JP2002509729A - 誘導性のアルファウイルス遺伝子発現系 - Google Patents

誘導性のアルファウイルス遺伝子発現系

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ウォルフガング エイ． レナー，
ラース ニーバ，
マルコ ブースマ，
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サイトス バイオテクノロジー アーゲー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、真核生物細胞における遺伝子発現の緻密な調節を可能にする新規な発現ベクターを提供する。より詳細には、本発明は、ＲＮＡ分子を形成するために転写されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを提供する。次いで、このＲＮＡ分子は、さらなるＲＮＡ分子を形成するために温度感受性レプリカーゼにより複製される。複製により作製されたこのＲＮＡ分子は、目的のタンパク質を産生するために翻訳され得るヌクレオチド配列か、または１つ以上の翻訳されないＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。また、異種のタンパク質および翻訳されないＲＮＡ分子を作製するための方法も提供される。さらに、異種のタンパク質および翻訳されないＲＮＡ分子を個体に投与するための方法が提供される。加えて、本発明のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、真核生物細胞中での遺伝子発現の強固な制御を可能にする新規な発
現ベクターに関する。本発明はまた、タンパク質およびＲＮＡ分子を生成する方
法、ならびにタンパク質およびＲＮＡ分子を植物または動物に投与する方法に関
する。
【０００２】 （関連分野） 動物またはヒト細胞中で導入された遺伝子、あるいは生物全体中の遺伝子の発
現を正確に制御する能力は、生物学および医学の多くの領域での進歩を可能にす
る。例えば、遺伝子発現の意図的な操作を可能にする方法は、その発現が構成的
に許容され得ない遺伝子、または発生の特定の段階の遺伝子の分析を容易にする
。これらの方法はまた、遺伝子治療のような臨床的適用にとって貴重である。こ
のような臨床的適用においては、治療用遺伝子の発現は、患者の必要性に従って
調節されなければならない。
【０００３】 広範に有益であるために、遺伝子調節技術は、遺伝子活性の迅速で、強固で、
正確、かつ可逆的な誘導を可能にしなければならない。Ｓａｅｚ，Ｅ．ら（Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６０８〜６１６（１９９７））に
概説されたように、理想の系は、以下の要件を満たすべきである： １．特異性−この系は、内因性因子に対して無作用であり、かつ外因性刺激に
よってのみ活性化されなければならない。
【０００４】 ２．非干渉性−この系の構成成分は、意図しない細胞経路に影響すべきではな
い。
【０００５】 ３．誘導可能性−不活性状態において、この系の基底活性は最小であるべきで
あるが、活性状態においては、高レベルの遺伝子発現は迅速に誘導可能であるべ
きである。
【０００６】 ４．誘導物質のバイオアベイラビリティ−誘導刺激は、目的の部位へ迅速に浸
透するべきである。
【０００７】 ５．可逆性−誘導刺激は、この系が迅速に不活性状態に戻ることができるよう
に、迅速になくなるべきである。
【０００８】 動物における遺伝子発現を制御する初期の方法は、内因性エレメント（例えば
、サイトカイン応答エレメントまたは熱ショックタンパク質）に基づいていた。
非誘導状態での高レベルの基底発現および一般的誘導物質により引き起こされた
多面発現性効果に起因して、これらの系は、哺乳動物細胞および生物中での遺伝
子を調節するのに必要な特性を欠いていた。
【０００９】 より進歩的機構は、非哺乳動物エレメントに依存する変換機構を構築すること
によってこれらの問題を回避しようと努めてきた。これらの系の基本的原則は、
合成転写因子の活性を改変する低分子（誘導物質）の存在に基づいており、この
合成転写因子は、異種プロモーターを介して標的遺伝子の発現を調節する。特異
性の増加は、哺乳動物の生理学に影響しない誘導物質を選択すること、および内
因性哺乳動物プロモーターと相互作用しないキメラトランスアクチベーター（天
然の転写因子と最小の相同性である）を組み立てることによって達成される。
【００１０】 遺伝子発現の調節のために現在使用される最も一般的系は、テトラサイクリン
ベースの系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７（１９９２））である。この系は、融合タン
パク質の連続発現に基づいており、この融合タンパク質中では、テトラサイクリ
ンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）が、ＶＰ１６タンパク質の転写活性ドメ
インへとの融合によって、アクチベーターへと変換されている。テトラサイクリ
ンの非存在下では、このキメラテトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴ
Ａ）が、最小プロモーターの上流に位置する天然のｔｅｔＲ結合部位（ｔｅｔＯ
）のマルチマーに結合することを介して遺伝子発現を活性化する。テトラサイク
リンの存在下では、このｔＴＡは、ｔｅｔＯ部位に結合することを妨げる高次構
造の変化を受け、それにより標的遺伝子の発現を阻止する。既存のアプローチを
超えるその有意な利点が原因で、このｔＴＡ系は、誘導性遺伝子発現に非常に有
用であり、そしてこの系は、多くのタンパク質の産生に首尾良く使用されてきた
（Ｗｉｍｍｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：９９５（１９９４）；Ｆｒｕｅｈら
、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２３６（１９９４）；Ｙｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０
：４５３０（１９９６））。
【００１１】 しかし、ｔＴＡタンパク質の毒性から生じる深刻な問題が、このｔＴＡ系につ
いて報告されており、そしていくつかの細胞型は、このｔＴＡタンパク質の発現
を許容し得ないことが示されている（Ｓｃｈｏｃｋｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６５２２（１９９５）；Ｈｏｗｅら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：１４１６８（１９９５）；Ｓｃｈｏｃｋｅｔおよび
Ｓｃｈａｔｚ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５１７
３（１９９６）；Ｂｏｈｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：２９９（１９９７））。培
養細胞中のｔＴＡの毒性は、適切なテトラサイクリン調節を有する安定なクロー
ンの確立を妨げるが、このｔＴＡ毒性は遺伝子治療においてより重要な問題であ
り、そして遺伝子治療におけるこのｔＴＡ系の使用も全く妨げ得る。
【００１２】 このｔＴＡ系のさらなる問題は、その顕著な基底発現である。基底発現は、結
合されるトランスアクチベーターの非存在下でのレポーター構築物の活性化、お
よび／またはテトラサイクリンが完全にｔＴＡトランスアクチベーションを抑制
し得ないことより生じ得る。高い基底発現は、この系の誘導性を制限し、そして
非常に毒性なタンパク質を用いる実験の伝導力（ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）を妨
げる（Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：
９３０２（１９９４）；Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．５９：４６３（１９９５）、Ｋｉｓｔｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０９３３（１９９６）；Ｈｏｆｆｍａｎｎ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：１０７８（１９９７））。
【００１３】 安定なクローンおよびトランスジェニック動物の場合、この基底発現のいくら
かは、外来ＤＮＡが組み込む染色体領域からの干渉に帰因され得る。全ての誘導
系が等しく組み込み効果に感受性ではないが、このｔＴＡ系の基底活性が、この
系が転写を効率的に抑制するために、テトラサイクリンの一定の存在（常には、
特にインビボでは達成し得ない）を必要とするという事実に帰因することは可能
である。基底発現、ならびにテトラサイクリンが遺伝子発現を抑制するために存
在するという要件が、このｔＴＡ系が遺伝子治療に使用されない理由である。
【００１４】 哺乳動物ステロイドホルモンレセプターの構成成分に基づく２つの遺伝子制御
系が公知である（Ｓａｅｚ，Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．８：６０８〜６１６（１９９７））。両方とも、短縮型のプロゲステロンレ
セプターホルモン結合ドメインを酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部分、およびＶＰ１
６タンパク質のトランスアクチベーションドメインと組合せている。この変異型
プロゲステロンレセプター部分は、プロゲステロンと結合しないが、プロゲステ
ロンおよびグルココルチコイドアンタゴニストミフェプリストン（ＲＵ４８６）
と結合する能力を保持し、その結果、ＲＵ４８６の存在下で、この融合タンパク
質（ＧＶＬＰまたはＴＡＸＩと呼ばれる）は、最小プロモーターの上流に位置す
るＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部位のマルチマーを介して転写を活性化する。
【００１５】 直前に記載されたこれらの系の重要な利点は、これらが、テトラサイクリンア
プローチよりも都合の良い動態学を有しているらしいことである。なぜなら、脂
肪親和性ホルモンは、迅速に代謝され、かつインビボで短い半減期を有するから
である。さらに、このようなホルモンはまた、テトラサイクリンよりも効率良く
、接近しがたい組織に浸透し得る。しかし、これらのホルモンレセプター系の主
要な不利は、その非常に高レベルの基底発現である。種々の細胞型の一過性かつ
安定なトランスフェクションにおいて、高レベルの基底活性は、これらのアプロ
ーチの誘導性を低下させ、約２０倍をほとんど超えない誘導比を生じる（Ｗａｎ
ｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８１８０（１９
９４）；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｃｅｌｌ ８３：８３５（１９９５）；Ｗ
ａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９（１９９７））。
【００１６】 遺伝子発現を調節する別のアプローチは、免疫抑制剤の作用機構についての研
究から派生した、タンパク質２量体化を誘導する方法に依存している（Ｓａｅｚ
，Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６０８〜６１６（
１９９７））。ＦＫ５０６の合成ホモダイマーを使用して、任意の２つのペプチ
ドに、ＦＫ５０６が結合するＦＫＢＰ１２のドメインを単に付与することによっ
て、結合させる一般的ストラテジーが考案された。免疫抑制剤（例えば、シクロ
スポリンＡまたはラパマイシン）がこのアプローチにおいて使用されなければな
らないので、このタンパク質２量体化アプローチのインビボ適用は、非常に制限
される。
【００１７】 上記の全てのストラテジーは、ｍＲＮＡの転写レベルを制御することにより発
現を調節する。このｍＲＮＡ転写機構は、常に外来ＤＮＡが挿入される染色体領
域によってある程度影響されるので、この組み込み機構を超える制御の欠失によ
って正確な調節は失敗する。相同組換えによるＤＮＡの部位特異的挿入のための
技術は利用可能であるが、挿入頻度があまりにも低く、このストラテジーが一般
的根拠に基づく遺伝子治療に成功することを不可能にする。
【００１８】 別の遺伝子発現系は、アルファウイルスに基づく（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．
、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７
））。アルファウイルスファミリーのいくつかのメンバーである、シンドビス（
Ｓｉｎｄｂｉｓ）（Ｘｉｏｎｇ Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８〜
１１９１（１９８９）：Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８〜２２（１９９３））、ＳＦＶ（Ｌｉｌｊｅｓｔｒ
ｏｅｍ，Ｐ．およびＧａｒｏｆｆ，Ｈ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：
１３５６〜１３６１（１９９１））ならびにその他（Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｌ．らＶ
ｉｒｏｌｏｇｙ １７１：１８９〜２０４（１９８９））は、種々の異なるタン
パク質のためのウイルスべースの発現ベクターとしての使用について、かなりの
注目を受けている（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７）；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｅｍ，Ｐ
．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９５〜５００（１９９
４））。
【００１９】 アルファウイルスは、（＋）鎖ＲＮＡウイルスであり、感染された細胞の細胞
質中完全に、かつＤＮＡ中間体を伴わずにそのゲノムＲＮＡを複製する（Ｓｔｒ
ａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５
８：４９１〜５６２（１９９４））。アルファウイルスが発現ベクターとして開
発され得るという考えは、１０年ほど前に最初に確立された（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８〜１１９１（１９８９））。それ以来、
いくつかの改良により、発現ベクターとしてのこれらのＲＮＡレプリコンの使用
がより実用的になってきた（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７））。
【００２０】 シンドビス（Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒ，Ｈ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
６：１４９５〜１５０１（１９９５）；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ、Ｔ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７０：５０８〜５１９（１９９６））およびＳＦＶ（Ｂｅｒｇｌｕｎ
ｄ，Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１３０〜１３４８１
９９６））の両方についてのＤＮＡベクターが開発されてきた。真核生物プロモ
ーターが、アルファウイルスレプリカ−ゼ遺伝子（４つの非構造タンパク質遺伝
子（ｎｓＰ１〜４）からなる）から上流のこれらのベクター中に導入される。ア
ルファウイルスレプリカ−ゼ遺伝子は、１つまたは２つのポリプロテインとして
翻訳され、次いでタンパク質分解により切断される（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およ
びＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２
（１９９４））。ＤＮＡは、核において組換え真核生物プロモーターからＲＮＡ
へと転写され、そして細胞質に輸送され、ここでレプリカ−ゼが、アルファウイ
ルスＲＮＡ分子の通常の複製の間と同様に、アルファウイルスＲＮＡ分子の複製
を触媒する（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。最近まで、異種配列の
一過性発現のみしか、アルファウイルスレプリカ−ゼの細胞変性性に起因して可
能でなかった（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７））。
【００２１】 約２０年前、Ｗｅｉｓｓら（Ｗｅｉｓｓ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４
６３〜４７４（１９８０））が、ＢＨＫ細胞の一貫して感染された培養を確立し
た。この表現型の原因である変異が、最近同定された（Ｄｒｙｇａ，Ｓ．Ａ．ら
、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８：７４〜８３（１９９７）。温度変化を介するｍＲ
ＮＡ転写の調節を可能にする別の変異が、ＢｕｒｇｅおよびＰｆｅｆｆｅｒｋｏ
ｒｎにより同定され（Ｂｕｒｇｅ，Ｂ．Ｗ．およびＰｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ，Ｅ
．Ｒ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０：２０３〜２１４（１９６６））、そしてＸｉ
ｏｎｇらによってより詳細に記載された（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４３：１１８８〜１１９１（１９８９））。
【００２２】 ＤＮＡ免疫（Ｈａｒｉｈａｒａｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０〜
９５８（１９８８））、リボザイム発現（Ｓｍｉｔｈ Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７１：９７１３〜９７２１（１９９７））、および哺乳動物組織における異種
タンパク質のインビボ発現における使用についての見込みを示すアルファウイル
ス配列を含むベクターが開発されている。
【００２３】 （発明の要旨） 本発明は、組換え宿主細胞中における、タンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子の
の調節された発現のための組成物および方法を提供する。より詳細には、本発明
は、安定にトランスフェクトされた組換え宿主細胞中で生成される特定のＲＮＡ
分子の量の正確な調節を可能にする、ポリヌクレオチドおよび方法を提供する。
この正確な調節は、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（すなわち、レ
プリカ−ゼ）の使用によって生じる。このＲＮＡポリメラーゼは、許容温度でＲ
ＮＡ分子のみを複製して、新しいＲＮＡ分子を形成する。
【００２４】 １つの一般的局面において、本発明のＤＮＡ発現ベクターは、インビボで転写
を開始し得る５’プロモーター、ＲＮＡ分子の複製を可能にする５’および／ま
たは３’配列（シス作用配列エレメント）、および目的の遺伝子の５’側にサブ
ゲノムプロモーター、ならびに1つ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象の後のみ 翻訳可能な目的の配列を含む。これらのＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象は、調節可
能なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される。このポリメラーゼは
、このＤＡＮベクターの転写によって生成される同じｍＲＮＡ分子によってか、
または異なるＲＮＡ分子によってコードされ得る。
【００２５】 別の局面において、本発明は、以下を含むＲＮＡ分子をコードするポリヌクレ
オチドを含むＤＮＡ分子を提供する：（ａ）少なくとも１つのシス作用配列エレ
メント、（ｂ）非細胞障害性の、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを
コードするヌクレオチド配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、な
らびに（ｃ）以下の１つをコードする、少なくとも１つの第２のヌクレオチド配
列： （ｉ）タンパク質またはその一部をコードする第２のオープンリーディングフ
レームであって、この第２のオープンリーディングフレームは、１つ以上のＲＮ
Ａ依存性ＲＮＡ複製事象の後に翻訳可能な様式である、第２のオープンリーディ
ングフレーム； （ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相
補的な配列；ならびに （ｉｉｉ）非翻訳ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分
子、ｒＲＮＡ分子、またはリボザイム）をコードする配列、またはその相補体。
【００２６】 本発明は、さらに、上記の第２のヌクレオチド配列を発現する、単一ベクター
系または複数ベクター系を提供する。単一ベクター系において、第１のオープン
リーディングフレームをコードする配列および第２のヌクレオチド配列は、同一
の核酸分子上に存在する。複数ベクター系において、第１のオープンリーディン
グフレームもしくはその小部分をコードする配列、および第２のヌクレオチド配
列は、1つ以上の別々の核酸分子上に存在する。
【００２７】 第１および第２のオープンリーディングフレームをコードする配列が、同一核
酸分子上か同一ベクター（すなわち、単一ベクター系）中のいずれかに存在する
場合、このオープンリーディングフレームの翻訳を阻害する領域は、第２のオー
プンリーディングフレームの５’側に存在する。
【００２８】 温度感受性レプリカ−ゼは、「低温（ｃｏｌｄ）」感受性または「高温（ｈｏ
ｔ）」感受性であり得、これにより制限温度より上か下のいずれかの温度でのみ
、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製を効率的に触媒する。１つの実施態様において、本発
明のＤＮＡ分子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、このポリメラ
ーゼは、３４℃より下の温度でレプリカ−ゼ活性を有し、そして３４℃以上の温
度では低いレプリカーゼ活性または検出不可能なレプリカ−ゼ活性を有さない。
【００２９】 本発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写産物、および本発明のパッケージングされた
ＲＮＡ分子を含むアルファウイルス粒子が、さらに提供される。パッケージング
されたＲＮＡ分子が生成される場合、第２のオープンリーディングフレームは、
このようなパッケージングに必要な１つ以上のタンパク質（例えば、シンドビス
構造タンパク質）をコードし得る。
【００３０】 別の局面において、本発明の核酸分子は、１つ以上のサイトカイン、リンフォ
カイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、毒性タンパク質、プロドラッグ転換
酵素、または他のタンパク質をコードする。
【００３１】 なお別の局面において、本発明の核酸分子は、非翻訳ＲＮＡ分子（例えば、ア
ンチセンスＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、またはリボザイム）をコ
ードする。
【００３２】 本発明はまた、組換え宿主細胞を作製する方法もまた提供し、この方法は、宿
主細胞に本発明の核酸分子を導入する工程を包含する。本発明の核酸分子の導入
によって作製される組換え宿主細胞が、さらに提供される。１つの実施態様にお
いて、これらの組換え宿主細胞のいくつかまたはすべては、安定に維持される１
つ以上の本発明のＤＮＡ分子を含む。
【００３３】 本発明はさらに、配列番号１のｐＣＹＴｔｓベクター、ならびに配列番号１の
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供す
る。
【００３４】 本発明はまた、組換え宿主細胞中でタンパク質および非翻訳ＲＮＡ分子を生成
する方法を提供し、この方法は、適切な培養条件下で宿主細胞を増殖させる工程
、宿主細胞に本発明の核酸分子を導入する工程、およびこの組換え宿主細胞によ
り生成されたタンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子を回収する工程を包含する。
【００３５】 異種ポリペプチド（サイトカイン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、インター
フェロン、毒性タンパク質、プロドラッグ転換酵素を含む）の調節された発現の
ための方法もまた提供される。
【００３６】 本発明の方法により生成されるタンパク質および非翻訳ＲＮＡ分子が、さらに
提供される。
【００３７】 本発明は、組換え宿主細胞中での異種タンパク質の発現を調節する方法もまた
提供し、この方法は、適切な培養条件下で宿主細胞を増殖させる工程、この宿主
細胞に本発明の核酸分子を導入する工程、および宿主細胞培養の温度を、許容可
能な温度から制限的温度へか、または制限的温度から許容温度へのいずれかに変
化させる工程を包含する。１つの実施態様において、本発明の核酸分子は、原核
生物宿主細胞または真核生物宿主細胞へ導入され、次いで、これらの細胞は、イ
ンビトロで培養される。関連する実施態様において、これらの宿主細胞は、無血
清培地またはタンパク質のない培地中で培養される。
【００３８】 組換え宿主細胞中でタンパク質を生成する方法もさらに提供され、この方法は
、適切な培養条件下で宿主細胞を増殖させる工程、この宿主細胞を、本発明のＲ
ＮＡ分子を含むアルファウイルス粒子で感染させる工程、およびタンパク質を回
収する工程を包含する。
【００３９】 個体内で、組換え宿主細胞中の本発明の核酸分子の導入および発現のための方
法もまた提供される。これらの組換え宿主細胞が、個体中でポリペプチドまたは
非翻訳ＲＮＡ配列を発現することが意図される場合、本発明の核酸分子は、イン
ビボまたはエキソビボのいずれかで宿主細胞中へ導入され得る。この核酸分子が
エキソビボで宿主細胞中へ導入される場合、この組換え宿主細胞は、それらが得
られた個体へ投与されるか、または異なる個体へ投与されるかのいずれかであり
得る。特定の実施態様において、この宿主細胞は哺乳動物ケラチノサイト、上皮
細胞、または線維芽細胞であり、これらはこれらが得られたのと同じ哺乳動物へ
再導入される。
【００４０】 本発明は、個体中でのタンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子の発現を調節する方
法をさらに提供し、この方法は、個体に本発明の核酸分子を投与する工程、およ
びこれらの個体の少なくとも一部の温度を、許容温度から制限的温度へか、また
は制限的温度から許容温度へのいずれかに変化させる工程を包含する。
【００４１】 本発明はまた、個体にタンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子を投与する方法を提
供し、この方法は、個体に本発明の核酸分子を投与する工程、およびこれらの個
体の少なくとも一部の温度を、制限的温度から許容温度へ変化させる工程を包含
する。
【００４２】 本発明はさらに、個体において、タンパク質または非翻訳ＲＮＡ分子の発現を
調節する方法を提供し、この方法は、これらの個体に本発明の組換え宿主細胞を
投与する工程、およびこれらの個体の少なくとも一部の温度を、許容温度から制
限的温度へか、または制限的温度から許容温度へのいずれかに変化させる工程を
包含する。
【００４３】 １つの実施態様において、宿主細胞は、組換え宿主細胞が投与されるのと同じ
個体から入手される。別の実施態様において、これらの組換え宿主細胞はケラチ
ノサイトである。
【００４４】 本発明はまた、本発明の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬
学的組成物を提供する。
【００４５】 本発明はさらに、遺伝子操作された非ヒト動物であって、少なくともそれらの
いくつかの細胞に本発明の核酸分子を含む、非ヒト動物を提供する。遺伝子操作
された非ヒト動物であって、その動物細胞のいくつかのゲノムまたは全てのゲノ
ム中に安定に組み込まれた本発明のＤＮＡ分子を含む非ヒト動物もまた提供され
る。本発明はまた、遺伝子操作された非ヒト動物を作製する方法を提供し、この
方法は、体細胞および生殖細胞系列細胞中に目的の配列を含むトランスジェニッ
ク動物を作製するために、本発明の核酸分子を含む細胞をこれらの動物に導入す
る工程、本発明の核酸分子をインビボでこれらの動物の細胞に導入する工程、ま
たは本発明のＤＮＡ分子を生殖細胞系細胞に導入する工程を包含する。
【００４６】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 本発明は、調節可能でかつ非細胞変性である改善された発現ベクター、ならび
にこれらのベクターを使用して目的のタンパク質分子およびＲＮＡ分子を生成す
るための方法に関する。
【００４７】 本発明は、宿主細胞において生成される特定のＲＮＡ分子の量の正確な調節を
可能にするポリヌクレオチドおよび方法を提供する。この正確な調節は、許容温
度にて、さらなるＲＮＡ分子を形成するための、ＲＮＡ分子しか複製しない温度
感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの使用により得られる。
【００４８】 本発明はさらに、誘導可能な遺伝子発現系に関し、アルファウイルスＤＮＡベ
クターを使用して、非細胞変性で温度感受性のウイルス非構造レプリカーゼタン
パク質をコードする遺伝子を保有する安定な細胞株を作製する。例えば、以下に
記載される実施例において使用される温度感受性レプリカ−ゼの活性は、トラン
スフェクト細胞の温度を、３７℃の温度から３４℃より低い温度に低下すること
によって作動する。宿主細胞の発現は３７℃では検出レベルより下であり、そし
てこの誘導プロフィールは、染色体挿入部位に無関係である。
【００４９】 （定義） 以下の定義は、本発明者らが本発明であるとみなす主題を明瞭にするために提
供される。
【００５０】 本明細書で使用される場合、用語「アルファウイルス」とは、Ａｌｐｈａｖｉ
ｒｕｓ属に含まれるＲＮＡウイルスのいずれかをいう。この属のメンバーの説明
は、ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５
８：４９１−５６２（１９９４）に含まれている。アルファウイルスの例として
は、アウラウイルス、Ｂｅｂａｒｕウイルス、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス、チク
ングニヤウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎウイル
ス、Ｇｅｔａｈウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、Ｍａｙｏａｒｏウイ
ルス、Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇウイルス、Ｍｕｃａｍｂｏウイルス、Ｎｄｕｍｕウ
イルス、Ｐｉｘｕｎａウイルス、Ｔｏｎａｔｅウイルス、Ｔｒｉｎｉｔｉウイル
ス、Ｕｎａウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、Ｗｈａｔａｒｏａウイルス、
シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエ
ラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）、およびロス川ウイルスが挙げられる。
【００５１】 本明細書で使用される場合、用語「精製した」とは、分子に関して使用され、
この用語は、精製した分子の濃度が、その分子の天然の環境においてその分子に
関連する分子に対して相対的に増大していることを意味する。天然に関連する分
子としては、タンパク質、核酸、脂質および糖が挙げられるが、一般に、水、緩
衝液、および統合性を維持するためにまたは精製する分子の精製を容易にするた
めに添加される試薬は含まれない。例えば、ｍＲＮＡが、オリゴｄＴカラムクロ
マトグラフィーの間、水性溶媒で希釈された場合でさえ、天然に関連する核酸お
よび他の生物学的な分子がカラムに結合しない場合、ｍＲＮＡ分子はこのクロマ
トグラフィーによって精製され、そして対象ｍＲＮＡ分子から分離される。
【００５２】 本明細書で使用される場合、用語「単離した」とは、分子に関して使用され、
この用語は、分子がその天然の環境から取り出されたことを意味する。例えば、
生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリぺプチドは、「単
離」されていないが、その天然の状態の共存している材料から分離した同じポリ
ヌクレオチドまたはポリぺプチドは「単離」されている。さらに、ベクター中に
含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために、単離されていると考えら
れる。単離したＲＮＡ分子は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子のインビボまたはイ
ンビトロでのＲＮＡ複製産物を含む。単離した核酸分子はさらに、合成的に生成
された分子を含む。さらに、組換え宿主細胞に含まれるベクター分子もまた、単
離されている。したがって、全ての「単離」した分子が「精製」されている必要
はない。
【００５３】 本明細書で使用される場合、句「低いまたは検出不可能」とは、遺伝子発現レ
ベルに関して使用される場合、その遺伝子が最大に誘導されるときに見られる発
現レベルよりも有意に低い（例えば、少なくとも５倍低い）発現レベルか、また
は以下の実施例の節で使用される方法によって容易に検出されない発現レベルの
いずれかをいう。
【００５４】 本明細書で使用される場合、句「個体」とは、多細胞生物をいい、そして植物
および動物の両方を含む。好ましい多細胞生物は動物であり、さらに好ましくは
脊椎動物であり、なおさらに好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトで
ある。
【００５５】 本明細書で使用される場合、句「シス作用」配列とは、ＲＮＡ分子のＲＮＡ依
存性の複製を触媒するためにレプリカーゼが結合する核酸配列をいう。これらの
複製事象は、全長ＲＮＡ分子および部分的ＲＮＡ分子の複製を生じ、したがって
、アルファウイルスの部分ゲノムプロモーターもまた「シス作用」配列である。
シス作用配列は、核酸分子の５’末端、３’末端、もしくは両方の末端またはそ
の近傍、ならびに内部に位置させ得る。
【００５６】 本明細書で使用される場合、句「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」とは、別
のＲＮＡ分子からのＲＮＡの生成を触媒するポリメラーゼをいう。この用語は、
本明細書中において、用語「レプリカーゼ」と同じ意味で使用される。
【００５７】 本明細書で使用される場合、句「非感染性にパッケージングされたＲＮＡ分子
」とは、パッケージングされたＲＮＡ分子をいい、これは、基本的に１回の宿主
細胞感染のみを起こし、そして病原性ではない。したがって、これらの分子は「
感染性」であるが宿主細胞への１回の感染進入のみについてであり、そしてさら
なる感染性粒子を形成するための複製をし得ない。
【００５８】 本明細書で使用される場合、用語「転写」とは、ＲＮＡポリメラーゼによって
触媒される、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ分子の生成をいう。
【００５９】 本明細書で使用される場合、句「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象」とは、ＲＮＡ
分子を鋳型として使用して、ＲＮＡ分子の形成を生じるプロセスをいう。
【００６０】 本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、遺伝物質を宿主細胞に感染す
るために使用される因子（例えば、プラスミドまたはウイルス）をいう。ベクタ
ーは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成され得る。
【００６１】 本明細書で使用される場合、用語「異種配列」とは、本発明のベクター中に存
在する第二のヌクレオチド配列をいう。用語「異種配列」はまた、本発明のベク
ターに含まれる異種ＤＮＡ配列によってコードされる任意のアミノ酸配列、また
はＲＮＡ配列をいう。異種ヌクレオチド配列は、タンパク質またはＲＮＡ分子の
存在する細胞型において正常に発現されるタンパク質またはＲＮＡ分子をコード
し得るか、またはその細胞型において正常に発現されない分子（例えば、シンド
ビス構造タンパク質）をコードし得る。
【００６２】 本明細書で使用される場合、句「翻訳されないＲＮＡ」とは、オープンリーデ
ィングフレームをコードしないか、またはオープンリーディングフレームもしく
はその部分をコードするが、その構成においてアミノ酸配列を生成しない（例え
ば、開始コドンが存在しない）ＲＮＡ配列もしくは分子をいう。このような分子
の例は、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、およびリボザイムである。アンチセンス
ＲＮＡは翻訳され得ないが、いくつかの場合において（実施例１１を参照のこと
）、アンチセンス配列は翻訳可能なセンス鎖に転換され得、この鎖からポリぺプ
チドを生成する。
【００６３】 本明細書で使用される場合、句「遺伝子治療」とは、疾患または障害の治療的
な処置のために、異種の遺伝情報を細胞へ伝達することをいう。異種ヌクレオチ
ド配列を細胞に伝達し、そしてポリぺプチド分子または翻訳されないＲＮＡ分子
を生成するように発現させる。
【００６４】 本明細書で使用される場合、句「温度感受性」とは、ある温度では反応を容易
に触媒するが、別の温度では同じ反応を緩やかに触媒するかまたは全く触媒しな
い酵素をいう。温度感受性の酵素の例は、ｐＣＹＴｔｓベクターによってコード
されるレプリカーゼタンパク質であり、これは、３４℃より下の温度では容易に
検出可能なレプリカーゼ活性を有し、そして３７℃では低い活性かまたは検出不
可能な活性を有する。
【００６５】 本明細書で使用される場合、句「許容温度」とは、酵素が相対的に高いレベル
の触媒活性を有する温度をいう。
【００６６】 本明細書で使用される場合、句「制限温度」とは、酵素が低いかまたは検出不
可能なレベルの触媒活性を有する温度をいう。「高温」および「低温」感受性変
異体の両方は公知であり、したがって、制限温度は、許容温度より高いかまたは
低い。
【００６７】 本明細書で使用される場合、用語「組換え宿主細胞」とは、本発明の１つ以上
の核酸分子が導入された宿主細胞をいう。
【００６８】 用語「１つ（ｏｎｅ）」、「１つ（ａ）」もしくは「１つ（ａｎ）」が本明細
書で使用される場合、これらは、他に示されない限り、「少なくとも１つ」また
は「１つ以上」を意味する。
【００６９】 （本発明のアルファウイルスベクター） 本発明のＤＮＡベクターは、宿主細胞において構成的に転写され、２つのオー
プンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ分子を生成する。これらのオープン
リーディングフレーム（これらは、同じ核酸分子から生成されてもよいしまたは
生成されなくてもよい）は、温度感受性レプリカーゼおよび目的の異種遺伝子を
コードする。第１のオープンリーディングフレームは、温度依存性ＲＮＡ依存性
ＲＮＡポリメラーゼを生成するように翻訳される。第２のオープンリーディング
フレーム（目的の１つ以上のポリぺプチドの全てまたは部分をコードする）は、
少なくとも１つのＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象の後まで翻訳されない。
【００７０】 ＤＮＡ発現ベクターは、インビボでＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモータ
ー、ＲＮＡ分子の複製を可能にする５’および／または３’配列（５’および３
’シス作用配列エレメント）、ならびに少なくとも１つの複製事象の後にのみ転
写可能になる目的の配列を含む。複製は、同じｍＲＮＡ分子上または異なるｍＲ
ＮＡ分子上で代替的にコードされる、調節可能なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼによって触媒される。目的の配列は、センスにおいて、ウイルスＲＮＡプロモ
ーターのプラス（＋）指向性下流にコードされ得る。目的の遺伝子のコード配列
の翻訳は、単一ベクター系に関しては、一般にレプリカーゼ配列である５’配列
によって阻害される。複数ベクター系においては、５’配列は、リボソームの解
離を誘導する、会合した終止コドンを有する１つ以上の短いオープンリーディン
グフレームを有することによって翻訳を阻害し得る。同様に、目的の配列へのリ
ボソームの移動または結合を阻害する任意の配列が、翻訳を阻害する５’配列と
して使用され得る（ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９０））。
【００７１】 ほとんどの生物学的な系において、ヌクレオチド配列の翻訳を防止するための
別の方法は、アンチセンス方向への配列の挿入を含む。翻訳を阻害するこの方法
は、一般に、センス方向においてオープンリーディングフレームを有するプラス
鎖へのこのマイナス（−）鎖ＲＮＡの複製の後のみに翻訳が起こるという原理に
基づく。翻訳されたセンス鎖はＲＮＡ複製によって形成され、そしてリボソーム
およびタンパク質合成のための鋳型として利用される。実施例１１に示されるよ
うに、アミノ酸配列の生成は、目的の遺伝子が、サブゲノムプロモーターに対し
てアンチセンスＲＮＡ配列３’の形成を生じる方向でＤＮＡ分子に挿入された場
合でさえ生じ得る。したがって、第２のオープンリーディングフレームはまた、
上記の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に相補的な配列を
含み、そしてコードされたアミノ酸配列の発現は依然として生じる。翻訳されな
いアンチセンスＲＮＡ配列の生成が所望される場合、このＲＮＡ分子は、これが
タンパク質合成のための鋳型として利用されないように設計され得る。例えば、
ＲＮＡは、開始コドンが存在しないように設計され得る。
【００７２】 翻訳されないアンチセンスＲＮＡ分子を使用して、組換え宿主細胞において発
現されるｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。遺伝子発現を調節するためのアンチセン
ス核酸分子の使用は、当該分野において公知であり（例えば、Ｋａｗａｍａｔａ
，Ｈ．ら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７：７１−７８（１９９８）；Ｂｅｃｈ
ｌｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４
１：１９３−１９９（１９９７）；Ｕｒａｋａｍｉ，Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４１：２４−３０（１９９７）を参
照のこと）、そしてこのような分子を宿主細胞に送達するための本発明のベクタ
ーの使用は、本発明の範囲内である。
【００７３】 さらに、第２のオープンリーディングフレームの代わりに、本発明のＤＮＡ配
列の転写によって直接的に生成されたＲＮＡ分子は、アンチセンス方向に翻訳さ
れないしまた存在もしないＲＮＡ配列をコードし得る。このような翻訳されない
ＲＮＡ分子の例としては、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、およびリボザイムが挙
げられる。定義された触媒活性を有するかなりの数のリボザイム配列が当該分野
において公知である（例えば、Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２６：３５３−３５４（１９９８）；Ｘｉｅ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３７７７−１３７８１（１９９７
）；Ｌａｖｒｏｖｓｋｙ．Ｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６２：１１
−２２（１９９７）；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｋ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．，Ｃｈ
ｅｍ Ｂｉｏｌ．２：３２５−３３３（１９９５）を参照のこと）。さらに、リ
ボザイムは、リボザイム媒介メッセージ欠失ストラテジーの一部として、真核生
物細胞内の特定の遺伝子の発現を「ノックアウト」するために使用されてきた（
Ｘｉｅ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３
７７７−１３７８１（１９９７））。さらに、アルファウイルスレプリコンは、
哺乳動物細胞において機能的なリボザイムを発現させるために使用されてきた（
Ｓｍｉｔｈ Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１３−９７２１（１９９７）
）。したがって、このようなリボザイム、および翻訳されない他のＲＮＡ分子の
調節された発現は、本発明の範囲内である。
【００７４】 本発明は、図１に示される説明図により例示される。本発明のこれらの実施態
様は、レプリカーゼおよび目的の遺伝子をコードする、２つのオープンリーディ
ングフレームを有するｍＲＮＡ分子を生成するように転写されるＤＮＡベクター
に関する。このＤＮＡベクターは、両方のオープンリーディングフレームのコー
ド配列を有するｍＲＮＡ分子を生成するように、これらのベクターの転写を駆動
するプロモーター配列を含む。第１のオープンリーディングフレームのｍＲＮＡ
配列が翻訳されて、第２のオープンリーディングフレームのＲＮＡ配列の発現に
必要とされるレプリカーゼを生成する。第２のオープンリーディングフレームは
、１つ以上の目的のタンパク質をコードする。
【００７５】 さらに、第１のｍＲＮＡ分子が、一旦ＤＮＡベクターから転写されると、さら
なるＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象が生じて、第１のｍＲＮＡ配列を増幅し、そし
て第１のｍＲＮＡ配列の反対の鎖方向性を有するＲＮＡ分子を生成する。
【００７６】 図１、節（７）〜（８）、（１０）、および（１２）〜（１３）において示さ
れるように、全長ＲＮＡ分子の部分的複製後に、本発明のＤＮＡ分子の第２のオ
ープンリーディングフレームのみが発現される。この全長ＲＮＡ分子の部分的複
製は、ＲＮＡから構成されるプロモーター配列（例えば、アルファウイルスサブ
ゲノムプロモーター配列）によって駆動される。
【００７７】 目的の遺伝子は、レプリカーゼタンパク質と同じＲＮＡ分子によってコードさ
