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Die
Erfindung betrifft Retrovirusvektoren. Genauer gesagt betrifft die
Erfindung Retrovirusvektoren, die eine verbesserte Genexpression
in nicht-humanen, embryonalen Zellen und in nicht-humanen embryonalen Stammzellen
bereitstellen.
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Hintergrund der Erfindung
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Auf
das Moloney Mausleukämievirus
basierende Retrovirusvektoren wurden in einer großen Anzahl an
Zellen zur Gentherapie eingeführt,
jedoch wurde beobachtet, dass die LTR des Moloney Mausleukämievirus
inaktiv ist und de novo methyliert wird, wenn sie in embryonale
Carcinomzelllinien (EC), embryonale Stammzellen (ES) und hämatopoetische
Stammzellen transduziert wird. (Linney et al., Nature, Band 308,
Seiten 470-472 (1984), Tsukiyama et al., (Mol. Cell. Biol., Band
9, Seiten 4670-4676 (1989)). Die Inaktivität des Enhancers wird durch
die Wechselwirkung mit den negativ wirkenden zellulären Faktoren
(Niwa et al., Cell, Band. 32, Seiten 1105-1113 (1983), Gorman et
al., Cell, Band 42, Seiten 519-526 (1985), Weiher et al, J. Virol., Band
61, Seiten 2742-2746 (1987), Akgun et al., J. Virol. Band 65, Seiten
382-388 (1991), Tsukiyama et al., Mol. Cell. Biol. Band 12, Seiten
1286-1291 (1992)). Es wurde ein LTR aus dem myeloproliferativen
Sarcomavirus (MPSV) isoliert Grez et al., (PNAS, Band 87, Seiten
9202-9206) berichten von einem retroviralen Vektor, der embryonaler
Mausstammzellvirus (MESV) genannt wird, welches in embryonalen Carzinomzellen
und ES Zellen aktiv ist. Es wurde ein LTR aus dem myeloproliferativen
Sarcomvirus (MPSV) isoliert. (Chirgos et al., Int. J. Cancer, Band
3, Seiten 223-237 (1968) und es wurde gezeigt, dass sie stärker exprimiert
wird als die LTR des Moloney Mausleukämievirus in embryonalen Carzinomzellen
(Seliger et al., Mol. Cell. Biol., Band 6, Seiten 286-293 (1986),
Hillery et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 84, Seiten 5232-5236
(1987), Weiher et al., 1987, Grez et al., J. Virol., Band 65, Seiten
4691-4698 (1991)) und in hämatopoetischen
Zellen. (Ostertag et al., J. Virol., Band 33, Seiten 573-582 (1980)),
Stocking et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 82, Seiten 5746-5750,
Stocking et al., Virology, Band 153, Seiten 145-149 (1986), Bowtell
et al., Mol. Biol. Med. Band 4, Seiten 229-250 (1987)). Der fundamentale
Unterschied zwischen dem Moloney Mausleukämievirus und den Enhancerwiederholungen
des myeloproliferativen Sacomavirus ist das Vorkommen einer Konsensusstelle
für die
Bindung des Transkriptionsfaktors Sp1 in MPSV. (Price et al., J.
Virol., Band 65, Seiten 1803-1811
(1991)). Von Sp1 Stellen wurde gezeigt, dass sie unabhängig von
einer Methylierung funktionieren und daher die MPSV LTR gegenüber einer
Transkriptionsinaktivierung resistenter als die LTR des Moloney
Mausleukämievirus
machen.
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Es
wurden auch andere negativ wirkende cis-Elemente in den Moloney
Mausleukämievirussequenzen charakterisiert.
Ein solches Element, das am 5' Ende
der LTR liegt, ist eine konservierte Sequenz in mehr als 90% der
Säugerretroviren
vom Typ C und wird als Negativkontrollregion oder ncr bezeichnet.
(Flanagan, et al., Virol. Cell. Biol. Band 9, Seiten 739-746 (1989)).
Von der ncr Sequenz wurde gezeigt, dass sie an einen Kernfaktor
bindet, wobei eine Transkriptionsrepression vermittelt wird. (Flanagan
et al., Virol. Cell. Biol., Band 12, Seiten 38-44 (1992)).
