TW201522629A - 提供治療多肽之持續遞送的微器官及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係相關於一種長效型治療配方及其使用方法，其中該配方包含一經基因修飾之微器官，其包含操作性連結至一或多個調節序列之一核酸序列。本發明更相關於提供治療多肽，如紅血球生成素與干擾素之持續表現與延長治療效用。

Description

提供治療多肽之持續遞送的微器官及其使用方法 相關申請案
本申請案申明於2013年10月24日提申之美國臨時申請案號61/894,960，於2014年4月28日提申之美國臨時申請案號61/985,368，於2014年10月14日提申之美國臨時申請案號62/063,608之優先權，每一者皆在此完整併入本案以作為參考資料。
序列表參考
本申請案包含一序列表，其已以ASCII版本電子檔提交，並在此完整併入本案以作為參考資料。該ASCII版本於2014年10月21日製作，命名為01118-0001-00TW_SL.txt。
發明領域
本發明係相關於一種經基因修飾之微器官，其提供治療多肽之持續遞送。使用提供治療多肽之持續遞送之經基因修飾微器官之方法，可提供有需要個體之延長治療效果。由本發明經基因修飾之微器官提供之治療多肽包括人類紅血球生成素與人類干擾素。
發明背景
治療多肽可口服、經皮、吸入、注射或緩釋儲存投藥。然而，治療多肽之有效持續遞送，與治療多肽後續之延長治療效果，受到置入體內之多肽之分解代謝與失活、需經常製造、純度與多肽投藥之限制，以及可利用分子之大小限制。就某些方法而言，治療多肽之量會因每次投藥而不同。
治療多肽純化流程的發展是一個非常漫長的過程。一旦重組蛋白經純化，則必須進一步配製以使之穩定，並可用於導入動物或人體中。此外，即使已經配製，經純化重組蛋白之使用壽命有限，由於維持與保存之限制；通常需要反覆純化與配製更多蛋白質。因此，開發治療多肽適當配方的過程是相當耗時、困難且昂貴的。
例如，紅血球生成素(EPO)是一種治療多肽，對於定向(committed)紅血球前驅細胞之生長與分化相當關鍵，必須保持持續低量之EPO，以滿足必須不斷更新由於衰老或失血而失去的紅血球之需求。末期腎臟病(ESRD)患者普遍有貧血現象，由於腎臟功能下降而使血清中EPO量逐漸降低。如果不進行治療，慢性腎臟病(CKD)引起之貧血，會造成心臟功能惡化、認知下降，而且往往會引起重要症狀，包括疲勞、虛弱和嗜睡。許多患者甚至無法進行日常生活之正常活動。目前的治療方案包括提供濃縮紅血球(PRBC)輸血，或外源性投予重組人類紅血球生成 素(rHuEPO)。大多數進行血液透析之患者(90%以上)接受靜脈內(IV)或皮下(SC)rHuEPO投藥，每週三次。
其他的研究顯示，rHuEPO之遞送方法對於臨床療效(每單位劑量rHuEPO之Hb增加)具有顯著影響。儘管與IV投藥相較，其生物利用率下降，rHuEPO之皮下(SC)遞送，仍可維持Hb於希望範圍內，為所需劑量之25-50%減少量範圍內。這被認為是血清EPO藥物動力學(PK)的結果，使得SC投藥可允許更長的時間週期，當血清EPO量維持在高於臨界值，以支持定向紅血球前驅物存活(突發形成和集落形成單元)。非常低或者迅速下降之血清EPO量，伴隨著間歇rHuEPO之IV投藥而發生，甚至與rHuEPO之SC投藥伴隨發生，被認為有助於這些定向紅血球前驅物的早期損耗，以及後續需要更高劑量的rHuEPO。
與頻繁投予rHuEPO及rHuEPO量相關之尖峰和低谷，被認為會導致不良健康事件。一種可產生持續低量EPO之遞送方法，以支持持續紅血球前驅物生存，將有益於更有效地治療CKD和ESRD患者之貧血，於較低之整體暴露於rHuEPO之情況下。
因此，此領域仍需要用於治療多肽產物配方，其可提供該治療多肽持續遞送一段時間，持續數週、數月或以上，以及提供這些配方持續遞送之方法，至有需要的個體，以治療疾病。
發明概要
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之微器官，其提供治療多肽之持續遞送，該微器官包含一載體，其包含編碼該治療多肽之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，並包含至少一額外調節序列，其中該至少一經基因修飾之微器官，係於個體體內表現該治療多肽持續至少三個月，如至少六個月。
在另一實施例中，本發明提供一種經基因修飾之微器官，其提供治療多肽之持續遞送，該微器官包含一輔助病毒依賴型腺病毒(HdAd)載體，或AAV載體，其包含編碼該治療多肽之核酸序列，操作性連結至一上游MAR調節序列，並包含至少一額外調節序列，其中該至少一經基因修飾之微器官，係於個體體內表現該治療多肽持續至少三個月，如至少六個月。
該治療多肽為人類紅血球生成素或人類干擾素。在某些實施例中，該至少一額外調節序列包含一MAR序列、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列，或一WPRE序列。
在某些實施例中，該至少一額外調節序列包含另一MAR調節序列與一EF1α促進子。在某些實施例中，該治療多肽為人類紅血球生成素，且該編碼紅血球生成素之核酸經最佳化，如SEQ ID NO：2所示。在某些實施例中，該經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官。
在某些實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含如圖3之表現卡匣。該圖3所示之表現卡匣(請見SEQ ID NO：11)特別包含無CpG之人類β-球蛋白MAR調節序列(SEQ ID NO：6)；一EF1α促進子(SEQ ID NO：18)；一編碼由該微器官表現之治療多肽之基因，如編碼人類EPO或IFN之基因，不論是經最佳化或野生型；SV40聚A序列(SEQ ID NO：9)；以及人類IFNβ S/MAR調節序列(SEQ ID NO：5)。因此，該組成物與此述方法之某些實施例，係使用經基因修飾之微器官，包含一載體，其包含含有MAR與EF1α調節因子之核酸序列，之後接著待表現之基因，之後接著SV40聚A序列與另一MAR序列，如圖3所示。
在一實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒(HdAd)載體，或AAV載體，其包含如圖3所示之表現卡匣。
在其他實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含如圖3所示之表現卡匣，其中該表現卡匣為不含CpG。在另一實施例中，僅有MAR因子與EPO基因不含CpG。
在某些實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒(HdAd)載體，或AAV載體，其包含如圖3所示之表現卡匣，其中該表現卡匣不含CpG。在另一實施例中，僅有MAR因子與EPO基因不含CpG。
在一實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：11之核酸。在一實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含SEQ ID NO：11之核酸。
在一實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒(HdAd)載體，或AAV載體，其包含至 少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：11之核酸。
在一實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒載體，或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：11之核酸。
在一實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒載體，其包含如SEQ ID NO：22之核酸，或至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：22之核酸。
在一實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含AAV載體，其包含如SEQ ID NO：26或27之核酸，或至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：26或27之核酸。
在一實施例中，經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒載體，或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：11之核酸，其中該如SEQ ID NO：11之核酸不含CpG。在另一實施例中，SEQ ID NO：11中僅有MAR因子與EPO基因不含CpG。在一實施例中，該核酸為至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：11之核酸，且部分或全部不含CpG。
在一方法實施例中，本發明提供一種治療有需要人類個體之貧血持續一段期間之方法，包含下列步驟：提供至少一經基因修飾之微器官，其提供人類紅血球生成素之持續遞送，該微器官包含一載體，其包含編碼人類紅血球生成素之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，並包含至少一額外調節序列；體外測定該至少一經基 因修飾之微器官之紅血球生成素分泌量；植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及測量該個體血清中之紅血球生成素含量；其中該至少一經基因修飾之微器官之植入，可增加體內紅血球生成素之血清含量超過基礎量至少三個月，如至少六個月。
在另一方法實施例中，本發明係提供一種治療有需要人類個體之貧血持續一段期間之方法，包含下列步驟：提供至少一經基因修飾之微器官，其提供人類紅血球生成素之持續遞送，該微器官包含一包含輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，其包含編碼人類紅血球生成素之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，且其中該核酸任擇地包含至少一額外調節序列；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之紅血球生成素分泌量；植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及測量該個體血清中之紅血球生成素含量；其中該至少一經基因修飾之微器官之植入，可增加體內紅血球生成素之血清含量超越基礎量至少三個月。
在上述每一方法與非方法實施例中，該至少一經基因修飾之微器官可為經基因修飾之皮膚微器官。在某些實施例中，該任擇性至少一額外調節序列可包含一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列、一額外MAR調節序列，或一WPRE序列。該額外調節序列可包括一EF1α促進子序列與一額外MAR調節序列。在某些實施例中，該治療貧血之方法包含提供一經基因修飾之皮膚微器官，其包含輔助病 毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：11之核酸，或至少85%、至少90%，或至少95%等同於SEQ ID NO：11之核酸序列。
在某些實施例中，紅血球生成素之有效劑量為約18-150U(或IU)紅血球生成素/Kg個體體重/日。在其他實施例中，紅血球生成素之有效劑量為18-25U(或IU)紅血球生成素/Kg該個體體重/日、35-45U(或IU)紅血球生成素/Kg該個體體重/日，55-65U(或IU)紅血球生成素/Kg該個體體重/日。在一實施例中，該植入之至少一經基因修飾之微器官提供紅血球生成素持續遞送至有需要之個體至少三個月。在另一實施例中，個體內血清紅血球生成素量會增加超過基礎值至少六個月。
在某些實施例中，本發明方法更包含在植入至少一經基因修飾之微器官後，測量該個體血液中之血紅素位準之步驟，其中該個體測得之血紅素位準增加，且之後於測量值之至少50%維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月，或血紅素位準於測量值之至少50%維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月。在某些案例中，該測出之血紅素位準於測量值之至少50%為9-11g/dl至少六個月。在某些案例中，該測出之血紅素位準於測量值之至少50%為至少9-11g/dl至少三個月。在某些案例中，該測出之血紅素位準於測量值之至少50%為至少9-11g/dl至少六個月。
在某些實施例中，本發明方法更包含於稍後日期植入至少一額外經基因修飾之微器官至該個體之步驟，其 可持續遞送人類紅血球生成素，該微器官包含一載體，其包含編碼該治療多肽之核酸序列，操作性連結至一上游MAR調節序列，並包含至少一額外調節序列。在一實施例中，該至少一額外經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官。在某些實施例中，該任擇性至少一額外調節序列可包含一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列、一額外MAR調節序列或一WPRE序列。在某些實施例中，該額外調節序列包括一EF1α促進子序列與一額外MAR調節序列。在某些實施例中，該至少一額外經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒載體，或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：11之核酸，或至少85%、至少90%，或至少95%等同於SEQ ID NO：11之核酸序列。
在上述方法之某些實施例中，植入經基因修飾之微器官包含皮下或皮內或真皮植入。
本發明係提供另一方法實施例，一種提供人類個體中增加血清紅血球生成素含量持續一段時間之方法，包含下列步驟：提供至少一經基因修飾之微器官，其提供人類紅血球生成素之持續遞送，該微器官包含一載體，其包含編碼人類紅血球生成素之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，並包含至少一額外調節序列；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之紅血球生成素分泌量；植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及測量該個體血清中之紅血球生成素含量，其中該至少一經基因修飾之微器官之植入，可增加體內紅血球 生成素之血清含量超越基礎量至少三個月。在一實施例中，體內紅血球生成素之血清含量增加超越基礎量至少六個月。在一實施例中，該至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官。在某些實施例中，紅血球生成素之有效劑量為約18-150U(或IU)紅血球生成素/Kg個體體重/日。在其他實施例中，紅血球生成素之有效劑量為18-25U(或IU)紅血球生成素/Kg該個體體重/日、35-45U(或IU)紅血球生成素/Kg該個體體重/日，55-65U(或IU)紅血球生成素/Kg該個體體重/日。在某些實施例中，該載體為輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體。在某些實施例中，該至少一額外經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：11之核酸，或至少85%、至少90%，或至少95%等同於SEQ ID NO：11之核酸序列。在某些實施例中，該至少一額外經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17之核酸，或至少85%、至少90%，或至少95%等同於SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17之核酸序列。
在某些實施例中，該任擇性至少一或多額外調節序列可包含一MAR序列、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列，或一WPRE序列。在某實施例中，該額外調節序列包括一EF1α促進子序列與一額外MAR調節序列。在某些實施例中，該方法更包含在植入至少一經基因修飾之微器官之後，測量該個體血清中之紅血球生成素位準，其中該個 體測出之血紅素位準增加，且之後於測量值之至少50%維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月，或血紅素位準於測量值之至少50%維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月。在某些案例中，該測出之血紅素位準於測量值之至少50%為9-11g/dl或9-12g/dl至少六個月。在某些實施例中，該方法提供人類個體增加之紅血球生成素量持續一段時間，包含提供該人類個體經基因修飾之皮膚微器官，其包含輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：11之核酸，或至少85%、至少90%，或至少95%等同於SEQ ID NO：11之核酸序列。
本發明方法中，紅血球生成素係遞送至一個體中，該個體患有：腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、化療引起的貧血、HIV治療造成之貧血、微血管病性溶血性貧血、早產造成之貧血、發炎性病症包括類風濕性關節炎、感染、與包括多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤之癌症相關之貧血、造血幹細胞疾病、與骨髓增生異常症候群(MDS)相關之貧血、鐮狀細胞貧血，或地中海型貧血包括α-地中海貧血、β-地中海貧血、α-地中海貧血表徵、輕微α-地中海貧血、中度α-地中海貧血、重度α-地中海貧血、β-地中海貧血表徵、輕微β-地中海貧血、中度β-地中海貧血、重度β-地中海貧血、康斯坦司普林(Constant Spring)型、庫利型貧血(Cooley’s anemia)、血紅素巴特胎兒水腫，以及血紅素E地中海貧血；或其中該個體需要在骨髓移植後，加速紅血球之再生，或其組合。在某些實施例中，該患有慢性腎衰竭之個體患有 慢性腎臟疾病(CKD)或末期腎臟病(ESRD)。
在本發明方法中，紅血球生成素係遞送至個體，體內血清紅血球生成素量增加超過基礎值至少六個月，或體內血清紅血球生成素量之衰退速率下降會低於基礎值，或其中該經基因修飾之微器官具有延長治療效果，如持續與增加之血容比百分率超過基礎值，或其中該經基因修飾之微器官可自動調節血紅素量。
在另一實施例中，本發明提供一種治療有需要人類個體之肝炎持續一段時間之方法，包含下列步驟：提供至少一經基因修飾之微器官，其可持續遞送人類干擾素，該微器官包含一載體，其包含編碼人類干擾素之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，並包含至少一額外調節序列；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之干擾素分泌量；植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及測量該個體血清中之干擾含量；其中該至少一經基因修飾之微器官之植入，可體內增加干擾之血清含量超越基礎量至少三個月。該干擾素可為人類干擾素α(alpha)、β(beta)、γ(gamma)或λ(lambda)。
在一實施例中，本發明之一方法提供之至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官。在某些實施例中，任擇性至少一額外調節序列可包含、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列、一額外MAR序列或一WPRE序列。在某實施例中，該額外調節序列包括一EF1α促進子序列與一額外MAR調節序列。在某些實施例中，該載體為 輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體。在某些實施例中，該至少一額外經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：23之核酸，或至少85%、至少90%，或至少95%等同於SEQ ID NO：23之核酸序列。
在一實施例中，本發明提供植入至少一經基因修飾之微器官之方法，可提供干擾素持續遞送至有需要個體至少三個月。在另一實施例中，該體內血清干擾素含量增加超過基礎值至少六個月。
在某些實施例中，本發明方法更包含於稍後日期植入至少一額外經基因修飾之微器官至該個體之步驟，該至少一額外經基因修飾之微器官提供人類干擾素之持續遞送，如人類干擾素α、β、γ或λ，該微器官包含一載體，其包含編碼人類干擾素之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，其中該核酸更包含至少一或多額外調節序列。在一實施例中，該至少一額外經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官。在某些實施例中，該載體為輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體。在某些實施例中，該載體包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25之核酸，或至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25之核酸。
在某些實施例中，植入經基因修飾之微器官包含皮下或皮內或真皮植入。
使用干擾素遞送至個體時，本發明方法可使用於 患有下列病症之個體：B型肝炎、C型肝炎或D型肝炎；或其組合。
在一實施例中，本發明係提供一種提供人類個體中增加血清干擾素含量持續一段時間之方法，包含下列步驟：提供至少一經基因修飾之微器官，其提供人類干擾素之持續遞送，該微器官包含一載體，其包含編碼人類干擾素之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，其中該核酸任擇地包含至少一或多額外調節序列；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之干擾素；植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及測量該個體血清中之干擾素含量，其中該至少一經基因修飾之微器官之植入，可體內增加干擾素之血清含量超越基礎量至少三個月。在一實施例中，體內血清干擾素含量增加超過基礎值至少六個月。在一實施例中，該至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官。在某些實施例中，該載體為輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體。
在某些實施例中，任擇性至少一額外調節序列可包含一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列、一額外MAR調節序列或WPRE序列。在某些實施例中，該至少一額外經基因修飾之皮膚微器官包含輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：23之核酸，或至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：23之核酸序列。
在某些實施例中，此述之每一方法更包含在植入步驟之後，投予甲基腎上腺皮質酮如Depo-Medrol®之步驟， 其中該投藥係於一或多個經基因修飾之微器官植入處附近皮下注射，在一實施例中，投藥位置距離經基因修飾之微器官植入處不超過5mm。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮如Depo-Medrol®之投藥劑量為每經基因修飾之微器官植入處約12mg。
在一實施例中，本發明係提供一種提供治療多肽至有需要個體一段持續時間之方法，該方法包含下列步驟：提供表現並分泌治療多肽之至少一經基因修飾之微器官；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之該治療多肽之分泌量；植入該至少一經基因修飾之微器官至該個體中；以及在該植入步驟後，經皮下注射投予甲基腎上腺皮質酮如Depo-Medrol®至每一經基因修飾之微器官植入處附近；其中該方法提供該治療多肽至該個體一段持續時間，至少三個月。在一實施例中，該至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官。在一實施例中，該甲基腎上腺皮質酮係經皮下注射投藥。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮注射處距離經基因修飾之微器官植入處不超過5mm。在一實施例中，持續期間為至少六個月。
在上述任一組成物與方法實施例中，該經基因修飾之微器官，如經基因修飾之皮膚微器官可由外植體獲得，並可維持其所衍生之組織或器官之立體結構。在上述任一組成物與方法實施例中，該經基因修飾之微器官如經基因修飾之皮膚微器官可為自體性。
上述之任一方法可更包含在該甲基腎上腺皮質 酮投藥步驟後，施加至少一局部類固醇至經基因修飾之微器官植入處與附近之皮膚區域。在一實施例中，該至少一局部性類固醇為二丙酸倍他米松(Diprolene®)、丙酸氯倍他索(Temovate®、Clobex®、Olux®-EOlux®、Cormax®)、丙酸鹵倍他索(Ultravate®)、氟欣諾能(Fluocinonide)(Vanos®)、氟氫縮松(Cordran®)、二氟拉松雙乙酸鈉(Psorcon®、ApexiCon®)、安西奈德(amcinonide)(Cyclocort®、Amcort®)、倍他米松二丙酸酯(betamethasone dipropionate)(Dipronsone®、Diprolene®AF)、哈西奈德(halcininide)(Halog®)、醋酸氟輕鬆(fluocinonide)(Lidex®)、二氟拉松雙乙酸鈉(diflorasone diacetate)(ApexiCon®、Florone®)、去羥米松(desoximetasone)(Topicort®)、曲安奈德縮丙酮(triamcinolone acetonide)(Kenalog®、Triderm®、Aristocort®HP、Aristocort®A、Aristocort®)、倍他米松戊酸酯(betamethasone valerate)(Valisone®、Luxiq®、β-Val®)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)(Cutivate®)、醋酸氟輕鬆(fluocinonide)(Lidex®-E)、糠酸莫米松(mometasone)(Elocon®)、氟輕鬆(fluocinolone acetonide)(Synalar®、Capex®、Derma-Smoothe®/FS)、糠酸莫米松(mometasone)(Elocon®)、氫化可的松戊酸酯(hydrocortisone valerate)(Westcort®)、氯可托龍新戊酸酯(clocortolone pivalate)(Cloderm®)、潑尼卡松(prednicarbate)(Dermatop®)、地奈德(DesOwen®、Tridesilon®、Desonate®、LoKara®、 Verdeso®)、丁酸氫化可的松(hydrocortisone butyrate)(Locoid®、Lipocream®、Cortizone®-10)、丙丁酸氫化可的松(hydrocortisone probutate)(Pandel®)、阿氯米松雙丙酸酯(alclometasone dipropionate)(Aclovate®)、或氫化可的松(hydrocortisone)(基底)(Hytone®、Nutracort®、Texacort®、Cortaid®、Synacort®、Aquinil®HC、Sarnol®HC、Cortizone®-10，Noble，Scalp relief)，或其任意組合。在一實施例中，至少一局部類固醇是倍他米松戊酸酯(betamethasone valerate)。在一實施例中，至少一局部類固醇是局部糖皮質激素。
在一實施例中，本發明方法包含每日施加至少一局部類固醇，自植入至少一經基因修飾之微器官一週後開始。
序列之描述
本發明主旨在說明書的結論部分被特別指出並清楚申明。然而，無論是組織和操作方法，連同目的，特徵和優點，本發明可經由參考下面的詳細描述與附圖而清楚，其中：圖1提供CAG-wt-hEPO表現卡匣之說明。
圖2提供CAG-opt-hEPO表現卡匣之說明。
圖3提供MAR-EF1α-opt-hEPO表現卡匣之說明。
圖4提供MAR CAG-opt-hEPO-WPRE表現卡匣之說明。
圖5說明來自經不同輔助病毒依賴型腺病毒載體 (HDAd)構築物轉導之EPO經基因修飾之微器官(GMMOs)之體外紅血球生成素分泌情況。
圖6說明經不同HDAd載體轉導之EPO GMMOs之體內紅血球生成素分泌情況，在皮膚與皮膚間之差異性。HA-131、HA-132與HA-138代表來自不同腹部整型皮膚來源之hEPO分泌量之獨立分析。
圖7a與7b說明具降低之衰退速率(自尖峰降低之%)之體內持續血清遞送。圖7a說明在植入經不同HDAd構築物轉導之EPO GMMOs之後，SCID小鼠中之持續血清hEPO濃度(IU/ml)與所得之增加與持續血容比百分比(%)。圖7b說明包括至少一MAR調節因子之表現卡匣產生EPO之SCID小鼠中，遞送EPO之衰退速率下降。控制組小鼠表現出恆定之血容比值%約50%(數據未顯示)。
圖8a與8b說明甲基腎上腺皮質酮之投藥會降低體內治療多肽之衰退速率。圖8a說明每週注射甲基腎上腺皮質酮如Depo-Medrol®於植入GMMOs附近，可產生hEPO之持續分泌，與無甲基腎上腺皮質酮投藥之分泌相較。圖8b說明血清hEPO濃度之衰退速率(IU/ml)，與無甲基腎上腺皮質酮投藥之衰退速率相較。實驗係於SCID小鼠中進行，每隻小鼠植入二EPO GMMOs，衰退速率自初始尖峰量開始觀察六日，自植入GMMOs開始。GMMOs植入由HDAd-CAG-wtEPO載體表現之hEPO。
圖9a與9b說明體內血清hEPO之持續遞送，具降低之衰退速率(自尖峰降低之%)。圖9a說明SCID小鼠在植入 EPO GMMOs，並投予甲基腎上腺皮質酮如Depo-Medrol®(Depo)後，hEPO血清量與血容比百分比。圖9b說明自包括至少一MAR調節因子之表現卡匣產生EPO，其中投予甲基腎上腺皮質酮之SCID小鼠中，遞送EPO之衰退速率下降。結果亦顯示當使用包括至少一MAR調節因子之表現卡匣時，血清hEPO含量增加。
圖10a與10b說明體內血清hEPO持續遞送，具降低之衰退速率(自尖峰降低之%)。圖10a說明SCID小鼠在植入EPO GMMOs，並於每個雙週投予甲基腎上腺皮質酮如Depo-Medrol®(Depo)後，hEPO血清量與血容比百分比。圖10b說明由包括至少一MAR調節因子之表現卡匣產生EPO之SCID小鼠中，遞送EPO之衰退速率下降，其中甲基腎上腺皮質酮係於八週內之每個雙週投予。
圖11說明投予EPO GMMO之紅血球生成素(EPO)劑量與血清EPO量之淨尖峰增加高於基礎值間之關係。EPO GMMO之hEPO表現自CAG-wtEPO卡匣。
圖12為依據本發明某些實施例，評估投予EPO GMMOs以治療血液透析病患之貧血之安全性與有效性之步驟流程圖。
圖13a與13b說明甲基腎上腺皮質酮(Depo-Medrol®)注射處，相對於EPO GMMOs植入處之實施例。在圖13b中，交叉線間之線標記處定義出EPO GMMO植入處。“星號”指出Depo-Medrol注射處。在圖13b中，較長之非虛線指出2紋點(tattoo dots)間之GMMO位置，較短之 虛線指出Depo-Medrol®皮下滲入與沿著GMMO之位置。
圖14說明EPO GMMO治療之效用與安全性評估之試驗設計實施例。
圖15a與15b說明由範例8所描述之臨床試驗病患收集之代表性數據。圖15a顯示在準備期間(植入前)之血清rHuEPO量，單位為mIU/ml。圖15b顯示在此相同期間(準備期；植入前)之血清Hb，單位為g/dL。不具有本發明之EPO GMMOs，需要超治療劑量之rHuEPO以維持目標範圍之血紅素位準(9-11g/dL與小於約12g/dL)。
圖16a、16b與16c說明由範例8所描述之另一臨床試驗病患收集之代表性數據，其中向該病患提供三個本發明EPO GMMO。圖16a顯示血清eEPO含量，單位為mIU/ml，隨時間之變化(自植入約110日)。圖16b顯示在此相同期間內(自植入約110日)，血清Hb含量之變化，單位為g/dL。圖16c顯示網狀紅血球(106/L)隨時間(自植入約110日)之變化。圖16a、16b與16c顯示出本發明之EPO GMMOs，當投至人體時，可有效升高血清EPO與Hb含量，達治療相關劑量至少110日，具與皮下rHuEPO注射相關之最小尖峰與波谷。此代表性病患於30日後穩定，並達目標Hb，其CMAX約100倍低於rHuEPO組(比較圖15a與15b)。此數據亦指出接受本發明EPO GMMOs之病患可自動調節其血清Hb量。
