DE60119386T2

DE60119386T2 - Verbessertes transfektionssystem

Info

Publication number: DE60119386T2
Application number: DE60119386T
Authority: DE
Inventors: Myung-Sam Pinole CHO; Helena San Francisco YEE
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 2000-09-28
Filing date: 2001-09-14
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2021-09-15
Also published as: JP2004509642A; WO2002027005A9; AR035495A1; DE60119386D1; UY26947A1; ES2263652T3; WO2002027005A3; CA2420771C; SV2002000640A; ECSP014147A; MY139948A; AU2001289075A1; HN2001000215A; TWI239354B; WO2002027005A2; EP1356069B1; DOP2001000254A; JP5022555B2; CA2420771A1; PE20030412A1

Description

Gebiet: Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein eine Verbesserung in Säugetierzellen-Expressionssystemen und ganz besonders ein Säugetierzellen-Genexpressionsvektorsystem, das ein episomales Instandhaltungssystem, einen starken Promotor/Verstärker, ein Protein-Transaktivierungssystem und für ein heterologes Protein kodierende DNA einschließt.
Stand der Technik: Es ist wohl bekannt, dass verschiedene Zellwirte, wie mikrobielle Zellen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugetierzellen, befähig sind, kleine Mengen (Milligramm-Mengen) spezifischer Proteine in relativ kurzen Zeiträumen zu produzieren. Auch ist es bekannt, dass Proteine aus unterschiedlichen genetisch geschneiderten Wirtszellsystemen Proteine mit unterschiedlichen Glycosylierungsprofilen in Abhängigkeit von der eingesetzten Zelle erzeugen. Für pharmazeutische Anwendungen ist es in einigen Fällen erwünscht, Proteine mit Glycosylierungsprofilen zu erzeugen, die denen ähneln, die bei Menschen vorgefunden werden. Dies wird gewöhnlich mit einem Säugetierzellensystem bewerkstelligt, da solche Systeme Proteine mit Glycosylierungen produzieren, die mit klinischen Anwendungen kompatibel sind. Der Nachteil im Zusammenhang mit einer Verwendung von Säugetierzellen besteht allerdings darin, dass in typischer Weise längere Zeiträume beansprucht werden, um eine gleichwertige Menge an Protein zu erzeugen. Somit wäre es sehr wünschenswert, ein genetisch geschneidertes bzw. biotechnologisch hergestelltes Säugetierzellen-Expressionssystem (zur Exprimierung heterologer Proteine) verfügbar zu haben, das größere Mengen des Proteins in kürzeren Zeiträumen zu exprimieren vermag.
Es ist bekannt, dass verschiedene episomale Instandhaltungselemente in einen Vektor in einem Genexpressionssystem eingeführt werden können, um Replikation zu gewährleisten. Es ist ebenfalls gut bekannt, dass genetisch geschneiderte Systeme starke Promotor/Verstärker-Systeme einschließen können und in vielen Fällen einschließen sollten. Außerdem ist es wohl bekannt, dass genetisch geschneiderte bzw. biotechnologisch hergestellte Zelllinien Protein-Transaktivierungssysteme einschließen können, um die Proteinexpression aus DNA zu verstärken bzw. zu verbessern, die für ein heterologes Protein kodiert und ebenfalls in das System einverleibt wird.
Gegenüber diesem Stand der Technik sind keine Versuche oder Vorschläge bewusst gemacht worden, alle vier der obigen Elemente oder Systeme in ein einzelnes Säugetierzellen-Expressionssystem einzuverleiben, so dass die kombinierten Vorteile aller Elemente in einem einzelnen und funktionierenden System vorliegen und vorhanden sind, das heterologe Proteine exprimiert. In überraschender Weise ist nun, bei Anwendung der obigen Kombination mit den unten beschriebenen technischen Vorgehensweisen, etwas herausgefunden worden, was sich als synergistischer Effekt auf die Proteinexpression erweist. Repräsentative Beispiele für zwei heterologe Proteine (bezeichnet mit IL-25A und IL-4SA) sind unten beschrieben.
WO 00/28 060 betrifft Zellen, die zur Produktion von Helferabhängigen adenoviralen Vektoren in Abwesenheit weiterer Helfer verwendet werden können, da sie genartige Einheiten mit der Befähigung zur Exprimierung der Funktionen enthalten, die zum Abschluss des viralen Zyklus notwendig, in solchen Vektoren aber abwesend sind.
Tsang T.C. et al. (International Journal of Molecular Medicine 5(3): 295-300, 2000) betrifft die Konstruktion neuer Amplifizier-Expressionsvektoren für hohe Gehaltsmengen einer IL-2-Genexpression.
Beide Literaturstellen schweigen sich bezüglich des Plasmids der vorliegenden Erfindung aus.
Zusammenfassung der Erfindung
Das vorliegende Säugetier-Genexpressionsvektorsystem umfasst:

(a) ein episomales Instandhaltungssystem,
(b) einen starken Promotor/Verstärker,
(c) ein Protein-Transaktivierungssystem sowie
(d) für heterologes Protein codierende DNA.

