TW201923070A - 以基因改造β細胞治療糖尿病 - Google Patents
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Abstract
本發明描述向有需要之個體表現趨除量之CXCL12的人類轉殖基因β細胞。本發明亦描述包含含有編碼CXCL12之核酸序列的轉殖基因的β細胞。
Description
本發明涉及基因改造人類β細胞以及使用此類細胞之方法。基因改造(轉殖基因)人類β細胞表現趨除(fugetactic)量之趨除劑,藉此賦予對人類單核免疫細胞之保護。在一個實施例中,趨除劑為例如CXCL12或CXCL13。在一個實施例中,轉殖基因β細胞包含載體,其中該載體包含編碼趨除劑,且較佳人類趨除劑之核酸序列。在一個實施例中,轉殖基因β細胞經進一步改造呈衰老細胞。本發明方法包括使用此等細胞在高血糖環境中表現胰島素,包括見於糖尿病患者,尤其第I型糖尿病患者中之胰島素。
β細胞負責在胰臟中產生胰島素。在患有第1型糖尿病(T1D)之個體中,β細胞會受到免疫系統攻擊及破壞,且因此患有T1D之個體無法有效產生其自身胰島素。Cloning technique used to create pancreatic cells for type 1 diabetes
, Diabetes.Co.Uk, www.diabetes.co.uk/news/2014/apr/cloning-technique-used-to-create-pancreatic-cells-for-type-1-diabetes-94233303.html (2014年4月29日)。
當個體之高血糖持續地超過個體之β細胞的能力時,會發生第2型糖尿病(T2D)且該T2D會導致β細胞功能失常、去分化及死亡。Felicia W Pagliuca及Douglas A. Melton, 「How to make a functional β-cell」,Development
2013, 140(12), 2472-2483。
自正常供體向糖尿病接受者進行同種異體β細胞移植(亦稱為胰島細胞移植)已視為一種治療糖尿病之方法。然而,單核免疫細胞(T細胞、B細胞及NK細胞)之浸潤引起β細胞移植失敗。Cloning technique used to create pancreatic cells for type 1 diabetes
, Diabetes.Co.Uk, http://www.diabetes.co.uk/news/2014/apr/cloning-technique-used-to-create-pancreatic-cells-for-type-1-diabetes-94233303.html (2014年4月29日);Alan H. Cruickshank及Emyr W Benbow, 「Recurrence of Diabetes」, Pathology of the Pancreas (第2版 1995);Felicia W Pagliuca及Douglas A. Melton, 「How to make a functional β-cell」,Development
2013, 140(12), 2472-2483。
當前臨床實踐為經由門靜脈將含有β細胞之胰島移植於肝臟中,其中基本原理為將自胰臟釋放之大多數胰島素用於肝臟中且藉由微創手術即可易於到達該部位。然而,移植之後不久便有二分之一的β細胞死亡,且認為此係由於肝臟中之低氧張力、活性免疫反應及高含量之毒素及藥物。此外,經血液介導的瞬時發炎反應(IBMIR)將經移植之胰島包封於纖維蛋白凝塊中且增強對移植的免疫反應。因此,已測試用於移植的若干替代部位,包括腸道、腎囊、腸網膜及皮下,其出於患者安全性可為最佳的,但尚未針對胰島素之全身性釋放進行充分評估。
為了防止其暴露於單核免疫細胞,已將β細胞包封於據報導會提供以下雙功能之裝置中:使此等細胞與免疫破壞分離且保護宿主不受移植物影響。當使用非自體性細胞(例如同種異體或異種細胞)來移植時或若將自體性細胞移植於自體免疫環境,諸如第1型糖尿病患者中,則需要免疫保護。此可藉由經由使用半透膜或骨架物理分離細胞來阻斷細胞反應來達成。此方法降低對免疫抑制之需求且近年來已在其他處加以詳細綜述(Sakata 等人,World J Gastrointest Pathophysiol. 2012;3:19-26;Qi, Adv Med. 2014;2014:429710)。包封亦防止細胞逃離移植物之位置,且(若需要)允許移除。此與不受控制之分化及生長特定相關,例如在移植有幹細胞衍生之胰臟前驅體的小鼠中通常觀測到畸胎瘤(Kroon等人,Nat Biotechnol. 2008;26:443-452;Kelly等人,Nat Biotechnol. 2011;29:750-756.)。畸胎瘤形成可由藉由使用細胞純化(Kelly等人,2011)或藉由改良分化方法產生由純成熟β細胞群組成之移植物來預防。若胰島素瘤/畸胎瘤係由移植細胞所形成,則包封亦預防可能的癌轉移。
此方法需要高效及可重複的微包封方案,且在不存在清除或移除之可能性的情況下,一些細胞可能在包封材料中死亡。一些報告已顯示,經微包封之β細胞在植入之後可繼續存活至多6個月(Orlando等人,Diabetes. 2014;63:1433- 1444)。此意謂當裝置不再起作用時,需要進行重複手術來替代微包封裝置。
鑒於上文,對研發有效地治療糖尿病,且尤其治療第1型糖尿病的技術的需要遠未得到滿足。
本發明涉及轉殖基因人類β細胞,以及轉殖基因衰老人類β細胞,其表現有效量之趨除劑,以使得此等細胞對人類免疫細胞具有抗性。趨除劑為此項技術中所熟知的,包括「CXCL12」。亦稱為SDF-1的此細胞介素係藉由胸腺及骨髓基質產生(參見例如,Honjo等人,1998年5月26日頒佈的標題為:「人類基質衍生因子1α.及1β.」之美國專利第5,756,084號)。已報導CXCL12會排斥效應T細胞,同時將免疫抑制性調節T細胞募集至解剖部位。參見例如Poznansky等人,Nature Medicine 2000, 6:543-8。亦報導CXCL12及其受體CXCR4為血管生成之組成部分。
亦揭示除CXCL12外之排斥免疫細胞之劑,其包括(但不限於) gp120、其他CXCR4配位體、IL-8、CXCR4結合抗體、CXCL13、CXCR5配位體、CXCR5結合抗體及其類似者。
本發明之一實施例為轉殖基因人類β細胞,其表現有效量之趨除劑,較佳CXCL12或CXCL13以使得該細胞對人類免疫細胞具有抗性。在一個實施例中,此類趨除有效量之趨除劑係由將針對該劑(例如CXCL12、CXCL13)之人類轉殖基因引入β細胞或β細胞之前驅體(例如多能幹細胞)中產生。此等人類轉殖基因β細胞之進一步特徵在於表現高血糖環境中之胰島素。因此,此等細胞可用於治療個體中之糖尿病之方法中。用於本文所述之方法中的轉殖基因人類β細胞可為自體性或非自體性,例如同種異體β細胞。在一個實施例中,患者罹患T1D。在另一實施例中,轉殖基因人類β細胞可改造為衰老細胞(不能分裂),以使得此等細胞任何的進一步分化成癌細胞得到消除且由於不當細胞分裂引起的凋亡誘導無效。
本發明之一實施例使用β細胞,例如自體性或同種異體β細胞,其由非糖尿病人類個體或患有糖尿病之人類個體獲得或衍生自其。此等β細胞包括功能性趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)表現載體。此類載體經設計以在轉殖基因β細胞中以足以在β細胞周圍產生趨除緩衝劑之量表現該劑。在不希望受理論束縛之情況下,預期此緩衝劑使得β細胞可抵抗免疫細胞攻擊,但仍表現維持糖尿病個體中之適當血糖量將所需的胰島素。由患有糖尿病之患者產生自體性β細胞為此項技術中已知的。參見例如Egli等人,EMBO J. 2015年4月1日; 34(7): 841-855,其以全文引用之方式併入本文中。衍生自幹細胞之同種異體β細胞可在市面上購得。
