DE69927249T2 - Induzierendes alphavirengen- expressionssystem - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Expressionsvektoren, die eine strenge Regulierung der Genexpression in eukaryotischen Zellen erlaubt. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung von Proteinen und RNA-Molekülen und Verfahren zur Verabreichung von Proteinen und RNA-Molekülen an eine Pflanze oder ein Tier.
  • Betreffender Stand der Technik
  • Die Fähigkeit zur genauen Kontrolle der Expression von Genen, die in tierische oder menschliche Zellen eingeführt sind, oder in ganzen Organismen wird in vielen Gebieten der Biologie und Medizin einen signifikanten Fortschritt ermöglichen. Zum Beispiel werden Verfahren, die die absichtliche Manipulation der Genexpression gestatten, die Analyse von Genen erleichtern, deren Expression konstitutiv oder in einem bestimmten Entwicklungszustand nicht geduldet werden kann. Diese Verfahren werden ebenfalls für klinische Anwendungen, wie zum Beispiel die Gentherapie, wertvoll sein, bei der die Expression eines therapeutischen Gens gemäß den Bedürfnissen des Patienten reguliert werden muss.
  • Damit die Genregulierungstechniken von breitem Nutzen sind müssen sie eine schnelle, nachdrückliche, präzise und reversible Induktion einer Genaktivität erlauben. Wie in Saez, E. et al. (Curr. Opin. Biotechnol. 8: 608–616 (1997)) besprochen wurde, sollte ein ideales System die folgenden Anforderungen erfüllen:
    • 1. Spezifität – Das System muss zu endogenen Faktoren verschieden sein und darf nur durch exogene Stimuli aktiviert werden.
    • 2. Keine Störung – Die Komponenten des Systems sollten nicht unbeabsichtigte zelluläre Wege beeinflussen.
    • 3. Induzierbarkeit – Im inaktiven Zustand sollte die Grundaktivität des Systems minimal sein, während im aktiven Zustand hohe Genexpressionsgehalte schnell induzierbar sein sollten.
    • 4. Bioverfügbarkeit des Induktors – Induzierende Stimuli sollten schnell zur interessierenden Stelle durchdringen.
    • 5. Reversibilität – Die Induktion von Stimuli sollte schnell verschwinden, um das System schnell in den inaktiven Zustand zurückkehren zu lassen.
  • Frühe Verfahren zum Kontrollieren der Genexpression in Säugern basierten auf endogenen Elementen, wie zum Beispiel Zytokin-Reaktionselemente oder Wärmeschockproteine. Aufgrund eines hohen Gehalts an Grundexpression im nicht induzierten Zustand und pleiotropen Wirkungen, die durch allgemeine induzierende Mittel verursacht wurden, fehlte diesen Systemen die zur Regulierung von Genen in Säugerzellen und Organismen erforderliche Spezifität.
  • Fortschrittlichere Methoden versuchten diese Probleme durch Konstruktion von Schaltungsmechanismen, die auf Nicht-Säugerelementen basieren, zu vermeiden. Das fundamentale Prinzip dieser Systeme basiert auf der Existenz eines kleinen Moleküls (Induktor), das die Aktivität eines synthetischen Transkriptionsfaktors modifiziert, der die Expression des Zielgens durch einen heterologen Promotor reguliert. Eine erhöhte Spezifität wird durch Auswahl von Induktoren erreicht, die nicht die Physiologie des Säugers beeinflussen, und durch Zusammenfügen chimärer Transaktivatoren mit minimaler Homologie zu natürlichen Transkriptionsfaktoren, die nicht mit endogenen Säugerpromotoren wechselwirken.
  • Das üblichste System, das derzeit zur Regulierung der Genexpression in Verwendung ist, ist das auf Tetracyclin basierende System (Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547 (1992)). Dieses System basiert auf der ununterbrochenen Expression eines Fusionsproteins, wobei das Tetracyclin-Repressorprotein (tetR) durch Fusion an die Transkriptionsaktivierungsdomäme des VP16-Proteins zu einem Aktivator umgewandelt wird. In Abwesenheit von Tetracyclin aktiviert dieser chimäre Tetracyclintransaktivator (tTA) die Genexpression durch Binden an ein Multimer der natürlichen tetR-Bindungsstelle (tetO), die stromaufwärts eines minimalen Promotors liegt. In Gegenwart von Tetracyclin macht das tTA einer Konformationsänderung durch, die verhindert, dass es an die tetO-Stelle bindet, wobei die Expression des Zielgens angehalten wird. Aufgrund der signifikanten Vorteile dieser Methode gegenüber den vorhandenen Methoden ist das tTA-System zur induzierbaren Genexpression äußerst nützlich und dieses System wurde erfolgreich für die Herstellung einer Anzahl von Proteinen verwendet (Wimmel et al., Oncogene 9: 995 (1994), Früh et al., EMBO J. 13: 3236 (1994), Yu et al., J. Virol. 70: 4530 (1996)).
  • Jedoch wurde mit dem tTA-System über ernsthafte Probleme, die aus der Toxizität des tTA-Proteins resultieren, berichtet und es wurde gezeigt, dass mehrere Zelltypen nicht zum Tolerieren der Expression des tTA-Proteins in der Lage sind (Schocket et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522 (1995), Howe et al., J. Biol. Chem. 23: 14168 (1995), Schocket und Schatz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5173 (1996), Bohl et al., Nat. Med. 3: 299 (1997)). Während die Toxizität von tTA in kultivierten Zellen die Herstellung stabiler Klone mit geeigneter Tetracyclinregulierung belastet, ist diese tTA-Toxizität in der Gentherapie ein signifikanteres Problem und kann insgesamt die Verwendung des tTA-Systems verhindern.
  • Ein weiteres Problem des tTA-Systems ist dessen beachtlicher Grad an Grundexpression. Eine Grundexpression kann aus der Aktivierung der Reporterkonstrukte in Abwesenheit eines gebundenen Transaktivators und/oder der Unfähigkeit von Tetracyclin zur vollständigen Unterdrückung der tTA-Transaktivierung resultieren. Eine hohe Grundexpression beschränkt die Induzierbarkeit des Systems und verhindert die Durchführung von Experimenten mit hoch toxischen Proteinen (Furth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9302 (1994), Hennighausen et al., J. Cell. Biochem. 59: 463 (1995), Kistner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10933 (1996), Hoffmann et al., Nucleic Acids Res. 25: 1078 (1977)).
  • Im Falle stabiler Klone oder transgener Lebewesen kann ein Teil dieser Grundexpression auf eine Störung chromosomaler Regionen zurückgeführt werden, in die sich die fremde DNA integriert. Obwohl alle induzierbaren Systeme bezüglich den Integrationswirkungen gleich empfindlich sind, ist es möglich, dass die Grundaktivität des tTA-Systems auf der Tatsache beruht, dass dieses System die konstante Anwesenheit von Tetracyclin erfordert, um wirksam die Transkription zu unterdrücken, etwas, das nicht immer, insbesondere in vivo erreichbar ist. Die Grundexpression und die Forderung, dass Tetracyclin zur Unterdrückung der Genexpression anwesend ist, sind Gründe, warum das tTA-System nicht in der Gentherapie verwendet wird.
  • Es sind zwei Genkontrollsysteme, die auf Komponenten von Steroidhormonrezeptoren von Säugern basieren, bekannt (Saez, E. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 608–616 (1997)). Beide kombinieren eine abgeschnittene Form der Progesteronrezeptorhormon-Bindungsdomäne mit der Hefe-GAL4-DNA-Bindungseinheit und der Transkativierungsdomäne des VP16-Proteins. Der mutierten Progesteronrezeptoreinheit misslingt die Bindung an Progesteron, jedoch behält sie die Fähigkeit das Progesteron und Glucocorticoidantagonistmifepriston (RU486) zu binden, so dass in Gegenwart von RU486 das Fusionsprotein (genannt GVLP oder TAXI) die Transkription durch ein Multimer auf der GAL4-DNA-Bindungsstelle, die stromaufwärts eines minimalen Promotors liegt, aktiviert.
  • Ein wichtiger Vorteil der unmittelbar vorstehend beschriebenen Systeme ist, dass sie eine günstigere Kinetik als die Tetracyclinmethoden zu haben scheinen, weil lipophile Hormone schnell metabolisiert werden und in vivo kurze Halbwertszeiten haben. Weiterhin können derartige Hormone ebenfalls weniger zugängliche Gewebe wirksamer als Tetracyclin durchdringen. Der Hauptnachteil der Hormonrezeptorsysteme ist jedoch deren sehr hoher Gehalt an Grundexpression. In vorübergehenden und stabilen Transfektionen verschiedener Zelltypen dämpft ein hoher Gehalt an Grundaktivität die Induzierbarkeit dieser Methoden, was zu Induktionsverhältnissen führt, die selten über dem 20-fachen liegen (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8180 (1994), Mangelsdorf et al., Cell 83: 835 (1995), Wang et al., Nat. Biotech. 15: 239 (1997)).
  • Eine weitere Methode zur Regulierung der Genexpression beruht auf einem Verfahren der Induktion einer Proteindimerisierung, die von Untersuchungen über den Wirkungsmechanismus immununterdrückender Mittel abgeleitet ist (Saez, E. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 608–616 (1997)). Unter Verwendung eines synthetischen Homodimers von FK506 wurde eine allgemeine Strategie zum Zusammenbringen zweier beliebiger Peptide ersonnen, indem sie einfach mit der FKBP12-Domäne, an die FK506 bindet, ausgestattet werden. Da immununterdrückende Arzneimittel, wie zum Beispiel Cyclosporin A oder Rapamycin bei dieser Methode verwendet werden müs sen, ist die in vivo Anwendung dieser Proteindimerisierungsmethode sehr beschränkt.
  • Alle der vorstehend erwähnten Strategien regulieren die Expression durch Kontrollieren des Gehalts der Transkription von mRNA. Da dieser mRNA-Transkriptionsmechanismus immer in gewissem Maße durch die chromosomale Region beeinflusst wird, in die die fremde DNA eingeschoben wird, scheitert aufgrund des Fehlens der Kontrolle über den Integrationsmechanismus eine genaue Regulierung. Obwohl für die ortsspezifische Insertion von DNA durch homologe Rekombination Techniken verfügbar sind, sind die Insertionsfrequenzen bei weitem zu niedrig, um einen Erfolg dieser Strategie für die Gentherapie auf einer allgemeinen Grundlage zu erlauben.
  • Ein weiteres Genexpressionssystem basiert auf Alphaviren (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 578–582 (1997)). Mehrere Mitglieder der Alphavirusfamilie, Sindbis (Xiong, C. et al., Science 243: 1188–1191 (1989), Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11: 18–22 (1993)), SFV (Liljeström, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9: 1356–1361 (1991)) und andere (Davis, N. L. et al., Virology 171: 189–204 (1989)) erhielten eine beachtliche Aufmerksamkeit zur Verwendung als Virus-basierenden Expressionsvektoren für eine Vielzahl verschiedener Proteine (Lundström, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 578–582 (1997), Liljeström, P., Curr. Opom. Biotechnol. 5: 495–500 (1994)).
  • Alphaviren sind positiv strängige RNA-Viren, die ihre genomische RNA vollständig im Zytoplasma der infizierten Zelle und ohne ein DNA-Zwischenprodukt replizieren (Strauss, J. und Strauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491–562 (1994)). Das Konzept, dass Alphaviren als Expressionsvektoren entwickelt werden können, wurde zuerst vor nahezu zehn Jahren aufgestellt (Xiong, C. et al., Science 243: 1188–1191 (1989)). Seitdem haben mehrere Verbesserungen die Verwendung dieser RNA-Replikone als Expressionsvektoren praktischer gemacht (Lundstrom, L., Curr. Opon. Biotechnol. 8: 578–582 (1997)).
  • DNA-Vektoren sind für sowohl Sindbis (Herweijer, H. et al., Hum. Gene Ther. 6: 1495–1501 (1995), Dubensky, T. W. et al., J. Virol. 70: 508–519 (1996)) als auch SFV (Berglund, P. et al., Trends Biotechnol. 14: 130–134 (1996)) entwickelt worden. Euka ryotische Promotoren werden in diese Vektoren stromaufwärts des Alphavirusreplikasegens (das aus den vier Nicht-Strukturproteingenen (nsP1-4) besteht) eingeführt, die als ein oder zwei Polyproteine translatiert werden, die dann proteolytisch gespalten werden (Strauss, J. und Strauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491–562 (1994)). Die DNA wird auf die RNA von dem rekombinanten eukaryotischen Promotor im Kern transkribiert und zum Zytoplasma transportiert, wo die Replikase die Replikation des Alphavirus-RNA-Moleküls wie während einer normalen Replikation des Alphavirus RNA-Moleküls katalysiert (Strauss, J. und Strauss. E., Microbiol. Rev. 58: 491–562 (1994)). Bis vor kurzem war nur die transiente Expression heterologer Sequenzen aufgrund der Zytopathogenität der Alphavirusreplikase möglich (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 578–582 (1997)).
  • Vor ungefähr 20 Jahren stellten Weiss et al. (Weiss, B. et al., J. Virol. 33: 463–474 (1980) eine ununterbrochen infizierte Kultur von BHK-Zellen her. Die für diesen Phänotyp verantwortliche Mutation wurde vor kurzem identifiziert (Dryga, S. A. et al., Virology 228: 74–83 (1997). Eine weitere Mutation, die die Regulierung der mRNA-Transkription über Temperaturverschiebungen erlaubt, wurde von Burge und Pfefferkorn (Burge, B. W. & Pfefferkorn, E. R., Virology 30: 203–214 (1966) identifiziert und ausführlicher von Xiong et al. (Xiong, C. et al., Science 243: 1188–1191 (1989) beschrieben.
  • Es wurden Vektoren, die alphavirale Sequenzen enthalten, entwickelt, die Aussicht auf Verwendung bei DNA-Immunisierungen (Hariharan, M. et al., J. Virol. 72: 950–958 (1998)), bei der Ribozymexpression (Smith S. et al., J. Virol. 71: 9713–9721 (1997)) und in vivo Expression heterologer Proteine in Säugergeweben zeigen (Altman-Hamamdzic S. et al., Gene Ther. 4: 815–822 (1997)).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur regulierten Expression von Proteinen oder nicht translatierten RNA-Molekülen in rekombinanten Wirtszellen bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Nukleotide und Verfahren bereit, die eine präzise Regulierung der Menge an spezifischen RNA-Molekülen, die in stabil transfizierten rekombinanten Wirtszellen hergestellt werden, gestatten. Diese präzise Regulierung resultiert aus der Verwendung einer temperaturempfindlichen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (das heißt, eine Replikase), die zur Bildung neuer RNA-Moleküle bei permissiven Temperaturen nur RNA-Moleküle repliziert.
  • In einem allgemeinen Aspekt umfassen die DNA-Expressionsvektoren der Erfindung einen 5'-Promotor, der zur Initiierung einer Transkription in vivo in der Lage ist, 5'- und/oder 3'-Sequenzen, die die Replikation des RNA-Moleküls ermöglichen (cis-aktive Sequenzelemente), und einen subgenomischen Promotor 5' zu dem interessierenden Gen sowie eine interessierende Sequenz, die nur nach einem oder mehreren RNA-abhängigen RNA-Replikationsereignissen translatierbar ist. Diese RNA-abhängigen RNA-Replikationsereignisse werden durch eine regulierbare RNA-abhängige RNA-Polymerase katalysiert, die durch dasselbe RNA-Molekül kodiert sein kann, das durch Transkription des DNA-Vektors oder durch ein unterschiedliches mRNA-Molekül erzeugt wird.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung DNA-Moleküle bereit, die Polynukleotide umfassen, die RNA-Moleküle kodieren, umfassend (a) zumindest ein cis-aktives Sequenzelement, (b) einen ersten offenen Leserahmen mit einer Nukleotidsequenz, die eine nicht-zytopathische, temperaturempfindliche RNA-abhängige RNA-Polymerase kodiert, und (c) zumindest eine zweite Nukleotidsequenz, die eines der folgenden kodiert
    • (i) einen zweiten offenen Leserahmen, der ein Protein kodiert oder einen Teil davon, wobei der zweite offene Leserahmen nach einem oder mehreren RNA-abhängigen RNA-Replikationsereignissen in einer translatierbaren Form ist,
    • (ii) eine Sequenz, die zu dem gesamten oder einem Teil des zweiten offenen Leserahmens gemäß (i) komplementär ist, und
    • (iii) eine Sequenz, die ein nicht translatiertes RNA-Molekül (zum Beispiel ein Antisense-RNA-Molekül, tRNA-Molekül, rRNA-Molekül oder Ribozym) kodiert oder ein Komplement davon.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Einzel- und Mehrfachvektorsysteme zum Exprimieren einer vorstehend beschriebenen zweiten Nukleotidsequenz bereit. In einem Einzelvektorsystem sind die den ersten offenen Leserahmen kodierenden Sequenzen und die zweite Nukleotidesequenz auf demselben Nukleinsäuremolekül vorhanden. In einem Mehrfachvektorsystem sind die den ersten offenen Leserahmen kodierenden Sequenzen oder Unterabschnitte davon und die zweite Nukleotidsequenz auf einem oder mehreren separaten Nukleinsäuremolekülen vorhanden.
  • Sind die den ersten und zweiten offenen Leserahmen kodierende Sequenzen entweder auf demselben Nukleinsäuremolekül oder in demselben Vektor vorhanden (das heißt, in einem Einzelvektorsystem) so wird eine Region 5' zu dem offenen Leserahmen vorhanden sein, die die Translation dieses offenen Leserahmens hemmt.
  • Die temperaturempfindliche Replikase kann „Kälte"- oder „Hitze"-empfindlich sein und wird daher eine RNA-abhängige RNA-Replikation nur bei Temperaturen entweder über oder unter der restriktiven Temperatur wirksam katalysieren. In einer Ausführungsform kodieren die DNA-Moleküle der Erfindung eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, die bei Temperaturen unterhalb von 34°C eine Replikaseaktivität aufweist und bei Temperaturen von 34°C und darüber eine geringe oder nicht nachweisbare Replikaseaktivität aufweist.
  • Weiterhin werden RNA-Transkriptionsprodukte der DNA-Moleküle der Erfindung und alphavirale Partikel, die verpackte RNA-Moleküle der Erfindung enthalten, bereitgestellt. Werden verpackte RNA-Moleküle erzeugt, so kann der zweite offene Leserahmen ein oder mehrere Proteine kodieren, die für derartiges Verpacken erforderlich sind (zum Beispiel Sindbis-Strukturproteine).
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung kodieren die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung ein oder mehrere Zytokine, Lymphokine, Tumornekrosefaktoren, Interferone, toxische Proteine, Pro-pharmakom konvertierende Enzyme oder weitere Proteine.
  • In einem weiteren Aspekt kodieren die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung ein nicht translatiertes RNA-Molekül, wie zum Beispiel ein Antisense-RNA-Molekül, tRNA-Molekül, rRNA-Molekül oder Ribozym.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Herstellung rekombinanter Wirtszellen bereit, umfassend ein Einführen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in Wirtszellen. Weiterhin werden rekombinante Wirtszellen bereitgestellt, die durch die Einführung von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung erzeugt werden. In einer Ausführungsform enthalten einige oder alle dieser rekombinanten Wirtszellen ein oder mehrere DNA-Moleküle der Erfindung, die stabil bewahrt werden.