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Ein
weiteres hemmendes Element liegt an der Primerbindungsstelle (PBS)
der Leaderregion des Moloney Mausleukämievirus. (Weiher et al., 1987,
Feuer et al., J. Virol., Band 63, Seiten 2317-2324 (1989). Loh et
al., Mol. Cell. Biol., Band 7, Seiten 3775-3784 (1987), Taketo et
al., J. Virol., Band 63, Seiten 4431-4433 (1989)). Die Sequenz aus
der PBS des Moloney Mausleukämievirus
wirkt bei der Bindung eines zellulären Faktors, der die RNA Transkription
hemmt (Loh et al., Mol. Cell. Biol., Band 10, Seiten 4045-4057 (1990),
Petersen, Mol. Cell. Biol., Band 11, Seiten 1214-1221 (1991), Kempler
et al., Virology, Band 183, Seiten 690-699 (1993)). Es wurde ein
endogenes Mausretrovirus, nämlich
dl587rev, aus Mausgenomsequenzen isoliert und dies enthält eine
neue PBS Sequenz, die Adenin an der Position +160 enthält (Colicelli
et al., J. Virol., Band 57, Seiten 37-45 (1987)). Der Einbau der
dl587rev PBS in Retroviren erlaubt eine erhöhte Expression in embryonalen
Carzinomzellen im Vergleich zur Wildtyp-PBS des Moloney Mausleukämievirus.
(Akgün
et al., J. Virol., Band 65, Seiten 382-388 (1991), Grey et al.,
J. Virol., Band 65, Seiten 4691-4698 (1991)).
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Zusätzlich wurde
eine ausgiebige de novo Methylierung von Cytosinresten in der proviralen
LTR des Moloney Mausleukämievirus
in embryonalen Stammzelllinien und in der embryonalen F9 Carcinomzelllinie
detektiert. (Stewart et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 79, Seiten
4098-4102 (1982), Niwa et al., (1983). Obwohl die kausale Rolle
der Methylierung bei der Vermittlung der Repression der Genexpression
immer noch unklar ist, wurde die Methylierung mit der Blockierung
der Transkription vieler unterschiedlicher Gene assoziiert. (Cedar,
Cell, Band 53, Seiten 3-4 (1988), Boyes et al., Cell, Band 64, Seiten
1123-1134 (1991)).
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Modifizierte
retrovirale Vektoren, die eine Expression in nicht-humanen embryonalen
Zellen erreichen, haben einen weiten Anwendungsbereich. Aufgrund
ihrer hohen Effizienz der Transduktion und Integration könnten aktive
Retrovirusvektoren sehr brauchbare Werkzeuge zum Transfer von Genen
in nicht-humane embryonale Stammzellen zur Erzeugung von transgenen
Mäusen,
nicht-humanen embryonalen Stammzellchimären und bei Zellmarkierungsstudien
während
einer nicht-humanen, embryonalen Entwicklung sein (Jaenisch, Science,
Band 240, Seiten 1468-1475 (1988), Cepko et al., Meth. Enzymol.,
Band 225, Seiten 933-960 (1993)). Retrovirale Expressionsvektoren,
die in nicht-humanen embryonalen Zellen exprimieren, zeigen auch eine
erhöhte
Expression in hämatopoetischen
Stammzellen und liefern daher brauchbare Werkzeuge zur Gentherapie über Knochenmarkzellen.
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Es
wurden Anstrengungen unternommen, um retrovirale Vektoren herzustellen,
die die inhärente
Inaktivität
der Transkriptionseinheit des Moloney Mausleukämievirus in embryonalen Zellen überwinden.