圖17a與17b說明由範例8所描述之另一臨床試驗病患收集之代表性數據，其中向該病患提供二個本發明EPO GMMO。圖17a顯示血清eEPO含量，單位為mIU/ml， 隨時間之變化(自植入約70日)。圖17b顯示在此相同期間內(自植入約110日)，血清Hb含量之變化，單位為g/dL(自植入約70日)。圖17a與17b顯示出本發明之EPO GMMOs，當投至人體時，可有效升高血清EPO與Hb含量，達治療相關劑量至少70日，具與皮下rHuEPO注射相關之最小尖峰與波谷。此代表性病患於45日後穩定，並達目標Hb，其CMAX約100倍低於rHuEPO組。此數據亦指出接受本發明EPO GMMOs之病患可自動調節其血清Hb量。
圖18a與18b說明由範例8所描述之另一臨床試驗病患收集之代表性數據，其中向該病患提供一個本發明EPO GMMO。圖18a顯示血清eEPO含量，單位為mIU/ml，隨時間之變化(自植入約30日)。圖18b顯示在此相同期間內，血清Hb含量之變化，單位為g/dL(自植入約30日)。圖18a與18b顯示出本發明之EPO GMMOs，當投至人體時，可有效升高血清EPO與Hb含量，達治療相關劑量至少30日，具與皮下rHuEPO注射相關之最小尖峰與波谷。
圖19說明比較當HDAd-CAG-opt-hIFNalpha與HDAd-MAR-EF1a-opt-hIFNalpha於本發明GMMOs中表現時之試驗結果。GMMOs係與HDAd-CAG-opt-hIFNalpha及HDAd-MAR-EF1a-opt-hIFNalpha一同製備，並將二GMMOs植入每一SCID小鼠背上。血清hIFNalpha，單位為ng/ml，係評估約185日。此結果指出HDAd-MAR-EF1a-opt-hIFNalpha構築物可使干擾素分泌量增加，並提供較長之體內分泌期間，與 HDAd-CAG-opt-hIFNalpha相較。
圖20說明比較當HDAd-CAG-opt-hIFNalpha與HDAd-MAR-EF1a-opt-hIFNalpha於本發明GMMOs中表現，同時投予Depo-Medrol®至植入處之試驗結果。GMMOs係與HDAd-CAG-opt-hIFNalpha及HDAd-MAR-EF1a-opt-hIFNalpha一同製備，並將二GMMOs植入每一SCID小鼠背上。在植入當日與實驗期間之植入後每二週，投予1mg(100μl)之Depo-Medrol®至每一GMMO植入處。血清hIFNalpha，單位為ng/ml，係評估約185日。結果指出該HDAd-MAR-EF1a-opt-hIFNalpha構築物可提供增加之體內效用，與HDAd-CAG-opt-hIFNalpha相較，Depo-Medrol®投藥可更穩定分泌量，並增進HDAd-MAR-EF1a-opt-hIFNalpha構築物之分泌期間。
圖21代表hEPO之等電聚焦結果，來自3個人類皮膚樣本，其經HDAd-CAG-wt-hEPO或HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO載體轉導。每一皮膚樣本觀察到類似之等電情況，代表GMMOs產生類似之hEPO異型體，即使是以二不同載體轉導。如預期的，來自未轉導之MO之樣本並未顯示出任何hEPO訊號，證實此方法之特異性。當hEPO GMMOs與EPO控制組相較時，測試樣本具有較多之鹼性(basic)EPO異型體，與重組EPO標準品及人類尿液紅血球生成素標準品相較。“NIBSC”為人類尿液EPO控制組；BRP為生物性參考物製劑(Biological Reference Preparation)(BRP批次1與2a)控制組，來自歐洲藥典委員會 (rHuEPO：促紅血球生成素a與b之等莫耳數混合物)；Aranesp為重組人類EPO控制組；“optEPO”為包含HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO之GMMO；“wtEPO”為包含HDAd-CAG-wt-hEPO之GMMO。
圖22a與22b顯示GMMO體外處理時間長度對其植入SCID小鼠背上後之體內表現度之影響。圖22a顯示經HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO轉導，並於體外處理3日(左方長條)或9日(右方長條)之GMMOs植入後之體內hEPO血清含量。圖22b顯示經AAV-LK19-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE轉導，並於體外處理3日(左方長條)或9日(右方長條)之GMMOs植入後之體內hEPO血清含量。長條代表以ELISA檢測小鼠血清內之hEPO濃度。該數值係為平均值+SD，每組n=5。
圖23顯示經AAV-LK19-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE轉導，並於體外處理3日(左方長條)或6日(右方長條)之GMMOs植入後之體內hEPO血清含量。長條代表以ELISA檢測小鼠血清內之hEPO濃度。
圖24顯示經AAV-LK19-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE轉導，並於體外處理3日(左方長條)或10日(右方長條)之GMMOs植入後之體內hEPO血清含量。
圖25顯示經HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO轉導，並於體外處理1日(左方長條)、3日(左方數來第二長條)、9日(左方數來第三長條)，或13日(左方數來第四長條)之GMMOs植入後之體內hEPO血清含量。
圖26顯示經HDAd-MAR-EF1a-opt IFNa轉導，並於體外處理2日(左方長條)、4日(中間長條)或9日(右方長條)之GMMOs植入後之體內IFNa血清含量。
圖27顯示經包含S/MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與MAR-EF1alpha-opt-hEPO表現卡匣之AAV轉導之GMMOs之體外分泌情況。該經包含MAR-EF1alpha-opt-hEPO表現卡匣之AAV轉導之GMMOs體外分泌情況，與S/MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE表現卡匣相較，有明顯增進。圖示出四個代表實驗(h-255；h-256；h-259與h-268)。
圖28顯示經包含S/MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與MAR-EF1alpha-opt-hEPO表現卡匣之AAV轉導之GMMOs之體外分泌情況。該經包含MAR-EF1alpha-opt-hEPO表現卡匣之AAV轉導之GMMOs體外分泌情況，與S/MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE表現卡匣相較，有明顯增進(約增加5倍)。
圖29a與29b顯示二不同形式之包含ssAAV8-MAR-CAG-optEPO-WPRE與scAAV8-MAR-CAG-optEPO-WPRE之AAV載體之體外表現度。圖29a顯示包含ssAAV8-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPO GMMOs之hEPO體外分泌情況。圖29b顯示包含scAAV8-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPO GMMOs之hEPO體外分泌情況。
圖30顯示不同AAV載體，AAV1/2，其包含AAV1/2-MAR-CAG-wtEPO之體外表現度。hEPO自包含AAV1/2-MAR-CAG-wtEPO之EPO GMMOs體外分泌。
圖31顯示不同AAV載體，AAV1，其包含scAAV2/1-CAG-wtEPO之體外表現度。hEPO自包含scAAV2/1-CAG-wtEPO之EPO GMMOs體外分泌。
圖32a與32b顯示二不同AAV載體，ssAAV2i8與scAAV2i8，其包含ssAAV2i8-MAR-CAG-optEPO-WPRE與sc AAV2i8-CAG-optEPO之體外表現度。圖32a顯示自包含ssAAV2i8-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPO GMMOs體外分泌。圖32b顯示自包含sc AAV2i8-CAG-optEPO之EPO GMMOs體外分泌。
圖33顯示不同AAV載體，AAV-LK19，其包含MAR-CAG-optEPO-WPRE表現卡匣之體外表現度。hEPO自包含AAV-LK19-MAR-optEPO-WPRE之EPO GMMOs體外分泌。
圖34顯示包含AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPO GMMO之體外皮膚與皮膚間之表現度差異性。不同提供者MOs標示為“HA-數字”。每一測試之皮膚種類中，包含AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE之GMMOs皆會分泌EPO。
圖35顯示包含AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPOGMMO之長期體外分泌情況。觀察到相對恆定之hEPO超過六個月。
圖36顯示體外處理時間對於GMMOs體內表現度之影響。AAV-LK19包含MAR-CAG-optEPO-WPRE表現卡匣。包含MAR-CAG-optEPO-WPRE之AAV-LK19，係用於轉導 MOs，且經轉導之MOs維持於體外3、10或14日，在植入之前。如同經HDAd轉導之MOs所觀察到的，經AAV轉導之MOs亦會分泌出較高量之hEPO，並使血容比%增加，當體外處理時間由14至10日降低至3日。
圖37顯示包含AAV-LK19 MAR-CAG-optEPO-WPRE表現卡匣之EPO GMMOs之長期體內分泌情況。包含AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPO GMMOs植入至SCID小鼠，並評估血清hEPO與血容比%。結果顯示hEPO穩定分泌至少241日。
圖38顯示包含HDAd-MAR-EF1a-opt-hEPO之EPO GMMOs之體內表現度，與AAV-LK19-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE相較。當經HDAd轉導之GMMOs初始具有較高之體內分泌量，與經AAV轉導之GMMOs相較，約3個月，血清中EPO之測量值約相同。當觀察較長期間，經AAV轉導之GMMOs可維持血清中之EPO含量，而經HDAd GMMOs轉導之小鼠之血清中EPO含量下降(數據未顯示)。
較佳實施例之詳細說明
在下列詳細敘述中，係提供多個特定詳細內容，以使本發明可完整瞭解。然而，此技術領域者應可實施，而不需這些特定詳細說明。在其他實施例，其他已知方法、流程與成分並未經詳述，以避免混淆本發明。
在某些實施例中，本發明係相關一種經基因修飾、組織基礎之微器官，其提供體外與體內之治療多肽持續遞 送，其中該微器官包含一載體，其包含一編碼治療多肽之核酸序列，其操作性連結至一或多個調節序列上，以及使用該器官之方法。在某些實施例中，本發明之經基因修飾之微器官表現並分泌治療多肽一段持續期間，如至少三個月或至少六個月。在一實施例中，該調節序列包括至少一MAR序列。在一實施例中，經基因修飾之微器官之植入伴隨著抗發炎劑如甲基腎上腺皮質酮之投藥。在一實施例中，治療多肽為紅血球生成素(“EPO”)。在另一實施例中，治療多肽為干擾素(“IFN”)，如IFN α、IFN β、IFN γ，或IFN λ。在某些實施例中，本發明治療配方之長效使用方法，係提供有需要個體延長之治療效果。在某些實施例中，本發明治療配方之長效使用方法，係提供有需要個體持續治療。在某些實施例中，該微器官包含為輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，其包含編碼一治療多肽之核酸序列。
在某些實施例中，本發明提供表現與分泌治療多肽之至少一經基因修飾之微器官(“GMMO”)，該微器官(“MO”；使用於此“MO”亦代表複數個微器官)包含一載體，如輔助病毒依賴型腺病毒載體(“HDAd”)，或腺伴隨病毒(AAV)載體，該載體包含編碼一治療多肽之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，其中該核酸更包含一或多個額外調節序列。在某些實施例中，使用本發明至少一GMMO之方法，可提供有需要個體延長之治療效果。在某些實施例中，使用至少一GMMO之方法可提供有需要個體治療多肽之持續遞送。使用於此，術語“GMMO”與“至少一 GMMO”係指“治療配方”，其中該治療配方可包括複數個表現相同治療多肽之GMMOs。
在一實施例中，GMMO包含一載體，如HDAd或AAV載體，包含編碼一治療多肽之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，其中該核酸任擇地更包含至少一額外調節序列，以及其中該至少一經基因修飾之微器官表現該治療多肽一段持續期間，至少三個月、至少四個月、至少五個月，或至少六個月。
在一實施例中，GMMO包含輔助病毒依賴型腺病毒載體或AAV載體，包含編碼一治療多肽之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，其中該核酸任擇地更包含至少一額外調節序列，以及其中該至少一經基因修飾之微器官表現該治療多肽一段持續期間，至少三個月、至少四個月、至少五個月，或至少六個月。
在一實施例中，治療多肽為人類紅血球生成素或人類干擾素，如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ或干擾素-λ。
在某些實施例中，本發明任一經基因修飾之微器官(GMMOs)，為此述之任一形式或實施例，可使用於本發明方法中，以遞送治療多肽持續一段時間。使用於此，在某些實施例中，術語“治療-GMMO”係指經基因修飾之微器官，如經基因修飾之皮膚微器官，其分泌治療多肽。使用於此，在某些實施例中，術語“EPO-GMMO”與“hEPO-GMMO”係指經基因修飾之微器官，如經基因修飾之皮膚微器官，其分泌人類EPO，並可與具有所有相同意義 與特性者交換使用。使用於此，在某些實施例中，術語“IFN-GMMO”與“hIFN-GMMO”係指經基因修飾之微器官，如經基因修飾之皮膚微器官，其分泌人類IFN，並可與具有所有相同意義與特性者交換使用。
在一實施例中，MO係由自體組織衍生。例如，EPO GMMO可包含由植入之相同個體收獲之自體組織，在該組織經EPO載體轉導之後。
在某些實施例中，本發明提供一種治療配方與其使用方法，其中該配方包含至少一GMMO。
在一實施例中，術語“MO”使用於此係指分離出之組織或器官結構，其衍生自或等同於以有利於細胞存活與功能之方式製備之外植體。在一實施例中，該外植體為完整組織外植體。在一實施例中，MO維持其所分離之組織或器官之至少部分體內結構。在另一實施例中，MO維持細胞-細胞交互作用，類似於由其取得之組織或器官。在一實施例中，MO為完整、經分離之組織樣本。在另一實施例中，MO維持其微結構，以及其所衍生之組織或器官之立體結構，並具有經挑選之構造，以允許必須之營養與氣體可被動擴散通過微器官內之細胞，並可使細胞廢物擴散出微器官細胞，以使細胞毒性，以及由於營養不足及/或廢物堆積伴隨之細胞死亡最小化。在一實施例中，MO為皮膚組織之裂片，即皮膚微器官(“DMO”)。
在一實施例中，該GMMO為經基因修飾之皮膚微器官。皮膚微器官(“DMO”)可包含複數個真皮成分，其中 在一實施例中，真皮為表皮下方之皮膚部分。這些成分包含纖維母細胞、上皮細胞、其它類型的細胞、毛囊基底、神經末梢、汗腺和皮脂腺，以及血管和淋巴管。在一實施例中，皮膚微器官可包含某些脂肪組織，其中在另一實施例中皮膚微器官不包含脂肪組織。
在本發明之某些實施例中，該皮膚微器官可包含基底表皮層組織，以及，任擇地皮膚之表皮層。在其他實施例中，皮膚微器官並不包括基底層組織。在本發明之另一實施例中，皮膚微器官並不包括表皮層。在又一實施例中，該皮膚微器官包含一不完整表皮層。在又一實施例中，該皮膚微器官包含數層表皮組織。在又一實施例中，該皮膚微器官包含表皮內褶至真皮。在又一實施例中，該皮膚微器官不包括完整之表皮層。在又一實施例中，該皮膚微器官可包括額外成分，如汗腺及/或毛囊。
在本發明之一實施例中，該DMO包括真皮之完整橫截面。在本發明之另一實施例中，該皮膚微器官包括真皮之部分橫截面。在又一實施例中，該DMO包括真皮橫截面之大部分，亦即真皮之大部分層與成分，包括乳頭與網狀真皮層。在又一實施例中，該DMO包括主要皮膚組織，但亦包括脂肪組織。在本發明之某些實施例中，該DMO不產生角質蛋白或產生可忽略量之角質蛋白，因而可在接受者植入後，如皮下或真皮植入後，預防角質囊腫形成。有關皮膚微器官之更詳細描述，包括收獲方法、於培養液中維持，以及植入該皮膚微器官，係描述於PCT專利申請號 WO2004/099363與WO2013/118109。
在一實施例中，MO為直徑1-2mm，長度30-40mm。在另一實施例中，MO之長度可為如1-3mm、1-4mm、2-4mm、0.5-3.5mm、1.5-2.5或1.5-10mm。在另一實施例中，MO之直徑可為如約2mm或約1.5mm。在另一實施例中，該直徑小於10mm，在另一實施例中，該長度小於1.5cm。在另一實施例中，MO之長度可為5-100mm、10-60mm、20-60mm、20-50mm、20-40mm、20-100mm、30-100mm、40-100mm、50-100mm、60-100mm、70-100mm、80-100mm，或90-100mm。在另一實施例中，MO之長度為約20mm、約30mm、約40mm或約50mm。在一實施例中，該長度大於100mm。在一實施例中，本發明之DMO具直徑約2mm，以及長度約30mm。在另一實施例中，本發明之DMO具直徑約2mm與長度約40mm。
在一實施例中，MO為一外植體。在一實施例中，MO衍生自組織。在另一實施例中，MO為一組織之切片或部位或部分。在另一實施例中，MO為一器官之切片或部位或部分。在一實施例中，MO為一器官或組織之完整切片或部位或部分。MO與皮膚移植片不同，在一實施例中，其設計為可於體內與體外存活一段長時間，以及，在另一實施例中，其立體結構經特定選擇，以允許必須之營養與氣體可被動擴散通過微器官內之細胞，並可使細胞廢物擴散出微器官細胞，以使細胞毒性，以及由於營養不足及/或廢物堆積伴隨之細胞死亡最小化。因此，在一實施例中，MO並 非皮膚移植片。在另一實施例中，MO與分離細胞之收集物不同，在一實施例中，其係生長於天然或人工骨架上，使得MO可維持其微結構，以及其所衍生之組織或器官之立體結構。因此，在一實施例中，MO並非生長於骨架上，或位於凝膠或海綿中之一或多種細胞種類。
有關MO之某些實施例之詳細描述請見於US2003/0152562。
本發明之治療用GMMO令人意外地顯示可使治療多肽如體內EPO之表現情況增加，以及衰退速率下降。在一實施例中，本發明之EPO GMMO可提供EPO體外與體內延長之持續表現與分泌，與先前已知之EPO GMMOs相較。治療多肽延長持續表現之優點為其可產生延長或持續之治療效果。術語治療多肽包括治療多肽之功能性片段。術語“一(a)”或“一(an)”代表大於一種。例如，本發明之“一經基因修飾之微器官”可為一或多個經基因修飾之微器官。
使用於此，在一實施例中，術語“外植體”係指自器官之天然生長處移出之組織或器官或其一部份，並置於培養液中一段時間。在一實施例中，該組織或器官可存活，在另一實施例中，具代謝活性，或其組合。在一實施例中，該外植體為完整的。使用於此，術語“外植體”，在某些實施例中，可與“微器官”或“微器官外植體”互相交換使用。
使用於此，術語“微結構”，在一實施例中，係指外植體之一特徵，其中該組織外植體之部分或全部細胞可維持與至少一細胞或非細胞物質之體外、物理性及/或功能 性接觸，其於體內呈物理性及/或功能性接觸。
在某些實施例中，MO外植體維持其所衍生之組織或器官之立體結構。在一實施例中，MO外植體維持空間上之交互作用，如細胞-細胞間、細胞-基質(matrix)間與細胞-基質(stroma)間之交互作用，以及其所衍生之組織之方位。在一實施例中，保留如上述之空間交互作用可允許維持外植體之生物性功能，如分泌自泌與旁泌因子，以及其他細胞外刺激，在一實施例中，其可提供外植體之長期存活。在一實施例中，MO外植體之至少部分細胞可維持植入後之體外或體內之與至少一細胞或非細胞物質之體外、物理及/或功能性接觸，其於體內呈物理性及/或功能性接觸。在一實施例中，“某些細胞”係指該族群之至少約50%，在另一實施例中，至少約60%，在另一實施例中，至少約70%，在另一實施例中，至少約80%，以及在另一實施例中，至少約90%或更多細胞。在另一實施例中，外植體之細胞維持其所衍生之器官或組織之至少一生物活性。
可由其分離出MO之哺乳動物範例包括人類與其他靈長動物、豬，包括全部或部分近交系豬(例如小型豬、基因轉殖豬)、囓齒動物等。MO可由各種器官之組織中加工而得，其在一實施例中為皮膚、真皮、淋巴系統、胰腺、肝臟、膽囊、腎、消化道、呼吸道、生殖系統、泌尿道、肺、膀胱、角膜、前列腺、骨髓、胸腺、脾臟，或其組合。由這些器官所得之外植體可包含蘭氏小島、毛囊、腺體、上皮或結締組織，或其組合，其微結構之排列類似於得到 該外植體之器官之微結構。在一實施例中，得到該外植體之器官之微結構，可使用技術上已知之材料、裝置及/或方法，於MO外植體中辨別或辨識出。
術語“約”於此係涵蓋數值或數值範圍，不同於所指出之數值或範圍，但落於所指出之數值或範圍附近，以減少顯著數字位數，或包含測量誤差所引起之偏差。
在某些實施例中，術語“基本上由.....組成”係指一GMMO，其僅有指出之成分，然而，亦可包括其他成分，如，以穩定、保存等該配方，或作為賦形劑或具無醫藥活性之成分，其不直接涉及GMMO之治療效果。
此外，當提及方法或方法步驟時，“基本上由.....組成”包括所指出之元件(element)，但排除其他元件或步驟，其具有進行該方法或步驟之必要明顯作用。
在一實施例中，術語“基因產物”係指蛋白質或多肽。在一實施例中，該基因產物係由核酸分子編碼，為待供應個體希望之基因產物。此基因產物之範例包括蛋白質、胜肽、醣蛋白與脂蛋白，一般係由接受者個體之細胞產生。
在某些實施例中，其載體與用於本發明之方法者包含一核酸序列，其操作性連結至一或多個調節序列，其中該核酸序列編碼一治療多肽。在另一實施例中，該載體基本上由此一核酸序列組成，在另一實施例中，該載體由此一核酸序列組成。在一實施例中，該核酸操作性連結至一或多個調節序列，其包含SEQ ID NO：1之核酸，或至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：1之核酸。在另 一實施例中，該核酸操作性連結至一或多個調節序列，其包含SEQ ID NO：2之核酸，或至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：2之核酸。在又一實施例中，核酸操作性連結至一或多個調節序列，其包含SEQ ID NO：19之核酸，或至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：19之核酸。在又一實施例中，核酸操作性連結至一或多個調節序列，其包含SEQ ID NO：20之核酸，或至少80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：20之核酸。
此技術已知之任一方法可用於基因改變該微器官外植體。數個不同載體中之任一個皆可用於本發明實施例中，如病毒載體、質體載體、直線形DNA等，如技術上已知者，以引入編碼治療試劑之外源核酸片段至目標細胞及/或組織。病毒載體之範例包括腺病毒載體、輔助病毒依賴性腺病毒載體、腺伴隨病毒載體與逆轉錄病毒載體。這些載體可使用如感染、轉導、轉染、磷酸鈣介導的轉染、DEAE-葡聚醣介導的轉染、電穿孔、微脂體介導的轉染、基因槍基因遞送、微脂體基因遞送，使用膜融合和陰離子性微脂體(其為陽離子微脂體之替代物)、直接注射、受體介導之吸收、磁電穿孔(磁電穿孔法)、超音波、或其任意組合，以及本領域中已知的其他技術插入(其他細節請見如“Methods in Enzymology”Vol.1-317,Academic Press,Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel F.M.et al.(eds.)Greene Publishing Associates,(1989)，以及Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Edition,Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)，或其他標準實驗室操作手冊)。編碼有興趣序列之多核苷酸片段，可接合至使用於轉導至哺乳動物細胞之表現載體系統上，以驅動重組產物於經轉導細胞中之表現。外源性核酸片段之引入可藉由引入載體至微器官附近而達成。一旦外源性核酸片段使用上述或技術上已知之任何技術加入細胞中，由該核酸片段編碼之治療試劑之製造及/或分泌速率便可定量。在一實施例中，術語“外源性”係指該物質源自於外部，例如源自於細胞或組織外部之核酸。
術語“載體”或“表現載體”使用於此係指一載體分子，其中有可表現之核酸序列。
GMMOs於此包含一輔助病毒依賴性腺病毒載體(“HDAD”、“HD”或“HDAd”或“HD-Ad”)，或腺伴隨病毒(AAV)載體。輔助病毒依賴性腺病毒載體可為無膽(gutless)、去內臟(gutted)、迷你型、完全刪除，高容量，△，或擬腺病毒。亦可刪除所有病毒編碼序列，除了支持DNA複製之序列，其中，在一實施例中，包含腺病毒倒轉末端重複與包裝序列(ψ)。在另一實施例中，HDAd並未表現病毒蛋白。在一實施例中，HDAd僅包含腺病毒同側作用(順式-肌動蛋白)因子，其為重複與包裝載體DNA所必須。在一實施例中，HDAd包含約500bp之野生型腺病毒序列。在另一實施例中，腺病毒載體額外地包含填充子(stuffer)DNA。在一實施例中，該填充子DNA為哺乳動物DNA。在一實施例中，該HDAd載體為非複製載體。
在一實施例中，HDAd展現高效率之體內與體外轉導、高量轉殖基因之表現，可維持長期之轉殖基因表現，在一實施例中，藉由預防由於病毒蛋白之殘餘表現所造成之毒性，或其組合而達成。在另一實施例中，HDAd具有高滴定數生產、可有效感染廣範圍之細胞種類，感染分裂中或未分裂細胞之能力，或其組合。在又一實施例中，使用於本發明之HDAd，並未誘發對植入GMMO之強適應性免疫反應，在一實施例中，特徵為於免疫勝任宿主中，產生受限於腺特異性第I型MHC之CD8細胞毒殺型T淋巴細胞(CTL)，其在一實施例中，可限制轉殖基因表現之期間，在另一實施例中，會於數週內產生腺病毒載體清除。在又一實施例中，使用於本發明方法中之HDAd並未誘發高細胞毒性T細胞量(在一實施例中，可測量陽性CD8染色，如技術上已知)，以及，在另一實施例中，並未誘發高輔助性T細胞量(在一實施例中，測量陽性CD4染色，如技術上已知)。
在另一實施例中，HDAd具有較低之種系傳輸與插入突變，其可能導致癌性轉化，由於載體基因體並未插入宿主細胞之染色體中。在一實施例中，HDAd之選殖能力相當大(在一實施例中，約37kb，在另一實施例中，約36kb)，可允許遞送整個基因座、多重轉殖基因，以及大同側作用因子，以增強、延長與調節轉殖基因之表現。
在一實施例中，該使用於本發明組成物與方法中之HDAd系統，類似於Palmer and Ng,2003(Mol Ther 8：846)與Palmer and Ng,2004(Mol Ther 10：792)中所述。
腺伴隨病毒(AAV)載體可為單股或雙股，並可為任何血清型。
包含編碼本發明治療多肽之核酸之載體，可藉由如轉導而引入至一微器官。有數種已知技術可引入卡匣及/或載體至細胞中，以實施本發明方法，例如但不侷限於：直接DNA吸收技術，以及病毒、質體、直線形DNA、微脂體介導轉導、受體介導之吸收，以及使用磷酸鈣介導與DEAE-葡聚醣介導引入之磁電穿孔法，以及電穿孔或微脂體介導之轉染(更多細節請見如“Methods in Enzymology”Vol.1-317,Academic Press,Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel F.M.et al.(eds.)Greene Publishing Associates,(1989)，以及Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Edition,Sambrook et al.Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)，或其他標準實驗室操作手冊)。
在某些實施例中，本發明涉及經基因修飾之微器官，其包含輔助病毒依賴性腺病毒載體或AAV載體，其包含編碼治療多肽之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，並任擇地包含至少一額外調節序列。
“調節序列”或“調節因子”於此係指可調節基因產物表現之核苷酸序列(如促進子、穩定序列與增強子序列)。在某些實施例中，該額外調節序列可包含一MAR序列(或第二MAR序列)、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列，或一WPRE序列。更特別的是，調節序列可依據基因產物待表現之細胞種類，以及希望之基因產物表現量而篩選。例 如，可使用可提供基因進行細胞種類特異性表現之促進子。此外，可使用可於多種不同細胞中主導基因連續表現之調節因子，如病毒調節因子。一般用於驅動基因表現之病毒促進子，包括衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒(CMV)與猿猴病毒40，以及反轉錄病毒LTR。此外，可使用可誘發表現其所連結之基因之調節因子。使用可誘發調節因子(如可誘發促進子)可允許細胞中基因產物製造之調整。有潛力使用於真核細胞之可誘發調節系統包括賀爾蒙-調節系統(如請見Mader,S.and White,J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5603-5607)、合成性配位基-調節因子(請見如Spencer,D.M.et al(1993)Science 262：1019-1024)與游離輻射調節因子(如請見Manome,Y.Et al.(1993)Biochemistry 32：10607-10613；Datta,R.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：1014-10153)。可發展之額外組織特異性或可誘發調節系統，亦可使用於本發明。
術語“促進子”係指一DNA序列，在一實施例中，其與上游之編碼序列操作性連結，對於一基因之基礎及/或調節轉錄作用相當重要。
使用於此，術語“操作性連結”係指一調節序列之位置係與另一核苷酸序列如編碼一治療多肽之基因，呈功能性關係。例如，若該調節序列為一促進子序列，以及若一編碼序列操作性連結至該促進子序列，此一般性表示該促進子可促進編碼序列之轉錄。操作性連結代表該連結之DNA序列通常為連續，且當需要結合二蛋白質編碼區域時， 為連續且在讀框內。然而，某些調節序列可操作性連結，但不與其表現經該調節序列促進之編碼序列連續。例如，當其與促進子分隔數千個鹼基時，增強子仍可作用，而內含子序列可具有不同長度。
使用於此，核苷酸序列係指一天然或合成之核苷酸及/或核苷，與其衍生物之直線形或依序陣列。術語“編碼(encoding)”與“編碼(coding)”係指經一核苷酸序列處理之過程，經由轉錄與轉譯作用，提供細胞資訊，而將一組胺基酸組合成一特定胺基酸序列，以製造一多肽。
在一實施例中，組成物中與使用於本發明方法中之促進子，為可調節促進子。在另一實施例中，可調節促進子係指一促進子，其下游基因之表現發生為特定條件之出現或提供(provision)之函數，該條件可刺激由特定促進子開始之表現。在某些實施例中，此條件會直接啟動表現，或在其他實施例中，移除表現障礙。在某些實施例中，此條件會關閉或降低表現。
在一實施例中，此條件可包含特定溫度、養分、缺乏養分、存在有金屬，或其他刺激或環境因子，如此領域者已知。在一實施例中，可調節促進子可經半乳糖調節(例如，UDP-半乳糖差向異構酶(GAL10)、半乳糖激酶(GAL1))，或經葡萄糖調節(如乙醇脫氫酶Ⅱ(ADH2))，或經磷酸鹽調節(例如，酸性磷酸酶(PHO5))。在另一實施例中，可調節促進子可經熱休克(熱休克促進子)，或化學物如IPTG或四環素或其他此領域已知者活化。應瞭解到， 任何用於此種調節之調節促進子與條件，皆包含於本發明之載體、核酸與方法中，並代表一實施例。
本發明之GMMOs包含一HdAd或AAV載體，其包含一核酸序列，其編碼一治療多肽，其操作性連結至一上游骨架/基質連結(S/MAR)序列，亦已知為MAR序列。術語“S/MAR”與“MAR”在本說明書中可互相交換使用，具有相同意義與特性。S/MAR序列轉錄增強序列，其已顯示出對於轉殖基因表現具有體內穩定效果(Klehr et al.(1991).Biochemistry 30：1264-1270)。含S/MAR之質體可作為穩定游離基因體，於初級人類纖維母細胞類似細胞中，支持長期轉殖基因表現。然而，S/MAR調節因子並不會在所有細胞類型中展現出普遍行為。在一實施例中，本發明之一載體包含至少一S/MAR序列。在另一實施例中，一載體包含至少二S/MAR序列。載體內之S/MAR序列可為相同或不同。在一實施例中，一S/MAR序列包含SEQ ID NO：4。在另一實施例中，一S/MAR序列包含SEQ ID NO：5。在又一實施例中，一S/MAR序列包含SEQ ID NO：6。在由一實施例中，一S/MAR序列包含任一技術上已知之S/MAR序列。