れ得るが、この遺伝子はまた別のＲＮＡ分子によってコードされ得る。従って、
本発明はさらに、目的の遺伝子を発現するための単一ベクター系および複数ベク
ター系の両方を提供する。
【００７８】 本発明の単一ベクター系において、第１のオープンリーディングフレームおよ
び第２のヌクレオチド配列をコードする配列は、同じ核酸分子の成分である。従
って、目的の遺伝子の調節された発現のために必要とされる成分のすべては、単
一の核酸分子（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に含まれる。
【００７９】 本発明の複数ベクター系において、第１のオープンリーディングフレームまた
はそのサブ部分をコードする配列、および第２のヌクレオチド配列は、異なる核
酸分子の成分である。従って、これらの複数ベクター系は、２つ以上の核酸分子
を含み得る。例えば、ｎｓＰ２、ｎｓＰ４、および目的の遺伝子は、それぞれ異
なるＤＮＡベクターによってコードされ得る。さらに、これらのＤＮＡベクター
のうちの１つ以上は、宿主細胞ゲノムに安定に組み込むように設計され得る。目
的の遺伝子の発現が、本発明の１つ以上の安定に組み込まれたＤＮＡ分子を含む
細胞型において所望される場合、目的の遺伝子の発現は、組み込まれた分子中に
存在しない系の成分をコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の細胞への導
入を必要とする。
【００８０】 任意の機能的プロモーターは、ＤＮＡベクターからのｍＲＮＡの転写を駆動す
るために使用され得るが、このプロモーターは、好ましくは構成性ＲＮＡポリメ
ラーゼＩＩプロモーターである（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモ
ーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）プロモーター
、糖質コルチコイドプロモーター、メタロチオネインプロモーター、単純ヘルペ
スウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒ
トポリオーマウイルスＢＫ（ＢＫＶ）プロモーター、またはモロニーマウス白血
病ウイルス（ＭｕＬＶ）プロモーター）。本発明の実施における使用のために適
切なさらなるプロモーターは、当該分野において公知である（例えば、Ｌｅｅ，
Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ． ７：４９５〜５０１（１９９７）；Ａｒｔｕｃ
，Ｍ．ら、Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４：３１７〜３２１（１９９５）を参照
のこと）。
【００８１】 ベクターはまた、一般に、原核生物および真核生物におけるベクター配列のク
ローニングおよび増幅のための選択マーカーを含む。例えば、ｐＣＹＴｔｓベク
ターは、細菌宿主細胞におけるポジティブ選択のためのアンピシリン耐性マーカ
ーおよびＥ．ｃｏｌｉの複製起点（すなわち、ＣｏｌＥ１）を含む。さらなる選
択マーカーおよび複製起点をコードする大多数の配列が当該分野において公知で
ある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩ
ＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵ
ＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ
，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）を参照のこ
と）。
【００８２】 レプリカーゼタンパク質コード配列、５’および３’シス作用性配列（存在す
る場合）、およびサブゲノムプロモーターを含む結合配列は、通常、ウイルス由
来、好ましくはアルファウイルス由来、最も好ましくはシンドビスウイルス由来
である。
【００８３】 ほとんどの場合において、アルファウイルスレプリカーゼタンパク質を使用す
る場合、レプリカーゼタンパク質の細胞変性表現型を、非細胞変性表現型に変換
することが望ましい。そのような表現型を付与する好ましい変異は、ｎｓｐ２遺
伝子中に存在する（例えば、７２６位のプロリン残基は、セリン残基で置換され
る）。レプリカーゼタンパク質を非細胞変性性にする変異は当該分野において公
知である（Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４６３〜４７４（１９８０）
；Ｄｒｙｇａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８：７４〜８３（１９９７））。これ
らの変異は、多くの手段（部位特異的変異誘発を含む）によって導入され得る。
【００８４】 上述のように、非細胞変性性シンドビスウイルスレプリカーゼが本発明の実施
において使用される場合、変異がｎｓｐ２遺伝子中に導入され得る。１つのその
ような変異は、７２６位でのプロリン残基の、２０の天然に存在するアミノ酸の
うちの別のものへの変換（例えば、セリン、「Ｐｒｏ ７２６ Ｓｅｒ」と省略
される）から生じる。あるいは、レプリカーゼ分子を非細胞変性性にする任意の
他の変異は、本発明の範囲内である。シンドビスレプリカーゼを非細胞変性性に
する変異の作製および同定は、他により詳細に記載されている（Ｗｅｉｓｓら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４６３〜４７４（１９８０）；Ｄｒｙｇａら、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ ２２８：７４〜８３（１９９７）；特許出願ＷＯ９７／３８０８７）
。さらに、そのような変異を導入するための方法が当該分野において公知である
（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ
，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲ
ＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊ
ｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）を参照のこと）
。
【００８５】 例えば、温度感受性（ｔｓ）は、レプリカーゼのｎｓｐ４遺伝子における変異
の導入によって付与され得る。好ましくは、温度感受性表現型をレプリカーゼ活
性に与える変異は、相補性群Ｆ中のタンパク質中に存在する（Ｌｅｍｍら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６４：３００１〜３０１１（１９９０））。例えば、温度感受性表
現型は、ｎｓｐ４のＧｌｙ１５３のＧｌｕへの変化によって付与され得る。さら
に、レプリカーゼ活性を温度感受性にする任意の他の変異は、本発明の実施にお
いて使用され得る。新しい温度感受性変異体を作製および同定するための方法は
、Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎによって記載されている（ＢｕｒｇｅおよびＰｆｅｆ
ｆｅｒｋｏｒｎ、Ｖｉｒｏｌ．３０：２０４〜２１３（１９６６）：Ｂｕｒｇｅ
およびＰｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ、Ｖｉｒｏｌ．３０：２１４〜２２３（１９６６
））。さらに、レプリカーゼ活性の温度感受性調節を可能にするｔｓ変異を産生
および同定するために有用な任意の方法を使用して、そのような変異体を生成お
よび単離し得る。
【００８６】 ほとんどの温度感受性変異体が「高温（ｈｏｔ）」感受性であるが、「低温（
ｃｏｌｄ）」感受性の変異体もまた公知である（例えば、Ｓｃｈｗｅｒ，Ｂ．ら
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：８０３〜８０９（１９９８）、
Ｍａｔｈｅ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１１：８８７〜８９６（１９９
８）、Ｄｏｅｄｅｎｓ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９０５４〜９０６４（
１９９７）、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：
２７６１２〜２７６１７（１９９７）を参照のこと）。温度感受性レプリカーゼ
は、「低温」または「高温」感受性であり得、従って、制限温度より高いかまた
はそれより低い温度のみのＲＮＡ複製を触媒する。１つの実施態様において、Ｒ
ＮＡ複製は、３４℃未満の温度のみで検出可能なレベルで生じる。関連する実施
態様において、ｐＣＹＴｔｓベクターまたはその改変体は、挿入された目的の遺
伝子を発現するために使用され、発現は、ベクターを含む細胞の温度を、３７℃
から約３４℃未満の温度に下げることによって誘導される。図４Ａ〜４Ｂにおい
て示されるように、ｐＣＹＴｔｓベクターによってコードされるレプリカーゼの
許容温度は、約３４℃未満である。さらに、目的の遺伝子の発現は、温度が約２
４℃から上昇される場合、最大発現レベルが約２９℃で達成されるまで増加する
。さらに、温度が約３４℃から下降するにつれて、目的の遺伝子の発現が上昇す
る。従って、ｐＣＹＴｔｓベクターによってコードされるレプリカーゼ活性につ
いての許容温度は、３４℃未満であり、そして２４℃未満の温度、ならびに２４
℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、およ
び３３℃、ならびに約３４℃までに介在する小数の温度を含む。
【００８７】 以前に公知のすべての調節可能なＤＮＡ発現系とは対照的に、３７℃で不活性
な状態にあるｐＣＹＴＳｔｓベクターを含む組換え宿主細胞における発現の基底
レベルは、標準的な方法（例えば、以下の実施例において使用される方法）を使
用して、検出レベル未満である。発現のこの低いレベルは、図４Ａ〜４Ｂ、図８
Ａ〜８Ｂ、図９、ならびに図１０において示されるデータから明白である。さら
に、遺伝子発現の温度依存性誘導プロフィールは、染色体組込み部位およびコピ
ー数から独立しているようである。
【００８８】 別の実施態様において、目的の配列および非細胞変性性調節可能レプリカーゼ
（例えば、Ｐｒｏ ７２６ Ｓｅｒ変異を有するｎｓｐ２、およびＧｌｙ １５
３ Ｇｌｕ変異を有するｎｓｐ４）は、２つの別のＤＮＡベクターによってコー
ドされる。そのような場合において、目的の配列を有するＤＮＡベクターは、シ
ス作用性配列および目的の配列の翻訳を阻害する５’領域の両方を有する。この
非細胞変性性調節可能レプリカーゼ遺伝子はまた、目的の配列を有するＤＮＡ分
子とは異なるＤＮＡ分子によってコードされ得る。この複数ベクター系における
目的の配列の複製および翻訳は、１つのベクター系におけるように温度によって
調節可能である。
【００８９】 本発明のベクターはまた、目的の１つより多い遺伝子の発現を調節するために
使用され得る。例えば、組換え宿主細胞は、１つより多くの本発明の核酸分子で
トランスフェクトされる。ここで、１つの核酸分子は、レプリカーゼおよび目的
のポリペプチドの両方をコードし、さらなる核酸分子は、目的のさらなるポリペ
プチドをコードし得る。同様に、非細胞変性性および温度感受性を付与する変異
の両方が使用される場合、適切な変異を有するポリペプチド（例えば、ｎｓｐ２
におけるＰｒｏ ７２６ Ｓｅｒ、およびｎｓｐ４におけるＧｌｙ １５３ Ｇ
ｌｕ）をコードする遺伝子は、別の核酸分子上に存在し得る。さらなる改変は、
当業者に明らかである。
【００９０】 実施例１１において示されるように、目的の配列はまた、機能的プロモーター
（例えば、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）プロモーター）から下流にアン
チセンス方向で挿入され得る。この構築物は、目的のタンパク質の産生によって
示されるようなセンス極性を有するプラス（＋）鎖に変換される。これらのデー
タは、アンチセンスＤＮＡフラグメントを本発明と共に使用して、機能的ポリペ
プチドまたはそのサブ部分を発現し得ることを示す。これらのデータはさらに、
アンチセンスＤＮＡが転写のための鋳型として使用される場合、５’および３’
ＣＳＥが、ウイルス転写に必要でなくともよいことを示す。
【００９１】 本発明のＤＮＡ分子はまた、ＲＮＡ分子のウイルス粒子へのパッケージングを
指向するパッケージングシグナルを含み得る。これらのＲＮＡ分子は、野生型ウ
イルスまたは欠陥ヘルパーウイルスのＲＮＡの存在下でパッケージングされ得る
。欠陥ヘルパーＲＮＡ分子の開発で有意な改良がなされた（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅ
ｋ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９〜６４４６（１９９３））。これ
らのＲＮＡ分子は、全長転写産物の複製に必要とされるシス作用性配列、および
構造タンパク質遺伝子の発現を駆動するサブゲノムＲＮＡプロモーター配列を含
む。例えば、パッケージングシグナルを有するＲＮＡ分子および欠陥ヘルパーウ
イルスＲＮＡの両方を含む細胞において、アルファウイルス非構造タンパク質は
、翻訳されてビリオン構造タンパク質を産生する欠陥ヘルパーウイルスＲＮＡ配
列の複製および増幅を可能にする。ヘルパーウイルスＲＮＡはパッケージングシ
グナルを欠くので、これらの分子は、アセンブリされたビリオンにパッケージン
グされない。従って、このような方法で産生されたビリオン粒子は、本質的に、
目的の遺伝子をコードするＲＮＡ配列のみを含み、一般に遺伝子発現の温度感受
性調節に必要な他の配列を含む。これらの非感染性のパッケージングされたＲＮ
Ａ分子は、ビリオン構造タンパク質をコードする配列を含まず、従って１回のみ
の宿主細胞感染を受け、そして病原性ではない。
【００９２】 非感染性のパッケージングされたＲＮＡ分子は、単に、その粒子を、これらの
細胞を含む培養培地に添加することによって、適切な宿主細胞の培養物を感染す
るために使用され得る。非感染性アルファウイルス粒子の調製は、「Ｓｉｎｄｂ
ｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」バージョンＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎカタログ番号Ｋ７５０−１）を含む、多くの供給源において記載されている
。
【００９３】 この系の１つの適用は、非感染性のパッケージングされたＲＮＡ分子の温度依
存性生成に関する。これらのパッケージングされたＲＮＡ分子は、２つの異なる
ＤＮＡ分子（例えば、本発明のＤＮＡ分子、およびヘルパーウイルスＲＮＡ配列
をコードするＤＮＡ分子）を含む組換え宿主細胞を用いることを含む多くの手段
によって産生され得る。例えば、これらのＤＮＡ分子のうちの１つは、パッケー
ジングシグナル配列、非細胞変性性温度感受性レプリカーゼをコードする配列、
および目的の遺伝子を含むＲＮＡ分子をコードする。他のＤＮＡ分子は、アルフ
ァウイルスサブゲノムプロモーターから下流のアルファウイルス構造タンパク質
をコードする配列を含む。そのような系を用いて、パッケージングシグナルを有
するＲＮＡ分子のみを含むウイルス粒子が、組換え宿主細胞において許容温度で
産生される。このことはそのとおりである。なぜなら、アルファウイルス構造タ
ンパク質は、許容温度で産生されるのみだからである。上記のさらなる改変体は
、当業者に明らかである。
【００９４】 広範な種々の目的のヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子発現系によって発現
され得る。これらの配列には、以下をコードする配列が挙げられるがそれらに限
定されない：リンホカイン、サイトカイン、トキシン、酵素、プロドラッグ変換
酵素、免疫応答を刺激する抗原、単鎖抗体、免疫応答を刺激または阻害するタン
パク質、腫瘍壊死因子、および治療的適用を有する種々のタンパク質（例えば、
成長ホルモンおよび調節因子）。
【００９５】 実施例５において示されるように、本発明のベクターによって発現される異種
配列はまた、エリトロポエチン（ＥＰＯ）をコードし得る。ＥＰＯは、サイトカ
インファミリーに属する糖タンパク質であり、そして最終の赤血球発達を誘導す
る。このタンパク質はまた、赤血球産生を調節する。
【００９６】 異種配列はまた、サイトカインまたはリンホカイン（例えば、β−インターフ
ェロン）をコードし得る。造血は、種々の造血細胞の増殖および／または分化を
刺激するリンホカインおよびサイトカインによって調節される。サイトカインお
よびリンホカインの代表的な例には、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、イン
ターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インター
ロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイ
キン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン
−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１
０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン
−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイ
キン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インター
ロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、顆粒
球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（
ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、およびイン
ターフェロンが含まれる。
【００９７】 異種配列はまた、分泌型酵素（例えば、分泌型アルカリホスファターゼ）、細
胞質酵素（例えば、グリーン蛍光タンパク質）、または治療的適用を有する任意
の数の他のタンパク質（例えば、ヒトインスリン、ヒト凝固因子ＶＩＩＩ）をコ
ードし得る。
【００９８】 本発明のベクターはまた、細胞傷害性ポリペプチドをコードする異種配列を発
現するために使用され得る。細胞傷害性ポリペプチドは、細胞増殖または代謝を
直接的または間接的に阻害するように作用する。トキシンの代表的な例は、Ｓｈ
ｉｇｅｌｌａトキシン、リシン、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａトキシン、Ｃｈｏｌｅｒ
ａトキシン、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ、およびＨｅｒｐｅｓ
ｓｉｍｐｌｅｘウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）を含む。本発明の他の
実施態様において、異種配列は、プロドラッグ変換酵素をコードする。プロドラ
ッグ変換酵素は、ほとんどまたは全く細胞傷害性を有さない化合物を、毒性生成
物に活性化する。代表的な例は、ＨＳＶＴＫ、アルカリホスファターゼ、グアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびペニシリン−Ｖアミダーゼである
。細胞傷害性ポリペプチドおよびプロドラッグ変換酵素の両方の例は、ＰＣＴ／
ＵＳ９７／０６０１０、ＥＰ ０７１６１４８、およびＷＯ９６／１７０７２を
含む多くの供給源において議論されている。
【００９９】 本発明のベクターとともに使用され得るヌクレオチド配列は、アンチセンス配
列のような非翻訳ＲＮＡ分子を含む。ＲＮａｓｅ Ｐは、遺伝子ダウンレギュレ
ーションを誘導する配列およびリボザイムを標的化した。Ｓｍｉｔｈ Ｓ．ら（
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１３〜９７２１（１９９７））は、リボザイム配列
を発現するために使用されるアルファウイルスベクターを記載する。
【０１００】 本発明の核酸分子はまた、実質的に任意のタンパク質（今までに同定されてい
ないが、例えばｃＤＮＡライブラリーまたは宿主細胞染色体中に含まれるヌクレ
オチド配列によってコードされるタンパク質を含む）を発現するために使用され
得る。そのようなタンパク質の例は、分泌型タンパク質および種々の細胞区画由
来のタンパク質を含む。本発明のベクターによって発現される異種配列は、非ヒ
ト種（例えば、他の哺乳動物、植物、真菌、細菌、またはウイルス）由来のタン
パク質およびＲＮＡ分子をコードし得る。これらの異種配列はさらに、ウイルス
膜タンパク質（例えば、ＨＩＶ ｇｐ１６０）またはウイルスポリタンパク質（
例えば、シンドビス構造タンパク質）をコードし得る。
【０１０１】 上記のタンパク質の配列は、種々の供給源（例えば、アメリカンタイプカルチ
ャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含む）から容易に
入手され得る。あるいは、上述の異種配列をコードするｃＤＮＡ配列は、そのよ
うな配列を発現する細胞から入手され得る。目的の遺伝子をコードするゲノム配
列およびｃＤＮＡ配列の両方を単離するための方法は、当該分野において周知で
ある（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２版（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬ
ＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第
２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓ
ｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
．（１９９７）を参照のこと）。例えば、ｍＲＮＡは、目的の配列を発現する細
胞から単離され得、その後に目的の配列が、オリゴｄＴプライマー、ランダムプ
ライマー、特異的プライマー、またはその組み合わせを使用する逆転写酵素を用
いて逆転写される。次いで、ｃＤＮＡ配列が、熱安定なプルーフリーディングポ
リメラーゼを用いるＰＣＲによって増幅され得る。あるいは、合成ＤＮＡ配列は
、本発明のベクターを用いて構築および発現され得る。
【０１０２】 ヌクレオチド配列が本発明のベクターに付加され得、融合タンパク質の産生を
生じる。例えば、そのような配列は、目的の遺伝子によってコードされるタンパ
ク質に融合され、そして発現産物に対して１つ以上の機能的特徴を付与するアミ
ノ酸配列をコードし得る。これらのアミノ酸配列は、細胞から（例えば、分泌配
列）または細胞内区画（例えば、核）への輸送のための遺伝子産物を標的化する
配列を含む。そのようなアミノ酸配列はさらに、精製を促進する配列（例えば、
６Ｈｉｓ「タグ」）を含む。アミノ酸配列および融合配列によって与えられる機
能に依存して、付加されたアミノ酸配列は、翻訳産物から切断されてもよいし切
断されなくてもよい。
【０１０３】 融合タンパク質はまた、種々の異なるタンパク質由来のドメインまたは領域を
有するタンパク質を含む。そのような融合タンパク質の例は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓエキソトキシンのドメインＩＩ、特定の細胞型と関連する細胞表面レセプ
ターについての結合親和性を有するドメインまたはアミノ酸配列、および予め選
択された生物学的活性を有する別のアミノ酸配列を含むタンパク質である。Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンのドメインＩＩは、細胞膜を横切って移動す
