製は、例えばプレパラティブ・クロマトグラ
フィー分離、並びにモノクローナル及び（又は）ポリク
ローナル抗体調製物を用いる免疫学的分離のような従来
の手段によって行なってもよい。 【００３４】エリスロポエチンのアミノ酸残基配列が解
明されたので、本発明により、エリスロポエチンをコー
ドするＤＮＡ配列の全体的及び（又は）部分的製造がな
されるが、そのＤＮＡ配列には、選ばれた非哺乳類宿主
による発現に「好適な」コードンの取り込み、制限エン
ドヌクレアーゼ酵素による開裂部位の具備及び容易に発
現するベクターの構築を容易にする別の開始、終末又は
中間ＤＮＡ配列の具備というような有利な特性が備えら
れている。これに伴い、本発明は、一以上のアミノ酸残
基の同一性又は位置に関して天然型とは異なるが、天然
型の一部もしくは全部の性質を有しているエリスロポエ
チンポリペプチド類似体もしくは誘導体（即ち、エリス
ロポエチンのアミノ酸残基の１以上の欠失、及び／又は
エリスロポエチンの１以上の特定の残基の他の残基との
置換、及び／又は１以上のアミノ酸残基のエリスロポエ
チンポリペプチドの末端部への付加、及び／又は１以上
のアミノ酸残基のエリスロポエチンポリペプチドの中間
部位への挿入により得られるエリスロポエチンポリペプ
チド類似体もしくは誘導体）の微生物発現をコードして
いるＤＮＡ配列の製造法（並びに cＤＮＡ及びゲノムＤ
ＮＡの部位特定突然変異誘発による生成法）を提供す
る。 【００３５】本発明のＤＮＡは、微生物宿主細胞におけ
る発現によって、天然ヒトエリスロポエチンの生物学的
性質を有するポリペプチド生成物を産生させることので
きる配列であって、具体的には、表VII にヒトＥＰＯポ
リペプチドとして示したアミノ酸配列（−27〜166 又は
1〜166 ）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列（縮
重を含む）であり、ゲノムＤＮＡ、 cＤＮＡ、及び、一
部又は全部が化学合成によるＤＮＡを含む。特に微生物
宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、好ましくは、該塩
基配列が前述の−27〜166 のアミノ酸配列をコードする
もの（例えば、表VIに示したゲノムＤＮＡ、及び表VI′
に示したイントロンを含まないＤＮＡ配列を挙げること
ができる）を用いる。 【００３６】本発明には、エリスロポエチン治療、具体
的には貧血症の状態及び最も具体的には慢性腎疾患を伴
うような貧血状態の治療に使用し得る、本発明のポリペ
プチド生成物の治療上有効量と薬学上許容される希釈
剤、及びアジュバント及び（又は）担体とからなる医薬
組成物も含まれる。 【００３７】本発明のポリペプチド生成物は、固体組織
及び血液又は尿のような液体試料中のエリスロポエチン
の定性及び定量に有用な試薬とするために、検出可能な
マーカー物質と共有結合させて標識化してもよい（例え
ば１２５Ｉで放射線標識化する。）。本発明のＤＮＡ生
成物もまた、（放射線標識及びビオチンのような非同位
元素標識のような）検出可能なマーカーで標識化されて
いてもよく、ヒト、サル及び他の哺乳類種の染色体地図
におけるエリスロポエチン遺伝子座及び（又は）それに
関連したすべての遺伝子群の座を決定するために、ＤＮ
Ａハイブリダイゼーション過程で用いられてもよい。そ
れらはまた、ＤＮＡレベルにおけるエリスロポエチン遺
伝子の欠陥を見出すために用いることができ、更には隣
接する遺伝子及びそれらの欠陥を見出すための遺伝子マ
ーカーとして用いることもできる。 【００３８】本明細書で詳細に記するように、本発明で
は更に、マルチプル一本鎖ポリヌクレオチドを含む不均
一な細胞もしくはウィルス試料において、配列未知の特
定の一本鎖ポリヌクレオチドを検出するための重要な改
良方法も提供するが、この方法は下記のとおりである。 (a) 一様に変異した塩基鎖を有する標識化一本鎖ポリヌ
クレオチドプローブの混合体が調製される。このプロー
ブの各々は、被検ポリヌクレオチドに独特である、と推
定される塩基配列に対して潜在特異的に相補的である。 (b) 試料が固体基質に固定される。 (c) 前記基質が、該試料のポリヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションによらないで、ポリヌクレオチドが更
にそれと結合するのを抑制するように処理される。 (d) 処理済みの基質を、全体的に相補性のポリヌクレオ
チド間でのみハイブリッド形成し易い条件下で、一時的
に前記標識化プローブの混合体と接触させる。次いで (e) 特定のポリヌクレオチドが、それと該標識化プロー
ブ混合物内の全体的に相補的なプローブとのハイブリッ
ド形成反応の存在を確認することによって検出される。
これは標識化プローブの基質との非特異的結合に起因す
る標識化物質の背景密度と比較して特定のポリヌクレオ
チド位置における基質上の標識化物質の密度が高いとい
うことにより証明される。 【００３９】この操作は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／Ｒ
ＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形成において、17
〜20塩基を有する64、 128、 256、 512、1024又はそれ
以上の混合ポリヌクレオチドプローブを使用することが
指示された状況下で特に有効である。 【００４０】以下に記すように、上記改良方法により、
サル種起源のエリスロポエチンをコードし、貧血サル腎
細胞 mＲＮＡから誘導されたライブラリー内の cＤＮＡ
クローンを実際に同定することができた。より具体的に
は、ヒトエリスロポエチンのフラクションを配列決定し
て導かれたアミノ酸配列情報に基づく、 128種類の一様
に変異した20-merプローブ混合体が、コロニーハイブリ
ダイゼーション操作で用いられ、合計 200,000のコロニ
ーの中から７つの「＋（陽性）」エリスロポエチン cＤ
ＮＡクローンが同定された。更に特記すべきは、本発明
の改良方法を実施することにより、ヒトゲノムライブラ
リーを構成する 1,500,000のファージプラークのスクリ
ーニングの中から３つの陽性クローンを迅速に単離する
ことができたことである。これは、ヒトエリスロポエチ
ンの別の連続配列のアミノ酸分析による第二の 128種類
の17-merプローブと一緒に上記した 128種類の20-merプ
ローブ混合体を用いて実現されたものである。 【００４１】上記で説明した操作は、哺乳類ゲノムクロ
ーンを単離するためのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成
過程において、多数の混合オリゴヌクレオチドプローブ
を使用した最初の例であり、しかも cＤＮＡクローンの
単離において32種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ
混合体を使用した最初の例である。 【００４２】本発明によれば、ヒト及びサルの天然エリ
スロポエチン（ＥＰＯ）のポリペプチド配列の全部をコ
ードしているＤＮＡ配列が単離され、特定化された。 【００４３】サル種起源のＤＮＡは、化学的に誘導され
た貧血状態を呈し、その血清が免疫学的測定によると正
常なサル血清と比べて高レベルのＥＰＯを含有するサル
の腎組織から得られた mＲＮＡにより構成された cＤＮ
Ａライブラリーから単離された。ＥＰＯをコードするＤ
ＮＡを含む所望 cＤＮＡクローンの単離は、128 種類が
混合され、放射線標識化された20-merのオリゴヌクレオ
チドプローブのプールを用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡコロニ
ーハイブリダイゼーションにより実現されたが、200,00
0 コロニーの迅速なスクリーニングが必要とされた。オ
リゴヌクレオチドプローブの設計は、少量のヒトＥＰＯ
試料の酵素的切断とアミノ酸配列決定により得られたア
ミノ酸配列情報に基づいた。 【００４４】ヒト種起源のＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡラ
イブラリーから単離された。ＥＰＯをコードするＤＮＡ
を含むクローンの単離は、 128種類が混合された20-mer
のオリゴヌクレオチドプローブの上記プールと、別の酵
素によるヒトＥＰＯフラグメントから得られたアミノ酸
配列情報に基づく 128種類の放射線標識化17-merプロー
ブの第二のプールとを用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡプラーク
ハイブリダイゼーションにより行なわれた。 【００４５】陽性のコロニー及びプラークは、20-merプ
ローブのプール内の16塩基鎖サブセットを用いたクロー
ンＤＮＡのジデオキシ配列法により確認され、選択され
たクローンは、それによりコードされるＥＰＯポリペプ
チドの一次構造形状を推定させるヌクレオチド配列分析
に供された。推定されたポリペプチド配列は互いに、ま
たヒトＥＰＯフラグメントのアミノ酸分析により得られ
た部分配列に対しても高度の相同性を示した。 【００４６】選択された陽性のヒトゲノムクローンは、
「シャトル」ＤＮＡベクターに挿入され、このベクター
は大腸菌に導入されて、培養哺乳類細胞をトランスフェ
クションするために増幅された。トランスフェクション
された前記宿主細胞の培養増殖により、培養液１ml当り
3000ＵのＥＰＯを含有していると推定される培地上澄標
品が得られた。 【００４７】以下の諸例は本発明の説明のために掲げら
れており、特にＥＰＯをコードするサル cＤＮＡクロー
ン及びヒトゲノムクローンの同定に先立って実施される
操作、この同定のための操作、並びに配列決定、発現系
の生成及びこの系におけるＥＰＯ発現の免疫学的確認に
関するものである。 【００４８】更に具体的には、例１はヒトＥＰＯフラグ
メントのアミノ酸配列及びこの配列に基づく放射線標識
化プローブ混合体の調製に関する。例２は一般に、陽性
サルcＤＮＡクローンの同定に必要な操作に関するもの
であり、このため動物の処置及び動物血清の予備的ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）分析に関する情報が得られ
る。例３は、 cＤＮＡライブラリーの調製、陽性クロー
ンのコロニーハイブリダイゼーションスクリーニングお
よび確認、陽性 cＤＮＡクローンのＤＮＡ配列並びにサ
ルＥＰＯポリペプチド一次構造形状（アミノ酸配列）の
情報に関する。例４は陽性ヒトゲノムクローンの同定に
必要な操作に関するものであり、このためゲノムライブ
ラリー、プラークハイブリダイゼーション操作及び陽性
クローンの確認に関する情報が得られる。例５は、陽性
ゲノムクローンのＤＮＡ配列及びサルＥＰＯ鎖の情報と
の違いも含めた、ヒトＥＰＯポリペプチドアミノ酸配列
の情報に関する。例６は、陽性サル cＤＮＡクローンか
ら得られたＥＰＯをコードするＤＮＡを取り込んだベク
ターの調製方法、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクショ
ンするためのベクターの使用法及びトランスフェクショ
ンされた細胞の培養増殖法に関する。例７は、陽性ヒト
ゲノムクローンから得られたＥＰＯをコードするＤＮＡ
を取り込んだベクターの調製方法、ＣＯＳ−１細胞をト
ランスフェクションするためのベクターの使用法及びト
ランスフェクションされた細胞の培養増殖法に関する。
例８は、例６及び７におけるトランスフェクションされ
た細胞の培養増殖により得られた培地上澄で実施された
イムノアッセイに関する。例９は、例６及び７における
真核生物細胞発現によるＥＰＯのイン・ビトロ及びイン
・ビボ生物学的活性に関する。 【００４９】例１０は、チャイニーズハムスター卵巣
（「ＣＨＯ」）細胞によるサル種ＥＰＯ− cＤＮＡ及び
ヒト種ゲノムＤＮＡについての哺乳類宿主発現系の調製
並びにこれらの発現系による生産物の免疫的および生物
学的活性、およびこれらの生産物の特徴づけに関する。 【００５０】例１１は、ヒト種ＥＰＯ及びＥＰＯ類縁体
をコードする合成遺伝子（それらは大腸菌及び酵母での
発現のための多数の優先コドンを含むものである）の調
製及びそれに基づく発現系に関する。 【００５１】例１２は、例１１の系における発現生成物
の免疫学的及び生物学的活性面に関する。 【００５２】 【実施例】例 １ Ａ．ヒトＥＰＯフラグメントのアミノ酸配列決定 ヒトＥＰＯを尿から単離し、トリプシン切断させて、約
100〜150 ピコモル量の17個に分断されたフラグメント
とし、単離した。 【００５３】フラグメントに任意に数字を付し、気相配
列決定装置（アプライド・バイオシステムス）を用いて
微細配列順序分析によりアミノ酸配列を分析し、以下の
表Ｉに示した配列情報を得た。表では、単一文字符号が
用いられており、「Ｘ」は明確に決定されなかった残基
を表わす。 【表１】 【００５４】Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブ混合体の
設計と調製 表Ｉに示したアミノ酸配列に関し、混合プローブ操作が
cＤＮＡ及び（又は）ゲノムＤＮＡライブラリーでのＤ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作に適用し得るかにつ
いて確認する目的で、遺伝暗号の縮重関係を精査した。
この分析では、フラグメントNo.T35の中に７つのアミノ
酸残基（Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys）が存在してい
たことが判明したが、この鎖は20塩基対について可能な
128 種類のＤＮＡ鎖のうちの一つによりコードされてい
るということにより独特に特徴づけることができる。 1
28種類の20塩基鎖オリゴヌクレオチドの第一の組は、し
たがって下記表IIに示した配列に従い、固体支持体上で
の標準ホスホアミデート法［例えば、ビューケージら；
「テトラヘドロン・レターズ」、第22巻、第 1859-1862
頁、1981年（Beaucage, et al., Tetrahedron Letters,
22, pp1859-1862 (1981)）参照］により合成される。 【表２】【００５５】更に分析すると、フラグメントNo.T38の中
に、６つのアミノ酸残基（Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu ）
の存在が確認され、それに基づけば、下記表III に示し
たように 128種類の混合オリゴヌクレオチドの17-merプ
ローブのプールを調製することができる。 【表３】 【００５６】オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ4 ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＮ）を用いて7500〜8000Ci
／mmol（ＩＣＮ）のγ‐３２Ｐ−ＡＴＰにより 5′末端
で標識化した。 【００５７】例 ２ Ａ. サルの処理操作 メスのカニクイザル（Cynomolgus monkey ）マカカ・フ
ァシキュラリアス（Macaca fascicularias）(2.5〜3 k
g， 1.5〜2 年齢) に１、３及び５日目；12.5mg／kgの
用量でpH 7.0の塩酸フェニルヒドラジン溶液を皮下注射
して処理した。ヘマトクリット値をそれぞれ注射する前
に測定した。７日目に、あるいはヘマトクリット値が初
期値の25％低下した際、塩酸ケタミン25mg／kgを投与し
て、血清及び腎臓を採取した。採取物を直ちに液体窒素
で凍結し、−70℃で保存した。Ｂ．ＥＰＯのＲＩＡ 試料中のＥＰＯ定量のためのラジオイムノアッセイ操作
を以下の操作に従い実施した。 【００５８】エリスロポエチンの標準（この標準は、Ｃ
ＡＴ−１と呼ばれる人尿由来のエリスロポエチンで、そ
のエリスロポエチン活性はエリスロポエチンの国際的標
準であるWHO IRP #1に対し検定されているものである。
なお、この標準はシカゴ大学のゴールドワッサー(Dr.E.