各種額外調節序列亦可包含於該HdAd載體中，如CAG促進子序列、EF1α促進子序列或WPRE序列。在一實施例中，本發明之又一調節序列可包含組成促進子。已知之組成促進子包括SV40、CMV、UBC、EF1alpha、PGK與CAG。已知每個促進子之間差異性相當大，其強度依據經轉導之細胞種類與生長條件而不同。研究指出促進子活 性可能受限於特定之細胞品系，顯示出需要仔細篩選與測試用於組成性基因表現之促進子。
在一實施例中，本發明之一額外調節序列可包含一CMV促進子，而另一實施例中，調節序列可包含一CAG促進子。在一實施例中，CAG促進子為複合促進子，其合併人類巨細胞病毒立即早期增強子與經修飾之雞β-肌動蛋白促進子與第一內含子。在一實施例中，一CAG促進子包含SEQ ID NO：7。在一實施例中，一CAG促進子包含任一技術上已知之CAG促進子。
在一實施例中，本發明之一額外調節序列包含一EF1α促進子。該EF1α基因於所有細胞中具管家(housekeeping)功能，並表現至高量。由於其在所有細胞中之必需管家功能，EF1α促進子之表現相對與細胞功能及其細胞種類無關。在一實施例中，EF1α促進子包含SEQ ID NO：18。在另一實施例中，EF1α促進子包含任一技術上已知之EF1α促進子。
在一實施例中，額外調節序列可包含猴病毒(SV)-40聚腺苷酸化序列，其在一實施例中，機制為在真核生物中，大多數信使RNA分子會在其3'端終止。在一實施例中，聚腺苷酸化(聚-A)尾部可保護mRNA分子不被外切酶切割，對於轉錄終止、mRNA由細胞核輸出，以及轉譯相當重要。在另一實施例中，本發明之一配方可包含一或多個調節序列。在一實施例中，聚-A尾部序列包含SEQ ID NO：9。
在一實施例中，本發明之額外調節序列包含土撥 鼠肝炎病毒轉錄後調節因子(WPRE)。WPRE已顯示出可增強腺病毒載體以及其他病毒載體之表現(Zanta-Boussif et al.(2009)GeneTherapy 16,605-619；Kingsman et al.,(2005)Gene Therapy 12,3-4)。WPRE序列顯示出可刺激表現，當以同義股方向選殖至轉殖基因與聚(A)序列之間。在一實施例中，WPRE調節序列係位於編碼本發明治療多肽之序列，如編碼EPO之序列，與聚(A)序列之間。在另一實施例中，WPRE調節序列係位於編碼IFN之序列與聚(A)序列之間。在一實施例中，WPRE序列包含SEQ ID NO：8。在另一實施例中，WPRE序列包含任一技術上已知之WPRE序列。
在一實施例中，編碼治療多肽之核酸序列操作性連結至一上游MAR調節序列，其包含SEQ ID NO：11。編碼治療多肽之核酸序列操作性連結至一上游MAR調節序列，其包含SEQ ID NO：13。在又一實施例中，編碼治療多肽之核酸序列操作性連結一調節序列，其包SEQ ID NO：15。在又一實施例中，編碼治療多肽之核酸序列操作性連結至一上游MAR調節序列，其包含SEQ ID NO：17。在又一實施例中，編碼治療多肽之核酸序列操作性連結至一上游MAR調節序列，其包含SEQ ID NO：23。在另一實施例中，編碼治療多肽之核酸序列操作性連結至一上游MAR調節序列，其包含SEQ ID NO：25。
在一實施例中，本發明之至少一經基因修飾之微器官包含一輔助病毒依賴性腺病毒載體，其包含編碼紅血球生成素之核酸序列，操作性連結至一上游MAR調節序列， 其中該核酸任擇地更包含至少一或多額外調節序列，以及其中至少一經基因修飾之微器官表現該治療多肽一段持續期間，至少三個月。
在一實施例中，本發明之至少一GMMO呈現治療多肽如EPO之持續體外表現量(圖5與6)。在某些實施例中，本發明之至少一GMMO呈現治療多肽如EPO之持續體內表現量、治療多肽如EPO衰退速率下降，以及延長之治療效果，如持續增加與維持血容比百分比(圖7a、7b、8a、8b、9a、9b、10a與10b)。在其他實施例中，本發明之至少一GMMO自動調節血紅素量(請見如圖15-18，其中追蹤一滴血紅素便可發現血清EPO含量之增加、網狀紅血球增加，之後血紅素上升)。
在一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少一S/MAR序列、一CAG促進子、一WPRE序列以及一聚(A)序列。在另一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少一CAG促進子與一聚(A)序列。又一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少一S/MAR序列、一EF1α促進子、一WPRE序列與一聚(A)序列。在又一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少二S/MAR序列、一EF1α促進子與一聚(A)序列。在又一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少二不同之S/MAR序列與一EF1α促進子，其中S/MAR序列之一為B球蛋白/MAR序列。
本發明之某些實施例提供治療有需要病患之貧 血一段持續期間之方法，包含下列步驟：提供至少一本發明GMMO，其提供人類紅血球生成素之持續遞送，該微器官包含一載體，如輔助病毒依賴性腺病毒載體或腺伴隨病毒載體，其包含一編碼人類紅血球生成素之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，且其中該核酸可任擇地更包含至少一額外調節序列；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之紅血球生成素分泌量；植入有效劑量之該至少一GMMO至該人類個體中；以及測量該個體血清中之紅血球生成素含量；其中該至少一GMMO之植入可增加紅血球生成素之體內血清含量超越基礎量至少三個月，如至少六個月。
在一實施例中，本發明方法使用至少一GMMO，其包含至少一或多個額外調節序列，選自於由一MAR序列、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列或一WPRE序列組成之族群。在一實施例中，本發明方法使用至少一GMMO，其包含含有SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13之核酸序列。在一實施例中，本發明方法使用至少一GMMO，其為一經基因修飾之皮膚微器官。在一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少一S/MAR序列、一CAG促進子、一WPRE序列與一聚(A)序列。在另一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少一CAG促進子與一聚(A)序列。在又一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少一S/MAR序列、一EF1α促進子、一WPRE序列與一聚(A)序列。在又一實施例中，包含於本發明載體中之調 節因子包括至少二S/MAR序列、一EF1α促進子與一聚(A)序列。在又一實施例中，包含於本發明載體中之調節因子包括至少二不同之S/MAR序列與一EF1α促進子，其中S/MAR序列之一為B球蛋白/MAR序列。在某些實施例中，本發明至少一GMMO呈現出體內持續表現EPO量、EPO衰退速率下降，以及延長治療效果之一或多者，如持續增加與維持血容比百分比(圖7a、7b、8a、8b、9a、9b、10a與10b)。
使用於此，術語“個體”係指一人類個體。“個體”於此亦可指稱“病患”。個體可為未接受過治療(naïve)，如未接受過EPO或IFN治療之病患。此外，個體可預先暴露於治療多肽如EPO或IFN，如以紅血球生成刺激試劑(ESA)注射療法或IFN注射。
就預先經ESA注射治療之病患而言，投予GMMO取代ESA注射，可提供紅血球生成素一段持續期間，並預防血紅素(Hb)量或血容比百分比降低至基礎值。在一實施例中，其中該病患經ESA治療，Hb反應代表預防Hb量降低，否則自然發生並維持高量之Hb，與病患之基礎值相較。在一實施例中，hEPO-GMMO投藥可預防Hb含量降低。在此方法中，Hb含量可於治療視窗中維持。在本發明某些實施例中，術語“EPODURE”係用於取代EPO GMMO或EPO-生物幫浦，並具所有相同意義與特性。類似地，“生物幫浦”、“BP”與“GMMO”於此可互相交換使用。
使用於此，術語"紅血球生成"係指紅血球細胞生 成或製造過程。EPO為紅血球生成調節，即紅血球製造，之必要因子。Hb反應之測量亦為紅血球細胞形成，即紅血球生成之測量。
在一實施例中，至少一GMMO之植入持續提供分泌紅血球生成素至少三個月。在另一實施例中，EPO分泌至少四個月。在另一實施例中，EPO分泌至少五個月。在又一實施例中，EPO分泌至少六個月。在另一實施例中，EPO分泌至少一年。在某些實施例中，EPO之分泌係以血清中紅血球生成素量增加，與基礎值相較而觀察。在一實施例中，觀察到增加之血清EPO含量至少三個月。在另一實施例中，觀察到增加之血清EPO含量至少四個月。在又一實施例中，觀察到增加之血清EPO含量至少五個月。在另一實施例中，觀察到增加之血清EPO含量至少六個月。在另一實施例中，觀察到增加之血清EPO含量至少一年。
在一實施例中，本發明至少一GMMO包含一載體，如HDAd或AAV載體，其包含一核酸EPO表現卡匣，包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13。在某些實施例中，此一GMMO展現出體內血清EPO含量衰退速率下降，植入後至少100日，與缺乏上游MAR序列之GMMO配方相較(圖7a、7b、9a、9b、10a與10b)。
在本發明之某些實施例中，該方法更包含在植入後測量該個體血中之血紅素(Hb)位準之步驟，其中該個體測出之血紅素位準增加，且之後於測量值之至少50%維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月，或血紅素位準於測量值 之至少50%維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月。在一實施例中，該測出之血紅素位準於測量值之至少50%為9-11g/dl或9-12g/dl至少六個月。
使用於此，持續“Hb反應”亦指持續“紅血球生成”，具Hb反應之所有品質與特性。
使用於此，術語“增加之Hb量”係指血液中Hb含量增加高出基礎值，為本發明長效治療配方投藥至有需要個體之反應。使用於此，術語“Hb含量增加”於此亦指“Hb反應”。GMMO投至未接受治療個體可增加Hb量至治療量。在暴露於EPO之前將GMMO投至個體，可維持Hb量於治療量。
在一實施例中，該Hb反應係指Hb量增加，使得Hb量範圍介於約9-11gm/dl，其為目前FDA建議之範圍。在另一實施例中，該Hb量範圍介於9.5-12.6gm/dl。在又一實施例中，該Hb量範圍介於10-12gm/dl。在又一實施例中，該Hb量範圍介於9-13.2gm/dl。在又一實施例中，該Hb量範圍介於8.5-13.8gm/dl。在另一實施例中，該Hb量範圍介於8-14.4gm/dl。在某些實施例中，該Hb量為目標治療量。使用於此，“g”與“gm”可互相交換使用，代表“克(gram)”或“克(grams)”。
由於血液中Hb量可能每日會有些許震盪，反應之增加範圍可能處於某些狀態，代表該期間之平均增加量。在該期間所進行之測量可能會反映出此震盪。例如，Hb之增加可能在特定期間內維持在目標範圍之90%，如上所述。 換言之，在至少一個月內測量到為Hb目標範圍之90%、在至少六個月內或至少一年內測量到為Hb目標範圍之90%。此外，Hb含量測量值之80%可在任一特定期間，增加或維持於目標範圍內。此外，Hb含量測量值之70%可在任一特定期間，增加或維持於目標範圍內。此外，Hb含量測量值之60%可在任一特定期間，增加或維持於目標範圍內。或者，Hb含量測量值之50%可在任一特定期間，增加或維持於目標範圍內。
Hb之測量可於規律基礎或不規律基礎上進行。在某些案例中，血液Hb含量之測量可每週進行一次。此外，血液Hb含量之測量頻率可更高或更低，如每週二次或每二週一次或每月一次。在一實施例中，血液測量一週進行一次。在另一實施例中，一週二次。在又一實施例中，一週三次。在又一實施例中，測量每二週進行一次。在又一實施例中，測量每個月進行一次。在一實施例中，測量係於規律排程基礎上進行。在另一實施例中，測量係於"有需要"基礎上進行。測量頻率可更高或更低，依據需求而定。
在某些實施例中，於Hb量增加期間之至少90%，Hb量之增加維持在特定範圍內。在其他實施例中，於該期間之至少80%，Hb量之增加維持在特定範圍內。在其他實施例中，於該期間之至少70%，Hb量之增加維持在特定範圍內。在其他實施例中，於該期間之至少60%，Hb量之增加維持在特定範圍內。在其他實施例中，於該期間之至少50%，Hb量之增加維持在特定範圍內。在某些實施例中， 本發明方法提供持續血紅素含量於測量值之至少50%範圍內，可預防rhu-EPO注射所觀察到的非生理Hb回收。
使用於此，術語“血容比”係指紅血球容積比或紅血球體積分率，為血液中紅血球細胞濃度之百分比。使用於此，Hb量之增加反映出血容比之增加。使用於此，“100%血容比”之測量係指純濃縮紅血球細胞相對於總體積之比例。
使用於此，術語“核酸”係指聚核苷酸或寡核苷酸，如去氧核糖核酸(DNA)，以及其適當之核糖核酸(RNA)或模擬物。
修飾核酸以達到特定目的之方法已揭示於本領域中，如Sambrook et al.(1989)。此外，本發明之核酸序列可包括有興趣蛋白質之非編碼核苷酸序列之一或多部分。DNA序列間之變異，其由點突變或誘發性修飾(包括插入、刪去與取代)，以增強活性、半生期或產生其所編碼之多肽，亦包含於本發明中。在某些實施例中，本發明之核酸序列包括無CpG區域。用於基因療法應用之基因遞送載體之主要限制為轉殖基因體內表現之快速衰退。已觀察到促進子內之二核苷酸之甲基化為限制長期基因表現之主要限制因素。
在某些實施例中，本發明調節序列在本發明載體中之效果，可在使用前經分析。引入核酸載體至微器官之表現效果與方法，可經此技術領域之標準方法常規性地評估，如下所述。在一實施例中，表現GMMO產生之治療多肽之表現與分泌量，係於 植入至少一GMMO前於體外測量。
在一實施例中，體外分泌量之測量提供決定至少一GMMO之劑量之指標，即植入個體之GMMOs數量。在一實施例中，分泌量可使用ELISA或其他此領域已知之技術測量。
在一實施例中，至少一GMMO與本發明方法中之核酸係編碼一治療多肽。在一實施例中，術語“多肽”係指一分子，包含胺基酸殘基，由結合胜肽(即醯胺)鍵連結，並包括多肽與蛋白質。因此，在一實施例中，本發明之多肽可具有單一或多個共價性連結之胺基酸鏈，並可更包含鏈內或鏈間連結，包含雙硫鍵。在一實施例中，某些多肽亦可形成次單元或多重單元巨分子複合物。在一實施例中，該多肽可預期具有形態上之傾向，並具有一立體結構。該形態傾向與立體結構通常係由多肽之一級(即胺基酸)序列，及/或雙硫鍵或其他共價或非共價鏈內或鏈間交互作用存在(或不存在)而定義出。
術語“胺基酸”或“胺基酸群”應理解為包括20個天然發生之胺基酸；這些胺基酸通常在體內經轉譯後修飾為，包括如羥基脯胺酸、磷酸絲胺酸和磷酸蘇胺酸；以及其他不尋常胺基酸，包括但不限於，2-胺基己二酸、羥基離胺酸、異鎖鏈賴胺素(isodesmosine)、正-纈胺酸、正-亮胺酸與鳥胺酸。此外，術語“胺基酸”可包括D-和L-胺基酸。
使用於此，術語“胺基酸”係指D或L空間異構物形式之胺基酸，除非另有指出。等效之蛋白質或等效之胜肽亦包含於本發明範疇中。“等效之蛋白質”與“等效多肽” 係與天然存在的蛋白質或多肽的線性序列不相同，但其具有不改變其生物活性之胺基酸取代。這些等效物之原始序列可不同，藉由一或多個胺基酸經相關胺基酸，例如類似之帶電胺基酸替代，或其側鏈或官能基經修飾。
該多肽或編碼該多肽之DNA序列，可由多種天然或非天然來源獲得，如原核或真核細胞。在一實施例中，來源細胞可為野生型、重組或突變物。在另一實施例中，該複數個多肽可為微生物內生性，如細菌、酵母菌或真菌，至病毒，至動物(包括哺乳動物、無脊椎動物、爬行動物、鳥類與昆蟲)或植物細胞。
在另一實施例中，該多肽可得自更特定之來源，如病毒顆粒之表面外衣、特定細胞裂解液、組織萃取物，或其可限制於表現於細胞膜表面之多肽。本發明之多肽可為任何尺寸。
如同此領域者所知，編碼一蛋白質之核酸序列或基因之片段或衍生物，仍可以如完整野生型基因或序列相同之方式作用。類似地，核酸序列形式可具有變異，與野生型序列相較，編碼有興趣之蛋白質或其片段，維持野生型功能，具有相同之生物作用，儘管有這些變異。
該多肽可包括功能性片段。“功能性片段”係指可進行多肽之一或多種功能之多肽部分，甚至是在多肽其餘部分不存在情況下。在一實施例中，該功能性片段足以與有興趣之標的物產生分子間交互作用。
依據本發明之其他實施例，重組基因產物可由具 一修飾核苷酸序列之聚核苷酸編碼，與相對應之天然聚核苷酸相較。
如上所述，在一實施例中，本發明之至少一GMMO與方法，提供一種治療配方，其包含含有編碼一治療多肽之核酸序列之載體。在一實施例中，術語“治療”係指一分子，當提供至有需要之個體時，可提供有助益之效果。在某些情況下，該分子為治療性，其功能可取代個體中缺乏或減少之此分子。在一實施例中，該治療蛋白質為個體缺乏之蛋白質，如個體所需蛋白質內生性缺失或錯義突變。在其他實施例中，該內生性蛋白質經突變，並產生一無功能性蛋白質，由提供功能性蛋白質而彌補。在其他實施例中，異源性蛋白質之表現係加入低內生性含量中，導致特定蛋白質之累積增強表現。在其他實施例中，該分子刺激一訊號級聯，其提供表現或分泌，或細胞或宿主功能之其他關鍵因子。
在一實施例中，術語“治療配方”係描述一物質，用於診斷，或在另一實施例中，用於治癒，或在另一實施例中，用於減輕，或在另一實施例中，用於治療，在另一實施例中，用於預防一疾病、病症、症狀或感染。在一實施例中，本發明之“治療配方”係指任一物質，其影響其所施加之目標之結構與功能。在一實施例中，治療微器官包含本發明之經基因修飾之微器官，其表現一治療多肽。因此，在一實施例中，治療微器官包含經基因修飾之皮膚微器官，其表現一治療多肽。在一實施例中，該治療微器官 表現EPO。在另一實施例中，該治療微器官表現IFN。
在另一實施例中，本發明之“治療多肽”為一分子，當投予患病個體時，可減輕疾病或病症之症狀。
在某些實施例中，本發明方法包括投予抗發炎試劑，及/或抗氧化試劑，在植入GMMO之後，其中該目標投藥位置接近或在植入GMMO附近，其在一實施例中係於每一GMMO植入處附近皮下注射(圖13a與13b)。在某些實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化試劑之投藥係與GMMO植入同時進行。
術語“抗發炎”試劑，使用於此，在一實施例中係指可降低發炎反應之物質或療法。抗發炎可藉由降低發炎反應而減緩疼痛。術語“抗增生”試劑，在一實施例中，使用於此係指可部分或完全抑制細胞生長之物質或療法。術語“抗氧化”，使用於此，在一實施例中係指可抑制其他分子氧化之物質或療法。抗氧化劑為可保護細胞對抗自由基作用之物質。自由基為體內分解食物，或環境暴露於如香菸與輻射時所產生之分子。自由基會傷害細胞。
可用於本發明方法之抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化試劑包括維生素C、N-乙醯基半胱胺酸、半胱天蛋白酶-1抑製劑(Z-WEHD-FMK)、胞嘧啶、吡非尼酮(Pirfendone)、TEMPOL、組織蛋白酶B抑製劑(CA-074-OME)、地美可欣(Demecolcine)、ZVAD(泛半胱天蛋白酶抑製劑)、米諾環素鹽酸鹽(Minocycline hydrochloride)(半胱天蛋白酶1與3抑製劑)、托珠單抗 (tocilizumab)(Actemra®)(IL-6抑製劑)、阿司匹林(COX抑製劑)、MIF拮抗劑(巨噬細胞遷移抑制因子)、英夫利昔單抗(Infliximab)(抗腫瘤壞死因子)、絲裂黴素C、白藜蘆醇、透明質酸與甲基腎上腺皮質酮，以及任何技術上已知之其他抗發炎試劑、抗增生試劑，及/或抗氧化劑。
在一實施例中，抗發炎試劑為甲基腎上腺皮質酮。在另一實施例中，抗發炎試劑為曲安奈德縮丙酮(triamcinolone acetonide)。在又一實施例中，抗發炎試劑為曲安奈德六縮丙酮(triamcinolone hexacetonide)。
在一實施例中，本發明更包含一投予甲基腎上腺皮質酮如Depo-Medrol®之步驟，在GMMO植入步驟之後，其中該甲基腎上腺皮質酮係皮下注射投藥至每一經基因修飾之微器官植入處附近。
在某些實施例中，本發明方法包括抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑之皮下投藥，在皮下植入治療GMMO如EPO GMMO之後，其中係皮下注射投藥至每一經基因修飾之微器官植入處附近。在一實施例中，投藥包括每次投藥至少一次皮下注射。在另一實施例中，投藥包括每次投藥至少二次皮下注射。在另一實施例中，投藥包括每次投藥至少三次皮下注射。在另一實施例中，投藥係沿著植入GMMO之直線長度。
甲基腎上腺皮質酮為抗發炎糖皮質激素。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係以本發明方法投藥。在某些實施例中，本發明方法包括甲基腎上腺皮質酮之皮下投藥， 在皮下植入治療GMMO如EPO GMMO之後，其中該投藥係皮下注射投藥至每一經基因修飾之微器官植入處附近。在一實施例中，投藥包括每次投藥至少一次皮下注射。在另一實施例中，投藥包括每次投藥至少二次皮下注射。在另一實施例中，投藥包括每次投藥至少三次皮下注射。在另一實施例中，投藥係沿著植入GMMO之直線長度。
在植入治療GMMO後，使用抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑之期間，在某些實施例中，包括在GMMO植入同時單次投藥。在另一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑之投藥，在植入治療GMMO之後，係每週重複一次，長達八週。
在一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑，在植入治療GMMO之後投藥一次。在另一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑係每週投藥。在一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑係在植入治療GMMO之後每週投藥，長達八週。在另一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑為雙週投藥(每隔一週)，其中在一實施例中投藥持續長達八週，在GMMO植入之後。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑為半週投藥一次(每週二次)，其中在一實施例中投藥持續長達八週，在GMMO植入之後。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑係依據“需求”投藥。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑之投藥侷限於GMMO植入之時。抗發炎試劑、 抗增生試劑及/或抗氧化劑之注射，可於GMMO植入之後進行。此外，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑之投藥可與GMMO植入同時進行。在某些實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化劑可於GMMO植入同時，以及GMMO植入之後投藥，包括GMMO植入後之任何時間。
在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係於GMMO植入後投藥一次。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮每週投藥一次，至多八週。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係於GMMO植入後每週投藥一次，至多八週。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係雙週投藥一次(每隔一週)，其中在一實施例中係於GMMO植入後連續投藥，至多八週。在又一實施例中，甲基腎上腺皮質酮每半週投藥一次(每週二次)，其中在一實施例中，係於GMMO植入後連續投藥，至多八週。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮於植入後第45日投藥。在又一實施例中，甲基腎上腺皮質酮依據“需要”投藥。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係於GMMO植入時與植入後45日投藥。在又一實施例中，甲基腎上腺皮質酮侷限於GMMO植入時投藥。甲基腎上腺皮質酮注射可於GMMO植入後進行。此外，甲基腎上腺皮質酮注射可與GMMO植入同時進行。在某些實施例中，甲基腎上腺皮質酮可於GMMO植入時以及GMMO植入後投藥，包括GMMO植入後之任何時間。
在本發明方法之一實施例中，其中GMMO於植入後或同時注射抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑，如甲 基腎上腺皮質酮，於離GMMO植入處不超過1mm處。在另一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑之注射處距離GMMO植入處不超過2mm。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑之注射處距離GMMO植入處不超過3mm。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑之注射處距離GMMO植入處不超過4mm。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑之注射處距離GMMO植入處不超過5mm。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑之注射處距離GMMO植入處不超過6mm。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑之注射處距離GMMO植入處不超過8mm。在又一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑之注射處距離GMMO植入處不超過10mm。
抗發炎試劑、抗增生試劑和/或抗氧化劑之注射位置與數目，取決於數個因素，包括GMMO植入之數目與尺寸。臨床技術人員可使用其背景知識，針對不同個體，或於不同時間進行GMMO植入之相同個體，選擇不同之投藥處方。
每一GMMO植入處面積之抗發炎試劑、抗增生試劑和/或抗氧化劑之每一特定次投藥之注射總量，視為試劑之劑量/GMMO。例如，每一GMMO植入處面積之甲基腎上腺皮質酮注射總量，於任一次投藥，視為甲基腎上腺皮質酮劑量/GMMO。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約1-120mg每GMMO。在一實施例中，甲基腎上腺皮質 酮之劑量為約1-60mg每GMMO。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約1-30mg每GMMO。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約1-5mg每GMMO。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約5-10mg每GMMO。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約10-15mg每GMMO。在又一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約15-25mg每GMMO。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約25-45mg每GMMO。在又一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約45-65mg每GMMO。在又一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約65-85mg每GMMO。在又一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約85-105mg每GMMO。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約105-120mg每GMMO。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約1-12mg每GMMO。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量為約12mg每GMMO。
在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮之劑量不超過120mg，就特定病患特定投藥之所有GMMO植入處。
在某些實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑，可於治療GMMO植入處皮下投藥。例如，在一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑可於治療GMMO植入處皮下投藥，如EPO GMMO植入，可導致治療多肽血清含量之衰退速率下降。換言之，抗發炎試劑、抗增生試劑或抗氧化劑於治療GMMO處皮下投藥，會導致治療多肽血清含量之持續增加，與基礎血清含量比較，在至 少三個月期間內。在另一實施例中，治療多肽持續增加至少四個月期間。在又一實施例中，治療多肽持續增加至少五個月期間。在又一實施例中，治療多肽持續增加至少六個月期間。在又一實施例中，治療多肽持續增加至少一年期間。
在某些實施例中，甲基腎上腺皮質酮於治療GMMO植入處，如EPO GMMO植入處皮下投藥，可導致治療多肽血清含量衰退速率下降。換言之，甲基腎上腺皮質酮於治療GMMO植入處之皮下投藥，可導致治療多肽血清含量之持續增加，與基礎血清含量比較，在至少三個月期間內。在另一實施例中，治療多肽持續增加至少四個月期間。在又一實施例中，治療多肽持續增加至少五個月期間。在又一實施例中，治療多肽持續增加至少六個月期間。在又一實施例中，治療多肽持續增加至少一年期間。
例如，甲基腎上腺皮質酮於治療GMMO植入處，如EPO GMMO植入處之皮下投藥，可導致體內EPO血清含量衰退速率下降，與無甲基腎上腺皮質酮投藥測得之含量相較(圖8b、9b與10b)。藉由以本發明GMMO提供之治療多肽如EPO血清含量衰退速率降低，治療多肽如EPO之持續遞送便上升並增進。包括投予甲基腎上腺皮質酮之GMMO植入方法，可有效提供長效治療多肽劑量，如EPO劑量，至有需要之個體中。
使用於此，術語“衰退速率”在一實施例中係指治療多肽由尖峰血清含量之降低速率。圖7a、7b、8a、8b、 9a、9b、10a與10b說明治療多肽衰退速率下降，與治療多肽持續遞送至個體有關。
在一實施例中，在本發明方法中使用甲基腎上腺皮質酮，會降低由GMMO表現與分泌之治療多肽之衰退速率。在一實施例中，在本發明方法中使用甲基腎上腺皮質酮，會降低由EPO GMMO表現與分泌之治療多肽之衰退速率。在另一實施例中，在本發明方法中使用甲基腎上腺皮質酮，會降低由IFN GMMO表現與分泌之INF之衰退速率。
在一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化試劑，於植入治療GMMO時投藥，會降低由GMMO表現與分泌之治療多肽之衰退速率，因而提供該治療多肽至有需要個體一段持續期間。在一實施例中，抗發炎試劑、抗增生試劑及/或抗氧化試劑為甲基腎上腺皮質酮。