本發明之一態樣為向有需要之個體投與轉殖基因人類β細胞,以調節個體中之胰島素量且治療糖尿病,該等細胞包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之轉殖基因。此外,足夠量之趨除劑的表現會防止轉殖基因β細胞因單核免疫細胞浸潤受到破壞之風險發生。轉殖基因人類β細胞可為自體性或同種異體的。在本發明之一實施例中,轉殖基因β細胞為源自患有糖尿病之患者的自體性β細胞。在另一實施例中,轉殖基因β細胞為同種異體人類β細胞。在另一實施例中,患者患有第1型糖尿病。
本發明之另一態樣係關於能夠表現趨除有效量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)以對免疫破壞具有抗性的轉殖基因人類β細胞。趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)可為內源性劑,亦即由待治療之個體表現之劑;或外源性劑,例如來自非自體性來源之劑或經改造之趨除劑。在一個實施例中,與未經改造之基因相比,編碼β細胞中之趨除劑的基因經改造為過度表現的。用於改造基因表現之方法為此項技術中已知的,舉例而言,進行定點基因編輯以用不同啟動子(例如組成型啟動子、誘導性啟動子等)替代內源性啟動子。在一個實施例中,將編碼趨除劑之重組聚核苷酸插入至β細胞中,使得趨除劑由重組聚核苷酸表現。用於將重組基因插入至細胞中之方法(轉導、轉染等)為此項技術中所熟知的,用用於插入至細胞中的重組聚核苷酸製造載體之方法亦為此項技術中所熟知的。
在一些實施例中,趨除劑為經改造之趨除劑。舉例而言,趨除劑之多肽序列可經改造以增加循環半衰期、併入保守胺基酸變化、增強結合至胞外基質、改良該劑活性等。因此,編碼經改造之趨除劑(例如CXCL12或CXCL13)之基因可經改造以使得基因與天然基因具有至少95%之序列一致性,且較佳與天然基因具有99%之序列一致性。同樣,經改造之趨除劑(例如經改造之CXCL12或CXCL13)之胺基酸序列與天然趨除劑具有至少95%且較佳99%之序列一致性。
在一個實施例中,提供一種包含載體之人類β細胞,載體本身包含編碼人類CXCL12或經改造之CXCL12的核酸序列,其中使該β細胞對人類免疫細胞具有抗性。
在一個實施例中,人類轉殖基因β細胞為由患有第1型糖尿病之個體獲得的自體性β細胞。
在一個實施例中,人類β細胞為同種異體β細胞。
在一個實施例中,人類單核免疫細胞包含NK細胞、T細胞及B細胞。在一個實施例中,T細胞包含細胞毒性T細胞。
在一個實施例中,轉殖基因人類β細胞表現呈趨除量之人類CXCL12。
在一個實施例中,人類CXCL12係選自由CXCL12α及CXCL12β組成之群。
在一個實施例中,人類轉殖基因β細胞包含在內源性CXCL12編碼區上游的轉殖基因調節區,其中該β細胞對人類免疫細胞具有抗性。較佳地,內源性CXCL12編碼區調節區包含組成型啟動子。在一些實施例中,內源性CXCL12編碼區調節區包含誘導性啟動子。
在一個實施例中,包含在內源性CXCL12編碼區上游的轉殖基因調節區,其中該β細胞對人類免疫細胞具有抗性的人類轉殖基因β細胞為自體性β細胞,且較佳為由患有糖尿病之患者獲得的β細胞。
在一個實施例中,包含在內源性CXCL12編碼區上游的轉殖基因調節區,其中該β細胞對人類免疫細胞具有抗性的人類轉殖基因β細胞為同種異體β細胞。
在一個實施例中,提供一種包含可表現之人類CXCL12或CXCL13基因之人類轉殖基因β細胞,其中該細胞表現趨除有效量之CXCL12或CXCl13以對人類免疫細胞具有抗性。
在一個實施例中,人類轉殖基因β細胞包含針對CXCL12之人類基因。
在一個實施例中,人類轉殖基因β細胞包含選自由CXCL12α及CXCL12β組成之群的人類基因。
在一個實施例中,人類轉殖基因β細胞包含針對CXCL12β之人類基因。
在一個實施例中,提供一種人類轉殖基因衰老β細胞,其包含可表現之人類CXCL12或CXCL13基因,其中該細胞表現趨除有效量之CXCL12或CXCl13以對人類免疫細胞具有抗性,且另外地,其中該細胞為衰老的。
在一個實施例中,人類轉殖基因衰老β細胞包含可表現之針對CXCL12之人類基因,且其能夠在高血糖介質存在下表現胰島素。
在一個實施例中,人類轉殖基因衰老β細胞包含可表現之人類基因,其選自由CXCL12α及CXCL12β組成之群。
在一個實施例中,人類轉殖基因β細胞包含可表現之人類基因,其為CXCL12β。
在一個實施例中,提供一種用於回應於高血糖環境產生胰島素之方法,該方法包含使該環境與如上文所述的人類轉殖基因β細胞群接觸。
在一個實施例中,人類轉殖基因β細胞對選自由以下組成之群的人類免疫細胞具有抗性:T細胞、B細胞、NK細胞及其混合物。
在一個實施例中,本文所述之β細胞係由以下獲得: (a) 由人類個體獲得人類祖細胞或人類多能幹細胞群; (b) 將個體之祖細胞或多能幹細胞分化於β細胞中;及 (c) 將編碼趨除劑之核酸分子引入β細胞中。
在一個實施例中,趨除劑為細胞介素、趨化細胞素、CXCR4結合抗體、CXCR4配位體、CXCR5結合抗體或CXCR5配位體。
在一個實施例中,趨除劑為CXCL12、CXCL13、gp120或IL-8。
在一態樣中,提供一種用於提高β細胞在包含免疫細胞之生物樣本中之存活期的方法,其係藉由改造β細胞以表現足以抑制或阻斷免疫細胞殺滅該β細胞之量的趨除劑。
相關申請之交叉引用
本申請案主張2017年10月3日申請的美國臨時申請案第62/567,604號;2017年10月4日申請的美國臨時申請案第62/568,117號;2018年3月2日申請的美國臨時申請案第62/637,913號;2018年4月25日申請的美國臨時申請案第62/662,651號;2018年7月6日申請的美國臨時申請案第62/694,634號;2018年7月11日申請的美國臨時申請案第62/696,603號;2018年8月10日申請的美國臨時申請案第62/717,587號;2018年8月20日申請的美國臨時申請案第62/719,975號;及2018年9月21日申請的美國臨時申請案第62/734,910號之優先權;其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。序列表
本申請案含有序列表,該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中。2018年9月25日創建的該ASCII複本命名為054610-501001WO_SL.txt且位元組大小為8,668。
本發明提供自體性/同種異體人類β細胞,其為轉殖基因的且包含編碼人類趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之轉殖基因,或經基因改造以表現或過度表現呈趨除量之內源性(人類)趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)。在一較佳實施例中,本文所述之轉殖基因β細胞經進一步改造呈衰老細胞。在其方法態樣之另一者中,β細胞經改造或處理以表現有效量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13),以抑制轉殖基因人類β細胞之免疫破壞且回應於高血糖環境產生胰島素。
進一步詳細揭示本發明之前,將首先界定以下術語。若術語未經界定,則其具有如此項技術中所理解的一般公認科學含義。
術語「CXCL13」係指其所有已知同功異型物。由於已知CXCL13會介導某些癌細胞增殖,因此其並非較佳的。參見例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3839818/
術語「趨除(fugetaxis)」或「趨除(fugetactic)」係指排斥(或化學排斥)具有遷移能力之真核細胞的藥劑之能力。由細胞表現的趨除量之CXCL12或CXCL13(或其他趨除劑)為足以阻斷或抑制免疫細胞朝細胞之遷移,或在一些態樣中,使細胞排斥免疫細胞之量。
術語「人類免疫細胞」可與術語「人類單核免疫細胞」互換使用,且包括NK細胞、T細胞及B細胞。