る。この系を用いて、特定の細胞型に結合し、これらの細胞の細胞質膜を横切っ
て移動し、そして所定の細胞内生物学的反応を触媒する融合タンパク質を設計し
得る。この型の系は、Ｐａｓｔａｎら、米国特許第５，７０５，１６３号に記載
される。特定の細胞型に結合するアミノ酸配列を同定するための方法は、Ｗｕ．
Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：４２９〜４３１（１９９６）にお
いて記載される。
【０１０４】 本発明のベクターはまた、選択マーカー、高コピー数の宿主細胞増幅を生じる
配列、およびベクター配列の染色体組込みを可能にする配列のような、さらなる
機能的特徴を付与する遺伝子エレメントを含み得る。
【０１０５】 本発明のベクターを含む原核生物細胞および真核生物細胞の選択のためのマー
カーは、当該分野において周知であり、そしてテトラサイクリン耐性、アンピシ
リン耐性、ネオマイシン耐性、およびカナマイシン耐性を含む。そのような配列
を含むＤＮＡ分子は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（１１０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒ
ｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡ
）、およびＰｒｏｍｅｇａ（２８００ Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｏａｄ、
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１，ＵＳＡ）を含む多くの供給源から利用可能で
ある。高コピー数増幅を生じるヌクレオチド配列はまた、当該分野において公知
であり、そしてｐＣＹＴｔｓベクターに含まれるＣｏｌＥ１配列を含む。
【０１０６】 （組換え宿主細胞） 本発明のベクターを含む種々の異なる組換え宿主細胞を生成し得る。アルファ
ウイルスは、広範な宿主範囲を有することが公知である。シンドビスウイルスは
、例えば、培養された哺乳動物細胞、は虫類動物細胞、および両生類細胞、なら
びにいくつかの昆虫細胞に感染する（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５１：６４５（１９７３）；Ｌｅａｋｅ，Ｃ．，Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．３５：３３５（１９９７）；Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｖ．，ＴＨＥ Ｔ
ＯＧＡＶＩＲＵＳＥＳ，Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８０），５８３−６２１頁）。従って、多数の組換え宿主
細胞は、本発明の実施に用いられ得る。ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞
、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞は、ヒト細胞に類似した様式において異種タン
パク質をグリコシル化する可能性を有するので（Ｗａｔｓｏｎ，Ｅ．ら、Ｇｌｙ
ｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：２２７（１９９４））異種タンパク質の生成に特に適
しており、そして選択され得る（Ｚａｎｇ，Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ １３：３８９（１９９５））か、または遺伝的に操作されて（Ｒｅｎｎｅ
ｒ Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４７：４７６（１９９５）；Ｌｅ
ｅ Ｋ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：３３６（１９９６））、無
血清培地および懸濁液において増殖し得る。
【０１０７】 目的の遺伝子を発現し得る組換え宿主細胞は、個体に挿入されることが意図さ
れる場合、これらの細胞は、一般的に、この細胞が挿入されるのと同属および同
種の別個体か、または同一個体のいずれかに由来する。細胞は、外科的手段およ
び組織生検を含むかなり多数の手段によって個体から得られ得る。
【０１０８】 宿主細胞へのポリヌクレオチドベクターの導入は、エレクトロポレーション、
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マ
イクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクト
ロポレーション、形質導入、スクレイプローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄ
ｉｎｇ）、弾道導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、およ
び感染のような方法を含む、標準的な実験室マニュアル（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ
．（１９８９），第９章；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯ
ＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９７），第１６章、を参照のこと）に記
載される方法によって果たされ得る。宿主細胞への外因性ＤＮＡ配列の導入方法
は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．ら、米国特許第５，５８０，８５９号に議論される。
【０１０９】 非感染性パッケージ化ＲＮＡ配列をまた用いて、宿主細胞を感染させ得る。こ
れらのパッケージ化ＲＮＡ配列は、培養培地にこれらを添加することによって宿
主細胞に導入され得る。
【０１１０】 先に示される様に、本発明のベクターはまた、ベクター配列の染色体組み込み
を可能にする遺伝エレメントを含み得る。このようなエレメントは、異種配列の
安定な維持のために有用であり、そして部位特異的組込み、および部位独立（ｓ
ｉｔｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）組み込みの両方を与える配列を含む。部位特
異的組み込み（例えば、相同組み込み）および部位独立組み込み（時々「無作為
組み込み（ｒａｎｄｏｍ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」と言われる）を用いて、
目的の異種配列を真核生物の染色体に導入し得る。遺伝物質を真核生物染色体へ
挿入するための記載および方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編（ＭＯＬＥＣＵ
ＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を含む多数の
出典から利用可能である。
【０１１１】 （ポリペプチドおよびＲＮＡ分子の生成） 本発明のベクターおよび組換え宿主細胞は、ポリペプチドおよびＲＮＡ分子の
生成に用いられ得る。従って、本発明は、宿主細胞におけるポリペプチドまたは
ＲＮＡ分子の調節された発現方法を提供し、これは本発明の核酸配列を宿主細胞
へ導入する工程、および温度を調節して、目的の配列をコードするＲＮＡ分子の
生成を抑制するかまたは誘導するかのいずれかの工程を含む。
【０１１２】 目的の遺伝子を発現する組換え宿主細胞は、一般的に、個体において（以下で
、より詳細に記載される）かまたはインビトロでの培養においてかのいずれかで
この遺伝子を発現する。
【０１１３】 哺乳動物細胞が、ポリペプチドおよびＲＮＡ分子の生成のための組換え宿主細
胞として用いられる場合、これらの細胞は、一般的に、組織培養において増殖さ
れる。培養において細胞を増殖させる方法は、当該分野で周知である（例えば、
Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，第２版、（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））；Ａｕｓｕｂｅｌ，
Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９７
）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．，ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ
Ｓ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）を参照のこと）。
【０１１４】 特定の適用に適した宿主細胞の選択は、発現されるポリペプチドまたはＲＮＡ
分子を含む多数の因子によって変化する。例えば、糖タンパク質が生成される場
合、一般的に、天然のタンパク質の様式に類似した様式においてタンパク質をグ
リコシル化する細胞型においてこのタンパク質を発現することが望ましい。
【０１１５】 １つの局面において、本発明は、組換え宿主細胞へ本発明の核酸分子を導入す
る工程、およびこれらの細胞を許容温度でインキュベートする工程を含む、ポリ
ペプチドおよびＲＮＡ分子を生成する方法を提供する。関連した局面において、
本発明は、本発明の方法に従って生成される精製されたポリペプチドおよびＲＮ
Ａ分子を提供する。
【０１１６】 発現される分子に依存して、この分子は、培養上清からか、または組換え宿主
細胞を溶解することによってのいずれかで得られ得る。発現産物がタンパク質で
ある場合、しばしば、培養上清から発現産物を得ることが可能である。これは、
このタンパク質がもともと会合した分泌シグナルを有さない場合でさえ、そうで
ある。このようなシグナルをコードするコドンは、本発明のベクター配列に付加
され得、そして組換え宿主細胞から分泌される融合タンパク質の発現を生じる。
このようなリーダー配列をコードするヌクレオチド配列は、当該分野で公知であ
り、そして公に利用可能である（例えば、ｐＰｂａｃベクターおよびｐＭｂａｃ
ベクター、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ １９９７／１９９８カタログ、カタログ番号
２１１５０３および番号２１１５０４、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，１１０１１ Ｎ
ｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９
２０３７，ＵＳＡを参照のこと）。
【０１１７】 宿主細胞をまた、本発明のＤＮＡ分子から転写されているか、またはこのよう
な転写された分子から複製されているかのいずれかのパッケージ化ＲＮＡ分子ま
たは非パッケージ化ＲＮＡ分子を用いて感染させ得る。さらに、これらの宿主細
胞は、制限温度で感染され得、次いで後に許容温度へシフトされ目的の遺伝子の
発現を活性化し得る。次いで、目的の遺伝子産物は回収され得、そして任意の適
切な手段によって精製され得る。
【０１１８】 目的の遺伝子から発現されたタンパク質は回収され得、そして硫酸アンモニウ
ム沈殿、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、および高速液体ク
ロマトグラフィーを含む当該分野で公知の方法によって組換え細胞培養物から精
製され得る。タンパク質を精製する方法は、多数の出典に記載される（例えば、
Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，第２版、（１９９８）を参照のこと）。
【０１１９】 ＲＮＡ分子を精製する方法もまた、当該分野で公知である（例えば、Ｃｅｌｉ
ｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２
版、（１９９８）を参照のこと）。これらの方法は、フェノール／クロロホルム
抽出、ＤＮＡｓｅを用いる消化に続いて、消化されなかったＲＮＡ分子の沈殿、
およびカラムクロマトグラフィー（例えば、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィ
ー）を含む。さらに、ＲＮＡ分子は、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈ
ｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載の
１工程のグアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法を用い
て他の細胞性物質から分離され得る。
【０１２０】 多数の異なるバイオプロセスパラメーターを、細胞培養プロセスの間に産生さ
れる発現産物の量を増加させるために変化され得る。本発明の核酸分子に曝露さ
せるか、または遺伝子発現の誘導より先に、宿主細胞を増殖させる条件（例えば
、培地の組成、ｐＨ、酸素濃度、攪拌、ならびに足場依存性細胞の場合、提供さ
れる表面およびこの表面のキャリア）は、所定の時間で達成される細胞密度およ
び細胞の生理学的状態の両方に影響する。従って、これらの培養条件は、ベクタ
ー曝露または誘導シグナルに対する、期待される細胞応答に影響する（例えば、
許容温度へシフトすること）。さらに、上記に言及される細胞培養プロセス条件
を、発現産物の生成、そしてしばしば、この発現産物の特性（例えば、グリコシ
ル化パターン）を最大にするように変化させ得る。
【０１２１】 発現産物の産生のために本発明の核酸分子を用いる細胞培養プロセス全体は、
利用される宿主細胞株の要求（例えば、足場依存性、Ｏ2濃度）に適応するよう に、発現産物の産生を最大にするように、そしてその後の発現産物の回収および
精製を容易にするように選択された、種々のバイオリアクターの配置（例えば、
攪拌タンク、潅流され膜に封入されたカプセル化細胞、流動化ベット、およびエ
アリフトリアクター）および規模（実験Ｔフラスコから数千リットルまで）にお
いて実行され得る。
【０１２２】 本発明はまた、無血清培養培地または無タンパク質培養培地において増殖させ
た哺乳動物細胞を用いて、目的のタンパク質またはＲＮＡ分子の生成に関する。
例えば、血清の接近を制限するか、または懸濁増殖を選択する条件下で長期間培
養することによって、無血清培地においておよび／または懸濁物において増殖し
得るＣＨＯ細胞株が選択される（Ｚａｎｇ，Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ１３：３８９（１９９５））。さらに、ＣＨＯ Ｋ１細胞の遺伝的改変によ
って、無タンパク質培養培地において懸濁された単細胞として増殖する、ＣＨＯ
Ｋ１：ｃｙｃＥと命名された改変化細胞株が得られた（Ｒｅｎｎｅｒ Ｗ．ら
、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４７：４７６（１９９５））。親のＣＨＯ細
胞において産生される糖タンパク質と異なるグリコシル化パターンを有する糖タ
ンパク質を生成するＣＨＯ変異体（例えば、ＬＥＣ１０細胞）もまた単離されて
いる（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２：９９（１９９２
））。あるいは、対応する改変オリゴ糖を有する糖タンパク質を合成し得るＣＨ
Ｏ細胞が、オリゴ糖の生合成に関与する酵素の活性を変化させる遺伝的改変によ
って得られ得る（Ｍｉｎｃｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：３４
８（１９９５））。
【０１２３】 さらに、多数の異なるバイオプロセスパラメーターをまた、本発明の組換え宿
主細胞によって生成されるポリペプチド産物のグリコシル化パターンを変化させ
るために変化させ得る。これらの因子は、培地の組成、ｐＨ、酸素濃度、攪拌の
欠如または存在、ならびに足場依存性細胞の場合、提供される表面を含む。従っ
て、糖タンパク質のグリコシル化パターンは、これらのタンパク質が発現される
宿主細胞および組換え宿主細胞が増殖する条件を選択することによって変更され
得る。
【０１２４】 以下に説明するように、目的のポリペプチドおよびＲＮＡ分子はまた、遺伝的
に操作された非ヒト動物において生成され得る。
【０１２５】 （遺伝子治療） 本発明のベクターはまた、遺伝子治療に有用である。本発明のベクターが、遺
伝子治療のために細胞へ導入される場合、使用される方法およびベクターは、一
般的に、組換え宿主細胞に対するベクター配列の安定な移入を提供する。このよ
うな場合において、ベクター配列は、宿主細胞において維持され、そして細胞子
孫へ移入される。例えば、遺伝子移入ベクターにおけるレトロウイルスの長い末
端反復配列を含むことは、組換え宿主細胞においてベクター配列の安定な維持を
与えることが見出されている（Ｐｅｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．６９
：１９３−１９８（１９９７）；Ｑｉｎｇ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５
６６３−５６６７（１９９７））。従って、ベクター配列の染色体組み込みは、
このような配列が、組換え宿主細胞において安定に維持され得る１つの機構であ
る。これらの配列は、染色体位置を問わずにか、または１つ以上の特定の染色体
遺伝子座（例えば、相同組換え）でかのいずれかで宿主細胞染色体へと組み込ま
れ得る。次いで、これらの組換え宿主細胞は、インビトロで培養され得るか、ま
たは個体へ導入され得る。
【０１２６】 本発明は、個体の宿主細胞へ本発明の核酸分子を導入する工程、および組換え
宿主細胞の温度を調節する工程を含む、目的のポリペプチドまたはＲＮＡを生成
するために個体中で目的の配列を発現するための方法を提供する。例えば、「熱
」感受性レプリカーゼを発現し、そして目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコー
ドする配列を含む本発明のベクターは、インビトロでヒトのケラチノサイト、上
皮細胞、または線維芽細胞へ導入され、次いでヒト被験体へ再導入され得る。こ
のような例において、これらの細胞を含む組織の温度が、許容温度まで低下され
る場合、目的のポリペプチドまたはＲＮＡの発現が生じる。
【０１２７】 本発明はまた、宿主細胞へ本発明の核酸分子を導入する工程、これらの個体へ
生じた組換え宿主細胞を導入する工程、そして目的のポリペプチドまたはＲＮＡ
分子の発現を誘導する工程を含む、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子を必要とする
個体へポリペプチドまたはＲＮＡ分子を投与する方法を提供する。同様に、本発
明の宿主細胞核酸分子は、インビボで個体の宿主細胞へ導入され得る。
【０１２８】 個体における遺伝子発現の誘導は、制限温度から許容温度へと温度を変化させ
ることによって生じる。遺伝子治療をうける個体がヒトであり、そして目的の遺
伝子の発現が特定の時間でのみ活性化されることが望ましい場合、３７℃が、通
常、制限温度であり、そして遺伝子誘導は、許容温度へと温度を上昇または低下
させることによって生じる。同様の様式において、目的の遺伝子の発現のために
特定の温度のみで不活化されることが望ましい場合、３７℃が、通常、許容温度
であり、そして遺伝子の不活化は、制限温度へと温度を上昇または低下させるこ
とによって生じる。
【０１２９】 個体へ導入された組換え宿主細胞は、個体において少なくとも一時的に維持さ
れる任意の細胞型か、または維持され、そして本発明のヌクレオチド配列を少な
くとも一時的に保持しそして発現する任意の細胞型であり得る。組換え宿主細胞
が導入される個体がヒトである場合、宿主細胞は、温度が、外的手段によって許
容温度と制限温度との間で変更され得る領域へ移植され得る任意の型の細胞であ
り得る。例えば、組換え宿主細胞は、個体から取り出され、本発明のベクターを
用いてトランスフェクトされ、そして皮膚温度が、通常３７℃または３７℃付近
のままである表面付近の領域（腋窩）に再移植された、ヒトケラチノサイト、上
皮細胞、または線維芽細胞であり得る。このような例において、遺伝子発現は、
組換えケラチノサイトまたは繊維芽細胞を含む組織の温度を許容温度へと変化さ
せることによって（例えば、組換え宿主細胞を含む位置を覆ってアイスパックま
たはペルティエ素子を置くことによって）活性化され得る。従って、目的の遺伝
子の発現の誘導は、個体の身体の一部（例えば、腋窩、腕、脚、手、足、首部な
ど）のみの温度を、制限温度から許容温度へと変化させることを必要とする。
【０１３０】 組換え宿主細胞はまた、表面下の位置（皮膚組織）で哺乳動物に移植され得る
。このような領域において組換え宿主細胞を導入する１つの利点は、これらの組
織の温度が表面（皮膚組織）よりも安定に維持され、従って遺伝子発現が、気候
条件における変化のような因子によってあまり活性化されそうにないことに由来
する。安定な領域の位置は、個体および個体の正常な体温を含む多数の因子によ
って変わるが、安定な組織は、一般的に、皮膚組織、神経組織、および筋肉組織
を含む。
【０１３１】 別の局面において、本発明は、個体の宿主細胞への本発明の核酸分子のインビ
ボでの導入を含む工程、およびこれらの核酸分子によってコードされる異種ポリ
ペプチドまたはＲＮＡ分子の発現を誘導する工程を含むポリペプチドまたはＲＮ
Ａ分子を必要とする個体へ、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子を投与する方法を提
供する。哺乳動物組織へのアルファウイルスベクターのインビボでの導入方法は
、Ａｌｔｍａｎ−Ｈａｍａｍｄｚｉｃ Ｓ．ら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：８１
５−８２２（１９９７））に記載される。
【０１３２】 さらなる局面において、個体の細胞へＲＮＡ分子を導入することによって、ポ
リペプチドまたはＲＮＡ分子を必要とする個体へポリペプチドまたはＲＮＡ分子
を投与するための方法が提供される。これらのＲＮＡ分子は、インビトロでの転
写および組換え宿主細胞発現を含む種々の方法によって得られ得る。ＲＮＡ分子
は、インビトロまたはインビボでのいずれかで個体の細胞へ導入され得る。個体
の宿主細胞へのＲＮＡ配列の導入方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．ら、米国特許第
５，５８０，８５９号に記載される。
【０１３３】 本発明はまた、遺伝子治療ベクターとして有用である温度感受性レプリカーゼ
をコードする、非感染性パッケージ化ＲＮＡ分子を提供する。これらのベクター
は、非感染性であり、組み込まれず、そして目的の遺伝子を温度感受性様式で発
現するという利点を有する。この型のベクターは、目的の遺伝子産物の単一投与
（例えば、ワクチン投与）が所望される種々の適用に有用である。
【０１３４】 本発明の核酸分子は、個体において安定に組み込まれた異種配列の、調節され
た発現に有用である。１つの適用において、糖尿病に罹患したヒト個体のケラチ
ノサイトまたは繊維芽細胞は、組織生検によって取り除かれる。ヒトインシュリ
ンをコードする目的の配列を含む本発明のＤＮＡ分子が、インビトロでこれらの
細胞へ導入され、そして安定に組み込まれる。これらの組換え宿主細胞は、体温
が比較的安定に維持される表面付近の位置（例えば、腋窩）に再移植される。食
前か、またはインシュリン産生が所望される何か別の時に、個体は、組換え宿主
細胞を含む位置を覆って特定の時間、アイスパックまたはペルティエ素子を置き
、異種インシュリンをコードする配列の発現を誘導する。さらに、低温感受性レ
プリカーゼが用いられる場合、暖めるアイテム（ｗａｒｍ ｉｔｅｍ）が個体に
よって使用され、許容温度へと温度を上昇させ得る。
【０１３５】 皮膚と接触するように置かれるこのアイテムの実際の温度は、用いられる温度