在某些實施例中，本發明方法更包含於GMMO植入處投予局部皮質類固醇。本發明之局部皮質類固醇，包括高藥效、廣效性與低藥效皮質類固醇。本發明方法中使用之局部皮質類固醇可為軟膏、最佳化軟膏、乳液、凝膠、乳霜、潤膚基底、泡沫、氣霧、泡沫氣霧、洗髮精、溶液、噴霧、膠帶、凡士林軟膏、強化乳霜、無水乳霜、疏水性潤膚劑，親水性潤膚劑，或油形式或載劑。在一實施例中，本發明方法中使用之皮質類固醇包含二丙酸倍他米松(Diprolene®)、丙酸氯倍他索(Temovate®、Clobex®、Olux®-EOlux®、Cormax®)、丙酸鹵倍他索(Ultravate®)、氟欣諾能(Fluocinonide)(Vanos®)、氟氫縮松(Cordran®)、 二氟拉松雙乙酸鈉(Psorcon®、ApexiCon®)、安西奈德(amcinonide)(Cyclocort®、Amcort®)、倍他米松二丙酸酯(betamethasone dipropionate)(Dipronsone®、Diprolene®AF)、哈西奈德(halcininide)(Halog®)、醋酸氟輕鬆(fluocinonide)(Lidex®)、二氟拉松雙乙酸鈉(diflorasone diacetate)(ApexiCon®、Florone®)、去羥米松(desoximetasone)(Topicort®)、曲安奈德縮丙酮(triamcinolone acetonide)(Kenalog®、Triderm®、Aristocort®HP、Aristocort®A、Aristocort®)、倍他米松戊酸酯(betamethasone valerate)(Valisone®、Luxiq®、β-Val®)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)(Cutivate®)、醋酸氟輕鬆(fluocinonide)(Lidex®-E)、糠酸莫米松(mometasone)(Elocon®)、氟輕鬆(fluocinolone acetonide)(Synalar®、Capex®、Derma-Smoothe®/FS)、糠酸莫米松(mometasone)(Elocon®)、氫化可的松戊酸酯(hydrocortisone valerate)(Westcort®)、氯可托龍新戊酸酯(clocortolone pivalate)(Cloderm®)、潑尼卡松(prednicarbate)(Dermatop®)、地奈德(DesOwen®、Tridesilon®、Desonate®、LoKara®、Verdeso®)、丁酸氫化可的松(hydrocortisone butyrate)(Locoid®、Lipocream®、Cortizone®-10)、丙丁酸氫化可的松(hydrocortisone probutate)(Pandel®)、阿氯米松雙丙酸酯(alclometasone dipropionate)(Aclovate®)，或氫化可的松(hydrocortisone)(基底)(Hytone®、Nutracort®、Texacort®、Cortaid®、Synacort®、Aquinil®HC、Sarnol®HC、 Cortizone®-10，Noble，Scalp relief)，或其任意組合。在一實施例中，該至少一局部類固醇為戊酸倍他米松。在一實施例中，該至少一局部類固醇為泡沫形式之戊酸倍他米松。
在一實施例中，本發明方法包含施加至少一局部皮質類固醇，在植入至少一經基因修飾之微器官後至少二週。在另一實施例中，施加至少一局部皮質類固醇至少三週。在又一實施例中，施加至少一局部皮質類固醇至少四週。在又一實施例中，施加至少一局部皮質類固醇至少六週。在又一實施例中，施加至少一局部皮質類固醇至少八週。
使用於此，術語“持續”係指一段延長期間。例如，在一實施例中，一段延長期間係指本發明治療多肽由本發明經基因修飾之微器官表現或分泌之時間值。在另一實施例中，一段延長期間係指在植入本發明GMMO後，觀察到之治療效果時間值。在又一實施例中，一段延長期間係指本發明治療多肽於體內之延長存在。在一實施例中，治療多肽之持續或延長存在，係觀察到在植入GMMO並投以甲基腎上腺皮質酮之後，治療多肽之衰退速率下降。在另一實施例中，治療多肽之持續或延長存在，係觀察到在植入本發明GMMO，但未進一步投予甲基腎上腺皮質酮之後，治療多肽之衰退速率下降。術語“延長”可與“持續”交換使用，具有相同意義與性質。
在一實施例中，該治療多肽為紅血球生成素 (EPO)。“紅血球生成素”或“EPO”使用於此係指得自哺乳動物如人類之全長EPO多肽，以及其片段，其可維持全長EPO之至少一生物功能及/或體內治療助益效果。在一實施例中，由EPO提供之至少一體內治療助益效果為增加Hb含量。在另一實施例中，由EPO提供之至少一體內治療助益效果為維持Hb含量。在又一實施例中，由EPO提供之至少一體內治療助益效果為增加與維持Hb含量。在一實施例中，由EPO提供之至少一體內治療助益效果為增加血容比百分比。在另一實施例中，由EPO提供之至少一體內治療助益效果為維持血容比百分比。在又一實施例中，由EPO提供之至少一體內治療助益效果為增加與維持血容比百分比。在一實施例中，由EPO提供之至少一體內治療助益效果為治療貧血。
在一實施例中，本發明方法係提供人類個體之血清紅血球生成素含量增加一段連續、持續期間，該方法包含下列步驟：提供至少一經基因修飾之微器官，其表現與分泌人類紅血球生成素，該微器官包含一輔助病毒依賴性腺病毒載體，其包含編碼人類紅血球生成素之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，且其中該核酸任擇地更包含至少一或多個額外調節序列；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之紅血球生成素分泌量；植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及測量該個體血清中之紅血球生成素含量，其中該至少一經基因修飾之微器官之植入，可增加紅血球生成素之體內血 清含量超越基礎量至少三個月。在一實施例中，該增加持續至少六個月。在一實施例中，該核酸包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17。
在一實施例中，本發明方法包含治療有需要人類個體之貧血持續一段期間之方法，包含下列步驟：提供至少一經基因修飾之微器官，其提供人類紅血球生成素之持續遞送，該微器官包含一載體，如HDAd或AAV載體，其包含編碼人類紅血球生成素之核酸序列，其操作性連結至一或多個調節序列；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之紅血球生成素分泌量；植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及測量該個體血清中之紅血球生成素含量；其中該個體測得之血紅素位準於測量值之至少50%維持於約9-11g/dl至少一個月。在一實施例中，Hb位準增加及/或維持至少三個月。在另一實施例中，Hb位準增加及/或維持至少六個月。在一實施例中，該核酸編碼紅血球生成素，並操作性連結至一或多個調節序列，包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17。
於此，“治療”係指治療性處理與預防或防止性措施，目的為預防或減輕上述目標病理症狀或病症。因此，在一實施例中，治療可包括直接作用或治癒、壓抑、抑制、預防、減輕嚴重度、延遲發作、減輕與疾病、障礙或病症相關之症狀，或其組合。因此，在一實施例中，“治療”特別指延緩進展、加快緩解、誘導緩解、加強緩解、加快恢 復、增加療效或減少對於替代治療之抵抗性，或其組合。在一實施例中，“預防”特別指延緩症狀的發作、預防疾病復發、減少復發次數與頻率、增加症狀發作之間的間隔，或其組合。在一實施例中，“壓抑”或“抑制”特別指降低症狀之嚴重度、降低急性發作之嚴重度、降低症狀數目、降低疾病相關症狀之發生率、減少症狀之延遲、緩解症狀、減少繼發症狀、減少繼發性感染、延長患者存活，或其組合。
在一實施例中，症狀為原發性，而在另一實施例中，症狀為繼發性。在一實施例中，“原發性”係指該症狀為特定疾病之直接結果，而在一實施例中，“繼發性”係指該症狀為衍生自或為原發性病因之結果。在一實施例中，本發明之化合物係用於治療原發性與或繼發性症狀，或與該疾病相關之繼發性併發症。在另一實施例中，“症狀”可以是一種疾病或病理學狀態的任何表現。
在一實施例中，該治療核酸可編碼或該治療多肽可為細胞介素，如紅血球生成素。
在另一實施例中，該治療核酸可編碼或該治療多肽可為酵素，如涉及葡萄糖儲存與分解者。在另一實施例中，該治療蛋白質包含轉運子，如離子轉運子，如CFTR，或葡萄糖轉運子或其他轉運子，其缺乏或異常表現會導致各種疾病。
依據本發明之此觀點，本發明之GMMO與方法係用於治療、預防或介入治療一疾病。在一實施例中，個體待治療 之疾病包括，但不侷限於：腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、化療誘發之貧血、HIV治療造成之貧血、微血管病性溶血性貧血、早產造成之貧血、發炎性病症包括類風濕性關節炎、感染、與包括多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤之癌症相關之貧血、造血幹細胞病症、與骨髓增生異常症候群(MDS)相關之貧血、鐮狀細胞貧血，或地中海型貧血包括α-、β-、或α/β-地中海型貧血，或其任一組合；及/或其中該個體需要在骨髓移植後，加速紅血球之再生、肝炎、B型肝炎、C型肝炎或D型肝炎，或其任一組合。
應瞭解到任何表現特定蛋白質之疾病，治療蛋白質之提供，其可伴隨本發明配方，並依據本發明方法，視為本發明之一部分。
使用於此，“治療(treatment)”或“治療(treating)”貧血係指增加個體血流可攜帶之氧氣量。此可藉由升高紅血球量(血容比百分比)及/或血紅素含量。血紅素為富含鐵之蛋白質，位於可攜帶氧氣至身體之紅血球中。
使用於此，“治療(treatment)”或“治療(treating)”肝炎係指降低肝炎病毒，如降低B型肝炎病毒，如降低C型肝炎病毒，如降低D型肝炎病毒，或降低這些病毒之組合。在一實施例中，治療可降低病毒負荷量，如C型肝炎RNA降低，或B型肝炎DNA降低。病毒數目或病毒負荷量之降低，可藉由測試病毒DNA，如B型肝炎病毒DNA之損失而評估。此外，病毒數目或病毒負荷量之降低，可藉由測試特定病毒抗原如B型肝炎“e”抗原(HBeAg)或B型肝炎之“表面”抗原 (HBsAg)。
在一實施例中，本發明之GMMO與方法包含一核酸序列，操作性連結至一或多個調節序列。在一實施例中，引入微器官細胞之核酸分子，為適合於該細胞中表現由該核酸編碼之基因產物之形式。因此，在一實施例中，該核酸分子包括基因(或其一部份)轉錄所需之編碼與調節序列。當該基因產物為蛋白質時，該核酸分子包括核酸分子轉譯所需之編碼與調節序列，包括促進子、增強子、多聚腺苷酸化訊號、運送編碼蛋白質所須之序列，如運送蛋白質或胜肽至細胞表面或分泌出所須之N-端訊號。
在一實施例中，本發明之GMMO與方法可增加有需要個體之治療多肽量，在植入本發明至少一GMMO之後。在一實施例中，該治療多肽為EPO。在另一實施例中，該治療多肽為IFN。在一實施例中，在植入至少一GMMO之後，增加至少5%高於基礎值。在另一實施例中，該治療多肽量增加至少7%，在另一實施例中，至少10%，在另一實施例中，至少15%，在另一實施例中，至少20%，在另一實施例中，至少25%，在另一實施例中，至少30%，在另一實施例中，至少40%，在另一實施例中，至少50%，在另一實施例中，至少60%，在另一實施例中，至少75%，在另一實施例中，至少100%，在另一實施例中，至少125%，在另一實施例中，至少150%高於基礎值，在另一實施例中，至少200%高於基礎值。在又一實施例中，本發明配方與方法可增加治療多肽之量，在植入至少一GMMO之後，其中治療多肽 之量之後會回復至基礎或接近基礎值。在一實施例中，回復至基礎或接近基礎值，會發生於治療胜肽或核酸投藥後一個月內。
在一實施例中，植入本發明至少一GMMO係提供治療多肽之“持續”或“長效”遞送。在一實施例中，植入本發明包含至少一MAR調節核酸序列之至少一GMMO，可提供治療多肽持續或長效遞送，與植入缺乏至少一MAR調節核酸序之類似GMMO相較。在一實施例中，治療多肽之表現係增加超過基礎值至少一個月，或在另一實施例中，至少三個月，而在又一實施例中，至少六個月。
在一實施例中，本發明方法係於植入至少一GMMO同時或之後，投予甲基腎上腺皮質酮，可降低本發明治療多肽之衰退速率，與不包含投予甲基腎上腺皮質酮之治療GMMO植入處方相較。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮投藥，與植入包含至少一MAR調節核酸序列之GMMO，對於治療多肽衰退速率之效果是加成的。在一實施例中，該治療多肽為EPO。在一實施例中，該治療多肽為IFN。在一實施例中，衰退速率下降至少一週。在另一實施例中，衰退速率下降至少一個月。在又一實施例中，衰退速率下降至少二個月。在又一實施例中，衰退速率下降至少三個月。在又一實施例中，衰退速率下降至少四個月。在另一實施例中，衰退速率下降至少五個月。在又一實施例中，衰退速率下降至少六個月。
在一實施例中，經由本發明配方表現之治療多肽 會增加，與“基礎值”相較，其在一實施例中，為宿主或未經基因修飾之細胞培養物之基因表現量。
在一實施例中，本發明配方與方法可增加功能性標記物之量，在一實施例中，為血容比百分比。
在另一實施例中，本發明GMMO為“長效性”，其在一實施例中係指該配方可增加治療多肽或核酸目標分子之分泌、表現、製造、循環或持久性。例如，當該治療多肽為EPO時，目標分子可為Hb。因此，在一實施例中，使用本發明GMMO可增加個體中Hb之製造、循環或持久性。
在本發明之又一實施例中，本發明之GMMO為“長效性”，其係指可增加功能性標記物之分泌、表現、製造、循環或持久性之GMMO。在一實施例中，該功能性標記物為血容比。在另一實施例中，該功能性標記物為Hb。在又一實施例中，該功能性標記物，如血容比或Hb之含量，增加至少2週，在另一實施例中，至少3週，在另一實施例中，至少4週，在另一實施例中，至少5週，在另一實施例中，至少6週，在另一實施例中，至少8週，在另一實施例中，至少2個月，在另一實施例中，至少3個月，在另一實施例中，至少4個月，在另一實施例中，至少5個月，在另一實施例中，至少7個月，在另一實施例中，至少8個月，在另一實施例中，至少9個月，在另一實施例中，至少10個月，在另一實施例中，至少11個月，或在另一實施例中，至少1年。在一實施例中，功能性標記物如Hb增加超過基礎值，反映於該期間進行之測量值之90%。在又一實施例中， 該增加反映於該期間，如一個月、六個月或一年，進行之測量值之80%。在又一實施例中，該增加反映於該期間，如一個月、六個月或一年，進行之測量值之70%。在另一實施例中，該增加反映於該期間，如一個月、六個月或一年，進行之測量值之60%，如一個月、六個月或一年。在又一實施例中，該增加反映於該期間，如一個月、六個月或一年，進行之測量值之50%。
在一實施例中，編碼治療多肽之核酸序列經最佳化，以增加治療多肽之表現量，在另一實施例中，增加治療多肽之期間，或在另一實施例中，其組合。在一實施例中，本發明之核酸序列包括無CpG序列。在一實施例中，調節核酸序列不含CpG。
在一實施例中，術語“最佳化”係指希望之改變，其在一實施例中為基因表現之改變，在另一實施例中，為蛋白質表現。在一實施例中，基因表現之最佳化為基因表現之調節最佳化。在另一實施例中，基因表現之最佳化為增加基因表現。依據本觀點，在一實施例中，基因表現增加2倍，與野生型相較。在另一實施例中，基因表現增加4倍。在又一實施例中，基因表現增加6倍。在又一實施例中，基因表現增加8倍。在又一實施例中，基因表現增加10倍。
在另一實施例中，最佳化基因表現可於特定環境條件下增加基因表現。在另一實施例中，最佳化基因表現包含基因表現減少，其在一實施例中，僅於特定環境條件下。
在另一實施例中，最佳化基因表現係增加基因表現期間。
在一實施例中，基因係於人類細胞中表現最佳化。在另一實施例中，基因係於微器官中表現最佳化。在又一實施例中，基因係於皮膚細胞中表現最佳化。在又一實施例中，基因表現之最佳化意味著加入序列因子至基因之側邊區域，及/或表現載體之別處。可加入以使基因表現最佳化之序列因子包括如，支架/基質附著區(S/MAR)、特化染色質結構(SCS)與土撥鼠肝炎轉錄後調節因子(WPRE)。
在一實施例中，本發明係提供一種上述之GMMO，其中該治療多肽為EPO。在另一實施例中，本發明提供一種GMMO，其提供EPO之持續遞送，該微器官包含一載體，其包含操作性連結至一或多個調節序列之核酸序列，其中該核酸序列編碼EPO，且該配方可增加EPO含量或EPO目標如血容比或Hb超過5%基礎值，該增加量可持續大於一個月。在又一實施例中，本發明提供一種提供GMMO至有需要個體之方法，其中該治療多肽為EPO，或其中該治療核酸編碼EPO。在又一實施例中，本發明提供一種提供EPO至有需要個體持續一段期間之方法。
在另一實施例中，本發明提供一種於有需要個體中誘發新血液細胞生成持續一段期間之方法，包含：提供一或多個GMMOs，該微器官包含一載體，其包含一核酸序列，操作性連結至一或多個調節序列；以及植入該GMMO於該個體中，其中該核酸序列編碼EPO，且其EPO量增加超 過5%基礎值，且該增加之EPO量可維持大於一個月。
編碼EPO之基因之辨識、選殖與表現，係描述於美國專利號5,756,349；5,955,422；5,618,698；5,547,933；5,621,080；5,441,868與4,703,008，在此併入本案以作為參考資料。自可支持含有重組EPO質體之哺乳細胞生長之細胞培養液純化出重組EPO，描述於美國專利號4,667,016，Lai等人，在此併入本案以作為參考資料。
在一實施例中，患有慢性腎衰竭之個體係患有慢性腎病(CKD)。在另一實施例中，患有慢性腎衰竭之個體係患有末期腎病(ESRD)。EPO可用於治療腎功能衰竭，包括CKD和ESRD所引起之貧血；與齊多夫定(AZT)治療之病患之HIV感染相關的貧血；與癌症化療相關的貧血；微血管病溶血性貧血，其可能繼發於機械閥溶血；早產兒貧血；類風濕性關節炎和其它發炎症狀引起之貧血；以及與包括多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤之癌症有關之貧血。此外，在預定手術之前進行EPO投藥可有益於個體，該個體患有造血幹細胞病症、與骨髓增生異常綜合徵(MDS)相關之貧血、需要骨髓移植後紅血球再生速度加快之個體，或需要誘發胎兒血紅素合成，為鐮狀細胞貧血和地中海貧血結果，之個體。
rHu-EPO(重組人類-EPO)之注射投藥已成為治療腎功能不全繼發性貧血之常規療法，其中提供劑量50-150U/kg，每週三次，用於回復血容比，並消除輸血依賴性。此計算出待治療個體之平均每日劑量為21.4-64.3 EPO U/kg/日。已觀察到在rHu-EPO注射治療血液透析病患期間，Hb含量通常會在非生理起伏或血紅素週期內升高與下降。在一實施例中，本發明方法提供有效EPO劑量10-150U紅血球生成素/Kg個體體重/日。在一實施例中，本發明方法提供有效EPO劑量18-150U紅血球生成素/Kg個體體重/日。在另一實施例中，有效劑量為18-30U紅血球生成素/Kg個體體重/日。在另一實施例中，有效劑量為30-50U紅血球生成素/Kg個體體重/日。在又一實施例中，有效劑量為50-65U紅血球生成素/Kg個體體重/日。在又一實施例中，有效劑量基於下列決定：個體的體重；個體的歷史血紅素量；以及在植入至少一GMMO步驟前一個月，投至該個體之紅血球生成素平均量。
在一實施例中，用於本發明組成物與方法中之EPO係經完全醣化，而在另一實施例中，其包含某些醣化殘基，而在另一實施例中，其未經醣化。
在一實施例中，該EPO基因可為野生型EPO基因，而在另一實施例中，該EPO基因可經修飾。在一實施例中，該經修飾之EPO基因可經最佳化。
在一實施例中，該EPO基因具對應於Genbank Accession Nos：X02158；AF202312；AF202311；AF202309；AF202310；AF053356；AF202306；AF202307；或AF202308之核酸序列，或編碼對應Genbank Accession Nos：CAA26095；AAF23134；AAF17572；AAF23133；AAC78791；或AAF23132之蛋白質序列。在另一實施例中，該EPO前 驅物基因具對應於Genbank Accession Nos：NM_000799；M11319；BC093628；或BC111937之核酸序列，或編碼對應於Genbank Accession Nos：NP_000790；AAA52400；AAH93628；或AAI11938之蛋白質序列。在另一實施例中，該EPO基因具如SEQ ID NO：1之核酸序列，而在另一實施例中，該EPO基因具如SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在另一實施例中，該EPO基因具如SEQ ID NO：2之核酸。在一實施例中，該編碼EPO，操作性連結至一或多調節序列之核酸具核酸序列如SEQ ID NO：11。在另一實施例中，該編碼EPO，操作性連結至一或多調節序列之核酸具核酸序列同源於SEQ ID NO：11。在一實施例中，該編碼EPO，操作性連結至一或多調節序列之核酸具核酸序列如SEQ ID NO：13。該編碼EPO，操作性連結至一或多調節序列之核酸具核酸序列同源於SEQ ID NO：13。在一實施例中，該編碼EPO，操作性連結至一或多調節序列之核酸具核酸序列如SEQ ID NO：15。在另一實施例中，該編碼EPO，操作性連結至一或多調節序列之核酸具核酸序列同源於SEQ ID NO：15。在一實施例中，該編碼EPO，操作性連結至一或多調節序列之核酸具核酸序列如SEQ ID NO：17。該編碼EPO，操作性連結至一或多調節序列之核酸具核酸序列同源於SEQ ID NO：17。
在一實施例中，用於基因修飾之載體具如SEQ ID NO：12之核酸序列。在一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列同源於SEQ ID NO：12。在另一實施例中， 用於基因修飾之載體具核酸序列如SEQ ID NO：10。在一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列同源於SEQ ID NO：10。在另一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列如SEQ ID NO：16。在一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列同源於SEQ ID NO：16。在另一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列如SEQ ID NO：14。在一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列同源於SEQ ID NO：14。在另一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列如SEQ ID NO：26。在一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列同源於SEQ ID NO：26。在另一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列如SEQ ID NO：27。在一實施例中，用於基因修飾之載體具核酸序列同源於SEQ ID NO：27。
在一實施例中，本發明之GMMO可用於治療患有貧血之個體。在一實施例中，貧血係定義為“紅血球細胞中攜氧Hb量不足之病理缺陷”。貧血之症狀包括疲勞、減少執行日常功能、認知功能受損、頭痛、頭暈、胸口疼痛和呼吸困難、噁心、抑鬱、疼痛或其組合。在一實施例中，貧血與預後較差及死亡率上升有關。在一實施例中，本發明之EPO GMMO可用於治療貧血，其中當貧血之一或多個症狀減輕時，個體便為經治療。
貧血通常為腎衰竭之結果，歸因於腎臟製造EPO降低。在另一實施例中，貧血係由於癌症浸潤、淋巴瘤或白血病，包括非何傑金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、化療、 機械閥溶血、早產兒、類風濕性關節炎、發炎性病症、造血障礙、與骨髓增生異常症候(MDS)相關之貧血，鐮狀細胞貧血、地中海貧血或骨髓替換，造成骨髓製造之紅血球細胞(erythroid)減少而引起。其他貧血原因包括，因失血過多如出血或月經異常出血造成之失血；癌症療法如外科手術、放射療法、化學療法、治療愛滋病患者的齊多夫定(Zidovudine，AZT)、免疫療法，或其組合；癌性骨髓浸潤或替換；溶血增加，其在一實施例中為裂解或破壞紅血細胞；低含量EPO，或其組合。在一實施例中，貧血係指範科尼氏(Fanconi)貧血，其在一實施例中為一種遺傳性貧血，會導致骨髓衰竭(再生不全性貧血)，並常常導致急性骨髓性白血病(AML)。在另一實施例中，貧血是指戴蒙布來克凡(Diamond Blackfan)貧血、正常紅血球貧血、再生不全性貧血、缺鐵性貧血、維生素缺乏貧血、鐵粒幼細胞貧血、陣發性夜間血尿症、慢性疾病貧血、腎臟疾病及透析貧血，或其組合。
在某些實施例中，本發明方法包含植入EPO GMMO之步驟，用於治療患有腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、化療誘發之貧血、HIV治療造成之貧血、微血管病性溶血性貧血、早產造成之貧血、發炎性病症包括類風濕性關節炎、感染、與包括多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤之癌症相關之貧血、造血幹細胞病症、與骨髓增生異常症候群(MDS)相關之貧血、鐮狀細胞貧血，或地中海型貧血包括α-、β-、或α/β-地中海型貧血，或其任一組合；及/或其中該個 體需要在骨髓移植後，加速紅血球之再生，或其組合之個體。在一實施例中，該患有慢性腎衰竭之個體係患有慢性腎臟疾病(CKD)或末期腎臟病(ESRD)。在一實施例中，該個體為人類個體。
在又一實施例中，本發明之長效性EPO GMMO係用於增加有需要個體之Hb含量。有需要個體Hb之增加可為如在進行重大手術之前之主要目標。
應瞭解到本發明之GMMO與方法可用於治療貧血，不論貧血之原因，以及貧血原因是否已知。在一實施例中，所提供之GMMO與方法為有效之EPO療法。術語“有效之EPO療法”，係指EPO量足以使病患之Hb量位於治療視窗內。在一實施例中，“有效之EPO療法”係指增加有需要個體之紅血球生成。在一實施例中，“有效之EPO療法”係指預防有需要個體之紅血球生成下降。使用於此，術語“有效之EPO療法”於此亦可指稱為EPO之“有效藥劑”或“有效劑量”。在一實施例中，“有效之EPO療法”亦指稱為可增加或增加與維持或維持個體之Hb於治療量。在另一實施例中，“有效之EPO療法”亦指稱為可增加或增加與維持或維持個體之血容比於治療量。
在本發明之一實施例中，有效之EPO療法可藉由植入至少一(1)EPO GMMO至病患中。在另一實施例中，有效之EPO療法可藉由植入至少二(2)EPO GMMO至病患中。在一實施例中，有效之EPO療法可藉由植入至少三(3)EPO GMMO至病患中。在一實施例中，有效之EPO療法可藉由 植入至少四(4)EPO GMMO至病患中。在一實施例中，有效之EPO療法可藉由植入至少五(5)EPO GMMO至病患中。在一實施例中，有效之EPO療法可藉由植入至少六(6)EPO GMMO至病患中。在一實施例中，有效之EPO療法可藉由植入大於六(6)EPO GMMO至病患中。
使用於此，“治療視窗”係指有需要個體希望之Hb量。在一實施例中，治療視窗係指Hb濃度在10gm/dl至12gm/dl範圍內。在另一實施例中，治療視窗係指Hb濃度在9-11gm/dl範圍內。在又一實施例中，治療視窗係指Hb濃度在9.5-12.6gm/dl範圍內。在又一實施例中，Hb濃度在9-13.2gm/dl範圍內。在又一實施例中，Hb濃度在8.5-13.8gm/dl範圍內。在另一實施例中，Hb濃度在8-14.4gm/dl範圍內。使用於此，術語“治療視窗”亦可指稱“治療量”或“治療Hb量”。在本發明之一實施例中，有效之EPO療法可使病患之Hb(“Hb”)量落於治療視窗內。在一實施例中，血液Hb量增加高於11.5g/dl，連續四周測量，可視為在治療視窗外。在另一實施例中，血液Hb量增加高於12.0g/dl，連續每週測量，可視為在治療視窗外。為了避免血液Hb量增加值落於治療視窗外，植入長效性EPO配方之方法可用於預防所得血清EPO之升高超過正常生理範圍之上限，其定義為超過200mU/ml。
使用於此，術語“有效藥劑”或“有效劑量”係指每日由至少一GMMO表現之治療多肽有效量，其提供治療效果。例如，表現EPO之GMMO之有效劑量，在一實施例 中可為由維持或增加與維持病患Hb於治療視窗內之一或多EPO GMMO之每日總分泌量。
使用於此，EPO之單位為可接受之國際單位，於此係使用符號“U”或“IU”代表。
在一實施例中，EPO治療之有效劑量介於18-150IU/kg病患體重/日。在另一實施例中，有效之EPO治療介於10-150IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療介於10-20IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療介於20-40IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療介於40-60IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療介於60-80IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療介於80-100IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療介於100-120IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療介於120-150IU/kg病患體重/日。
在另一實施例中，有效之EPO治療劑量介於18-25IU/kg體重/日(低劑量)。在又一實施例中，有效之EPO治療劑量介於18-30IU/kg體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療劑量介於35-45IU/kg體重/日。在又一實施例中，有效之EPO治療劑量介於30-50IU/kg體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療劑量介於55-65IU/kg體重/日。在又一實施例中，有效之EPO治療劑量介於50-65IU/kg體重/日。
在一實施例中，有效之EPO治療藥劑介於20IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療藥劑介 於40IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療藥劑介60IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療藥劑介於80IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療藥劑介於100IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療藥劑介於120IU/kg病患體重/日。在一實施例中，有效之EPO治療藥劑介於150IU/kg病患體重/日。在一實施例中，藥劑不超過約65IU/kg體重/日。
在另一實施例中，有效劑量可依據每一個體調整，考量到病患之體重、歷史Hb量與先前以ESA注射投藥之平均EPO劑量。先前投藥之平均EPO劑量可自植入方法前一個月之期間計算。此外，先前投藥之平均EPO劑量可計算自大於或小於至少一個月之期間。劑量可依據投藥之EPO劑量，在植入之前至少一個月，其中投藥之劑量依據每日基礎標準化。在某些情況下，該劑量係依據在植入之前至少二個月期間之EPO投藥平均量。在某些情況下，該劑量係依據在植入之前至少三個月期間之EPO投藥平均量。在其他情況下，該劑量係依據在植入之前至少六個月期間之EPO投藥平均量。例如，若個體先前接受每週三次注射，總劑量150U/kg/週，調整劑量可包括植入至少一GMMO所產生之約20U/Kg/日。
在一實施例中，該劑量符合個體先前接受之量，標準化至每日基礎。在另一實施例中，劑量降低至多至個體先前接受量之25%，標準化至每日基礎。在又一實施例中，劑量增加至多至個體先前接受量之25%，標準化至每 日基礎。在又一實施例中，劑量降低至多至個體先前接受量之50%，標準化至每日基礎。在又一實施例中，劑量增加至多為個體先前接受量之50%，標準化至每日基礎。
在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高至少一個月。在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高至少二個月。在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高至少三個月。在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高至少四個月。在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高至少五個月。在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高至少六個月。在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高超過六個月。在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高超過九個月。在一實施例中，植入至少一EPO GMMO之反應為Hb量持續升高超過一年。
植入至少一EPO GMMO之反應可能不會使Hb持續升高，或提供足夠之升高量使Hb到達目標視窗。在此案例中，可植入額外之EPO GMMOs於個體中。例如，若在植入至少一EPO GMMO後，血液中之Hb量降低約1g/dl或更高每週，或每二週或每個月，與在植入前至少一個月期間之基礎Hb平均值相較，便可植入額外的EPO GMMOs。此外，在植入至少一EPO GMMO之後，血液Hb量降低至約1g/dl或更高每週、每二週或每個月，與植入後之初始增加平 均Hb相較，可植入額外EPO GMMOs。在一實施例中，額外EPO GMMOs之目標為增加至多至25%超過初始EPO劑量。在另一實施例中，額外EPO GMMOs之目標為增加至多至50%超過初始EPO劑量。