  • Die Erfindung stellt weiterhin den pCYTts-Vektor der SEQ ID Nr: 1 sowie isolierte Nukleinsäuremoleküle, umfassend Polynukleotide mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr: 1, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Herstellung von Proteinen und nicht translatierten RNA-Molekülen in rekombinanten Wirtszellen bereit, umfassend das Vermehren von Wirtszellen unter geeigneten Kultivierungsbedingungen, das Einführen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in Wirtszellen und das Gewinnen der Proteine oder nicht translatierten RNA-Moleküle durch die rekombinanten Wirtszellen.
  • Es werden ebenfalls Verfahren für die regulierte Expression heterologer Polypeptide, einschließlich Zytokinen, Lymphokinen, Tumornekrosefaktoren, Interferonen, toxischen Proteinen und Pro-pharmakon konvertierenden Enzymen, bereitgestellt.
  • Weiterhin werden Proteine und nicht translatierte RNA-Moleküle, die durch die Verfahren der Erfindung hergestellt werden, bereitgestellt.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Regulierung der Expression heterologer Proteine in rekombinanten Wirtszellen bereit, umfassend das Vermehren von Wirtszellen unter geeigneten Kultivierungsbedingungen, das Einführen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in die Wirtszellen und das Ändern der Temperatur der Wirtszellenkultur von entweder einer permissiven Temperatur zu einer restriktiven Temperatur oder einer restriktiven Temperatur zu einer permissiven Temperatur. In einer Ausführungsform werden die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen eingeführt, die dann in vitro kultiviert werden. In entsprechenden Ausführungsformen werden diese Wirtszellen in einem serumfreien oder proteinfreien Medium kultiviert.
  • Zusätzlich werden Verfahren zur Herstellung von Proteinen in rekombinanten Wirtszellen bereitgestellt, umfassend das Vermehren von Wirtszellen unter geeigneten Kultivierungsbedingungen, das Infizieren der Wirtszellen mit alphaviralen Partikeln, die RNA-Moleküle der Erfindung enthalten, und das Gewinnen des Proteins.
  • Ebenfalls werden Verfahren für die Einführung und Expression von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in rekombinante Wirtszellen innerhalb eines Individuums bereitgestellt. Sollen diese rekombinante Wirtszellen Polypeptid- oder nicht translatierte RNA-Sequenzen in einem Individuum exprimieren, so können die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung entweder in vivo oder ex vivo in Wirtszellen eingeführt werden. Werden die Nukleinsäuremoleküle ex vivo in Wirtszellen eingeführt, so können die rekombinanten Wirtszellen entweder dem Individuum, von dem sie erhalten wurden, oder einem davon verschiedenen Individuum verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen sind die Wirtszellen Keratinozyten, epitheliale Zellen oder Fibroblasten von Säugern, die in denselben Säuger eingeführt werden, von dem sie erhalten wurden.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Regulierung der Expression von Proteinen oder nicht translatierten RNA-Molekülen in Individuen bereit, umfassend das Verabreichen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung an Individuen und das Ändern der Temperatur von zumindest einem Teil dieser Individuen von entweder einer permissiven Temperatur zu einer restriktiven Temperatur oder einer restriktiven Temperatur zu einer permissiven Temperatur.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Verabreichung von Proteinen und nicht translatierten RNA-Molekülen an Individuen bereit, umfassend das Verabreichen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung an Individuen und das Ändern der Temperatur von zumindest einem Teil der Individuen von einer restriktiven Temperatur zu einer permissiven Temperatur.
  • Die Erfindung stellt zusätzlich Verfahren zur Regulierung der Expression von Proteinen und nicht translatierten RNA-Molekülen in Individuen bereit, umfassend das Verabreichen rekombinanter Wirtszellen der Erfindung an diese Individuen und das Ändern der Temperatur von zumindest einem Teil dieser Individuen von entweder einer permissiven Temperatur zu einer restriktiven Temperatur oder einer restriktiven Temperatur zu einer permissiven Temperatur.
  • In einer Ausführungsform werden die Wirtszellen von demselben Individuum erhalten, welchem die rekombinanten Wirtszellen verabreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform sind die rekombinanten Wirtszellen Keratinozyten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend Nukleinsäuremoleküle der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin genetisch veränderte, nicht humane Lebewesen bereit, die zumindest in einigen ihrer Zellen Nukleinsäuremoleküle der Erfindung enthalten. Ebenfalls werden genetisch veränderte nicht humane Lebewesen bereitgestellt, die stabil in das Genom von einigen oder allen Zellen des Lebewesens integrierte DNA-Moleküle der Erfindung enthalten. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zum Herstellen genetisch veränderter nicht humaner Lebewesen bereit, umfassend das Einführen von Zellen, die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung enthalten, in diese Lebewesen, das Einführen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in die Zellen dieser Lebewesen in vivo oder das Einführen von DNA-Molekülen der Erfindung in Keimbahnzellen zur Erzeugung transgener Lebewesen, die die interessierende Sequenz in ihren somatischen und Keimbahnzellen enthalten.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1. Die DNA von pCYTts (1) wird in den Kern inseriert. Der eukaryotische Promotor (durchgezogener horizontaler Pfeil) steuert die Transkription (2) in die mRNA (3). Die Translation (4) des ersten offenen Leserahmens (ORF) der mRNA resultiert in der Erzeugung einer temperaturempfindlichen Replikase (ts-Replikaseprotein) (5). Der zweite das interessierende Gen kodierende offene ORF ist für Ribosomen nicht zugänglich. Daher findet keine Translation (6) des interessierenden Gens statt. Bei niedriger Temperatur katalysiert die ts-Replikase die Replikation (7) der mRNA (3) in eine (–)Strang-RNA von voller Länge (8). Die ts-Replikase katalysiert ebenfalls nachfolgende Replikationen (9, 10) in eine (+)Strang-RNA von voller Länge (11) und eine subgenomische RNA (12). Die subgenomische RNA (12) wird dann in das interessierende Protein translatiert (13) (nicht gezeigt). Die Kombination aus Amplifikation und qualitativer Änderung der RNA resultiert in noch nie da gewesener Schärfe und Regulierbarkeit der Expression des interessierenden Gens.
  • Die Abkürzungen in 1 sind folgende: Rous-Sarkom-Virus-Promotor (RSV Pr.), cis-aktive Sequenzelemente (CSE), Nicht-Strukturproteine 1–4 (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), interessierendes Gen (G. O. I.) und subgenomischer Promoter (S. G.).
  • 2 ist eine schematische Darstellung des pCYTts-Vektors. Der pCYTts-Vektor enthält zusätzlich zu den in 1 gezeigten Elementen einen Ampicillin-Resistenzmarker zur Auswahl in bakteriellen Zellen und eine ColE1-Sequenz, die eine bakterielle Amplifikation mit hoher Kopienzahl steuert. Der pCYTts-Vektor wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt.
  • 3A–3D zeigen die vollständige cDNA-Sequenz von pCYTts (SEQ ID Nr. 1).
  • 4A–4B. GFP-(4A) und SEAP-(4B)Herstellung bei verschiedenen Temperaturen. Mit pCYTtsGFP oder pCYTtsSEAP stabil transfizierte Zellen wurden während 48 Stunden bei den angegebenen Temperaturen vermehrt (gefüllte Rauten und nicht gefüllte Quadrate). Zwei unabhängige Experimente sind in jeder der 4A und 4B gezeigt. Die GFP-Fluoreszenz (4A) wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2 bestimmt. Die SEAP-Aktivität (4B) wurde kolorimetrisch entsprechend der Beschreibung in Beispiel 3 bestimmt. Für beide Proteine wurde bestimmt, dass die maximale Proteinexpression bei 20°C liegt. Die Aktivitäten der Proteine wurden in Bezug auf den minimalen Wert bei 29°C berechnet.
  • 5A–5B. Zeitverlauf der Erzeugung der GFP-(5A) und SEAP-Erzeugung (5B) in mit pCYTtsGFP (5A) und pCYTtsSEAP (5B) stabil transfizierten BHK-Zellen bei 30°C. Die GFP-Erzeugung wurde durch Spektralfluorophoto metrie gemessen und in Fluoreszenzeinheiten pro 106 Zellen, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, quantitativ bestimmt. Die SEAP-Erzeugung pro 106 Zellen wurde durch Messen der enzymatischen Aktivität unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 3, bestimmt. Es wurde geschätzt, dass die Menge an SEAP, das nach 80 Stunden erzeugt worden war, über 107 Molekülen pro Zelle beträgt.
  • 6A–6B. Der Beginn der GFP-(6A) oder SEAP-(6B)mRNA-Transkription in einer Mischpopulation von mit pCYTtsGFP oder pCYTtsSEAP stabil transfizierten BHK-Zallen wurde durch Messen der Menge an erzeugtem GFP oder SEAP bestimmt (siehe Beispiele 2 und 3). Die Zellen wurden während 2, 4, 6, 8 und 10 Stunden bei 29°C (schwarze Balken) inkubiert und dann während weiteren 24 Stunden bei 37°C (nicht gefüllte Balken) vermehrt.
  • 7A–7B. Diese Figuren zeigen die Ergebnisse der Experimente, die unter Verwendung von mit pCYTtsGFP stabil transfizierten BHK-Zellen erhalten wurden, die vorübergehend mit einem für die Strukturproteine des Sindbis-Virus kodierendem Plasmid transfiziert wurden. Die Bedingungen des Experiments waren folgende: (I) Inkubationsphase der transfizierten BHK-Zellen bei 29°C oder 37°C während 48 Stunden, (II) der Überstand der Zellen wurde auf eine neue BHK-Zellschicht gegeben und die Zellen wurden auf die angegebenen Temperaturen eingestellt, (III) Inkubation bei entweder 29°C oder 37°C der neuen BHK-Zellschicht während 6 Stunden und (IV) Waschen der Zellen und letzte Inkubation bei 29°C oder 37°C während 48 Stunden. Die Infektionsereignisse wurden durch die Expression des Markergens GFP, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, sichtbar gemacht. 7A zeigt die Ergebnisse von zwei getrennten Experimenten, die entsprechend der vorstehenden Beschreibung durchgeführt wurden. Eine Fluoreszenz weist auf eine GFP-Expression hin, wohingegen keine Fluoreszenz auf keine nachweisbare GFP-Expression hinweist. 7B zeigt die Ergebnisse von vier getrennten Experimenten, die entsprechend der vorstehenden Beschreibung durchgeführt wurden. Die + und – Symbole zeigen an, ob eine GFP-Expression nachgewiesen wurde.
  • 8A–8B. Western-Blot von β-Interferon (β-INF) (8A) und Erythropoietin (EPO) (8B), die im pCYTts-System exprimiert werden. 8A zeigt in der Spur 1 den Marker, Spur 2 die positive Kontrolle, Spur 3 den Überstand der β-INF-exprimierenden Zellen nach Inkubation bei 37°C während 3 Tagen, Spur 4 den Überstand der β-INF-exprimierenden BHK-Zellen (vorübergehende Transfektion) nach Inkubation bei 29°C während 3 Tagen, Spur 5 den Überstand der GFPexprimierenden BHK-Zellen, Spur 6 den Marker, Spur 7 den Überstand der β-INF-exprimierenden BHK-Zellen (Mischpopulation) nach Inkubation bei 29°C während 3 Tagen und Spur 8 den Marker. 8B zeigt in Spur 1 den Marker, Spur 2 den Überstand der EPO-exprimierenden Zellen (vorübergehende Transfektion) nach Inkubation bei 29°C während 5 Tagen, Spur 3 den Überstand der EPO-exprimierenden Zellen nach Inkubation bei 37°C während 5 Tagen, Spur 4 den Überstand der GFPexprimierenden BHK-Zellen und Spur 5 den Marker.
  • 9 zeigt einen Western-Blot von EPO. Die Proben in jeder Spur sind folgende: Spur 1 EPO-Standard, Spur 2 Überstand der stabil pCYTts504-Epo-transfizierten Zellen bei 37°C während 4 Tagen, Spur 3 Überstand der stabil pCYTts504-Epo-transfizierten Zellen bei 29°C während 4 Tagen, Spur 4 Marker.
  • 10 zeigt eine Punktauftragung von EPO. Die Stelle + zeigt den EPO-Standard, die Stellen 2 und 10 den Überstand von BHK-Zellen (2), die Stelle 3 die bei 30°C inkubierten GFP-exprimierenden BHK-Zellen, die Stelle 4 die bei 37°C inkubierten IC4-Zellen, die Stelle 8 den Überstand der mit CYTts504Epo-RNA enthaltenden viralen Partikeln infizierten BHK-Zellen, inkubiert bei 37°C nach 2 Tagen, die Stelle 9 den Überstand der mit CYTts504Epo-RNA enthaltenden viralen Partikeln infizierten BHK-Zellen, die bei 30°C während 2 Tagen inkubiert wurden.
  • 11 zeigt einen Überblick über eine Ausführungsform der Erfindung. Diese Ausführungsform betrifft die Herstellung von rekombinatem humanen EPO unter Verwendung von Wirtszellen, die mit verpackten RNA-Replikonen, die von der Nieren-(BHK)-Zelllinie IC4/4 des jungen Hamsters erzeugt werden, infiziert sind. Diese Zelllinie wurde entsprechend der nachstehenden Beschreibung in Beispiel 6 hergestellt.
  • 12 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform der Erfindung. Gemäß dem in dieser Figur beschriebenen Verfahren werden RNA-Replikone durch die stabile EPO-verpackende BHK-Zelllinie IC4/4 erzeugt und aus dem Kulturmedium isoliert.
  • Dann werden Wildtyp-BHK-Zellen, die entweder in serum- oder proteinfreien Kulturmedien kultiviert werden können, mit den Replikonen infiziert. Das durch die infizierten Zellen hergestellte Protein wird dann durch herkömmliche Verfahren gereinigt. Das in dieser Figur dargelegte Verfahren kann ohne weiteres zur Herstellung großer Mengen an humanem EPO oder anderen Proteinen auf einen größeren Maßstab übertragen werden.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Expressionsvektoren, die regulierbar und nicht zytopathisch sind, sowie Verfahren zur Verwendung dieser Vektoren für die Herstellung von Proteinen und interessierenden RNA-Molekülen.
  • Die Erfindung stellt Polynukleotide und Verfahren bereit, die die präzise Regulierung der Menge an spezifischen RNA-Molekülen, die in Wirtszellen hergestellt werden, erlauben. Diese präzise Regulierung resultiert aus der Verwendung einer temperaturempfindlichen RNA-abhängigen RNA-Polymerase, die bei permissiven Temperaturen nur RNA-Moleküle zur Bildung zusätzlicher RNA-Moleküle replizieren wird.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin induzierbare Genexpressionssysteme, die Alphavirus-DNA-Vektoren zur Erzeugung stabiler Zelllinien verwenden, die Gene tragen, die ein nicht zytopathisches temperaturempfindliches virales Nicht-Struktur-Replikaseprotein kodieren. Zum Beispiel wird die Aktivität der in den nachstehend dargestellten Beispielen verwendeten temperaturempfindlichen Replikase durch Verringerung der Temperatur der transfizierten Zellen von einer Temperatur von 37°C auf eine Temperatur von weniger als 34°C eingeschaltet. Die Wirtszellenexpression bei 37°C liegt unterhalb des Nachweisgehalts und das Inkubationsprofil ist von der chromosomalen Integrationsstelle abhängig.
  • Definitionen
  • Die folgenden Definitionen werden zur Klarstellung des Gegenstands, von dem die Erfinder meinen, dass er die vorliegende Erfindung sei, bereitgestellt.
  • Der Begriff „Alphavirus", wie er hier verwendet wird, betrifft alle RNA-Viren, die die Gattung Alphavirus umfasst. Beschreibungen der Elemente dieser Gattung sind in Strauss und Strauss, Microbior. Rev. 58: 491–562 (1994) enthalten. Beispiele von Alphaviren umfassen Aura-Virus, Bebaru-Virus, Cabassou-Virus, Chikungunya-Virus, östlichen Pferdeenzephalomyelitisvirus, Fort Morgan-Virus, Getah-Virus, Kyzylagach-Virus, Mayoaro-Virus, Middleburg-Virus, Mucambo-Virus, Ndumu-Virus, Pixuna-Virus, Tonate-Virus, Triniti-Virus, Una-Virus, westlicher Pferdeenzephalomyelitisvirus, Whataroa-Virus, Sindbis-Virus (SIN), Semliki Forest-Virus, venezolanischer Pferdeenzephalomyelitisvirus (VEE) und Ross River-Virus.
  • Wird der Begriff „gereinigt", wie er hier verwendet wird, in Bezug auf ein Molekül verwendet, so bedeutet dies, dass die Konzentration des zu reinigenden Moleküls im Vergleich zu Molekülen, die mit ihrer natürlichen Umgebung assoziiert sind, erhöht wurde. Natürlich assoziierte Moleküle umfassen Proteine, Nukleinsäuren, Lipide und Zucker, umfassen jedoch im Allgemeinen nicht Wasser, Puffer und Reagenzien, die zur Bewahrung der Unversehrtheit oder zur Vereinfachung der Reinigung des zu reinigenden Moleküls zugegeben wurden. Selbst wenn zum Beispiel mRNA mit einem wässrigen Lösungsmittel während einer Oligo-dT-Säulenchromatographie verdünnt wird, werden mRNA-Moleküle durch diese Chromatographie gereinigt, wenn natürlich assoziierte Nukleinsäuren und andere biologische Moleküle nicht an die Säule binden und von den betreffenden mRNA-Molekülen getrennt werden.
  • Der Begriff „isoliert", wie er hier verwendet wird, wird in Bezug auf ein Molekül verwendet, wobei der Begriff bedeutet, dass das Molekül aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde. Zum Beispiel ist ein in einem lebenden Tier natürlich vorhandenes Polynukleotid oder ein Polypeptid nicht „isoliert", jedoch ist dasselbe Polynukleotid oder Polypeptid, das von den coexistierenden Materialien seines natürlichen Zustands getrennt ist, „isoliert". Weiterhin wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung angenommen, dass in einem Vektor enthaltene rekombinante DNA-Moleküle isoliert sind. Isolierte RNA-Moleküle umfassen in vivo oder ex vivo RNA-Replikationsprodukte von DNA- oder RNA-Molekülen. Isolierte Nukleinsäuremoleküle umfassen weiterhin synthetisch hergestellte Moleküle. Zusätzlich sind Vektormoleküle, die in rekombinanten Wirtszellen enthalten sind, ebenfalls isoliert. Somit müssen nicht alle „isolierten" Moleküle „gereinigt" sein.
  • Der Begriff „gering oder nicht nachweisbar", wie er hier verwendet wird, bezieht sich bei Verwendung unter Bezugnahme auf Genexpressionsgehalte auf einen Expressionsgehalt, der entweder signifikant niedriger ist als derjenige, der beobachtet wird, wenn das Gen maximal induziert wird, (zum Beispiel bei einem um mindestens das fünffache niedrigeren Gehalt) oder der durch die im folgenden Beispielabschnitt verwendeten Verfahren nicht nachweisbar ist.
  • Der Begriff „Individuum", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf vielzellige Organismen und umfasst sowohl Pflanzen als auch Tiere. Bevorzugte vielzellige Organismen sind Tiere, bevorzugter sind Wirbeltiere, noch bevorzugter sind Säuger und besonders bevorzugt sind Menschen.