Goldwasser)より入手した。）又は未知試料を37℃で２
時間抗血清と一緒にインキュベートした後、試験管を氷
冷し、１２５Ｉ‐標識化エリスロポエチンを加え、管を
15時間以上 0℃でインキュベートした。各試験管には、
希釈免疫血清50μｌ、１２５Ｉ‐エリスロポエチン10,0
00cpm.トラシロール５μｌ及びＥＰＯ標準もしくは未知
試料 0〜250 μｌからなり、残部が0.1%BSA含有ＰＢＳ
であるインキュベート混合物 500μｌが入っていた。使
用した抗血清は、ヒト尿エリスロポエチンの純粋な 1％
標品で免疫されたウサギの第２回目採血液であった。試
験のための最終的抗血清希釈液は、抗体‐結合１２５Ｉ
‐ＥＰＯが入力総カウント数の10〜20％を超えないよう
に調整された。一般に、これは１：50,000〜１：100,00
0 の最終的抗血清希釈液に相当した。 【００５９】抗体‐結合１２５Ｉ‐エリスロポエチン
は、スタフＡ (staph A) 150μｌの添加により沈澱し
た。40分間インキュベートした後、試料を遠心分離し、
ペレットを0.15M NaCl、2mM EDTA及び0.05％トリトンＸ
-100含有10mMトリス‐ＨＣｌ 0.75ml （pH 8.2）で二回
洗浄した。洗浄したペレットをガンマーカウンターで計
測し、１２５Ｉ‐エリスロポエチン結合体の％を求め
た。免疫前の血清のカウント数を、非特異的沈澱につい
て補正するため、全ての最終値から差し引いた。未知試
料のエリスロポエチン含量を標準曲線と比較して求め
た。 【００６０】上記操作を、未処理サル血清のみならず、
前記Ａ部で得られたサル血清にも適用した。正常血清値
を分析すると含有量は約36mU／mlであったが、処理サル
血清では含有量は1000〜1700mU／mlであった。 【００６１】例 ３ Ａ．サル cＤＮＡライブラリーの構築 メッセンジャーＲＮＡを、チャーグウィンら：「バイオ
ケミストリー」、第18巻、第5294頁、1979年［Chirgwi
n, et al., Biochemistry 18, p 5294 (1979)］のチオ
シアン酸グアニジウム法によって正常と貧血サル腎臓か
ら単離し、ポリ(A)+ mＲＮＡを、マニアティスら：
「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マ
ニュアル」（1982年、ニューヨーク州、ハーバー、コー
ルドスプリングス所在、コールドスプリングスハーバー
ラボラトリー）［Maniatis, et al., “Molecular Clon
ing, A Laboratory Manual"（Cold Springs Harbor Lab
oratory,Cold Springs Harbor, N.Y., 1982）］第 197-
198頁に記載されているように、オリゴ(dＴ)-セルロー
スカラムクロマトグラフィーで二回精製した。 cＤＮＡ
ライブラリーを、オカヤマら：「モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー」、第２巻、第161-170 頁、
1982年［Okayama,et al., Mol.and Cell. Biol., 2, pp
161-170 （1982）］の一般的方法の修正法により調整し
た。本発明での好ましい操作のキーポイントは以下のと
おりであった：(1) pUC8を唯一のベクターとして使用
し、ＰstＩで切断し、次いで60〜80塩基鎖のオリゴ dＴ
の尾部をつけた。(2) Ｈinc II切断によりベクターの一
端からオリゴ dＴ尾部を取り除いた、(3) 第一の鎖の合
成とオリゴ dＧの尾部づけを公表された方法により実施
した、(4) ＢamＨＩ切断によりベクターの一端からオリ
ゴ dＧ尾部を取り除いた、及び(5) ＤＮＡによるＲＮＡ
鎖の置換には、オリゴ dＧ尾部つきベクターよりも３倍
モル過剰の２つのリンカー（GATCTAAAGACCGTCCCCCCCCC
およびACGGTCTTTA）を用いた。Ｂ．サル cＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めのコロニーハイブリダイゼーション トランスフォー
メーションを受けた大腸菌を、50μｇ／mlのアンピシリ
ン含有栄養平板上に、10×10cmプレート当り9000コロニ
ーの密度で分散させた。ジーン・スクリーン・フィルタ
ー（Gene Screen filter）（ニューイングランド・ヌク
レア・カタログNo. NEF-972 ）をＢＨＩ‐ＣＡＭプレー
ト（バクト(Bacto) 脳心臓浸出液37ｇ／ｌ、カザミノ酸
2ｇ／ｌ及び寒天15ｇ／ｌ、クロラムフェニコール 500
μｇ／ml含有）にて予め湿潤させ、プレートからコロニ
ーを採取するのに用いた。コロニーを同一の培地で12時
間以上増殖させて、プラスミド複製数を増やした。増殖
したコロニー（コロニ・サイド・アップ）を、以下の溶
液でそれぞれ飽和された２枚のワットマン 3ＭＭ紙上に
フィルターを連続的におくことにより処理した： (1) ５分間は50mMグルコース‐25mMトリスＨＣｌ (pH
8.0)-10mM EDTA （pH 8.0）、(2) 10分間は 0.5M Ｎａ
ＯＨ、及び(3) ３分間は 1.0M トリスＨＣｌ（pH 7.5）
フィルターを次いで、80℃にて２時間減圧乾燥させた。 【００６２】フィルターを次に、プロティナーゼＫで消
化に付し、緩衝液Ｋ［ 0.1M トリスＨＣｌ（pH 8.0）‐
0.15M ＮａＣｌ‐10mM EDTA （pH 8.2）-0.2％ＳＤＳ］
中に該プロテアーゼ酵素50μｇ／mlを含む溶液で処理し
た。具体的には、この溶液 5mlを各フィルターに加え、
55℃で30分間消化処理し、しかる後溶液を除去した。 【００６３】フィルターを次いで、プレハイブリダイゼ
ーション緩衝液(5×SSPE-0.5% SDS-100 μｇ／mlSS大腸
菌 DNA-5×BFP) 4mlで処理した。プレハイブリダイゼー
ション処理を55℃で、おおむね４時間以上行ない、その
後、プレハイブリダイゼーション緩衝液を除去した。 【００６４】ハイブリッド形成操作を以下の方法で行な
った。各フィルターに、表IIの 128種類のプローブ配列
（ＥＰＶ混合体とされる全ての混合体）をそれぞれ0.02
5 ピコモル含有するハイブリダイゼーション緩衝液(5×
SSPE-0.5% SDS-酵母菌 tＲＮＡ 100μｇ／ml) ３mlを加
え、フィルターを48℃で20時間保持した。この温度は、
全てのプローブについて決定された計算解離温度（Ｔ
ｄ）の最低のものより２℃低かった。 【００６５】ハイブリッド形成後、フィルターを振盪器
にて10分間、室温で 6×SSC-0.1% SDSにより３回洗浄
し、ハイブリッド形成温度（48℃）にて２〜３回６×SS
C-1% SDSで洗浄した。 【００６６】フィルターのオートラジオグラフィーによ
り、スクリーニングされた 200,000コロニーの中から７
つの陽性クローンが見出された。 【００６７】推定されるサル cＤＮＡクローンの一つ
（クローン＃83）の最初の配列分析が、ウォレスら：
「ジーン」、第16巻、第21‐26頁、1981年［Wallace, e
t al., Gene,16, pp21-26 (1981)］の方法を修正して確
認のために行われた。即ち、サルcＤＮＡクローン＃83
からのプラスミドＤＮＡをＥcoＲＩで切断して直鎖状と
なし、沸騰水浴上で加熱して変性させた。ヌクレオチド
配列をサンガーら：「P.N.A.S.」（米国）、第74巻、第
5463-5467頁、1977年［Sanger, et al., P.N.A.S.(U.