感受性変異の型、個体、組換え宿主細胞の位置、所望される遺伝子発現のレベル
、および他の因子によって変化する。
【０１３６】 （遺伝子操作された、非ヒト動物） 遺伝子操作された動物は、異種タンパク質の産生のために現在使用される（例
えば、Ｊｅｎｇ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８０：３１６７−３１７５
（１９９７）；Ｌｉｍｏｎｔａ Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１
：１０７−１１３（１９９５）を参照のこと）。これらのタンパク質は、しばし
ば、血液、乳および尿のような体液から採取される（Ｍｅａｄｅ，Ｈ．ら、Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２１−２２（１９９８）；Ｋｅｒｒ，Ｄ．ら
、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５−７９（１９９８））。
【０１３７】 本発明はまた、本発明の核酸分子を含む細胞を含む遺伝子操作された、非ヒト
動物を提供する。これらの動物は、一般的に、それらの体細胞および生殖系細胞
に安定して組み込まれた本発明の１つ以上のＤＮＡ分子を有する。生殖系細胞に
おける本発明のＤＮＡ分子を有する動物を作製するための多くの方法は、当該分
野において公知である（例えば、Ｈｅｗ，Ｃ．ら、米国特許第５，５４５，８０
８号；Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｐ．、米国特許第５，５７４，２０６号；Ｍｉｎｔ
ｚ，Ｂ．、米国特許第５，５５０，３１６号；Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．ら、米国特許
第４，８７３，１９１号を参照のこと）。例えば、ＤＮＡ分子は、受精した、発
生学的発生の１細胞期と８細胞期との間の哺乳動物の卵母細胞に、マイクロイン
ジェクションによって導入され得る。次いで、これらの卵母細胞は、適切な雌に
移植されて、生殖系を通じて異種導入遺伝子を次世代へ安定して伝達する創始動
物を産生する。一般的に、サザンブロット分析を用いて、任意の特定の個体のゲ
ノムが、異種ＤＮＡ配列を保有するか否かを決定する。
【０１３８】 遺伝子操作された動物はまた、体細胞において排他的に本発明の核酸分子を含
み得る。これらの分子を含む宿主細胞は、動物に移植され得るか、または核酸分
子が、動物の宿主細胞へインビボで導入され得る。
【０１３９】 遺伝子操作された動物の細胞における目的の遺伝子の発現は、動物の全てまた
は一部分の体温を制限温度から許容温度に変化させることによって誘導され得る
。従って、用いられる動物の選択は、多くの因子（使用されるレプリカーゼの制
限温度および許容温度、遺伝子操作されるべき動物の正常な体温、ならびに目的
の遺伝子を含む）によって変化する。これらの動物は、温血かまたは冷血のいず
れかであり得る。例えば、Ｈｅｗ，Ｃ．ら（米国特許第５，５４５，８０８号）
は、「抗冷凍」遺伝子プロモーターに連結されるヌクレオチド配列を発現するト
ランスジェニック魚の作製を記載する。本発明の核酸分子を含むこのような動物
における目的の配列の発現は、水温の変化により調節され得、この魚は制限温度
と許容温度との間に保たれる。
【０１４０】 温血動物が本発明の核酸分子を含む場合、その動物の正常な体温は、制限温度
かまたは許容温度のいずれかであり得る。さらに、多くの実例において、目的の
遺伝子の発現は、任意のある時点で動物の一部分においてのみ誘導されるかまた
は抑制されるかのいずれかである。例えば、温血動物の正常な体温が制限温度で
あり、かつ温度感受性レプリカーゼが「熱」感受性である場合、その動物は、そ
の端部（例えば、足、腕、脚など）または表面組織が許容温度まで低下する条件
下で保たれ得る。
【０１４１】 本発明の核酸分子を含む細胞を有する温血動物が、許容温度である正常な体温
を有する場合、目的の遺伝子は、一般的にその動物の内部領域における細胞にお
いて発現される。このような動物は、乳腺および尿路上皮組織における目的の遺
伝子の発現に特に有用である。例えば、Ｋｅｒｒ，Ｄ．ら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．１６：７５−７９（１９９８））は、尿路上皮細胞において外来遺
伝子を発現するトランスジェニック動物の作製を記載する。これらの動物は、そ
れらの尿において外来遺伝子産物を排出する。従って、目的の遺伝子産物は、そ
のような動物から容易に回収可能である。同様に、乳腺組織における目的の遺伝
子の発現によって、遺伝子産物が動物の乳に排出されることとなり得る。
【０１４２】 従って、本発明は、少なくともいくつかの細胞中に本発明の核酸分子を含む、
遺伝子操作された非ヒト動物をさらに提供する。いくつかのまたは全ての動物細
胞のゲノムに安定して組込まれた本発明のＤＮＡ分子を含む、遺伝子操作された
非ヒト動物もまた、提供される。本発明はまた、遺伝子操作された非ヒト動物を
作製するための方法を提供し、この方法は、本発明の核酸分子を含む細胞をこれ
らの動物に導入する工程、本発明の核酸分子をこれらの動物の細胞にインビボで
導入する工程、または本発明のＤＮＡ分子を生殖系細胞に導入して、それらの体
細胞および生殖系細胞中に目的の配列を含むトランスジェニック動物を作製する
工程を含む。
【０１４３】 （薬学的組成物） 本発明は、生理学的に受容可能なキャリアを含む溶液中にかつ治療学的有効量
で、本発明のポリヌクレオチドを含む薬学的組成物をさらに提供する。例えば、
これらの薬学的組成物の投与は、免疫原性でありそしてワクチン接種として機能
することが意図される、動物の組織におけるポリペプチドの発現を生じ得る。同
様に、目的の配列は、活性な苦痛の処置に必要とされるポリペプチドまたはＲＮ
Ａ分子をコードし得る。従って、本発明の薬学的組成物の投与は、これらの場合
において治療効果を有するよう意図される。
【０１４４】 本発明の核酸分子および組換え宿主細胞は、通常、薬学的に受容可能なキャリ
ア中の個体に投与される。その投与がレシピエントの個体により寛容化され得る
場合、組成物は、「薬理学的に受容可能」であるといわれる。さらに、本発明の
組成物は、「治療学的有効量」（すなわち、所望の生理学的効果を生ずる量）に
おいて投与される。
【０１４５】 当業者によって理解されるように、本発明のＤＮＡ分子または組換え宿主細胞
が個体に投与される場合、それらは、塩、緩衝剤、アジュバントまたは組成物の
効力の改善のために所望される他の物質を含む組成物中に存在し得る。薬学的組
成物の調製の際の使用に適切な材料の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲ
ＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｏｓｏｌ．Ａ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、（１９８０））を含む多くの出典において提供され
る。
【０１４６】 本発明の治療組成物は、当該分野で公知の種々の手段によって投与され得るが
、通常は、注射、注入または他の適切な物理的方法により投与される。あるいは
、この組成物は、筋肉内、静脈内、または皮下に投与され得る。投与のための組
成物の成分としては、無菌の水性（例えば、生理食塩水）または非水性の溶液お
よび懸濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチ
レングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステル
（例えば、オレイン酸エチル）である。キャリアまたは閉鎖包帯を使用して、皮
膚の浸透性を増大させ得、そして抗原の吸収を増強させ得る。
【０１４７】 組換え宿主細胞が、個体に投与される場合、治療有効量を提供するために必要
とされる細胞または核酸分子の数は、個体の状態、発現されることが意図される
タンパク質またはＲＮＡ分子、および個体の大きさのような因子によって変化す
る。
【０１４８】 （実施例） 以下の酵素および試薬を、以下の実施例において記載される実験において使用
した：Ｐｗｏ ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび制限酵素をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ（９１１５ Ｈａｇｕｅ Ｒｏａｄ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ
ｉｓ、ＩＮ ４６２５０）より入手した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）、バクトトリプトンおよび酵母抽出物を、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｐ．
Ｏ．Ｂｏｘ ６８、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，１４０７２、ＵＳＡ）か
ら入手した。Ｂｓｐ１２０ Ｉを、ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｉｎｃ．（３
００ Ｐｅａｒｌ Ｓｔ．Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ，１４２０２、ＵＳＡ）から入
手した。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅコンピテント細胞を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（１１
０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ
，ＣＡ，９２０３７、ＵＳＡ）から入手した。ＤＮＡ精製キットおよびＴａｑポ
リメラーゼを、ＱＩＡＧＥＮ，ＩＮｃ．、（９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ
，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１、ＵＳＡ）から入手した。ＨＰ−１
培地を、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｌａｔｔｂ
ｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。全ての標準化学物質を、Ｆ
ｌｕｋａ（９８０ Ｓｏｕｔｈ ２ndＳｔ．，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ，１
１７７９，ＵＳＡ）、Ｓｉｇｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
１４５０８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ ６３１７８、ＵＳＡ）、Ａｌｄｒｉｃ
ｈ（１００１ Ｗｅｓｔ Ｓｔ．Ｐａｕｌ Ａｖｅ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ
、５３２３３、ＵＳＡ）から入手し、そして全ての細胞培養の材料を、Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．（１ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｒａｎ
ｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、０７４１７、ＵＳＡ）から入手した。
【０１４９】 （実施例１） （ｐＣＹＴｔｓベクター系の構築） ＤＮＡの操作および配列決定を、標準的手順により実行した。ｎｓＰ２におけ
る変異を、以下のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより導入した： オリゴ−ｎｓｐ２ １：５’−ＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＴＴＡＣＡＧ
ＧＧＧ（配列番号２）、 オリゴ−ｎｓｐ２ ２：５’−ＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＧＧＧＣ（配
列番号３）、 オリゴ−ｎｓｐ２ ３：５’−ＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣ
ＡＡＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＣＧＣＧ（配列番号４）、および オリゴ−ｎｓｐ２ ４：５’−ＧＡＡＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣ
ＡＣＣＣＴＣＧＴＧＧ（配列番号５）（第１の分析および続くクローニングに使
用される単一の制限部位（ＤｒａＩ、ＣｌａＩおよびＳａｌＩ）は下線部である
）。ＰＣＲ反応を、オリゴ−ｎｓｐ２ １（配列番号２）およびオリゴ−ｎｓｐ
２ ３（配列番号４）、またはオリゴ−ｎｓｐ２ ２（配列番号３）およびオリ
ゴ−ｎｓｐ２ ４（配列番号５）のいずれかを用いて実行した。１００ｐｍｏｌ
の各オリゴを使用し、そして４単位のＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１
ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む１００μｌ反応混合物中で ５ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＳｉｎＲｅｐ５：Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４３：１１８８−１１９１（１９８９））を使用した。全てのＤＮＡ濃度を
、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，
８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、０８
８５４）を使用して測光により決定した。ＰＣＲ反応を開始する前に、ポリメラ
ーゼを直接添加した（開始点は９５℃であった）。温度サイクルは、以下であっ
た：９５℃で２分間、続いて９５℃（４５秒間）、５８℃（３０秒間）、７２℃
（９０秒間）を５サイクル、そして続いて９５℃（４５秒間）、６８℃（３０秒
間）、７２℃（９０秒間）を２５サイクル。
【０１５０】 ２つのＰＣＲフラグメントを、Ｑｉａ ｓｐｉｎＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ
、Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ
、９１３１１）を使用して精製し、そして最終的に２０単位のＳａｌＩおよびＤ
ｒａＩ、それぞれ２０単位のＣｌａＩおよびＤｒａＩを使用して、適切な緩衝液
中で消化した。この消化を、３７℃で１２時間行った。ＤＮＡフラグメントをゲ
ル精製し（Ｇｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ；Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．，１０７０ Ｊｏ
ｓｈｕａ Ｗａｙ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ、９２０８３、ＵＳＡ）、そして最終的に
、ＣｌａＩ／ＳａｌＩで消化され、そしてゲル精製されたＳｉｎＲｅｐ５ベクタ
ー（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８−１１９１（１９
８９））に連結した。得られたベクターの正確な配列を、ｎｓＰ２遺伝子全体の
ＤＮＡ配列決定により調べた。
【０１５１】 ｎｓＰ４における変異をまた、以下のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによ
って導入した： オリゴ−ｎｓｐ４ １：５’−ＧＧＴＡＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＴＣＧＣＡＴＧＣ ＣＴＧＧＡＴＡＣ（配列番号６）、 オリゴ−ｎｓｐ４ ２：５’−ＧＴＡＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＧＡＣＴＧＴＣＴ
ＣＧＴＣＴＡＣＣ（配列番号７）、 オリゴ−ｎｓｐ４ ３：５’−ＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＡＡＣＧＣＣＡＴＡＧＣＧ
ＴＣＧ（配列番号８）、および オリゴ−ｎｓｐ４ ４：５’−ＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＡＣＡＧＴ
ＴＧＧ（配列番号９）（第１分析および最終クローニング工程について使用され
る単一の制限部位（ＳｐｈＩ、ＨｐａＩおよびＳｐｅＩ）は下線部である）。２
つのＰＣＲ反応を、オリゴ−ｎｓｐ４ １（配列番号６）およびオリゴ−ｎｓｐ
４ ３（配列番号８）かまたはオリゴ−ｎｓｐ４ ２（配列番号７）およびオリ
ゴ−ｎｓｐ４ ４（配列番号９）のいずれかを使用して上記のように実行した。
【０１５２】 両方のＰＣＲ産物を、ゲル精製し、次いで、ｎｓＰ４遺伝子全体を増幅するた
めにアセンブリＰＣＲにおいて使用した。アセンブリＰＣＲについて、５０ｐｍ
ｏｌの外側プライマー（３および４）ならびに約１０ｎｇの各ＰＣＲフラグメン
トを使用した。反応容量は、１００μｌであった（４単位のＴａｑまたはＰｗｏ
ポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）。 ＰＣＲ条件は以下であった： ９５℃で２分間、続いて９２℃（４５秒間）、５８℃（３０秒間）、７２℃（
１２０秒間）の５サイクル、そして続いて９２℃（４５秒間）、６４℃（３０秒
間）、７２℃（１２０秒間）の２５サイクル。
【０１５３】 得られたＰＣＲフラグメントを上記のように精製し、そして溶出液を適切な緩
衝液中で、２０単位のＳｐｅＩおよびＨｐａＩを用いて消化した。このフラグメ
ントをゲル精製し、そしてゲル精製ＳｐｅＩ／ＨｐａＩ制限ＳｉｎＲｅｐ５ベク
ターに連結した。得られたベクターの正確な配列を、ＤＮＡ配列決定により調べ
た。
【０１５４】 ＳｐｅＩ／ＨｐａＩを用いたＳｉｎＲｅｐ５−ｎｓＰ４ｍｕｔおよびＳｉｎＲ
ｅｐ５−ｎｓｐ２ｍｕｔの一晩の消化、そしてｎｓｐ４フラグメントおよびＳｉ
ｎＲｅｐ−ｎｓｐ２ｍｕｔベクターのゲル精製。ｎｓｐ４ｍｕｔフラグメントを
、ＳｉｎＲｅｐ５−ｎｓｐ２ｍｕｔベクター中に連結した。最終工程は、Ｃｌａ
ＩおよびＨｐａＩを制限エンドヌクレアーゼとして用いての、９８７／ＳｉｎＲ
ｅｐ５ベクター（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４
３９−６４４６（１９９３））中へのｎｓｐ遺伝子のクローニングであった。生
じたベクターをｐＣＹＴｔｓと称した（図２および図３Ａ〜３Ｄ（配列番号１）
）。
【０１５５】 ｐＣＹＴｔｓ構築物：５つの異なる遺伝子を、ｐＣＹＴｔｓベクターにクロー
ニングした。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、分泌アルカリホスホターゼ（
ＳＥＡＰ）、β−インターフェロン（β−ＩＮＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰ
Ｏ）、およびＨＩＶ ｇｐ１６０。
【０１５６】 （実施例２） （一過的発現および安定した発現におけるＧＦＰの調節された発現） 細胞質性タンパク質（例えば、本発明者らはクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃ
ｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用した（Ｃｒａｍｅｒｉら
、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３１５−３１９（１９９６））を発現するた
めに、ｐＣＹＴｔｓ系を首尾良く使用した。ＧＦＰを、ＸｂａＩおよびＢｓｐ１
２０ Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を介してｐＣＹＴｔｓ中に連結する。正確な挿
入物を有するクローンを制限消化により同定した。ＧＦＰ発現を、一過的発現お
よび安定した発現の両方において試験した。
【０１５７】 ＢＨＫ２１細胞における一過的トランスフェクションを、ＣａＰＯ4沈殿トラ ンスフェクションプロトコルを用いて実行した：３０μｌ Ｈ2Ｏ中の６μｇの プラスミドＤＮＡ（ｐＣＹＴｔｓ ＧＦＰ）を、３０μｌの１Ｍ ＣａＣｌ2溶 液と混合した。６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ
ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．０５）の添加後、この溶液を５
秒間ボルテックスにかけ、続いて室温で２５秒間インキュベートした。直ちにこ
の溶液を、２％ＦＣＳを含む２ｍｌのＨＰ−１培地（２％ＦＣＳ培地）に添加し
た。次いで、６ウェルプレート中８０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞培養物
の培地を、ＤＮＡを含む培地によって置換した。ＣＯ2インキュベーター中３７ ℃で５時間のインキュベーション後、ＤＮＡ含有培地を、２％ＦＣＳ培地中の１
５％グリセロール２ｍｌにより置換した。３０秒間のインキュベーション段階の
後、グリセロール含有培地を除去し、そして細胞を５ｍｌのＨＰ−１培地（１０
％ＦＣＳを含む）で洗浄した。最終的に、１０％ＦＣＳを含む新鮮なＨＰ−１培
地２ｍｌを添加した。
【０１５８】 ｐＣＹＴｔｓＧＦＰを用いたＢＨＫ細胞の一過的トランスフェクションの後、
発現を３７℃で試験した。ＧＦＰの発現は、以下に記載の方法を用いて検出され
なかった。温度が２９℃にシフトダウンされた場合、ＧＦＰは産生された。ＧＦ
Ｐ発現細胞は、少なくとも５日間生存した。
【０１５９】 ＢＨＫ２１細胞における安定したトランスフェクション。安定したトランスフ
ェクションを、安定したトランスフェクションのために線状化プラスミドＤＮＡ
を用いたのを除いて、一過的トランスフェクションについて本質的に記載される
ように実行する。２０μｇのｐＣＹＴｔｓＧＦＰを、適切な緩衝液中で３０単位
のＮａｅＩとともに、３７℃で少なくとも４時間インキュベートした。反応を、
フェノール／クロロホルム抽出、続いて線状化ＤＮＡのイソプロパノール沈殿に
より停止した。制限反応を、エチジウムブロマイドで染色した０．８％アガロー
スゲルを用いるゲル電気泳動により調べた。トランスフェクションについて、５
．４μｇの線状化ｐＣＹＴｔｓＧＦＰを、３０μｌ Ｈ2Ｏにおける０．６μｇ の環状ｐＳＶｔｒｐＢ（選択プラスミド）と混合した。一過的トランスフェクシ
ョンについて記載された手順が続く。
【０１６０】 安定してトランスフェクトされた細胞を選択し、そして選択培地（トリプトフ
ァンを含まず、３００μＭインドールおよび５％透析ＦＣＳが補充されているＨ
Ｐ−１培地）においてＣＯ2インキュベーター中３７℃で増殖させた。混合した 集団が、コンフルエンシーまで増殖した場合、培養物を２つの部分に分け、そし
て両部分を３７℃でさらに１２時間培養した。次いで、一方の部分の細胞を３０
℃にシフトさせて、目的の遺伝子の発現を誘導した。他方の部分は３７℃に保っ
た。
【０１６１】 （遺伝子発現の検出） グリーン蛍光タンパク質は、その強い蛍光に起因して、分光蛍光計において容
易に検出され得る。このことは、ＧＦＰが細胞の細胞質に位置する場合に見られ
る。ＧＦＰ産生は蛍光顕微鏡により検出され、そして細胞全体の分光蛍光分析（
分光蛍光分析器、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ−５００１ＰＣ）により定量した。剥