Das episomale Instandhaltungssystem und das Protein-Transaktivierungssystem können Sub-Elemente einschließen, die auf den selben oder unterschiedlichen Plasmiden innerhalb des Säugetierzellen-Expressionssystems angeordnet sind. In einem bevorzugten System umfasst das episomale Instandhaltungssystem ein oriP-Element und ein EBNA1-Exprimiergen. Ein bevorzugter starker Promotor/Verstärker ist CMV, und das bevorzugte Protein-Transaktivierungssystem schließt sowohl TAT- als auch TAR-Elemente ein. Eine bevorzugte DNA-Kodiersequenz für das heterologe Protein schließt DNA ein, die für Substanzen kodiert (unten detaillierter beschrieben), die als IL-2SA und IL-4SA bekannt sind. Eine bevorzugte Säugetierzelllinie stammt aus einem Primat, obwohl weitere Säugetierzelllinien ebenfalls verwendet werden können. Es sollte allerdings angemerkt sein, dass die bevorzugten Zelllinien nicht aus Nagetieren stammen sollten, und zwar aus den unten noch anzugebenden Gründen.
Die zur Darstellung der vorliegenden Systeme verwendeten Komponenten werden im Folgenden beschrieben.

1. Ein pBR322-basierter Expressionsvektor wurde mit menschlichem CMV-Verstärker/Promotor-Element und mit 5'-IS zur Säugetierzellenexpression ergänzt, und dieses Plasmid ist pSM97 (beschrieben in US 5,854,021 ).
2. EBNA1- und oriP-Elemente, die die Instandhaltung von Plasmid-DNA als eine episomale Struktur zu stützen vermögen (Yates et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3806-3810 und US 4,686,186 ), wurden zum obigen Expressionsvektor gegeben.
3. TAT(Transaktivatorgen)- und TAR(Transaktivierungsreaktionssequenz)-Elemente, die die Transaktivierungsfunktion von TAT-Protein zu stützen vermögen (beschrieben in US 5,801,056 ), hierin bezeichnet als TAT/TAR-Elemente, wurden zum Expressionsvektor gegeben, um einen mit den TAT/TAR-Elementen kombinierten Expressionsvektor zu ergeben.
4. BMLFI-Transaktivator (Lieberman et al., J. Virol. 60: 140-148, 1986, Kenney et al., J. Virol. 63: 3870-3877, 1989, und Ruvolo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8852-8857), ursprünglich abgeleitet aus Epstein-Barr-Virus, wurde in den Vektor inseriert bzw. eingereiht.

Kurze Beschreibung der Figuren
1-1 und 1-2 zeigen körperliche Plandarstellungen von Interleukin-2-Mutein-(bezeichnet als IL-2SA)-Expressionsvektoren zur Transfektionsstudie der Optimierung von Expressionsvektoren, die kombinierte oriP- und TAT/TAR-Elemente einschlossen.
2 zeigt körperliche Plandarstellungen von Expressionsvektoren zur Transfektionsstudie des BMLF-Transaktivierungseffekts.
3 ist ein Diagramm, das die Verstärkung/Verbesserung der IL-2SA-Sekretion in Übergangstransfektionsassays zur Identifizierung und zum Vergleich des oriP-Effekts, TAT/TAR-Transaktivierungseffekts und der TAT/TAR-Transaktivierungs- plus oriP-Effekte zeigt. Anzumerken sei, dass das linearisierte pSS179 als Basislinie des IL-2SA-Expressionsniveaus angenommen wurde, weil die oriP-Funktion nach Linearisierung durch Verwendung eines Restriktionsenzyms und in ähnlicher Weise mit linearisiertem pSS185 abgestellt sein sollte.
4 zeigt BMLF1-Transaktivierungseffekte auf die IL-2SA-Sekretion aus CHO-Zellen in einer verlängerten Züchtungszeit. Bei 3 dpt wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und mit den gleichen Zahlen von Zellen auf eine Lochvertiefung mit frischem Medium, ergänzt mit 5 % FBS, gesät. Die Sekretionsniveaus von IL-2SA aus pSS179-transfizierten CHO-Zellen blieben ähnlich über 4 bis 7 dpt wie die nach 3 dpt erhaltenen aufrecht. Allerdings zeigten und ergaben IL-2SA-Expressionsniveaus aus mit pSS212, 213 und 214 transfizierten CHO-Zellen nach 4 dpt keinen verstärkten Effekt der BMLF1-Transfektionsaktivität, die sich bei 3 dpt zeigte.
5 zeigt BMLF1-Transaktivierungseffekte auf die IL-2SA-Sekretion aus HKB11-Zellen in einer verlängerten Züchtungszeit unter einer Arznei-Selektion. Bei 3 dpt gesehene BMLF1-Transaktivierungseffekte aus mit pSS212, 213 und 219 transfizierten HKB11-Zellen wurden nach Zugabe von HygB abgestellt, obwohl der TAT/TAR-Effekt unter der Arznei-Selektion beibehalten blieb, wie in 6 gezeigt.
6 zeigt TAT/TAR-Transaktivierungseffekte auf die IL-2SA-Sekretion aus HKB11-Zellen unter der Hygromycin-B-Selektion. Die transfizierten Zellen wurden wie im Text beschrieben in Stand gehalten.
7 zeigt körperliche Plandarstellungen von Expressionsvektoren zur Cotransfektionsstudie zur Hochdurchsatzexpression.
Spezifische Ausgestaltungen Materialien und Verfahren Zellen
Menschliche embryonale Nierenzellen (293) (ATCC CRL-1573) 293EBNA (EBNA1 exprimierende 293-Zellen), erhalten von Invitrogen (Carlsbad, CA)
Dihydrofolat-Reduktase (dhfr)-negative CHO (Chinesische Hamster-Ovar)-Zellen wurden von Genentech Inc. erhalten.
HKB11 (ATCC, CRL-12568) ist eine menschliche somatische Hybridzelllinie (US-Patentanmeldung 09/209 920), abgeleitet aus der Zellfusion menschlicher embryonaler Nieren (293)-Zellen mit Burkitt's-Lymphoma-Ursprungs(P3HR-1)-Zellen.
Konstruktion der Plasmide
Das IL-2SA ist ein IL-2-Mutein mit einer einzelnen Aminosäuresubstitution (N88R), wie beschrieben in WO 99/60 128. Eine kurze Beschreibung der individuellen Expressionsvektoren der 1-1 und 1-2 wird wie folgt gegeben:

pSL160N: IL-2SA-Kodiersequenz wurde in die PvuII-Stelle von pSM97 eingereiht und weiter durch Zugabe von HSAG1-Element (EcoRI- und XbaI-Fragment; 1447 bp), beschrieben in McArthur und Stanners (J. Biol. Chem. 266: 6000-6005, 1991), in die SpeI-Stelle von pSM97 und von EBV-TR (Cho et al., US-Patentanmeldung 09/209 915) in die NaeI-Stelle von pSM97 modifiziert.
pSS179: IL-2SA-Kodiersequenz wurde in die BamHI/XhoI-Stelle von pCEP4 eingereiht.
pSS178: TAR-Element (82 bp) wird stromaufwärts von IL-2SA von pSS179 angeordnet.
pSS185: Ein funktionales TAT-Element, beschrieben in der Plasmidkonstruktion, wurde in die NruI-Stelle (stromaufwärtige Stelle des TK-Promotors) von pSS178 eingereiht.
pSH201: Eine intronische Sequenz MIS (ca. 270 bp) wurde am 3'-Ende der TAR-Sequenz (NotI/HindIII) von pSS185 angeordnet.
pSC221: HSAG-Element von pSL160N wurde weggelassen, und TAR-Element wurde am 3'-Ende von CMVe/p und am 5'-Ende der MIS angeordnet.
pSS225: EBNA1- und funktionale TAT- und hph-Exprimiersegmente wurden aus pSH201 herausgeschnitten.
pSS226: Ein funktionales TAT-Exprimierelement wurde am 5'-Ende von amp-r-Gen von pSS225 eingereiht.

Die Beschreibung des individuellen Expressionsvektors von 2 wird wie folgt gegeben:

pSS210: BMLF1- und hph exprimierendes oriP-Plasmid wurden im Abschnitt der Konstruktion des Plasmids beschrieben.
pSS212: IL-2SA-Kodiersequenz wurde am 3'-Ende des CMVe/p des pSS210 angeordnet.
pSS213: Ein TAR-Element wird am 5'-Ende von IL-2SA des pSS212 angeordnet.
pSS214: Eine intronische Sequenz, MIS, wird ferner am 5'-Ende von IL-2SA des pSS213 addiert.

Eine Kurzbeschreibung der individuellen Plasmidstruktur der 7 wird wie folgt gegeben:

pSS223: Dieses Plasmid ist grundsätzlich gleich wie pSS225, es fehlt aber die IL-2SA-Kodiersequenz.
pSC186: Eine TAT-Kodiersequenz wurde am 3'-Ende des CMVe/p von pCEP4 angeordnet, und das funktionale hph-Exprimiersequenz wurde gelöscht.
pSS240: IL-2SA-Kodiersequenz wurde in die PvuII-Stelle des pSS223 eingereiht.
pSS241: IL-4-Kodiersequenz wurde in die PvuII-Stelle des pSS223 eingereiht.