術語「抗免疫細胞」或「對免疫系統隱形」指示β細胞表現足以阻斷或抑制免疫細胞朝細胞之遷移,或在一些態樣中,使β細胞排斥免疫細胞的趨除劑之量。在一較佳實施例中,此類阻斷或抑制係藉由將本發明之β細胞暴露於人類單核免疫細胞(例如PBMC)之後的細胞死亡之程度量測。細胞死亡可藉由自已經歷裂解的細胞釋放的乳酸脫氫酶(LDH)來評定。較佳地,本發明之抗免疫細胞β細胞可藉由在兩天培育期內,在約30:1免疫細胞與本發明之β細胞之比下,顯示LDH量相對於對照低50%的細胞來評定。更佳地,抗免疫β細胞顯示LDH量相對於對照低60%;且甚至更佳地,LDH量相對於對照低75%;且最佳地,LDH量相對於對照低95%。用於評定LDH量之程序闡述於本文實例2中。
驅除劑為具有驅除活性之藥劑。驅除劑可包括(但不限於) CXCL12、CXCL13、gp120、IL-8、CXCR4結合抗體、CXCR4配位體、CXCR5結合抗體或CXCR5配位體。
術語「效應T細胞」係指能夠藉由釋放細胞介素引起特異性免疫反應的分化T細胞。
術語「調節T細胞」係指降低或抑制B細胞或其他T細胞對抗原之免疫反應的T細胞。
術語「CXCL12」或「SDF-1多肽」係指此項技術中熟知的細胞介素(參見例如表1)。在一實施例中,術語係指結合CXCL12特異性抗體且具有趨化性或趨除活性之蛋白質或其片段。趨化性或趨除活性係藉由分析T細胞遷移方向(例如朝向相關藥劑或離開相關藥劑)來測定。參見例如,Poznansky等人,Nature Medicine 2000, 6:543-8;N. Papeta等人,「Long-term survival of transplanted allogeneic cells engineered to express a T Cell chemorepellent」,Transplantation
2007, 83(2), 174-183。「趨除」或「趨除遷移」為遷移性細胞離開藥劑源(亦即,朝向較低濃度之藥劑)之移動。應理解,術語「CXCL12」係指其所有已知同功異型物,包括α、β、γ、δ、ε、φ及θ同功異型物。較佳CXCL12同功異型物為α及β。已知CXCL12會誘導血管生成。
術語「第1型糖尿病」及「第2型糖尿病」係指與增加之血糖相關的兩種嚴重病理生理學。第1型糖尿病之特徵在於自體免疫攻擊製造胰臟胰島素之β細胞,而第2型糖尿病與β細胞功能不良及外周胰島素抗性增加相關。與第1型相似,亦在第2型糖尿病中觀測到β細胞死亡。第1型及通常,第2型糖尿病需要個人注射胰島素。第1型糖尿病之典型特徵在於胰臟中之胰島的產胰島素β細胞有所損失,引起胰島素缺乏。此類型之糖尿病可進一步歸類為免疫介導性或特發性。大多數第1型糖尿病屬於免疫介導性,其中β細胞損失係由於T細胞介導之自體免疫攻擊。第2型糖尿病之特徵在於β細胞功能障礙以及胰島素抗性。咸信身體組織對胰島素之缺陷反應性涉及胰島素受體及下游細胞信號傳遞。與第1型糖尿病相似,β細胞群不足亦為多種第2型糖尿病患者中之病原性因素。在第2型糖尿病之早期,可藉由改善胰島素分泌且降低肝臟產生之葡萄糖的多種措施及藥物來逆轉高血糖症。隨著疾病進展,胰島素分泌出現減弱,且胰島素之治療替代物有時在某些患者中可能變得必要。
「個體」或「患者」係指哺乳動物,較佳人類個體。
「有需要之個體」或「有需要之患者」為患有第1型或第2型糖尿病之個體。
如本文所用,術語「治療(treat)」、「治療(treating)」、「治療(treatment)」及其類似術語係指減少或改善病症及/或與其相關的症狀。應瞭解,雖然不排除,但治療病症或病狀並不需要完全消除該病症、病狀或與其相關之症狀。
在本發明中,「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「含有」及「具有」及其類似術語可具有美國專利法中歸屬於其之含義且可意謂「包括(includes)」、「包括(including)」及其類似術語;「主要由……組成(consisting essentially of/consists essentially)」同樣具有美國專利法中所歸屬之含義且該術語為開放的,允許存在多於所列舉者,只要所列舉者之基本或新穎特徵不因存在多於所列舉者而改變即可,但不包括先前技術實施例。
術語「約」當用於例如溫度、時間、量、濃度及此類其他名稱之數值名稱(包括範圍)前時,指示可變化(+)或(-) 10%、5%、1%或在其之間的任何子範圍或子值的近似值。在整個本發明之上下文中亦呈現其他定義。
本發明之一態樣為轉殖基因β細胞,例如人類自體性β細胞或非自體性β細胞,例如同種異體β細胞,其包含可操作地連接於啟動子的編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸,以使得趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)在β細胞微環境中以趨除量表現。啟動子可為β細胞之內源性啟動子或β細胞中之異源性但具有功能性之啟動子。較佳地,編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸對用轉殖基因β細胞治療的個體為內源性的。在一個實施例中,同種異體β細胞源自非T1D供體。
本發明之一態樣為人類β細胞,其包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)的基因改造之內源性人類基因,其中該基因經改造而包含可操作地連接於編碼趨除劑之序列的異源啟動子,以使得趨除劑在β細胞微環境中以趨除量由內源性基因表現。可使用此項技術中已知的基因組編輯技術將啟動子引入β細胞中以可操作地連接於編碼趨除劑之序列。熟知CXCL12具有若干同功異型物,其包括α、β、γ及θ。在一較佳實施例中,所用同功異型物為CXCL12β。本文所述之轉殖基因人類β細胞回應於高血糖環境產生胰島素。術語「胰島素」意謂涵蓋胰島素原及胰島素兩者。
一般而言,本發明提供β細胞,且較佳人類β細胞,其表現呈足以阻斷或抑制免疫細胞(例如人類免疫細胞)向β細胞之遷移或足以排斥免疫細胞之量的趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)。術語免疫細胞及單核細胞(T細胞、B細胞及NK細胞)可互換使用。趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)多肽排斥免疫細胞(例如效應T細胞)之能力可使用博伊登室分析(boyden chamber assay)來活體外評定。參見例如,如Poznansky等人,Journal of Clinical Investigation, 109, 1101 (2002) 中先前所述。可替代地,藉由將此類細胞與人類PBMC組合來評定轉殖基因人類β細胞之存活率。可藉由隨時間推移量測一或多種細胞死亡標記物來評估細胞死亡之比率。一種常用的此類標記物為細胞壞死期間所釋放的乳酸脫氫酶(LDH)。
在不希望受任何理論束縛之情況下,申請者預期在本發明之一態樣中,由轉殖基因β細胞產生的趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之量足以在β細胞微環境中提供趨除作用,但並未產生呈足以提高藥劑之全身量且打破藥劑在一個過程中之有益作用,而在另一過程中產生不利後果之間的平衡的量。此外,已知當CXCL12與其受體CXCR4結合時,其會誘導血管生成。此外,在不受任何理論束縛之情況下,預期表現CXCL12的所植入之轉殖基因β細胞之微環境將誘導提高所植入之細胞的存活率的血管生成反應。
趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之趨除有效量為足以阻斷免疫細胞殺滅轉殖基因β細胞之任何量。例如,轉殖基因β細胞微環境中的趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之趨除有效量可為至少約100 ng/mL且較佳至少100 nM。在一些實施例中,轉殖基因β細胞微環境中的趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之量為至少約1000 ng/mL。舉例而言,以下特定範圍適用於本發明:約100 nM至約200 nM、約100 nM至約300 nM、約100 nM至約400 nM、約100 nM至約500 nM、約100 nM至約600 nM、約100 nM至約700 nM、約100 nM至約800 nM、約100 nM至約900 nM或約100 nM至約1 µM。
在各實施例中,轉殖基因β細胞微環境中的趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之趨除有效量在20 ng/mL至約5 µg/mL範圍內。在各實施例中,趨除有效量在20 ng/mL至約1 µg/mL範圍內。在各實施例中,β細胞微環境中的趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之量為在約100 ng/mL至約500 ng/mL、約500 ng/mL至5 µg/mL,約800 ng/mL至約5 µg/mL或約1000 ng/mL至約5000 ng/mL範圍內的充足趨除量。在不希望受理論束縛之情況下,預期當在一起使用轉殖基因及非轉殖基因β細胞時,轉殖基因β細胞可表現足量之趨除劑,以使得微環境產生延伸至鄰近非轉殖基因β細胞的趨除作用。轉殖基因β細胞微環境中的趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之趨除有效量可為所述範圍內的任何值或子範圍(包括端值)。
儘管免疫學家普遍使用小鼠及小鼠DNA以進一步理解人類免疫系統之運轉方式,但人類與小鼠之間存在顯著差異。因此,由載體編碼的趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)較佳為人類藥劑。Javier Mestas及Christopher C. W. Hughes, 「Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology」,Journal of Immunology
2004, 172(5), 2731-2738;O. Cabrera等人,「The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function」,PNAS
2006, 103(7), 2334-2339;M. Votey, 「Of mice and men: how the nPOD program is changing the way researchers study type 1 diabetes」, diaTribe, Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (2015年8月21日)。
CXCL12多肽為此項技術中已知的。參見例如,Poznansky等人,Nature Medicine 2000, 6:543-8及 美國專利公開案第20170246250號,兩者均以全文引用之方式併入本文中。術語CXCL12及SDF-1可互換使用。例示性CXCL12/SDF-1同功異型物提供於美國公開案20170246250之表I中。例示性CXCL12/SDF1同功異型物亦提供於(下)表1中: 表1:人類CXCL12/SDF1同功異型物
在一個實施例中,CXCL12多肽與NP 001029058具有至少約85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性且具有趨化細胞素或趨除活性。在一個實施例中,CXCL12多肽與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少約85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性且具有趨化細胞素或趨除活性。此類序列一致性係基於用已知保守第二胺基酸替代第一胺基酸。此類保守替代在此項技術中為公認的,且針對所得經改造之CXCL12多肽的趨除特性的測試亦為此項技術中所熟知的。參見例如,Poznansky,見上文。
CXCL13肽為此項技術中已知的。CXCL13亦稱為B淋巴細胞化學引誘劑(BLC)或B細胞引誘趨化細胞素1 (BCA-1),且此等術語可互換使用。舉例而言,人類CXCL13可見於寄存編號Q53X90。在一個實施例中,CXCL13多肽具有包含以下之胺基酸序列:MKFISTSLLLMLLVSSLSPVQGVLEVYYTSLRCRCVQESSVFIPRRFIDRIQILPRGNGCPRKEIIVWKKNKSIVCVDPQAEWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRKIP (SEQ ID NO: 7)。在一個實施例中,CXCL13多肽與Q53X90具有至少約85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性且具有趨化細胞素或趨除活性。在一個實施例中,CXCL13多肽與SEQ ID NO: 7具有至少約85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性且具有趨化細胞素或趨除活性。
用於本文所述之方法中的轉殖基因β細胞可為自體性或非自體性,例如同種異體β細胞。「自體性細胞」為來自同一個體之細胞。「同種異體」細胞為來自相同物種的遺傳學類似但不相同的供體之細胞。適用於本發明方法中的同種異體細胞較佳來自人類個體。適用於本發明方法中的同種異體細胞可來自親屬,例如同胞、表親、父母或子女;或非親屬。用於選擇同種異體供體之標準為此項技術中所熟知的,參見例如,Tatum等人,Diabetes Metab Syndr Obes 2017: 10 73-78。人類同種異體β細胞可在市面上購得,且自體性β細胞係藉由由Egli
等人所述的方法產生,見上文。
在一實施例中,本發明方法中所用之轉殖基因人類β細胞為自體性轉殖基因β細胞,可藉由利用此項技術中已知的方法自由患者獲得的多能祖細胞或多能幹細胞衍生β細胞而製備。此等衍生之β細胞可包含以下(例如用以下轉染或感染等):包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸序列的表現載體。
可替代地,本發明方法中所用之轉殖基因β細胞可藉由將胰島β細胞與有需要之個體分離來製備。此等經分離之胰島β細胞可包含以下(例如用以下轉染或感染等):包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸序列的表現載體。可替代地,β細胞可經基因改造以表現內源性趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)基因,以使得其組成性產生趨除有效量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)。
在本發明之一實施例中,β細胞包含以下(例如用以下轉染或感染等):包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸分子的表現載體,該核酸分子可操作地連接於適用於β細胞中之表現的啟動子。載體可整合至β細胞之基因組中或其可以游離方式存在且不整合至基因組中。
本發明之轉殖基因β細胞亦可由成體幹細胞藉由以下製備:將成體幹細胞與個體分離,在合適條件下培養幹細胞以擴展細胞群且誘導分化成β細胞。細胞可藉由以下經改造以表現趨除有效量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13):將編碼趨除有效量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之表現載體引入細胞中;或編輯基因組以表現趨除有效量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)。載體可在分化成β細胞之前引入幹細胞中或幹細胞之基因組可經編輯以含有異源啟動子。可替代地,載體可引入所得β細胞中或所得β細胞之基因組可經編輯以含有異源啟動子。