  • Der Begriff „cis-aktiv", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen, an die eine Replikase zum Katalysieren der RNA-abhängigen Replikation von RNA-Molekülen bindet. Diese Replikationsereignisse resultieren in der Replikation von RNA-Molekülen mit voller Länge und partiellen RNA-Molekülen und somit ist der Alphavirus-subgenomische Promotor ebenfalls eine „cis-aktive" Sequenz. Cis-aktive Sequenzen können sich am 5'-Ende, 3'-Ende oder beiden Enden oder in der Nähe davon sowie innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls befinden.
  • Der Begriff „RNA-abhängige RNA-Polymerase", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Polymerase, die die Herstellung eines RNA-Moleküls von einem anderen RNA-Molekül katalysiert. Dieser Begriff wird hier synonym mit dem Begriff „Replikase" verwendet.
  • Der Begriff „nicht infektiös verpackte RNA-Moleküle", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf verpackte RNA-Moleküle, die im Wesentlichen nur eine Runde einer Wirtszelleninfektion durchmachen und nicht pathogen sind. Diese Moleküle sind daher nur bezüglich eines einzigen Eindringens in eine Wirtszelle „infektiös" und sind nicht zur Reproduktion unter Bildung zusätzlicher infektiöser Partikel in der Lage.
  • Der Begriff „Transkription", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Herstellung von RNA-Molekülen von DNA-Templaten, die durch RNA-Polymerasen katalysiert wird.
  • Der Begriff „RNA-abhängiges RNA-Replikationsereignis", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Prozesse, die unter Verwendung eines RNA-Moleküls als Templat zur Bildung eines RNA-Moleküls führen.
  • Der Begriff „Vektor", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Mittel (zum Beispiel ein Plasmid oder Virus), das zum Übertragen von genetischem Material in eine Wirtszelle verwendet wird. Ein Vektor kann entweder aus einer DNA oder RNA zusammengesetzt sein.
  • Der Begriff „heterologe Sequenz", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine zweite Nukleotidsequenz, die in einem Vektor der Erfindung vorhanden ist. Der Begriff „heterologe Sequenz" bezieht sich ebenfalls auf jede Aminosäure oder RNA-Sequenz, die von einer in einem Vektor der Erfindung enthaltenen heterologen DNA-Sequenz kodiert wird. Heterologe Nukleotidsequenzen können Proteine oder RNA-Moleküle kodieren, die normalerweise in dem Zelltyp, in dem sie vorhanden sind, exprimiert werden, oder sie können Moleküle kodieren, die normalerweise nicht darin exprimiert werden (zum Beispiel Sindbis-Strukturproteine).
  • Der Begriff „nicht translatierte RNA", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine RNA-Sequenz oder ein Molekül, das keinen offenen Leserahmen oder einen offenen Leserahmen oder einen Teil davon in einer Form kodiert, wobei eine Aminosäuresequenz nicht hergestellt wird (zum Beispiel ist kein Startcodon vorhanden). Beispiele für derartige Moleküle sind tRNA-Moleküle, rRNA-Moleküle und Ribozyme. Antisense RNA kann nicht translatiert sein, jedoch kann in machen Fällen (siehe Beispiel 1) eine Antisense-Sequenz in einen translatierbaren Strang konvertiert werden, von dem ein Polypeptid hergestellt wird.
  • Der Begriff „Gentherapie", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Übertragung von heterologer genetischer Information in Zellen für die therapeutische Behandlung von Krankheiten oder krankhaften Störungen. Die heterologe Nukleotidse quenz wird in eine Zelle übertragen und zur Herstellung eines Polypeptids oder eines nicht translatierten RNA-Moleküls exprimiert.
  • Der Begriff „temperaturempfindlich", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Enzym, das bei einer Temperatur leicht eine Reaktion katalysiert, jedoch bei einer anderen Temperatur dieselbe Reaktion langsam oder überhaupt nicht katalysiert. Ein Beispiel für ein temperaturempfindliches Enzym ist das durch den pCYTts-Vektor kodierte Replikaseprotein, das eine leicht nachweisbare Replikaseaktivität bei Temperaturen unterhalb von 34°C aufweist und eine geringe oder nicht nachweisbare Aktivität bei 37°C aufweist.
  • Der Begriff „permissive Temperatur", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Temperaturen, bei denen ein Enzym relativ hohe Gehalte an katalytischer Aktivität aufweist.
  • Der Begriff „restriktive Temperatur", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Temperaturen, bei denen ein Enzym niedrige oder nicht nachweisbare Gehalte an katalytischer Aktivität aufweist. Sowohl „Hitze"- als auch „Kälte"-empfindliche Mutanten sind bekannt und somit kann eine restriktive Temperatur höher oder niedriger als eine permissive Temperatur sein.
  • Der Begriff „rekombinante Wirtszelle", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Wirtszelle, in die ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle der Erfindung eingeführt worden sind.
  • Werden die Begriffe „eines", „ein" oder „eine" in dieser Offenbarung verwendet, so bedeuten sie „zumindest eines" oder „ein oder mehrere", sofern es nicht anders angegeben ist.
  • Alphavirale Vektoren der Erfindung
  • Die DNA-Vektoren der vorliegenden Erfindung werden konstitutiv in Wirtszellen zur Herstellung von RNA-Molekülen mit zwei offenen Leserahmen transkribiert. Diese offenen Leserahmen, die von demselben Nukleinsäuremolekül erzeugt werden kön nen oder auch nicht, kodieren eine temperaturempfindliche Replikase und ein interessierendes heterologes Gen. Der erste offene Leserahmen wird zur Herstellung einer temperaturabhängigen RNA-abhängigen RNA-Polymerase translatiert. Der zweite offene Leserahmen, der das gesamte oder einen Teil von einem oder mehreren interessierenden Polypeptiden kodiert, wird bis nach zumindest einem RNA-abhängigen RNA-Replikationsereignis nicht translatiert.
  • Die DNA-Expressionsvektoren umfassen einen 5'-Promotor, der zur Initiierung der RNA-Synthese in vivo in der Lage ist, 5'- und/oder 3'-Sequenzen, die die Replikation des RNA-Moleküls ermöglichen (5'- und 3'-cis-aktive Sequenzelemente) sowie eine interessierende Sequenz, die nur nach mindestens einem Replikationsereignis translatierbar ist. Die Replikation wird durch eine regulierbare RNA-abhängige RNA-Polymerase katalysiert, die alternativ auf demselben oder einem davon verschiedenen mRNA-Molekül kodiert wird. Die interessierende Sequenz kann in Sense, plus (+) Orientierung stromabwärts eines viralen RNA-Promotors kodiert sein. Die Translation der kodierenden Sequenz des interessierenden Gens wird durch eine 5'-Sequenz inhibiert, die im Falle eines Einzelvektorsystems im Allgemeinen die Replikasesequenz sein wird. Im Mehrfachvektorsystem kann eine 5'-Sequenz die Translation inhibieren, indem sie einen oder mehrere kurze offene Leserahmen mit assoziierten Stoppcodonen aufweist, die zur Abtrennung von Ribosomen führen. Entsprechend kann jede Sequenz, die das Wandern oder Binden von Ribosomen an die interessierende Sequenz verhindert, als 5'-Sequenz verwendet werden, die die Translation hemmt (Voet und Voet, BIOCHEMISTRY, John Wiley & Sons, Inc. (1990)).
  • Ein weiteres Verfahren zur Verhinderung der Translation von Nukleotidsequenzen betrifft in den meisten biologischen Systemen die Insertion der Sequenz in Antisense-Richtung. Dieses Verfahren der Hemmung der Translation basiert auf dem Prinzip, dass eine Translation im Allgemeinen nur nach der Replikation dieser minus (–)Strang-RNA in eine plus-Strang-RNA mit einem offenen Leserahmen in Sense-Orientierung stattfindet. Der translatierte Sense-Strang wird durch RNA-Replikation gebildet und dient als Templat für Ribosomen und Proteinsynthese. Wie in Beispiel 11 gezeigt ist, kann die Herstellung von Aminosäuresequenzen stattfinden, selbst wenn das interessierende Gen in das DNA-Molekül in einer Orientierung eingeschoben wird, die zur Bildung einer Antisense-RNA-Sequenz 3' zu dem subgenomischen Promotor führt. Daher kann der zweite offene Leserahmen ebenfalls eine Sequenz umfassen, die zum gesamten oder einem Teil des vorstehend beschriebenen zweiten offenen Leserahmens komplementär ist, und die Expression der kodierten Aminosäuresequenz wird dennoch stattfinden. Ist die Herstellung einer nicht translatierten Antisense-RNA-Sequenz erwünscht kann das RNA-Molekül so entworfen werden, dass es nicht als Templat zur Proteinsynthese dient. Zum Beispiel kann die RNA so entworfen werden, dass ein Startcodon nicht vorhanden ist.
  • Nicht translatierte Antisense-RNA-Moleküle können zur Hemmung der Translation von mRNA, die in rekombinanten Wirtszellen exprimiert wird, verwendet werden. Die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen zur Regulierung der Genexpression ist aus dem Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Kawamata, H. et al., Br. J. Cancer 77: 71–78 (1998), Bechler, K., Biochem. Biophys. Res. Commun. 241: 193–199 (1997), Urakami, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 241: 24–30 (1997) und die Verwendung der vorliegenden Vektoren zur Abgabe derartiger Moleküle an Wirtszellen liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
  • Statt eines zweiten offenen Leserahmens können RNA-Moleküle, die durch Transkription einer DNA-Sequenz der Erfindung hergestellt werden, zusätzlich RNA-Sequenzen kodieren, die weder translatiert werden noch in Antisense-Orientierung vorhanden sind. Beispiele für derartige nicht translatierte RNA-Moleküle umfassen tRNA-Moleküle, rRNA-Moleküle und Ribozyme. Eine beachtliche Zahl von Ribozymsequenzen mit definierten katalytischen Aktivitäten ist aus dem Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Brown, J., Nucleic Acids Res. 26: 353–354 (1998), Xie, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13777–13781 (1997), Lavrovsky, Y. et al., Biochem. Mol. Med. 62: 11–22 (1997), Chapman, K. und Szostak, J. Chem. Biol. 2: 325–333 (1995)). Weiterhin wurden Ribozyme zum „Knockout" der Expression eines spezifischen Gens in eukaryotischen Zellen als Teil einer Ribozym-vermittelten Informationsdeletionsstrategie verwendet (Xie, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13777–13781 (1997)). Zusätzlich wurden alphavirale Replikone zur Expression eines funktionellen Ribozyms in Säugerzellen verwendet (Smith S. et al., J. Virol. 71: 9713–9721 (1997)). Die regulierte Expression derartiger Ribozyme und anderer nicht translatierter RNA-Moleküle liegt daher innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Die Erfindung wird durch das in 1 gezeigte Diagramm beispielhaft erläutert. Diese Ausführungsformen der Erfindung betreffen DNA-Vektoren, die zur Herstellung eines mRNA-Moleküls mit zwei offenen Leserahmen, die eine Replikase und ein interessierendes Gen kodieren, transkribiert werden. Die DNA-Vektoren enthalten eine Promotorsequenz, die die Transkription dieser Vektoren zur Herstellung von mRNA-Molekülen mit kodierenden Sequenzen für beide offene Leserahmen steuert. Die mRNA-Sequenzen des ersten offenen Leserahmens werden zur Herstellung einer Replikase, die für die Expressions der RNA-Sequenzen des zweiten offenen Leserahmens erforderlich ist, translatiert. Der zweite offene Leserahmen kodiert ein oder mehrere interessierende Proteine.
  • Weiterhin können sobald das erste mRNA-Molekül von dem DNA-Vektor transkribiert worden ist, zusätzliche RNA-abhängige RNA-Replikationsereignisse stattfinden, um die erste mRNA Sequenz zu amplifizieren und RNA-Moleküle mit einer Strangpolarität herzustellen, die zu der ersten mRNA-Sequenz entgegengesetzt ist.
  • Wie in 1 in den Abschnitten (7)–(8), (10) und (12)–(13) gezeigt ist, wird der zweite offene Leserahmen eines DNA-Moleküls der Erfindung nur nach einer teilweisen Replikation eines RNA-Moleküls von voller Länge exprimiert. Diese teilweise Replikation der RNA-Moleküle von voller Länge wird von einer Promotorsequenz gesteuert, die aus RNA besteht (zum Beispiel eine alphavirale subgenomische Promotorsequenz).
  • Obwohl das interessierende Gen durch dasselbe RNA-Molekül kodiert sein kann wie das Replikaseprotein, kann dieses Gen ebenfalls durch ein separates RNA-Molekül kodiert sein. Somit stellt die Erfindung weiterhin sowohl Einzel- als auch Mehrfachvektorsystems zum Exprimieren eines interessierenden Gens bereit.
  • In einem Einzelvektorsystem der Erfindung sind Sequenzen, die den ersten offenen Leserahmen kodieren und die zweite Nukleotidsequenz Komponenten desselben Nukleinsäuremoleküls. Somit sind alle der für eine regulierte Expression des interessierenden Gens erforderlichen Komponenten in einem einzelnen Nukleinsäuremolekül enthalten (das heißt eine DNA oder RNA).
  • In einem Mehrfachvektorsystem der Erfindung sind die Sequenzen, die den ersten offenen Leserahmen oder Unterabschnitte davon kodieren, und die zweite Nukleotidsequenz Komponenten unterschiedlicher Nukleinsäuremoleküle. Diese Mehrfachvektorsysteme können daher zwei oder mehrere Nukleinsäuremoleküle umfassen. Zum Beispiel können nsP2, nsP4 und das interessierende Gen jeweils von unterschiedlichen DNA-Vektoren kodiert werden. Weiterhin kann einer oder mehrere dieser DNA-Vektoren zur stabilen Integration in das Wirtszellengenom entworfen werden. Wird die Expression eines interessierenden Gens in einem Zelltyp erwünscht, der ein oder mehrere stabil integrierte DNA-Moleküle der Erfindung enthält, so wird die Expression des interessierenden Gens die Einführung von Nukleinsäuremolekülen (DNA oder RNA), die die Komponenten des Systems kodieren, in die Zellen erfordern, in denen das (die) integrierte(n) Molekül(e) nicht vorhanden ist.
  • Obwohl jeder funktionelle Promotor zum Steuern der Transkription der mRNA von dem DNA-Vektor verwendet werden kann, ist der Promotor vorzugsweise ein konstitutiver RNA-Polymerase II-Promotor (zum Beispiel der Rous-Sarkom-Virus- (RSV), Cytomegalievirus-(CMV), Affenvirus 40-(SV40), myeloproliferativer Sarkom-Virus-(MPSV), Glucocorticoid-, Metallothionein-, Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(HSVTK), menschlicher Immunschwächevirus-(HIV), Maus-Milchdrüsentumorvirus-(MMTV), menschlicher Polyomavirus BK-(BKV) oder muriner Moloney-Leukämievirus-(MuLV)Promotor). Zusätzliche Promotoren, die zur Verwendung bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Lee, A. et al., Mol. Cells 7: 495–501 (1997)), Artuc, M. et al., Exp. Dermatol. 4: 317–321 (1995)).
  • Der Vektor wird im Allgemeinen ebenfalls Selektionsmarker zum Klonieren und Amplifizieren der Vektorsequenzen in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen enthalten. Der pCYTts-Vektor enthält beispielsweise einen Ampicillinresistenzmarker zur positiven Selektion in bakteriellen Wirtszellen und einen E. coli Replikationsursprung (da heißt ColE1). Eine beträchtliche Zahl von Sequenzen, die zusätzliche Selektionsmarker und Replikationsursprünge kodieren, sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook, J. et al., Hrsg. MOLECULAR CLONING., A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), Ausubel, F. et al., Hrsg. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. (1997)).
  • Die das Replikaseprotein kodierenden Sequenzen, die 5'- und 3'-cis-aktiven Sequenzen (sofern vorhanden) und die den subgenomischen Promotor enthaltenden Junction-Sequenzen werden normalerweise von einem Virus, vorzugsweise einem Alphavirus, besonders bevorzugt vom Sindbis-Virus abgeleitet.
  • Bei Verwendung von Alphavirus-Replikaseproteinen ist es in den meisten Fällen erwünscht, den zytopathischen Phänotyp des Replikaseproteins zu einem nicht zytopathischen Phänotyp zu konvertieren. Bevorzugte Mutationen, die einen derartigen Phänotyp verleihen, sind im nsp2-Gen (zum Beispiel wird der Prolinrest bei der Position 726 durch einen Serinrest ersetzt). Aus dem Stand der Technik sind Mutationen bekannt, die das Replikaseprotein nicht zytopathisch machen (Weiss et al., J. Virol. 33: 463–474 (1980), Dryga et al., Virology 228: 74–83 (1997)). Diese Mutationen können durch eine Reihe von Mitteln, einschließlich der ortsspezifischen Mutagenese eingeführt werden.
  • Wie vorstehend bemerkt wurde, kann eine Mutation im nsp2-Gen eingeführt werden, wenn eine nicht zytopathische Sindbis-Virusreplikase bei der Ausübung der Erfindung verwendet wird. Eine derartige Mutation resultiert aus dem Austausch des Prolinresta bei der Position 726 gegen eine andere der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, wie zum Beispiel Serin (abgekürzt mit „Pro 726 Ser"). Alternativ dazu liegt jede andere Mutation, die das Replikasemolekül nicht zytopathisch macht, innerhalb des Umfangs der Erfindung. Der Erzeugung und die Identifizierung von Mutationen, die die Sindbis-Replikase nicht zytopathisch machen, sind ausführlicher an anderer Stelle beschrieben (Weiss et al., J. Virol. 33: 463–474 (1980), Dryga et al., Virology 228: 74–83 (1997), Patentanmeldung WO 97/38087). Weiterhin sind Verfahren zur Induktion derartiger Mutationen aus dem Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook, J. et al., Hrsg. MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), Ausubel, F. et al., Hrsg., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997)).
  • Die Temperaturempfindlichkeit (ts) kann zum Beispiel durch die Einführung einer Mutation im nsp4-Gen der Replikase verliehen werden. Mutationen, die einen temperaturempfindlichen Phänotyp bezüglich Replikaseaktivitäten verleihen, sind vorzugsweise in einem Protein in der Komplementationsgruppe F vorhanden (Lemm et al., J. Virol. 64: 3001–3011 (1990)). Zum Beispiel kann ein temperaturempfindlicher Phänotyp durch Austausch von Gly 153 von nsp4 gegen Glu verliehen werden. Zusätzlich kann jede andere Mutation, die die Replikaseaktivität temperaturempfindlich macht, bei der Ausübung der Erfindung verwendet werden. Verfahren zum Erzeugen und Identifizieren neuer temperaturempfindlicher Mutanten sind von Pfefferkorn (Burge und Pfefferkorn, Virol. 30: 204–213 (1966), Burge und Pfefferkorn, Virol. 30: 214–223 (1966) beschrieben worden. Weiterhin kann jedes Verfahren, das zum Herstellen und Identifizieren von ts-Mutanten, die eine temperaturempfindliche Regulierung der Replikaseaktivität gestatten, verwendbar ist, zum Erzeugen und Isolieren derartiger Mutanten verwendet werden.