S.A)、74, pp5463-5467 (1977)］のジデオキシ法で調べ
た。16の配列からなるＥＰＶプローブ混合体の一部を塩
基配列決定のプライマーとして用いた。Ｃ．サルＥＰＯ cＤＮＡ配列 クローン＃83のヌクレオチド配列分析をメッシング：
「メソッド・イン・エンザイモロジー」、第 101巻、第
20-78頁、1983年［Messing, Methodsin Enzymology, 1
01, pp20-78 (1983)］の方法に従って行なった。表IVに
示したのは、クローン＃83における約1600塩基対のＥco
ＲＩ／ＨinｄIII クローン化フラグメントの予備的な制
限酵素地図分析結果である。制限エンドヌクレアーゼ酵
素認識部位のおおよその位置は、該フラグメントの 5′
末端のＥcoＲＩ部位に対する 3′側の塩基数によって表
わされる。ヌクレオチドの配列決定は、重複するフラグ
メントを重ね合せるように、個々の制限フラグメントを
つなげることにより行なわれた。例えば、Ｃ113 の制限
フラグメント（111 のＳau3A／324 のＳmaＩ）における
ヌクレオチド分析で得られる配列情報とＣ73のフラグメ
ント（424 のＡluＩ／203 のＢstＥII）の逆方向配列決
定により得られる配列情報との重複である。 【表４】【００６８】約1342塩基対（ＥcoＲＩ部位の 3′側のＳ
au３Ａ部位からＨinｄIII 部位までの範囲内で）の配列
を決め、全ての解読可能な構造を分析して、表Ｖに示し
たＤＮＡ及びアミノ酸鎖の情報を解明することができ
た。表中、成熟ＥＰＯのアミノ末端と推定される最初の
アミノ酸残基（ヒューイック・エムら：「ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、第 256巻、第
7990-7997頁、1981年［Hewick,M.,et al.,J.Biol.Che
m., 256,7990-7997 (1981) ］の操作によりアミノ酸分
析が気相配列決定装置［アプライド・バイオシステム社
（Appllied Biosystems, Inc）］によって行なわれた成
熟ヒトエリスロポエチンの最初の20個のアミノ末端残基
配列分析と対比させて確認されるような）は、数値の＋
１で示されている。成熟蛋白質アミノ酸鎖において一番
目の残基である最初のアミノ末端アラニン残基の「上
流」に位置していてメチオニンを特定化するＡＴＧコド
ン（−27で示される）の存在は、成熟ＥＰＯが循環系に
入る前に切除される27のアミノ酸「リーダー」領域を含
む前駆体型として、ＥＰＯが細胞質中でまず発現される
可能性のあることを示している。ポリペプチド中の潜在
的グリコシル化部位は* で示されている。翻訳領域の分
子量は 21117ダルトンであり、成熟サルＥＰＯを構成す
るポリペプチドの165 残基の分子量は 18236ダルトンで
あった。 【表５】【００６９】 【表６】 【００７０】 【表７】【００７１】表Ｖのポリペプチド鎖は、例えばホップ
ら：「P.N.A.S.」（米国）、第78巻、第 3824-3828頁、
1981年［Hopp, et al., P.N.A.S.(U.S.A.)、78、pp3824
-3828(1981)］、カイトら：「ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー」、第157巻、第 105-132頁、1
982年［Kyte,et al.,J.Mol.Biol., 157、pp105-132 (19
82)］及び（又は）チューら：「バイオケミストリ
ー」、第13巻、第222-245 頁、1974年［Chou,et al.,Bi
ochem,13, pp222-245 (1974)］及び「アドバンシズ・イ
ン・エンザイモロジー」、第47巻、第 45-47頁、1978年
［Advances in Eyzymology, 47, pp45-47(1978) ］の方
法により、高度に親水性の領域及び（又は）潜在的に高
度な免疫原性領域を示す二次構造特性の存在に関する分
析に容易に付されるであろう。ホップらの方法によるコ
ンピューター補助分析は、カリフォルニア州、パロアル
ト、ユニバーシティアベニュ 124のインテリジェネティ
ックス社から入手可能なＰＥＰレファレンスのセクショ
ン６、７に示すプログラムにより実施可能である。 【００７２】例 ４ Ａ．ヒトゲノムライブラリー ローンら：「セル」、第15巻、第1157‐1174頁、1978年
［Lawn, et al,Cell］の方法により調製されたCh4Aファ
ージ担持ヒト胎児肝ゲノムライブラリーを得、プラーク
ハイブリダイゼーション分析で使用するために保存し
た。Ｂ．ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするため
のプラークハイブリダイゼーション操作 ファージ粒子を溶解し、ＤＮＡを、ジーンスクリーン・
プラス・フィルタ（ニューイングランド・ヌクレア・カ
タログNo.NEF-972）及びNZYAM プレート・（１リットル
につき、NaCl 5ｇ、MgCl２ -6Ｈ２ Ｏ 2ｇ、ＮＺ‐アミ
ンＡ10ｇ、酵母エキス5 ｇ、カザミノ酸 2ｇ、マルトー
ス 2ｇ、及び寒天15ｇ）を使用することを除いては、ウ
ー：「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、第68巻、
第389-395 頁、1979年［Woo, Methods In Enzymology,
68, pp389-395 (1979)］の方法により、フィルター（フ
ィルター当り50,000プラーク）に固定した。 【００７３】風乾したフィルターを80℃で１時間焼付
し、次いで例３のＢに記したように、プロティナーゼＫ
で消化した。プレハイブリダイゼーションを55℃で４時
間以上1M NaCl-1% SDS 緩衝液で行ない、しかる後緩衝
液を除去した。ハイブリッド形成及びハイブリッド後洗
浄を例３のＢに記したように行なった。ＥＰＶで示され
る 128種類の20-merプローブ混合体及びＥＰＱ混合体で
示される表III の128 種類の17-merプローブ混合体を用
いた。ハイブリッド形成は、ＥＰＶプローブ混合体を用
い、48℃で行なわれた。ＥＰＱプローブ混合体ハイブリ
ッド形成は46℃、即ち混合体中の最低の計算Ｔｄ値より
4℃低い温度、で行なわれた。再ハイブリッド形成のた
めのハイブリッド形成プローブの除去を、１×SSC-0.1%
SDSと一緒に２分間煮沸することにより行なった。フィ
ルターのオートラジオグラフィーにより、調べられた
1,500,000のファージプラーク中３つの陽性クローン
（いずれのプローブ混合体とも反応する）が見出され
た。ＥＰＯをコードしているような陽性クローンの確認
が、ＤＮＡシークエンシングと、例３のサル cＤＮＡと
のヘテロ二重鎖形成の電子顕微鏡写真による視覚化とに
よってなされた。この操作によっても、ゲノムＤＮＡ鎖
における多数のイントロンの存在が実証された。 【００７４】例 ５ （λｈＥ１で示される）陽性クローンの一つのヌクレオ
チド配列分析（前記サンガーらのジデオキシ法）を行な
ったが、これまでに得られた結果は表VIに示されてい
る。 【００７５】表VI中、最初のＤＮＡ配列は、ヒトＥＰＯ
遺伝子の翻訳部分の直前の非翻訳配列と思われる最前の
620塩基を示す。より具体的には、その配列は、リーダ
ー配列（「前配列」）における最初の４つのアミノ酸
（−27〜−24）をコードする翻訳ＤＮＡ領域（この領域
は、後述する表VII に示されるヒトＥＰＯゲノムＤＮＡ
とサルＥＰＯ cＤＮＡがコードするアミノ酸配列の間の
相同性等に基づいて決定された。）まで続く 5′末端遺
伝子からなっているようである。リーダーの始まりをコ
ードする遺伝子の前に位置する鎖中の４つの塩基対はま
だ明確には確認されなかったため、「Ｘ」で表わされて
いる。次いで、約 639塩基対（そのうち 439塩基対が配
列決定されたが、残りの 200塩基対は「I.S.」で表わさ
れている）からなるイントロンに続いており、翻訳され
るポリペプチドの残基−23として示されたグルタミン酸
コドンの直前に位置している。その直後に続くエキソン
鎖は、（成熟ヒトＥＰＯのアミノ酸鎖残基＋１として示
される）アラニン残基から、＋26のスレオニンを特定化
するコードンまでのアミノ酸残基をコードしていること
が判明し、しかる後具体的に示した 256塩基からなる第
二のイントロンに続いている。このイントロンの後、27
〜55のアミノ酸残基のエキソン配列が続き、その後 612
塩基対からなる第三のイントロンが始まる。次のエキソ
ンはヒトＥＰＯの56〜115 の残基をコードしており、次
いで特定化された 134塩基からなる第四のイントロンが
始まる。第四のイントロンに続くのは、第 116〜166 の
残基をコードするエキソンと「停止」コードン（ＴＧ
Ａ）である。最後に、表VIでは、ヒトＥＰＯ遺伝子の非
翻訳 3′領域と思われる 568塩基対鎖を明らかにしてい
るが、「Ｘ」で示される２つの塩基対はまだ明確には配
列決定されなかった。 【００７６】表VIはこのように、 166個の特定のアミノ
酸残基の成熟ヒトＥＰＯ（推定分子量＝18,399）の一次
構造形状（アミノ酸配列）を確認するのに役立つ。同表
中で同時に示されているのが、ヒト遺伝子オペロンのプ
ロモーター／オペレーター機能にとって重要な 5′−
3′ＤＮＡ鎖とともに、27残基のリーダー配列をコード
するＤＮＡ配列である。成熟ヒトＥＰＯポリペプチドの
潜在的グリコシル化部位は、表中に* で示されている。
表VIの特定のアミノ酸配列がヒトエリスロポエチンの自
然発生的対立遺伝型のそれを構成している可能性がある
ことに注意すべきである。この立場に関する支持が、残
基 126において表に示したセリンと対立するメチオニン
を有する多くのエリスロポエチン分子の発見に至った、
尿中ヒトエリスロポエチンの単離物を配列決定するとい
う長年の努力の結果の末に見出された。 【００７７】以下の表VII はヒトおよびサルのＥＰＯに
おけるポリペプチド配列の相同性の程度を示している。
表中の上部の連続列において、一文字の符号は残基−27
で始まるヒトＥＰＯについて推定翻訳されたポリペプチ
ド配列を示すために用いられており、下部の連続列は指
定の残基−27で始まるサルＥＰＯについて推定されたポ
リペプチド配列を示している。* は、配列相同性を強調
するために用いられている。推定されたヒトおよびサル
ＥＰＯ配列は、ヒトにおける部位 116に「付加的」リジ
ン（Ｋ）残基を示していることに注目すべきである。表
VIと相互に参照することにより、この残基が丁度ゲノム
配列において推定される mＲＮＡのスプライス部位にあ
ることが明らかとなる。ヒトポリペプチド配列における
リジン残基の存在は、下記例７でヒトゲノムＤＮＡによ
りトランスフォーメーションされたＣＯＳ−１細胞から
単離された mＲＮＡより得られるヒト cＤＮＡ鎖クロー
ンを配列決定することによっても更に確認された。尚、
リーダー領域を含む前駆体型のヒトＥＰＯをコードする
イントロンを含まない本発明のＤＮＡ配列を表VI及び表
VII に基づいて作成し、これをまとめて表VI′に示す。 【表８】【００７８】 【表９】 【００７９】 【表１０】【００８０】 【表１１】 【００８１】 【表１２】【００８２】 【表１３】 【００８３】 【表１４】【００８４】 【表１５】 【００８５】例 ６ 例３の操作で得たサル cＤＮＡによりコードされるＥＰ
Ｏポリペプチド物質を単離可能な量で微生物合成するた
めに最初の試みとして選択された発現系は、哺乳類宿主
細胞のうちの一種（即ち、ＣＯＳ−１細胞、A.T.C.C. N
o.CRL-1650）であった。その細胞は、大腸菌宿主(pＢＲ
322 由来ＤＮＡの存在下にて) および哺乳類宿主（ＳＶ
40ウィルス由来ＤＮＡの存在下にて）内で自律的に複製
することが可能な「シャトル」ベクターによりトランス
フェクションされた。 【００８６】更に具体的には、発現ベクターは以下の操
作により調製された。例３のプラスミドクローン＃83を
大腸菌で増殖させ、約1.4kb のサルＥＰＯをコードする
ＤＮＡをＥcoＲＩおよびＨinｄIII 切断により単離し
た。分別して単離されたのは、約4.0 kbの pＢＲ322 由
来ＨinｄIII ／ＳalＩフラグメントであった。約30bpの
ＥcoＲＩ／ＳalＩ「リンカー」フラグメントがＭ13mp 1
0RF DNA （ＰアンドＬラボラトリーズ）から得られた。
このリンカーはＥcoＲＩ付着端を含んでおり、順にＳst
Ｉ、ＳmaＩ、ＢamＨＩおよびＸbaＩ認識部位さらにはＳ
alＩ付着端が続いている。上記３つのフラグメントは約
5.4kb の中間プラスミド（「pERS」）の形成のために連
結されたが、このプラスミドにおいて、ＥＰＯ ＤＮＡ
は有効な制限エンドヌクレアーゼ認識部位の「バンク」
近傍の一端に位置していた。pERSを次いでＨinｄIII お
よびＳalＩで消化すると、ＥＰＯ ＤＮＡおよびＥcoＲ
ＩからＳalＩ（Ｍ13mp 10 ）までのリンカーが得られ
た。1.4kb のフラグメントを約4.0kb の pＢＲ322 のＢ
amＨＩ／ＳalＩおよび約30bpの他のM13mp10・ＨinｄIII
／ＢamＨＩ ＲＦフラグメントリンカーと結合させた。
Ｍ13リンカーフラグメントは、ＨinｄIII 付着端、それ
に続くＰstＩ、ＳalＩ、ＸbaＩに認識部位およびＢamＨ
Ｉ付着端という特徴を有していた。結合生成物は、再
び、制限部位バンクをＥＰＯ ＤＮＡの近傍両端に有す
る有用な中間プラスミド（「 pＢＲ‐ＥＰＯ」）であっ
た。 【００８７】ＣＯＳ−１細胞におけるＥＰＯ ＤＮＡ発
現のために選択されたベクター（「pDSVL1」）は大腸菌
にて選別および自律的に複製させられるよう予め調製さ
れた。これらの特徴は、 pＢＲ322 ヌクレオチド2448〜
4362の領域に存在する複製起点とアンピシリン耐性遺伝
子ＤＮＡ鎖により付与される。この配列は、ベクターに
取込まれる前に、ヌクレオチド2448に直接隣接するよう
にＨinｄIII 認識部位を付与するリンカーを付加するこ
とにより構造的に変換された。選択されたベクターの他
の有用な特性としては、ＣＯＳ−１細胞において自律的
に複製しうる能力と哺乳動物細胞中で機能するウィルス
性プロモーター配列の存在であった。これらの特徴は、
ＳＶ40ゲノムにおけるヌクレオチド数5171〜270 の343b
p 配列に存在する複製ＤＮＡ配列の起点および「後期遺
伝子」ウィルス性プロモーターＤＮＡ配列により示され
る。市販のリンカー［コラボレーティブ・リサーチ（Co
llaborative Research）］を用いて唯一の制限部位（Ｂ