本發明之轉殖基因β細胞亦可藉由以下製備:由個體之體細胞,例如β細胞、纖維母細胞或角質細胞產生誘導多能幹(iPS)細胞;處理iPS細胞以誘導分化成β細胞;且將包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸序列的表現載體引入經分化之β細胞中。
本發明之轉殖基因β細胞亦可藉由以下製備:製備由個體體細胞產生之誘導多能幹(iPS)細胞;將包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸序列的表現載體引入iPS細胞中;且在引入轉殖基因之前或之後處理iPS細胞,以誘導分化成β細胞。
本發明之轉殖基因β細胞亦可利用此項技術中已知的方法藉由以下產生:獲得祖細胞或類祖細胞之細胞,例如胰臟β-細胞祖細胞;將包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸序列的載體引入細胞中;且在引入載體之前或之後處理細胞以誘導分化成β細胞,或對體內葡萄糖量起反應之胰島素釋放細胞;參見例如,Millman等人Nature Communications (2016年5月10日) 第1-8頁;Baek等人 Curr Stem Cell Rep (2016) 2:52-61;Russ等人,EMBO. J. 34, 1759-1772 (2015);及 Qadir等人,Cell Reports 22,2408-2420 (2018年2月27日)。祖細胞及類祖細胞之細胞可為用轉殖基因細胞治療的個體之自體性或非自體性,例如同種異體細胞。對體內葡萄糖量起反應的產胰島素細胞(參見例如Qadir等人,見上文)可如本文所述經基因改造以表現趨除量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13),且亦為本發明之一實施例。此類基因改造之產胰島素細胞亦可用於本發明方法中來治療如本文所述之糖尿病。
可藉由此項技術中已知的方法將來自個體的任何適合體細胞再程式化為iPS細胞,參見例如,Pagliuca及Melton (2013) How to make a functional β-cell, Development (3013) 140(12); 2472-2483;Yu等人(2007). Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920;Takahashi及Yamanaka, 2006, Cell 126(4):663-676;Wernig等人,2007, Nature 448:7151;Okita等人,2007 Nature 448:7151;Maherali等人,2007 Cell Stem Cell 1:55-70;Lowry等人,2008 PNAS 105:2883-2888;Park等人,2008 Nature 451:141-146.;Takahashi等人,2007 Cell 131, 861-872;美國專利第8,546,140號;美國專利第7,033,831號及美國專利第8,268,620號。可使用此項技術中已知的方法將iPS細胞分化成β細胞,參見例如美國專利公開案第20170081641號及美國專利公開案第20130164787號,以及Millette及Georgia, 「Gene Editing and Human Pluripotent Stem Cells: Tools for advancing Diabetes Disease Modeling and Beta Cell Development」, Current Diabetes Reports 2017年11月, 17: 116;美國專利申請案第20130273651號;Shi, Y.,等人 Stem Cells., 25: 656-662 (2005);或Tateishi, K.等人,J Biol Chem., 283: 31601-31607 (2008)。
較佳地,編碼趨除劑之序列可操作地連接於適用於β細胞中之表現的調節區。適合調節區為此項技術中已知的,且包括啟動子,諸如哺乳動物啟動子,其包括例如次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPTR)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子、肌肉肌酸激酶啟動子及人類延長因子啟動子(EF1α)、GAPDH啟動子、肌動蛋白啟動子及泛素啟動子以及病毒啟動子(包括SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)、多角體蛋白啟動子、人類免疫缺乏病毒(HIV)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)啟動子、腺病毒啟動子、腺相關病毒啟動子、或單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子)。其他相關啟動子,例如病毒及真核啟動子亦為此項技術中熟知的(參見例如,Sambrook及Russell (Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press))。可操作地連接於編碼趨除劑之序列的調節區可為適用於個體細胞中之表現的任何組成型啟動子。
本發明之表現趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之轉殖基因細胞,無論自體性或非自體性,例如同種異體,均可藉由此項技術中已知的用於投與β細胞的任何手段向有需要之個體投與。可以足夠提供能夠緩解與低胰島素量相關的症狀中之至少一些的胰島素量的量投與本發明之轉殖基因細胞。
本發明之另一態樣為一種治療有需要之個體中的糖尿病之方法,其包含以下步驟:(a)由個體獲得或衍生β細胞或產胰島素類β細胞;(b)將編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之適合表現載體引入細胞中以形成表現所引入之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)的自體性轉殖基因細胞;及(c)將自體性轉殖基因細胞移植於個體中。
可利用適用於將外源性基因轉移於哺乳動物細胞,例如β細胞中之多種載體,包括整合至基因組中之載體及不整合至基因組中但以游離基因體之形式存在的載體;及用於將此類載體引入細胞中之方法,且各載體及方法為此項技術中已知的。舉例而言,可使用反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(AAV)類載體及EBV類載體。參見例如,US 20110280842;Narayanavari及Izsvák, Cell Gene Therapy Insights 2017;3(2),131-158;Hardee等人,Genes 2107, 8, 65;Tipanee等人,Bioscience Reports (2017) 37;及Chira等人 Oncotarget, 第6卷, 第31期, 第30675-30703頁。