  • Obwohl die meisten temperaturempfindlichen Mutanten „Hitze"-empfindlich sind, sind ebenfalls „Kälte"-empfindliche Mutanten bekannt (siehe zum Beispiel Schwer, B. et al., Nucleic Acids Res. 26: 803–809 (1998), Mathe, E. et al., J. Cell Sci. 111: 887–896 (1998), Doedens, J. et al., J. Virol. 71: 9054–9064 (1997), Patterson, B. et al., J. Biol. Chem. 272: 27612–27617 (1997)). Die temperaturempfindliche Replikase kann „Kälte"- oder „Hitze"-empfindlich sein und wird daher die RNA-Replikation nur bei Temperaturen entweder oberhalb oder unterhalb der restriktiven Temperaturen katalysieren. In einer Ausführungsform findet die RNA-Replikation nur bei Temperaturen von weniger als 34°C mit nachweisbaren Gehalten statt. In einer betreffenden Ausführungsform wird der pCYTts-Vektor oder eine Variante davon zum Exprimieren eines interessierenden eingeschobenen Gens verwendet, wobei die Expression durch Verringerung der Temperatur der den Vektor enthaltenden Zellen von 37°C auf eine Temperatur von weniger als ungefähr 34°C induziert wird. Wie in 4A–4B gezeigt wird liegen die permissiven Temperaturen für die durch den pCYTts-Vektor kodierte Replikase unterhalb von ungefähr 34°C. Weiterhin nimmt die Expression des interessierenden Gens zu, wenn die Temperatur von ungefähr 24°C erhöht wird, bis ein maximaler Expressionsgehalt bei ungefähr 29°C erreicht ist. Zusätzlich nimmt die Expression des interessierenden Gens zu, sowie die Temperatur von ungefähr 34°C absinkt. Somit sind die permissiven Temperaturen für die durch den pCYTts-Vektor kodierte Replikaseaktivität unterhalb von 34°C und umfassen Temperaturen unterhalb von 24°C sowie 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C und 33°C und dazwischen liegende gebrochene Temperaturwerte bis zu ungefähr 34°C.
  • Im Gegensatz zu allen früher bekannten regulierbaren DNA-Expressionssystemen ist der Grundexpressionsgehalt in rekombinanten Wirtszellen, die den pCYTSts-Vektor im inaktiven Zustand bei 37°C enthalten, unterhalb des Nachweisgehalts bei Verwendung von Standardverfahren (zum Beispiel diejenigen, die in den folgenden Beispielen verwendet werden). Dieser niedrige Expressionsgehalt wird aus den in 4A–4B, 8A–8B, 9 und 10 dargestellten Daten offensichtlich. Weiterhin scheint das temperaturabhängige Induktionsprofil der Genexpression von der chromosomalen Integrationsstelle und Kopienzahl unabhängig zu sein.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die interessierende Sequenz und nicht zytopathische regulierbare Replikase (zum Beispiel nsp2, welches die Mutation Pro 726 Ser trägt, und nsp4, welches die Mutation Gly 153 Glu trägt) durch zwei getrennte DNA-Vektoren kodiert. In einem solchen Fall trägt der die interessierende Sequenz tragende DNA-Vektor sowohl cis-aktive Sequenzen als auch eine 5'-Region, die die Translation der interessierenden Sequenz hemmt. Das nicht zytopathische regulierbare Replikasegen kann ebenfalls durch ein DNA-Molekül kodiert sein, das von dem die interessierende Sequenz tragenden verschieden ist. Die Replikation und Translation der interessierenden Sequenz in diesem Mehrfachvektorsystem ist wie in dem Einvektorsystem durch die Temperatur regulierbar.
  • Die Vektoren der Erfindung können ebenfalls zum Regulieren der Expression von mehr als einem interessierenden Gen verwendet werden. Zum Beispiel können rekombinante Wirtszellen mit mehr als einem Nukleinsäuremolekül der Erfindung transfiziert werden, wobei ein Nukleinsäuremolekül sowohl die Replikase als auch ein interessierendes Polypeptid kodiert, und zusätzliche Nukleinsäuremoleküle könnten zusätzliche interessierende Polypeptide kodieren. Werden entsprechend sowohl Nicht-Zytopathizität als auch Temperaturempfindlichkeit verleihende Mutationen verwendet, können Polypeptide kodierende Gene mit geeigneten Mutationen (zum Bei spiel Pro 726 Ser in nsp2 und Gly 153 Glu in nsp4) auf separaten Nukleinsäuremolekülen sein. Zusätzliche Variationen würden für den Fachmann offensichtlich sein.
  • Wie in Beispiel 11 gezeigt ist kann die interessierende Sequenz ebenfalls in Antisense-Richtung stromabwärts eines funktionellen Promotors (zum Beispiel der myeloproliferative Sarkom-Virus (MPSV)-Promotor) eingeschoben werden. Dieses Konstrukt wird zu einem plus (+)-Strang mit Sense-Polarität konvertiert, wie durch die Herstellung des interessierenden Proteins gezeigt wird. Diese Daten zeigen, dass Antisense-DNA-Fragmente mit der vorliegenden Erfindung zum Exprimieren funktioneller Polypeptide oder Unterabschnitten davon verwendet werden können. Diese Daten weisen weiter darauf hin, dass die 5'- und 3'-CSEs für die virale Transkription nicht notwendig sein könnten, wenn eine Antisense-DNA als Templat für die Transkription verwendet wird.
  • Die DNA-Moleküle der Erfindung können ebenfalls Verpackungssignale enthalten, die die Verpackung von RNA-Molekülen in virale Partikel steuern. Diese RNA-Moleküle können in Gegenwart eines Virus vom Wildtyp oder defekter Helfervirus-RNA verpackt werden. Eine signifikante Verbesserung wurde mit der Entwicklung defekter Helfer-RNA-Moleküle gemacht (Bredenbeek, P. et al., J. Virol. 67: 6439–6446 (1993)). Diese RNA-Moleküle enthalten cis-aktive Sequenzen, die zur Replikation des Transkriptionsprodukts mit voller Länge erforderlich sind, und subgenomische RNA-Promotorsequenzen, die die Expression der Strukturproteingene steuern. Zum Beispiel gestatten in Zellen, die sowohl RNA-Moleküle mit Verpackungssignalen als auch defektive Helfervirus-RNA enthalten, alphavirale Nicht-Strukturproteine die Replikation und Amplifikation der defektiven Helfervirus-RNA-Sequenzen, die zur Herstellung von Virion-Strukturproteinen translatiert werden. Da der Helfervirus-RNA Verpackungssignale fehlen werden diese Moleküle nicht in zusammengesetzte Virionen verpackt. Somit enthalten auf diese Weise hergestellte Virionpartikel im Wesentlichen nur RNA-Sequenzen, die das interessierende Gen kodieren, und im Allgemeinen andere Sequenzen, die zur temperaturempfindlichen Regulierung der Genexpression erforderlich sind. Diese nicht infektiösen verpackten RNA-Moleküle enthalten keine Sequenzen, die Virionstrukturproteine kodieren, und machen daher nur eine Runde der Wirtszelleninfektion mit und sind nicht pathogen.
  • Nicht infektiöse verpackte RNA-Moleküle können zum Infizieren einer Kultur geeigneter Wirtszellen einfach durch Zugabe der Partikel zu dem diese Zellen enthaltenden Kulturmedium verwendet werden. Die Herstellung nicht infektiöser alphaviraler Partikel ist in einer Reihe von Quellen, einschließlich „Sindbis Expression System", Fassung C (Invitrogen, Katalog Nr. K750-1) beschrieben.
  • Eine Verwendung dieses Systems richtet sich auf die temperaturabhängige Herstellung nicht infektiöser verpackter RNA-Moleküle. Diese verpackten RNA-Moleküle könne durch eine Anzahl von Mittel, einschließlich unter Verwendung rekombinanter Wirtszellen, die zwei unterschiedliche DNA-Moleküle enthalten (zum Beispiel ein DNA-Molekül der Erfindung und ein eine Helfervirus-RNA-Sequenz kodierendes DNA-Molekül), hergestellt werden. Zum Beispiel wird eines dieser DNA-Moleküle ein RNA-Molekül kodieren, das Verpackungssignalsequenzen, eine nicht zytopathische temperaturempfindliche Replikase kodierende Sequenzen und das interessierende Gen enthält. Das andere DNA-Molekül wird Sequenzen enthalten, die alphavirale Strukturproteine stromabwärts eines Alphavirus-subgenomischen Promotors kodieren. Unter Verwendung eines derartigen Systems werden virale Partikel, die nur RNA-Moleküle mit Verpackungssignalen enthalten, bei permissiven Temperaturen in rekombinanten Wirtszellen hergestellt. Dies geschieht deshalb, weil alphavirale Strukturproteine nur bei einer permissiven Temperatur hergestellt werden. Zusätzliche Variationen des Vorstehenden würden für den Fachmann offensichtlich sein.
  • Eine große Vielzahl von interessierenden Nukleotidsequenzen kann durch das Genexpressionssystem der Erfindung exprimiert werden. Diese Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Sequenzen, die Lymphokine, Zytokine, Toxine, Enzyme, Pro-pharmakon konvertierende Enzyme, Antigene, die Immunantworten stimulieren, einzelkettige Antikörper, Proteine, die Immunantworten stimulieren oder hemmen, Tumornekrosefaktoren und verschiedene Proteine mit therapeutischen Verwendungen (zum Beispiel Wachstumshormone und Regulierungsfaktoren) kodieren.
  • Wie in Beispiel 5 gezeigt ist können heterologe Sequenzen, die durch die Vektoren der Erfindung exprimiert werden, ebenfalls Erythropoietin (EPO) kodieren. EPO ist ein Glycoprotein, das zur Familie der Zytokine gehört, und es induziert die terminale Erythrozytenentwicklung. Dieses Protein reguliert die Herstellung roter Blutzellen.
  • Heterologe Sequenzen können ebenfalls ein Zytokin Lymphokin (zum Beispiel β-Interferon) kodieren. Die Hämatopoiese wird durch Lymphokine und Zytokine reguliert, die die Proliferation und/oder Differenzierung verschiedener hämopoetischer Zellen stimulieren. Repräsentative Beispiele für Zytokine und Lymphokine umfassen Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-3 (IL-3), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-7 (IL-7), Interleukin-8 (IL-8), Interleukin-9 (IL-9), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-11 (IL-11), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-14 (IL-14), Interleukin-15 (IL-15), Interleukin-16 (IL-16), Interleukin-17 (IL-17), der die Granulozytenkolonie stimulierende Faktor (G-CSF), der die Granulozyten-Makrophagenkolonie stimulierende Faktor (GM-CSF), der die Makrophagenkolonie stimulierende Faktor (M-CSF) und Interferone.
  • Heterologe Sequenzen können ebenfalls sezernierte Enzyme (zum Beispiel sezernierte alkalische Phosphatase), zytoplasmatische Enzyme (zum Beispiel grünes Fluoreszenzprotein) oder jede Zahl von anderen Proteinen mit therapeutischen Verwendungen (zum Beispiel menschliches Insulin, menschlicher Koagulationsfaktor VIII) kodieren.
  • Die Vektoren der Erfindung können ebenfalls zum Exprimieren einer heterologen Sequenz, die zytotoxische Polypeptide kodiert, verwendet werden. Zytotoxische Polypeptide haben die Funktion das Zellwachstum oder den Metabolismus direkt oder indirekt zu hemmen. Repräsentative Beispiele für Toxine umfassen Shigella Toxin, Ricin, Diphtheria Toxin, Cholera Toxin, Pseudomonas Exotoxin A und Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (HSVTK). Innerhalb anderer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kodiert die heterologe Sequenz ein ein Pro-pharmakon konvertierendes Enzym. Ein ein Pro-pharmakon konvertierendes Enzym aktiviert eine Verbindung mit geringer oder keiner Zytotoxizität in ein toxisches Produkt. Repräsentative Beispiele sind HSVTK, alkalische Phosphatase, Guaninphosphoribosyltransferase und Penicillin-V-Amidase. Beispiele für sowohl zytotoxische Polypeptide als auch Pro-pharmakon konvertierende Enzyme sind in zahlreichen Quellen, einschließlich der PCT/US97/06010, EP 0716148 und der WO 96/17072 erörtert.
  • Nukleotidsequenzen, die mit den Vektoren der Erfindung verwendet werden können, umfassen nicht translatierte RNA-Moleküle, wie zum Beispiel Antisense-Sequenzen, auf RNase P gerichtete Sequenzen, die eine Genherabregulierung induzieren, und Ribozyme. Smith S. et al. (J. Virol. 71: 9713–9721 (1997) beschreibt alphavirale Vektoren, die zum Exprimieren von Ribozymsequenzen verwendet werden.
  • Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können ebenfalls zum Exprimieren von so gut wie jedem Protein, einschließlich derjenigen, die noch nicht identifiziert worden sind aber durch Nukleotidsequenzen kodiert werden, die zum Beispiel in cDNA-Bibliotheken oder Wirtszellchromosomen enthalten sind, verwendet werden. Beispiele für derartige Proteine umfassen sezernierte Proteine und Proteine von verschiedenen Zellkompartimenten. Heterologe Sequenzen, die durch die Vektoren der Erfindung exprimiert werden, können Proteine und RNA-Moleküle von nicht humanen Spezies (zum Beispiel andere Säuger, Pflanzen, Pilze, Bakterien oder Viren) kodieren. Diese heterologe Sequenz kann weiterhin virale Membranproteine (zum Beispiel HIV gp160) oder virale Polyproteine (zum Beispiel Sindbis-Strukturproteine) kodieren.
  • Sequenzen der vorstehend beschriebenen Proteine können leicht aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich zum Beispiel der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), erhalten werden. Alternativ dazu können cDNA-Sequenzen, die die vorstehend erwähnten heterologen Sequenzen kodieren, aus Zellen erhalten werden, die derartige Sequenzen exprimieren. Verfahren zum Isolieren von sowohl genomischen als auch cDNA-Sequenzen, die die interessierenden Gene kodieren, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Celis, J., Hrsg. CELL BIOLOGY, Academic Press, 2. Auflage (1988) Sambrook, J. et al., Hrsg., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), Ausubel, F. et al., Hrsg. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1998)). mRNA kann zum Beispiel aus einer Zelle isoliert werden, die eine interessierende Sequenz exprimiert, worauf die interessierende Sequenz unter Verwendung von Oligo-dT-Primern, zufallsverteilt bindenden Primern, spezifischen Primern oder Kombinationen von allen, mit Umkehrtranskriptase umgekehrt transkribiert wird. Die cDNA-Sequenzen können dann durch PCR unter Verwendung von nachweislich hitze stabil lesenden Polymerasen amplifiziert werden. Alternativ dazu können synthetische DNA-Sequenzen mit den Vektoren der Erfindung konstruiert und exprimiert werden.
  • Zu den Vektoren der Erfindung können Nukleotidsequenzen addiert werden, was zur Erzeugung eines Fusionsproteins führt. Zum Beispiel können derartige Sequenzen Aminosäuresequenzen kodieren, die an ein Protein fusioniert werden, das durch ein interessierendes Gen kodiert wird, und die ein oder mehrere funktionelle Charakteristika dem Expressionsprodukt verleihen. Diese Aminosäuresequenzen umfassen Sequenzen, die auf das Genprodukt zum Ausführen aus der Zelle (zum Beispiel eine sekretorische Sequenz) oder zu einem subzellulären Kompartiment (zum Beispiel Kern) zielen. Derartige Aminosäuresequenzen umfassen weiterhin Sequenzen, die die Reinigung erleichtern (zum Beispiel eine sechs His-„Markierung"). In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz und der durch die fusionierte Sequenz vermittelten Funktion können die addierten Aminosäuresequenzen von dem Translationsprodukt gespalten oder nicht gespalten werden.
  • Fusionsproteine umfassen ebenfalls Proteine, die Domänen oder Regionen aufweisen, die von mehreren unterschiedlichen Proteinen stammen. Beispiele für ein derartiges Fusionsprotein sind diejenigen, die eine Domäne II von Pseudomonas Exotoxin, eine Domäne oder Aminosäuresequenz enthalten, die eine Bindungsaffinität für einen mit einem speziellen Zelltyp assoziierten Zelloberflächenrezeptor aufweisen, und eine weitere Aminosäuresequenz mit einer vorher ausgewählten biologischen Aktivität enthalten. Die Domäne II von Pseudomonas Exotoxin wird durch die Zellmembranen hinweg translozieren. Unter Verwendung dieses Systems können Fusionsproteine konstruiert werden, die an spezifische Zelltypen binden, die durch die zytoplasmatischen Membranen dieser Zellen translozieren und die vorher festgelegte intrazelluläre biologische Reaktionen katalysieren. Ein System von diesem Typ wird in Pastan et al., U.S. Patent Nr. 5,705,163 beschrieben. Verfahren zur Identifikation von Aminosäuresequenzen, die an spezifische Zelltypen binden, sind in Wu. A., Nature Biotech. 14: 429–431 (1996) beschrieben.
  • Die Vektoren der Erfindung können ebenfalls genetische Elemente enthalten, die zusätzliche funktionelle Charakteristika verleihen, wie zum Beispiel Selektionsmar ker, Sequenzen, die zu einer Wirtszellenamplifikation mit hoher Kopienzahl führen, und Sequenzen, die eine chromosomale Integration von Vektorsequenzen gestatten.
  • Marker zur Auswahl von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen, die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und umfassen Tetracyclin, Ampicillin, Neomycin und den Kanamycinresistenzmarker. DNA-Moleküle, die derartige Sequenzen enthalten, sind aus zahlreichen Quellen, einschließlich Stratagene (11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA) und Promega (2800 Woods Hollows Road, Madison, WI 53711, USA) erhältlich. Nukleotidsequenzen, die zu einer Amplifikation mit hoher Kopienzahl führen, sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen die ColE1-Sequenz, die in dem pCYTts-Vektor enthalten ist.
  • Rekombinante Wirtszellen
  • Eine Vielzahl verschiedener rekombinanter Wirtszellen, die die Vektoren der Erfindung enthalten, kann hergestellt werden. Von Alphaviren ist bekannt, dass sie einen großen Bereich an Wirten aufweisen. Der Sindbis-Virus infiziert zum Beispiel kultivierte Säuger-, Reptilien- und Amphibienzellen sowie einige Insektenzellen (Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51: 645 (1973), Leake, C., J. Gen. Virol. 35: 335 (1977), Stollar, V., in THE TOGAVIRUSES, R. W. Schlesinger, Hrsg., Academic Press (1980), Seiten 583–621). Somit können bei der Ausübung der Erfindung zahlreiche rekombinante Wirtszellen verwendet werden. BHK-, COS-, Vero-, HeLa- und CHO-Zellen sind besonders zur Herstellung heterologer Proteine geeignet, weil sie das Potential zum Glycosylieren heterologer Proteine auf eine Weise, die zu derjenigen von menschlichen Zellen ähnlich ist, haben (Watson, E. et al., Glycobiology 4: 227 (1994)) und sie können so ausgewählt (Zhang, M. et al., Bio/Technology 13: 389 (1995)) oder genetisch verändert (Renner W. et al., Biotech. Bioeng. 47: 476 (1995), Lee K. et al., Biotech Bioeng. 50: 336 (1996)) werden, dass sie in serumfreiem Medium sowie in Suspensionen wachsen.
  • Sollen rekombinante Wirtszellen, die zur Expression eines interessierenden Gens in der Lage sind, in ein Individuum inseriert werden, werden diese Zellen im Allgemeinen entweder von einem anderen Individuum derselben Gattung und Spezies oder von demselben Individuum sein, in das die Zellen inseriert werden sollen. Zellen können von einem Individuum durch jede Zahl von Mittel, einschließlich chirurgischer Mittel und Gewebebiopsie erhalten werden.