以植入長效性EPO配方如表現與分泌EPO之EPO GMMOs之治療，目標在於供應連續製造與遞送EPO至有需要之病患。有需要之病患可包括患有貧血及/或需要增加Hb者。已報導貧血或需要增加Hb之個體，可由更具生理性之EPO治療中獲益，與非生理性丸藥注射相較[Fishbane,S.,Hemoglobin cycling in hemodialysis patients treated with recombinant human erythropoietin.Kidney International,vol.68,2005,pp.1337-1343；Fishbane,S.,Recombinant Human EPO：Has Treatment Reached its Full Potential,Seminars in Dialysis,Vol 19,No 1,2006,pp.1-4]。植入會表現與分泌EPO回病患體內之EPO GMMOs，其中自體組織維持局部化並持續供應治療，可提供助益，與丸藥注射治療相較，其需要病患順從度，且每一次血清EPO注射會產生非生理性、規律或不規律波峰與波谷。此外，植入GMMO可提供治療多肽之持續遞送，優點為劑量可向下調節，或以剝除或移除GMMO而中止治療。此與仰賴注射病毒載體或包含病毒載體之細胞之基因療法相較，植入GMMO位置為已知，因此GMMO可準確失活或移除。
此方法之一優點為若EPO之遞送劑量過高，或若該治療因任何理由需要終止，該一或多個植入之GMMOs 可切除(或甚至潛在地原位剝除)，以停止EPO治療之製造與遞送。在一實施例中，若血液Hb量大於11.5g/dl超過二週，則至少一EPO GMMO便可移除或失活，以降低EPO劑量約25%。在另一實施例中，若血液Hb量大於12.0g/dl超過二週，則至少一EPO GMMO便可移除或失活，以降低EPO劑量約25%。
在一實施例中，本發明之配方與方法可與其他可有效治療貧血之治療共同投藥。在一實施例中，其他治療包括鐵劑補充、維生素B12補充、額外EPO來源、雄激素、生長因子如G-CSF，或其組合。在另一實施例中，本發明之配方與方法可與其他可有效治療如血液與骨髓幹細胞移植共同投予。
在一實施例中，本發明提供上述之治療GMMO，其中治療多肽為干擾素(IFN)，其在某些實施例中，為IFN α、IFN α 2b、IFN β、IFN λ或IFN γ，來自人類或其他哺乳動物。在某些實施例中，IFN多肽為全長IFN之功能性片段，其維持全長IFN之至少一生理功能，及/或全長IFN之至少一體內治療助益效果。在一實施例中，本發明之至少一GMMO包含一載體，如HDAd或AAV載體，其包含編碼IFN之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，其中該核酸更包含至少一或多額外調節序列，且其中該至少一經基因修飾之微器官表現該治療多肽一段持續期間，至少三個月。
在一實施例中，本發明方法提供人類個體增加之 血清IFN量一段持續期間，包含下列步驟：提供至少一GMMO，其提供人類IFN之持續遞送，該微器官包含一載體如HDAd或AAV載體，其包含編碼IFN之核酸序列，其操作性連結至一上游MAR調節序列，且其中該核酸更包含至少一或多額外調節序列；體外測定該至少一經基因修飾之微器官之IFN；植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及測量該個體血清中之干擾素含量，其中該至少一GMMO之植入可體內增加IFN之血清含量超越基礎量至少三個月。
IFNs為多功能細胞激素，可謂細胞產生多效性作用，如抗病毒、抗增生與抗發炎作用。由於這些對於IFNs之細胞反應，IFN-α與IFN-β已於臨床上用於治療病毒、增生性與發炎性疾病，如多發性硬化症、B型肝炎、C型肝炎與數種形式之癌症。IFN療法亦具有治療其他發炎性疾病、病毒疾病與增生性疾病之潛在用途。因此，需要IFNs之個體可具有上述疾病或症狀之一種或組合。
目前有四種主要IFNs類型：alpha(α)、beta(β)、lambda(λ)與gamma(γ)。
在一實施例中，該治療多肽為IFN α，在另一實施例中，為IFN β，在另一實施例中，為IFN γ，以及在另一實施例中，為IFN λ。在另一實施例中，該治療多肽為IFN α之亞型，包括但不侷限於：1、2a、2b、4、5、6、7、8、10、13、14、16、17，或21。在另一實施例中，該治療多肽為IFN omega、epsilon、kappa或其類似物。在另一實施 例中，該治療多肽為IFN λ或其類似物。在另一實施例中，該治療多肽為IFN λ之任一亞型，包括但不局限於：介白素(IL)28A、IL28B或IL29。在另一實施例中，該治療多肽為IFN zeta、nu、tau、delta，或其類似物。在另一實施例中，該治療多肽為技術上已知之任一IFN。
在一實施例中，本發明方法與GMMO之IFN為IFN α。在另一實施例中，本發明方法與GMMO之IFN為IFN α2b。在一實施例中，IFN-α-2b為重組性、非醣化165-胺基酸αIFN蛋白質，包含來自人類白血球之IFN-α-2b之基因。IFN-α-2b為第1型、水溶性IFN，具分子量19,271道耳吞(19.271kDa)。在一實施例中，IFN-α-2b具比活性約2.6 x 108(260million)國際單位/mg，以HPLC測量。
在一實施例中，HDAd載體包含SEQ ID NO：22。在另一實施例中，HDAd載體包含SEQ ID NO：24。在一實施例中，HDAd載體包含同源於SEQ ID NO：22之核酸序列。在另一實施例中，HDAd載體包含同源於SEQ ID NO：24之核酸序列。在一實施例中，HDAd載體包含同源於SEQ ID NO：28之核酸序列。在另一實施例中，HDAd載體包含同源於SEQ ID NO：28之核酸序列。
在一實施例中，本發明之治療IFN-α GMMO可用於預防或治療毛細胞白血病、性病濕疣、卡波濟氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、慢性非-A型、非B型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎，或其組合。在另一實施例中，本發明之治療IFN-α GMMO可投至易患上述疾病或症狀之一者， 或已或將暴露於此述之感染試劑之個體。在另一實施例中，本發明之治療IFN-α GMMO可用於預防或治療C型肝炎。依據此觀點，在一實施例中，本發明配方可與其他C型肝炎治療同時或交替投藥，特別包括利巴韋林(ribavirin)、替拉瑞佛(teleprevir)、波普瑞佛(boceprevir)或聚乙二醇化IFNs，或其組合。在另一實施例中，本發明之治療IFN-α GMMO可用於預防或治療D型肝炎。
在一實施例中，本發明使用IFN-α GMMO可減輕肝炎症狀。在一實施例中，使用GMMO可減輕C型肝炎症狀及/或治療。在另一實施例中，使用GMMO可減輕B型肝炎症狀及/或治療。在又一實施例中，使用GMMO可減輕D型肝炎症狀及/或治療。在一實施例中，該疾病或症狀為C型肝炎，基因型1。在另一實施例中，該疾病或症狀為C型肝炎，基因型2。在又一實施例中，該疾病或症狀為C型肝炎，基因型3。在又一實施例中，該疾病或症狀為C型肝炎，基因型4、5、6、7、8、9、10或11。在又一實施例中，該個體患有C型肝炎，基因型組合。
在某些實施例中，本發明方法可治療個體之肝炎，其中該肝炎為D型肝炎。在一實施例中，該D型肝炎為慢性D型肝炎。在另一實施例中，該肝炎病毒感染係由B型肝炎與D型肝炎感染之組合引起。
使用於此，“B型肝炎”係指肝臟被刺激與腫脹(發炎)，由於B型肝炎病毒(HBV)感染引起。B型肝炎感染可經由與患有B型肝炎之個體之血液、精液、陰道分泌液，以及 其它體液接觸感染而傳播。感染可經由下列傳播：輸血(在美國並不常見)；醫療機構直接接觸血液；與感染者性接觸；使用不潔針頭或器械紋身或針灸；用藥期間共用針頭；與感染者共用個人物品(如牙刷、剃須刀和指甲刀)；以及如果母親受感染，B型肝炎病毒會在分娩時被傳遞給嬰兒。
使用於此，“C型肝炎”係指一種傳染性疾病，影響主要在肝臟，由C型肝炎病毒(HCV)導致。該感染通常是無症狀的，但慢性感染可導致肝臟瘢痕化，最終轉為肝硬化，這是多年後一般常見的。在某些情況下，患有肝硬化者將繼續發展為肝衰竭、肝癌或危及生命的食道與胃靜脈曲張。HCV主要是經由與靜脈藥物使用相關之血液與血液接觸、醫療器械消毒不良，以及輸血傳播。
使用於此，“D型肝炎”係指由D型肝炎病毒(HDV)引起之肝臟發炎。HDV為缺陷性RNA病毒，無法自主複製，但可以組裝為病毒顆粒，僅具有B型肝炎病毒(HBV)脂蛋白封套。因此，HDV的傳播，只可能經由同時感染HBV(合併感染)或經由慢性B型肝炎或B型C型肝炎帶原狀態(超感染)之疊加。而共感染一般會導致自限急性肝炎，超感染會導致嚴重的急性肝炎，受感染者80%-90%會進展為慢性(慢性D型肝炎)。
在另一實施例中，GMMO可單獨或與化療試劑結合使用於或評估各種其它細胞增生疾病，包括慢性髓細胞性白血病、多發性骨髓瘤、淺表性膀胱癌、皮膚癌(包括，除其他外，基底細胞癌與惡性黑素瘤)、腎細胞癌、卵巢癌、 低度淋巴細胞，以及皮膚T細胞淋巴瘤，以及神經膠質瘤。在另一實施例中，長效性IFN-α配方可用於預防或治療由肺癌、大腸直腸癌與乳癌引起之實體瘤，單獨或與其他化療試劑結合。在另一實施例中，提供IFN持續遞送之GMMO可用於治療多發性硬化症。在另一實施例中，長效性IFN-α配方可用於預防或治療組織細胞疾病，其在一實施例中為Erdheim-Chester症(ECD)，其在一實施例中為會破壞人體結締組織之潛在致命疾病，其在一實施例中，由組織細胞製造過剩引起，其在一實施例中，由積聚在疏鬆結締組織引起，導致其變得增厚和緻密。在另一實施例中，提供IFN持續遞送之GMMO可用於預防或治療嚴重眼部白塞氏症(Behcet's disease)。
在一實施例中，該IFN α基因具對應於Genbank Accession Nos：K01900；M11003；或M71246之核酸序列，或編碼對應於Genbank Accession Nos：AAA52716；AAA52724；或AAA52713之蛋白質序列之核酸序列。在一實施例中，該IFN β基因具對應於Genbank Accession Nos：M25460；AL390882；或CH236948之核酸序列，或編碼對應於Genbank Accession Nos：AAC41702；CAH70160；或EAL24265之蛋白質序列之核酸序列。在一實施例中，該IFN γ基因具對應於Genbank Accession Nos：J00219；AF506749；NM_000619；或X62468之核酸序列，或編碼Genbank Accession Nos：AAB59534；AAM28885；NP_000610；或CAA44325之蛋白質序列之核酸序列。在另一實施例中，該 IFN α基因具如SEQ ID NO：19之核酸序列，而在另一實施例中，該IFN α基因具如SEQ ID NO：20之核酸序列，而在另一實施例中，該IFN α基因具如SEQ ID NO：21之核酸序列。在另一實施例中，該IFN α基因具同源於SEQ ID NO：19之核酸，而在另一實施例中，該IFN α基因具同源於SEQ ID NO：20之核酸，而在另一實施例中，該IFN α基因具同源於SEQ ID NO：21之核酸。
EPO表現卡匣
CAG-wt-hEPO與CAG-opt-hEPO：在某些實施例中，任一此述之表現卡匣皆可轉導至微器官中，以產生本發明經基因修飾之微器官。例如，CAG-wtEPO表現卡匣係編碼野生型(wt)紅血球生成素多肽(EPO)(SEQ ID NO：3)，以及CAG-opt-hEPO表現卡匣係編碼最佳化EPO(SEQ ID NO：2)。CAG-wtEPO表現卡匣之核酸序列如SEQ ID NO：17。CAG-opt-hEPO表現卡匣之核酸序列如SEQ ID NO：15。CAG-wtEPO與CAG-opt-hEPO包括一CAG促進子序列(SEQ ID NO：7)；人類EPO無內含子基因，自ATG至終止密碼子(分別為SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2)；以及SV40聚A序列(SEQ ID NO：9)。本發明之GMMOs可包含CAG-wtEPO表現卡匣(SEQ ID NO：17)，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：17之序列。本發明之GMMOs可包含CAG-opt-hEPO表現卡匣(SEQ ID NO：15)，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：15之序列。本發明之GMMOs可更包含一HDAd或AAV載體，其包含SEQ ID NO： 17或SEQ ID NO：15，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：15之序列。在一實施例中，該GMMOs包含一HDAd載體，其包含CAG-wt-hEPO，其中該GMMO包含如SEQ ID NO：14之核酸序列，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：14之序列。在一實施例中，該GMMOs包含一AAV載體，其包含CAG-wt-hEPO。在一實施例中，該GMMOs包含一HDAd載體，其包含CAG-opt-hEPO，其中該GMMO包含如SEQ ID NO：16之核酸序列，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：16之序列。在一實施例中，該GMMOs包含一AAV載體，其包含CAG-opt-hEPO。
MAR-opt-hEPO-WPRE(於此亦稱之為MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE)：在某些實施例中，任一此述之表現卡匣可轉導至微器官中，以產生本發明之經基因修飾之微器官。例如，該MAR-opt-hEPO-WPRE表現卡匣(於此亦稱之為MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE)係編碼一最佳化紅血球生成素多肽(EPO)(SEQ ID NO：2)。MAR-opt-hEPO-WPRE表現卡匣之核酸序列如SEQ ID NO：13。該MAR-opt-hEPO-WPRE包括人類IFNβ S/MAR調節序列(SEQ ID NO：5)；一CAG促進子(SEQ ID NO：7)；最佳化人類EPO無內含子基因，自ATG至終止密碼子(SEQ ID NO：2)WPRE調節序列(SEQ ID NO：8)；以及SV40聚A序列(SEQ ID NO：9)。該最佳化人類EPO基因為人類密碼子使用最佳化。本發明之GMMOs可包含 MAR-opt-hEPO-WPRE表現卡匣(SEQ ID NO：13)，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：13之序列。本發明之GMMOs可更包含一HDAd或AAV載體，其包含如SEQ ID NO：13之核酸序列，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：13之序列。在一實施例中，該GMMOs包含一HDAd載體，其包含MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE，其中該GMMO包含如SEQ ID NO：12之核酸序列，或序列80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：12之序列。在一實施例中，該GMMOs包含一AAV載體，其包含MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE，其中該GMMO包含如SEQ ID NO：26之核酸序列，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：26之序列。
MAR-EF1α-opt-hEPO：本發明GMMO中存在之該MAR-EF1α-opt-hEPO表現卡匣係圖示說明於圖3。該MAR-EF1α-opt-hEPO表現卡匣係編碼一最佳化紅血球生成素多肽(EPO)(SEQ ID NO：2)。MAR-EF1α-opt-hEPO表現卡匣之核酸序列如SEQ ID NO：11。該MAR-EF1α-opt-hEPO包括無CpG人類β-球蛋白MAR調節序列(SEQ ID NO：6)；一EF1α促進子(SEQ ID NO：18)；最佳化人類EPO無內含子基因，自ATG至終止密碼子(SEQ ID NO：2)；SV40聚A序列(SEQ ID NO：9)；以及人類IFNβ S/MAR調節序列(SEQ ID NO：5)。最佳化人類EPO基因為人類密碼子使用最佳化。本發明包含一表現卡匣，其包含SEQ ID NO：11，除了hEPO之非-最佳化版本(SEQ ID NO：1)係用於取代最佳化版本之外。本發明之GMMOs包含MAR-EF1α-opt-hEPO表現卡匣 (SEQ ID NO：11)，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：11之序列。本發明之GMMOs可更包含一HDAd或AAV載體，其包含SEQ ID NO：11，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：11之序列。該HDAd與AAV載體骨架可不包含CpG。在一實施例中，GMMOs包含一HDAd載體，其包含MAR-EF1α-opt-hEPO，其中該GMMO包含如SEQ ID NO：10之核酸序列，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：10之序列。在一實施例中，GMMOs包含一AAV載體，其包含MAR-EF1α-opt-hEPO，其中該GMMO包含如SEQ ID NO：27之核酸序列，或80%、85%、90%或95%等同於SEQ ID NO：27之序列。
在一實施例中，術語“等同於”、“同源性”、“同源物”或“同源於”，在任一情況下，代表該序列，在一實施例中，之至少70%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少72%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少75%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少77%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少80%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少82%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少85%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少87%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少90%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少92%對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少 95%或更多對應於指出之序列。在另一實施例中，該核酸序列之至少95-100%對應於指出之序列。類似地，對應於特定序列包括二者直接對應，以及與於此定義之序列同源。
同源性可以電腦運算法進行序列對齊而決定，該方法為技術上已知。例如，核酸序列同源性之電腦運算法分析包括利用任何數目之可用軟體套件，如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT與TREMBL套件。
決定同源性之額外方法係經由核酸序列之雜合而決定，如技術上所描述(請見如“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1985)；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,(Volumes 1-3)Cold Spring Harbor Press,N.Y.；and Ausubel et al.,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。在一實施例中，雜合方法可於中度至嚴苛條件下進行。雜合條件為如靜置於42℃溶液中整夜，包含：10-20%甲醯胺、5 X SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5 X Denhardt’s溶液、10%葡聚醣硫酸鹽，以及20μg/ml失活、經剪切之鮭魚精子DNA。
在一實施例中，本發明提供一種包含微器官之治療配方，及其用途。在一實施例中，治療微器官之製備包含(a)自捐增者個體取得複數個微器官外植體。該複數個微器官外植體之每一者包含一群細胞，該複數微器官外植體 之每一者維持其所衍生之器官之微結構，同時具有經篩選之立體空間，以允許微器官外植體之適當養分與氣體擴散至細胞中，並將細胞中之廢物擴散出微器官外植體，以維持由於微器官外植體之營養不足與廢物堆積造成之細胞毒性與其伴隨之死亡最小化；以及(b)基因修飾該複數個微器官外植體，以獲得複數個GMMO外植體。
微器官轉變為GMMOs之製備與加工方法揭示於WO2004/099363與WO2011/159758。該微器官包含經定義尺寸之組織，使得養分與氣體可擴散入立體微器官中之每一細胞，而外植體之細胞廢物可足夠擴散出，以確保微器官之體外維持，其在一實施例中，置於基本培養液中，可持續一段延長期間，經由體外轉導控制希望微器官細胞中之候選基因，使用病毒或非病毒載體，因而產生GMMOs。
一般而言，該核酸序列選殖至一特定載體中，取決於將序列導入微器官中之較佳方法，如上所述。一旦希望之核酸片段選殖至特定載體上，其便成為一重組載體。
在一實施例中，微器官培養於32℃，在基因修飾之前與之後，而在另一實施例中，其培養於37℃。在另一實施例中，微器官培養於33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、39℃、40℃、28℃、30℃、31℃，或25℃。
在一實施例中，微器官培養於10% CO2，在基因修飾之前與之後，而在另一實施例中，其培養於5% CO2。在另一實施例中，微器官培養於12% CO2、15% CO2、17% CO2，或20% CO2。在另一實施例中，微器官培養於0% CO2、 2% CO2、6% CO2、7% CO2、8% CO2或9% CO2。
在另一實施例中，培養溫度、CO2濃度或其組合，可在基因修飾之前、期間或之後，維持單一溫度或濃度，而在另一實施例中，培養溫度、CO2濃度或其組合，可在基因修飾之前、期間或之後之不同時間點，進行調整。
在另一實施例中，微器官培養於85-100%濕度下，而在一實施例中為95%濕度下，在另一實施例中，90%濕度下，以及在另一實施例中，98%濕度下。
在一實施例中，治療核酸或多肽之量可使用技術上任何已知之方法偵測。特定表現載體系統效率與將核酸引入細胞之方法，可以技術上之常規標準方法評估。例如引入細胞之DNA可經由濾膜雜合技術偵測(如南方墨漬法)，以及偵測所引入DNA轉錄製造之RNA，例如，藉由北方墨漬法、RNase酶保護法或逆轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)。其基因產物可藉由適當之試驗偵測，如藉由免疫偵測所製造之蛋白質，如以特定抗體，或藉由功能試驗偵測基因產物之功能活性，如酵素試驗。在一實施例中，ELISA、西方墨漬法或放射線免疫試驗可用於偵測蛋白質。
因此，在一實施例中，治療多肽或核酸表現量可於體外測量，而在另一實施例中，治療多肽或核酸表現量係於體內測量。在一實施例中，多肽或核酸表現量係於體外測量，其在一實施例中，為EPO量，而在另一實施例中，為IFN-α量，可經由體外測定每一微器官之治療試劑分泌量， 偵測植入病患之微器官數量；瞭解病患需要之治療試劑之目標劑量，並計算在植入該病患後，提供該目標劑量之GMMO數目。
在本發明之另一較佳實施例中，聚核苷酸亦可包括反式-或順式-肌動蛋白增強或抑制因子，其轉錄或轉譯調控微器官細胞內之內生性基因，或引入微器官之額外重組基因之表現。有多種範例為適用之轉譯或轉錄調節因子，其可於哺乳動物中利用，如技術上已知者。
例如，轉錄調節因子包含順式或反式-肌動蛋白因子，其為由特定促進子轉錄活化所必須[(Carey et al.,(1989),J.Mol.Biol.209：423-432；Cress et al.,(1991),Science 251：87-90；and Sadowski et al.,(1988),Nature 335：5631-564)]。
轉譯活化子之範例為花椰菜花葉病毒轉譯活化劑(TAV)[請見如Futterer and Hohn,(1991),EMBO J.10：3887-3896]。在此系統中，係製造出雙向mRNA。亦即，二編碼區域係轉錄為相同mRNA。若無TAV，則僅有第一作用子(cistron)被核醣體轉譯出，然而，於表現有TAV之細胞中，二作用子皆被轉譯出。
順式-肌動蛋白調節因子之聚核苷酸序列可經由一般之基因敲入技術，引入微器官之細胞中。基因敲入/敲除方法學之總覽請見，如美國專利號5,487,992、5,464,764、5,387,742、5,360,735、5,347,075、5,298,422、5,288,846、5,221,778、5,175,385、5,175,384、5,175,383、4,736,866， 以及Burke and Olson,Methods in Enzymology,194：251-270,1991；Capecchi,Science 244：1288-1292,1989；Davies et al.,Nucleic Acids Research,20(11)2693-2698,1992；Dickinson et al.,Human Molecular Genetics,2(8)：1299-1302,1993；Duff and Lincoln,“Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells”,Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders,1995；Huxley et al.,Genomics,9：742-750 1991；Jakobovits et al.,Nature,362：255-261 1993；Lamb et al.,Nature Genetics,5：22-29,1993；Pearson and Choi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90：10578-82；Rothstein,Methods in Enzymology,194：281-301,1991；Schedl et al.,Nature,362：258-261,1993；Strauss et al.,Science,259：1904-1907,1993，WO 94/23049、WO 93/14200、WO 94/06908與WO 94/28123亦提供此資訊。
亦希望進行內生性序列之降低調節，以評估重組產物之獨佔性製造。為此，反義RNA可以使用作為內生性序列失活之方法。互補於內生性mRNA序列之外源性聚核苷酸編碼序列，係於微器官細胞中轉錄出。降低調節亦可經由此領域中已知之技術進行基因敲除(“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook et al.,(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)；Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley & Sons,New York(1988)。
亦希望重組產物有過度表現。過度表現可以各載體中提供高複本數之一或多個編碼序列於而達成。這些外生性聚核苷酸序列可位於哺乳動物表現載體之適當促進子轉錄控制下，以調節其表現。在另一實施例中，相同基因之複數個複本或數個相關基因，可使用作為增進多肽或核酸表現之方法。在一實施例中，以DNA因子進行表現穩定化，其在一實施例中為骨架/基質相關區域(S/MARs)或骨架相關區域(SARs)。
在一實施例中，減少體內GMMO加工時間可明顯增進AAV與HDAd轉導GMMOs之體內表現度。因此，在本發明之一觀點中，係提供加工GMMOs之方法，其中該標準實施之體外加工時間降低。該GMMOs之標準體外加工時間為9、10、11、12、13、14或15日。因此，在本發明之一實施例中，該GMMO於體外加工小於9日。在另一實施例中，該GMMO於體外加工小於8、7、6、5、4、3、2或1日。在某些實施例中，該GMMO於體外加工8、7、6、5、4、3、2或1日，或時間範圍介於上述日數之任二者間。術語“體外加工時間”係指包括自病患移除MO後，至再植入至該個體之期間。
在一實施例中，微器官於體外維持一段時間，該範圍為數小時至數個月。在一實施例中，於體外維持係指 微器官使用病毒載體進行體外基因操作，即維持GMMO。在另一實施例中，體外維持係指在基因操作之前維持微器官。
在一實施例中，GMMOs係於植入前維持數日，以及在另一實施例中，在植入前維持數週。在一實施例中，微器官在植入前維持3-7日。在一實施例中，微器官在植入前維持2日。在一實施例中，微器官在植入前維持3日。在另一實施例中，微器官在植入前維持4日。在另一實施例中，微器官在植入前維持5日。在又一實施例中，微器官在植入前維持6日。在又一實施例中，微器官在植入前維持7日。在又一實施例中，微器官在植入前維持8日。在又一實施例中，微器官在植入前維持1-9日。在一實施例中，微器官微器官在植入前維持9-14日。在一實施例中，微器官在植入前維持2至4週。在一實施例中，微器官在植入前維持3週。在一實施例中，微器官在植入前維持4週或更久。在又一實施例中，微器官在植入前維持至少9日。在一實施例中，微器官在植入前維持至少3日。在另一實施例中，微器官在植入前維持至少5日。在又一實施例中，微器官在植入前維持至少7日。
不受理論限制，在一實施例中，該培養允許細胞加工並裂解病毒蛋白質，其在一實施例中為病毒外殼，為病毒載體轉導之結果。在一實施例中，此病毒外殼蛋白質之轉換發生於2-3日內，在一實施例中，僅有極少量病毒外殼蛋白質可體外維持至第10日。在一實施例中，病毒外殼 之裂解更進一步降低本發明配方之致免疫性，並可增加有興趣基因之體內表現量與表現期間。在另一實施例中，該培養允許早期載體-誘發先天免疫反應於體外發生，其在一實施例中，不會持續超過24小時，在無載體基因轉錄情況下。在另一實施例中，一般在轉錄勝任第一代載體投藥後產生之晚期適應反應，其主要特徵，在一實施例中，為淋巴細胞浸潤，而在另一實施例中，載體-特異性CTL誘發並未由載體引起。
在一實施例中，該體外微器官暴露於載體中，劑量為1x107-1x1012感染顆粒(ip)/GMMO，在另一實施例中，劑量為-1x108-1x1011ip/GMMO，而在另一實施例中，劑量為1x109-5x1010ip/GMMO，在又一實施例中，劑量為1x1010-5x1010ip/GMMO。在一實施例中，使用劑量1.5x1010ip/GMMO。在一實施例中，該體外微器官之暴露劑量不小於1.5x106病毒顆粒/GMMO，且不大於1x1012病毒顆粒/GMMO。
在一實施例中，生長因子係用於增加微器官中之細胞數目。
在一實施例中，體外表現可在植入前評估，而可進行表現之重組蛋白質之體外至體內相關性研究。
在本發明之某些實施例中，待植入之經基因修飾細胞之組織樣本量，可由下列一或多者決定：依據調控指南常規投至此個體之有興趣治療試劑之對應劑量、特定臨床流程或類似個體之族群統計學、對應於如有興趣蛋白質 之治療試劑對應量、對應於在該案例中之相同個體，他/她已由注射或其他路徑先接受藥物、個體資料如體重、年紀、生理條件、臨床狀態、由先前組織樣本所得之藥物動力數據，該樣本包括經基因修飾之細胞投藥至其他類似個體，對應於先前之組織樣本，其包括經基因修飾之細胞投藥至該個體，或其組合。因此，在一實施例中，測定一或多個微器官之基因產物之體外表現，並測定或預估體外與體內治療多肽或核酸表現量之關係，以及依據該計算出或預估之關係，而決定待植入至特定病患之微器官數目。治療試劑之劑量可如先前所述調整(WO2004/099363)。
在一實施例中，微器官或GMMO可於體外維持一段預定期間，直至需要植入宿主中。在一實施例中，微器官或GMMO可維持或儲存於培養液中1-3日、2-4日、2-5日、3-6日、1-7日、1-8週之間，或1-4個月。在一實施例中，微器官或GMMO可維持或儲存於培養液中至少3日。在另一實施例中，至少4日，此外，至少5日，在又一實施例中，至少6日，在又一實施例中，至少7日，在又一實施例中，至少8日，在又一實施例中，至少9日。在另一實施例中，維持於組織樣本之上清液中之治療試劑，可單離出或施加至相同或不同個體中。
此外或額外地，GMMO可以技術上已知之方法冷凍保存，如但不受限於，逐步冷凍(0℃、-20℃、-80℃、-196℃)於含有10% DMSO之DMEM中，在由組織樣本形成後立即冷凍，或在基因改造之後冷凍。