本發明之另一態樣為一種用於提高β細胞在包含免疫細胞之生物樣本中之存活期的方法,其包含將編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之表現載體引入β細胞中;或藉由編輯β細胞之基因組以使得β細胞表現趨除量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)。在本發明之一態樣中,趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)係由β細胞以足以阻斷或抑制免疫細胞(例如,T細胞、B細胞及/或NK細胞)向β細胞遷移之量表現。在本發明之一態樣中,趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)係由β細胞以足以使β細胞排斥免疫細胞之量表現。在本發明之一態樣中,基因改造β細胞處於個體,例如患有第1型或第2型糖尿病之人類個體中。在一個實施例中,β細胞為個體之自體性β細胞。
用於向哺乳動物細胞遞送病毒載體及非病毒載體之方法為此項技術中所熟知的,且包括例如脂質體轉染、顯微注射、彈道法(ballistics)、病毒體(virosome)、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質-核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子及DNA之試劑增強性攝取。脂質體轉染試劑為市售的(例如TransfectamTM
及LipofectinTM
)。適用於聚核苷酸之高效受體識別脂質體轉染的陽離子型及中性脂質為已知的。核酸可遞送至細胞(離體投與)或目標組織(活體內投與)。脂質:核酸複合物,包括靶脂質體,諸如免疫脂質之複合物的製備為熟習此項技術者熟知的。可使用經重組介導之系統來將載體引入細胞中。此類重組方法包括例如使用位點特異性重組酶,如Cre、Flp或PHIC31 (參見例如,Oumard等人,Cytotechnology (2006) 50: 93-108) ,其可介導轉殖基因之定向插入。
適用於本發明中之載體包括包含編碼趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之核酸的表現載體,該核酸可操作地連接於啟動子以指導轉錄。適合啟動子為此項技術中所熟知的,且描述於例如Sambrook及Russell (Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press)中。用於指導趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)之表現的啟動子可為例如SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子或顯示對在哺乳動物細胞中之表現有效的其他啟動子。
適用於本發明方法中之載體包括例如SV40載體、乳頭狀瘤病毒載體、埃-巴二氏病毒載體(Epstein-Barr virus)、反轉錄病毒載體及慢病毒載體。
本發明中所用之載體可包含來自真核病毒,例如SV40、乳頭狀瘤病毒及埃-巴二氏病毒之調節元件,包括例如針對轉錄物之高效聚腺苷酸化、轉錄終止、核糖體結合及/或轉譯終止之信號。載體之額外元件可包括例如強化子及異源剪接內含子信號。
在本發明之一實施例中,β細胞之基因組可經基因改造以增加內源性趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)基因之表現量。此類增加之表現可藉由以下來達成:引入可操作地連接於內源性趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)基因之異源啟動子;或改變內源性趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)啟動子,以使得β細胞表現趨除量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)。此類增加之表現可藉由來達成:將啟動子引入β細胞之基因組中以使得其可操作地連接於編碼內源性趨除劑之序列,且由此表現或過度表現呈趨除量之趨除劑。
用於改造基因組之基因編輯技術為此項技術中所熟知的,且包括例如CRISPR/CAS 9、Piggybac、睡美人(Sleeping Beauty)基因組編輯系統(參見例如,Zhang等人 Molecular Therapy Nucleic Acids, 第9卷, 2017年12月, 第230-241頁);系統(參見例如,Cong等人,Science. 2013; 339(6121): 819-23;Mali等人,Science. 2013; 339(6121): 823-6;González等人,Cell Stem Cell. 2014; 15(2): 215-26;He等人,Nucleic Acids Res. 2016; 44(9);Hsu等人,Cell. 2014; 157(6): 1262-78.);鋅指核酸酶類系統(參見例如,Porteus及Carroll, Nat Biotechnol. 2005; 23(8): 967-73;Urnov等人,Nat Rev Genet. 2010; 11(9): 636-46);TALEN類系統(類轉錄活化因子效應核酸酶) (參見例如,Cermak等人,Nucleic Acids Res. 2011; 39(12);Hockemeyer等人,Nat Biotechnol. 2011; 29(8): 731-4;Joung及Sander JD, Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14(1): 49-55;Miller等人,Nat Biotechnol. 2011; 29(2): 143-8;及Reyon等人,Nat Biotechnol. 2012; 30(5): 460-5)。
在一個實施例中,用使得細胞可存活且能夠控制患者之血糖但無法複製(亦即,誘導細胞衰老)之試劑處理本文所述之轉殖基因β細胞。一種此類試劑為絲裂黴素C,其為已知的DNA交聯劑。處理後,此等細胞中之DNA交聯,藉此使得不可能形成複製所需的單鏈DNA。此類處理防止細胞,尤其由幹細胞產生之彼等細胞分裂,以使得若細胞變成癌細胞,其不可分裂。能夠誘導細胞衰老之其他已知試劑包括由Petrova等人,「Small Molecule Compounds that Induce Cellular Senescence」 Aging Cell, 15(6):999-1017 (2016)敍述之彼等試劑,,其以全文引用之方式併入本文中。僅舉例而言,此類試劑包括引起端粒由於複製相關端粒縮短,次細胞毒性應激,諸如暴露於UV、γ照射、過氧化氫及低氧發生功能障礙之試劑。使本發明之β細胞呈現非複製之特定手段並非至關重要,但其限制條件為此等細胞可在不存在細胞分裂之風險下植入。研究顯示,成人胰臟具有極少的β細胞轉換,其表明限制細胞分裂之能力將幾乎不會對植入細胞產生胰島素造成影響。. 參見例如,Perl等人,The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism
, 第95卷, 第10期, 2010年10月1日, 第 E234-E239頁。
本發明之另一態樣為一種調節個體中之胰島素量的方法,其包含向有需要之個體投與本發明之β細胞,其中β細胞表現胰島素且產生呈趨除量之趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)。β細胞可為自體性β細胞或非自體性β細胞,例如同種異體β細胞,且可具有表現趨除劑之載體,該載體可整合至β細胞基因組中或以游離方式存在。在本發明之一實施例中,轉殖基因β細胞可經基因改造以過度表現呈趨除量之內源性趨除劑(例如CXCL12、CXCL13)。