amＨＩ）をベクターにつけ、ウィルス性プロモーター配
列に直接接合させた。更にベクターには、「後期遺伝
子」ウィルス mＲＮＡポリアデニル化信号（通常、転写
ターミネターと称される）を有する 238塩基対配列（Ｓ
Ｖ40のヌクオレチド数2533〜2770に由来する）が取込ま
れていた。このフラグメントは、ベクターにおいて、
「後期遺伝子」ウィルス性プロモーターから唯一のＢam
ＨＩ部位までに対応し、適切に配向していた。更に、ベ
クターには、ウィルス性プロモーターとターミネーター
との間の配列において、唯一のＢamＨＩ部位に挿入され
た遺伝子の潜在的転写に関与しない部位に別の哺乳類遺
伝子が存在していた［哺乳類遺伝子は、ガッサーら：
「P.N.A.S.」（米国）、第79巻、第 6522-6526頁、1982
年（Gasser, et al., P.N.A.S.(U.S.A)、79、pp6522-65
26 (1982)）のように、プラスミド pＭＧ−１から単離
された約2,500 bpのマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）小遺伝子からなっていた］。 【００８８】pDSVL1の構築について以下に補足説明を加
える。 【００８９】このプラスミドベクターは 5049bp から成
り、４種のＤＮＡフラグメントから合成により得られる
ものである。これら４種のＤＮＡフラグメント及び合成
リンカーはいずれも容易に入手可能なものであり、その
塩基配列もすでに決定されている。 【００９０】各ＤＮＡフラグメントは夫々次のように調
製することができる。 (1) ヌクレオチド１−2520：この2520bpのＥcoＲＩ−Ｐ
stＩフラグメントはｐＭＧ１から得られ、マウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼ小遺伝子をコードするものである。
ｐＭＧ１はスタンフォード大学のDr.R.Schimkeから入手
したもので、このプラスミドは一般に入手可能なもので
ある（前掲ガッサーら参照）。 (2) ヌクレオチド2521−2783：この263bp から成るＰst
Ｉ−ＢamＨＩフラグメントは、ＳＶ40ゲノムのヌクレオ
チド数2533−2770由来のＢamＨＩ−ＢclＩフラグメント
(238bp) のＢclＩ部位に合成リンカーを付加してＰstＩ
部位に変換することにより調製したものである。尚、Ｓ
Ｖ40及びここで用いた合成リンカーは市販されているも
のである。 (3) ヌクレオチド2784−3129：この346bp から成るＢam
ＨＩ−ＨinｄIII フラグメントは、ＳＶ40ゲノムのヌク
レオチド数5171−270 由来のＰvuII−ＨinｄIII フラグ
メント(343bp) のＰvuII部位（ヌクレオチド数 270）
に、市販の合成リンカーを接合させてＢamＨＩ部位に変
換することにより調製したものである。 (4) ヌクレオチド3130−5049：この1920bpから成るＨin
ｄIII −ＥcoＲＩフラグメントは、pBR322のヌクレオチ
ド数2448−4362領域のヌクレオチド数2448にＨinｄIII
認識部位を付与する合成リンカーを直接付加することに
よって調製したものである。 【００９１】例えば、上記マニアティスらの方法によ
り、ＥＰＯをコードするＤＮＡをＢamＨＩフラグメント
としてプラスミド pＢＲ‐ＥＰＯから単離し、ＢamＨＩ
で切断されたプラスミド pＤＳＶＬ１に結合させた。制
限酵素分析を行ない、２つの得られたクローンベクター
（複製ベクターＨおよびＬ）が正確に配向してＥＰＯ遺
伝子が挿入されたことを確認した。プラスミド pＤＳＶ
Ｌ‐ＭｋＥを示した第２図参照。誤って配向したＥＰＯ
遺伝子を有するベクター（ベクターＦ，ＸおよびＧ）
は、正確に配向したＥＰＯ ＤＮＡを有するベクターで
トランスフォーメーションされた宿主のＥＰＯ発現量を
測定するためのトランスフェクション実験において、ネ
ガティブコントロールとして使用するために保存した。 【００９２】キャリアＤＮＡ（マウス肝および脾ＤＮ
Ａ）と結合したベクターＨ、Ｌ、Ｆ、ＸおよびＧを用
い、リン酸カルシウム微細沈澱法により、二重60mmプレ
ートをトランスフェクションした。二重60mmプレートは
また、「にせ」のトランスフォーメーションのネガティ
ブコントロールであるキャリアＤＮＡによってもトラン
スフェクションされた。５日後、全ての培地について、
天然ＥＰＯの免疫学的性質を有するポリペプチドの有無
に関し試験した。 【００９３】例 ７ Ａ．ＣＯＳ−１細胞を含む第一ＥＰＯ発現系 ヒトゲノムのＤＮＡ ＥＰＯクローンによりコードされ
たヒトＥＰＯポリペプチド物質を単離可能な量で微生物
合成する最初の試みのために選択された系には、哺乳類
宿主細胞（即ち、ＣＯＳ−１細胞、A.T.C.C. No.CRL-16
50）での発現が包含される。ヒトＥＰＯ遺伝子を、ま
ず、大腸菌宿主(pＢＲ322 由来ＤＮＡの存在下にて) お
よび哺乳類細胞系ＣＯＳ−１（ＳＶ40由来ＤＮＡの存在
下にて）内で自律的に複製することが可能な「シャト
ル」ベクターにてまずサブクローン化した。ＥＰＯ遺伝
子含有シャトルベクターを次いでＣＯＳ−１にトランス
フェクションした。ＥＰＯポリペプチド物質がトランス
フェクションされた細胞から産生され、細胞培地に分泌
された。 【００９４】更に具体的には、発現ベクターは以下の操
作により調製された。ラムダクローンλｈＥ１から単離
され、ヒトゲノムＥＰＯ遺伝子を含むＤＮＡをＢamＨＩ
およびＨinｄIII 制限エンドヌクレアーゼで消化して、
全ＥＰＯ遺伝子を含む5.6kbＤＮＡフラグメントを単離
した。このフラグメントを、同様に消化された細菌プラ
スミド pＵＣ8 ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
社(Bethesda ResearchLaboratories, Inc.)］と混合
し、結合させて、この制限フラグメントの簡便な供給源
となる中間プラスミド「pUC8-HuE」を得た。 【００９５】ＣＯＳ−１細胞におけるＥＰＯ ＤＮＡ発
現のために選択される 3338bp から成るベクター（pSV4
SEt ）を予め調製した。プラスミドpSV4SEt は３種のＤ
ＮＡフラグメントから合成されており、各フラグメント
は市販のＤＮＡに入手容易な合成リンカーを付加して修
飾したものである。このプラスミドは、大腸菌における
選択および自律的な複製をなすＤＮＡ配列を含んでい
た。これらの特徴は、細菌プラスミドpBR322のヌクレオ
チド数2448〜4362領域に存在している複製起点およびア
ンピシリン耐性遺伝子ＤＮＡ配列により付与される。こ
の領域を、ヌクレオチド数2448にＨinｄIII 認識部位を
付与するリンカーを付加することにより構造的に変換
し、pSV4SEt のヌクレオチド数1422‐3338（ＨinｄIII
‐ＥcoＲＩ）領域とした。このＨinｄIII ‐ＥcoＲＩ領
域は、カリフォルニア大学のティジャン(R.Tjian) より
分与を受けたプラスミド pＳＶ08（メイヤーら：「セ
ル」、第25巻、第373-384 頁、1981年［Myers,R.M., et
al.,Cell, 25, pp373-384 (1981)］）をＨinｄIII お
よびＥcoＲＩで消化することにより得た。得られたＨin
ｄIII リンカー部分を含む該断片概略を以下に示す。 【化１】 【００９６】尚、該ＨinｄIII ‐ＥcoＲＩ断片は、以下
に述べるような方法によっても、調製することができ
る。まず、pBR322よりＳfaＮＩ−ＢglＩ断片（約914 b
p）を単離する。次に、pBR322よりアンピシリン耐性遺
伝子領域にかかる部分を含むＢglＩ−ＨinｄIII 断片
（約908 bp）を単離する。最後に、以下に示す配列［pB
R322のヌクレオチド数2448から2567（ＳfaＮＩ部位）の
配列に、更にＨinｄIII 部位を2448側に付加した配列］
を有する129 bpのＤＮＡ断片を合成する。 【００９７】これら３つのＤＮＡ断片を連結して得られ
たプラスミドを、ＨinｄIII およびＥcoＲＩで消化する
ことにより、唯一の大断片として該ＨinｄIII ‐ＥcoＲ
Ｉ断片が得られる。 【化２】 【００９８】プラスミドpSV4SEt は、ＣＯＳ−１細胞に
おいても自律的に複製することができた。この特徴は、
ＳＶ40のウィルス複製起点を含む343bp のＨinｄIII ‐
ＰvuIIフラグメント（ヌクレオチド数5171〜270 ）にあ
った。このフラグメントを、ＥcoＲＩ認識部位をヌクレ
オチド数270に接合させるリンカー、およびＳalＩ認識
部位をヌクレオチド数5171に接合させるリンカーを付加
することにより変換し、pSV4SEt のヌクレオチド数 1-3
53（ＥcoＲＩ‐ＳalＩ）領域とした。ＳＶ40由来の1063
bpのＨinｄIII ‐ＢclＩフラグメント（ヌクレオチド数
1708〜2770）を、ＳalＩ認識部位をヌクレオチド2770に
接合させるリンカーを付加することにより変換し、pSV4
SEt のヌクレオチド数354-1421（ＳalＩ‐ＨinｄIII ）
領域とした。このフラグメント中には、唯一のＢamＨＩ
認識配列も含まれていた。即ち、以上の３種のＤＮＡフ
ラグメントから成るプラスミドpSV4SEt は、ヒトＥＰＯ
遺伝子が挿入されるＢamＨＩおよびＨinｄIII 認識部
位、大腸菌内で複製および選択される配列、並びにＣＯ
Ｓ−１細胞内で複製される配列を含んでいた。 【００９９】ＥＰＯ遺伝子をpSV4SEt に挿入するため、
プラスミドpUC8-HuEをＢamＨＩおよびＨinｄIII制限エ
ンドヌクレアーゼで消化し、ＥＰＯをコードする5.6kb
のＤＮＡフラグメントを単離した。pSV4SEt もＢamＨＩ
およびＨinｄIII で切断し、2513bpの大フラグメントを
単離した（全ての必要な機能を保有している）。これら
のフラグメントを混合連結して、最終的ベクター「pSVg
Hu EPO」を得た（第３図参照）。このベクターを大腸菌
（ＨＢ101 株）中で増殖させ、ベクターＤＮＡを単離し
た。制限酵素分析を行ない、ＥＰＯ遺伝子の挿入を確認
した。 【０１００】プラスミドpSVgHuEPO DNA を用いＣＯＳ−
１細胞においてヒトＥＰＯポリペプチド物質を発現させ
た。更に具体的には、pSVgHuEPO DNA をキャリアＤＮＡ
とともに、ＣＯＳ−１細胞の三重60mmプレートにトラン
スフェクションした。コントロールとして、キャリアＤ
ＮＡのみをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションし
た。細胞培養培地を５日後および７日後に採取し、天然
ヒトＥＰＯの免疫学的性質を有するポリペプチドの有無
について試験した。Ｂ．ＣＯＳ−１細胞を含む第二ＥＰＯ発現系 更に別の系が、ＣＯＳ−１細胞（A.T.C.C. No.CRL-165
0）において、ヒトゲノムＤＮＡ ＥＰＯクローンによ
りコードされたヒトＥＰＯポリペプチド物質の改良生産
法を得るために設計された。 【０１０１】直前のシステムにおいて、ＥＰＯが、5.6k
b のＢamＨＩからＨinｄIII までの制限フラグメント中
に存在するそれ自身のプロモーターを用いて、ＣＯＳ−
１細胞にて発現された。下記調製例では、ＥＰＯ遺伝子
を、ＳＶ40後期プロモーターにより発現しうるように変
換させる。 【０１０２】更に具体的には、クローン化された 5.6kb
のＢamＨＩからＨinｄIII までのゲノムヒトＥＰＯ制限
フラグメントを以下の操作により変換した。前記プラス
ミドpUC8-HuEをＢamＨＩおよびＢstE II制限エンドヌク
レアーゼで切断した。ＢstEIIは、ペプチド前駆体をコ
ードする開始ＡＴＧから 5′方向に44塩基対であり、Ｈ
inｄIII 制限部位から 3′方向に約 680塩基対である部
位において、5.6kb ＥＰＯ遺伝子を切断する。約4900塩
基対のフラグメントを単離した。ＳalＩおよびＢstE II
付着端並びに内在ＢamＨＩ認識部位を有する合成リンカ
ー 【化３】 【０１０３】を合成し、精製した。２つのフラグメント
をＳalＩおよびＢamＨＩで切断されたプラスミドpBR322
と混合し、連結させて、中間プラスミド pＢＲｇＨＥを
得た。ゲノムヒトＥＰＯ遺伝子は、アミノ末端をコード
する領域に近接したＢamＨＩ部位から 3′方向に53塩基
対である部位に一つのＡＴＧを含む完全な構造の遺伝子
を保有する4900塩基対のＢamＨＩ切断フラグメントとし
て、それらから単離することができる。 【０１０４】このフラグメントを単離し、ＢamＨＩフラ
グメントとして、ＢamＨＩ切断発現ベクタープラスミド
ｐＤＳＶＬ１に挿入した。得られるプラスミド、即ち第
４図に示すｐＤＳＶＬ‐ｇＨｕＥＰＯを用い、例６及び
７Ａに示したように、ＣＯＳ−１細胞からＥＰＯポリペ
プチド物質を発現させた。 【０１０５】例 ８ 例６における６つのトランスフェクションされたＣＯＳ
−１の増殖後の培地を、例２のＢに示した操作に従い、
ラジオイムノアッセイによって分析した。各試料を 25
0、 125、50および25μｌ量で分析した。不正確なＥＰ
Ｏ遺伝子配向を有するベクターでトランスフェクション
されたにせの細胞増殖物の上澄は、明らかにＥＰＯ免疫
応答性に関し陰性であった。正確な配列のＥＰＯ ＤＮ
Ａを有するベクター（ＨおよびＬ）でトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ−１細胞の増殖物から得た２つの上澄
のそれぞれの試料に関し、抗体に対する１２５Ｉ‐ＥＰ
Ｏ結合阻害率は72〜88％の範囲であり、全ての値が標準
曲線の上位に位置していた。培地上澄の正確なＥＰＯ濃
度は、このため、信頼すべき程度までには調べることが
できなかった。しかしながら、最大量(250μｌ) の計算
値から控えめに推定すると、300 mU／mlであった。 【０１０６】例６の代表的培養液、並びに例７Ａで得た
５日目および７日目の培養液を、組換えサルおよびヒト
ＥＰＯ物質および天然ヒトＥＰＯ標準と比較するため
に、ＲＩＡで試験し、結果を第１図のグラフで示した。
即ち、結果は予期されたように、組換えサルＥＰＯは抗
ヒトＥＰＯ抗体と著しく競合したが、試験条件下では完
全には結合を阻害できないことを示した。組換えヒトＥ
ＰＯに関する最大の％阻害率はしかしながら、ヒトＥＰ
Ｏ標準の値と極めて近似していた。用量応答曲線が平行
関係であることは、一般に免疫学的な配列（エピトー
プ）の同一性を示唆している。サルＥＰＯ培養液の先の
評価をそれよりも高い希釈レベルで再度実施すると、2.