本發明之GMMO投藥可藉由植入有需要之個體而達成。依據此觀點，在一實施例中，本發明配方可經由皮下植入。在另一實施例中，配方可經由皮內植入。在又一實施例中，配方可經由真皮植入。
在一實施例中，本發明之GMMO可於暫時症狀之急性治療時單次植入，或可植入大於一次，尤其是在漸進性、反覆發作或退行性疾病案例中。在一實施例中，本發明之一或多個GMMO可同時投藥，或在另一實施例中，其可以交錯方式投藥。在一實施例中，該交錯方式可由疾病階段或期數而決定。在某些實施例中，本發明方法更包含於稍後日期植入表現與分泌治療多肽之至少一額外GMMO至個體之步驟，該微器官包含一載體，其包含一核酸序列，其編碼治療多肽，操作性連結至一上游MAR調節序列，其中該核酸更包含至少一額外調節序列。在一實施例中，該治療多肽為人類紅血球生成素。在另一實施例中，該治療多肽為人類干擾素。
在一實施例中，該微器官於個體中希望之位置植入，使得微器官之至少一部份維持存活。在本發明之一實施例中，至少約5%，在另一實施例中，至少約10%，在本發明之另一實施例中，至少約20%，在本發明之另一實施例中，至少約30%，在本發明之另一實施例中，至少約40%，以及在本發明之另一實施例中，至少約50%或更多之細胞維持存活，在投藥至個體後。在又一實施例中，至少約60%之微器官細胞維持存活，而在另一實施例中，至少約70%， 以及在又一實施例中，至少約80%，而在又一實施例中，至少約90%或更多細胞維持存活，在投藥至個體後。投藥至個體後，細胞之存活期間可短至數小時，如24小時，至數日，長至數週至數月或數年。
微器官植入接受者個體中，可提供重組產物如治療多肽之持續劑量。該微器官可在植入前製備，以有效加入宿主中，加速植入組織之血管生成。因此，重組產物可於製造後立即遞送至周邊接受循環系統中。此外，微器官可在植入前製備，以預防細胞附著並有效加入至宿主中。
在一實施例中，GMMO被包覆。在另一實施例中，GMMO未被包覆。
本發明GMMOs之植入可經由標準手術技術植入，或經由注射微器官製劑至哺乳動物預定組織區域，利用特別適合之注射器，其計量針頭適用於微器官投藥。在另一實施例中，可使用導管植入微器官。在一實施例中，任一植入方法係描述於WO2004/099363或WO2013/118109，可使用於本發明中。
在一實施例中，微器官可皮下、皮內、真皮、肌肉內、腹腔內或胃內植入。在一實施例中，術語植入排除以薄層皮瓣(split-thickness)或全層皮瓣(full-thickness skin)嫁接物嫁接。在本發明之一實施例中，用於植入之捐贈者微器官較佳製備自接受哺乳動物之器官組織(即自體)，或同系哺乳動物，儘管同種異體或異種組織亦可用於製備微器官，而在植入前或後提供測量，以預防嫁接排斥。在另一 實施例中，微器官並未置入或由生物可相容並經免疫保護之材料包覆，如可再補充、非生物可分解性或生物可分解性裝置。
在一實施例中，病毒自體外細胞轉換或消除，係經由技術上已知之方法增強，如物理方法，其在一實施例中為加熱、使用抗病毒試劑、會刺激細胞轉換病毒之試劑等。
在一實施例中，當本發明GMMO增加多肽表現量與期間，多肽表現量並未維持無限升高。
相對於其他涉及短暫細胞轉導或細胞轉換過於快速之方法，本發明之長效性治療配方包含不會快速複製之細胞。因此，該GMMO由穩定構築物製造穩定之蛋白質，並預期持續製造已經鑑定之蛋白質。
請參照圖12，其圖示說明評估投藥治療GMMOs之安全性與有效性之步驟流程，其中圖a為hEPO GMMO，經HDAd MAR-EF1α-opt-hEPO轉導，以治療血液透析病患之貧血，依據本發明之某些示範性實施例。僅管以下討論依據EPO GMMO，該方法與步驟係描述於圖12，可施行於本發明之治療GMMO。此外，圖14顯示圖12步驟之總覽，用於治療具有EPO GMMO之人類個體，以及包括每一步驟期間之關係。在一實施例中，該步驟描述於圖12，為臨床試驗之實施例。在一實施例中，該個體患有末期腎臟疾病(ESRD)。在另一實施例中，個體患有繼發於ESRD之貧血。在一實施例中，個體接受血液透析。在一實施例中，個體 接受血液透析每週至少二次。在一實施例中，個體接受血液透析每週至少三次。在某些實施例中，個體包括有需要增加、維持或增加與維持Hb量之人類。在又一實施例中，圖12之步驟可加入、移除及/或修改。
就本發明之某些實施例而言，轉導DMO以創造EPO GMMO之方法描述於下列範例中。在本發明之一實施例中，DMOs可經hEPO轉導產生本發明載體。在一實施例中，該載體包含HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO(圖3；SEQ ID NO：10)。在又一實施例中，該載體包含HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE(圖4；SEQ ID NO：12)。在又一實施例中，該載體包含表現與分泌人類EPO之HDAd病毒載體或任一AAV病毒載體，以及一MAR因子。在其他實施例中，任一編碼治療多肽之核酸，可經wt-hEPO或opt-hEPO表現卡匣取代，如圖1-4所示。例如，MAR-EF1alpha-optIFNalpha表現卡匣(SEQ ID NO：23)可包含最佳化IFNα核酸，取代卡匣中之opt-EPO，如圖3所示。此外，MAR-CAG-optIFNα-WPRE表現卡匣(SEQ ID NO：25)可包含最佳化IFNα核酸，取代卡匣中之optEPO，如圖4所示。
在一實施例中，在EPO GMMO植入之後，甲基腎上腺皮質酮係皮下投予至每一GMMO植入處附近。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮皮下投予至每一GMMO植入處附近，與GMMO植入同時。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮並未投藥作為EPO GMMO治療之一部分。
在一實施例中，抗發炎劑、抗增生劑或抗氧化劑， 或其任一組合，係作為EPO GMMO治療之一部分投藥。在一實施例中，用於本發明方法之抗發炎劑、抗增生劑或抗氧化劑可包括維生素C、N-乙酰半胱氨酸、半胱天蛋白酶-1抑製劑(Z-WEHD-FMK)、胞嘧啶、吡非尼酮(Pirfendone)、TEMPOL、組織蛋白酶B抑製劑(CA-074-OME)、地美可欣(Demecolcine)、ZVAD(泛半胱天蛋白酶抑製劑)、米諾環素鹽酸鹽(Minocycline hydrochloride，半胱天冬1和3抑製劑)、安挺樂(Actemra)(IL-6抑製劑)、阿司匹林(COX抑製劑)、MIF拮抗劑(巨噬細胞遷移抑制因子)、英夫利昔單抗(Infliximab，抗腫瘤壞死因子)、絲裂黴素C、白藜蘆醇、玻尿酸、曲安奈德縮丙酮(triamcinolone acetonide)、曲安奈德六縮丙酮(triamcinolone hexacetonide)，以及甲基腎上腺皮質酮。在一實施例中，用於本發明方法之抗發炎劑、抗增生劑或抗氧化劑係皮下投藥至每一EPO GMMO處附近。在一實施例中，抗發炎劑、抗增生劑或抗氧化劑係每周投藥一次。在另一實施例中，抗發炎劑、抗增生劑或抗氧化劑係雙周投藥一次。在另一實施例中，抗發炎劑、抗增生劑或抗氧化劑係半周投藥一次。
在其他實施例中，甲基腎上腺皮質酮係皮下投藥至每一GMMO處附近，在植入表現與分泌治療多肽之GMMO之後。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係在GMMO植入之後，每周投藥一次。在另一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係在GMMO植入之後，每二周投藥一次(每兩週)。在又一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係在GMMO植入之後， 每半周投藥一次(每週二次)。在一實施例中，甲基腎上腺皮質酮係於GMMO植入同時單次投藥。
在一實施例中，抗發炎劑、抗增生劑或抗氧化劑如甲基腎上腺皮質酮藥劑，係於GMMO植入處多次注射遞送。在一實施例中，藥劑係於至少一次注射中遞送。在另一實施例中，藥劑係於至少二次注射中遞送。在又一實施例中，藥劑係於至少三次注射中遞送。在又一實施例中，藥劑係於至少四次注射中遞送。在一實施例中，每GMMO之甲基腎上腺皮質酮總劑量為12mg。在另一實施例中，每GMMO之甲基腎上腺皮質酮總劑量為1-120mg。例如，12mg劑量係於3次注射中遞送，每次注射4mg甲基腎上腺皮質酮。在一實施例中，每GMMO植入處之甲基腎上腺皮質酮總劑量不超過120mg。在另一實施例中，每GMMO植入處之甲基腎上腺皮質酮總劑量大於120mg。
抗發炎劑、抗增生劑或抗氧化劑之注射處，如甲基腎上腺皮質酮注射處，應盡量接近GMMO。在一實施例中，該注射處距離GMMO不超過1mm。在另一實施例中，該注射處距離GMMO不超過2mm。在又一實施例中，該注射處距離GMMO不超過3mm。在又一實施例中，該注射處距離GMMO不超過4mm。在又一實施例中，該注射處距離GMMO不超過5mm。在又一實施例中，該注射處距離GMMO不超過6mm。在又一實施例中，該注射處距離GMMO不超過7mm。在又一實施例中，該注射處距離GMMO不超過8mm。在又一實施例中，該注射處距離 GMMO不超過9mm。在另一實施例中，該注射處距離GMMO不超過10mm。圖13顯示本發明之一實施例，每植入GMMO具三次注射甲基腎上腺皮質酮，每次注射處距離植入GMMO中心線不超過5mm。
在GMMO植入與抗發炎試劑如甲基腎上腺皮質酮投藥之後，局部類固醇如皮質類固醇，如戊酸倍他米松(betamethasone valerate)，可於植入處施加。在一實施例中，局部類固醇之施加可為每周一次，在另一實施例中為雙周一次，在另一實施例中為每日一次。在一實施例中，局部類固醇係自植入GMMO後一周投藥。在另一實施例中，局部類固醇係依據目前醫藥實施知識投藥。在一實施例中，局部類固醇之施加期間至少二週，在又一實施例中，至少三週，在又一實施例中，至少四週，在又一實施例中，至少五週，在又一實施例中，至少六週，在又一實施例中，至少七週，在又一實施例中，至少八週。
在某些實施例中，補充用rHuEPO注射(促紅血球生成素-alfa-Epogen)可於個體進行研究之任何時刻提供，當Hb值落於下列目標範圍內時。若於3週連續評估後(約2週期間)，Hb量掉至低於9g/dL，或於任一單次測量，掉至低於8g/dL，便可投予補充rHuEPO，使用標準運算法，以Hb量以及Hb量上升或下降之速率為基礎。當連續2週評估時，Hb量回到目標範圍，便停止rHuEPO注射或降低劑量。
在評估與追蹤期間，區塊1206-1212之步驟，以及在EPO GMMO植入之後，以Hb反應為基準，需要藉由剝 除或使一或多個額外EPO GMMOs失活而修飾劑量。例如，若平均Hb位準係位於目標範圍9-11g/dL連續二週，變化至小於1.0g/dL，自準備期之平均Hb位準起算，不需改變EPO GMMOs劑量。此外，若平均Hb位準>11.5或增加至1.0g/dL連續二週，自準備期(1202)之平均Hb位準起算，EPO GMMOs劑量可藉由剝除或使一或多個植入之EPO GMMOs失活而降低。降低劑量之目標為劑量降低至多至25%小於原始劑量，並以在植入前，EPO GMMO製造之EPO之體外評估為基準。
EPO GMMO個體之劑量降低可額外地於設定之連續3周之任一時間點發生，每周測量Hb高於12.0g/dL(約2週期間Hb>12.0g/dL)。在這些個體中，有效投藥劑量可藉由切除一或多個EPO GMMOs而減少，以降低總投藥劑量約25-50%，以EPO產生之體外評估為基準。
更進一步移除或剝除或使EPO GMMOs失活之劑量降低，每一次至多50%，可隨後於個體中實施，其持續具有連續Hb>12.0g/dL至少2週，介於EPO GMMOs移除或剝除或失活之間。若單次評估時Hb13.0g/dL，進一步評估可於下次透析期間評估；若Hb維持13.0g/dL，可移除或剝除或失活EPO GMMOs，以達到劑量降低(以體外評估)至多至50%。
其他EPO GMMOs之劑量增加，可藉由使用冷凍保存之MOs而達成，其可依據本發明方法解凍、經基因修飾與植入。
範例 材料與裝置列表
製造培養液係用於培養皮膚微器官，並包含DMEM-12(HyClone貨號SH30023.02)，補充有2.5μg/ml兩性黴素(Amphotericin)B(Gilead Sciences Inc.,AmBisome®)，以及50μg/ml健他黴素(Gentamycin)硫酸鹽(Teva Pharmaceutical Industries,IKA-injection)。
收獲皮膚微器官
人類皮膚微器官(“DMO”)係收獲自捐贈者下腹部皮膚區域(腹部整型之皮膚)。收獲DMO之細節請見US-2013-0090669-A1與WO 2013/118109，在此併入本案以作為參考資料。
病毒載體
用於轉導DMO之輔助病毒依賴性非複製腺病毒hEPO載體包括：HDAd-CAG-wt-hEPO(圖1；SEQ ID NO：14)；HDAd-CAG-opt-hEPO(圖2；SEQ ID NO：16)；HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO(圖3；SEQ ID NO：10)。HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO之載體骨架為無CpG；以及HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE(圖4；SEQ ID NO：12)。
用於轉導DMO之AAV hEPO載體包括AAV-LK19-CAG-opt-hEPO-WPRE(SEQ ID NO：26)；以及AAV-LK19-MAR-EF1alpha-opt-hEPO(SEQ ID NO：27)。額外載體係描述於圖示與範例中。
hEPO濃度之分析
ELISA套組系統得自R&D Systems Inc.,Quantikine® IVD人類紅血球生成素ELISA，貨號DEP00-10，係用於測定紅血球生成素(hEPO)濃度，在由GMMOs體外表現(培養液)與體內表現(血清)hEPO之後。
人類EPO表現卡匣
CAG-wtEPO：CAG-wtEPO表現卡匣存在於HDAd或AAV載體中，係圖示說明於圖1中。CAG-wtEPO表現卡匣編碼野生型(wt)紅血球生成素多肽(EPO)(SEQ ID NO：3)。CAG-wtEPO表現卡匣之核酸序列係示於SEQ ID NO：17。CAG-wtEPO包括CAG促進子序列(SEQ ID NO：7)；人類EPO無內含子基因，自ATG至終止密碼子(SEQ ID NO：1)；以及SV40聚A序列(SEQ ID NO：9)。
CAG-opt-EPO：CAG-optEPO表現卡匣存在於HDAd或AAV載體係圖示說明於圖2中。CAG-opt-EPO表現卡匣編碼最佳化紅血球生成素多肽(EPO)(SEQ ID NO：2)。CAG-opt-EPO表現卡匣之核酸序列係示於SEQ ID NO：15。CAG-opt-EPO包括一CAG促進子序列(SEQ ID NO：7)；最佳化人類EPO無內含子基因，自ATG至終止密碼子(SEQ ID NO：2)；以及SV40聚A序列(SEQ ID NO：9)。該最佳化人類EPO基因為人類密碼子使用最佳化。
MAR-opt-hEPO-WPRE(於此亦稱之為MAR-CAG-opt-hEPO)：AR-opt-hEPO-WPRE表現卡匣存在於HDAd載體中，係圖示說明於圖4中。MAR-opt-hEPO-WPRE表現卡匣係編碼最佳化紅血球生成 素多肽(EPO)(SEQ ID NO：2)。MAR-opt-hEPO-WPRE表現卡匣之核酸序列係示於SEQ ID NO：13。MAR-opt-hEPO-WPRE包括人類IFNβ S/MAR調節序列(SEQ ID NO：5)；一CAG促進子(SEQ ID NO：7)；最佳化人類EPO無內含子基因，自ATG至終止密碼子(SEQ ID NO：2)；WPRE調節序列(SEQ ID NO：8)；以及SV40聚A序列(SEQ ID NO：9)。該最佳化人類EPO基因為人類密碼子使用最佳化。
MAR-EF1α-opt-hEPO：MAR-EF1α-opt-hEPO表現卡匣存在於HDAd或AAV載體中，係圖示說明於圖3中。該HDAd或AAV載體骨架可為無CpG。MAR-EF1α-opt-hEPO表現卡匣編碼最佳化紅血球生成素多肽(EPO)(SEQ ID NO：2)。MAR-EF1α-opt-hEPO表現卡匣之核酸序列係示於SEQ ID NO：11。MAR-EF1α-opt-hEPO包括一無CpG之人類β-球蛋白MAR調節序列(SEQ ID NO：6)；一EF1α促進子(SEQ ID NO：18)；最佳化人類EPO無內含子基因，自ATG至終止密碼子(SEQ ID NO：2)；SV40聚A序列(SEQ ID NO：9)；以及人類IFNβ S/MAR調節序列(SEQ ID NO：5)。該最佳化人類EPO基因為人類密碼子使用最佳化。
表現紅血球生成素之經基因修飾皮膚微器官(EPO GMMO)之製備
hEPO GMMOs之製備係依據內部(in-house)標準操作流程(SOPs)。簡言之，DMOs係收獲自人類個體，如US-2013-0090669-A1描述，在此併入本案以作為參考資料。 DMOs以生理食鹽水清洗一次，之後以不含血清之製造培養液清洗三次。此外，在某些案例中，血清包括於培養液中。
用於製造hEPO GMMOs之經潤洗DMOs係分為不同組(8-10 DMOs/組)，依據用於轉導之病毒載體分組：‧組別1：HDAd-CAG-wtEPO；‧組別2：HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE；‧組別3：HDAd-MAR-EF1a-opt-hEPO；‧組別4：HDAd-CAG-opt-hEPO；‧組別5：AAV-LK19-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE；以及‧組別6：AAV-LK19-MAR-EF1a-opt-hEPO。
每一組別之DMOs係培養於1ml製造培養液中，於5% CO2，32℃培養箱中24小時。培養後，每一組之DMOs係經250μl製造培養液轉導，其含有1.5x1010輔助病毒依賴性之非複製性腺病毒(HDAd)hEPO病毒顆粒於各治療組別中。HDAd載體缺乏所有病毒蛋白質編碼序列，僅含有載體DNA複製與包裝需要之順式-肌動蛋白因子。混合物置於軌道搖晃器上4小時(300rpm)，之後不搖晃20小時，於5% CO2，32℃培養箱中。就終止轉導步驟而言，將含有病毒載體之溶液移除並丟棄，培養液連續三次以3ml新鮮製造培養液交換，以移除殘餘、未吸附之病毒顆粒。在清洗之後，hEPO GMMOs係培養於24孔盤中(1 BP/孔)，其填充有1ml新鮮製造培養液，並培養於5% CO2，32℃培養箱3日。每一hEPO GMMO組之培養液於3日後再次交換，收集耗盡(spent)培養 液，使用ELISA系統檢測hEPO量。
就用於治療人類個體之EPO GMMOs而言，製造流程係於優良製造實施(GMP)條件下進行，並包括後續製程，以產生最終產物。所有DMOs係收獲自下腹部之皮膚。10塊皮膚核心樣本，約30mm長與2mm寬，一般於臨床中心之不住院手術室進行，在局部麻醉下，使用具14號取芯針頭之收獲裝置。後續製程包括但不侷限於：自個體收獲DMOs，引入DMOs至培養液中，以選定之HDAd-EPO載體轉導DMOs，以創造EPO GMMOs，產物於鑑定、測量分泌量與無菌檢測之後釋出，並將EPO GMMOs植入至個體中。
體外微器官之維持
每3-4日收集用過之製造培養液，並評估分泌性重組蛋白質之量，以及EPO GMMOs之存活率。新鮮製造培養液加至24-孔盤中。
體內動物試驗
八周大(於植入日)雄性SCID小鼠(嚴重複合型免疫缺乏症小鼠NOD.CB17-Prkdcscid/NCrHsd，得自Harlan實驗室)係使用於SCID小鼠試驗中。
hEPO GMMOs投藥至SCID小鼠中
得自每一治療組之hEPO GMMOs係使用10G植入針頭，皮下植入至4-5隻單獨小鼠背部(每隻小鼠二hEPO GMMOs)。
為了測量血液中人類EPO(hEPO)濃度與血容比值，於下列時間點收集小鼠血液(100μl)：hEPO GMMO植 入(基準線)前數日、hEPO GMMO植入後六日，以及之後在實驗期間約每10日。血容比值係以離心法測量，並使用ELISA套組系統測量血清hEPO量，依據製造商之流程。
葡萄糖測量
葡萄糖代謝係使用作為非破壞性試驗，以測量體外經基因修飾之微器官之存活率。組織以葡萄糖消耗評估，使用Sigma-Aldrich Corporation’s GAGO20葡萄糖(GO)試驗套組，依據使用手冊及/或葡萄糖測量儀(Accu-Check Sensor/Performa,Roche或等效物)。
血容比測量
血容比值係使用離心法測量，使用參考法，由國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)建議，如技術上已知。為了測定血容比，試管內之全血係於10-15,000xg離心5分鐘，以沉澱出紅血球(稱之為濃縮紅血球)，濃縮紅血球柱比毛細管內之樣本總長之比例，係以繪圖讀取裝置測量，於10分鐘離心時間內。
hEPO GMMOs投藥至人類
hEPO GMMOs植入手術係於第9日進行，於DMO收獲手術之後。基因修飾，使用HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO或HDAd-CAG-MAR-opt-hEPO-WPRE係於體外進行，係評估GMMOs之hEPO分泌，如上所述。植入手術於非血液透析日進行。待植入hEPO GMMOs之數量將依據目標劑量而決定，以及體外測定GMMO之藥效。
EPO GMMOs將SC植入至腹部[以如 WO2013/118109所述之植入裝置，在此併入本案以作為參考資料]，在臨床中心之不住院手術室進行局部麻醉。
接受指定hEPO GMMO之個體，可依據體外測量之GMMO hEPO分泌而製造hEPO劑量。
hEPO GMMOs係於臨床中心之不住院手術室進行皮下植入。個體接受IV預防性抗生素(1 gram頭孢菌素或由主治醫師選定之抗生素)以及局部麻醉，包括利多卡因(lidocaine)與正腎上腺素。
在植入每一GMMO時，Depo-Medrol®係皮下注射至每一GMMO植入處附近。請注意注射處應盡量接近GMMO，且距離GMMO不超過5mm。
Depo-Medrol注射處方：請勿注射於GMMO上或過於接近(小於1mm)。使用0.5cc之胰島素注射器。以70%乙醇或洛赫西定(Chlorhexidine)消毒GMMO植入處附近之皮膚。注射必須於皮下進行，請勿掐捏注射區域之皮膚。於GMMO之每一側注射二次，一開始於GMMO近端插入針頭並滲入，之後再次於GMMO中央插入針頭並滲入。每GMMO注射8mg之Depo-Medrol 40mg/ml。此代表組共0.2cc每GMMO。於GMMO之每一側注射0.1cc，每次0.05cc，共2次注射。
在植入所有hEPO GMMO至個體後，若發現Hb反應高於可接受範圍，便進行靜脈切開術以降低Hb量，且若效率不佳，則EPO GMMOs劑量便可藉由切除一或多個hEPO GMMOs而降低。
範例1 使用不同皮膚樣本之EPO GMMOs體外hEPO分泌再現性
目的：本試驗測試當使用不同之構築物轉導收獲自三種不同腹部整型捐贈皮膚之MOs時，是否可得到類似之體外GMMO分泌情況。
實驗流程簡述：DMOs收獲自健康捐贈者之三種不同皮膚樣本(HA-131,HA-132,HA-138)。實驗組別由4 DMOs組成，其經HDAd-CAG-wt-hEPO或HDAd構築物，其包含額外調節序列如MAR，1.5x1010 vp/BP，轉導。於實驗期間，GMMOs維持於製造培養液中，其補充有10% DBS。其他參數如培養盤、培養液體積與培養條件(32℃，5% CO2)在整個實驗期間維持不變。培養液每3-4日更換一次、收集，並以ELIA測試hEPO量。
在一單獨實驗中，EPO GMMOs製備如下：製備經不同載體轉導之EPO GMMOs。收集含有分泌性hEPO之培養液，來自每一組之四個不同之GMMOs，匯集並以ELISA(R&D Systems Inc.,Quantikine® IVD人類紅血球生成素ELISA，貨號DEP00-10)分析其hEPO濃度。hEPO值範圍為2457至5800IU/ml，如下表1所示。樣本在通過EPO抗體管柱之前與之後分析。所使用之管柱為薄管柱(thin monolith)，其上固定有EPO單株抗體3F6，其對於內生性與重組人類EPO具高度親和力(Art.No.0250 EPO純化套組，Maiia Diagnostics,Uppsala,Sweden)。
用於等電聚焦之參考樣本：
1)生物參考物製劑(BRP批次1與2a)，來自歐洲藥典委員會(rHuEPO：促紅血球生成素a與b之等莫耳混合物)，以及耐血比a(darbepoetin a)(NESP)來自Amgen，係混合，並系統性包含於IEF實驗中，使得其可存在於所有分析影像中做為參考位置標記物。
2)人類尿液EPO製劑，來自國家生物標準與控制研究所(NIBSC)。
等電聚焦-hEPO樣本之等電點分布係使用IEF與“雙墨漬”法監測。樣本與參考物係載入聚丙烯醯胺膠片(丙烯醯胺與雙丙烯醯胺總濃度為5%，以及3%交聯劑)，pH梯度為2-8、7M尿素、5%(w/v)蔗糖，厚度為1mm。樣本係於膠片上跑，依據下列流程：於250V預聚焦，於10℃進行30分鐘，之後進行聚焦步驟，以1W/cm膠片長度，最後停止於3600V/h。
雙重墨漬法：第一次半乾式墨漬法係使用轉移緩 衝液(25mM Tris，192mM甘胺酸)，於1mA/cm2進行30分鐘，之後靜置於37℃，5mM DTT中45分鐘，之後薄膜進行阻斷45分鐘，於含有5%(w/v)無脂牛奶之PBS中。免疫墨漬法係將該阻斷之薄膜與經1%(w/v)無脂牛奶/PBS溶液稀釋之小鼠抗人類EPO(AE7A5)抗體，共靜置1小時。第二次半乾式墨漬法係使用50mM甘胺酸/HCl，0.1M NaCl，pH 2.6溶液，於1mA/cm2薄膜上進行10分鐘。
在此步驟結束時，係如上述再次進行第二次阻斷。在第二次阻斷後，薄膜係於4℃以生物素化二級抗體(山羊抗-小鼠IgG(H+L))，其稀釋於1%(w/v)無脂牛奶/PBS溶液中，靜置整夜。為了使墨漬EPO顯色，該薄膜係於室溫下與稀釋於1%(w/v)無脂牛奶/PBS溶液中之鏈黴親和素過氧化酶(streptavidin-peroxydase)靜置45分鐘。之後加入受質，3,3’-二胺基聯苯胺(DAB)四氯化氫藥錠(貨號D5905,Sigma)，並進行化學冷光反應，其強度係由CCD相機捕捉。
結果
圖6結果顯示出皮膚來源對於不同構築物之表現度具有影響，然而，在所有案例中，包含額外調節因子，如MAR，之構築物，其表現至少如同控制組HDAd-CAG-wt-hEPO構築物。在第二次實驗中，當皮膚HA-132經轉導時，在分泌情況方面並未觀察到明顯差異。然而，當皮膚HA-131與HA-138經三個不同載體轉導時，構築物，HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO之分泌量為約30-40%高於目前之HDAd構 築物。
圖21代表得自3個皮膚樣本，經HDAd-CAG-wt-hEPO或HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO載體轉導之hEPO之等電聚焦結果。如圖所示，每一皮膚所觀察到的圖樣類似，表示具類似之hEPO異型體，即使經二種不同載體轉導。如所預期，取自經轉導MO之樣本，並未顯示出任何hEPO訊號，證實本發明之特異性。
比較重組與人類尿液衍生標準品之pH值(pH範圍為2-4)，經測試樣本之IEF更具鹼性(pH範圍為3-7)。這些結果與由不同人類個體收集之樣本結果一致(如上)。此外，結果顯示相對於重組EPO蛋白質，由hEPO GMMOs產生之EPO具病患特異性，並接近於內生性EPO之組成。
範例2 經HDAd-CAG-wt-hEPO與包含額外調節序列之表現卡匣轉導之GMMOs之體外表現度
目的：本試驗係測試使用不同構築物轉導並加工之GMMO，是否會得到不同的體外表現度。目標蛋白質之分泌量與表現期間，係由分泌至培養液之EPO而反映出，用於評估不同構築物之表現度。
實驗流程：GMMOs係利用GMMO製造之標準操作流程(SOPs)製備。在目前試驗中，每一實驗組別含有四個DMOs，其收獲自相同之腹部整型術捐贈皮膚。收獲係使用Nouvag醫用鑽頭，設定於7,000 RPM，裝配有14G取芯針頭，並具專屬DermaVac定位裝置。DMOs以生理食鹽水清 洗一次，之後以製造培養液(補充有10%精製牛血清[DBS])清洗五次，並各自於1ml製造培養液，5% CO2，32℃培養箱中培養24小時。在此潛伏期間之後，MOs經240μl製造培養液，其含有1.5x1010 Vp/BP之HDAd-EPO載體，轉導。該混合物置於軌道搖晃器4小時(300rpm)，之後不搖晃20小時，於5% CO2，32℃培養箱中。為了終止轉導，含有病毒載體之溶液係移除並丟棄，培養液與3ml新鮮製造培養液交換六次，以移除殘餘、未吸收之病毒顆粒。在清洗之後，加入1ml培養液，GMMOs培養於5% CO2、32℃培養箱中3日。在交換培養液之後，EPO量係於耗盡培養液中，以ELISA(R&D Systems Inc.,Quantikine® IVD人類紅血球生成素ELISA，貨號DEP00-10)測量。GMMOs於相同條件下額外培養數個月，每3-4日更換培養液。EPO量一開始每周測量，之後逐漸降低頻率至每10日一次。
結果
比較經不同構築物轉導之GMMOs之分泌量，顯示HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO構築物之分泌情況至少符合且一般大於HDAd-CAG-wt-hEPO構築物(圖5)之分泌情況。此外，此實驗得到之結果顯示新構築物之體外分泌衰退速率更緩和：自實驗開始約3個月，新構築物分泌約50%大於目前之構築物。
範例3 植入SCID小鼠之EPO GMMOs體內hEPO血清量
目的：本試驗係測試將經不同之病毒構築物轉導之BP，植入收獲自腹部整型之捐贈皮膚後，是否可獲得類似之SCID小鼠血清體內GMMO分泌情況。
實驗流程簡述：DMOs經收獲、經不同HDAd載體轉導，並在其植入六周大SCID小鼠之前，維持於體外數日。在其植入至小鼠前一日，由每一GMMO(“BP”)分泌之體外hEPO量係經ELISA測定。五隻小鼠植入經HDAd-CAG-wt-hEPO轉導之二BP、五隻小鼠植入經HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE轉導之二BP，以及最後五隻小鼠植入經HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO轉導之二BP。該二BPs係經皮下植入於小鼠之背部，每側一個，使用14G植入針頭。基準線採血：小鼠於BP植入前8日採血，以測量hEPO背景濃度與血容比值。一但血液樣本植入，每10-14日收集一次，總共18週，以監測體內GMMOs表現度。血容比係以離心法測量，血液中之血清hEPO量係以hEPO ELISA套組測量，依據製造商建議之流程。
結果
圖7a顯示SCID小鼠植入經HDAd-轉導之GMMOs後，血清之長期hEPO分泌量，以及相對之血容比值。
所有小鼠顯示出血清hEPO量之快速上升與其血容比百分比相對應之增加，表示植入之BPs可存活，並可傳遞生物活性量之hEPO一段延長期間(由於EPO血清量只要增加數mU便會明顯增加SCID小鼠之血容比%，因此預期在 不同組別間之血容比值會有差異)。所得之結果亦顯示構築物HDAd-MAR-CAG-optEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-optEPO，會增進GMMOs體內分泌量，並降低衰退速率(圖7b)；於植入後第125日，分別於HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO構築物偵測到為初始尖峰量之3.54%與2.87%。相對地，使用載體HDAd-CAG-wt-hEPO時，僅有初始尖峰之0.58%。此外，當考慮到絕對分泌值，若使用HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO構築物時，血清EPO量維持7-20倍高，與HDAd-CAG-wt-hEPO相較，在植入後96日與當日。當未轉導MOs植入作為控制組，hEPO之血容比百分比方面未觀察到上升或改變(未顯示數據)。
範例4 甲基腎上腺皮質酮(Depo-Medrol ® )投藥可降低EPO GMMO植入SCID小鼠血清中之hEPO衰退速率
為了增強體內表現度，同時降低發炎並增進hEPO GMMO之植入後整合性，係於小鼠植入處注射類固醇Depo-Medrol®，每周一次。此類固醇(Depo-Medrol®)經臨床驗證並可常規地使用於整型手術，以降低發炎並增進整合度，並使手術傷口癒合。每一Depo-Medrol係依據下列施加：含有1mg之Depo-Medrol之100μl溶液，係注入至每一植入GMMO附近。表現EPO之GMMOs係如上述製備與植入。每隻SCID小鼠植入二EPO GMMOs。
結果
如圖8a與圖8b所示，當Depo-Medrol®注射至植入GMMO之小鼠，GMMO分泌之人類EPO之衰退速率降低，自初始尖峰血清值起算，且hEPO分泌期間增進。例如，於植入後第20日，Depo-Medrol®組之血清hEPO濃度回復至尖峰值之35%，與控制組之11%相較。
範例5 Depo-Medrol ® 之不同劑量處方可降低經EPO GMMO植入之SCID小鼠中之hEPO血清衰退速率