將本文所述之轉殖基因β細胞引入個體中的方法為熟習此項技術者熟知的,且包括(但不限於)注射、靜脈內、門靜脈內或非經腸投與。可進行單次、多次、連續或間歇投與。參見例如, Schuetz及Markmann, Curr Transplant Rep. 2016年9月; 3(3): 254-263。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。用於醫藥學活性物質,包括細胞的培養基及試劑的使用為此項技術中熟知的。用於靜脈內輸注β細胞之典型醫藥組合物可經製備以含有250 ml無菌林格氏溶液(Ringer's solution)及100 mg組合。用於製備可非經腸投與之化合物的實際方法將為熟習此項技術者已知或顯而易知的且較詳細地描述在例如Remington's Pharmaceutical Science, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)及其第18版及第19版中,,其以引用之方式併入本文中。
本發明之轉殖基因及基因改造β細胞可引入若干不同的此項技術中熟知的個體之部位中之任一者中,包括(但不限於)胰臟、腹腔、腎臟、肝臟、門靜脈或脾臟。
此外,為了避免發生可引起患者罹患腫瘤之可能性的任何可能的轉殖基因β細胞轉變成癌細胞,可藉由與已知試劑,諸如絲裂黴素C接觸或暴露於來自電離輻射、低氧、過氧化氫等之次毒性應激而使轉殖基因β細胞為衰老細胞。衍生自多能幹細胞之細胞典型地在不當細胞分裂期間或由於免疫細胞清除而經歷細胞凋亡。本文所述之衰老的轉殖基因β細胞不能分裂,藉此消除在細胞分裂期間出現的細胞凋亡觸發事件。此外,本文所述之衰老的轉殖基因β細胞具有抗免疫細胞性,藉此提供防止由於免疫細胞清除導致細胞凋亡誘導。因此,預期本文所述之轉殖基因β細胞將具有比非衰老轉殖基因β細胞要長至顯著較長的壽命。
轉殖基因,且較佳衰老的改造β細胞可經由移植物移植於個體中。理想的β細胞移植部位將為支持移植細胞在個體中之植入、長期功能及存活期且出於最大患者安全性而可輕易獲得的部位。植入部位包括肝臟、腸道、皮下及胰臟部位。
本文中使用之以下縮寫具有以下含義,且若縮寫未加以界定,則其具有其一般公認科學含義。在本文中使用已獲確認的單字母縮寫來敍述胺基酸。 FLAG = DYKDDDDK蛋白質標籤(SEQ ID NO: 10)
g/L = 每公升之公克數
HRP = 辣根過氧化酶
LDH = 乳酸去氫酶
iBLOT = 半乾燥蛋白質傳送裝置(Invitrogen)
MES = 2-(N-嗎啉基)乙磺酸
mL = 毫升
N/A = 不適用
nM = 奈莫耳
PBMC = 外周血單核細胞
PBS = 磷酸鹽緩衝鹽水
TMB = 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺
mL = 微升
mg = 微克
× g = 倍重力 實例
實例 1 :用於評定 CXCL12-a 及 CXCL12-b 同功異型物之表現量的模型細胞
g/L = 每公升之公克數
HRP = 辣根過氧化酶
LDH = 乳酸去氫酶
iBLOT = 半乾燥蛋白質傳送裝置(Invitrogen)
MES = 2-(N-嗎啉基)乙磺酸
mL = 毫升
N/A = 不適用
nM = 奈莫耳
PBMC = 外周血單核細胞
PBS = 磷酸鹽緩衝鹽水
TMB = 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺
mL = 微升
mg = 微克
× g = 倍重力 實例
實例 1 :用於評定 CXCL12-a 及 CXCL12-b 同功異型物之表現量的模型細胞
用2種不同的CXCL12 (α及β)之同功異型物使用可在市面上購得的針對各同功異型物之質體(購自GenScript之質體)轉染HEK293細胞。用250 μg/mL G418(可購自ThermoFisher)選定經轉染之細胞且產生針對各同功異型物之穩定池。使細胞處於適合培養基中3天。用分析稀釋緩衝液1:1稀釋來自表現CXCL12α及CXCL12β的經轉染HEK293細胞之改良性培養基。針對各同功異型物確立兩個獨立池,且隨後藉由使用標準化濃度曲線之吸收度來獲得各同功異型物在溶液中之濃度。重複此實驗兩次且結果如下: CXCL12α CXCL12β
1. 310 nM 1410 nM
2. 274 nM 1330 nM
1. 310 nM 1410 nM
2. 274 nM 1330 nM
以上結果顯示,與表現CXCL12α之轉殖基因模型細胞相比,轉殖基因模型細胞表現呈明顯較高量之CXCL12β。 實例2 -用於評定 CXCL12 之其他同功異型物之表現量的模型細胞
用5種不同的CXCL12 (α及β)之同功異型物使用可在市面上購得的針對各同功異型物之質體(購自GenScript之質體)轉染HEK293細胞。用250 μg/mL G418(可購自ThermoFisher)選定經轉染之細胞且產生針對各同功異型物之穩定池。使細胞處於適合培養基中3天。用MES緩衝液在4%至8% NuPage凝膠(可購自ThermoFisher)中分離改良性培養基且轉移至硝化纖維素(iBLOT)。
用5種不同的CXCL12 (α及β)之同功異型物使用可在市面上購得的針對各同功異型物之質體(購自GenScript之質體)轉染HEK293細胞。用250 μg/mL G418(可購自ThermoFisher)選定經轉染之細胞且產生針對各同功異型物之穩定池。使細胞處於適合培養基中3天。用MES緩衝液在4%至8% NuPage凝膠(可購自ThermoFisher)中分離改良性培養基且轉移至硝化纖維素(iBLOT)。
用經HRP標記的抗FLAG標籤抗體/TMB色素原(購自GenScript)在西方墨點法上偵測表現量,如圖1中所示。結果證明,CXCL12之γ、δ及θ同功異型物具有比α或β同功異型物要高的濃度。實例 3 :轉殖基因 β 細胞之製備
衍生自人類誘導之多能幹細胞的胰臟β細胞係購自Takara Bio USA公司(加利福尼亞州山景城(Mountain View, CA))且根據所提供之說明書進行培養。
用含有人類CXCL12同型(CXCL12a/SDF-1α或CXCL12b/SDF-1β)或對照之慢病毒載體(pLenti-C-Myc-DDK,馬里蘭州羅克維爾(Rockville, MD)之OriGene Technologies)轉導細胞。以每個β細胞約10:1之比率使用慢病毒載體。包括標籤(帶下劃線)之序列提供於下文中。藉由ELISA (佐治亞州諾克羅斯(Norcross, GA)之RayBioTech)測定CXCL12同型之濃度(表1)。 CXCL12a (亦稱為SDF1a)
寄存編號NM_199168
CXCL12b (亦稱為SDF1b)
寄存編號NM_000609
實例 4 :轉殖基因 β 細胞排斥 PBMC
寄存編號NM_199168
CXCL12b (亦稱為SDF1b)
寄存編號NM_000609
實例 4 :轉殖基因 β 細胞排斥 PBMC
使來自實例3之轉殖基因β細胞與人類外周血單核細胞(PBMC,密歇根州諾維(Novi, MI)之Innovative Research)以30:1 (PBMC與β細胞)之比率接觸。簡言之,將PBMC再懸浮於全β培養基中,計數且添加100 μL PBMC (以將經表現之CXCL12的稀釋度降至最低)加以調整以實現30:1 PBMC:β細胞比率。最終體積為1.1 mL。亦產生不存在PBMC下之β細胞及不存在β細胞下之PBMC的背景對照。緊接著,自各樣本移除150 μL培養基且以1200 × g離心10分鐘。移除上清液且儲存於4℃下(零時)。使細胞返回至培育箱且以與零時樣本相似之方式在之後24及48小時時取樣。
在根據製造商說明書使用Pierce LDH細胞毒性分析套組(Thermo Scientific)接觸之後24及48小時時測試LDH之釋放量。增加之LDH為細胞毒性(細胞溶解)之指標。
來自代表性實驗之資料(減除背景)提供於表1及圖2A中。來自第二代表性實驗之資料提供於圖2B中。 表1. LDH及CXCL12量
此等資料表明,藉由β胰島細胞表現之CXCL12保護β胰島細胞不受免疫細胞攻擊,藉此使得其具有抗性。在此實驗中表現呈比SDF1a/CXCL12a要高之量的表現SDF1b/CXCL12b的β細胞顯示,在PBMC存在下基本上沒有細胞毒性。實例 5 :轉殖基因 β 細胞之替代性製備