Ein Ansatz war, Vektoren mit einem internen Promotor herzustellen,
um eine Gentranskription in embryonalen Stammzellen zu vermitteln,
während
die retrovirale LTR nur zur Bildung eines viralen Volllängengenoms
in der Verpackungszelle verwendet wird (Bowtell et al., J. Virol.,
Band 62, Seiten 2464-2473 (1988), Guild et al., J. Virol. Band 62,
Seiten 3795-3801 (1988), Soriano et al., J. Virol., Band 65, Seiten
2315-2319 (1991)). Es besteht jedoch eine Evidenz, dass der Enhancer
und die Primerbindungsstelle des Moloney Mausleukämievirus sogar
negative Effekte auf heterologe Promotoren haben, die intern plaziert
werden (Gorman et al., Cell, Band 42, Seiten 519-526 (1985), Bowtell
et al., (1988)). Ein weiterer Ansatz umfasst den Einbau von verschiedenen Elementen,
die in embryonalen Stammzellen aktiv sind, um die Moloney Leukämievirussequenzen
zu ersetzen, wie den Enhancer der myeloproliferativen Sarcomavirusvariante
(Hilberg et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 84, Seiten 5232-5236
(1987)) oder eines mutierten Polyomavirus (Linney et al., Nature,
Band 308, Seiten 470-472 (1984)) oder der PBS von dl587rev (Weiher
et al., 1987, Grey et al., 1991). Diese Ansätze hatten beschränkten Erfolg.
Die Gründe
für den
beschränkten
Erfolg können
die Wechselwirkung von multiplen hemmenden Elementen in oder nahe
der LTR sein und so können
einzelne Modifikationen nicht ausreichend sein, um die Barriere
zur Transkriptionsaktivität
vollständig
zu überwinden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die
Erfindung wird nun in Bezug auf die Zeichnungen beschrieben.
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Die 1 ist
ein Schema der Konstruktionsstrategie von Plasmid pG1.
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Die 2 ist
die Sequenz der multiplen Klonierungsstelle im pG1 Plasmid.
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Die 3 ist
eine Karte von Plasmid pG1.
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Die 4 ist
eine Karte von Plasmid pN2..
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Die 5 ist
eine Karte von Plasmid pG1Na.
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Die 6 ist
eine Karte von Plasmid MP-neo.
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Die 7 ist
eine Karte von Plasmid MP-ncr-neo.
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Die 8 ist
eine Karte von Plasmid MP-Thy-neo.
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Die 9 ist
eine Karte von Plasmid pGEM11.
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Die 10 ist
eine Karte von Plasmid MP-dl-neo.
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Die 11 ist
eine Karte von Plasmid MP-ncr-dl-neo.
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Die 12 ist
eine Karte von Plasmid MP-Thy-dl-neo.
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Die 13 ist
ein Schema der Modifikationen, die in der LTR und den Leaderregionen
der Retrovirusvektoren eingeführt
werden.
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Die 14 ist
eine Karte von LN-ncr-neo.
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Die 15 ist
eine quantitative Southern Blot Analyse der Gentransfereffizienz
durch Retrovirusvektoren in NIH 3T3 Zellen und F9 Zellen.
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Die 16 ist
eine Northern Blot Analyse von stabil transduzierten NIH 3T3 und
F9 Zellen.
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Die 17A ist ein Schema der modifizierten Retrovirusvektoren,
die die Lage der Restriktionsenzymstellen und der Sonde zeigen,
die zur Methylierungsanalyse der Retrovirusvektoren in F9 Zellen
durch Southern Blot Analyse verwendet werden.
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Die 17B ist ein Southern Blot der genomischen
DNA aus stabil transduzierten F9 Zellen, die BamHI und entweder
EcoRV alleine oder EcoRV und SmaI verdaut wurde.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein retroviraler Plasmidvektor
bereitgestellt, der umfasst eine Enhancerregion, die vom myeloproliferativen
Sarcomvirus erhalten wurde und eine Primerbindungsstelle, die vom
Mausretrovirus dl587rev erhalten wurde. Der retrovirale Plasmidvektor
umfasst keine Negativkontrollregion.
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In
einer Ausführungsform
umfasst der Retrovirusplasmidvektor ferner eine Nukleinsäuresequenz,
die Cytosinreste in der proviralen LTR demethyliert. In einer Ausführungsform
wird die Nukleinsäuresequenz
aus der 5'-stromaufwärts liegenden
Region des Thy-1 Gens der Maus erhalten.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein retroviraler
Plasmidvektor bereitgestellt, der umfasst eine Enhancerregion, die
vom myeloproliferativen Sarcomavirus erhalten wurde, eine Primerbindungsstelle,
die vom Mausretrovirus dl587rev erhalten wurde und eine Nukleinsäuresequenz,
die Cytosinreste in der proviralen LTR demethyliert.