  • Die Einführung von Polynukleotidvektoren in Wirtszellen kann durch Verfahren, die in Standardlaborhandbüchern beschrieben sind (siehe Sambrook, J. et al., Hrsg., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), Kapitel 9, Ausubel, F. et al., Hrsg., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), Kapitel 16), einschließlich Verfahren, wie zum Beispiel Elektroporation, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Transfektion, Mikroinjektion, kationische Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Beladung durch Einritzen, ballistische Einführung und Infektion, ausgeführt werden. Verfahren für die Einführung exogener DNA-Sequenzen in Wirtszellen werden in Felgner, P. et al., U.S. Patent Nr. 5,580,859 erörtert.
  • Nicht infektiös verpackte RNA-Sequenz können ebenfalls zur Infektion von Wirtszellen verwendet werden. Diese verpackten RNA-Sequenzen können durch deren Zugabe zu dem Kulturmedium in Wirtszellen eingeführt werden.
  • Wie vorstehend bemerkt ist, können die Vektoren der Erfindung ebenfalls genetische Elemente enthalten, die eine chromosomale Integration von Vektorsequenzen gestatten. Derartige Elemente sind für die stabile Erhaltung heterologer Sequenzen verwendbar und umfassen Sequenzen, die sowohl eine ortsspezifische als auch ortsunabhängige Integration verleihen. Die ortsspezifische Integration (zum Beispiel homologe Integration) und ortsunabhängige Integration, die manchmal als „statistische Integration" bezeichnet wird, können zur Einführung interessierender heterologer Sequenzen in eukaryotische Chromosomen verwendet werden. Beschreibungen und Verfahren zur Insertion genetischen Materials in eukaryotische Chromosomen sind aus zahlreichen Quellen, einschließlich Sambrook, J. et al., Hrsg. (MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)) erhältlich.
  • Herstellung von Polypeptiden und RNA-Molekülen
  • Die Vektoren und rekombinanten Wirtszellen der Erfindung können zur Herstellung von Polypeptiden und RNA-Molekülen verwendet werden. Somit stellt die Erfindung Verfahren zur regulierten Expression von Polypeptiden oder RNA-Molekülen in Wirtszellen bereit, umfassend den Schritt des Einführens von Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen und des Regulierens der Temperatur, um entweder die Herstellung von den die interessierenden Sequenzen kodierenden RNA-Molekülen zu unterdrücken oder zu induzieren.
  • Rekombinante Wirtszellen, die ein interessierendes Gen exprimieren, werden im Allgemeinen entweder dieses Gen in Individuen (ausführlicher nachstehend beschrieben) oder in in vitro Kulturen exprimieren.
  • Werden Säugerzellen als rekombinante Wirtszellen zur Herstellung von Polypeptiden und RNA-Molekülen verwendet, werden diese Zellen im Allgemeinen in Gewebekultur vermehrt. Verfahren zur Vermehrung von Zellen in Kultur sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Celis, J., Hrsg., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2. Auflage, (1998), Sambrook, J. et al., Hrsg., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), Ausubel, F. et al., Hrsg., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), Freshney, R., CULTURE OF ANIMAL CELLS, Alan R., Liss. Inc. (1983)).
  • Die Auswahl einer für eine spezielle Verwendung geeignete Wirtszelle wird sich mit einer Reihe von Faktoren, einschließlich des Polypeptids oder RNA-Moleküls, das exprimiert wird, ändern. Wird zum Beispiel ein Glycoprotein hergestellt, ist es im Allgemeinen erwünscht, dass dieses Protein in einem Zelltyp exprimiert wird, der das Protein auf eine Art glycosyliert, die zu derjenigen von natürlichem Protein ähnlich ist.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden und RNA-Molekülen bereit, umfassend das Einführen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in rekombinante Wirtszellen und das Inkubieren dieser Zellen bei einer permissiven Temperatur. In einem entsprechenden Aspekt stellt die Erfin dung gereinigte Polypeptide und RNA-Moleküle bereit, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden.
  • In Abhängigkeit von dem Molekül, das exprimiert wird, kann das Molekül entweder vom Kulturüberstand oder durch Lysieren der rekombinanten Wirtszellen erhalten werden. Ist das Expressionsprodukt ein Protein, ist es häufig möglich, das Expressionsprodukt von dem Kulturüberstand zu erhalten. Dies ist selbst dann der Fall, wenn das Protein kein natürlich assoziiertes Sekretionssignal aufweist. Codone, die ein derartiges Signal kodieren, können an die Vektorsequenzen der Erfindung addiert werden und werden zur Expression eines Fusionsproteins führen, das aus der rekombinanten Wirtszelle ausgeschieden wird. Nukleotidsequenzen, die derartige Signalsequenzen kodieren, sind aus dem Stand der Technik bekannt und öffentlich verfügbar (siehe zum Beispiel pPbac- und pMbac-Vektoren, Stratagene 1997/1998 CATALOG, Katalog #211503 und #211504, Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA).
  • Wirtszellen können ebenfalls mit verpackten oder nicht verpackten RNA-Molekülen, die entweder von den DNA-Molekülen der Erfindung transkribiert oder von derartig transkribierten Molekülen repliziert worden sind, infiziert werden. Weiterhin können diese Wirtszellen bei einer restriktiven Temperatur infiziert werden und später auf eine permissive Temperatur zur Aktivierung des interessierenden Gens gebracht werden. Das interessierende Genprodukt kann dann gewonnen und durch alle geeigneten Mittel gereinigt werden.
  • Das von dem interessierenden Gen exprimierte Protein kann aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, einschließlich der Ammoniumsulfatfällung, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie gewonnen und gereinigt werden. Verfahren zur Reinigung von Proteinen sind in zahlreichen Quellen beschrieben (siehe zum Beispiel Celis, J., Hrsg., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2. Auflage, (1988)).
  • Verfahren zur Reinigung von RNA-Molekülen sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Celis, J., Hrsg., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2. Auflage (1998)). Diese Verfahren umfassen die Phenol/Chloroform-Extraktion, Verdau mit DNAsen, gefolgt von Fällung der unverdauten RNA-Molekülen, und Säulenchromatographie (zum Beispiel Oligo-dT-Säulenchromatographie). Weiterhin können RNA-Moleküle von anderem Zellmaterial unter Verwendung des einstufigen Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahrens, das in Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987) beschrieben ist, getrennt werden.
  • Eine Anzahl verschiedener biologischer Prozessparameter kann zur Erhöhung der Menge an Expressionsprodukt, das während des Zellkultivierungsverfahrens hergestellt wird, variiert werden. Die Bedingungen, unter denen die Wirtszellen vermehrt werden (zum Beispiel Mediumzusammensetzung, pH-Wert, Sauerstoffkonzentration, Rühren und im Falle von adhäsionsabhängigen Zellen, die bereitgestellte Oberfläche und der Träger dieser Oberfläche) beeinflussen vor dem Aussetzen gegenüber Nukleinsäuremolekülen der Erfindung oder Induktion der Genexpression sowohl die zu einer gegebenen Zeit erreichte Zelldichte als auch den physiologischen Zustand der Zellen. Diese Kultivierungsbedingungen werden daher die erwartete zelluläre Antwort bezüglich der Vektoraussetzung oder des Induktionssignals beeinflussen (zum Beispiel Einstellung auf eine permissive Temperatur). Weiterhin können die vorstehend erwähnten Zellkultivierungsverfahrensbedingungen zur Maximierung der Herstellung des Expressionsprodukts und häufig der Charakteristika (zum Beispiel Glycosylierungsmuster) dieses Expressionsprodukt variiert werden.
  • Das gesamte Zellkultivierungsverfahren, das die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung Herstellung des Expressionsprodukts verwendet, kann mit einer Vielzahl von Bioreaktorkonfigurationen (zum Beispiel Rührtankreaktor, Perfusionsreaktor, Membraneingeschlossener Reaktor, eingekapselter Zellenreaktor, Fließbettreaktor und Airlift-Reaktor) durchgeführt werden, die so gewählt werden, dass sie sich den Anforderungen der verwendeten Wirtszelllinie (zum Beispiel Adhäsionsabhängigkeit, O2-Konzentrationen) unter Maximierung der Herstellung des Expressionsprodukts und unter Erleichterung der nachfolgenden Gewinnung und Reinigung des Expressionsprodukts anpassen.
  • Der Erfindung betrifft ebenfalls die Herstellung von Proteinen oder interessierenden RNA-Molekülen unter Verwendung von Säugerzellen, die in serumfreien oder proteinfreien Kulturmedien vermehrt wurden. Beispielsweise durch Langzeitkultur unter Bedingungen, die den Serumzugang beschränken oder bezüglich eines Suspensionswachstums auswählen. Es werden CHO-Zelllinien ausgewählt, die zur Vermehrung in serumfreiem Medium und/oder in Suspension in der Lage sind (Zang, M. et al., Bio/Technology 13: 389 (1995)). Weiterhin wurde durch genetische Modifikation von CHOK1-Zellen eine mit CHOK1:cycE bezeichnete modifizierte Zelllinie erhalten, die als suspendierte einzelne Zellen in proteinfreien Kulturmedien wachsen (Renner W. et al., Biotech. Bioeng. 47: 476 (1995)). Es wurden ebenfalls CHO-Mutanten (zum Beispiel LEC10-Zellen isoliert, die Glycoproteine mit Glycosylierungsmustern erzeugen, die zu den in parenteralen CHO-Zellen erzeugten verschieden sind (Stanley, P., Glycobiology 2: 99 (1992)). Alternativ dazu können CHO-Zellen, die zur Synthese von Glycoproteinen mit entsprechend modifizierten Oligosacchariden in der Lage sind, durch genetische Modifikationen erhalten werden, die die Aktivitäten von Enzymen, die mit der Oligosaccharidbiosynthese zu tun haben, ändern (Minch et al., Biotechnol. Prog. 11: 348 (1995)).
  • Weiterhin kann eine Anzahl verschiedener Bioprozessparameter variiert werden, um das Glycosylierungsmuster von Polypeptidprodukten, die durch die rekombinanten Wirtszellen der Erfindung erzeugt werden, zu ändern. Diese Faktoren umfassen die Mediumzusammensetzung, pH-Wert, Sauerstoffkonzentration, fehlendes oder vorhandenes Rühren und, für den Fall von adhäsionsabhängigen Zellen, die bereitgestellte Oberfläche. Somit kann das Glycosylierungsmuster von Glycoproteinen durch die Wahl der Wirtszelle, in der diese Proteine exprimiert werden, und der Bedingungen, unter denen die rekombinanten Wirtszellen vermehrt werden, geändert werden.
  • Wie nachstehend erklärt ist, können ebenfalls interessierende Polypeptide und RNA-Moleküle in genetisch veränderten nicht humanen Lebewesen hergestellt werden.
  • Gentherapie
  • Die Vektoren der Erfindung sind ebenfalls zur Gentherapie verwendbar. Werden die Vektoren der vorliegenden Erfindung in Zellen zur Gentherapie eingeführt, werden im Allgemeinen die verwendeten Verfahren und Vektoren für die stabile Übertragung von Vektorsequenzen in die rekombinanten Wirtszellen sorgen. In solchen Fällen werden die Vektorsequenzen in der Wirtszelle bewahrt und in Zellabkömmlinge übertragen. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass der Einschluss langer terminaler Wiederholungen von Retroviren in Gentransfervektoren eine stabile Erhaltung der Vektorsequenzen in rekombinanten Wirtszellen vermittelt (Peng, L. et al., J. Surg. Res. 69: 193–198 (1997), Qing, K. et al., J. Virol. 71: 5663–5667 (1997)). Somit ist die chromosomale Integration von Vektorsequenzen ein Mechanismus, durch den derartige Sequenzen stabil in rekombinanten Wirtszellen bewahrt werden können. Diese Sequenzen können in Wirtszellchromosomen entweder ohne Rücksicht auf den chromosomalen Ort oder bei einem oder mehreren spezifischen chromosomalen loci (zum Beispiel homologe Rekombination) integrieren. Diese rekombinanten Wirtszellen können dann in vitro kultiviert werden oder in ein Individuum eingeführt werden.
  • Die Erfindung stellt Verfahren zum Exprimieren einer interessierenden Sequenz in einem Individuum zur Herstellung eines interessierenden Polypeptids oder RNA-Moleküls bereit, umfassend das Einführen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in Wirtszellen des Individuums und das Regulieren der Temperatur der rekombinanten Wirtszellen. Zum Beispiel können Vektoren der Erfindung, die eine „Hitze"-empfindliche Replikase exprimieren und eine Sequenz enthalten, die ein interessierendes Polypeptid oder eine RNA kodiert, in menschliche Keratinozyten, epitheliale Zellen oder Fibroblasten in vitro eingeführt werden und dann wiederum in eine menschliche Versuchsperson eingeführt werden. IN einem solchen Fall findet die Expression des interessierenden Polypeptids oder der RNA statt, wenn die Temepratur der diese Zellen enthaltenden Gewebe auf eine permissive Temperatur erniedrigt wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Verabreichung von Polypeptiden oder RNA-Molekülen an Individuen, die diese benötigen, bereit, umfassend das Einführen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in Wirtszellen, das Einführen der resultierenden rekombinanten Wirtszellen in diese Individuen und die Induktion der Expression der interessierenden Polypeptide oder RNA-Moleküle. Entsprechend können Nukleinsäuremoleküle der Erfindung von Wirtszellen in Wirtszellen eines Individuums in vivo eingeführt werden.
  • Die Induktion der Genexpression in Individuen findet durch Änderung der Temperatur von einer restriktiven zu einer permissiven statt. Ist das eine Gentherapie durchmachende Individuum ein Mensch und ist eine Aktivierung der Expression des interessierenden Gens nur zu spezifischen Zeiten erwünscht, wird normalerweise 37°C eine restriktive Temperatur sein und eine Geninduktion wird aus dem Erhöhen oder Erniedrigen der Temperatur auf eine permissive resultieren. Auf ähnliche Weise wird, wenn eine Inaktivierung der Expression des interessierenden Gens nur zu spezifischen Zeiten erwünscht ist, normalerweise 37°C eine permissive Temperatur sein und die Geninaktivierung wird aus dem Erhöhen oder Erniedrigen der Temperatur auf eine restriktive Temperatur resultieren.
  • Die in ein Individuum eingeführten rekombinanten Wirtszellen können von jedem Zelltyp sein, der mindestens zeitweise in dem Individuum bewahrt wird, oder von jedem Zelltyp, der zeitweise bewahrt wird und mindestens zeitweise Nukleotidsequenzen der Erfindung bewahrt und exprimiert. Ist das Individuum, in das die rekombinanten Wirtszellen eingeführt werden ein Mensch, können die Wirtszellen von jedem Typ sein, der in ein Gebiet implantiert werden kann, in dem die Temperatur zwischen einer perimissen und einer restriktiven durch äußere Mittel verändert werden kann. Die rekombinanten Wirtszellen können zum Beispiel Keratinozyten, epitheliale Zellen oder Fibroblasten sein, die aus einem Individuum entfernt worden sind, mit einem Vektor der vorliegenden Erfindung transfiziert und in ein Gebiet nahe der Oberfläche, wo die Hauttemperatur normalerweise bei 37°C (zum Beispiel eine Achselhöhle) oder in der Nähe davon liegt, reimplantiert worden sind. In einem solchen Fall kann die Genexpression durch Änderung der Temperatur der Gewebe, die die rekombinanten Keratinozyten oder Fibroblasten enthalten, auf eine permissive aktiviert werden (zum Beispiel durch Legen eines Eisbeutels oder Peltierelements über den die rekombinanten Wirtszellen enthaltenden Ort). Somit erfordert die Induktion der Expression des interessierenden Gens, dass die Temperatur von nur einem Teil des Körpers des Individuums (zum Beispiel Achselhöhle, Arm, Bein, Fuß, Halsregion, usw.) von einer restriktiven zu einer permissiven geändert wird.
  • Rekombinante Wirtszellen können ebenfalls in Säugern an Orten unterhalb der Oberfläche dermaler Gewebe implantiert werden. Ein Vorteil zur Einführung rekombinanter Wirtszellen in derartige Regionen leitet sich davon ab, dass die Temperaturen dieser Gewebe stabiler gehalten wird als dermale Oberflächengewebe und somit ist es weniger wahrscheinlich, dass die Genexpression durch Faktoren, wie zum Beispiel Änderungen der klimatischen Bedingungen, aktiviert wird. Obwohl die Stellen geeigneter Regionen mit einer Zahl von Faktoren, einschließlich des Individuums und der normalen Körpertemperatur des Individuums, variieren, werden geeignete Gewebe im Allgemeinen Haut-, Nerven- und Muskelgewebe umfassen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids oder RNA-Moleküls an ein Individuum, das diese benötigt, bereit, umfassend die in vivo Einführung von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in Wirtszellen des Individuums und der Induktion der Expression heterologer Polypeptide oder RNA-Moleküle, die durch diese Nukleinsäuremoleküle kodiert werden. Verfahren für die in vivo Einführung von alphaviralen Vektoren in Säugergeweben sind in Altman, Hamamdzic S. et al. (Gene Ther. 4: 815–822 (1997)) beschrieben.
  • In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids oder RNA-Moleküls an ein Individuum, das diese benötigt, durch Einführen von RNA-Molekülen in die Zellen des Individuums bereitgestellt. Diese RNA-Moleküle können durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich der in vitro Trankription und rekombinanten Wirtszellenexpression, erhalten werden. Die RNA-Moleküle können in Zellen des Individuum entweder in vitro oder in vivo eingeführt werden. Verfahren zur Einführung von RNA-Sequenzen in Wirtszellen von Individuen sind in Felgner, P. et al., U.S: Patent Nr. 5,580,859 beschrieben.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls nicht infektiöse verpackte RNA-Moleküle bereit, die eine temperaturempfindliche Replikase kodieren, die als Gentherapievektoren verwendbar sind. Diese Vektoren weisen die Vorteile auf, dass die nicht infektiös, nicht integierend sind und das interessierende Gen auf temperaturempfindliche Weise exprimieren. Vektoren von diesem Typ sind für eine Vielzahl von Verwendungen nützlich, bei denen eine einzelne Verabreichung des interessierenden Genprodukts erwünscht ist (zum Beispiel eine Impfstoffverabreichung).
  • Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind für die regulierte Expression stabil integrierter heterologer Sequenzen in Individuen verwendbar. In einer Verwendung werden Keratinozyten oder Fibroblasten eines menschlichen Individuums, das an Diabetes leidet, durch Gewebebiopsie entfernt. DNA-Moleküle der Erfindung, die eine menschliches Insulin kodierende interessierende Sequenz enthalten, werden eingeführt und stabil in diese Zellen in vitro integriert. Diese rekombinanten Wirtszellen werden an einem Ort nahe der Oberfläche, an dem die Körpertemperatur relativ stabil gehalten wird (zum Beispiel die Achselhöhle) reimplantiert. Vor einer Mahlzeit oder zu einem anderen Zeitpunkt, zu dem eine Insulinproduktion erwünscht ist, legen die Individuen Eisbeutel oder ein Peltierelement während einer spezifizierten Zeitdauer über den Ort, der die rekombinanten Wirtszellen enthält, um die Expression der heterologen Insulin-kodierenden Sequenzen zu induzieren. Weiterhin kann von dem Individuum ein warmer Gegenstand verwendet werden, um die Temperatur auf eine permissive zu erhöhen, wenn eine kältempfindliche Replikase verwendet wird.
  • Die tatsächliche Temperatur des Gegenstands, der in Kontakt mit der Haut gebracht wird, wird mit der Art der verwendeten temperaturempfindlichen Mutation, dem Individuum, dem Ort der rekombinanten Wirtszellen, dem Gehalt an erwünschter Genexpression und anderen Faktoren variieren.