離した細胞を５ｍｌ ＰＢＳ（１リットルあたり：０．１３２ｇ ＣａＣｌ2・ ２Ｈ2Ｏ；０．２０ｇ ＫＣｌ；０．２０ｇ ＫＨ2ＰＯ4；０．１０ｇ ＭｇＣ ｌ2・６Ｈ2Ｏ；８ｇ ＮａＣｌ；１．１５ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4；ｐＨ７．２）を用
いて洗浄し、そして１ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。励起波長は、３９７ｎｍで
あり、そして発光波長は５１０ｎｍであった。蛍光検出についての直線的範囲に
おける測定を実行するために、細胞を希釈して、０．０５と１．０との間の放射
単位の蛍光を得た。
【０１６２】 最適な誘導温度を決定するために、安定してトランスフェクトされた細胞の混
合集団の培養物を、ＦＣＳを含まない選択培地において異なる温度で４８時間イ
ンキュベートした。培養物を３４℃以下にシフトさせた場合、発現が誘導された
。最も高い発現は、２９℃で検出された（図４Ａ）。安定してトランスフェクト
された細胞を３０℃で４時間誘導し、続いて、３７℃で２４時間増殖させた場合
、緑色の細胞が、蛍光顕微鏡法により観察され得た。このことは、明らかに、目
的の遺伝子の発現が、４時間の誘導後に始まることを示した（図６Ａ）。
【０１６３】 （時間依存性） この系の反応速度を、誘導後の異なる時点での測光により決定した。ＧＦＰ発
現は上記のように検出された。誘導１０時間後、ＧＦＰの明らかな発現は、２９
℃で検出可能である（図５Ａ）。誘導後、細胞を３７℃にシフトして戻した場合
、新しいｍＲＮＡ生成は、妨げられるべきであるが、しかし、目的のタンパク質
の翻訳は、高い発現レベルで生じるべきである。誘導の４、６、８、または１０
時間後、細胞を３７℃にシフトし戻し、２４時間後、ＧＦＰの発現は上記のよう
に検出された（図６Ａ）。従って、転写は、誘導後短時間で始まる。
【０１６４】 （細胞株の長期安定性） 目的の遺伝子の長期発現を決定するために、安定してトランスフェクトされた
細胞を、３７℃で少なくとも８週間培養した。ＧＦＰの発現を、細胞を２９℃に
シフトすることによって試験した。安定したトランスフェクション後に直接使用
した細胞と少なくとも４週間培養した細胞との間では、ＧＦＰの発現レベルにお
いて差異が観察されなかった。
【０１６５】 （実施例３） （一過的発現および安定した発現におけるＳＥＡＰの調節された発現） ｐＣＹＴｔｓ系を首尾良く用いて、分泌タンパク質（本発明者らは、ヒト起源
の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、１０２０ Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ、
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、９４３０３、ＵＳＡ）を例として使用した）を発現
させた。ＳＥＡＰコード配列を、ＸｂａＩおよびＳｔｕＩを介してｐＣＹＴｔｓ
中に連結する。正確な挿入物を有するクローンを、制限消化により同定した。Ｓ
ＥＡＰ発現を、一過的発現および安定した発現の両方について試験した。
【０１６６】 ＢＨＫ２１細胞における一過的トランスフェクションを、実施例２に記載され
るように、ＣａＰＯ4共沈トランスフェクションプロコトルを用いて実行した。
【０１６７】 （ＢＨＫ２１細胞における安定したトランスフェクション） 安定したトランスフェクションを、線状化プラスミドＤＮＡを使用したことを
除いて、本質的に、一過的トランスフェクションについて記載された通り、実行
した。２０μｇのｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰを、３０単位のＭｌｕＩと共に適切な緩
衝液中で、３７℃で少なくとも４時間インキュベートした。１０μｇのｐＳＶｎ
ｅｏを、３０単位のＳｃａＩを用いて、３７℃で少なくとも４時間消化した。両
方の反応を、フェノール／クロロホルム抽出、続いて線状化ＤＮＡのイソプロパ
ノール沈殿により停止させた。この制限反応を、エチジウムブロマイドで染色し
た０．８％アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により調べた。トランスフェク
ションのために、５．８８μｇの線状化ｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰを、３０μｌ Ｈ 2 Ｏ中の０．１２μｇの線状化ｐＳＶｎｅｏ（選択プラスミド）と混合する。一 過的トランスフェクションについて記載された手順が続く。
【０１６８】 （遺伝子発現の検出） ｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰを含む、一過的にトランスフェクトされた細胞および安
定してトランスフェクトされた細胞を、３日間の誘導後、ドットプロットによっ
てＳＥＡＰ発現について試験した。２．５μｌの細胞培養上清を、ニトロセルロ
ース膜上にスポットした。この膜を室温、１０分間で乾燥した後、アルカリホス
ファターゼ検出試薬（５０μｌ ＮＢＴ溶液（７０％ ジメチルホルムアミド中
、７．７％ニトロブルーテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ））および３７μｌのＸ−
リン酸溶液（ジメチルホルムアミド中、５％の５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリルホスフェート）を含有する１０ｍｌ ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５））を用いて、発色反応を行っ
た。
【０１６９】 ＳＥＡＰ活性を比色酵素活性試験において定量した。ＳＥＡＰを含む５００μ
ｌの培養上清を６５℃で５分間インキュベートし、そして最終的には遠心分離し
た（２０，０００ｇ；２０秒間）。ＳＥＡＰ活性を決定するために、遠心分離し
て得られた上清の４００μｌを、キュベット中で、５００μｌの２×ＳＥＡＰ緩
衝液（２０ｍＭ Ｌ−ホモアルギニン、２Ｍ ジエタノールアミン、および１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ９．８）と混合した。１００μｌニトロフェニル
ホスフェート（１２０ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ １０４、Ｓｉｇｍａ）をサンプルに
添加した後、ＳＥＡＰ活性を分光光度計において、４０５ｎｍで追跡した。吸光
度を１０分間にわたって３０秒毎に測定した。異なる時点で得られた値を、時間
に対してプロットし、そして線形の傾きを有するプロットが得られた。
【０１７０】 混合された集団において、１細胞あたり産生されるＳＥＡＰ分子の量は、１細
胞あたり約１０7分子であると見積もられた。ＳＥＡＰの安定した発現を得るた めに、クローン化された細胞をセルソーター中において自動的に分別し、そして
最終的にはＳＥＡＰ活性について分析した。２０クローンのうち約１つがＳＥＡ
Ｐ発現を示した。ＳＥＡＰ発現は、混合された集団中よりも１桁大きいと見積も
られた。
【０１７１】 最も高いＳＥＡＰ発現は、２９℃で検出された（図４Ｂ）。ＳＥＡＰ活性は、
２９℃でのインキュベーションの１５時間後、検出され得た。しかし、ＳＥＡＰ
の発現は、図６Ｂに示されるように、ずっと早く始まった。ＳＥＡＰ発現細胞を
４、６、８または１０時間の誘導後３７℃にシフトし戻し、２４時間後、ＳＥＡ
Ｐの発現が上記のように検出された。ＳＥＡＰ発現は、誘導後６時間という早い
ときに検出され得た（図６Ｂ）。従って、ＳＥＡＰ発現はまた、誘導後短時間で
始まった。
【０１７２】 （実施例４） （一過性および安定な発現におけるβ−ＩＮＦの調節された発現） ヒト起源のβ−インターフェロン遺伝子を使用して、ｐＣＹＴｔｓ系が抗ウイ
ルス性分泌タンパク質を発現するために使用され得ることを実証した。β−イン
ターフェロンは、抗ウイルス活性を有し、そしてＲＮＡ複製を妨げる。ｐＣＹＴ
ｔｓ系は、遺伝子がＲＮＡ複製を妨げるタンパク質をコードする場合であっても
、これらの遺伝子の発現を厳密に調節する。
【０１７３】 β−インターフェロンをコードする遺伝子を、Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ．Ｃ．およ
びＰｅａｒｌ．Ｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．５：８２７〜８２９（１９９２
））において記載されるように生成した。プライマーを、ＧｅｎＢａｎｋの報告
Ｖ００５３４、Ｊ００２１８、Ｋ００６１６、およびＭ１１０２９において開示
されるヒトβ−インターフェロンヌクレオチド配列を使用して生成した。β−イ
ンターフェロンｃＤＮＡを、ＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０Ｉを用いた制限後にｐ
ＣＹＴｔｓ中に連結した。β−インターフェロンの発現を、一過性および安定な
発現系において試験した。
【０１７４】 β−ＩＮＦの一過性および安定（混合された集団）な発現をウエスタンブロッ
ティングによって測定した。０．５ｍｌの培養培地をメタノール／クロロホルム
沈殿し、そしてペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。サ
ンプルを１５％アクリルアミドゲルにアプライする前に、５分間９５℃で加熱し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をＰｒｏｔａｎニトロセルロース膜（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ．Ｉｎｃ．、１０ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｖ
ｅ．、Ｋｅｅｎｅ．ＮＨ０３４３１．ＵＳＡ）にトランスファーした。この膜を
ＴＢＳ（１０×ＴＢＳ、１リッターあたり：８７．７ｇ ＮａＣｌ、６６．１ｇ
Ｔｒｉｚｍａ塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）および９．７ｇ Ｔｒｉｚｍａベース（Ｓ
ｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）中の１％ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、１
時間室温でブロックし、その後、マウス抗ヒトβ−ＩＮＦ抗体（０．２μｇ／ｍ
ｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて
１時間インキュベートした。このブロットを３回、１０分間、０．０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄し、そして西洋ワサビペルオ
キシダーゼ−抗マウスＩｇＧ結合体（０．１μｇ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌ
ｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）とともに、１時間インキュベートし
た。ＴＢＳ−Ｔを用いて１０分間２度洗浄した後、ＴＢＳを用いて１０分間２度
洗浄し、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて発色した。
【０１７５】 ２９℃でのインキュベーションの３または５日後、サンプルをブロットのため
に採取した。培養物の別の部分を、３７℃に保ち、そしてサンプルを５日後に採
取した。図８Ａは、β−ＩＮＦが２９℃での３日後に生成され、一方、３７℃で
のインキュベーションは、検出可能なβ−ＩＮＦ産生を生じなかったことを示す
。
【０１７６】 （実施例５） （一過性発現におけるＥＰＯの調節された発現） ｐＣＹＴｔｓ系を、首尾よく使用して、薬学的に関連する分泌タンパク質を発
現した。そのような発現の例として、発明者らは、ヒト起源のエリスロポエチン
（ＥＰＯ）をコードする遺伝子を使用した。この遺伝子は、実施例４に記載され
るようにＰＣＲによって生成された。プライマーを、ＧｅｎＢａｎｋの報告Ｘ０
２１５８において開示されるヒトＥＰＯヌクレオチド配列を使用して生成した。
ＥＰＯをコードする遺伝子を、ＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０Ｌ（Ｆｅｒｍｅｎｔ
ａｓ）を用いた制限の後に、ｐＣＹＴｔｓ中に連結した。正確な挿入物を有する
クローンを制限消化によって同定した。ＥＰＯ発現を一過性および安定な発現系
の両方において試験した。
【０１７７】 ＢＨＫ２１細胞を、実施例２に記載のように、ＣａＰＯ4共沈殿プロトコール に従って、一過性にトランスフェクションした。
【０１７８】 ＥＰＯ産生を、実施例４に記載のように、ウエスタンブロッティングによって
測定した。この検出を、ニトロセルロース膜を、１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ中の２μ
ｇのウサギ抗ヒトＥＰＯ抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉ
ｎｃ．）で１時間インキュベートし、その後ＴＢＳ−Ｔを用いて各１０分間３回
の洗浄によって行った。最後に、このニトロセルロース膜を、ＴＢＳ−Ｔ中に１
：５０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．）
とともに、１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの１０分間の２度の洗浄お
よびＴＢＳでの１０分間の２度の洗浄の後、このブロットを実施例３に記載のよ
うに、アルカリホスファターゼ染色によって発色した。一過性のトランスフェク
ションした細胞は、４日間、２９℃で、検出可能な量のＥＰＯの産生を誘導した
（図８Ｂ）。
【０１７９】 （実施例６） （安定な発現におけるＥＰＯの調節された発現） ｐＣＹＴｔｓ５０４ＥＰＯ発現ベクターにおいて、ヒトエリスロポエチン（Ｅ
ＰＯ）コード配列（増殖培地中への分泌のためのその天然のリーダーペプチドを
含む）をシンドビスウイルスカプシドタンパク質（Ｃタンパク質）をコードする
配列と、インフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で、融合した。この構築物の合理性
は、Ｃタンパク質のコード領域内に位置する翻訳エンハンサーを欠く構築物と比
較すると１０倍から２０倍増加した発現レベルをもたらすことが示されているエ
ンハンサー（Ｆｒｏｌｏｖら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３：１１３７１〜１１３７７（１９９６））を含むということであった。この
融合遺伝子は、発現ベクターｐＣＹＴｔｓのサブゲノムプロモーターから発現さ
れる。Ｃタンパク質の自己タンパク質分解活性によって触媒される、融合タンパ
ク質からのＥＰＯ前駆体の同時翻訳の放出の際に、ＥＰＯは、そのＮ末端リーダ
ーペプチドによって分泌経路に方向付けされる。
【０１８０】 安定なトランスフェクションのために、３：１の割合のｐＣＹＴｔｓ５０４Ｅ
ＰＯ（ＭｌｕＩを用いる制限切断により直線化された）およびネオマイシン耐性
付与プラスミド９８７ＢＢｎｅｏ（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６７：６４３９〜６４４６（１９９３））（ＳｃａＩを用いる制限切断により直
線化された）を、実施例２に記載のリン酸カルシウム共沈殿プロトコールを用い
て、ＢＨＫ２１細胞に導入した。選択条件（１０％ＦＣＳおよび２００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８（ネオマイシン）を補充したＨＰ−１培地）下における３７℃での
１週間のインキュベーションの後、単一のコロニーを分離して、さらに同一の条
件下で増殖した。
【０１８１】 ＥＰＯ分泌クローンをスクリーニングするために、細胞を、１２ウェルプレー
ト中で、３７℃で８０％コンフルエンスまで増殖し、そしてさらに４日間、３０
℃でインキュベートした。各培養物上清の３μｌを、抗ＥＰＯウサギＩｇＧおよ
び抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体を用いて、ドットブロット分析
によって分泌されたＥＰＯについて分析した。調査した２７クローンの内、１つ
のＥＰＯ分泌クローンを同定した。ＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、上清１リッターあたり２．５ｍｇのＥ
ＰＯのおよその濃度を推定した。分泌されたタンパク質の同定をウエスタンブロ
ット分析によってさらに確認した。その目的のために、細胞を、Ｇ４１８（２０
０μｇ／ｍｌ）を補充した３０μｌのＨＰ−１培地（ＦＣＳなし）を含むＴ−７
５細胞培養フラスコ中で、３７℃で、８０％コンフルエンスまで増殖させ、次に
３０℃でさらに４日間インキュベートした。培養上清の２０μｌを１５％ ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてニトロセルロース膜上にブロット
した。抗ＥＰＯウサギＩｇＧ／抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体系
を使用して、異なる供給源由来の本物のＥＰＯサンプルと同一の電気泳動移動度
（見かけの分子量、約２９ｋＤａ）を示す単一のタンパク質を特異的に検出した
（図９）。生じた細胞株を、１Ｃ４と称した。
【０１８２】 （実施例７） （ＥＰＯ ＲＮＡを含有するシンドビスウイルス粒子の生成） ＲＮＡａｓｅを含有しない１μｇのベクター（ｐＤＨ−ＥＢ；Ｂｒｅｄｅｎｂ
ｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１１：６４３９〜６４４６（１９９３））を、Ｅｃ
ｏＲＩ消化によって直線化した。続いて、ＳＰ６インビトロ転写キット（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎによるＩｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐＣＡＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ＢＶ、ＮＶ Ｌｅｅｋ．Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、インビトロの
転写を行った。生じる５’−キャップされたｍＲＮＡを還元アガロースゲル上で
分析した。
【０１８３】 ５μｇのインビトロ転写したｍＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアル
（シンドビス発現系、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ．Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
に従い、１Ｃ４細胞株（実施例６）にエレクトロポーレーションした。３７℃で
の１０時間のインキュベーションの後、ＦＣＳ含有培地を、ＦＣＳを含有しない
ＨＰ−１培地に交換して、続いて、３０℃で７２時間さらにインキュベーション
をした。上清をＢＨＫ２１細胞層に継代して、２時間４℃でインキュベートして
、そして最後に捨てた。この細胞をＨＰ−１緩衝液で４回洗浄し、そして２４時
間３０℃でインキュベートした。この培養上清の３μｌを、抗ＥＰＯウサギＩｇ
Ｇおよび抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体を使用するドットブロッ
ト分析によって分泌されたＥＰＯについて分析した（図１０）。
【０１８４】 （実施例８） （一過性発現におけるｇｐ１６０の調節された発現） ｐＣＹＴｔｓ系を使用して、ｇｐ１６０（ＨＩＶエンベロープタンパク質）を
発現した。ｇｐ１６０遺伝子を、ｐＡｂＴ４６７４（ＡＴＣＣ４０８２９）より
増幅し、そしてＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０Ｌを介して、ｐＣＹＴｔｓ中にクロ
ーン化した。ＢＨＫ２１細胞をリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して一過性にトランス
フェクトした。１５０μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の０．
８μｇ ｐＣＹＴｔｓ ｇｐ１６０ ＤＮＡを、２．５μｌのリポフェクタミン
を含有する１５０μｌのＤＭＥＭと混合した。この溶液を室温で１５分インキュ
ベートして、そして２４ウェルプレート中の８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞
層に添加した。ＣＯ2インキュベーター中の３７℃での５時間のインキュベーシ ョンの後、この細胞を洗浄して、さらに１２時間３７℃でインキュベートした。
細胞を分け、そして一部を２９℃でインキュベートし、一部を３７℃で５日間イ
ンキュベートした。細胞を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で
溶解した。サンプルを９５℃で５分間加熱し、そして８％アクリルアミドゲルに
供した。ｇｐ１６０発現を、実施例４に記載のように、ウエスタンブロッティン
グによって分析した。ニトロセルロース膜を、１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ中に１：３
０００に希釈したウサギ抗ヒトｇｐ１６０抗体（Ｓｃｈａｗａｌｌｅｒ博士、Ｄ
ｉａｍｅｄ ＡＧ．Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄより親切に提供された）とともに１
時間インキュベートし、次にＴＢＳ−Ｔとともに１０分間、３回洗浄した。次に
、この膜を、１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ中に１：５０００に希釈したアルカリホスフ
ァターゼ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．）とともに１時間インキュベー
トした。この膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間２度洗浄し、そしてＴＢＳで１０分間２
回洗浄した。実施例３に記載のように発色を行った。一過性にトランスフェクト
した細胞は、検出可能な量のｇｐ１６０を産生した（データ示さず）。
【０１８５】 （実施例９） （ヒト包皮線維芽細胞におけるＧＦＰの調節された発現） ｐＣＹＴｔｓ系を使用して、ヒト包皮線維芽細胞においてグリーン蛍光タンパ
ク質を発現させた。リポフェクタミンを実施例８に記載されるように使用して細
胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に、この細胞の
一部を３７℃でインキュベートして、他方の一部を２９℃でインキュベートした
。４８時間後、明るい緑色の細胞が、２９℃でインキュベートした培養物におい
て、蛍光顕微鏡で観察された。一方、３７℃では、ＧＦＰの発現は全く検出され
なかった。
【０１８６】 （実施例１０） （センス方向における挿入物を有するマルチベクター系） 本発明の調節可能なベクター系を、非細胞障害性ウイルス粒子の生成のために
使用した。目的の遺伝子として、本発明者らは、シンドビスウイルスの構造タン
パク質を選択し、そしてマーカータンパク質として本発明者らはＧＦＰを選択し
た。細胞を、実施例２に記載のように、ｐＣＹＴｔｓＧＦＰを用いて安定にトラ
ンスフェクトした。安定にトランスフェクトした細胞を、実施例２に記載のプロ
トコールに従って、シンドビスウイルス構造タンパク質を保有する欠損ヘルパー