Der pBR322-basierte Säugetierzellen-Expressionsvektor mit einer funktionalen dhfr-Genexpression (pSM97; Cho et al., US 5,854,021 ), der pCEP4-Vektor, bestehend aus oriP, EBNA1 und aus funktionaler hph-Genexpression auf Basis von pBR322, wurde von Invitrogen (Carlsbad, CA) erhalten.
82 Basenpaare des TAR-Elements wurden mit PCR mit pBennCAT (Gendelman H.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9759-9763, 1986) als Template hergestellt. 2 Primer wurden durch Addieren der KpnI-Stelle am 5'-Ende des TAR und der HindIII-Stelle am 3'-Ende des TAR hergestellt. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde mit HindIII und KpnI abgebaut und in pCEP4 nach Abbau von pCEP4 mit KpnI und HindIII eingereiht. Das funktionale TAT-Exprimiersegment wurde aus pSVTAT (Peterlin B.M. et al., Proc. Natl., Acad. Sci USA 83: 9739-9738, 1986) durch dessen Abbau mit BamHI (modifiziert mit Klenow-Fragment) und mit HpaI hergestellt.
Dieses Fragment wurde auf pSV₂neo nach Abbau mit PvuII und HpaI eingereiht. Dieses funktionale TAT-Exprimiersegment kann leicht durch Abbau mit PvuII und BamHI herausgeschnitten werden, um sich in jedem weiteren Expressionsvektor einzureihen, wie dargestellt in 1 (pSS185 und pSC221). BMLF1-Kodiersequenz und polyA-Signalfläche wurden aus DNA-Sequenz umfassendem B95-8 EBV von 84301 (NheI) bis 82180 (HindIII) der B95-8 EBV-Sequenzdaten (P.J. Farrell, "Epstein-Barr-Virus Genome" in Advanced Viral Oncology; herausgegeben von G. Klein; Ravens Press, Ltd.: New York 1989, S. 103-132) hergestellt und in die PvuII-Stelle des pCEP4, einem Vektor mit CMVe/p, eingereiht. Diese BMLF1-Expression steht nun unter der Steuerung des CMVe/p.
Das funktionale BMLF1-Expressionssegment wurde durch Abbau mit SpeI und NheI aus diesem Vektor entfernt, und ein neuer Expressionsvektor wurde konstruiert. Dieses entstandene Plasmid pSS210 ist in 2 zu finden. Das Interleukin-2-Mutein (N88R), bekannt als IL-2SA (WO 99/60 128, IL-2-Selektive Agonisten und Antagonisten) wurde als Reportergen verwendet.
Transfektion
Stationäre Transfektionen wurden mit den Zellen durchgeführt, die im Anker-abhängigen Modus wachsen. Logarithmisch wachsende HKB11-Zellen (1,5 × 10⁶ Zellen) in 4 mL frischem Medium mit entweder 5 % FBS oder ohne Serum wurden in 1 Lochvertiefung einer Gewebekulturschale im 6-Lochvertiefungsformat (Corning Inc.; Corning, NY) gesät, und man ließ sie am Boden der Platte 2 oder mehr h lang in einem befeuchteten CO₂-Inkubator bei 37°C anhaften und wachsen. Ein Cocktail (1 mL), bestehend aus 5 μg DNA und 20 μL DMRIE-C-Reagens (Life Technologies, Rockville, MD), wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers zubereitet und in die Lochvertiefung gegeben und milde vermischt. Die Platten wurden im CO₂-Inkubator inkubiert.
Schütteltransfektionen wurden mit an Serum-freie Suspensionsbedingungen adaptierten Zellen durchgeführt. Logarithmisch wachsende HKB11-Zellen (5 × 10⁶ Zellen) in 4 mL frischem Medium wurden mit 1 mL des DNA/DMRIE-C-Komplexes wie in der obigen stationären Transfektion vermischt. Diese 5 mL transfizierten Zellen in einem 6-Lochvertiefungsformat wurden auf einem Schüttler (90 bis 100 U/min) in einem befeuchteten CO₂-Inkubator inkubiert. Transfizierte Zellen wurden bei 3 und 7 Tagen post Transfektion (dpt) durch Aufspaltung entweder auf 1:4 oder auf 1:5 subgezüchtet. Das gesamte Kulturvolumen wurde vom anfänglichen Transfektionsvolumen auf das 20-Fache bei 10 dpt gesteigert. Der Gewebekulturüberstand wurde mit einem ELISA zur Bestimmung der Sekretionsniveaus der Proteine analysiert.
ELISA
Zum Nachweis von IL-2SA wurden Dynatech Immulo-2-Rundbodenplatten mit 1 μg/mL gereinigtem anti-Mensch-IL-2 (PharMingen, San Diego, CA) aus Ratte mit 0,1 M NaHCO₂-(pH = 8,2)-Puffer überzogen, bei 37°C 3 h lang in einer befeuchteten Kammer inkubiert, mit PBS/0,05 % Tween 20 (Sigma P-1379, St. Louis, MO) gewaschen und mit PBS/1 & BSA 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Kulturüberstände, enthaltend IL-2SA, und ein Standard aus gereinigtem IL-2SA (als Standardkurve) wurden serienmäßig mit PBS/1 % BSA (50 μL/Lochvertiefung) verdünnt und bei Raumtemperatur 2 h lang inkubiert. Eingefangenes IL-2SA wurde mit biotinyliertem Maus-anti-Mensch-IL-2 (62,5 ng/mL; PharMingen, San Diego, CA) und anschließender Inkubation mit HRP-Streptavidin (125 ng/mL; Zymed Laboratories Inc. #43-4323, South San Francisco, CA) nachgewiesen. Zwischen allen Inkubationen (einer einstündigen Inkubation jeweils bei Raumtemperatur) wurden die Platten mit PBS/Tween 20 gewaschen. Die Platten wurden mit der Substrat-Lösung Tetramethylbenzidin (TMB; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Produkt #50-65-00 und 50-76-01, Gaithersburg, MD) entwickelt und die Reaktion mit 1 N HCl gestoppt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 450 mm/570 mm mit einem Molecular Device's Vmax-Kinetik-Mikroplatten-Messkopf (S/N 04514, Sunnyvale, CA) und mit dem von Molecular Devices gelieferten Softmax-Programm gemessen. Die IL-2SA-Konzentration im Gewebekulturüberstand wurde durch Vergleich mit der OD der Standardkurve des gereinigten IL-2SA bestimmt und ermittelt.
Zur Messung der Mensch-Interleukin-4 (IL-4)-Sekretion war der Assay ähnlich, mit der Ausnahme, dass Maus-anti-Mensch-IL-4-Antikörper (PharMingen, Kat. #18651D, San Diego, CA) zum Überzug der Platte und biotinylierter anti-Ratte-IL-4-Antikörper (PharMingen, Kat. #18502D, San Diego, CA) als Nachweis-Antikörper verwendet wurden. Auch wurde gereinigtes IL-4-Molekül als Standard verwendet.
Beispiel 1
Proteinexpression in Übergangstransfektionsassays mit TAT/TAR-oriP-Expressionsvektoren
Säugetierzellen-Expressionsvektoren, ausgerüstet mit CMVe/p in pBR322-Plasmid, zeigten Expression und Sekretion mit relativ hohem Niveau von 1 bis 20 μg/mL heterologem Protein. Allerdings waren einige Proteine nur sehr schwierig zu exprimieren, z.B. IL-2SA. Daher wurden verschiedene Expressionsvektoren unter Ausrüstung mit verschiedenen Verstärkungselementen, hauptsächlich mit Transaktivierungsproteinen und mit dem oriP-Element, konstruiert, um das transferierte Plasmid als ein Episom in Stand zu halten. Jedes Element allein ergab einen kleinen Niveauanstieg (3- bis 5-fach) in Übergangstransfektionsassays. Es wurden 2 Expressionsvektoren konstruiert, der eine mit IL-2SA in pCEP4-Vektor (pSS179) und der andere unter Addition von TAT/TAR-Transaktivierungselementen zum pSS179 (pSS185). Beide IL-2SA exprimierende Plasmid-DNAs (pSS179 und pSS185) wurden mit Restriktionsenzymen und mit der gleichen Menge beider DNAs (von 5 μg jeweils) abgebaut und ungeschnittene Plasmide transfiziert. Eine kleine Menge beider mit Restriktionsenzym abgebauter DNAs wurde herangezogen, um die Menge an ausgefällter DNA zu bestätigen, um zu gewährleisten, dass gleiche Mengen und Qualitäten (für eine 100 %ige Überführung in die lineare Form) in jeder Transfektion verwendet wurden. Transfektionen wurden unter Anwendung eines stationären Transfektionsverfahrens in einem Medium, ergänzt mit 5 % FBS, durchgeführt. Die Expressionsniveaus jedes Plasmids wurden unter der Annahme analysiert, dass die lineare Form des Plasmids die oriP-Funktion abstellt, weil lineare DNA bei dieser Bedingung nicht repliziert werden kann. Obwohl oriP und TAT/TAR einen Verstärkungseffekt aufweisen, ist, bei individueller Bewertung unter der Steuerung eines CMV-Promotors, die Steigerung deutlich niedrig (3- bis 5-fach) in den Übergangstransfektionsassays.
Wie in 3 dargestellt, waren die Effekte des oriP-Elements (des ungeschnittenen pSS179) und der TAT/TAR-Transaktivierung (des geschnittenen pSS185) auf die IL-2SA-Sekretion um das 2,7- bzw. 6-Fache höher als diejenigen aus der linearen Form des pSS179 bei 3 dpt. Der Mehrfach-Anstieg bei 5 dpt betrug 5,6 bzw. 10. Allerdings zeigte und ergab das ungeschnittene pSS185 (intakte TAT/TAR-Transaktivierung und oriP-Funktion) unerwartet hohe Niveaus (um das 26-Fache bei 3 dpt und um das 34-Fache bei 5 dpt) der IL-2SA-Sekretion als diejenigen Niveaus aus geschnittenem pSS179.
Es wurden auch weitere Vektorkonstruktionen, bestehend aus dem gleichen funktionalen Element, getestet. Die IL-2SA exprimierenden Vektoren pSC221 (TAT/TAR-dhfr), pSH201 (TAT/TAR-oriP mit EBNA1) und pSS226 (TAT/TAR-oriP w/o EBNA1) wurden verwendet, um HKB11- und 293EBNA-Zellen zu transfizieren, um 2 Wirtszellen und episomale Vektoren von TAT/TAR und TAT/TAR-oriP zu vergleichen. Siehe 1 bezüglich der körperlichen Plandarstellungen der Expressionsvektoren. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war der TAT/TAR-oriP-Effekt (pSH201) gegenüber TAT/TAR (pSC221) um das ca. 9-Fache höher in HKB11-Zellen und um das ca. 4-Fache höher in 293EBNA-Zellen bei 3 dpt. Diese Effekte waren ähnlich wie derjenige (um das 4,4-Fache), der mit episomalem und linearem pSS185 beobachtet wurde (3). 293EBNA-Zellen zeigten geringfügig niedrigere Sekretionsniveaus von IL-2SA als HKB11-Zellen, allerdings war es klar, dass TAT/TAA-oriP-Vektor auch in anderen als den HKB11-Zellen, hier in 293EBNA-Zellen, zur maximalen Proteinproduktion verwendet werden kann. Es wurde beobachtet, dass mit EBNA1-Gen ausgerüsteter TAT/TAR-oriP-Vektor geringfügig besser als ohne EBNA1-Gen war. Es hat den Anschein, dass HKB11- und 293EBNA-Zellen nicht genug EBNA1-Protein aufweisen können, um den episomalen Vektor in Stand zu halten. Tabelle 1: Vergleich der HKB11- und der 293EBNA-Zellen, transfiziert mit TAT/TAR- und mit TAT/TAR-oriP-Vektoren, zur IL-2SA-Sekretion in Serumfreiem Medium bei 3 dpt