  • Genetisch veränderte nicht humane Lebewesen
  • Genetisch veränderte Lebewesen werden derzeit zur Herstellung heterologer Proteine verwendet (siehe zum Beispiel Jeng, S. et al., J. Dairy Sci. 80: 3167–3175 (1997), Limonta J. et al., Immunotechnology 1: 107–113 (1995)). Diese Proteine werden häufig aus Körperflüssigkeiten, wie zum Beispiel Blut, Milk und Urin geerntet (Meade, H. et al., Nat. Biotechnol. 16: 21–22 (1998), Kerr, D. et al., Nat. Biotechnol 16: 75–79 (1998)).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls genetisch veränderte nicht humane Lebewesen bereit, umfassend Zellen, die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung enthalten. Diese Lebewesen werden im Allgemeinen ein oder mehrere DNA-Moleküle der Erfindung aufweisen, die in ihre somatischen und Keimbahnzellen sta bil integriert sind. Aus dem Stand der Technik ist eine Zahl von Verfahren zur Herstellung von Lebewesen mit DNA-Molekülen der Erfindung in ihren Keimbahnzellen bekannt (siehe zum Beispiel Hew, C. et al., U.S. Patent Nr. 5,545,808, Jolicoeur, P., U.S. Patent Nr. 5,574,206, Mintz, B., U.S. Patent Nr. 5,550,316, Wagner, T. et al., U.S. Patent Nr. 4,873,191). Zum Beispiel können DNA-Moleküle durch Mikroinjektion in eine befruchtete Eizelle eines Säugers zwischen dem Einzellen- und Achtzellenstadium der embryonalen Entwicklung eingeführt werden. Dann werden diese Eizellen in ein geeignetes weibliches Lebewesen zur Herstellung von Stammlebewesen implantiert, die das heterologe Transgen stabil durch die Keimbahn auf die nächste Generation übertragen werden. Im Allgemeinen wird eine Southern-Blot-Analyse zur Bestimmung verwendet, ob das Genom eines beliebigen speziellen Individuums die heterologe DNA-Sequenz trägt.
  • Die genetisch veränderten Lebewesen können ebenfalls Nukleinsäuremoleküle der Erfindung ausschließlich in somatischen Zellen enthalten. Die diese Moleküle enthaltenden Wirtszellen können in das Tier implantiert oder die Nukleinsäuremoleküle können in Wirtszellen des Lebewesens in vivo eingeführt werden.
  • Die Expression des interessierenden Gens in den Zellen eines genetisch veränderten Lebewesens kann durch Änderung der Körpertemperatur des gesamten oder eines Teils des Lebewesens von einer restriktiven zu einer permissiven induziert werden. Somit wird die Wahl des verwendeten Lebwesens mit einer Anzahl von Faktoren, einschließlich der restriktiven und permissiven Temperaturen der verwendeten Replikase, der normalen Körpertemperatur des genetisch zu verändernden Lebwesens und des interessierenden Gens, variieren. Diese Lebewesen können entweder Warm- oder Kaltblütler sein. Zum Beispiel beschreibt Hew, C. et al. (U.S. Patent Nr. 5,545,808) die Herstellung von transgenem Fisch, der an einen „Antigefrier"-Genpromotor gebundene Nukleotidsequenzen exprimiert. Die Expression einer interessierenden Sequenz in einem derartigen Lebewesen, das ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung enthält, kann durch Änderung der Wassertemperatur des Fischs, in dem der Fisch gehalten wird, zwischen restriktiven und permissiven Temperaturen reguliert werden.
  • Enthält ein warmblütiges Lebwesen ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, kann die normale Körpertemperatur des Lebewesens entweder eine restriktive oder permissive sein. Weiterhin wird in vielen Fällen die Expression des interessierenden Gens in nur einem Teil des Lebwesens zu einem Zeitpunkt entweder induziert oder gehemmt sein. Ist zum Beispiel die normale Körpertemperatur eines warmblütigen Lebewesens eine restriktive Temperatur und ist die temperaturempfindliche Replikase „Hitze"-empfindlich, kann das Lebewesen unter Bedingungen gehalten werden, wobei die Temperatur seiner Extremitäten (zum Beispiel Füße, Arme, Beine, u.s.w.) oder Oberflächengewebe auf eine permissive erniedrigt wird.
  • Weist ein warmblütiges Lebewesen mit Zellen, die ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung enthalten, eine normale Körpertemperatur auf, die eine permissive ist, wird das interessierende Gen im Allgemeinen in Zellen in inneren Regionen des Lebewesens exprimiert. Derartige Lebewesen sind insbesondere zur Expression des interessierenden Gens in Milchdrüsen und urothelialen Geweben verwendbar. Kerr, D. et al. (Nat. Biotechnol. 16: 75–79 (1998)) beschreibt zum Beispiel die Herstellung transgener Tiere, die in den Zellen ihres Urothels fremde Gene exprimieren. Diese Lebewesen scheiden das fremde Genprodukt in ihrem Urin aus. Somit kann das Produkt des interessierenden Gens leicht von derartigen Lebewesen gesammelt werden. Ähnlich kann die Expression des interessierenden Gens in Milchdrüsengeweben dazu führen, dass das Genprodukt in der Milch des Lebewesens ausgeschieden wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher weiterhin genetisch veränderte nicht humane Lebewesen bereit, die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung in mindestens einigen ihrer Zellen enthalten. Ebenfalls werden genetisch veränderte nicht humane Lebewesen bereitgestellt, die DNA-Moleküle der Erfindung enthalten, die in das Genom einiger oder aller Zellen des Lebewesens stabil integriert sind. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Herstellung genetisch veränderter nicht humaner Lebewesen bereit, umfassend das Einführen von Zellen, die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung enthalten, in diese Lebewesen, das Einführen von Nukleinsäuremolekülen der Erfindung in die Zellen dieser Lebewesen in vivo oder das Einführen von DNA-Molekülen der Erfindung in Keimbahnzellen zur Herstellung transgener Lebewesen, die die interessierende Sequenz in ihren somatischen und Keimbahnzellen enthalten.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die Erfindung stellt weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend Polynukleotide der Erfindung in Lösung mit einem physiologisch verträglichen Träger und in einer therapeutisch wirksamen Menge. Die Verabreichung dieser pharmazeutischen Zusammensetzungen kann zum Beispiel zur Expression eines Polypeptids in Geweben eines Lebewesen führen, das immunogen ist, und soll als Impfung wirken. Ähnlich kann die interessierende Sequenz Polypeptide oder RNA-Moleküle kodieren, die zur Behandlung eines aktiven Leidens erforderlich sind. Die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung soll daher in diesen Fällen eine therapeutische Wirkung aufweisen.
  • Die Nukleinsäuremoleküle und rekombinanten Wirtszellen der Erfindung werden normalerweise einem Individuum in einem pharmakologisch verträglichen Träger verabreicht. Eine Zusammensetzung wird als „pharmakologisch verträglich" bezeichnet, wenn ihre Verabreichung von einem Empfängerindividuum toleriert wird. Weiterhin wird die Zusammensetzung der Erfindung in einer „therapeutisch wirksamen Menge" (das heißt, eine Menge, die eine gewünschten physiologische Wirkung erzeugt) verabreicht.
  • Werden DNA-Moleküle oder rekombinante Wirtszellen der Erfindung einem Individuum verabreicht können sie, entsprechend dem Verständnis eines Durchschnittsfachmanns, in einer Zusammensetzung vorliegen, die Salze, Puffer, Adjuvantien oder andere Substanzen enthält, die zur Verbesserung der Wirksamkeit der Zusammensetzung wünschenswert sind. Beispiele für Materialien, die zur Verwendung bei der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen geeignet sind, sind in zahlreichen Quellen, einschließlich REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol. A. Hrsg. Mack Publishing Co., (1980)) bereitgestellt.
  • Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Mittel verabreicht werden, jedoch werden sie normalerweise durch Injektion, Infusion oder andere geeignete physikalische Verfahren verabreicht. Alternativ dazu können die Zusammensetzungen intramuskulär, intravenös oder subkutan verabreicht werden. Komponenten der Zu sammensetzungen zur Verabreichung umfassen sterile wässrige (zum Beispiel physiologische Salzlösung) oder nicht wässrige Lösungen und Suspensionen. Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle, wie zum Beispiel Olivenöl und injizierbare organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat. Träger oder Okklusivverbände können zum Erhöhen der Hautdurchlässigkeit und zur Erhöhung der Antigenabsorption verwendet werden.
  • Werden rekombinante Wirtszellen einem Individuum verabreicht, wird die Zahl der Zellen oder Nukleinsäuremoleküle, die zur Bereitstellung einer therapeutisch wirksamen Menge erforderlich ist, mit solchen Faktoren, wie dem Zustand des Individuums, den Proteinen oder RNA-Molekülen, die exprimiert werden sollen, und der Größe des Individuums variieren.
  • Beispiele
  • Die folgenden Enzyme und Reagenzien wurden in den Experimenten, die in den folgenden Beispielen beschrieben sind, verwendet: Pwo-Polymerase, dNTPs und Restriktionsenzyme wurde von Boehringer Mannheim (9115 Hague Road, Indianapolis, IN 46250) erhalten. T4 DNA-Ligase, fetales Kälberserum (FCS), Bactotrypton und Hefeextrakt wurden von Gibco BRL (Postfach 68, Grand Island, NY, 14072, USA) erhalten. Bsp120I wurde von MBI Fermentas, Inc. (300 Pearl St. Buffalo, NY, 14202, USA) erhalten, XL-1 Blue kompetente Zellen wurden von Stratagene (11011 North RTorrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037, USA) erhalten. DNA-Reinigungskits und Taq-Polymerasen wurden von QIAGEN, Inc., (9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA. 91311, USA) erhalten. HP-1-Medium wurde von Cell Culture Technologies (Glattbrugg, Schweiz) erhalten, Alle Standardchemikalien wurden von Fluka (980 South 2nd St., Ronkonkoma, NY, 11779, USA), Sigma Chemical Co. (Postfach 14508, St. Louis, MO 63178, USA), Aldrich (1001 West St. Paul Ave. Milwaukee, WI, 53233, USA) erhalten und alle Zellkulturmaterialien wurden von Becton Dickinson & Co. (1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ, 07417, USA) erhalten.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion des pCYTts-Vektorsystems:
  • Manipulationen und Sequenzierung von DNA wurden mit Standardverfahren ausgeführt. Die Mutationen in nsP2 wurden durch PCR unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide eingeführt:
    Oligo-nsp2 1: 5'-AACATTGAAATCGATATTACAGGGG (SEQ ID Nr: 2),
    Oligo-nsp2 2: 5'-CGGGTTATGGTCGACCGGGC (SEQ ID Nr: 3),
    Oligo-nsp2 3: 5'-GTGCCCTCCCCTGAGTTTAAACAATTCAGGGCCGAACGCG (SEQ ID Nr: 4) und
    Oligo-nsp2 4: 5'-GAATTGTTTAAACTCAGGAGGCACCCTCGTGG (SEQ ID Nr: 5),
    wobei die einzelnen Restriktionsstellen, die zur ersten Analyse und nachfolgendem Klonieren verwendet worden sind (DraI, ClaI und SalI) unterstrichen sind. PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von entweder Oligo-nps2 1 (SEQ ID Nr: 2) und Oligo-nsp2 3 (SEQ ID Nr: 4) oder Oligo-nsp2 2 (SEQ ID Nr: 3) und Oligon-nsp2 4 (SEQ ID Nr: 5) durchgeführt. Von jedem Oligo wurden 100 pmol verwendet und 5 ng der Templat-DNA (pSinRep5: Xiong, C. et al., Science 243: 1188–1191 (1989)) wurde in der Reaktionsmischung von 100 μl, die 4 Einheiten Taq- oder Pwo-Polymerase, 0,1 mM dNTPs und 1,5 mM MgSO4 enthielt, verwendet. Alle DNA-Konzentrationen wurden photometrisch unter Verwendung der GeneQuant-Vorrichtung (Pharmacia Biotech Inc., 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854) bestimmt. Die Polymerase wurde direkt vor Beginn der PCR-Reaktion zugegeben (Startpunkt war bei 95°C). Die Temperaturzyklen waren folgende: 95°C während 2 Minuten, gefolgt von 5 Zyklen bei 95°C (45 Sekunden), 58°C (30 Sekunden), 72°C (90 Sekunden) und anschließend 25 Zyklen bei 95°C (45 Sekunden), 68°C (30 Sekunden), 72°C (90 Sekunden).
  • Die zwei PCR-Fragmente wurden unter Verwendung des Qia-spin PCR-Kits (Qiagen, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) gereinigt und schließlich in einem geeigneten Puffer unter Verwendung von 20 Einheiten SalI und DraI, beziehungsweise 20 Einheiten ClaI und DraI verdaut. Der Verdau wurde während 12 Stunden bei 37°C durchgeführt. Die DNA-Fragmente wurden Gel-gereinigt (Gene-Clean: Bio 101 Inc., 1070 Joshua Way, Vista, CA, 92083, USA) und schließlich in den mit ClaI/SalI verdauten und Gel-gereinigten SinRep5-Vektor (Xiong, C., et al., Science 243: 1188–1191 (1989)) ligiert. Die korrekte Sequenz des erhaltenen Vektors wurde durch DNA-Sequenzierung des gesamten nsP2-Gens überprüft.
  • Die Mutationen in nsP4 wurden ebenfalls durch PCR unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide eingeführt:
    Oligo-nsp4 1: 5'-GGTAGACGAGACAGTCGCATGCCTGGATAC (SEQ ID Nr: 6),
    Oligo-nsp4 2: 5'-GTATCCAGGCATGCGACTGTCTCGTCTACC (SEQ ID Nr: 7),
    Oligo-nsp4 3: 5'-CAGACCGGTTAACGCCATAGCGTCG (SEQ ID Nr: 8) und
    Oligo-nsp4 4: 5'-CTCTATTACTAGTATGGACAGTTGG (SEQ ID Nr: 9), wobei die einzelnen Restriktionsstellen, die zur ersten Analyse und letztem Klonierungsschritt verwendet worden sind (SphI, HpaI und SpeI), unterstrichen sind. Zwei PCR-Reaktionen wurden entsprechend der vorstehenden Beschreibung unter Verwendung von entweder Oligo-nsp4 1 (SEQ ID Nr: 6) und Oligo-nsp4 3 (SEQ ID Nr: 8) oder Oligo-nsp4 2 (SEQ ID Nr: 7) und Oligo-nsp4 4 (SEQ ID Nr: 9) ausgeführt.
  • Beide PCR-Produkte wurden Gel-gereinigt und dann in einer Assemblierungs-PCR und zur Amplifikation des gesamten nsP4-Gens verwendet. Für die Assemblierungs-PCR wurden 50 pmol der äußeren Primer (3 und 4) und ungefähr 10 ng von jedem PCR-Fragment verwendet. Das Reaktionsvolumen betrug 100 μl, das 4 Einheiten Taq- oder Pwo-Polymerase, 0,1 mM dNTPs und 1,5 mM MgSO4 enthielt. Die PCR-Bedingungen waren folgende:
    95°C während 2 Minuten, gefolgt von 5 Zyklen bei 92°C (45 Sekunden), 58°C (30 Sekunden), 72°C (120 Sekunden) und anschließend 25 Zyklen 92°C (45 Sekunden), 64°C (30 Sekunden), 72°C (120 Sekunden).
  • Das erhaltene PCR-Fragment wurde entsprechend der vorstehenden Beschreibung gereinigt und das Eluat wurde mit 20 Einheiten SpeI und HpaI in einem geeigneten Puffer verdaut. Das Fragment wurde Gel-gereinigt und in Gel-gereinigten mit SpeI/HpaI restringierten SinRep5-Vektor ligiert. Die korrekte Sequenz des erhaltenen Vektors wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft.
  • SinRep5-nsP4mut und SinRep5-nsp2mut wurden über Nacht mit SpeI/HpaI verdaut und das nsp4-Fragment und der SinRep-nsp2mut-Vektor wurden Gel-gereinigt. Das nsp4mut-Fragment wurde in den SinRep5-nsp2mut-Vektor ligiert. Der letzte Schritt war das Klonieren des nsp-Gens in den 987/SinRep5-Vektor (Bredenbeek. P. et al., J. Virol. 67: 6439–6446 (1993)) unter Verwendung von ClaI und HpaI als Restriktionsendonukleasen, der resultierende Vektor wurde pCYTts genannt (2 und 3A–3D (SEQ ID Nr: 1)).
  • pCYTts-Konstrukte: Fünf verschiedene Gene wurden in den pCYTts-Vektor kloniert. Grün fluoreszierendes Protein (GFP), sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP), β-Interferon (β-INF), Erythropoietin (EPO) und HIV gp160.
  • Beispiel 2
  • Regulierte Expression von GFP in vorübergehender und stabiler Expression
  • Das pCYTts-System wurde erfolgreich zur Expression zytoplasmatischer Proteine verwendet, als Beispiel verwendeten wird das grün fluoreszierende Protein (GFP) der Qualle Aequorea victoria (Crameri et al., Nat. Biotech. 14: 315–319 (1996)). GFP wird in pCYTts über XbaI und Bsp120I (Fermentas) ligiert. Klone mit korrektem Einschub wurden durch Restriktionsverdau identifiziert. Die GFP-Expression wurde in sowohl vorübergehender als auch stabiler Expression getestet.
  • Eine vorübergehende Transfektion in BHK21-Zellen wurde unter Verwendung des Transfektionsprotokolls mit CaPO4-Fällung ausgeführt: 6 μg Plasmid-DNA (pCYTts-GFP) in 30 μl H2O wurden mit 30 μl einer 1 M CaCl2-Lösung gemischt. Nach Zugabe von 60 μl Phosphatpuffer (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, pH-Wert 7,05) wurde die Lösung während 5 Sekunden verwirbelt, anschließend wurde bei Raumtemperatur während 25 Sekunden inkubiert. Die Lösung wurde sofort zu 2 ml HP-1-Medium, das 2% FCS (2% FCS-Medium) enthielt, gegeben. Dann wurde das Medium einer zu 80% konfluenten BHK21-Zellkultur in einer Platte mit 6 Vertiefungen durch das DNA-enthaltende Medium ersetzt. Nach einer Inkubation während 5 Stunden bei 37°C in einem CO2-Inkubator wurde das DNA-enthaltende Medium durch 2 ml 15% Glycerol in 2% FCS-Medium ersetzt. Das Glycerol-enthaltende Me dium wurde nach einer Inkubationsphase von 30 Sekunden entfernt und die Zellen wurden mit 5 ml HP-1-Medium, das 10% FCS enthielt, gewaschen. Schließlich wurden 2 ml frisches HP-1-Medium, das 10% FCS enthielt, zugegeben.
  • Nach der vorübergehenden Transfektion von BHK-Zellen mit pCYTtsGFP wurde die Expression bei 37°C getestet. Unter Verwendung der nachstehenden Verfahren wurde keine Expression von GFP nachgewiesen. GFP wurde erzeugt, wenn die Temperatur auf 29°C eingestellt wurde. Die GFP-exprimierenden Zellen überlebten mindestens 5 Tage.