構築物（ｐＤＨＢＢ；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１１：６４３
９〜６４４６（１９９３））を用いて、一過性のトランスフェクトをした。
【０１８７】 トランスフェクトした細胞を３７℃で一晩増殖した。次に、この細胞を２９℃
に移し、ウイルス遺伝子発現を誘導した。形成されたウイルス粒子は、パッケー
ジされたｐＣＹＴｔｓＧＦＰ ＲＮＡ配列を含有し、そしてＧＦＰを、パッケー
ジされたウイルス粒子が新たな標的細胞に感染する場合に発現する。新たな感染
を行うために、発現の４日後に、培地を回収し、そして遠心分離（１８００ｒｐ
ｍ；３分）した。上清を８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞層上に配置し、そし
て２９℃で４時間インキュベートした。インキュベートの期間の後、この培地を
捨て、そしてこの細胞を５ｍｌのＨＰ−１培地で３回洗浄し、次に、２９℃でさ
らに２４時間インキュベーションした。最後に、マーカー遺伝子ＧＦＰの発現レ
ベルを、実施例２に記載のように、蛍光顕微鏡で測定した。
【０１８８】 約１０％のＢＨＫ細胞が初めにＧＦＰを産生し、２９℃でのさらなる２４時間
のインキュベーションの後、全ての細胞がＧＦＰを産生した。これらの細胞の馴
化培地を再度回収し、遠心分離し、そしてＢＨＫ細胞の８０％コンフルエント層
の上に配置した。２９℃でのインキュベーションの４８時間後、これらの細胞の
１００％がＧＦＰを発現したことが見出された。
【０１８９】 コントロールとして、トランスフェクトした細胞を、馴化培地を回収し、そし
て遠心分離（１８００ｒｐｍ、３分間）した後、３７℃で５日間増殖した。上清
を８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞層上に配置した。２９℃でのインキュベー
ションの８時間後、この培地を取り除き、そしてこの細胞を５ｍｌのＨＰ−１培
地で３回洗浄し、そして２９℃でさらに２４時間インキュベートした。最後に、
ＧＦＰの発現レベルを測定する。ＧＦＰ発現細胞は、検出されなかった（図７Ａ
および７Ｂ）。
【０１９０】 （実施例１１） （アンチセンス方向における挿入物を有するマルチベクター系） モデル系として、本発明者らは、ウイルス粒子の産生をともなう調節可能な系
を試験した。目的の遺伝子として、本発明者らは、シンドビスウイルスの構造タ
ンパク質を選択し、そしてマーカータンパク質として本発明者らはＧＦＰを選択
した。細胞を、実施例２に記載のように、ｐＣＹＴｔｓＧＦＰを用いて安定にト
ランスフェクトした。
【０１９１】 アンチセンスヘルパーベクターを以下のように構築した： 構造タンパク質を、ｐＨＤＢＢベクター（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ Ｐ．ら、Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９〜６４４６（１９９３））をＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化することにより、得た。このフラグメントをゲル電気泳動により
精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＭＰＳＶＨＥベクター（Ａ
ｒｔｅｌｔ Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ ６８：２１３〜２１９（１９８８））中にクロ
ーン化した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位は、これらのベクターにおい
て反対の配向なので、構造タンパク質フラグメントを、ｐＭＰＳＶＨＥ中にアン
チセンス配向にクローン化した。得られたベクターを、ｐＭＰＳＶアンチＤＨＢ
Ｂと呼ぶ。
【０１９２】 安定にトランスフェクトした細胞を、実施例１０に記載のｐＭＰＳＶアンチＤ
ＨＢＢを用いて、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を
３７℃で一晩増殖させた。次に、この細胞を２９℃に移し、ウイルス遺伝子発現
を誘導した。誘導の４日後に、馴化培地を収集し、そして遠心分離（１８００ｒ
ｐｍ；３分間）した。この上清を８０％コンフルエントのＢＨＫ細胞層上に配置
し、そして２９℃で４時間インキュベートした。インキュベートの期間の後、こ
の培地を捨て、そしてこの細胞を５ｍｌのＨＰ−１培地で３回洗浄し、そして、
２９℃でさらに２４時間インキュベーションした。最後に、マーカー遺伝子ＧＦ
Ｐの発現レベルを、実施例２に記載のように、蛍光顕微鏡で測定した。
【０１９３】 約１％のＢＨＫ細胞が初めにＧＦＰを産生し、そして２９℃でのさらなる１２
０時間のインキュベーションの後、３０％の細胞がＧＦＰを産生した。従って、
アンチセンスＤＮＡフラグメントでさえ、本発明において使用され、機能的タン
パク質を産生し得る。
【０１９４】 （結論） 上記の実施例において記載される発現系は、Ｓａｅｚ．Ｅ．ら（Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６０８〜６１６（１９９７））において記
載される理想的な誘導性遺伝子発現系のほとんどの全ての基準を満たす。この系
は、温度が３４℃未満にシフトした場合にのみスイッチが入るという点において
非常に特異的である。いくつかの実験において示される基礎発現は、上記の実施
例において使用される標準的な検出方法を用いて検出不可能である。ウイルス感
染の非常に感度の高い系を用いる場合でさえ（図７Ａ〜７Ｂおよび図９）、３７
℃での基礎発現は検出され得なかった。このことは、高度な調節の厳密性を示す
。なぜなら、機能的なレプリカーゼ分子は、目的のタンパク質の高発現レベルを
生じるＲＮＡ複製および転写の自己触媒的サイクルを開始するからである。
【０１９５】 さらに、図６Ａ〜６Ｂにおいて示されるように、遺伝子発現は、誘導後迅速に
開始し、そして温度が制限的な温度に戻った後に迅速に停止する。インデューサ
ーのバイオアベイラビリティーにともなう問題は存在しない。なぜなら、２９℃
への温度シフトは、迅速に拡がり、そして非毒性だからである。一旦、制限温度
に到達すると、遺伝子発現の持続は、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡま
たは目的のＲＮＡの安定性に依存するのみである。
【０１９６】 テトラサイクリン系と比較して、上記の実施例に記載されるこの系は、検出可
能な基礎発現が存在しないこと、および温度シフトのバイオアベイラビリティー
が、抗生物質テトラサイクリンまたはｔＴＡタンパク質の発現よりも、かなり有
害でないという利点を有する。本明細書において記載される調節可能なＤＮＡベ
クター系のさらなる利点は、１つのベクターのみが宿主細胞中に導入される必要
があるという点である。なぜなら、発現および調節に必要とされる全ての関連す
るタンパク質は、この１つのベクターにコードされ得るからである。このことは
、２つのベクターが細胞中にトランスフェクトされなければならないテトラサイ
クリン系とは対照的である（Ｇｏｓｓｅｎ．Ｍ．＆ Ｂｕｊａｒｄ．Ｈ．、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７〜５５５１（１９
９２））。
【０１９７】 すでに言及したように、ｐＣＹＴｔｓ系のスイッチを切ることは、レプリカー
ゼおよび目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性に依存する。レプリカ
ーゼの半減期は、発現後１．５時間であることが示されている（ＤｅＧｒｏｏｔ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９６７〜８９７
１（１９９１））。従って、ｍＲＮＡの安定性は、この系がいかに迅速にスイッ
チを切られるのかを決定する限定因子である。例えば、ＳＥＡＰ ｍＲＮＡを、
制限温度にシフトした後、約１０時間翻訳した（図６Ａ〜６Ｂ）。この高度な安
定性もまた、ＣＡＴ ｍＲＮＡについて見出された（Ｘｉｏｎｇ、Ｃ．ら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８〜１１９１（１９８９））。このことは、シンド
ビスウイルス由来のｍＲＮＡは、このｍＲＮＡにコードされるタンパク質にかか
わらず、非常に安定であることを示唆する。
【０１９８】 この系を、混合した集団において試験し、この発現系が、挿入部位およびコピ
ー数に依存しないことを証明した（図４Ａ〜４Ｂおよび図５Ａ〜５Ｂにおいて示
される）。
【０１９９】 結論として、上記の実施例に記載されたｐＣＹＴｔｓ温度調節可能遺伝子発現
系は、一般的に使用される調節可能な系に対して有意な利点を有する。その非常
に低い基礎発現レベルに起因して、今のところ、従来のインビトロ遺伝子発現系
において困難な課題であるＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０の発現にお
いて示されるように、この系は宿主毒性タンパク質の発現に使用され得る。この
系はまた、長期の発現および再誘導性について試験されているので、遺伝子治療
のためにも有用である。遺伝子治療におけるその可能性のある使用が、温度調節
が容易に達成可能である、ヒト皮膚細胞におけるＧＦＰの一過性の発現において
示されている。
【０２００】 本発明が上記の記載および実施例において特定して記載された以外に、実施さ
れ得ることは明らかである。
【０２０１】 本発明の多数の変更および改変が、上記の教示を考慮して可能であり、従って
、添付の特許請求の範囲内である。
【０２０２】 本明細書において引用される全ての刊行物（特許、特許出願、科学文献、実験
室マニュアル、書籍、または他の文献）の全開示は、本明細書によって参考とし
て援用される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＣＹＴｔｓのＤＮＡ（１）は、核に挿入される。真核生物プロモーター（実
線の水平方向の矢印）は、ｍＲＮＡ（３）への転写（２）を駆動する。ｍＲＮＡ
の第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写（４）は、温度感受性
レプリカーゼ（ｔｓ−レプリカーゼタンパク質）（５）の生成を生じる。目的の
遺伝子をコードする第２のオープンＯＲＦは、リボゾームに接近し得ない。した
がって、目的の遺伝子の翻訳（６）は生じない。低温度にてｔｓ−レプリカーゼ
は、ｍＲＮＡ（３）の全長（−）鎖ＲＮＡ（８）への複製（７）を触媒する。こ
のｔｓ−レプリカーゼはまた、全長（＋）鎖ＲＮＡ（１１）およびサブゲノムＲ
ＮＡ（１２）への部分配列複製（９、１０）を触媒する。次いで、このサブゲノ
ムＲＮＡ（１２）は、目的のタンパク質（示していない）に翻訳される（１３）
。ＲＮＡの増幅および質的変化の組み合わせは、目的の遺伝子発現の前例のない
緊張および調節能力を生じる。 図１の略語を以下に示す：ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ ｐｒ．
）、シス作用配列エレメント（ＣＳＥ）、非構造タンパク質１〜４（ｎｓＰ１、
ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）、目的の遺伝子（Ｇ．Ｏ．Ｉ．）、およびサブ
ゲノムプロモーター（Ｓ．Ｇ．）。
【図２】 図２は、ｐＣＹＴｔｓベクターの略図である。ｐＣＹＴｔｓベクターは、図１
に示されるエレメントに加えて、細菌細胞選択のためのアンピシリン耐性マーカ
ーおよび高コピー数細菌増幅を指向するＣｏｌＥ１配列を含む。ｐＣＹＴｔｓベ
クターは、実施例１に記載されるようにして調製した。
【図３】 図３Ａ〜３Ｄは、ｐＣＹＴｔｓの完全ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号１）。
【図４】 異なる温度でのＧＦＰ（図４Ａ）およびＳＥＡＰ（図４Ｂ）生成。ｐＣＹＴｔ
ｓＧＦＰまたはｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰで安定にトランスフェクトされた細胞を、
示される温度（黒菱形および白四角）で４８時間増殖させた。２つの独立した実
験を、図４Ａおよび図４Ｂの各々に示す。ＧＦＰ蛍光（図４Ａ）は、実施例２に
記載されるように決定した。ＳＥＡＰ活性（図４Ｂ）は、実施例３に記載される
ように比色定量的に決定した。最大のタンパク質発現は、両方のタンパク質につ
いて２９℃であることが決定された。タンパク質の活性は、２９℃での最大値に
対して相対的に算出した。
【図５】 ｐＣＹＴｔｓＧＦＰ（図５Ａ）およびｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰ（図５Ｂ）で３０
℃にて安定にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるＧＦＰ生成（図５Ａ）
およびＳＥＡＰ生成（図５Ｂ）の時間経過。ＧＦＰ産生を、実施例２に記載され
るように、分光蛍光分析によって測定し、そして１０6細胞あたりの蛍光ユニッ トを定量した。１０6細胞あたりのＳＥＡＰ生成を、実施例３に記載されるよう にして、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用して酵素活性を測定
することにより決定した。８０時間後に生成されたＳＥＡＰの量は、細胞あたり
１０7分子を超えることが推定された。
【図６】 ｐＣＹＴｔｓＧＦＰまたはｐＣＹＴｔｓＳＥＡＰで安定にトランスフェクトさ
れたＢＨＫ細胞の混合集団における、ＧＦＰ（図６Ａ）またはＳＥＡＰ（図６Ｂ
）のｍＲＮＡ転写の開始を、生成されたＧＦＰまたはＳＥＡＰの量を測定するこ
とによって決定した（実施例２および３を参照のこと）。細胞を２９℃で２時間
、４時間、６時間、８時間および１０時間インキュベート（黒棒）し、次いで、
さらに、３７℃で２４時間増殖させた（白棒）。
【図７Ａ】 これらの図は、安定にｐＣＹＴｔｓＧＦＰでトランスフェクトされたＢＨＫ細
胞（シンドビスウイルスの構造タンパク質をコードするプラスミドで一過性にト
ランスフェクトされた）を使用して得られた実験の結果を示す。実験条件は以下
であった：（Ｉ）トランスフェクトされたＢＨＫ細胞の２９℃または３７℃での
４８時間のインキュベーション段階；（ＩＩ）細胞の上清を新しいＢＨＫ細胞層
上に置き、そして示された温度まで細胞をシフトした；（ＩＩＩ）新しいＢＨＫ
細胞層の２９℃または３７℃のいずれかでの６時間のインキュベーション；なら
びに（ＩＶ）細胞の洗浄そして２９℃または３７℃での４８時間の最後のインキ
ュベーション。感染事象を、実施例２に記載されるようにしてマーカー遺伝子Ｇ
ＦＰの発現によって可視化した。図７Ａは、上記に記載されるようにして行った
２つの別々の実験の結果を示す。蛍光はＧＦＰ発現を示すのに対し、蛍光が見ら
れないものはＧＦＰ発現が検出不能であることを示す。
【図７Ｂ】 これらの図は、安定にｐＣＹＴｔｓＧＦＰトランスフェクトされたＢＨＫ細胞
（シンドビスウイルスの構造タンパク質をコードするプラスミドで一過性にトラ
ンスフェクトされた）を使用して得られた実験の結果を示す。実験条件は以下で
あった：（Ｉ）トランスフェクトされたＢＨＫ細胞の２９℃または３７℃での４
８時間のインキュベーション段階；（ＩＩ）細胞の上清を新しいＢＨＫ細胞層上
に置き、そして示された温度まで細胞をシフトした；（ＩＩＩ）新しいＢＨＫ細
胞層の２９℃または３７℃のいずれかでの６時間のインキュベーション；ならび
に（ＩＶ）細胞の洗浄そして２９℃または３７℃での４８時間の最後のインキュ
ベーション。感染事象を、実施例２に記載されるようにしてマーカー遺伝子ＧＦ
Ｐの発現によって可視化した。図７Ｂは、上記に記載されるようにして行った４
つの別々の実験の結果を示す。＋および−記号は、ＧＦＰ発現が検出されたか否
かを示す。
【図８Ａ】 ｐＣＹＴｔｓ系において発現されたβインターフェロン（β−ＩＮＦ）（図８
Ａ）およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）（図８Ｂ）のウエスタンブロット。図
８Ａは、レーン１：マーカー、レーン２：陽性コントロール、レーン３：３７℃
にて３日間のインキュベーション後にβ−ＩＮＦを発現している細胞の上清、レ
ーン４：２９℃にて３日間のインキュベーション後にβ−ＩＮＦを発現している
ＢＨＫ細胞（一過性のトランスフェクション）の上清、レーン５：ＧＦＰを発現
しているＢＨＫ細胞の上清、レーン６：マーカー、レーン７：２９℃にて３日間
のインキュベーション後にβ−ＩＮＦを発現しているＢＨＫ細胞（混合集団）の
上清、およびレーン８：マーカーを示す。
【図８Ｂ】 ｐＣＹＴｔｓ系において発現されたエリトロポイエチン（ＥＰＯ）（図８Ｂ）
のウエスタンブロット。図８Ｂは、レーン１：マーカー、レーン２：２９℃にて
５日間のインキュベートション後にＥＰＯを発現している細胞（一過性のトラン
スフェクション）の上清、レーン３：３７℃にて５日間のインキュベーション後
にＥＰＯを発現している細胞の上清、レーン４：ＧＦＰを発現しているＢＨＫ細
胞の上清、およびレーン５：マーカーを示す。
【図９】 図９は、ＥＰＯのウエスタンブロットを示す。各レーンのサンプルは以下であ
る；レーン１：ＥＰＯ標準；レーン２：３７℃にて４日間、安定にｐＣＹＴｔｓ
５０４−Ｅｐｏトランスフェクトされた細胞の上清；レーン３：２９℃にて４日
間、安定にｐＣＹＴｔｓ５０４−Ｅｐｏトランスフェクトされた細胞の上清；レ
ーン４：マーカー。
【図１０】 図１０は、ＥＰＯのドットブロットを示す。スポット＋は、ＥＰＯ標準；スポ
ット２および１０は、ＢＨＫ細胞の上清（２）；スポット３は、３０℃にてイン
キュベートされた、ＧＦＰを発現しているＢＨＫ細胞；スポット４は、３７℃に
てインキュベートされた、１Ｃ４細胞；スポット８は、３７℃にて２日間インキ
ュベートされた、ウイルス粒子を含むＣＹＴｔｓ５０４Ｅｐｏ ＲＮＡで感染さ
れたＢＨＫ細胞の上清；スポット９は、３０℃にて２日間インキュベートされた
、ウイルス粒子を含むＣＹＴｔｓ５０４Ｅｐｏ ＲＮＡで感染されたＢＨＫ細胞
の上清を示す。
【図１１】 図１１は、本発明の１つの実施態様の概要を示す。この実施態様は、生後まも
ないハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞株１Ｃ４／４によって産生される、パッケ
ージングされたＲＮＡレプリコンで感染された宿主細胞を使用する、組換えヒト
ＥＰＯの産生に関する。このＢＨＫ細胞株は、実施例６に記載されるように産生
された。
【図１２】 図１２は、本発明の１つの実施態様のフローチャートを示す。この図に記載さ
れるプロセスしたがって、ＲＮＡレプリコンは、ＥＰＯを安定にパッケージング
するＢＨＫ細胞株１Ｃ４／４によって産生され、そして培養培地から単離される
。次いで、野生型のＢＨＫ細胞（この細胞は、血清を含まない培養培地かまたは
タンパク質を含まない培養培地のいずれかで培養され得る）を、このレプリコン
で感染させる。次いで、感染した細胞によって産生されるタンパク質を、従来の
プロセスによって精製する。この図に概説されるプロセスは、ヒトＥＰＯまたは
他のタンパク質の多量の産生のために容易にスケールアップされ得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 7/04 5/10 9/12 7/04 15/00 ＺＮＡＡ 9/12 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ブースマ， マルコ オランダ国 エヌエル−8915 シービー リウ ワーデン， テレマンストラアト 10ディー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA21 BA24 BA28 BA38 CA01 CA04 CA11 DA02 EA02 FA01 FA10 GA11 GA14 GA18 HA03 HA08 HA17 4B050 CC03 DD01 EE03 EE10 LL01 4B065 AA90X AA93X AA95Y AB01 AC14 BA02 BA03 BC03 CA24 CA26 CA44 4C084 AA13 MA17 MA66 ZA362 ZA512 ZB212 4H045 AA20 AA30 CA01 DA01 DA13 DA14 DA17 DA89 EA20 FA72 FA74

Claims (74)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子
    であって、ここで該ＲＮＡ分子は、以下： （ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、 （ｂ）非細胞変性、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする
    ヌクレオチド配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、および （ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの第２のヌクレオチド配
    列： （ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディン
    グフレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以
    上のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に翻訳可能な形式である、第２のオープンリ
    ーディングフレーム； （ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部
    に相補的な配列；および （ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子またはその相補体をコードする配列、
    を含む、ＤＮＡ分子。
  2. 【請求項２】 前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがウイルス起源である
    、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがアルファウイルス起
    源である、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 ３４℃以下でレプリカーゼ活性を有するか、または３４℃以
    上で検出可能なレプリカーゼ活性を有さないＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを
    コードする、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  5. 【請求項５】 請求項１（ｃ）（ｉ）に記載の第２のオープンリーディング
    フレームが、サイトカイン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、
    毒性タンパク質、プロドラッグ転換酵素、または他のタンパク質をコードする、
    請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  6. 【請求項６】 請求項１（ｃ）（ｉ）に記載の第２のオープンリーディング
    フレームが、ヒトエリスロポエチンまたはヒトβインターフェロンをコードする
    、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 請求項１（ｃ）（ｉｉ）または１（ｃ）（ｉｉｉ）に記載の
    第２のヌクレオチド配列が、アンチセンスＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ
    分子、リボザイムからなる群から選択される翻訳されないＲＮＡ分子をコードす