Anmerkung: Der Mehrfach-Anstieg von IL-SA durch TAT/TAR und TAT/TAR-oriP wurde unter der Annahme eines Wertes von 1 für die IL-2SA-Produktion aus pSC221 berechnet.

Beispiel 2
Proteinexpression in Übergangstransfektionsassays mit SMLF1-oriP-Expressionsvektoren
BMLF1 wurde ursprünglich als promisker Transaktivator (Lieberman et al., J. Virol 60: 140-148, 1986) bekannt. Seit damals hat sich dieses dieses Protein als post-transkriptionaler Transaktiviator erwiesen (Kenney et al., J. Virol 63: 3870-3877, 1989), und kürzlichst wurde es als Transaktivator zur Intron-losen Genexpression und als Inhibitor zur Introngebundenen Genexpression beschrieben (Ruvolo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8852-9957). Vorliegend wurde das BMLF1-Protein bezüglich seiner Transaktivierungsfunktion einer Säugetier-Genexpression (IL-2SA) getestet. Die IL-2SA-Kodiersequenz ohne stromabwärts vom CMVe/p von pSS210 eingereihtes 5'-IS ist pSS212. Die IL-2SA exprimierende Kodiersequenz wurde durch Addieren der TAR-Sequenz an das 5'-Ende von IL-2SA (pSS213) und weiter durch Addieren einer intronischen Sequenz (MIS) am 5-Ende des IL-2SA von pSS213 modifiziert, um den Vektor pSS214 zu ergeben. Siehe 2 bezüglich der körperlichen Plandarstellungen der individuellen Expressionsvektoren. Stationäre Übergangstransvektionsassays zeigen an, dass das BMLF1-Protein die IL-2SA-Expression, unabhängig von Intron, um das 3- bis 4-Fache in HKB11-Zellen (Tabelle 2) und um das 10- bis 20-Fache in CHO-Zellen (Tabelle 3) in Serum-haltigem Medium verstärkt. Tabelle 2: Vergleich der IL-2SA-Produktion (3 dpt) aus HKB11-Zellen, transfiziert mit verschiedenen IL-2SA exprimierenden Vektoren in Serumhaltigem Medium

Anmerkung: Der Mehrfach-Anstieg der IL-25A-Produktion durch BMLF1 wurde aus dem Durchschnitt von 3 Versuchen unter der Annahme eines Wertes von 1 für die IL-2SA-Produktion aus pSS179 berechnet.