  • Stabile Transfektion in BHK21-Zellen. Die stabile Transfektion wird im Wesentlichen entsprechend der Beschreibung für die vorübergehende Transfektion ausgeführt, mit der Ausnahme, dass für die stabile Transfektion eine linearisierte Plasmid-DNA verwendet wurde. 20 μg pCYtsGFP wurden mit 30 Einheiten NaeI in einem geeigneten Puffer während mindestens 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Isopropanolfällung der linearisierten DNA angehalten. Die Restriktionsreaktion wurde durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 0,8% Agarosegels, gefärbt mit Ethidiumbromid, überprüft. Für die Transfektion wurden 5,4 μg linearisiertes pCYTtsGFP mit 0,6 μg ringförmigem pSVtrpB (Selektionsplasmid) in 30 μl H2O gemischt. Dem folgte das für die vorübergehende Transfektion beschriebene Verfahren.
  • Stabil transfizierte Zellen wurden ausgewählt und in Selektionsmedium (HP-1-Medium, ohne Tryptophan, ergänzt mit 300 μM Indol und 5% dialysiertem FCS) bei 37°C in einem CO2-Inkubator vermehrt. Als sich die Mischpopulation bis zur Konfluenz vermehrt hatte wurde die Kultur in zwei Teile geteilt und beide Teile wurden für weitere 12 Stunden bei 37°C kultiviert. Dann wurde ein Teil der Zellen zur Induktion der Expression des interessierenden Gens auf 30°C eingestellt. Der andere Teil wurde auf 37°C gehalten.
  • Nachweis der Genexpression
  • Das grün fluoreszierende Protein kann aufgrund seiner starken Fluoreszenz leicht in einem Spektralfluorometer nachgewiesen werden. Dies wird beobachtet, wenn sich GFP im Zytoplasma der Zelle befindet. Die GFP-Produktion wurde durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen und durch Spektralfluorophotometrie der gesamten Zelle quantifiziert (Spektralfluorophotometer, Shimadzu RF-5001PC). Abgetrennte Zellen wurden mit 5 ml PBS (pro Liter: 0,132 g CaCl2·2H2O, 0,20 g KCl, 0,20 g KH2PO4, 0,10 g MgCl2·6H2O, 8 g NaCl, 1,15 g Na2HPO4, pH-Wert 7,2) gewaschen und in 1 ml PBS resuspendiert. Die Anregungswellenlänge betrug 397 nm und die Emissionswellenlänge betrug 510 nm. Zur Ausführung der Messungen in einem für den Fluoreszenznachweis linearen Bereich wurden die Zellen verdünnt, um eine Fluoreszenz zwischen 0,05 und 1,0 Emissionseinheiten zu erhalten.
  • Zur Bestimmung der optimalen Induktionstemperatur wurden Kulturen von Mischpopulationen stabil transfizierter Zellen während 48 Stunden bei unterschiedlichen Temperaturen im Selektionsmedium ohne FCS inkubiert. Die Expression wurde induziert, wenn die Temperatur der Kulturen auf 34°C oder weniger eingestellt wurde. Die höchste Expression wurde bei 29°C nachgewiesen (4A). Wurden stabil transfizierte Zellen bei 30°C während 4 Stunden induziert und anschließend bei 37°C während 24 Stunden vermehrt, konnten grüne Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. Dies zeigte deutlich, dass die Expression des interessierenden Gens nach 4 Stunden Induktion beginnt (6A).
  • Zeitabhängigkeit
  • Die Kinetik des Systems wurde photometrisch zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Induktion bestimmt. Die GFP-Expression wurde entsprechend der vorstehenden Beschreibung nachgewiesen. Zehn Stunden nach Induktion ist eine deutliche Expression von GFP bei 29°C nachweisbar (5A). Wenn die Temperatur der Zellen nach Induktion zurück auf 37°C eingestellt wird, sollte eine neue RNA-Produktion blockiert sein, jedoch sollte die Translation des interessierenden Proteins mit einem höheren Expressionsgehalt stattfinden. Die Zellen wurden nach 4, 6, 8 oder 10 Stunden nach Induktion zurück auf 37°C gebracht, 24 Stunden später wurde die GFP-Expression, entsprechend der vorstehenden Beschreibung, nachgewiesen (6A). Somit beginnt die Transkription kurz nach der Induktion.
  • Langzeitstabilität der Zelllinie
  • Zur Bestimmung der Langzeitexpression des interessierenden Gens wurden stabil transfizierte Zellen während mindestens 8 Wochen bei 37°C kultiviert. Die Expression des GFP wurde durch Einstellen der Temperatur der Zellen auf 29°C getestet. Es wurde kein Unterschied in dem Expressionsgehalt von GFP zwischen den Zellen, die direkt nach der stabilen Transfektion verwendet wurden, und den Zellen, die während mindestens 4 Wochen kultiviert wurden, beobachtet.
  • Beispiel 3
  • Regulierte Expression von SEAP in vorübergehender und stabiler Expression
  • Das pCYTts-System wurde erfolgreich zur Expression sezernierter Proteine verwendet, als Beispiel verwendeten wir die sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) menschlichen Ursprungs (CLONTECH Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA, 94303, USA). Die SEAP-kodierende Sequenz wird in pCYTts über XbaI und StuI ligiert. Klone mit dem korrekten Einschub wurden durch Restriktionsverdau identifiziert. Die SEAP-Expression wurde sowohl bezüglich der vorübergehenden als auch stabilen Expression getestet.
  • Die vorübergehende Transfektion in BHK21-Zellen wurde unter Verwendung des Transfektionsprotokolls mit CaPO4-Cofällung, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, ausgeführt.
  • Stabile Transfektion in BHK21-Zellen
  • Die stabile Transfektion wurde im Wesentlichen entsprechend der Beschreibung für die vorübergehende Transfektion ausgeführt, mit der Ausnahme, dass linearisierte Plasmid-DNA verwendet wurde. 20 μg pCYTtsSEAP wurde mit 30 Einheiten MluI in einem geeigneten Puffer während mindestens 4 Stunden bei 37°C inkubiert. 10 μg pSVneo wurden mit 30 Einheiten ScaI während mindestens 4 Stunden bei 37°C verdaut. Beide Reaktionen wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Isopropanolfällung der linearisierten DNA angehalten. Die Restriktionsreaktionen wurden durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 0,8% Agarosegels, gefärbt mit Ethidiumbromid, überprüft. Für die Transfektion wurden 5,88 μg linearisiertes pCYTtsSEAP mit 0,12 μg linearisiertem pSVneo (Selektionsplasmid) in 30 μl H2O gemischt. Dem folgte das für die vorübergehende Transfektion beschriebene Verfahren.
  • Nachweis der Genexpression
  • Vorübergehend und stabil transfizierte Zellen, die pCYTtsSEAP enthielten, wurden auf SEAP-Expression 3 Tage nach der Induktion durch Punktauftragung getestet. 2,5 μl Zellkulturüberstand wurden auf eine Nitrocellulosemembran getüpfelt. Nach Trocknen der Membran während 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Entwicklungsreaktion unter Verwendung von alkalische Phosphatase-Nachweisreagenzien (10 ml AP-Puffer (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH-Wert 9,5) mit 50 μl NBT-Lösung (7,7% Nitroblau-Tetrazolium (Sigma) in 70% Dimethylformamid) und 37 μl X-Phosphatlösung (5% 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in Dimethylformamid)) ausgeführt.
  • Die SEAP-Aktivität wurde in einem kolorimetrischen enzymatischen Aktivitätstest quantitativ bestimmt. 50 μl SEAP-enthaltender Kulturüberstand wurden bei 65°C während 5 Minuten inkubiert und schließlich zentrifugiert (20000 g, 20 Sekunden). Zur Bestimmung der SEAP-Aktivität wurden 400 μl des zentrifugierten Überstands mit 500 μl 2 × SEAP-Puffer (20 mM L-Homoarginin, 2 M Diethanolamin und 1 mM MgCl2·6H2O, pH-Wert 9,8 in einer Küvette gemischt. Die SEAP-Aktivität wurde an einem Spektralphotometer bei 405 nm nach Zugabe von 100 μl Nitrophenylphosphat (120 mM) (Sigma 104, Sigma) zu der Probe verfolgt. Die Extinktion wurde alle 30 Sekunden über einen Zeitraum von 10 Minuten gemessen. Die zu verschiedenen Zeitpunkten erhaltenen Werte wurden gegen die Zeit aufgetragen und eine Auftragung mit linearer Krümmung wurde erhalten.
  • Es wurde geschätzt, dass in der Mischpopulation die Menge an SEAP-Molekülen, die pro Zelle erzeugt werden, ungefähr 107 Moleküle pro Zelle beträgt. Zum Erreichen einer stabilen Expression von SEAP wurden klonierte Zellen automatisch in einer Zellensortiervorrichtung sortiert und schließlich bezüglich der SEAP-Aktivität analysiert. Ungefähr einer von 20 Klonen zeigte eine SEAP-Expression. Es wurde ge schätzt, dass die SEAP-Expression um eine Größenordnung höher ist als in der Mischpopulation.
  • Die höchste SEAP-Expression wurde bei 29°C nachgewiesen (4B). Die SEAP-Aktivität konnte 15 Stunden nach der Induktion bei 29°C nachgewiesen werden (5B). Jedoch begann die SEAP-Expression viel früher als in 6B gezeigt ist. Die Temperatur der SEAP-exprimierenden Zellen wurde nach 4, 6, 8 oder 10 Stunden der Induktion zurück auf 37°C eingestellt, 24 Stunden später wurde die SEAP-Expression, entsprechend der vorstehenden Beschreibung, nachgewiesen. Die SEAP-Expression konnte erst 6 Stunden nach der Induktion nachgewiesen werden (6B). Somit begann die SEAP-Expression ebenfalls kurz nach der Induktion.
  • Beispiel 4
  • Regulierte Expression von β-INF in vorübergehender und stabiler Expression
  • Ein β-Interferon-Gen menschlichen Ursprungs wurde verwendet, um zu zeigen, dass das pCYTts-System zum Exprimieren antiviraler sezernierter Proteine verwendet werden kann. β-Interferon weist antivirale Aktivität auf und stört die RNA-Replikation. pCYTts-Systeme regulieren streng die Expression von Genen, selbst wenn diese Gene Proteine kodieren, die die RNA-Replikation stören.
  • Das β-Interferon-kodierende Gen wurde entsprechend der Beschreibung in Prodromou, C. und Pearl, L. (Protein Eng. 5: 827–829 (1992)) erzeugt. Primer wurden unter Verwendung der menschlichen β-Interferonnukleotidsequenzen, die in den GenBank-Berichten V00534, J00218, K00616 und M11029 offenbart sind, erzeugt. Die β-Interferon-cDNA wurde in pCYTts nach Restriktion mit XbaI und Bsp120I ligiert. Die Expression von β-Interferon wurde in vorübergehenden und stabilen Expressionssystemen getestet.
  • Die vorübergehende und stabile (Mischpopulationen) Expression von β-INF wurde durch Western-Blotting bestimmt. 0,5 ml Kulturmedium wurde mit Methanol/Chloroform gefällt und das Pellet wurde in einem SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert. Die Proben wurden während 5 Minuten bei 95°C erhitzt, bevor sie auf 15% Acrylamidgele aufgebracht wurden. Nach der SDS-PAGE wurden die Proteine auf Protan Nitrocellulosemembranen überführt (Schleicher & Schuell, Inc., 10 Optical Ave., Keene, NH 03431, USA). Die Membran wurde mit 1% Rinderalbumin (Sigma) in TBS (10 × TBS pro Liter: 87,7 g NaCl, 66,1 g Trizmahydrochlorid (Sigma) und 9,7 g Trizmaausgangsstoff (Sigma), pH-Wert 7,4) während 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert, anschließend wurde mit Maus-Anti-Mensch-β-INF-Antikörper (0,2 μg/ml, Research Diagnostics Inc., USA) während 1 Stunde inkubiert. Der Blot wurde 3 mal während 10 Minuten mit TBS, das 0,05% Tween20 (TBS-T) enthielt, gewaschen und während 1 Stunde mit einem Meerrettichperoxidase-Anti-Maus-IgG-Konjugat (0,1 μg/ml, Amershan Life Science, England) inkubiert. Nachdem 2 mal während 10 Minuten mit TBS-T und 2 mal während 10 Minuten mit TBS gewaschen worden war, wurde die Entwicklung unter Verwendung des ECL-Kits (Amersham) ausgeführt.
  • Die Proben für den Blot wurden nach 3 oder 5 Tagen Inkubation bei 29°C genommen. Ein anderer Teil der Kultur wurde auf 37°C gehalten und eine Probe wurde nach 5 Tagen genommen. 8A zeigt, dass β-INF nach 3 Tagen bei 29°C hergestellt wird, wohingegen eine Inkubation bei 37°C keine nachweisbare β-INF-Produktion ergibt.
  • Beispiel 5
  • Regulierte Expression von EPO in vorübergehender Expression
  • Das pCYTts-System wurde erfolgreich zur Expression pharmazeutisch relevanter sezernierter Proteine verwendet. Als Beispiel für eine derartige Expression verwendeten wir ein Gen menschlichen Ursprungs, das Erythropoietin (EPO) kodiert. Dieses Gen wurde durch PCR, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 4, hergestellt. Die Primer wurden unter Verwendung der menschlichen EPO-Nukleotidsequenzen, die in dem GenBank-Bericht X02158 offenbart sind, erzeugt. Das EPO-kodierende Gen wurde in pCYTts nach Restriktion mit XbaI und Bsp120L (Fermentas) ligiert. Klone mit korrektem Einschub wurden durch Restriktionsverdau identifiziert. Die EPO-Expression wurde sowohl in vorübergehenden als auch stabilen Expressionssystemen getestet.
  • BHK21-Zellen wurden entsprechend dem CaPO4-Cofällungs-Protokoll, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, vorübergehend transfiziert.
  • Die EPO-Produktion wurde durch Western-Blotting, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 4 bestimmt. Der Nachweis wurde durch Inkubation der Nitrocellulosemembran mit 2 g Kaninchen-Anti-Mensch-EPO-Antikörper (Research Diagnostics Inc.) in 10 ml TBS-T während 1 Stunde, gefolgt von 3 mal Waschen für jeweils 10 Minuten mit TBS-T, ausgeführt. Schließlich wurde die Nitrocellulosemembran während 1 Stunde mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 1:5000 in TBS-T verdünnt, inkubiert. Nach 2 mal Waschen während 10 Minuten mit TBS-T und 2 mal während 10 Minuten mit TBS wurde der Blot durch Färben mit alkalischer Phosphatase, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 3, entwickelt. Vorübergehend transfizierte Zellen, die während 4 Tagen bei 29°C induziert wurden, erzeugten nachweisbare Mengen an EPO (8B).
  • Beispiel 6
  • Regulierte Expression von EPO in stabiler Expression
  • In dem pCYTts504EPO-Expressionsvektor wurde die menschliches Erythropoietin (EPO) kodierende Sequenz (einschließlich ihres natürlichen Signalpeptids zur Sekretion in das Wachstumsmedium) im Rahmen bezüglich der Sequenz für das Sindbis-Virus-Kapselprotein (C-Protein) fusioniert. Der Grund für dieses Konstrukt bestand darin, den Translationsverstärker mit einzuschließen, der sich innerhalb der C-Protein-kodierenden Region befindet, und von dem gezeigt wurde, dass er im Vergleich zu Konstrukten, denen dieser Verstärker fehlt, zu einem um das 10- bis 20-fache erhöhten Expressionsgehalt führt (Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11371–11377 (1996)). Das Fusionsgen wird von dem subgenomischen Promotor des Expressionsvektors pCATts exprimiert. Nach der Cotranslationsfreisetzung des EPO-Vorläufers von dem Fusionsprotein, die durch die autoproteolytische Aktivität des C-Proteins katalysiert wird, wird EPO durch sein N-terminales Signalpeptid auf den Sekretionsweg geführt.
  • Zur stabilen Transfektion wurde ein Verhältnis von 3:1 des pCYTts504EPO (linearisiert durch Restriktionsspaltung mit MluI) und des Neomycinresistenz-verleihenden Plasmids 987BBneo (Bredenbeek et al., J. Virol. 67: 6439–6446 (1993) (linearisiert durch Restriktionsspaltung mit ScaI) in BHK21-Zellen unter Verwendung des Calciumphosphatase-Cofällungsprotokolls, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, eingeführt. Nach 1 Woche Inkubation bei 37°C unter selektiven Bedingungen (HP-1-Medium ergänzt mit 10% FCS und 200 μg/ml G418 (Neomycin)) wurden einzelne Kolonien getrennt und weiter unter denselben Bedingungen vermehrt.
  • Zum Screenen auf EPO-sezernierende Klone wurden Zellen in Platten mit 12 Vertiefungen bei 37°C zu einer Konfluenz von 80% vermehrt und bei 30°C während weiteren 4 Tagen inkubiert. Drei μl von jedem Kulturüberstand wurden auf sezerniertes EPO durch Punkt-Blotanalyse unter Verwendung eines Anti-EPO-Kaninchen-IgG und eines Anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugats analysiert. Unter 27 untersuchten Klonen wurde ein EPO-sezernierender Klon identifiziert. Eine ungefähre Konzentration von 2,5 mg EPO pro Liter Überstand wurde unter Verwendung eines EPO-ELISA-Kits (Boehringer Mannheim) geschätzt. Die Identität des sezernierten Proteins wurde weiterhin durch Western-Blotanalyse bestätigt. Zu diesem Zweck wurden Zellen auf eine Konfluenz von 80% bei 37°C in einem T-75 Zellkulturkolben mit 30 μl HP-1-Medium (ohne FCS), ergänzt mit G418 (200 μg/ml) vermehrt und dann bei 30°C während weiteren 4 Tagen inkubiert. Zwanzig μl des Kulturüberstands wurden auf einem 15% SDS-Polyacrylamidgel getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Unter Verwendung eines Anti-EPO-Kaninchen-IgG/Anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat-Systems wurde ein einzelnes Protein spezifisch nachgewiesen, das dieselbe elektrophoretische Beweglichkeit wie eine authentische EPO-Probe von einer unterschiedlichen Quelle zeigte (scheinbares M, ungefähr 29 kDa) (9). Die resultierende Zelllinie wurde mit IC4 bezeichnet.
  • Beispiel 7
  • Herstellung von Sindbis-Viruspartikeln, die EPO-RNA enthalten
  • Ein μg RNase-freier Vektor (pDH-EB, Bredenbeek et al., J. Virol. 11: 6439–6446 (1993)) wurde durch EcoRI-Verdau linearisiert. Anschließend wurde die in vitro Transkription unter Verwendung des SP6 in vitro Transkriptionskits (InvitroscripCAP von Invitrogen, Invitrogen BV, NV Leek, Holland) ausgeführt. Die resultierende 5'-verkappte mRNA wurde auf reduzierenden Agarosegelen analysiert.
  • Fünf μg in vitro transkribierte mRNA wurden in die IC4-Zelllinie (Beispiel 6) gemäß dem Handbuch von Invitrogen (Sindbis-Expressionssystem, Invitrogen BV, Holland) elektrophoresiert. Nach 10 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das FCS-enthaltende Medium gegen HP-1-Medium ohne FCS, gefolgt von einer zusätzlichen Inkubation bei 30°C während 72 Stunden, ausgetauscht. Der Überstand wurde über eine BHK21-Zellschicht gegeben, bei 2 Stunden bei 4°C inkubiert und schließlich verworfen. Die Zellen wurden 4 mal mit HP-1-Puffer gewaschen und während 24 Stunden bei 30°C inkubiert. Drei μl des Kulturüberstands wurden auf sezerniertes EPO durch Punkt-Blotanalyse unter Verwendung eines Anti-EPO-Kaninchen-IgG und eines Anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugats analysiert (10).