    る、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 宿主細胞に請求項１に記載のＤＮＡ分子を導入する工程を包
    含する、組換え宿主細胞の作製方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法により作製される組換え宿主細胞を含
    む、インビトロ細胞培養物。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を含む
    、インビトロ細胞培養物。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載のＤＮＡ分子のいくつかのＤＮＡ配列また
    はすべてのＤＮＡ配列が前記宿主細胞に安定に維持される、請求項１０に記載の
    細胞培養物。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載のＤＮＡ分子から転写される、ＲＮＡ分子
    。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のＲＮＡ分子を含む、アルファウイルス
    粒子。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載のＲＮＡ分子を含む、組換え宿主細胞を
    含む、インビトロ細胞培養物。
  15. 【請求項１５】 配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
    を含む、単離された核酸分子。
  16. 【請求項１６】 組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲ
    ＮＡ分子を産生するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）少なくとも１つの請求項１に記載のＤＮＡ分子を該宿主細胞に導入する
    工程；および （ｃ）該タンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を回収する工程、 を包含する、方法。
  17. 【請求項１７】 組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲ
    ＮＡ分子を産生するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）少なくとも１つの請求項１２に記載のＲＮＡ分子を該宿主細胞に導入す
    る工程；および （ｃ）該タンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を回収する工程、 を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 前記タンパク質がエリスロポエチンである、請求項１７に
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ＲＮＡがアルファウイルス粒子にパッケージされる、
    請求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１２に記載のＲＮＡ分子を含むアルファウイルス粒
    子を産生するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）アルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のオープンリー
    ディングフレームを有する少なくとも１つの請求項１に記載のＤＮＡ分子を該宿
    主細胞に導入する工程；および （ｃ）該アルファウイルス粒子を回収する工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 組換え宿主細胞においてタンパク質を産生するための方法
    であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）請求項２０に記載の方法により産生されるアルファウイルス粒子を該宿
    主細胞に感染させる工程；および （ｃ）該タンパク質を回収する工程、 を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】 前記タンパク質がエリスロポエチンである、請求項２１に
    記載の方法。
  23. 【請求項２３】 組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲ
    ＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）少なくとも１つの請求項１に記載のＤＮＡ分子を該宿主細胞に導入する
    工程；および （ｃ）（ｉ）該宿主細胞培養の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工
    程、または （ｉｉ）該宿主細胞培養の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる
    工程、 を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲ
    ＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）少なくとも１つの請求項１２に記載のＲＮＡ分子を該宿主細胞に導入す
    る工程；および （ｃ）（ｉ）該宿主細胞培養の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工
    程、または （ｉｉ）該宿主細胞培養の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる
    工程、 を包含する、方法。
  25. 【請求項２５】 個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の
    発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）少なくとも１つの請求項１に記載のＤＮＡ分子を該個体に投与する工程
    ；および （ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化
    させる工程、または （ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変
    化させる工程、 を包含する、方法。
  26. 【請求項２６】 個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の
    発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）少なくとも１つの請求項１２に記載のＲＮＡ分子を該個体に投与する工
    程；および （ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化
    させる工程、または （ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変
    化させる工程、 を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 前記個体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の
    発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）請求項１に記載の少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を
    該個体に投与する工程；および （ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化
    させる工程、または （ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変
    化させる工程、 を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 前記組換え宿主細胞が、該宿主細胞が投与される同じ個体
    から得られる、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記組換え宿主細胞が、ケラチノサイト、上皮細胞または
    線維芽細胞である、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記個体がヒトである、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 少なくとも１つの請求項１に記載のＤＮＡ分子および薬学
    的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  33. 【請求項３３】 少なくとも１つの請求項１２に記載のＲＮＡ分子および薬
    学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  34. 【請求項３４】 少なくとも１つの請求項１３に記載のアルファウイルス粒
    子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  35. 【請求項３５】 少なくとも１つの請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む宿主
    細胞を有する遺伝的に操作された非ヒト動物。
  36. 【請求項３６】 前記ＤＮＡ分子が前記宿主細胞のゲノムに安定に組み込ま
    れている、請求項３５に記載の動物。
  37. 【請求項３７】 少なくとも１つの請求項１２に記載のＲＮＡ分子を含む宿
    主細胞を有する、遺伝的に操作された非ヒト動物。
  38. 【請求項３８】 ＲＮＡ分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含
    むＤＮＡベクター系であって、該ＲＮＡ分子は、以下： （ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント （ｂ）非細胞変性、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする
    核酸配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、および （ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの第２のヌクレオチド配
    列： （ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディング
    フレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上
    のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に、翻訳可能な形式である、第２のオープンリ
    ーディングフレーム； （ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に
    相補的な配列；および （ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子またはその相補体をコードする配列、 を含む、ＤＮＡベクター系。
  39. 【請求項３９】 前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがウイルス起源であ
    る、請求項３８に記載のＤＮＡベクター系。
  40. 【請求項４０】 前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがアルファウイルス
    起源である、請求項３８に記載のＤＮＡベクター系。
  41. 【請求項４１】 ３４℃以下の温度でレプリカーゼ活性を有するか、または
    ３４℃以上で検出可能なレプリカーゼ活性を有さないＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
    ラーゼをコードする、請求項３８に記載のＤＮＡベクター系。
  42. 【請求項４２】 請求項１（ｃ）（ｉ）に記載の第２のオープンリーディン
    グフレームが、サイトカイン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン
    、毒性タンパク質、プロドラッグ転換酵素、または他のタンパク質をコードする
    、請求項３８に記載のＤＮＡベクター系。
  43. 【請求項４３】 請求項１（ｃ）（ｉ）に記載の第２のオープンリーディン
    グフレームが、ヒトエリスロポエチンまたはヒトβインターフェロンをコードす
    る、請求項３８に記載のＤＮＡベクター系。
  44. 【請求項４４】 請求項１（ｃ）（ｉｉ）または１（ｃ）（ｉｉｉ）に記載
    の第２のヌクレオチド配列が、アンチセンスＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮ
    Ａ分子、リボザイムからなる群から選択される翻訳されないＲＮＡ分子をコード
    する、請求項３８に記載のＤＮＡベクター系。
  45. 【請求項４５】 少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチドを
    宿主細胞に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞の作製方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４５に記載の方法により作製された組換え宿主細胞
    を含む、インビトロ細胞培養物。
  47. 【請求項４７】 少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチドを
    含む組換え宿主細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
  48. 【請求項４８】 請求項３８に記載のいくつかのポリヌクレオチド配列また
    はすべてのポリヌクレオチド配列が前記宿主細胞に安定に維持される、請求項４
    ７に記載の細胞培養物。
  49. 【請求項４９】 請求項３８に記載のベクター系の１つ以上のポリヌクレオ
    チドから転写される、１つ以上のＲＮＡ分子を含む組成物。
  50. 【請求項５０】 少なくとも１つの請求項４９に記載のＲＮＡ分子を含む、
    アルファウイルス粒子。
  51. 【請求項５１】 少なくとも１つの請求項４９に記載のＲＮＡ分子を含む組
    換え宿主細胞を含む、インビトロ細胞培養物。
  52. 【請求項５２】 組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲ
    ＮＡ分子を産生するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチドを該宿主細胞に
    導入する工程；および （ｃ）該タンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を回収する工程、 を包含する、方法。
  53. 【請求項５３】 組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲ
    ＮＡ分子を産生するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）少なくとも１つの請求項４９に記載のＲＮＡ分子を該宿主細胞に導入す
    る工程；および （ｃ）該タンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子を回収する工程、 を包含する、方法。
  54. 【請求項５４】 前記タンパク質がエリスロポエチンである、請求項５３に
    記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記ＲＮＡがアルファウイルス粒子にパッケージされる、
    請求項５３に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 請求項５０に記載のＲＮＡ分子を含むアルファウイルス粒
    子を産生するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）アルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のオープンリー
    ディングフレームを有する少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチ
    ドを該宿主細胞に導入する工程；および （ｃ）該アルファウイルス粒子を回収する工程、 を包含する、方法。
  57. 【請求項５７】 組換え宿主細胞においてタンパク質を産生するための方法
    であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）請求項５６に記載の方法により産生されるアルファウイルス粒子を該宿
    主細胞に感染させる工程；および （ｃ）該タンパク質を回収する工程、 を包含する、方法。
  58. 【請求項５８】 前記タンパク質がエリスロポエチンである、請求項５７に
    記載の方法。
  59. 【請求項５９】 組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲ
    ＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチドを該宿主細胞に
    導入する工程；および （ｃ）（ｉ）該宿主細胞培養の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工
    程、または （ｉｉ）該宿主細胞培養の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる
    工程、 を包含する、方法。
  60. 【請求項６０】 組換え宿主細胞においてタンパク質または翻訳されないＲ
    ＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）適切な培養条件下で宿主細胞を増殖する工程； （ｂ）少なくとも１つの請求項４９に記載のＲＮＡ分子を該宿主細胞に導入す
    る工程；および （ｃ）（ｉ）該宿主細胞培養の温度を許容温度から制限的温度へ変化させる工
    程、または （ｉｉ）該宿主細胞培養の温度を制限的温度から許容温度へ変化させる
    工程、 を包含する、方法。
  61. 【請求項６１】 個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の
    発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチドを該個体に投与
    する工程；および （ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化
    させる工程、または （ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変
    化させる工程、 を包含する、方法。
  62. 【請求項６２】 個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の
    発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）少なくとも１つの請求項４９に記載のＲＮＡ分子を該個体に投与する工
    程；および （ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化
    させる工程、または （ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変
    化させる工程、 を包含する、方法。
  63. 【請求項６３】 前記個体がヒトである、請求項６２に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 個体においてタンパク質または翻訳されないＲＮＡ分子の
    発現を調節するための方法であって、以下： （ａ）少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿
    主細胞を該個体に投与する工程；および （ｂ）（ｉ）該個体の少なくとも一部の温度を許容温度から制限的温度へ変化
    させる工程、または （ｉｉ）該個体の少なくとも一部の温度を制限的温度から許容温度へ変
    化させる工程、 を包含する、方法。
  65. 【請求項６５】 前記組換え宿主細胞は、該宿主細胞が投与される同じ個体
    から得られる、請求項６４に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記組換え宿主細胞が、ケラチノサイト、上皮細胞または
    線維芽細胞である、請求項６５に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 前記個体がヒトである、請求項６４に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチドお
    よび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  69. 【請求項６９】 少なくとも１つの請求項４９に記載のＲＮＡ分子および薬
    学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  70. 【請求項７０】 少なくとも１つの請求項５０に記載のアルファウイルス粒
    子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  71. 【請求項７１】 少なくとも１つの請求項３８に記載のポリヌクレオチドを
    含む宿主細胞を有する、遺伝的に操作された非ヒト動物。
  72. 【請求項７２】 前記ポリヌクレオチドが前記宿主細胞ゲノムに安定に組み
    込まれている、請求項７１に記載の動物。
  73. 【請求項７３】 少なくとも１つの請求項４９に記載のＲＮＡを含む宿主細
    胞を有する、遺伝的に操作された非ヒト動物。
  74. 【請求項７４】 １つ以上のＲＮＡ分子を含む組成物であって、該ＲＮＡ分
    子は、以下： （ａ）少なくとも１つのシス作用性配列エレメント、 （ｂ）非細胞変性、温度感受性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする
    ヌクレオチド配列を有する第１のオープンリーディングフレーム、および （ｃ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの第２のヌクレオチド配
    列： （ｉ）タンパク質またはその部分をコードする第２のオープンリーディング
    フレームであって、ここで該第２のオープンリーディングフレームが、１つ以上
    のＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象後に、翻訳可能な形式である、オープンリーディ
    ングフレーム； （ｉｉ）（ｉ）の第２のオープンリーディングフレームの全てまたは一部に
    相補的な配列；および （ｉｉｉ）翻訳されないＲＮＡ分子またはその相補体をコードする配列、 を含む、組成物。
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