Wie beschrieben in 2, weisen pSS212, pSS213 und pSS214 IL-2SA exprimierende Segmente, ausgerüstet Intron-los, Intron-los mit TAR bzw. ausgerüstet mit TAR-MIS am 5'-Ende des Moleküls, auf. Tabelle 3: Vergleich der IL-2SA-Produktion (3 dpt) aus CHO-Zellen, transfiziert mit verschiedenen IL-2SA-exprimierenden Vektoren, in Serumhaltigem Medium

Anmerkung: Mehrfach-Anstieg und Expressionsvektoren sind im Zusammenhang mit Tabelle 2 beschrieben.

Beispiel 3
Proteinproduktion in verlängerten Übergangstransfektionsassays
Zur Herstellung größerer Proteinmengen wurden die Transaktivierungsproteine in oriP-Plasmid bei um bis zu 10 Tagen verlängerter Züchtungszeit post Transfektion getestet. In diesem Versuch wurde ein Grund-Expressionsvektor von IL-2SA (pSL160N), der IL-2SA-Expressionsvektor, ergänzt mit TAT/TAR-Transaktivierungselementen (pSC221), der IL-2SA-Expressionsvektor mit oriP-Element allein (pSS225) und der IL-2SA-Expressionselement mit sowohl TAT/TAR-Transaktivierungselementen als auch mit oriP-Element (pSS185) herangezogen. Siehe 1 bezüglich der körperlichen Plandarstellungen der Plasmidstruktur. An Serum-freie Suspensionsbedingung adaptierte HKB11-Zellen wurde mit den bereits beschriebenen Schütteltransfektionsverfahren transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden in Serum-freiem Medium unter zweimaliger Aufspaltung auf das 4- bis 5-Fache bei 3 dpt und 7 dpt über eine Zeitdauer von 10 Tagen post Transfektion sub-gezüchtet. Das gesamte transfizierte Kulturvolumen wurde um das 20- bis 25-Fache gesteigert.
Es wurde beobachtet, dass sich der oriP-Effekt und die TAT/TAR-Transaktivierungseffekte (Tabelle 4) geringfügig von den in Tabelle 3 angegebenen Daten unterschieden, was sich durch die unterschiedlichen Plasmidzustände der linearen Form der oriP-Plasmid-DNA (z.B. des linearisierten pSS179 und pSS185) und durch die Plasmidstruktur ohne oriP-Element (z.B. des pSL160N und pSS221) erklären ließe. Beispielsweise wurde bei einem Basislinien-Expressionsvektor vom linearen pSS179 angenommen, dass er das gleiche Ergebnis mit pSL160N zeigt, und beim linearen pSS185 wurde angenommen, das gleiche Plasmid wie pSC221 zu sein, wegen der unterbrochenen oriP-Funktion durch Linearisierung der Plasmidstruktur.
Allerdings war der kombinierte Effekte der TAT/TAR- und oriP-Funktion ähnlich. Während dieser verlängerten Züchtungszeit wurde, wie in Tabelle 9 angegeben, der Anstieg der Proteinexpression (die IL-2SA-Titer) ohne drastisches Absinken der Expressionsniveaus beibehalten. Die Gesamtausbeute der IL-2SA-Produktion aus pSS185 (IL-2SA exprimierender Vektor mit TAT/TAR- und oriP-Elementen) bei der verlängerten Übergangstransfektionszeit (von 10 Tagen) ergab eine extrem hohe Proteinausbeute (460,8 μg) aus 5 μg transfizierter DNA mit 5 × 10⁶ Zellzahlen am Beginn, während der nicht-optimierte Expressionsvektor (pSL160N) in einer 3-Tage-Kultur mit den gleichen Mengen von DNA und Zellen als Ernte lediglich 28,8 μg des Proteins bei 10 dpt und 1,4 μg Protein bei 3 dpt mit einem Standard-Expressionsvektor ergab.
Mit diesem System wurde gezeigt, dass es leicht zur effizienten Produktion von Proteinen hochgefahren wurde, z.B. als 50 × 10⁶ HKB11-Zellen (50 mL-Kultur) mit 50 μg pSS185 transfiziert wurden, konnten ca. 5 mg Protein nach 10 Tagen post Transfektion mit einem Endkulturvolumen von 1 Liter erhalten werden. Mit dieser Erfahrung wurde festgestellt, dass dieser Effekt proportional ist, und dass die Proteinproduktion aus 500 μg DNA im Schüttelkolben um das ca. 100-Fache höher lag als das, was in einer Standard-Transfektion mit 5 μg DNA im 6-Lochvertiefungsformat gefunden wurde. Dieses Ergebnis der höheren Transfektion zeigt an, dass Kosten bei der DNA-Zubereitung und bei den Transfektionsreagenzien mit diesem verlängerten Hochfahr-Transfektionssystem im Vergleich zu einem Standard-Transfektionssystem gespart werden können, worin um das 20- bis 25-Fache höhere Anfangsmaterialien (DNA, Transfektionsreagens und Zellen) verwendet werden.
Wie in 4 und 5 dargestellt, konnte der BMLF1-Transaktivator nicht in einem verlängerten Transfektionssystem verwendet werden, weil die IL-2SA-Titer und die Zellzahl drastisch nach 3 dpt absanken und das BMLF1-Protein, letztlich, gegenüber den BMLF1-exprimierenden Zellen im verlängerten Übergangstransfektionsmodus toxisch sein könnte. Tabelle 4: Vergleich der IL-2SA-Produktion in einem verlängerten und hochgefahrenen Übergangstransfektionssystem mit verschiedenen Expressionsvektoren unter Serum-freier Bedingung