用編碼CXCL12之反轉錄病毒表現載體或不編碼CXCL12之對照反轉錄病毒載體活體外轉染或感染自患有第1型糖尿病之受試者分離的β細胞。使用博伊登室分析如Poznansky等人,Journal of Clinical Investigation, 109, 1101 (2002)中先前所述,針對趨除量之CXCL12的表現來分析攜帶編碼CXCL12之反轉錄病毒載體的轉殖基因β細胞。預期在此分析中,表現至少100 nM CXCL12之轉殖基因β細胞將排斥免疫細胞。實例 6 :轉殖基因 β 細胞之強迫衰老對轉殖基因細胞介素表現之影響
如實例3中所述製備β細胞。藉由ELISA分析在絲裂黴素C (購自Santa Cruz Biotechnology)處理之前的SDF1a/CXCL12a及SDF1b/CXCL12b之表現量以測定基線表現(「之前」)。用含有10 μg/mL絲裂黴素C (一種已知會誘導衰老的試劑)之新製培養基替代培養基。使細胞返回至培育箱持續2小時。藉由平緩移液移除含有絲裂黴素C之培養基。用PBS洗滌細胞兩次。第二次洗滌之後,將細胞補充新製完全培養基。藉由ELISA分析測定SDF1a/CXCL12a或SDF1b/CXCL12b表現。
來自兩個代表性實驗之資料顯示在表2及圖3A中。SDF1a/CXCL12a及SDF1b/CXCL12b表現不受轉殖基因β細胞之強迫衰老之影響。
表2:絲裂黴素C處理之前及之後的CXCL12a及CXCL12b量
實例 7 :轉殖基因 β 細胞之強迫衰老對 PBMC 攻擊之影響
如實例3中所述製備β細胞。用絲裂黴素C或對照如實例4中所述處理細胞。如實例2中所述,使細胞與PBMC接觸。
來自兩個代表性實驗之資料顯示在圖4A及圖4B中。LDH量不受轉殖基因β細胞之強迫衰老之影響。實例 8 :轉殖基因 β 細胞之強迫衰老對胰島素產生之影響
如實例3中所述製備β細胞。用絲裂黴素C或對照如實例4中所述處理細胞。
用1 mL第2培養基替代完全生長培養基且每24小時用培養基替代物在第2培養基上維持2天。在第3天,用高血糖培養基(4.5g/L葡萄糖)攻擊β細胞。高血糖攻擊之後24小時取用經調節之培養基的樣本且藉由夾心ELISA量測胰島素表現。
來自兩個代表性實驗之資料顯示在表3及圖5中。結果顯示,轉殖基因β細胞及轉殖基因衰老β細胞產生與回應於高血糖攻擊之對照β細胞實質上相等的量之胰島素。 表3:回應於高血糖攻擊之胰島素表現
實例 9 :轉殖基因 β 細胞之活體內評估
向具有人類化免疫系統之人類化小鼠,參見例如,N. Walsh, 「Humanized mouse models of clinical disease」, Annu Rev Pathol 2017, 12, 187-215;E. Yoshihara等人,投與表現趨除量之CXCL12的轉殖基因人類β細胞或對照轉殖基因人類β細胞,且在初始投與之後的不同時間點分析胰島素產量及轉殖基因β細胞在小鼠中之存活期。預期表現趨除量之CXCL12的轉殖基因人類β細胞將比對照轉殖基因人類β細胞存活更長時段。亦預期,接受表現趨除量之CXCL12的轉殖基因人類β細胞的小鼠亦將比接受對照轉殖基因人類β細胞的小鼠具有較高量之人類胰島素,且相較於投與對照轉殖基因人類β細胞的小鼠中之量,較高量之人類胰島素將存留較長時段。
向具有人類化免疫系統之人類化小鼠,參見例如,N. Walsh, 「Humanized mouse models of clinical disease」, Annu Rev Pathol 2017, 12, 187-215;E. Yoshihara等人,投與過度表現CXCL12的由內源性CXCL12基因基因改造之人類β細胞或對照人類β細胞,且在初始投藥之後的不同時間點分析人類胰島素之產量及β細胞在小鼠中之存活期。預期,過度表現CXCL12之基因改造人類β細胞將比未經基因改造以過度表現CXCL12的對照人類β細胞存活更長時段。亦預期,接受過度表現CXCL12的基因改造人類β細胞的小鼠亦將比接受對照人類β細胞的小鼠具有較高量之人類胰島素,且相較於投與對照人類β細胞的小鼠中之量,較高量之人類胰島素將存留較長時段。
視情況地,用使細胞內之DNA交聯的試劑(例如絲裂黴素C)處理細胞以防止細胞分裂。
僅為說明本發明闡述前述描述且並不意謂為限制性的。由於本領域熟習此項技術者可進行併入本發明之精神及主旨的所述之實施例之修改,因此本發明應視為廣義上包括在申請專利範圍之範疇內的所有變化及其等效物。
圖1為西方墨點法之像片,其顯示當各過度表現於β細胞中時,CXCL12α、CXCL12β、CXCL12γ、CXCL12θ及CXCL12δ及CXCL14之相對量。
圖2A及圖2B為顯示自與PBMC以30:1 PBMC:β細胞比一起培育24及48小時的表現CXCL12α或表現CXCL12β之β細胞釋放的乳酸去氫酶(LDH,細胞溶解之標記物)的相對量的條形圖。
圖3顯示表現各細胞介素之兩個β細胞組中CXCL12α或CXCL12β之表現量。
圖4A及圖4B為顯示在存在或不存在β細胞之經誘導之衰老(藉由絲裂黴素C處理)下,自與PBMC以30:1 PBMC:β細胞比一起培育24及48小時的表現CXCL12α或表現CXCL12β之β細胞釋放的LDH之相對量的條形圖。
圖5顯示在存在或不存在用絲裂黴素C處理下,由表現CXCL12α或CXCL12β之β細胞的高血糖攻擊引起的胰島素誘導。
Claims (23)
- 一種人類β細胞,其表現或過度表現呈足以使得該β細胞對人類免疫細胞具有抗性的量的人類趨除(fugetactic)劑,其中該β細胞能夠表現胰島素且不能進行細胞分裂。
- 一種人類β細胞,其包含載體,該載體本身包含編碼人類CXCL12之核酸序列,其中該β細胞對人類免疫細胞具有抗性。
- 如請求項1或2之人類β細胞,其中該細胞為由患有第1型糖尿病之個體獲得的自體性β細胞。
- 如請求項1或2之人類β細胞,其中該細胞為同種異體β細胞。
- 如請求項1至4中任一項之人類β細胞,其中該等人類免疫細胞包含NK細胞、細胞毒性T細胞及/或B細胞。
- 如請求項1至5中任一項之人類β細胞,其中該細胞表現呈趨除量之人類CXCL12。
- 如請求項6之人類β細胞,其中該CXCL12係選自由CXCL12α及CXCL12β組成之群。
- 一種人類β細胞,其包含在內源性CXCL12編碼區上游的轉殖基因調節區,其中該β細胞對人類免疫細胞具有抗性。
- 如請求項8之人類β細胞,其中該細胞為自體性β細胞。
- 如請求項8之人類β細胞,其中該細胞為同種異體β細胞。
- 如請求項9之人類β細胞,其中該細胞為由患有第1型糖尿病之個體獲得或衍生的自體性β細胞。
- 如請求項10之人類β細胞,其中該細胞為由沒有第1型糖尿病之個體獲得或衍生的同種異體β細胞。
- 如請求項8至12中任一項之人類β細胞,其中該轉殖基因調節區為外源性組成型或誘導性啟動子。
- 如請求項8至10中任一項之人類β細胞,其中該細胞表現呈趨除量之CXCL12。
- 如請求項14之人類β細胞,其中該CXCL12係選自由CXCL12α及CXCL12β組成之群。
- 如請求項15之人類β細胞,其中該細胞表現CXCL12β。
- 如請求項2至16中任一項之人類β細胞,其中該β細胞不能進行細胞分裂。
- 如請求項1至17中任一項之人類β細胞,其中該人類CXCL12係選自由以下組成之群:CXCL12α、CXCL12β、CXCL12δ及CXCL12γ。
- 如請求項8至18中任一項之人類β細胞,其中該等人類免疫細胞包含NK細胞、細胞毒性T細胞及B細胞。
- 一種用於回應於高血糖環境產生胰島素之方法,其包含使該環境與如請求項1至19中任一項之人類轉殖基因β細胞群接觸。
- 如請求項20之方法,其中該高血糖環境包含人類免疫細胞。
- 如請求項21之方法,其中該等人類免疫細胞包含NK細胞、T細胞及B細胞。
- 一種組合物,其供用於治療糖尿病,該組合物包含如請求項1至19中任一項之人類轉殖基因β細胞。
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