91〜3.12 U／mlの範囲であった。調べられたヒトＥＰＯ
生産量は、５日間増殖試料が392 mU／mlで、７日間増殖
試料が567 mU／mlであった。例７Ｂの発現系におけるＥ
ＰＯ測定値は同レベルかそれ以上であった。 【０１０７】例 ９ 例６および７で得られた培養液を、ゴールドワッサー
ら：「エンドクリノロジー」、第97巻、第２号、第 315
-323頁、1975年［Goldwasser,et al., Endocrinology
, 97, 2, pp 315-323 (1975)］の方法によるＥＰＯ活
性イン・ビトロ分析に供した。被検培養液のサルＥＰＯ
測定値は 3.2〜4.3 U/mlの範囲であった。ヒトＥＰＯ培
養液もこのイン・ビトロ分析では活性を示し、この活性
は抗ＥＰＯ抗体で中和することができた。例６の組換え
サルＥＰＯ培養液も、コーツら：「ネーチャー」、第 1
91巻、第 1065-1067頁、1961年［Cotes, et al.,Natur
e, 191,pp1065-1067 (1961)］およびハモンドら：「ア
ナルス・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイ
エンス」、第 149巻、第516-527 頁、1968年［Hammond,
et al., Ann, N.Y. Acad. Sci., 149, pp.516-527 (19
68) ］の一般的方法によるイン・ビボ生物学的活性分析
に供したところ、活性値は0.94〜1.24 U／mlであった。 【０１０８】例 １０ 前述の諸例において、組換えサルまたはヒトＥＰＯ物質
を、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションするのに用
いたベクターからつくった。これらのベクターは、細胞
内におけるＳＶ40のＴ抗原とベクター上のＳＶ40の複製
起点との存在によって、ＣＯＳ−１細胞内で複製する。
これらのベクターはＣＯＳ−１細胞内で有効量のＥＰＯ
を産生するが、その発現はベクターが最終的に減少して
いくため、まさしく一時的である（７〜14日）。更にま
た、少量のＣＯＳ−１のみが該ベクターでトランスフェ
クションされた。本例では、チャイニーズハムスターの
卵巣（ＣＨＯ）ＤＨＦＲ- 細胞および選別可能なマーカ
ーＤＨＦＲを用いた発現系を述べている［関連する発現
系の議論については、いずれも米国特許第4,399,216 号
並びに1984年 8月29日に公開された欧州特許出願第1170
58号、第117059号および第117060号参照］。 【０１０９】ウルラウブら：「プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ」
（米国）、第77巻、第4461頁、1980年［Urlaub, et a
l., Proc. Nat. Acad. Sci.(U.S.A.) Vol.77, 4461(198
0)］に示されたＣＨＯ ＤＨＦＲ- 細胞(DuX-Bll)CHO K
1 細胞は、構造遺伝子の突然変異によってジヒドロ葉酸
レダクターゼ酵素（ＤＨＦＲ）を欠如しており、このた
め培地中にグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンの
存在を要求する。プラスミド pDSVL-MkE（例６）または
プラスミドpDSVL-gHuEPO（例７Ｂ）を、60mm培養プレー
ト中のヒポキサンチン、チミジンおよびグリシン含有培
地で増殖するＣＨＯ ＤＨＦＲ- 細胞内に、キャリアＤ
ＮＡと一緒にトランスフェクションした。プラスミドpS
VgHuEPO （例７Ａ）を、細菌プラスミドベクター pＢＲ
322 でクローン化されたマウスジヒドロ葉酸レダクター
ゼ遺伝子含有プラスミドｐＭＧ２と混合した。 【０１１０】ｐＭＧ２は、Gasser C.S.et al, Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA,79, p 6522-6526 (1982)にその調
製方法が記載されているｐＭｇ２と同一のプラスミドで
ある。本プラスミドは、前述の文献の著者の１人である
Dr. Schimke R.D.より、分与を受けた。本願出願時点
で、Dr.Schimkeは、希望者に対し本プラスミドを分譲し
ている。従って、本プラスミドの入手については、Dr.S
chimkeから分譲を受ける事により可能である。また、以
下に述べるように当該文献に従い、調製することもでき
る。 【０１１１】ｐＭｇ２は、マウス染色体dhfr遺伝子の
５′上流領域の後に、マウスdhfr遺伝子ｃＤＮＡを接続
し、更にｃＤＮＡの３′非翻訳領域中に、マウス染色体
dhfr遺伝子３′下流領域を挿入した約4.3 kbのいわゆる
「dhfr mini 遺伝子」を含むプラスミドである。まず、
マウス染色体dhfr遺伝子の５′上流〜エクソンＩ，IIま
での領域を持つプラスミドｐＤＲ34（Crouse G.F.et a
l, J.Biol.Chem. 257, p7887-7897(1982)）より、1.0kb
のＥcoＲＩ−ＴaqＩ断片（５′上流領域とエクソンＩ
の一部を含む）を単離した。また、マウスdhfr遺伝子ｃ
ＤＮＡを含むプラスミドｐＤＨＦＲll（Chang A.C.Y.et
al, Nature 275, p617-624(1978)）より、0.19kbのＴa
qＩ断片及び1.3kb のＴaqＩ−ＰstＩ断片（両断片は、
ｃＤＮＡ中における連続した断片である。）を単離し
た。1.0kb のＥcoＲＩ−ＴaqＩ断片のＴaqＩ部位は、エ
クソンＩ中に単一に存在する認識部位であり、ｃＤＮＡ
中の最初のＴaqＩ部位に相当する。 【０１１２】これらの３つの断片は、ＥcoＲＩ−ＴaqＩ
断片（1.0 kb）、ＴaqＩ断片(0.19kb)、ＴaqＩ−ＰstＩ
断片（1.3 kb）の順に正しく並ぶよう連結し、ＴaqＩ断
片が正方向に入っている方のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片（2.
49kb）をｐＢＲ 322のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片（大きい
方）に挿入し、ｐＭｇ１を得た。 【０１１３】次に、マウス染色体dhfr遺伝子の最終エク
ソンと2.7kb の３′下流領域を持つプラスミドｐＤＨＦ
Ｒｇ１（Nunberg J.H.et al,Cell, 19, p355-364(198
0)）より、1.8kb のＢglII断片（マウス染色体dhfr遺伝
子３′下流領域）を単離した。このＢglII断片（1.8 k
b）を、ｐＭｇ１の２番目のＢglII部位に挿入し、ｐＭ
ｇ２を得た。 【０１１４】プラスミド混合体およびキャリアＤＮＡを
CHO DHFR- 細胞にトランスフェクションした（一つのプ
ラスミドを獲得した細胞は一般に第二のプラスミドをも
獲得する）。３日後、細胞を、ヒポキサンチンおよびチ
ミジン欠如培地の数個の 100mm培養プレートに、トリプ
シン処理して分散させた。ＤＨＦＲ遺伝子で安定的にト
ランスフォーメーションされその結果ＥＰＯ遺伝子によ
ってもトランスフォーメーションされたそれらの細胞の
みがこの培地で生存する。 7〜21日後、生存する細胞の
コロニーが明確になった。これらのトランスフォーマン
トコロニーは、トリプシン処理で分散された後、ヒポキ
サンチンおよびチミジン欠如培地中で継続して増殖する
ことができ、新種の細胞株（例えば、CHO pDSVL-MkEPO,
CHO pSVgHuEPO及びCHO-pDSVL-gHuEPO）が得られた。 【０１１５】上記細胞株の培養液を、組換えサルまたは
ヒトＥＰＯの有無についてＲＩＡで分析した。 【０１１６】CHO pDSVL-MkEPO 株培地は、プラスミドpD
SVL-MkEPO でトランスフェクションされたＣＯＳ−１細
胞から得たＥＰＯと同様の免疫学的性質を有するＥＰＯ
を含有していた。代表的な65時間培養液は0.60 U／mlの
サルＥＰＯを含有していた。 【０１１７】CHO pSVgHuEPO およびCHO pDSVL-gHuEPOの
培養液は、プラスミドpSVgHuEPO またはpDSVL-gHuEPOで
トランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞から得たも
のと同様の免疫学的性質を有する組換えヒトＥＰＯを含
有していた。ＲＩＡにより測定すると、代表的なCHO pS
VgHuEPO の３日間培養液は2.99 U／mlのヒトＥＰＯを含
有し、CHO pDSVL-gHuEPOの 5.5日間試料は18.2 U／mlの
ヒトＥＰＯを有していた。 【０１１８】前記細胞株から得られるＥＰＯ量は、遺伝
子を増幅させて産生能の高い新規細胞株をつくることに
よって増加させることができる。ＤＨＦＲ遺伝子により
コードされた産物たるジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素
（ＤＨＦＲ）は、薬物メソトレキセート（ＭＴＸ）で阻
害することができる。更に具体的には、ヒポキサンチン
およびチミジン欠如培地で増殖した細胞は、ＭＴＸによ
り阻害されまたは殺される。適切な条件下（例えば最低
のＭＴＸ濃度）では、ＭＴＸに耐性でかつＭＴＸ存在下
でも増殖可能な細胞を得ることができる。これらの細胞
は、ＤＨＦＲ遺伝子数が増加し、その結果ＤＨＦＲ酵素
量が増加することにより、ＭＴＸ耐性であることが判明
する。残存した細胞を次いで、徐々に濃度を高めてＭＴ
Ｘで処理してもよく、これにより更に多量のＤＨＦＲ遺
伝子を含む細胞株が得られる。ＤＨＦＲ遺伝子と一緒に
発現ベクター上に乗せられ、またはＤＨＦＲ遺伝子とと
もにトランスフォーメーションされた「パッセンジャー
遺伝子」（例えばＥＰＯ）は、それらの遺伝子コピー数
の増加がしばしば見出されている。 【０１１９】この増幅系の実施例として、細胞株CHO pD
SVL-MkEPO を徐々に増加させたＭＴＸ濃度（0nM, 30nM
及び 100nM）に供した。各増加段階から得た代表的な65
時間培地試料をＲＩＡ分析すると、それぞれ0.60，2.45
及び6.10 U／ml含有していた。 【０１２０】細胞株CHO pDSVL-gHuEPOを、30nM、50nM、
100 nM、200 nM、 1μM 及び 5μMにＭＴＸ濃度を増加
させて試験に供した。100nM ＭＴＸ段階から得た代表的
な３日間培地試料は、ＲＩＡで調べると、3089±129 U/
mlのヒトＥＰＯを含有していた。100 nMおよび 1μM Ｍ
ＴＸ段階から得た代表的な48時間培地試料は、ＲＩＡで
調べると（３回分析の平均）、それぞれ 466および1352
U／mlのヒトＥＰＯを含有していた。これらの操作で
は、１×10６ 個の細胞を60mm培養皿中の培地５mlに接
種した。24時間後、培地を除去し、無血清培地（0.1 mM
の非必須アミノ酸およびＬ‐グルタミンが添加された高
グルコースＤＭＥＭ）５mlで置き換えた。ＥＰＯを無血
清培地で48時間蓄積させた。培地をＲＩＡ分析用に集
め、細胞をトリプシン処理し、計数した。100 nMおよび
1μM ＭＴＸで増殖した細胞に関する467 U/mlおよび13
52 U／mlの平均ＲＩＡ値から、それぞれ実際の収量2335
U／プレートおよび6750 U／プレートが求められた。一
プレート当りの平均細胞数はそれぞれ1.94×10６ およ
び3.12×10６ であった。これらの培養条件下での有効
産生速度は、したがって、1264および2167 U／10６ 細
胞／48時間であった。 【０１２１】直上に記載した培養細胞は、遺伝的に不均
一な群である。標準的スクリーニング操作が、最大産生
能を有するおおむね均一なクローンを単離するために用
いられている。米国食品薬局（U.S.Foodand Drug Admin
istration ）、薬品および生物学センター（Center for
Drugs and Biologics）、生物学研究調査庁（Officeof
Biologics Research Review ）、1984年 6月 1日、
「生物の産生に用いられる株化細胞の特徴において考慮
すべき点（Points to Consider in the Characterizat
ion of Cell Lines Used to Produce Biologics）］の
セクションＡ、パート２参照。 【０１２２】前記ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞系の生産性は、
適切な細胞培養技術により改善することができる。哺乳
類培養細胞の増殖には、成長培地に血清の存在を要す
る。血清を含有しない培地でＣＨＯ細胞からエリスロポ
エチンを産生する方法は、培地からのエリスロポエチン
の精製を著しく容易化するものである。下記方法によれ
ば、産生に充分な多量の無血清培地において、経済的に
エリスロポエチンを産生させることができる。 【０１２３】標準的細胞培養条件下で増殖させたCHO pD
SVL-gHuEPO細胞株を用い、スピナー細胞培養フラスコに
接種する。この細胞を、 5％胎児牛血清、Ｌ‐グルタミ
ン、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された
高グルコースＤＭＥＭおよびＨam′s Ｆ12の50‐50混合
物、0.05mM非必須アミノ酸並びに適当な濃度のメソトレ