Anmerkung: Die Gesamtausbeuten zeigen eine Multiplikation der IL-2SA-Titer (μg/mL), bezogen auf das Volumen (mL), an.
pSS160N: IL-2SA-Kodiersequenz in einem dhfr-Vektor
pSS221: IL-2SA-Kodiersequenz in einem TAT/TAR-Vektor
pSS225: IL-2SA-Kodiersequenz in einem oriP-Vektor
pSSl85: IL-2SA-Kodiersequenz in einem TAT/TAR-oriP-Vektor

Die Zellen wurden auf 1:4 bei 3 dpt und auf 1:5 bei 7 dpt aufgespalten.
Beispiel 4
Proteinexpression unter einer Arznei-Selektion
Die IL-2SA-Expression aus den oriP-Vektoren pSS178 und pSS179 (siehe 1 bezüglich der körperlichen Plandarstellungen der Plasmide) wurden getestet und mit der IL-2SA-Expression aus dem TAT/TAR-oriP-Vektor pSS185 unter einer Arznei-Selektion verglichen, um Arznei-resistente Zellen zur höheren Proteinproduktion über noch längere Zeiträume zu erhalten. In einem Schüttelkolben unter Serum-freier Bedingung wachsende HKB11-Zellen wurden mit den 3 Expressionsvektoren im 6-Lochvertiefungsformat transfiziert. 3 Tage post Transfektion wurden die transfizierten Zellen in einen Schüttelkolben mit 2 × 10⁶ Zellen in 20 mL Serum (5 %ig), enthaltend Medium, ergänzt mit 100 μg/mL Hygromycin B (HygB), inokuliert. Die Zellen wurden 2-mal pro Woche in den gleichen Selektionsmedien sub-gezüchtet. Die Zellen wurden zentrifugiert und im gleichen Volumen frischen Medium in den ersten 3 Durchläufen resuspendiert. Nach dieser anfänglichen Selektionsphase wurde Zellkultur unter Beibehaltung einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/mL sub-gezüchtet. Die Titer der IL-2SA-Produktion aus jedem Durchlauf wurden mit einem ELISA gemessen. 4 Wochen post Produktion wurde die IL-2SA-Produktivität aus pSS185 bei einem höheren Titer als demjenigen aus pSS178 und pSS179 um mehr als das 10-Fache beibehalten (6). Diese Ergebnisse zeigen an, dass TAT/TAR-Transaktivierungselemente mit oriP-Elementen gemeinsam (pSS185) unter dem Arznei-Selektionssystem eine viel höhere Produktivität im Vergleich mit der IL-2SA-Produktivität aus den oriP-Vektoren pSS178 und pSS179 zeigen.
Beispiel 5
TAT/TAR-oriP-System zur Hochdurchsatz-Transfektion
Obwohl der TAT/TAR-oriP-Expressionsvektor eine unerwartet hohe Proteinexpression zeigte und ergab, ist der Vektor zu groß, um in einer Hochdurchsatz-Klonierung verwendet zu werden. Daher wurde der Expressionsvektor in 2 funktionale Gruppen aufgeteilt. Der Haupt-Kloniervektor (5,9 kb) besteht aus CMVe/p, TAR, MIS, einer Klonierstelle (PvuII) und aus einem polyA-Signal in dem oriP-Vektor pSS223. Das TAT exprimierende oriP-Vektor(8,7 kb)-pSC186-Plasmid war cotransfiziertes Plasmid. In Übergangstransfektionsassays zur Hochdurchsatz-Siebung wurden 5 μg pSS223 mit dem Gen von Interesse und mit 1 μg TAT exprimierendem oriP-Plasmid pSS186 transfiziert. Wie in 7 dargestellt, wurden die IL-2SA- und IL-4-Kodiersequenzen in die PvuII-Klonierstelle des pSS223 eingereiht. Die entstandenen Plasmide sind pSS240 bzw. pSS241. HKB11-Zellen wurden mit 5 μg pSS240 oder pSS241 und mit 1 μg pSC186 in einem Schüttel-Transfektionsmodus unter Serum-freier Bedingung cotransfiziert. Es wurde ein ähnliches Ergebnis des 3- bis 5-fachen Anstiegs in den Cotransfektionsassays (Tabelle 5) wie in TAT/TAR-oriP-Vektor (pSS185) gegenüber oriP-Vektor (pSS225) (Tabelle 4) beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass das Cotransfektionsverfahren der 2 funktional separierten Plasmide gleichwertig mit der Transfektion des Einzelexpressionsvektors ist, der sowohl aus TAT/TAR- als auch aus oriP-Elementen besteht. Tabelle 5: Vergleich der Proteinproduktion (in μg/mL) aus TAR-oriP-Vektor mit derjenigen aus der Cotransfektion mit TAT-oriP-Vektor

Anmerkung: Der Mehrfach-Anstieg wurde aus den Cotransfektionswerten über die Werte der Einzeltransfektion berechnet.