目的：此試驗檢測當Depo-Medrol每周施加至植入處，是否可得到類似之體內GMMO之分泌情況，其得自經不同病毒構築物轉導之BPs植入之SCID小鼠血清。
實驗流程簡述：DMOs經收獲、經不同HDAd載體轉導，並於體外維持七日，之後植入六周大SCID小鼠。在其植入至小鼠前一日，由每一BP分泌之體外hEPO量係經ELISA測定。五隻小鼠植入經HDAd-CAG-wt-hEPO轉導之二BP、五隻小鼠植入經HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE轉導之二BP，以及最後五隻小鼠植入經HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO轉導之二BP。該二BPs係經皮下植入於小鼠之背部，每側一個，使用14G植入針頭。於植入日及之後每周一次，1mg之Depo-Medrol®(於l00μl生理食鹽水溶液中)係皮下注射至二植入之HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO構築物之GMMOs中(控制組，HDAd-CAG-wt-hEPO，並未接受任何類固醇治療)。基準線採血：小鼠於BP植入前5日採血，以測量hEPO背景濃 度與血容比值。植入SCID之血液樣本，每10-14日收集一次，總共16週，以監測體內GMMOs表現度。血容比係以離心法測量，血液中之血清hEPO量係以hEPO ELISA套組(請見上述)測量，依據製造商建議之流程。
投至試驗中可增強體內hEPO GMMO表現度之額外化合物包括：維生素C、N-乙酰半胱氨酸、半胱天蛋白酶-1抑製劑(Z-WEHD-FMK)、胞嘧啶、吡非尼酮(Pirfendone)、TEMPOL、組織蛋白酶B抑製劑(CA-074-OME)、地美可欣(Demecolcine)、ZVAD(泛半胱天蛋白酶抑製劑)、米諾環素鹽酸鹽(Minocycline hydrochloride，半胱天蛋白酶1和3之抑製劑)、安挺樂(Actemra)(IL-6抑製劑)、阿司匹林(COX抑製劑)、MIF拮抗劑(巨噬細胞遷移抑制因子)、英夫利昔單抗(Infliximab，抗腫瘤壞死因子)、絲裂黴素C、白藜蘆醇與玻尿酸(數據未顯示)。每一測試化合物係投至不同SCID小鼠組別。
結果
圖9a顯示植入經HDAd轉導之GMMOs之SCID小鼠，血清中之長期hEPO分泌量，以及相對應之血容比值之上升。
所有小鼠皆顯示血清hEPO量快速上升，且血容比百分比相對應增加，代表植入之BPs為可存活，並可傳遞生物活性量之hEPO一段延長期間。此外，所得之結果亦顯示出除了使用HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與 HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO構築物(圖7a與7b)，可使表現度增進之外，施加Depo-Medrol®至植入處可更增進經HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO構築物轉導之GMMOs之體內分泌量，並降低衰退速率，在持續分泌期間(圖9b)。於植入後第111日，於HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO構築物中分別偵測到初始尖峰值之18%與9%。相對地，經控制組載體，HDAd-CAG-wt-hEPO，轉導之GMMOs植入且未施加Depo-Medrol®於植入處者，僅為初始尖峰值之0.8%。此外，當考慮到絕對分泌值時，使用HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO構築物，以及Depo-Medrol之血清EPO量，可維持40-50倍高，與僅使用HDAd-CAG-wt-hEPO但未使用Depo-Medrol組相較，於植入後第97日與當日。當未轉導之DMOs植入作為控制組時，並未觀察到hEPO上升或血容比百分比改變(數據未顯示)。在SCID小鼠模式中，於hEPO GMMO植入處注射數種不同抗發炎化合物、類固醇、糖皮質激素與抗氧化劑之測試，令人驚訝地表現出陽性結果，亦即血清人類EPO退速率降低，且持續維持EPO血清含量，僅於與Depo-Medrol®一同注射時觀察到。注射抗-半胱天蛋白酶-1抗體之結果，並未提供在Depo-Medrol®組觀察到的衰退速率降低，在相同實驗條件下。此外，所有其他測試之抗發炎試劑、抗增生試劑與抗氧化劑並不具陽性結果，在測試之劑量與施加方法下(數據未顯示)。
範例6 hEPO GMMO投藥劑量與血清hEPO量淨尖峰增加高於基礎值間之關係
進行臨床試驗第I/II期，其中患有慢性腎臟疾病(CKD)，第三期與第四期之預透析貧血病患，係植入自體hEPO GMMOs，其經HDAd-CAG-wtEPO載體轉導。單次植入hEPO GMMOs之治療可提供介於1.5個月至大於二年之有效hEPO治療。病患進行18-25IU/kg/日(低劑量)、35-45IU/kg/日(中劑量)或55-65IU/kg/日(高劑量)之治療。
結果
劑量反應係以植入前hEPO GMMOs產生之每日hEPO投藥劑量，與植入後受治療病患之hEPO血清濃度尖峰(圖11)呈現。
範例7 使用新HDAd構築物，其中Depo-Medrol®每第二周施加至植入處之SCID小鼠體內結果
目的：此試驗檢測當Depo-Medrol每第二周施加至植入處，是否可得到類似之體內GMMO分泌情況，其得自經不同病毒構築物轉導之BPs植入之SCID小鼠血清。
實驗流程簡述：DMOs經收獲、經不同HDAd載體轉導，並於體外維持七日，之後植入六周大SCID小鼠。在其植入至小鼠前一日，由每一BP分泌之體外hEPO量係經ELISA測定。五隻小鼠植入經HDAd-CAG-wt-hEPO轉導之二BP、五隻小鼠植入經HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE 轉導之二BP，以及最後五隻小鼠植入經HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO轉導之二BP。該二BPs係經皮下植入於小鼠之背部，每側一個，使用14G植入針頭。於植入日與之後每二周一次，1mg之Depo-Medrol®(於100μl生理食鹽水溶液中)係皮下注射至每隻小鼠之二植入之GMMOs中。基準線採血：小鼠於BP植入前5日採血，以測量hEPO背景濃度與血容比值。植入後，血液樣本每10-14日收集一次，總共17週，以監測體內GMMOs表現度。血容比係以離心法測量，血液中之血清hEPO量係以hEPO ELISA套組測量，依據製造商建議之流程。
結果
圖10a顯示植入經HDAd轉導之GMMOs之SCID小鼠，血清中之長期hEPO分泌量，以及相對應之血容比值之上升。
所有小鼠皆顯示血清hEPO量快速上升，且血容比百分比相對應增加，代表植入之BPs為可存活，並可傳遞生物活性量之hEPO一段延長期間。此外，所得之結果亦顯示出除了使用HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO構築物(圖7a與7b)之表現度增進之外，施加Depo-Medrol®至植入處可更增進經所有構築物轉導之GMMOs之體內分泌量，並降低衰退速率，在持續分泌期間(圖10b)。於植入後第117日，於HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO構築物中分別偵測到初始尖峰值之12%與8%。相對地，經控制組載 體，HDAd-CAG-wt-hEPO，轉導之GMMOs植入，且Depo-Medrol®於植入處者隔周施加者，僅為初始尖峰值之2%。在此實驗中，Depo-medrol可增進控制組治療組別，回復倍數約4倍，自0.59%(請見圖7)至2%；然而，其並未接近使用HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO構築物所觀察到之持續表現度。此外，由此實驗獲得之數據顯示Depo-Medrol之施加可由每周一次降至每二周一次。此外，當考慮到絕對分泌值時，使用HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO構築物之血清EPO量，維持於6-7倍高，與HDAd-CAG-wtEPO構築物相較，於植入後第103日與當日。當未經轉導之DMOs植入作為控制組時，並未觀察到hEPO上升或血容比百分比改變(數據未顯示)。
使用構築物HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE、HDAd-MAR-EF1α-Opt-hEPO與HDAd-CAG-wtEPO，並投予甲基腎上腺皮質酮(範例1-5與7)之結論：構築物HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO具有至少如HDAd-CAG-wt-hEPO載體一樣好之體外分泌情況。然而，HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO構築物額外顯示出增進之體外分泌量與分泌期間。
皮膚來源可對於不同構築物之表現度具有某些影響，然而，在本試驗之所有觀察中，HDAd-MAR-CAG- opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO構築物之表現度至少與HDAd-CAG-wt-hEPO構築物一樣好，若無更好的話。
HDAd-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO可明顯增進GMMO之體內表現度，與HDAd-CAG-wt-EPO相較，同時增加分泌量，且更重要的，增加分泌期間。
Depo-Medrol®施加至植入處可進一步增進所有構築物之體內表現度。
範例8 使用hEPO GMMO持續紅血球生成素治療慢性腎臟疾病病患與末期腎臟疾病(ESRD)透析病患之貧血之安全性與效用
申請人已進行第I/II期、前瞻式、開放式作業、劑量增量研究，以評估本發明EPO GMMO之安全性與藥效。
整個hEPO GMMO製造過程，自收獲至植入，費時約9-15日。DMOs收獲自下腹部之皮膚組織，經HDAd-MAR-EF1α-optEPO載體轉導，以及hEPO GMMOs再次植入相同區域中。
用於轉導本臨床試驗微器官之MAR-EF1α-optEPO載體構築物示於SEQ ID NO：10。再植入至個體之經轉導EPO GMMOs，包含如SEQ ID NO：11之核酸。
hEPO GMMOs之植入劑量為約25IU/Kg/日。
此人類臨床試驗涉及自體皮膚GMMOs，其提供一種新穎之重組蛋白質製造與遞送系統，可提供治療人類EPO之體內持續分泌，使用小型組織外植體，來自病患本身之皮膚，稱之為皮膚微器官(DMOs)。
試驗目的：本試驗目的為評估hEPO GMMO治療之活性與安全性。生物活性評估包括hEPO GMMO分泌期間，其為高於基礎值之血清EPO量測量值(基礎值定義為於篩選、收獲前與植入前訪視之平均血清EPO)。
試驗族群：本試驗導入年紀18至80歲之人類，其診斷患有貧血，由於末期腎臟疾病，進行血液透析治療至少6個月，或由於慢性腎臟疾病(CKD)所引起。
病患依據表2分組參與。
其中一目的係維持Hb位準於目標範圍9-11g/dl或9-12g/dl，或小於12g/dl。
每一病患係接受自體hEPO GMMO組織植入，傾向提供持續製造並遞送治療量之EPO六(6)個月或更久，於hEPO GMMO植入後。試驗週期係如表3。
時間線相對於植入日(第0日)。
週期I：篩選週期
若個體之運鐵蛋白飽和度小於20%且鐵蛋白小於100ng/ml，該個體進行原始鐵劑補充處方，不小於500mg，之後再次測試血液學參數。若之後發現運鐵蛋白飽和度高於20%，及/或鐵蛋白高於100ng/ml，該個體便可進行最終參與試驗決定，否則便視需要投以額外之鐵劑。以至多325mg/d之乙醯基柳酸(ASA)治療之病患，在收獲前一周暫時中斷治療。
週期II：準備期與收獲與EPO GMMO製造週期
準備期(run-in phase)為4週。於準備期之第2/第3週時進行收獲手術，並於準備期之第3/第4週時進行植入手術。
個體維持穩定劑量之rHuEPO +/- 25%，於準備期期間。個體於該周之第二次血液透析期間進行每周評估(或於CKD病患該周之預定臨床訪視日)。於第一周，EPO PK透析前、rHuEPO注射後15分鐘、rHuEPO注射後1小時、於 血液透析完成後(定義為當動脈線中斷連結之時)、於血液透析完成後18-24小時，以及其之後之每日進行。在此周之透析日，於透析前與rHuEPO注射後15分鐘進行EPO PK；就CKD病患而言，第一周係於EPO注射前一周之第一日進行EPO PK，以及注射後之15分鐘、1小時、4小時與18-24小時，以及其後之每日進行。在此周期間，於rHuEPO注射當日，EPO PK血清樣本係於rHuEPO注射前與後15分鐘採樣。第2週，4個EPO PK樣本係採自ESRD，於透析前一周之每透析日，以及rHuEPO注射後15分鐘，就CKD病患而言，至多為一周3次，於rHuEPO注射當日，EPO PK係於rHuEPO注射前與後15分鐘採樣。血液學分析每周進行一次，就ESRD病患而言，其於該周之第二透析日進行。
個體進行收獲手術，至多15個微器官(MOs)，開始於第3周(某些人提早至第1周)。MOs依據個體組別指派加工為hEPO GMMO。植入計算劑量之hEPO GMMO，於第4周(某些人提早至第2周)之非透析日(就ESRD而言)進行。
整個hEPO GMMO製造過程，自收獲至植入前，費時約9-14日。
血液係於植入訪視前1-2日，以及植入當日採集。結果用於決定血液學分析，以及紅血球生成素值之基準線。用於測試抗-EPO抗體與抗-腺病毒抗體之樣本係於此時採集。在收獲訪視前，並未於透析期間投予肝素。
在收獲參訪時，在流程進行之前，投以預防性抗生素局部麻醉。至多15個皮膚核心組織樣本，約30mm長， 係移自腹部皮膚，使用具14號取芯針頭之收獲裝置，於治療中心之不住院手術室進行局部麻醉。皮膚捐贈處係以Draize評分評估、拍照與包紮，於收獲後監測個體至多2小時。不再次進行乙醯基柳酸(ASA)投藥，直至植入後。
皮膚樣本以無菌方式轉移至GMP製造廠。在GMP組織處理流程中之關鍵步驟，在收獲後，皮膚核心暴露於GMP-製造之非-整合性HDAd病毒載體中約24小時，以引入EPO基因與其相關之表現卡匣至體外完整皮膚組織之細胞中，使其可產生並分泌人類EPO。之後於整個隨後7日，進行清洗與培養液交換，以降低殘餘之病毒載體滴定數至最低值，於產物無菌度測試中，並用以測量EPO分泌量。
在植入前每一hEPO GMMO之平均EPO製造，係用於決定hEPO GMMOs植入個體中之數目，以達到希望之總劑量每公斤每日。病患持續rHuEPO治療至第1日或更早。自植入日(第0日)起，未投予rHuEPO。在植入訪視之前，並未於透析期間投予肝素。血液樣本係於1-2日內採集，就ESRD而言，當與透析連結時便於透析訪視當日採集，在植入訪視前，以及植入當日。結果用於決定血液學與紅血球生成素值之基準線。
總言之，來自篩選、收獲前與植入前之訪視之血液學分析與紅血球生成素之結果，係用於提供基礎值，在開始hEPO GMMO治療之前(基準線定義為篩選、收獲前與植入前之訪視之平均血清EPO)。
週期III(植入藥效期)：第0日至第52周
hEPO GMMO植入手術係於第5次訪視(第0日)、收獲後9-14日，於治療中心之不住院手術室進行。就ESRD而言，植入係於2透析期間之間進行，並非於透析當日。
在手術進行之前，進行預防性抗生素與局部麻醉投藥。植入希望數目之hEPO GMMOs，依據病患之目標劑量每組，以及每一hEPO GMMO之體外分泌，係於腹部皮膚進行，該區域有別於收獲處，藉由皮內或皮下插入，使用植入工具以控制植入深度，植入裝置與流程係描述於WO 2013/118109，在此併入本案以作為參考資料。
每一病患係於植入處，於植入後立即以SC注射Depo-Medrol®(每植入之hEPO GMMO不小於4mg)(劑量至多為40mg Depo-Medrol®)。就糖尿病患而言，若有需要的話，在Depo-Medrol®治療期間監測血糖，並調整降血糖治療。
植入位置係經Draize評分評估，且就血腫而言，以紋點標記於每一GMMO植入處之每一端、照相、施加局部抗生素並包紮，於植入後監測個體至多2小時。在收獲訪視之前經乙醯基柳酸(ASA)治療之病患，於植入日後再次啟動治療。
在週期III期間，個體經臨床研究員評估如下：EPO位準之血液樣本在植入前與植入後開始第一週之每日採集(於透析當日，樣本於透析前收集)。就之後之2-4週，血液樣本係於每透析日之透析前採集，就CKD病患而言，在臨床訪視期間一週3次。自第5週起，血液樣本每週採集 一次。就ESRD而言，於該週之第二透析日透析之透析前採集。病患經臨床研究員每周評估一次，在前12週。在植入後立即提供Depo-Medrol® SC注射(每植入之GMMO不小於4mg)每2週重複一次，總計8周(總共4次投予Depo-Medrol®)。Depo-Medrol®之第二次至第四次投藥係於透析當日進行。就糖尿病患而言，若有需要的話，在Depo-Medrol®治療期間監測血糖，並調整降血糖治療。
生物化學分析包括鐵蛋白、鐵、運鐵蛋白與其飽和度、血清白蛋白、維生素B12、葉酸與PTH之分析，係於透析單位依照常規進行。ESRD病患之樣本係於透析前經靜脈針頭管採樣，當與透析連結時。抗-腺病毒抗體係經測試，於植入後第4周之此週期間。
自第13周起，個體係由臨床研究員依據試驗目的而評估，每2週一次，直至第24周，以及之後每個月一次。ESRD病患係於透析治療之臨床中心訪視日之其中一日評估。完整之醫師檢驗係於第14與第26周進行。
此藥效期(週期III)終止於當病患需要外源性EPO注射或於治療之第52週。
表4顯示臨床試驗設計流程。
結果
本發明EPO GMMOs進行之臨床試驗，顯示出令人驚訝之體內藥效。請見圖15、16、17與18與對應之圖示說明。此述之增進GMMOs可遞送持續、生理相關量之內生性紅血球生成素(eEPO)，其之後可維持血紅素於臨床上希望之範圍內。血紅素量可維持且不需要救援rHuEPO或輸血。EPO GMMOs相當安全且具良好耐受性。依據這些結果，此述之GMMOs可用於治療任何疾病與病症，包括末期腎臟疾病(ESRD)、對於重組人源化紅血球生成素(rHuEPO)反應不靈敏之病患，以及β-地中海型貧血(Beta Thalassemia)病患，包括中度β-地中海型貧血(Beta Thalassemia Intermedia)。
範例9
綜覽：在此試驗中，經二種病毒載體轉導之EPO GMMOs之體外與體內表現度：係研究腺伴隨病毒(AAV)與HDAd。GMMOs經AAV-LK19-MAR-opt-hEPO-WPRE與HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO載體轉導，並維持於補充有10%血清之DMEM-F12培養液中。體外hEPO分泌量之分析顯示經HDAd與AAV二者轉導之GMMOs，可於體外與體內分泌hEPO。
自體外維持之二系統中移出血清，在HDAd系統中可產生約40%之hEPO分泌量降低，而在AAV系統中有更明顯之降低(90%)。
當GMMOs經AAV-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE或HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO載體轉導，於SCID小鼠體內模式中，經HDAd轉導之GMMOs顯示出明顯較高之hEPO血清量。然而，該AAV系統顯示出較穩定之分泌情況，在數個月期間內。
一般而言，經收獲之DMOs係於數日體外流程中，轉換為分泌目標蛋白質之GMMOs。此製造過程包括DMO收獲後之潛伏期、經病毒載體轉導，並於製造培養液中維持GMMO。本試驗之另一目標為評估體外處理時間，以決定最佳時機。
DMOs係經收獲、經HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO(SEQ ID NO：27)或AAV-LK19-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE(SEQ ID NO：26)病毒載體轉導，並維持於體外小於標準9日，之後植入至六週大SCID小鼠中。
生長培養液10%血清：HyClone DME/F-12 1：1(X1)+2.50mM L-麩醯胺+15mM HEPES緩衝液(Thermo scientific，貨號SH30023.01)。培養液補充有10%DCS(補充有HyClone精製小牛血清，Thermo scientific，貨號SH30072.03)；AmBisome 2.5μg/ml(兩性黴素(Amphotericin)B溶液250ug/ml Biological Industries)；健他黴素(Gentamycin)硫酸鹽50μg/ml(健他黴素(Gentamycin)-IKA 80mg/2ml-Teva)。
84個30mm皮膚核心MOs係於滅菌箱內製備，在臨床收獲手術流程之後，使用含有2ml生理食鹽水之14G針頭(自皮膚表面2.05mm深)，並以真空吸氣。MO以生理食鹽水由針頭沖出。每4-5次收獲更換一次針頭。MO靜置於生理食鹽水中1分鐘。之後所有MO以具有10%血清之DMEM F-12培養液，於培養皿中清洗3次。每次清洗皆以新的培養皿進行。
所有MOs皆培養於具10%血清之1ml生長培養液中，於24孔/盤(SARSTEDT貨號80.1836.500，用於懸浮細胞)，於5% CO2，32℃，培養箱中培養48小時。
某些MO係經AAV-LK19-MAR-optEPO-WPRE 1.5*1013vp/ml轉導。載體經含有10% DCS血清之生長培養液稀釋至最終濃度為1.5x1011 vp/BP(10.0μl/BP)。
其他MO經HdAd-EF1a-opt-hEPO 9.07*1012vp/ml轉導。載體經含有10% DCS血清之生長培養液，稀釋至最終濃度為1.5x1010 vp/BP(1.66μl/BP)。
250μl之轉導培養液係使用1ml移液器加入每一孔中。培養盤置於指定托盤，並培養於32℃，5% CO2，24小時，於150rpm下搖晃首個4小時。
GMMOs以轉導培養液清洗，並加入生長培養液，依據開放系統SOP。亦即，以移液器將250μl轉導培養液移出培養皿，並加入2ml新鮮生長培養液(第一次清洗)。加入3ml生長培養液至新6孔盤之每一孔中(“維持培養盤”)， GMMOs轉移至進行轉導之培養盤之各孔中(第二次清洗)。自每一孔中移出3ml培養液，並加入3ml新鮮培養液(第三次清洗)。此步驟重複3次。GMMOs轉移至新的24孔盤中，每孔內含有1ml新鮮生長培養液。培養盤係於32℃，5% CO2培養3日。
就體內實驗而言，控制組與測試GMMOs/MOs係由製造廠轉移至臨床中心之32℃，無CO2之培養箱中，使用含有2ml生長培養液(2.5小時轉移時間)之2ml冷凍管。所有GMMOs/MOs皆在植入前以生理食鹽水清洗6次。
在某些情況下，Depo-Medrol®(40mg/ml,Pfizer)係如下注射：1mg depomedrol/GMMO/MO(25ul DepoMedrol®儲存液+75ul生理食鹽水/GMMO/MO)。小鼠每10日採血一次，並以ELISA測量血清中之EPO。
於植入每一GMMO至小鼠前一日，由每一GMMO分泌之體外hEPO量係以ELISA測量。在一實驗中，二組之五隻小鼠係植入經HDAd-MAR-EF1α-opt-hEPO轉導之GMMOs，一組於體外處理3日後進行，第二組於體外處理9日後進行。相同流程於經AAV-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE載體轉導之10個GMMOs進行。每隻小鼠之二GMMO係皮下植入於小鼠背部，每側一個，使用10G植入針頭。基準線採血-小鼠於GMMOs植入前6日採血，以測量hEPO之背景濃度。一旦植入，血液樣本每10-14日收集一次，就經HDAd轉導之GMMOs而言總計17週，就AAV轉導之GMMOs而言總計35週，已測量體內GMMOs之表現度。血 液中之血清hEPO量係由hEPO ELISA套組測量，依據製造商建議之流程。
圖22a與22b顯示體外處理週期對於所得GMMOs之體內表現度之影響，當經兩種病毒載體，HDAd或AAV轉導後。圖22a顯示經HDAd轉導之GMMOs之體內表現度增進，當體外GMMO之處理期間由9日降為3日。圖22b顯示經AAV轉導之GMMOs之體內表現度增進，當體外GMMO之處理期間由9日降為3日。
於植入後第7日，類似之分泌量可於GMMOs體外處理9或3日間獲得。然而，於以經9日體外處理GMMOs植入小鼠後第7日，血清中之蛋白質量立即劇烈降低。於植入後第58日，經AAV轉導之GMMOs，其經體外處理9日，植入之SCID小鼠之hEPO血清量顯示有14倍差異，與經AAV轉導之GMMOs，其經體外處理3日，植入之小鼠相較(請見如圖22b)。
當處理時間由13日降至10日、9日、6日、3日與1日，皆得到類似結果(請見如圖23-25)。因此，將體外處理時間由標準13日或大於或小於9日，降至1日，可明顯增進GMMO之體內藥效。
範例10
在此試驗中，係評估經HDAd-CAG opt-IFNa與HDAd-EF1a-opt IFNa轉導之IFN GMMOs。比較體外處理時間為9日、4日與2日者。尤其是，於收獲後不同日(第2日、第4日與第9日)，將IFN GMMOs植入至SCID小鼠中。 DepoMedrol®係於植入日與之後之每二週提供至SCID小鼠中。
材料與方法：
生長培養液：具10%DCS(精製小牛血清)之DME/F-12培養液：HyClone DME/F-12為1：1(X1)+2.50mM L-麩醯胺+15mM HEPES緩衝液(Thermo scientific，貨號SH30023.01)。培養液補充有10% DCS(補充有HyClone精製小牛血清，Thermo scientific，貨號SH30072.03)；AmBisome 2.5μg/ml(微脂體兩性黴素(Amphotericin)B 50mg-Gilead)；健他黴素(Gentamycin)硫酸鹽50μg/ml(健他黴素(Gentamicin)-IKA 80mg/2ml-Teva)。
病毒載體：pAd-CAG-optINFα(SEQ ID NO：28)，滴定數為7.32 x 10e12 vp/ml。delta28-MAR-EF1a-optINFa(SEQ ID NO：22)，滴定數為1.60x10e13 vp/ml。
實驗流程：
49個約30mm皮膚核心MOs，係於無菌箱中製備，在使用設定於7000rpm之鑽頭，以及含有2ml生理食鹽水14G針頭(自皮膚表面起2.05mm深)，以真空吸氣收獲，MO以生理食鹽水由針頭沖出。每4-5次收獲更換一次針頭。之後所有MO以DMEMF-12培養液，不含血清，於培養皿中清洗3次。(所有MO皆為乾淨的)。每次清洗皆以新的培養皿進行。
所有MOs培養於1ml生長培養液中，於24孔/盤(SARSTEDT貨號80.1836.500，用於懸浮細胞)，於5% CO2 培養箱，32℃，培養24小時。
病毒轉導：
某些MO係經包含CAG-optINFa表現卡匣(SEQ ID NO：28)之HDAd，7.32*1012vp/ml轉導。HDAd載體以含有10% DCS血清之生長培養液稀釋至最終濃度1.5x1010 vp/BP(2.05μl/BP)。
某些MO經包含無CpG-optINFa(SEQ ID NO：23)之HDAd，1.60*1013vp/ml，轉導。載體以含有10% DCS血清之生長培養液，稀釋至濃度最終濃度1.5x1010 vp/BP(0.94μl/BP)。
250μl轉導培養液(生長培養液加病毒載體)係使用1ml移液器加入每一孔。培養盤置於指定托盤，並培養於32℃，5% CO2，24小時，於150rpm下搖晃首個4小時。
IFNa GMMOs經清洗移除轉導培養液，並加入生長培養液。一般而言，以移液器將250μl轉導培養液移出培養皿，並加入2ml新鮮生長培養液(第一次清洗)。加入3ml生長培養液至新6孔盤之每一孔中(“維持培養盤”)，GMMOs轉移至進行轉導之培養盤之各孔中(第二次清洗)。每一孔中移出3ml培養液，並加入3ml新鮮培養液(第三次清洗)。進行3次額外清洗。GMMOs轉移至新的24孔盤中，每孔內含有1ml新鮮生長培養液。培養盤係於32℃，5% CO2培養3日。
植入
IFN GMMOs係由製造處轉移至臨床中心之32℃， 無CO2之培養箱中，使用含有2ml生長培養液(2.5小時轉移時間)之2ml冷凍管。所有GMMOs皆在植入前以生理食鹽水清洗6次。
每隻小鼠以10G針頭SQ植入GMMOs。
Depo-Medrol®(40mg/ml,Pfizer)係於植入日與之後之每二週注射至某些測試小鼠中。注射如下：1mg Depo-Medrol®每GMMO(25微升Depo-Medrol®儲存液+75微升生理食鹽水/GMMO)。
小鼠係於一週後採血，之後每10日一次，以ELISA測量血清中之IFN。
結果
結果示於圖26，其顯示體外處理時間由9日降為2日，可使血清INFa α量上升，於第30-40日與更久。
範例11
綜覽：在下列試驗中，經AAV-LK19-MAR-EF1a-optEPO與AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE轉導之EPO GMMOs係進行體內分泌情況測試。植入後，二GMMOs皆會產生血清hEPO。MAR-EF1a-optEPO載體會產生較高量，與MAR-CAG-optEPO-WPRE相較。請見圖28。
材料與方法
具10%DCS(精製小牛血清)之DME/F-12培養液：HyClone DME/F-12 1：1(X1)+2.50mM L-麩醯胺+15mM HEPES緩衝液(Thermo scientific，貨號SH30023.01)。培養液補充有10% DCS(補充有HyClone精製小牛血清，Thermo scientific，貨號SH30072.03)；AmBisome 2.5μg/ml(微脂體兩性黴素(Amphotericin)B 50mg-Gilead)；健他黴素(Gentamycin)硫酸鹽50μg/ml(Gentamicin-IKA 80mg/2ml-Teva)。
病毒轉導：某些MOs經AAV-LK19-EF1a-optEPO，第1批，1.2*1013vp/BP轉導。該載體以含有10% DCS血清之生長培養液，稀釋至最終濃度1.5x1011 vp/MO(12.5μl/MO)。其他MOs經AAV-LK19-MAR-optEPO-WPRE，第3批，1.0*1013vp/BP轉導。該載體以含有10% DCS血清之生長培養液，稀釋至最終濃度1.5x1011 vp/BP(15μl/BP)。
GMMO’s/MO’s係轉移至臨床中心之32℃，無CO2之培養箱中，使用含有2ml生長培養液(2.5小時轉移時間)之2ml冷凍管。所有GMMO’s/MO’s皆在植入前以生理食鹽水清洗6次。每隻小鼠以10G針頭SQ植入2 GMMOs。Depo-Medrol®(40mg/ml,Pfizer)於植入日與植入後45日注射至所有組別。注射如下：1mg Depo-Medrol®/GMMO&MO(25ul Depo-Medrol®儲存液+75ul生理食鹽水/GMMO&MO)。
範例12
綜覽：係評估經不同AAV病毒載體轉導之GMMOs之體外表現度。AAV病毒載體之每一者皆包含此述之EPO表現卡匣，可體外分泌hEPO。
結果
圖29a與29b顯示二不同形式之包含ssAAV8- MAR-CAG-optEPO-WPRE與scAAV8-MAR-CAG-optEPO-WPRE之AAV載體之體外表現度。兩種AAV載體皆可產生能夠於體外分泌hEPO至少42天之EPO GMMOs。
圖30顯示一不同AAV載體之體外表現度，該載體為AAV1/2，其包含AAV1/2-MAR-CAG-wtEPO。AAV1/2-MAR-CAG-wtEPO係可產生能夠體外分泌hEPO至少50天之EPO GMMOs。
圖31顯示一不同AAV載體之體外表現度，該載體為AAV1，其包含scAAV2/1-CAG-wtEPO。scAAV2/1-CAG-wtEPO係可產生能夠體外分泌hEPO至少33天之EPO GMMOs。
圖32a與32b顯示二不同AAV載體之體外表現度，該等載體為ssAAV2i8與scAAV2i8，其包含ssAAV2i8-MAR-CAG-optEPO-WPRE與scAAV2i8-CAG-optEPO。hEPO係自包含ssAAV2i8-MAR-CAG-optEPO-WPRE及sc AAV2i8-CAG-optEPO之EPO GMMOs體外分泌至少62天。
圖33顯示一不同AAV載體之體外表現度，該載體為AAV-LK19，其包含MAR-CAG-optEPO-WPRE表現卡匣。hEPO係自包含AAV-LK19-MAR-optEPO-WPRE之EPO GMMOs體外分泌至少42天。
圖34顯示包含AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPO GMMO之體外皮膚與皮膚間之表現度差異性。不同提供者MOs標示為“HA-數字”。每一測試之皮膚種類中，包含AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE之GMMOs皆會分泌EPO。
圖35顯示包含AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPO GMMO之長期體外分泌情況。觀察到相對恆定之hEPO超過六個月。
圖36顯示體外處理時間對於GMMOs體內表現度之影響。AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE係用於轉導MOs，且該經轉導之MOs係在植入之前維持於體外3、10或14日。如同經HDAd轉導之MOs所觀察到的，經AAV轉導之MOs亦會分泌出較高位準之hEPO，並當體外處理時間由14至10日降低至3日，提供增加之血容比%。