キセートからなる培地が入ったスピナー細胞培養フラス
コ内で、懸濁液細胞系として増殖させる。懸濁細胞培養
では、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞を容易に多量に増殖させる
ことができる。懸濁液中で増殖したＣＨＯ細胞を用い、
培地 200mlが入った 850cm２ のローラー瓶に 1.5×10
７ 個の生育細胞の初期接種密度で、ローラー瓶に接種
する。細胞を３日間にわたり、付着細胞系として一面に
拡がるまで増殖させる。この増殖相に使用される培地
は、懸濁増殖に用いられたものと同様である。３日の増
殖期間の最後に、血清含有培地を除去し、 100mlの無血
清培地、即ち0.05mM非必須アミノ酸およびＬ‐グルタミ
ンが添加された高グルコースＤＭＥＭおよびＨam′s Ｆ
12の50‐50混合物で置き換える。ローラー瓶をローラー
瓶インキュベーターに１〜３時間戻し、培地を再び除去
し、新しい無血清培地 100mlで置き換える。無血清培地
を１〜３時間インキュベートすると、汚染血清蛋白質濃
度が減少する。ローラー瓶を７日間インキュベーターに
戻し、その間にエリスロポエチンが無血清培地中で蓄積
する。７日間の産生期の最後に、培養済み培地を除去
し、第二の産生サイクルのために新しい無血清培地で置
き換える。この産生系の実施例では、代表的な７日間無
血清培地試料は、ＲＩＡによると、3892±409 U/mlのヒ
トエリスロポエチンを含有していた。 0.9〜 1.8×10５
細胞／cm２ の推定細胞密度に基づけば、各 850cm２
のローラー瓶は0.75〜 1.5×10 8 個の細胞を含有してお
り、したがって７日間の100 mlの培養についてのＥＰＯ
産生速度は 750〜1470 U／10６ 細胞／48時間であっ
た。 【０１２４】10nM MTXで処理された細胞株CHO pDSVL-Mk
EPO の培養液をＲＩＡイン・ビトロおよびイン・ビボＥ
ＰＯ活性分析に供した。培養済み培地試料は、ＲＩＡで
測定すると41.2±1.4 U/ml、イン・ビトロ生物学的活性
分析で測定すると41.2±0.064 U/mlおよびイン・ビボ生
物学的活性分析で測定すると42.5±5 U/ml、のＭｋＥＰ
Ｏを含有していた。ポリペプチド生成物のアミノ酸の配
列を調べるとＥＰＯ生成物の存在が示されており、基本
的な種では推定アミノ末端アラニンに隣接する「リーダ
ー」配列の３残基分を有していた。これは、ＣＨＯ細胞
内でのポリペプチドの膜処理が不正確であることの結果
なのか、あるいはヒトＥＰＯと比較したサルＥＰＯアミ
ノ末端構造の違いを反映しているのかはまだわかってい
ない。 【０１２５】細胞株CHO pDSVL-gHuEPOの培養液を３つの
分析に供した。 5.5日目の試料は、培地中に組換えヒト
ＥＰＯを、ＲＩＡ分析で18.2 U／ml、イン・ビトロ分析
で15.8±4.6 U/mlおよびイン・ビボ分析で16.8±3.0 U/
ml含有していた。 【０１２６】徐々に100 nMのＭＴＸまで増加させて得た
CHO pDSVL-gHuEPO細胞の培養液を３つの分析に供した。
３日間の試料は、組換えヒトＥＰＯをＲＩＡで3089±12
9 U/ml、イン・ビトロ分析で2589±71.5U/mlおよびイン
・ビボ分析で2040±160 U/ml含有していた。この生成物
のアミノ酸配列は表VIに示したアミノ末端と一致してい
る。 【０１２７】10nMのＭＴＸ中、プラスミドpDSVL-MkE で
トランスフェクションされたＣＨＯ細胞培養済み培地を
プールし、数日間にわたりＭＴＸを透析除去すると、 2
21±5.1 U/ml(EPO-CCM) のＥＰＯ活性がある培地が得ら
れた。正常BALB/cマウスのヘマトクリット値に及ぼすEP
O-CCM のイン・ビボ効果を調べるため、以下の実験を行
なった。トランスフェクションしてないＣＨＯ細胞の細
胞培養済み培地（ＣＣＭ）およびEPO-CCM をＰＢＳで調
製した。ＣＣＭをコントロール群（マウス３匹）に用
い、２つの用量の EPO-CCM(4単位 (Ｕ))の注射および44
単位（Ｕ）の注射）を実験群（１群２匹）に用いた。５
週間の間、７匹のマウスを週３回腹腔内注射した。８回
目の注射後における、コントロール群の平均ヘマトクリ
ット値は50.4％、 4Ｕ群は55.1％、および44Ｕ群は67.9
％であった。 【０１２８】哺乳類細胞の発現生成物は、エタノール勾
配をかけ、好ましくはpH 7でＨＰＬＣ（Ｃ４ ）に付す
ことにより、培地から実質的に精製された形で容易に単
離回収することができる。 【０１２９】予備実験を行ない、ＣＯＳ−１およびＣＨ
Ｏ細胞におけるヒトＥＰＯ遺伝子発現調整培地から得ら
れる組換え糖蛋白質生成物を、ウェスタン・ブロット分
析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによってヒト尿ＥＰＯ単離物
と比較して、その特徴を調べた。これらの研究では、Ｃ
ＨＯ由来ＥＰＯ物質はＣＯＳ−１発現生成物よりもやや
高分子量であったが、この生成物はプールされたヒト尿
抽出物よりもわずかに大きいことが判明した。全ての生
成物はやや不均一であった。シアル酸を除去するための
ノイラミニダーゼ酵素処理により、ほぼ同じ分子量であ
るにもかかわらず、いずれも得られたアシアロヒト尿抽
出物よりも大であるＣＯＳ−１およびＣＨＯ組換え生成
物が得られた。組換えＣＨＯ生成物および尿抽出物生成
物を（両者から炭水化物を全て除去するため）エンドグ
リコシダーゼＦ酵素（ＥＣ 3.2.1）処理して、本質的に
同一の分子量を有する実質的均一生成物を得た。 【０１３０】精製されたヒト尿ＥＰＯおよび本発明によ
る組換え型のＣＨＯ細胞産生ＥＰＯを、ネッサーら：
「アナリチカル・バイオケミストリー」、第 142巻、第
58-67頁、1984年［Nesser, et al., Anal. Biochem.,
142,58-67(1984)］の加水分解方法を用いて修正したレ
ディーンら：「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、
第83巻（Ｄ部）、第139-191 頁、1982年［Ledeen, et a
l., Methods in Enzymology, 83 (Part D), 139-191
(1982) ］の方法により炭水化物分析に供した。尿単離
物について実験的に求めた炭水化物組成値（生成物中の
炭水化物モル比で示される）は次のとおりであった：ヘ
キソース1.73、N-アセチルグルコサミン1 、N-アセチル
ニューラミン酸0.93、フコース 0、およびN-アセチルガ
ラクトサミン0。組換え生成物（100 nMのＭＴＸを含むC
HO pDSVL-gHuEPOの３日間培地から得たもの）の値は次
のとうりであった：ヘキソース15.09 、N-アセチルグル
コサミン1 、N-アセチルニューラミン酸 0.998、フコー
ス0、およびN-アセチルガラクトサミン 0。これらの値
は、上記ウェスタンおよびＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析ともに
一致している。 【０１３１】例 １１ 本例は、表VIに示したヒト種ＥＰＯ配列をコードし、大
腸菌および酵母菌［サッカロマイセス・セレビシエ (S.
cerevisiae)］細胞での発現におけるそれぞれの「優
先」コドンを取込んでいる２つの構造遺伝子ヌクレオチ
ド塩基集合体の全体的製造に関する。また、ヒトＥＰＯ
類縁体をコードする遺伝子の構造についても述べられて
いる。簡単に言うと、用いられたプロトコールは、アル
トンらの開示（1983年11月24日にWO 83/04053 として公
開）に掲載されているものとほぼ同じであった。遺伝子
はまず成分オリゴヌクレオチドを組み立ててマルチプル
・ジュープレックスとし、これを次いで３つの別個のセ
クションに組み立てるように設計した。これらのセクシ
ョンは、容易に増幅するように設計してあり、増幅系か
ら除いてから順番に、あるいは多数フラグメントの結合
により、適切な発現ベクターに構築された。 【０１３２】下記表VIII〜XIV は、いかなるリーダーま
たはプレ配列も欠如しているが、−１位に第一のメチオ
ニン塩基を有するヒトＥＰＯ翻訳生成物をコードする合
成遺伝子の設計と組立体を示している。更に遺伝子は実
質的部分に大腸菌の優先コドンを取込んでおり、このた
めその構築は「ＥＣＥＰＯ」遺伝子と呼ばれる。 【表１６】 【０１３３】 【表１７】 【０１３４】 【表１８】【０１３５】 【表１９】 【０１３６】 【表２０】【０１３７】 【表２１】 【０１３８】 【表２２】【０１３９】更に具体的には、表VIIIは、ヒト種ポリペ
プチドのアミノ末端残基をコードするセクション１のＥ
ＣＥＰＯの遺伝子を得るために用いられるオリゴヌクレ
オチドを示している。オリゴヌクレオチドは二重鎖（１
と２、３と４等）として組立てられ、二重鎖は次いで結
合され、表IXのようなＥＣＥＰＯセクション１が得られ
た。組立てられたセクションは末端ＥcoＲＩ及びＢamＨ
Ｉ付着端をそれぞれ含み、ＥcoＲＩ付着端の「下流」に
はＸbaＩ制限酵素認識部位が存在し、ＢamＨＩ付着端の
「上流」にはＫpnＩ認識部位が存在していることに注目
されたい。セクション１は、このセクションの配列の確
認のために用いられるＭ13ファージベクターを用いて、
容易に増幅させることができた。いくつかの困難な点
が、大腸菌由来ＲＦ ＤＮＡからＸbaＩ／ＫpnＩフラグ
メントとしてセクションを単離する上で現われたが、そ
れはおそらく宿主内でＫpnＩ認識部位塩基がメチル化さ
れるためであろう。一本鎖ファージＤＮＡがしたがって
単離され、プライマー・エクステンション法によりイン
・ビトロで二重鎖型とされ、しかる後所望の二重鎖フラ
グメントが容易に単離された。 【０１４０】ＥＣＥＰＯ遺伝子セクション２および３
（表XIおよびXIII）を、表ＸおよびXII のオリゴヌクレ
オチドからそれぞれ同様の方法で調製した。各セクショ
ンは配列の確認に用いられるＭ13ベクターで増幅され、
ファージＤＮＡから単離された。表XIから明らかなよう
に、ＥＣＥＰＯセクション２はＥcoＲＩおよびＢamＨＩ
付着端から構成されており、ＫpnＩ／ＢglIIフラグメン
トとして単離することができた。同様に、ＥＣＥＰＯセ
クション３をＢamＨＩおよびＳalＩ付着端から調製し、
ＢglII／ＳalＩフラグメントとしてファージＲＦＤＮＡ
から単離することができた。このように調製された３つ
のセクションは、大腸菌翻訳開始のアミノ末端メチオニ
ンコドン（ＡＴＧ）を含み、完全なヒトＥＰＯポリペプ
チドをコードするＤＮＡ連鎖（表 XIV）として容易に組
立てすることができる。開始ＡＴＧの「上流」には、大
腸菌の高度な発現ＯＭＰ−ｆ遺伝子におけるリボソーム
結合部位配列を実質的に複製する一連の塩基対が存在し
ていることにも注目されたい。 【０１４１】適切な発現ベクターを用いてＥＣＥＰＯを
運搬することができる。特定のベクターとして、チャー
ルズ・エフ・モーリス(Charles F. Morris) により1984
年 8月 6日に出願され、同時に係属中の米国特許出願第
636,727 号（公開された欧州特許出願No. 136,490 ）に
記載された、プラスミドpCFM414(A.T.C.C.40076)の誘導
体である「温度感受性」プラスミドpCFM536 をＥＣＥＰ
Ｏ遺伝子発現用に選択した。より具体的にはpCFM536 を
ＸbaＩおよびＨinｄIII で消化し、大フラグメントを単
離して、ＥＣＥＰＯ遺伝子と２つの部分で結合させるの
に用いた。セクション１（ＸbaＩ／ＫpnＩ）、２（Ｋpn
Ｉ／ＢglII）および３（ＢglII／ＳalＩ）をＭ13内で正
確な順序で予め組立てておき、ＥＰＯ遺伝子をそれから
一本のＸbaＩ／ＨinｄIII フラグメントとして単離し
た。このフラグメントは、Ｍ13mp 9ファージ由来のＳal
ＩからＨinｄIII までの部位のポリリンカーの部分を有
していた。得られた発現プラスミドp536による発現の制
御はラムダＰＬ プロモーターによりなされたが、この
プロモーター自体、ＣＩ８５７リプレッサー遺伝子（例
えば、大腸菌株Ｋ１２ΔＨｔｒｐ から得られる）の支
配下にある。 【０１４２】上記合成ＥＣＥＰＯ遺伝子は、下記のよう
な［Ａsn２ 、des-Ｐro２ 〜Ｉle６］ｈＥＰＯおよび
［Ｈis７ ］ｈＥＰＯのようなエリスロポエチン類縁体
をコードするように様々に変更してもよい。Ａ．［Ａsn ２ 、des-Ｐro ２ 〜Ｉle ６ ］ｈＥＰＯ ＸbaＩ〜ＨinｄIII 挿入体として、表 XIVのＥＣＥＰＯ
合成遺伝子を担持するプラスミド 536をＨinｄIII およ
びＸhoＩで消化した。後者のエンドヌクレアーゼは、Ａ
sp８ をコードするコードンの最後の塩基からＡrg１０
コードンの二番目の塩基までの唯一の６塩基対認識部位
においてＥＣＥＰＯ遺伝子を切断する。ＸbaＩ／ＸhoＩ
「リンカー」配列を製造したが、それは次の配列を有し
ていた。 【化４】 【０１４３】ＸbaＩ／ＸhoＩリンカーおよびＸhoＩ／Ｈ
inｄIII ECEPO 遺伝子鎖フラグメントを、チャールズ・
エフ・モーリス(Charles F. Morris) により1984年 8月
6日に出願され、同時に係属中の米国特許出願第636,72
7 号明細書に記載された、プラスミド pCFM414（A.T.C.