Diskussion
Durch Säugetierzellen exprimierte heterologe Proteine weisen bessere oder erwünschtere Qualitäten zur Charakterisierung der Proteine als Proteine auf, die aus Nicht-Säugetierzellen exprimiert werden, und somit sind Säugetierzellen bevorzugt. Allerdings ist die Menge der mit Säugetierzellen hergestellten Proteine gewöhnlich kleiner als mit anderen Systemen. Zur Kompensation der obigen Probleme wurde ein Übergangstransfektionssystem optimiert, um eine "Schnellspur"-Proteinproduktion zu erstellen. Die ermittelten Ergebnisse beruhen auf vielen Faktoren, und zwar wie folgt: Optimierter HKB11-Zellwirt, der an eine Serum-freie Suspensionsbedingung adaptiert war:

1. Schüttel-Transfektionsverfahren in Serum-freiem Medium: In diesem Verfahren konnte eine größere Anfangszelldichte unter optimalen Wachstumsbedingungen angewandt werden, mit denen anschließend mehr Protein erzeugt werden kann. In stationären Transfektionen konnten mehr als 1,5 × 10⁶ Zellen pro Lochvertiefung nicht zur Transfektion eingesetzt werden, und zwar wegen der nicht-optimalen Wachstumsbedingung von Zellen, die als Monoschicht wachsen. Verwendung von Monoschicht-Zellen (z.B. von CHO-Zellen) zur:
2. Transfektion, wobei die Schüttelbedingungen für die transfizierte Kultur mehr Protein-Sekretion (2- bis 3-fach mehr) gegenüber Nicht-Schüttelbedingungen ergaben, und zwar aus nicht ganz klaren Gründen.
3. Optimierte Expressionsvektoren unter Verwendung des oriP-Elements, welche gleichzeitig transferiertes Plasmid als Episome und Transfektionselemente in Stand zu halten vermögen, die die Proteinexpression verstärken und verbessern.
4. Der entscheidendste Teil und das unerwartete Ergebnis des vorliegenden verbesserten Transfektionssystems waren die Kombination des oriP-Elements mit den TAT/TAR-Transaktivierungselementen zur Proteinexpression, wobei eine solche Kombination in einem Einzelvektor oder in einem Transfektionssystem bisher nicht im Stand der Technik vorgeschlagen worden ist.

Der Versuch mit den CHO-Zellen wurde nach dem Erhalt der ineffektiven Daten im TAT/TAR-oriP-Transaktivierungssystem und aufgrund der folgenden veröffentlichten Information nicht intensiv weiter verfolgt. Ein oriP-Plasmid repliziert in Nagetierzellen nicht effizient (Yates et al., Nature 313: 812-815, 1985, und Mizuguchi et al., FEBS lett 472: 173-178, 2000), und CHO-Zellen fehlen die zellulären Faktoren für ein TAT/TAR- Transaktivierungssystem (Alonso et al., J. Virol 66: 4617-4621, 1992, und Wimmer et al., Virology 255: 182-189, 1999).
Im Lichte der obigen Offenbarung sind Variationen denkbar, die sich dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet des Standes der Technik ohne Weiteres und unmittelbar erschließen. Demzufolge sollen die obigen Beispiele lediglich als Erläuterung gelten, und der Umfang der hierin offenbarten Erfindungen soll nur auf der Grundlage der nun folgenden Ansprüche eingeschränkt sein.

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein Plasmid, wobei das Plasmid umfasst: (a) ein oriP-Element und Nukleinsäure einkodierendes EBNA1, (b) CMV-Promotor/Verstärker, (c) Nukleinsäure einkodierendes TAT und TAR; sowie (d) ein heterologes Protein einkodierende DNA.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, ferner umfassend Nukleinsäure einkodierendes BMLF1.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, ferner umfassend BMLF1-Protein.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das heterologe Protein aus der IL-4 und IL-2SA bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Säugetierzelllinie, transformiert mit der Zusammensetzung des Anspruchs 1.
Zusammensetzung, umfassend ein erstes Plasmid und ein zweites Plasmid, worin das erste Plasmid ein oriP-Element, Nukleinsäure einkodierendes EBNA1 und Nukleinsäure einkodierendes TAT und das zweite Plasmid ein oriP-Element, Nukleinsäure einkodierendes TAR und einen CMV-Promotor/Verstärker umfassen, der operabel an DNA gebunden ist, die ein heterologes Protein einkodiert.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, worin das erste Plasmid ferner Nukleinsäure einkodierendes BMLF1 umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, worin die Zusammensetzung ferner BMLF1-Protein umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, worin das heterologe Protein aus der aus IL-9 und IS-2SA bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Säugetierzelllinie, transformiert mit der Zusammensetzung des Anspruchs 6.
Verfahren zur Erzeugung eines heterologen Proteins aus einer Säugetier-Wirtszelle, umfassend die Stufen: (a) Transformierung der Säugetier-Wirtszelle mit der Zusammensetzung des Anspruchs 1; (b) Expandierung der Wirtszelle aus Stufe (a) in Kultur; und (c) Isolierung des heterologen Proteins aus der Kultur der Stufe (b).
Verfahren zur Erzeugung eines heterologen Proteins aus einer Säugetier-Wirtszelle, umfassend die Stufen: (a) Transformierung der Säugetier-Wirtszelle mit der Zusammensetzung des Anspruchs 6; (b) Expandierung der Wirtszelle aus Stufe (a) in Kultur; und (c) Isolierung des heterologen Proteins aus der Kultur der Stufe (b).