圖37顯示包含AAV-LK19 MAR-CAG-optEPO-WPRE表現卡匣之EPO GMMOs之長期體內分泌情況。兩個包含AAV-LK19-MAR-CAG-optEPO-WPRE之EPO GMMOs植入至SCID小鼠，並評估血清hEPO與血容比%。結果顯示至少241日之hEPO穩定分泌。
圖38顯示包含HDAd-MAR-EF1a-opt-hEPO之EPO GMMOs之體內表現度，與AAV-LK19-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE相較。當經HDAd轉導之GMMOs初始具有較高之體內分泌量，與經AAV轉導之GMMOs相較，約3個月，血清中EPO之測量值約相同。當觀察較長期間，經AAV轉導之GMMOs可維持血清中之EPO含量，而經HDAd GMMOs轉導之小鼠之血清中EPO含量下降(數據未顯示)。
結論
HDAd與AAV載體為轉導微器官之有效載體，可製造表現治療蛋白質，並持續遞送治療多肽之經基因修飾 之微器官。藥效已於體外、動物體內模式與人類臨床試驗中呈現。
儘管本發明的某些特徵已於此說明與描述，然而，許多修飾、取代、變化與等效物，將可由此領域之技術人員進行。因此，應瞭解到，後附之申請專利範圍包含這些修飾與變化，其亦落入本發明精神範疇中。
<110> 邁德詹尼克斯醫療以色列有限公司
<120> 提供治療多肽之持續遞送的微器官及其使用方法
<130> 01118-0001-00TW
<140>
<141>
<150> 62/063,608
<151> 2014-10-14
<150> 61/985,368
<151> 2014-04-28
<150> 61/894,960
<151> 2013-10-24
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 582
<212> DNA
<213> 人類
<400> 1
<210> 2
<211> 582
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成性 最佳化EPO聚核苷酸
<400> 2
<210> 3
<211> 193
<212> PRT
<213> 人類
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 IFNbeta S/MAR聚核苷酸
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 IFNbeta S/MAR聚核苷酸之5'區域
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 無CpG之beta-球蛋白MAR聚核苷酸
<400> 6
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 CAG促進子聚核苷酸
<400> 7
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 WPRE聚核苷酸
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<211> 230
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 聚核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 pdelta28-MAR-EF1alpha-optEPO聚核苷酸
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<210> 11
<211> 2914
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 MAR-EF1alpha-opt-hEPO表現卡匣之聚核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成 pdelta28-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE聚核苷酸
<400> 12
<210> 13
<211> 3484
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 S/MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE卡匣聚核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成 pdelta-CAG-wt-hEPO聚核苷酸
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<210> 15
<211> 2027
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 CAG-opt-hEPO卡匣聚核苷酸
<400> 15
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<211> 32187
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成 pdelta-CAG-opt-hEPO聚核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成 CAG-wt-hEPO卡匣聚核苷酸
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成 EF1alpha促進子聚核苷酸
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<212> DNA
<213> 人類
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成 最佳化IFN聚核苷酸
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<212> PRT
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成 pdelta28-MAR-EF1alpha-optIFNalpha聚核苷酸
<400> 22
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 人工序列之描述：合成 pAAV-LK19-MAR-CAG-opt-hEPO-WPRE聚核苷酸
<400> 26
<210> 27
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<223> 人工序列之描述：合成 pAd-CAG-Opt INFa聚核苷酸
<400> 28

Claims (111)

  1. 一種經基因修飾之微器官，其提供治療多肽之持續遞送，該微器官包含一載體，其包含一操作性地連結至一上游MAR調節序列的編碼該治療多肽之核酸序列，並包含至少一額外調節序列，其中該至少一經基因修飾之微器官係於一個體體內表現該治療多肽至少三個月之持續期間，如至少六個月之持續期間。
  2. 如請求項1之經基因修飾之微器官，其中該治療多肽為人類紅血球生成素或人類干擾素。
  3. 如請求項2之經基因修飾之微器官，其中該治療多肽為人類干擾素，以及該人類干擾素為干擾素α、干擾素β、干擾素λ，或干擾素γ。
  4. 如請求項1、2或3之經基因修飾之微器官，其中該至少一額外調節序列包含一MAR序列、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列，或一WPRE序列。
  5. 如請求項1、2、3或4之經基因修飾之微器官，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、或SEQ ID NO：25，或至少95%等同於SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23，或SEQ ID NO：25之核酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之經基因修飾之微器官，其中該載體為輔助病毒依賴型腺病毒(HdAd)載體，或腺伴隨病 毒(AAV)載體。
  7. 如請求項1至6中任一項之經基因修飾之微器官，其中該經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官。
  8. 一種於對其有需要之人類個體中治療貧血持續一段期間之方法，其包含下列步驟：a.提供至少一經基因修飾之微器官，其提供人類紅血球生成素之持續遞送，該微器官包含一載體，其包含一操作性連結至一上游MAR調節序列之編碼人類紅血球生成素之核酸序列，並包含至少一額外調節序列；b.體外測定該至少一經基因修飾之微器官之紅血球生成素分泌位準；c.植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及d.測量該個體血清中之紅血球生成素位準；其中該至少一經基因修飾之微器官之植入，可增加體內血清紅血球生成素之位準超越基礎位準至少三個月。
  9. 如請求項8之方法，其中該至少一額外調節序列包含一MAR序列、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列或一WPRE序列。
  10. 如請求項8或9之方法，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：17，或至少95%等同於SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：17之核酸序列。
  11. 如請求項8、9或10之方法，其中該載體為HdAd或AAV載 體。
  12. 如請求項9、10或11之方法，其中該至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官，其中該經基因修飾之皮膚微器官可包含一不完全表皮層。
  13. 如請求項8至12中任一項之方法，其更包含在該植入步驟之後投予甲基腎上腺皮質酮之步驟，其中該投藥係於每一經基因修飾之微器官植入處附近進行皮下注射，並任擇地於植入後重複甲基腎上腺皮質酮治療之投予，每2週一次，總共8週。
  14. 如請求項13之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少一次皮下注射。
  15. 如請求項14之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少二次皮下注射。
  16. 如請求項15之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少三次或至少四次皮下注射。
  17. 如請求項13-16中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之注射處距離經基因修飾之微器官植入處不超過5mm。
  18. 如請求項13-16中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予劑量為每植入之經基因修飾之微器官約1-120mg。
  19. 如請求項18之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為每經基因修飾之微器官植入處約1-60mg。
  20. 如請求項17之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為 每經基因修飾之微器官植入處約1-30mg。
  21. 如請求項18之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為每經基因修飾之微器官植入處約10-20mg。
  22. 如請求項19之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為約1-12mg，如約12mg、約11mg、約10mg、約9mg、約8mg、約7mg、約6mg、約5mg、約4mg、約3mg、約2mg，或約1mg每經基因修飾之微器官植入處。
  23. 如請求項8-22中任一項之方法，其中該有效劑量為18-150IU紅血球生成素/Kg該個體體重/日。
  24. 如請求項23之方法，其中該有效劑量為18-30U(或IU)紅血球生成素/Kg，或18-25U紅血球生成素/Kg該個體體重/日。
  25. 如請求項23之方法，其中該有效劑量為30-50U紅血球生成素/Kg，或35-45U紅血球生成素/Kg該個體體重/日。
  26. 如請求項23之方法，其中該有效劑量為50-65U紅血球生成素/Kg，或55-65U紅血球生成素/Kg該個體體重/日。
  27. 如請求項8至26中任一項之方法，其中該有效劑量係依據下列決定：a.該個體之體重；b.該個體之歷史血紅素位準；以及c.在該植入步驟之前一個月，投予該個體之紅血球生成素平均量。
  28. 如請求項8至28中任一項之方法，其中該植入之至少一 經基因修飾之微器官，係於該個體中提供持續分泌性紅血球生成素至少三個月，如至少六個月。
  29. 如請求項8至28中任一項之方法，其中該體內血清紅血球生成素位準會增加超過基礎位準至少六個月，或其中該體內血清紅血球生成素位準之衰退速率會降低超過基礎位準，或其中該經基因修飾之微器官具有延長之治療效果，如持續與增加之血容比百分率超過基礎位準，或其中該經基因修飾之微器官可自動調節血紅素位準。
  30. 如請求項8至29中任一項之方法，其更包含在該植入後測量該個體血液中之血紅素位準之步驟，及其中該個體中測得之血紅素量係增加，且於至少50%之測量值維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月，或血紅素於至少50%之測量值維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月。
  31. 如請求項28之方法，其中該測得之血紅素於至少50%之測量值為9-11g/dl或9-12g/dl至少六個月。
  32. 如請求項7至29中任一項之方法，其更包含於稍後日期植入至少一額外經基因修飾之微器官至該個體之步驟，該微器官可提供如請求項2或4至7任一項所述之持續遞送人類紅血球生成素。
  33. 如請求項8至32中任一項之方法，其更包含於該植入之前，維持該至少一經基因修飾之微器官於體外小於9日，如1至8日、1至3日或2至3日。
  34. 如請求項8至33中任一項之方法，其中該植入為皮下或 皮內或真皮植入。
  35. 如請求項8至34中任一項之方法，其中該個體患有：腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、化療誘發之貧血、HIV治療造成之貧血、微血管病性溶血性貧血、早產造成之貧血、發炎性病症包括類風濕性關節炎、感染、與包括多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤之癌症相關之貧血、造血幹細胞病症、與骨髓增生異常症候群(MDS)相關之貧血、鐮狀細胞貧血，或地中海型貧血包括α-、β-、或α/β-地中海型貧血，或其任一組合；及/或其中該個體需要在骨髓移植後，加速紅血球之再生。
  36. 如請求項35之方法，其中該個體患有慢性腎衰竭，並患有慢性腎臟疾病(CKD)或末期腎臟病(ESRD)。
  37. 一種提供人類個體中增加血清紅血球生成素位準持續一段時間之方法，包含下列步驟：a.提供至少一經基因修飾之微器官，其提供人類紅血球生成素之持續遞送，該微器官包含一載體，其包含一操作性連結至一上游MAR調節序列之編碼人類紅血球生成素之核酸序列，並包含至少一額外調節序列；b.體外測定該至少一經基因修飾之微器官之紅血球生成素分泌位準；c.植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及d.測量該個體血清中之紅血球生成素位準；其中該至少一經基因修飾之微器官之植入增加體內血清 紅血球生成素之位準超過基礎位準至少三個月。
  38. 如請求項37之方法，其中該至少一額外調節序列包含一MAR序列、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列或一WPRE序列。
  39. 如請求項37或38之方法，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：17，或至少95%等同於SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：17之核酸序列。
  40. 如請求項37、38或39之方法，其中該載體為HdAd或AAV載體。
  41. 如請求項37至40中任一項之方法，其中該至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官，其中該經基因修飾之皮膚微器官可包含一不完全表皮層。
  42. 如請求項37至41中任一項之方法，其更包含在該植入步驟之後投予甲基腎上腺皮質酮之步驟，其中該投藥係於每一經基因修飾之微器官植入處附近進行皮下注射，並任擇地於植入後重複該甲基腎上腺皮質酮之投予，每2週一次，總共8週。
  43. 如請求項42之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少一次皮下注射。
  44. 如請求項43之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少二次皮下注射。
  45. 如請求項44之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少三次或至少四次皮下注射。
  46. 如請求項42至45中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之注射處距離經基因修飾之微器官植入處不超過1mm。
  47. 如請求項42至45中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之注射處距離經基因修飾之微器官植入處不超過5mm。
  48. 如請求項42至47中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投藥劑量為每植入經基因修飾之微器官約1-120mg。
  49. 如請求項48之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為每經基因修飾之微器官植入處約1-60mg。
  50. 如請求項49之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為每經基因修飾之微器官植入處約1-30mg。
  51. 如請求項50之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為約1至12mg，如約12mg、約11mg、約10mg、約9mg、約8mg、約7mg、約6mg、約5mg、約4mg、約3mg、約2mg，或約1mg。
  52. 如請求項37-51中任一項之方法，其中該有效劑量為18-150IU紅血球生成素/Kg該個體體重/日。
  53. 如請求項52之方法，其中該有效劑量為18-30IU紅血球生成素/Kg該個體體重/日，或18-25IU紅血球生成素/Kg該個體體重/日。
  54. 如請求項52之方法，其中該有效劑量為30-50IU紅血球生成素/Kg該個體體重/日，或35-45IU紅血球生成素/Kg該 個體體重/日。
  55. 如請求項52之方法，其中該有效劑量為50-65IU紅血球生成素/Kg該個體體重/日，或55-65IU紅血球生成素/Kg該個體體重/日。
  56. 如請求項37至55中任一項之方法，其中該體內血清紅血球生成素位準會增加超過基礎位準至少六個月。
  57. 如請求項37至56中任一項之方法，其更包含在植入後測量該個體血液中之血紅素位準之步驟，其中該個體中所測出之血紅素位準係增加且於至少50%之測量值維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月，或血紅素位準於至少50%之測量值維持於9-11g/dl或9-12g/dl至少三個月。
  58. 如請求項57方法，其中該測得之血紅素位準於至少50%之測量值為9-11g/dl或9-12g/dl至少六個月。
  59. 如請求項37至58中任一項之方法，其更包含於稍後日期植入至少一額外經基因修飾之微器官至該個體之步驟，該微器官可提供如請求項2或4至7任一項所述持續遞送人類紅血球生成素。
  60. 如請求項59之方法，其更包含在該植入至少一額外經基因修飾之微器官之後投予甲基腎上腺皮質酮之步驟，其中該投予係於每一經基因修飾之微器官植入處附近經由皮下注射。
  61. 如請求項37至60中任一項之方法，其更包含於該植入之前，維持該至少一經基因修飾之微器官於體外小於9日，如1至8日、1至3日或2至3日。
  62. 如請求項59至61中任一項之方法，其更包含在植入該至少一額外經基因修飾之微器官之前，維持該至少一經基因修飾之微器官於體外小於9日，如1至8日、1至3日或2至3日。
  63. 如請求項37至62中任一項之方法，其中該植入為皮下或皮內或真皮植入。
  64. 如請求項59至63中任一項之方法，其中該至少一額外經基因修飾之微器官之植入為皮下或皮內或真皮植入。
  65. 如請求項37至64中任一項之方法，其中該個體患有：腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、化療誘發之貧血、HIV治療造成之貧血、微血管病性溶血性貧血、早產造成之貧血、發炎性病症包括類風濕性關節炎、感染、與癌症相關之貧血包括多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤、造血幹細胞病症、與骨髓增生異常症候群(MDS)相關之貧血、鐮狀細胞貧血，或地中海型貧血包括α-、β-、或α/β-地中海型貧血，或其任一組合；或其中該個體需要在骨髓移植後，加速紅血球之再生。
  66. 如請求項65之方法，其中該個體患有慢性腎衰竭，並患有慢性腎臟疾病(CKD)或末期腎臟病(ESRD)。
  67. 一種提供治療多肽至有需要個體一段持續時間之方法，該方法包含下列步驟：a.提供表現並分泌治療多肽之至少一經基因修飾之微器官；b.體外測定該至少一經基因修飾之微器官之該治療多 肽之分泌位準；c.植入該至少一經基因修飾之微器官至該個體中；以及d.在該植入步驟後，經皮下注射投予甲基腎上腺皮質酮至每一經基因修飾之微器官植入處附近；其中該方法提供該治療多肽至該個體至少三個月之一段持續時間。
  68. 如請求項67之方法，其中該至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官，其中該經基因修飾之皮膚微器官可包含一不完全表皮層。
  69. 如請求項67或68之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少一次皮下注射、每次投予至少二次皮下注射，或每次投予至少三次皮下注射。
  70. 如請求項67至69中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之注射處距離經基因修飾之微器官植入處不超過1mm。
  71. 如請求項67至69中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之注射處距離經基因修飾之微器官植入處不超過5mm。
  72. 如請求項67至71中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投藥劑量為每植入經基因修飾之微器官約1-120mg。
  73. 如請求項72之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為每經基因修飾之微器官植入處約1-60mg、每經基因修飾之微器官植入處約1-30mg、每經基因修飾之微器官 植入處約1-12mg，如每經基因修飾之微器官植入約12mg、約11mg、約10mg、約9mg、約8mg、約7mg、約6mg、約5mg、約4mg、約3mg、約2mg，或約1mg。
  74. 如請求項67至73中任一項之方法，其中該植入為皮下或皮內或真皮植入。
  75. 如請求項67至74中任一項之方法，更包含於該植入之前，體外維持該至少一經基因修飾之微器官小於9日，如1至8日、1至3日或2至3日。
  76. 如請求項67至75中任一項之方法，其中該持續期間為至少六個月。
  77. 一種於對其有需要之人類個體中治療肝炎持續一段時間之方法，其包含下列步驟：a.提供至少一經基因修飾之微器官，其可持續遞送人類干擾素，如干擾素α、干擾素β、干擾素λ或干擾素γ，該微器官包含一載體，其包含一操作性連結至一上游MAR調節序列之編碼人類干擾素之核酸序列，並包含至少一額外調節序列；b.體外測定該至少一經基因修飾之微器官之干擾素分泌位準；c.植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及d.測量該個體血清中之干擾素位準；其中該至少一經基因修飾之微器官之植入係可增加體內血清干擾素之位準超越基礎位準至少三個月。
  78. 如請求項77之方法，其中該至少一額外調節序列包含一MAR序列、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列或一WPRE序列。
  79. 如請求項77至78中任一項之方法，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25，或至少95%等同於SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25之核酸序列。
  80. 如請求項77至79中任一項之方法，其中該載體為HdAd或AAV載體。
  81. 如請求項77至80中任一項之方法，其中該至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官，其中該經基因修飾之皮膚微器官可包含一不完全表皮層。
  82. 如請求項77-81中任一項之方法，其更包含在該植入步驟之後投予甲基腎上腺皮質酮之步驟，其中該投藥係於每一經基因修飾之微器官植入處附近經由皮下注射，並任擇地於植入後重複該甲基腎上腺皮質酮之投予，每2週一次，總共8週。
  83. 如請求項82之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少一次皮下注射、每次投予至少二次皮下注射、每次投予至少三次皮下注射，或每次投予至少四次皮下注射。
  84. 如請求項82至83中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之注射處距離經基因修飾之微器官植入處不超過5mm。
  85. 如請求項82至84中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮 質酮之投藥劑量為每植入經基因修飾之微器官約1-120mg。
  86. 如請求項85之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為每經基因修飾之微器官植入處約1-60mg、每經基因修飾之微器官植入處約1-30mg、每經基因修飾之微器官植入處約10-20mg如每經基因修飾之微器官植入處約12mg、約11mg、約10mg、約9mg、約8mg、約7mg、約6mg、約5mg、約4mg、約3mg、約2mg，或約1mg。
  87. 如請求項77至86中任一項之方法，其中該植入之至少一經基因修飾之微器官係可持續提供干擾素分泌至少三個月。
  88. 如請求項77至87中任一項之方法，其中該體內血清干擾素位準係增加超過基礎位準至少六個月。
  89. 如請求項77至88中任一項之方法，其更包含於稍後日期植入至少一額外之如請求項2至7之經基因修飾之微器官至該個體之步驟，該微器官可提供持續遞送之人類干擾素。
  90. 如請求項77至89中任一項之方法，其更包含於該植入步驟之前，體外維持該至少一經基因修飾之微器官少於9日，如1至8日、1至3日或2至3日之步驟。
  91. 如請求項77至90中任一項之方法，其中該植入為皮下或皮內或真皮植入。
  92. 如請求項77至91中任一項之方法，其中該個體患有：B、C或D型肝炎；或其組合。
  93. 一種於人類個體中提供增加之血清干擾素位準持續一段時間之方法，其包含下列步驟：a.提供至少一經基因修飾之微器官，其提供人類干擾素之持續遞送，如干擾素α、干擾素β、干擾素λ，或干擾素γ，該微器官包含一載體，其包含一操作性連結至一上游MAR調節序列之編碼紅血球生成素之核酸序列，並包含至少一額外調節序列；b.體外測定該至少一經基因修飾之微器官之干擾素分泌位準；c.植入有效劑量之該至少一經基因修飾之微器官至該人類個體中；以及d.測量該個體血清中之干擾素位準，其中該至少一經基因修飾之微器官之植入可增加體內血清干擾素之位準超越基礎位準至少三個月。
  94. 如請求項93之方法，其中該至少一額外調節序列包含一MAR序列、一CAG促進子序列、一EF1α促進子序列或一WPRE序列。
  95. 如請求項93或94之方法，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25，或至少95%等同於SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25之核酸序列。
  96. 如請求項93至95中任一項之方法，其中該載體為HdAd或AAV載體。
  97. 如請求項93至96中任一項之方法，其中該至少一經基因修飾之微器官為經基因修飾之皮膚微器官，其中該經基 因修飾之皮膚微器官可包含一不完全表皮層。
  98. 如請求項93至97中任一項之方法，其更包含在該植入步驟之後投予甲基腎上腺皮質酮之步驟，其中該投予係於每一經基因修飾之微器官植入處附近皮下注射，該方法包含一任擇地進一步之步驟，其係於植入後重複該甲基腎上腺皮質酮之投予，每2週一次，總共8週。
  99. 如請求項98之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少一次皮下注射。
  100. 如請求項98之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之投予包含每次投予至少二次皮下注射、每次投予至少三次皮下注射，或每次投予至少四次皮下注射。
  101. 如請求項98至100中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之注射處距離經基因修飾之微器官植入處不超過5mm。
  102. 如請求項98至101中任一項之方法，其中該甲基腎上腺皮質酮之劑量為每經基因修飾之微器官植入處約1-120mg、每經基因修飾之微器官植入處約1-60mg、每經基因修飾之微器官植入處約1-30mg、每經基因修飾之微器官植入處約1-12mg，如約12mg、約11mg、約10mg、約9mg、約8mg、約7mg、約6mg、約5mg、約4mg、約3mg、約2mg，或約1mg每經基因修飾之微器官植入處。
  103. 如請求項93至102中任一項之方法，其中該體內血清干擾素位準係增加超過基礎位準至少六個月。
  104. 如請求項93至103中任一項之方法，其更包含於稍後日期植入至少一額外之如請求項2至7任一項的經基因修飾之微器官至該個體之步驟，該微器官可提供人類干擾素之持續遞送。
  105. 如請求項104之方法，其更包含在該植入步驟之後投予甲基腎上腺皮質酮之步驟，其中該投予係於每一經基因修飾之微器官植入處附近經由皮下注射，並任擇地於植入後重複該甲基腎上腺皮質酮之投予，每2週一次，總共8週。
  106. 如請求項93至105中任一項之方法，其更包含於該植入步驟之前，體外維持該至少一經基因修飾之微器官少於9日，如1至8日、1至3日或2至3日之步驟。
  107. 如請求項104至106中任一項之方法，其更包含於該至少一額外經基因修飾之微器官植入之前，體外維持該至少一經基因修飾之微器官少於9日，如1至8日、1至3日或2至3日之步驟。
  108. 如請求項93至107中任一項之方法，其中該植入為皮下或皮內或真皮植入。
  109. 如請求項104至108中任一項之方法，其中該至少一額外經基因修飾之微器官之植入為皮下或皮內或真皮植入。
  110. 如請求項93至109中任一項之方法，其中該個體患有：B、C或D型肝炎；或其組合。
  111. 一種經基因修飾之皮膚微器官，其包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23， 或SEQ ID NO：27之核酸，或至少95%等同於SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23，或SEQ ID NO：27之核酸。
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