C.40076 ）の誘導体であるプラスミドpCFM526 のＸbaＩ
およびＨinｄIII 切断により得られる大フラグメントに
挿入し、所望の類似体のＭet−１型の大腸菌発現をコー
ドするプラスミド担持ＤＮＡ配列を得た。Ｂ．［Ｈis ７ ］ｈＥＰＯ プラスミド 536を、前記ＡのようにＨinｄIII およびＸ
hoＩで切断した。ＸbaＩ／ＸhoＩリンカーを製造した
が、それは次の配列を有していた。 【化５】 【０１４４】リンカーおよびＸhoＩ／ＨinｄIII ECEPO
配列フラグメントを次いでpCFM526に挿入し、所望の類
縁体のＭet−１型の大腸菌発現をコードするプラスミド
担持ＤＮＡ配列を得た。 【０１４５】酵母菌の優先コドンを取込んだ合成遺伝子
（「SCEPO 」）の構造は、以下の表XV〜XXI に示したと
おりである。ECEPO 遺伝子の場合と同様に、完全な構築
には３組のオリゴヌクレオチド（表XV、XVIIおよびXIX
）形成が含まれており、これを二重鎖に形成し、各セ
クション（表 XVI、XVIII およびXX）に組立てた。合成
は、SCEPO およびECEPO の構造においていくらか適合性
のある(sub-optimal) コドン（即ち、各遺伝子における
セクション２のオリゴヌクレオチド１〜６と同様に、各
遺伝子のセクション１のオリゴヌクレオチド 7〜12が一
致する）を用いることにより、部分的に容易化されたこ
とに注目されたい。 【表２３】【０１４６】 【表２４】 【０１４７】 【表２５】【０１４８】 【表２６】 【０１４９】 【表２７】【０１５０】 【表２８】 【０１５１】 【表２９】 【０１５２】組立てられたＳＣＥＰＯセクションがＭ13
にて配列決定され、セクション１、２および３はＨinｄ
III ／ＫpnＩ、ＫpnＩ／ＢglIIおよびＢglII／ＳalＩフ
ラグメントしてファージから単離可能であった。 【０１５３】ＳＣＥＰＯ遺伝子生成物にとり現在好まし
い発現系は、グランド・エー・ビッターにより1983年4
月22日に出願され、同時に欧州特許出願第0123,294号と
して1984年10月31日に公開された、係属中の米国特許出
願第487,753 号明細書に記載されているようなサッカロ
マイセス・セレビシエのα‐因子分泌に基づく分泌系で
ある。簡単に言えば、この系は、酵母α‐因子遺伝子生
成物のリーダー配列をコードするＤＮＡが、発現すべき
外来性遺伝子の暗号領域の 5′側に直接位置している構
造からなる。その結果、翻訳された遺伝子生成物は、余
剰生成物の分泌時に、内在酵母酵素によって「切離され
る」リーダーまたはシグナル配列を含んでいる。この構
築ではα‐因子翻訳開始（ＡＴＧ）コードンを利用して
いるため、ＳＣＥＰＯ遺伝子の−１位にそのようなコー
ドンを付与する必要がなかった。表XXI から明らかにな
るであろうように、アラニン（+1）暗号配列は、α‐因
子プロモーターに続くα‐因子リーダーの最初の80残基
のＤＮＡを含むプラスミドに直接挿入されるリンカー配
列の後にきている。SCEPO 遺伝子発現のための特定の好
ましい構築においては、前記SCEPO セクションフラグメ
ントおよびプラスミド pαＣ３のＨinｄIII ／ＳalＩ消
化による大フラグメントからなる４部分の結合が行なわ
れる。得られるプラスミド pαＣ３／SCEPO から、α‐
因子プロモーター、リーダー配列およびSCEPO 遺伝子を
ＢamＨＩ消化により単離し、ＢamＨＩ消化プラスミド p
ＹＥと連結させて、発現プラスミド pYE／SCEPO を形成
した。 【０１５４】例 １２ 本例は、例１１の発現系における、合成ECEPO およびSC
EPO 遺伝子の組換え生成物の発現に関する。 【０１５５】大腸菌宿主細胞に用いられる発現系におい
て、例１１のプラスミド p536 を、ＣＩ８５７遺伝子を
有する適切なプラスミド pMW1 で予めトランスフォーメ
ーションされたＡＭ7 大腸菌細胞に移入させた。ＬＢブ
ロス（アンピシリン50μｇ／mlおよびカナマイシン５μ
ｇ／ml、好ましくは 10mM MgSO４ も添加）中の培養細
胞を28℃に維持し、 OD. 600＝0.1 となるまで培養細胞
が増殖してから、培養温度を42℃に上げてＥＰＯ発現を
誘導した。約40 OD.まで増殖した細胞は、約５mg/OD.リ
ットルのＥＰＯ生成物（ゲルで評価）を産生した。 【０１５６】細胞を採取し、分離し、フレンチプレス
（10000psi）で破壊し、リゾチームおよびＮＰ‐40界面
活性剤で処理した。24000 xg遠心分離で得たペレットを
塩酸グアニジンで溶解し、Ｃ４ （バイダック、Ｖyda
c）リバース・フェース（ReversePhase ）ＨＰＬＣ（エ
タノール 0〜80％、50mM ＮＨ4 Ａｃ、pH 4.5）により
一工程で更に精製した。分離した蛋白質は95％以上純粋
な生成物であり、得られた生成物は、約３：１の量比
で、二つの異なるアミノ末端 A-P-P-R……および P-P-R
……を有していた。ｈＥＰＯおよび［ desＡla１ ］ｈ
ＥＰＯ生成物についての後者の観察は、宿主細胞におけ
るアミノ末端「プロセッシング」が、末端メチオニンお
よびある場合には開始アラニンを除去するように作用す
ることを示している。単離物のラジオイムノアッセイ活
性は150000〜160000 U／mgであり、イン・ビトロ分析活
性では 30000〜62000 U/mgであり、更にイン・ビボ分析
活性では約 120〜720 U/mgであった（参考のために、各
分析におけるヒト尿単離物標準は70000 U/mgである）。
イン・ビボ分析における組換え生成物の用量応答曲線
は、ヒト尿ＥＰＯ標準のものとは著しく異なっていた。 【０１５７】例１１のＡおよびＢで形成されたＥＰＯ類
似プラスミドを、 pＭＷ１でトランスフォーメーション
されたＡＭ7 大腸菌細胞にそれぞれ移入させ、細胞を上
記のように培養した。精製単離物をＲＩＡおよびイン・
ビトロ分析で試験した。［Ａsn２ 、des-Ｐro２ 〜Ｉle
６ ］ｈＥＰＯ発現生成物のＲＩＡおよびイン・ビトロ
分析値はそれぞれ約11000 U/mgおよび6000 U／mg蛋白質
であったが、［Ｈis７］ｈＥＰＯの分析値はそれぞれ約
41000 U/mgおよび14000 U/mg蛋白質であって、類似生成
物が分析によると「親」発現生成物の 1/4〜1/10「活
性」であることが示された。 【０１５８】サッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞に
用いられる発現系において、プラスミド pYE／SCEPO を
二つの異なる株、即ち、YSDP4 （遺伝子型α pep4-3 tr
p1）およびＲＫ81（遺伝子型ααpep4-3 trp1 ）に移入
させた。トランスフォーメーションされたYSDP4 宿主
を、カザミノ酸が 0.5％添加されたpH 6.5のＳＤ培地
［ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー所在、
コールドスプリングハーバーラボラトリー、「酵母遺伝
学の方法(Methods in Yeast Genetics) 、第62頁、1983
年］で30℃にて増殖させた。細胞が36 OD.まで増殖した
ときに採取した培地は、ＥＰＯ生成物を約244 U/ml（Ｒ
ＩＡで97μｇ／OD・リットル）含有していた。6.5 OD.