  • Beispiel 8
  • Regulierte Expression von gp160 in vorübergehender Expression
  • Das pCYTts-System wurde zur Expression von gp160, das HIV-Hüllprotein, verwendet. Das gp160-Gen wurde von pAbT4674 (ATCC 40829) amplifiziert und in pCYTts über XbaI und Bsp120L kloniert. BHK21-Zellen wurden unter Verwendung von Lipofectamin (Life Technologies, Basel, Schweiz) vorübergehend transfiziert. 0,8 μg pCYTts gp160-DNA in 150 μl Dulbeccos modifiziertem Eaglemedium (DMEM, Life Technologies, Basel, Schweiz) wurden mit 150 μl DMEM, das 2,5 μl Lipofectamin enthielt, gemischt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 15 Minuten inkubiert und zu einer zu 80% konfluenten BHK-Zellschicht in einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation während 5 Stunden bei 37°C in einem CO2-Inkubator wurden die Zellen gewaschen und während weiteren 12 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden aufgeteilt und ein Teil wurde bei 29°C inkubiert und ein Teil wurde bei 37°C während 5 Tagen inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und in einem SDS-PAGE-Probenpuffer lysiert. Die Proben wurden während 5 Minuten bei 95°C erhitzt und auf ein 8% Acrylamidgel aufgebracht. Die gp160-Expression wurde durch Western-Blotting, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 4 analysiert. Die Nitrocellulosemembran wurde mit Kaninchen-Anti-Mensch-gp160-Antikörper (freundlicherweise von Dr. Schwaller, Diamed AG, Schweiz zur Verfügung gestellt) inkubiert, 1:3000 in 10 ml TBS-T während 1 Stunde verdünnt und anschließend dreimal während 10 Minuten mit TBS-T gewaschen. Dann wurde die Membran während 1 Stunde mit alkalische Phosphatase-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 1:5000 in 10 ml TBS-T verdünnt, inkubiert. Die Membran wurde zweimal mit TBS-T während 10 Minuten und zweimal während 10 Minuten mit TBS gewaschen. Die Entwicklung wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 3 ausgeführt. Vorübergehend transfizierte Zellen erzeugten nachweisbare Mengen an gp160 (Daten sind nicht gezeigt).
  • Beispiel 9
  • Regulierte Expression von GFP in menschlichen Vorhautfibroblasten
  • Das pCYTts-System wurde zur Expression des grün fluoreszierenden Proteins in menschlichen Vorhautfibroblasten verwendet. Zellen wurden unter Verwendung von Lipofectamin, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8, transfiziert. Zwölf Stunden nach der Transfektion wurde ein Teil der Zellen bei 37°C inkubiert, der andere Teil wurde bei 29°C inkubiert. Nach 48 Stunden wurden in den bei 29°C inkubierten Kulturen hellgrüne Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, wohingegen bei 37°C keine GFP-Expression nachgewiesen wurde.
  • Beispiel 10
  • Ein Mehrfachvektorsystem mit dem Einschub in Sense-Richtung
  • Zur Herstellung nicht zytopathischer viraler Partikel wurde das regulierbare Vektorsystem der Erfindung verwendet. Als interessierendes Gen wählten wir die Strukturproteine des Sindbis-Virus und als Markerprotein wählten wir GFP. Die Zellen wurden mit pCYTtsGFP, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, stabil transfiziert. Die stabil transfizierten Zellen wurden mit einem Defekthelferkonstrukt (pDHBB, Bredenbeek et al., J. Virol. 11: 6439–6446 (1993)), das die Sindbis-Virusstrukturproteine trug, gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll vorübergehend transfiziert.
  • Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C vermehrt. Dann wurde die Temperatur der Zellen zur Induktion der viralen Genexpression auf 29°C eingestellt. Die gebildeten viralen Partikel enthalten verpackte pCYTtsGFP-RNA-Sequenzen und GFP wird exprimiert, wenn die verpackten viralen Partikel neue Zielzellen infizieren. Zum Durchführen der neuen Infektion wurde nach 4 Tagen Expression das Medium gesammelt und zentrifugiert (1800 Upm, 3 Minuten). Der Überstand wurde auf zu 80% konfluente BHK-Zellschichten gegeben und während 4 Stunden bei 29°C inkubiert. Nach der Inkubationsphase wurde das Medium verworfen und die Zellen wurden, gefolgt von Inkubation bei 29°C während weiteren 24 Stunden, 3 mal mit 5 ml HP-1-Medium gewaschen. Schließlich wurde der Expressionsgehalt des Markergens GFP durch Fluoreszenzspektroskopie, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2 gemessen.
  • Anfänglich erzeugten 10% der BHK-Zellen GFP und nach zusätzlichen 24 Stunden Inkubation bei 29°C exprimierten alle Zellen GFP. Das konditionierte Medium dieser Zellen wurde wieder geerntet, zentrifugiert und über eine zu 80% konfluente Schicht von BHK-Zellen gegeben. Nach 48 Stunden Inkubation bei 29°C wurde festgestellt, das 100% dieser Zellen GFP exprimierten.
  • Als Kontrolle wurden die transfizierten Zellen während 5 Tagen bei 37°C vermehrt, worauf das konditionierte Medium gesammelt und zentrifugiert wurde (1800 Upm, 3 Minuten). Der Überstand wurde auf eine zu 80% konfluente BHK-Zellschicht gegeben. Nach 8 Stunden Inkubation bei 29°C wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden 3 mal mit 5 ml HP-1-Medium gewaschen und bei 29°C während zusätzlichen 24 Stunden inkubiert. Schließlich wurde der Expressionsgehalt von GFP bestimmt. Es konnten keine GFP-exprimierende Zellen nachgewiesen werden (7A und 7B).
  • Beispiel 11
  • Ein Mehrfachvektorsystem mit Einschub in Antisense-Richtung
  • Als Modellsystem testeten wird das regulierbare System mit der Herstellung viraler Partikel. Als interessierendes Gen wählten wird die Strukturproteine des Sindbis-Virus und als Markerprotein wählten wird GFP. Die Zellen wurden mit pCYTtsGFP, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, stabil transfiziert.
  • Der Antisense-Helfervektor wurde folgendermaßen konstruiert:
    Die Strukturproteine wurden durch Verdau des pDHBB-Vektors (Bredenbeek, P. et al., J. Virol. 67: 6439–6446 (1993)) mit EcoRI und BamHI erhalten. Das Fragment wurde durch Gelelektrophorese gereinigt und in den EcoRI/BamHI-verdauten pMPSVHE-Vektor kloniert (Artelt, P. et al., Gene 68: 213–219 (1988)). Da die EcoRI- und BamHI-Restriktionsstellen in diesen Vektoren in entgegengesetzten Orientierungen sind wurde das Strukturproteinfragment in Antisense-Orientierung in pMPSVHE kloniert. Der resultierende Vektor wurde mit pMPSVanti-DHBB bezeichnet.
  • Die stabil transfizierten Zellen wurden mit pMPSVanti-DHBB, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 10, vorübergehend transfiziert. Transfizierte Zellen wurden über Nacht bei 37°C vermehrt. Dann wurde zur Induktion der viralen Genexpression die Temperatur der Zellen auf 29°C eingestellt. Nach 4 Tagen Induktion wurde das konditionierte Medium gesammelt und zentrifugiert (1800 Upm, 3 Minuten). Der Überstand wurde auf eine zu 80% konfluente BHK-Zellschicht gegeben und während 4 Stunden bei 29°C inkubiert. Nach der Inkubationsphase wurde das Medium verworfen und die Zellen wurden 3 mal mit 5 ml HP-1-Medium gewaschen und während zusätzlichen 24 Stunden bei 29°C inkubiert. Schließlich wurde der Expressionsgehalt des Markergens GFP durch Fluoreszenzspektroskopie, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, gemessen.
  • Anfänglich erzeugten ungefähr 1% der BHK-Zellen GFP und nach zusätzlichen 120 Stunden Inkubation bei 29°C exprimierten 30% der Zellen GFP. Somit können selbst Antisense-DNA-Fragmente innerhalb dieser Erfindung zur Herstellung funktioneller Proteine verwendet werden.
  • Schlussfolgerungen
  • Das in den vorangehenden Beispielen beschriebene Expressionssystem erfüllt nahezu alle der Kriterien für ein ideales induzierbares Genexpressionssystem, entsprechend der Beschreibung in Saez, E. et al., (Curr. Opin. Biotechnol. 8: 608–616 (1997)). Dieses System ist darin sehr spezifisch, dass es nur dann anschaltet, wenn die Temperatur auf unterhalb 34°C eingestellt wird. Wie in mehreren Experimenten gezeigt wird, ist die Grundexpression mit den Standardnachweisverfahren, die in den vorangehenden Beispielen verwendet werden, nicht nachweisbar. Selbst mit dem sehr empfindlichen System der viralen Infektion (7A–7B und 9) konnte bei 37°C keine Grundexpression nachgewiesen werden. Dies zeigt den hohen Grad der Regulierungsstringenz, weil ein funktionelles Replikasemolekül einen autokatalytischen Zyklus der RNA-Replikation und -Transkription initiieren würde, was zu einem hohen Expressionsgehalt des interessierenden Proteins führen würde.
  • Wie weiterhin in 6A–6B gezeigt wird beginnt die Genexpression schnell nach der Induktion und stoppt kurz nachdem die Temperatur zurück auf einen restriktiven Wert eingestellt wird. Es gibt kein Problem mit der Bioverfügbarkeit des Induktors, weil sich die Temperatureinstellungen auf 29°C schnell ausbreiten und nicht toxisch sind. Sobald eine restriktive Temperatur erreicht worden ist hängt die Dauer der Genexpression nur von der Stabilität der mRNA ab, die das interessierende Protein oder die RNA kodiert.
  • Im Vergleich zu dem Tetracyclinsystem weist das in den vorangehenden Beispielen beschriebene System die Vorteile auf, dass es keine nachweisbare Grundexpression gibt und die Bioverfügbarkeit einer Temperatureinstellung viel weniger schädlich als das antibiotische Tetracyclin oder die Expression des tTA-Proteins ist. Ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen regulierbaren DNA-Vektorsystems besteht darin, dass nur ein Vektor in eine Wirtszellen eingeführt werden muss, weil alle relevanten Proteine, die zur Expression und Regulierung benötigt werden, durch diesen einen Vektor kodiert werden können. Dies steht im Gegensatz zu dem Tettracyclinsystem, bei dem zwei Vektoren in die Zellen transfiziert werden müssen (Gossen, M. & Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551 (1992)).
  • Wie schon bemerkt wurde ist das Ausschalten des pCYTts-Systems von der Stabilität der Replikase und der mRNA, die das interessierende Protein kodiert, abhängig.
  • Es wurde gezeigt, dass die Halbwertszeit der Replikase nach Expression eine halbe Stunde beträgt (De Groot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8967–8971 (1991)). Daher ist die mRNA-Stabilität der beschränkende Faktor, der bestimmt, wie schnell das System ausgeschaltet wird. Die SEAP-mRNA wurde zum Beispiel während ungefähr 10 Stunden nach Einstellen auf eine restriktive Temperatur translatiert (6A–6B). Diese hohe Stabilität wurde ebenfalls für CAT-mRNA gefunden (Xiong, C. et al., Science 243: 1188–1191 (1989)), was darauf hinweist, dass die von dem Sindbis-Virus stammende mRNA ohne Rücksicht auf das durch diese mRNA kodierte Protein sehr stabil ist.
  • Das System wurde in einer Mischpopulation getestet, um zu beweisen, dass das Expressionssystem von der Integrationsstelle und der Kopienzahl unabhängig ist, wie in 4A–4B und 5A–5B gezeigt wurde.
  • Folglich weist das temperaturregulierbare pCYTts-Genexpressionssystem, das in den vorangehenden Beispielen beschrieben wurde, gegenüber den im Allgemeinen verwendeten regulierbaren Systemen signifikante Vorteile auf. Aufgrund seines sehr geringen Grundexpressionsgehalts kann dieses System für die Expression von toxischen Wirtsproteinen verwendet werden, wie mit der Expression des HIV-Hüllproteins gp160 gezeigt wurde, was bis jetzt mit den früheren in vitro Genexpressionssystemen eine schwierige Aufgabe war. Da das vorliegende System ebenfalls auf Langzeitexpression und Reinduzierbarkeit getestet wurde, ist es für die Gentherapie verwendbar. Seine potentielle Verwendung zur Gentherapie wurde in der vorübergehenden Expression von GFP in menschlichen Hautzellen, die leicht für eine Temperaturregulierung zugänglich sind, gezeigt.
  • Es wird klar sein, dass die Erfindung anders ausgeübt werden kann, als insbesondere in der vorangehenden Beschreibung und in den Beispielen beschrieben ist.
  • Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind im Licht der vorstehenden Lehren möglich.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (25)

  1. DNA-Molekül, umfassend ein Polynukleotid, welches ein RNA-Molekül kodiert, wobei das RNA-Molekül folgendes umfasst: a) zumindest ein cis-aktives Sequenzelement; b) einen ersten offenen Leserahmen mit einer Nukleotidsequenz, die eine alphavirale, nicht-zytopatische, temperaturempfindliche und RNA-abhängige RNA-Polymerase kodiert; und c) zumindest eine zweite Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i) einen zweiten offenen Leserahmen, der ein Protein kodiert, oder ein Teil davon, wobei der zweite offene Leserahmen nach einem oder mehr RNA-abhängigen RNA-Replikationsereignissen in einer translatierbaren Form ist; ii) eine Sequenz, die zu dem gesamten oder einem Teil des zweiten offenen Leserahmens gemäß i) komplementär ist; und iii) eine Sequenz, die ein nicht translatiertes RNA-Molekül kodiert oder ein Komplement davon.
  2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei der zweite offene Leserahmen gemäß Anspruch 1(c)(i) ein Zytokin kodiert, ein Lymphokin, ein Tumornekrosefaktor, ein Interferon, ein toxisches Protein, ein ein Pro-pharmakon konvertierendes Enzym, humanes Erythropoietin, humanes ☐-Interferon oder ein anderes Protein.
  3. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die zweite Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1(c)(ii) oder Anspruch 1(c)(iii) ein nicht translatiertes RNA-Molekül kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense RNA- Molekül, einem RNA-Molekül, einem tRNA-Molekül, einem rRNA-Molekül oder einem Ribozym.
  4. Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 1.
  5. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die RNA-abhängige RNA-Polymerase von einem Sindbis-Virus stammt.
  6. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das DNA-Molekül eine RNA-abhängige RNA-Polymerase kodiert, die eine Replikaseaktivität bei Temperaturen unterhalb von 34°C aufweist und eine geringe oder nicht nachweisbare Replikaseaktivität bei 34°C und darüber.
  7. DNA-Vektorsystem, umfassend ein oder mehrere Polynukleotide, welche wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definierte RNA-Moleküle kodieren.
  8. RNA-Molekül, transkribiert von dem DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder dem DNA-Vektorsystem gemäß Anspruch 7.
  9. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend ein Einführen des DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6, des RNA-Moleküls nach Anspruch 8 oder des DNA-Vektorsystems nach Anspruch 7 in eine Wirtszelle.
  10. Eine in vitro Zellkultur, umfassend eine rekombinante Wirtszelle, umfassend das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das RNA-Molekül nach Anspruch 8 oder das DNA-Vektorsystem nach Anspruch 7 oder hergestellt mittels des Verfahrens nach Anspruch 9.
  11. Zellkultur nach Anspruch 10, wobei einige oder alle der DNA-Sequenzen des DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des DNA-Vektorsystems nach Anspruch 7 in der Wirtszelle stabil bestehen.
  12. Verfahren zur Herstellung alphaviraler Partikel, enthaltend das RNA-Molekül nach Anspruch 8, umfassend: (a) das Wachsen von Wirtszellen unter geeigneten Kultivierungsbedingungen; (b) das Einführen von zumindest einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des DNA-Vektorsystems nach Anspruch 7, das einen oder mehrere offene Leserahmen aufweist, welche virale Strukturproteine kodieren, in die Wirtszelle; und (c) das Gewinnen der viralen Partikel.
  13. Alphavirales Partikel, enthaltend zumindest ein RNA-Molekül nach Anspruch 8.
  14. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines nicht translatierten RNA-Moleküls in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend: (a) das Wachsen von Wirtszellen unter geeigneten Kultivierungsbedingungen; (b) das Einführen von zumindest einem Nukleinsäuremolekül in die Wirtszelle, wobei das Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6; (ii) das RNA-Molekül nach Anspruch 8; und (iii) das DNA-Vektorsystem nach Anspruch 7; oder Infizieren der Wirtszelle mit den alphaviralen Partikeln nach Anspruch 13 oder den alphaviralen Partikeln, welche mittels des Verfahrens nach Anspruch 12 hergestellt wurden; und (c) das Gewinnen des Proteins oder des nicht translatierten RNA-Moleküls.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Protein Erythropoietin ist.
  16. Verfahren zur Regulierung der Expression eines Proteins oder eines nicht translatierten RNA-Moleküls in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend: (a) das Wachsen von Wirtszellen unter geeigneten Kultivierungsbedingungen; (b) das Einführen von zumindest einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zumindest einem RNA-Molekül nach Anspruch 8 oder dem DNA-Vektorsystem nach Anspruch 7 in die Wirtszellen; und (c) das Ändern der Temperatur der Wirtszellenkultur von: (i) einer permissiven Temperatur zu einer restriktiven Temperatur; oder (ii) einer restriktiven Temperatur zu einer permissiven Temperatur.
  17. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend zumindest ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zumindest ein RNA-Molekül nach Anspruch 8, das DNA-Vektorsystem nach Anspruch 7, das alphavirale Partikel nach Anspruch 13, das alphavirale Partikel, hergestellt mittels des Verfahrens nach Anspruch 12, die rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 10 oder 11 oder die rekombinante Wirtszelle, hergestellt mittels des Verfahrens nach Anspruch 9 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  18. Genetisch verändertes, nicht humanes Lebewesen mit Wirtszellen, enthaltend zumindest ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das RNA-Molekül nach Anspruch 8, das DNA-Vektorsystem nach Anspruch 7 oder die rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 10 oder 11.
  19. Nicht humanes Lebewesen nach Anspruch 18, wobei das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder das DNA-Vektorsystem nach Anspruch 7 in das Wirtszellgenom stabil integriert ist.
  20. Verwendung von zumindest einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zumindest einem RNA-Molekül nach Anspruch 8, des DNA-Vektorsystems nach Anspruch 7, der rekombinanten Wirtszelle nach Anspruch 10 oder 11 oder der rekombinanten Wirtszelle, hergestellt mittels des Verfahrens nach Anspruch 9 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Regulierung des Expression eines Proteins oder eines nicht translatierten RNA-Moleküls.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Verabreichung an ein Individuum vorgesehen ist.
  22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, wobei die Regulierung der Expression eines Proteins oder eines nicht translatierten RNA-Moleküls eine Änderung der Temperatur von zumindest einem Teil des Individuums umfasst von: (i) einer permissiven Temperatur zu einer restriktiven Temperatur; oder (ii) einer restriktiven Temperatur zu einer permissiven Temperatur.
  23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die rekombinanten Wirtszellen von dem gleichen Individuum erhalten werden, dem die Wirtszellen verabreicht werden sollen.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei die rekombinanten Wirtszellen Keratinozyten, Epithelialzellen oder Fibroblasten sind.
  25. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Individuum ein Mensch ist.
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