または60 OD.まで増殖した形質転換ＲＫ81細胞は、約80
〜90 U／mlのＥＰＯ濃度（ＲＩＡで34μｇ／OD・リット
ル）の培地を与えた。予備分析では、発現系により得ら
れる生成物は極めて不均一であったが、それはおそらく
発現される蛋白質のグリコシル化が様々であり、関連す
る炭水化物の中でマンノース含量が比較的高かったため
であろう。 【０１５９】ＨＢ 101大腸菌細胞に含まれるプラスミド
ＰαＣ３ および pＹＥを、1984年9月27日に米国特許庁
施行規則に従い、それぞれ受託番号A.T.C.C. No.39881
およびA.T.C.C.No.39882として、メリーランド州、ロッ
クビル、パークローン・ドライブ12301 のアメリカン・
タイプ、カルチャー・コレクション（American Type Cu
lture Collection）に寄託した。ＡＭ7 細胞中のプラス
ミド pCFM 526 、ＪＭ103 細胞中のpCFM 536およびＪＭ
103細胞のpMW1を同様に、それぞれ A.T.C.C. No.3993
2、No.39934および No.39933 として、1984年11月21日
に寄託した。サッカロマイセス・セレビシエ株YSPD4 お
よびＲＫ81をそれぞれA.T.C.C. No.20734 およびNo.207
33として1984年11月21日に寄託した。 【０１６０】前述のように、本発明の組換え体由来生成
物は、天然源からのＥＰＯ単離物のイン・ビトロ生物学
的活性を様々な程度で保有しており、したがって赤血球
形成細胞の増殖に用いられる培地において、ＥＰＯ単離
物に対する代替物としての利用性を有するものと考えら
れる。同様に、本発明のポリペプチド生成物が天然ＥＰ
Ｏ単離物のイン・ビボ活性を有する範囲内において、そ
れらはヒトをはじめとする哺乳動物におけるエリスロポ
エチン治療処置に用いるのに極めて好適であり、イン・
ビボでのＥＰＯに起因する効果、例えば、網状赤血球応
答の刺激、鉄動態効果の促進（例えばプラズマ鉄回転効
果および骨髄通過時間効果）、赤血球質量変化、ヘモグ
ロビン合成促進および例１０に示した哺乳動物における
ヘマトクリット値の増加などのあらゆる効果を促進させ
る。本発明の生成物で治療可能なヒトの分類の中には、
一般に輸血を要する患者、外傷者などの外科患者、透析
患者などの腎疾患患者並びに血友病、鎌型赤血球病及び
生理学的貧血などのような各種血液組成に影響を及ぼす
疾患の患者が含まれる。ＥＰＯ治療の採用による輸血治
療の必要性の最小化は感染物質による感染の抑制につな
がると期待される。本発明の生成物は、組換え法により
生産されたものであるため、発熱物質、天然阻害物質等
が混入しておらず、このため天然由来生成物と比べ、高
い総合的な治療効果を発揮すると予想される。本発明の
生成物によるエリスロポエチン治療は、低酸素環境条件
下にある個体において酸素供給能を高め、更には可能性
として有益な心臓脈管系効果をもたらすと期待される。 【０１６１】本発明のポリペプチド生成物を投与するた
めの好ましい方法は、非経口投与（例えば、静注、筋
注、皮下注または腹腔内注）であり、投与される組成物
には、治療有効量の生成物が、許容される希釈剤、担体
および／またはアジュバントとともに通常含有されてい
る。有効量は治療条件によって実質上変動すると思われ
るが、治療量は実際には活性物質の7U〜7000 U／kg体重
の範囲内であると予想される。ヒト血清アルブミンのよ
うな標準的希釈剤が本発明の医薬組成物用として考えら
れ、生理的食塩水のような標準的担体が同様に考えられ
る。 【０１６２】本発明の組成物に使用するのに好適なアジ
ュバント物質には、テストステロン、前駆細胞刺激剤、
インシュリン様成長因子、プロスタグランジン類、セロ
トニン、サイクリックＡＭＰ、プロラクチンおよびトリ
ヨードチロニンのように赤血球生成刺激効果に関して独
立に注目される化合物、並びにメテノレン、スタノゾロ
ールおよびナンドロロンのように、再生不良性貧血の治
療に一般に用いられる薬物が含まれる。 【０１６３】更にアジュバントとして考えられるものに
は、アドレナリン作動性物質、甲状線ホルモン、男性ホ
ルモンおよびＢＰＡのように、エリスロポエチンまたは
アシアロ‐ＥＰＯの効果を高めること、あるいは補強す
ること、が報告された物質並びに「肝造血因子」と目さ
れる化合物類、「エリスロトロピン類」（Erythrotropi
ns）および「エリスロジェニン類」(erythrogenins) が
挙げられる。 【０１６４】本発明ポリペプチドの診断的用途も同様に
広範であり、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ等の各種イムノア
ッセイ技術、並びに各種のイン・ビトロおよびイン・ビ
ボ活性分析において標識および未標識型での使用が挙げ
られる。 【０１６５】本発明の他の面によれば、ここに記載され
た、ヒトおよびサルＥＰＯポリペプチドをコードするク
ローンＤＮＡ配列は、天然生成物の単離物についての数
10年間にわたる分析にもかかわらず今まで利用できなか
った哺乳類エリスロポエチンアミノ酸配列に関し、それ
らが与える情報において極めて価値が高い。このＤＮＡ
配列はまた、各種組換え技術によって大量のエリスロポ
エチンを微生物合成するのに役立つ生成物としても極め
て価値がある。即ち、本明細書で示したＤＮＡ配列は、
新規でかつ有用なウィルス性および環状プラスミドＤＮ
Ａベクター、新規でかつ有用なトランスフォーメーショ
ンおよびトランスフェクションされた原核ならびに真核
宿主細胞（培地で増殖される細菌、酵母細胞および哺乳
類細胞が含まれる）およびＥＰＯ、並びにＥＰＯ生成物
の発現が可能な微生物宿主細胞の新規でかつ有用な培養
増殖方法を得る上で有益である。本発明のＤＮＡ配列
は、ここに具体的に説明したヒトおよびサル種以外の哺
乳動物種におけるＥＰＯおよび関連蛋白質をコードする
cＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列を単離する上で、標識
化プローブとして使用するのに極めて適した物質でもあ
る。本発明のＤＮＡ配列が、各種の別の蛋白質合成方法
において（例えば昆虫の細胞）、あるいはヒトおよび他
の哺乳動物の遺伝子治療において使用される範囲は計算
できない。本発明のＤＮＡ配列は、エリスロポエチンお
よびエリスロポエチン生成物を大量に産生する真核「宿
主」として機能する遺伝子変異哺乳動物種を得る上で有
用であると予想される。一般的には、パーミターら：
「サイエンス」、第222 巻、第4625号、第 809-814頁、
1983年［Palmiter, et al., Science, 222(4625), 809-
814(1983)］参照。 【０１６６】この観点からすれば、したがって、特定の
実施例の開示は本発明の範囲を制限するものでないこと
は明白であり、多数の改変および変更が当業者において
考えられる。一例として、実施例で得られるＤＮＡ配列
は cＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列を含み、それは本発
明がＤＮＡ配列の製造に必要なアミノ酸配列情報を提供
するためのものだからであるが、本発明にはＥＰＯアミ
ノ酸配列の情報に基づいて調製されるような合成ＤＮＡ
配列も含まれる。 【０１６７】同様の意味で、前記諸例は、細菌性プラス
ミドおよびウィルス性ゲノム起源のハイブリッドベクタ
ーに挿入されたＤＮＡの哺乳動物細胞発現に関し、ＥＰ
Ｏ生成物を微生物発現させる発明を説明するものである
が、広範な発現系が本発明の概念の中に含まれる。特
に、培養された各種細菌、酵母菌及び哺乳動物細胞に適
用される均一源からのベクターを含む発現系、及びベク
ターを含まない発現系（例えば、リン酸カルシウムでト
ランスフェクションされた細胞）が含まれる。 【０１６８】本発明のハイブリッド形成改良方法は、実
際には上記ＤＮＡ／ＤＮＡスクリーニングに用いられた
が、これはＲＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＤＮＡスクリ
ーニングにて同様に適用可能である。ここに説明したよ
うな混合プローブ技術は、一般に、より迅速にかつ信頼
をもってポリヌクレオチドを単離できるハイブリッド形
成過程において多くの改良点を有している。これらの多
数の個々の操作上の改良点としては、改良されたコロニ
ー移転および保存方法、および同様のフィルターで再プ
ローブ化でき、フィルターの繰返し使用が可能で、新規
なプロテアーゼ処理の適用を可能にするジーンスクリー
ン(Gene Screen) およびジーンスクリーン・プラス（Ge
ne Screen Plus）のようなナイロン基質フィルターの使
用［例えば、タウブら：「アナリテイカル・バイオケミ
ストリー」、第126 巻、第 222-230頁、1982年［Taub,
et al., Anal. Biochem., 126, pp222-230 (1982)］と
比較されたい］、多数の混合プローブ（例えば、32種類
を超える数）のそれぞれの極めて低い濃度（0.025 ピコ
モルのオーダー）での使用、および、用いられる全ての
混合プローブの中の最低の計算解離温度に非常に近い厳
格なる温度下での（即ち、それより４℃以内、好ましく
は２℃以内での）ハイブリダイゼーションおよびポスト
ハイブリダイゼーション工程の実施、が挙げられる。こ
れらの改良点を組合わせると、それらの実施によるもの
とは予想できない程の結果が得られる。このことは、比
較的低めの充分量なるメッセンジャーＲＮＡ種に cＤＮ
Ａスクリーンを用いると好結果が得られたと今までに報
告されたプローブ数の４倍量を含む混合プローブ操作
を、 1,500,000のファージプラークのゲノムライブラリ
ースクリーニングにおいて唯一の遺伝子配列を単離する
のに適用して成功した、という事実により詳細に説明さ
れる。この偉業は、アンダーソンらの、「混合プローブ
スクリーニング法は相当するＲＮＡの遺伝子が利用でき
ない限り、哺乳類蛋白質遺伝子を単離するのは実際上不
可能である」との論評の公開と実質上同時に行なわれた
ものである。（アンダーソンら：「P.N.A.S 」、米国、
第80巻 第6838-6842 頁、1983年） 【０１６９】 【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kirin-Amgen Inc. <120> Process for preparing mammalian cells capable of producing human erythropoietin <130> PA01-261 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ラジオイムノアッセイによる組換えヒ
ト及びサルＥＰＯの活性を示したものである。 【図２】図２は、ベクター pＤＳＶＬ‐ＭｋＥ， pＳＶ
ｇＨｕＥＰＯ及び pＤＳＶＬ‐ｇＨｕＥＰＯを示したも
のである。 【図３】図３は、ベクター pＤＳＶＬ‐ＭｋＥ， pＳＶ
ｇＨｕＥＰＯ及び pＤＳＶＬ‐ｇＨｕＥＰＯを示したも
のである。 【図４】図４は、ベクター pＤＳＶＬ‐ＭｋＥ， pＳＶ
ｇＨｕＥＰＯ及び pＤＳＶＬ‐ｇＨｕＥＰＯを示したも
のである。
ト及びサルＥＰＯの活性を示したものである。 【図２】図２は、ベクター pＤＳＶＬ‐ＭｋＥ， pＳＶ
ｇＨｕＥＰＯ及び pＤＳＶＬ‐ｇＨｕＥＰＯを示したも
のである。 【図３】図３は、ベクター pＤＳＶＬ‐ＭｋＥ， pＳＶ
ｇＨｕＥＰＯ及び pＤＳＶＬ‐ｇＨｕＥＰＯを示したも
のである。 【図４】図４は、ベクター pＤＳＶＬ‐ＭｋＥ， pＳＶ
ｇＨｕＥＰＯ及び pＤＳＶＬ‐ｇＨｕＥＰＯを示したも
のである。
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フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ６７５２９８
(32)優先日 昭和59年11月30日(1984．11．30)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヒトエリスロポエチンの成熟部分にあたる配列番号
１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮ
Ａと、ヒトエリスロポエチンプロモーター以外の転写制
御配列との機能的結合を哺乳動物細胞中に生ぜしめる工
程を含むことを特徴とする、ヒトエリスロポエチン産生
哺乳動物細胞の作製方法。 ２．配列番号１に示すアミノ酸配列の構成アミノ酸残基
の１以上が欠失、置換、付加及び／又は挿入され、天然
型のヒトエリスロポエチンとは異なったアミノ酸配列を
有し、かつヒトエリスロポエチンの生物学的活性を有す
る蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡと、ヒトエ
リスロポエチンプロモーター以外の転写制御配列との機
能的結合を哺乳動物細胞中に生ぜしめる工程を含むこと
を特徴とする、ヒトエリスロポエチンの生物学的活性を
有する蛋白質を産生する哺乳動物細胞の作製方法。 ３．請求項１に示すＤＮＡと、ヒトエリスロポエチンプ
ロモーター以外の転写制御配列との機能的結合の近傍に
薬剤耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を配置し、薬剤
の添加により遺伝子増幅を生ぜしめる工程をさらに含む
ものである、請求項１に記載の方法。 ４．前記薬剤耐性遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
遺伝子であり、前記薬剤がメトトレキセートである、請
求項３に記載の方法。 ５．前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞が、ラ
ジオイムノアッセイによる測定において、１０6個の細
胞あたり４８時間に１００Ｕを超えるヒトエリスロポエ
チンを培地中に産生するものである、請求項１に記載の
方法。 ６．前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞が、ラ
ジオイムノアッセイによる測定において、１０6個の細
胞あたり４８時間に５００Ｕを超えるヒトエリスロポエ
チンを培地中に産生するものである、請求項１に記載の
方法。 ７．前記ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞が、ラ
ジオイムノアッセイによる測定において、１０6個の細
胞あたり４８時間に１０００Ｕを超えるヒトエリスロポ
エチンを培地中に産生するものである、請求項１に記載
の方法。 ８．請求項２に示すＤＮＡと、ヒトエリスロポエチンプ
ロモーター以外の転写制御配列との機能的結合の近傍に
薬剤耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を配置し、薬剤
の添加により遺伝子増幅を生ぜしめる工程をさらに含む
ものである、請求項２に記載の方法。 ９．前記薬剤耐性遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
遺伝子であり、前記薬剤がメトトレキセートである、請
求項８に記載の方法。 １０．前記ヒトエリスロポエチンの生物学的活性を有す
る蛋白質を産生する哺乳動物細胞が、ラジオイムノアッ
セイによる測定において、１０6個の細胞あたり４８時
間に１００Ｕを超えるヒトエリスロポエチンの生物学的
活性を有する蛋白質を培地中に産生するものである、請
求項２に記載の方法。 １１．前記ヒトエリスロポエチンの生物学的活性を有す
る蛋白質を産生する哺乳動物細胞が、ラジオイムノアッ
セイによる測定において、１０6個の細胞あたり４８時
間に５００Ｕを超えるヒトエリスロポエチンの生物学的
活性を有する蛋白質を培地中に産生するものである、請
求項２に記載の方法。 １２．前記ヒトエリスロポエチンの生物学的活性を有す
る蛋白質を産生する哺乳動物細胞が、ラジオイムノアッ
セイによる測定において、１０6個の細胞あたり４８時
間に１０００Ｕを超えるヒトエリスロポエチンの生物学
的活性を有する蛋白質を培地中に産生するものである、
請求項２に記載の方法。
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