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Der
retrovirale Plasmidvektor leitet sich vom Moloney Mausleukämievirus
ab.
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Daher
wird in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein retroviraler
Plasmidvektor bereitgestellt, der vom Moloney Mausleukämievirus
stammt, worin die Enhancerregion der LTR des Moloney Mausleukämievirus
entfernt und durch eine Enhancerregion des myeloproliferativen Sarcomavirus
ersetzt wurde. Ebenfalls wird die Primerbindungsstelle des Moloney
Mausleukämievirus
entfernt und mit einer Primerbindungsstelle ersetzt, die von Mausretrovirus
dl587rev erhalten wurde. Die Negativkontrollregion des Moloney Mausleukämievirus
wird ebenfalls deletiert.
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Die
Primerbindungsstelle des Moloney Mausleukämievirus wird als die Sequenz
von der Base 146 bis zur Base 163 des Moloney Mausleukämievirus
definiert.
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In
einer Ausführungsform
umfasst der retrovirale Plasmidvektor ferner eine Nukleinsäuresequenz,
die Cytosinreste in der proviralen LTR demethyliert. Eine solche
Nukleinsäuresequenz
kann aus der 5'-stromaufwärts liegenden
Region des Thy-1 Gens der Maus erhalten werden, wie dies hierin
vorher beschrieben wurde.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein retroviraler
Plasmidvektor bereitgestellt, der vom Moloney Mausleukämievirus
erhalten wurde, worin die Enhancerregion der LTR des Moloney Mausleukämievirus
entfernt und durch eine Enhancerregion vom myeloprolifertaiven Sarcomavirus
ersetzt wurde und die Primerbindungsstelle des Moloney Mausleukämievirus
entfernt und durch eine Primerbindungstelle ersetzt wurde, die vom
Mausretrovirus dl587rev erhalten wurde. Der Vektor umfasst auch
eine Nukleinsäure,
die die Cytosinreste in der proviralen LTR demethyliert.
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In
einer Ausführungsform
können
die vom Moloney Mausleukämievirus
abgeleiteten retroviralen Plasmidvektoren von der LN Reihe der Vektoren
abgeleitet werden, wie dies in Bender et al., J. Virol., Band 61, Seiten
1639-1649 (1987) und Miller et al., Biotechniques, Band 7, Seiten
980-990 (1989) beschrieben ist. Solche Vektoren haben einen Teil
des Verpackungssignals, das vom Maussarcomavirus stammt und ein
mutiertes gag Initiationscodon. Der Ausdruck "mutiert" meint, wie er hierin verwendet wird,
dass das gag Initiationscodon so deletiert oder verändert wurde,
dass das gag Protein oder Fragmente oder Verkürzungen hiervon nicht exprimiert
werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann der Retrovirusvektor zumindest vier Klonierungs- oder Restriktionsenzymerkennungsschnittstellen
aufweisen, worin zumindest zwei der Schnittstellen eine mittlere Frequenz
in eukaryontischen Genen von einmal in 10 000 Basenpaaren aufweisen,
das heißt
das Restriktionsprodukt hat eine mittlere DA Größe von mindestens 10 000 Basenpaaren.
Bevorzugte Klonierungsstellen werden aus der Gruppe ausgewählt, die
besteht aus NotI, SnaBI, SalI und XhoI. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Retrovirusvektor jede dieser Klonierungsstellen. Solche
Vektoren sind ferner in der US Patentanmeldung 919 062 vom 23. Juli
1992 beschrieben, die hiermit in ihrer Gesamtheit eingeführt ist.
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Wenn
ein Retrovirusvektor, der solche Klonierungsschnittstellen enthält, verwendet
wird, kann auch ein Schaukelklonierungsvektor bereitgestellt werden,
der zumindest zwei Klonierungsschnittstellen umfasst, die mit zumindest
zwei Klonierungsschnittstellen kompatibel sind, die aus der Gruppe
ausgewählt
werden, welche besteht aus NotI, SnaBI, SalI und XhoI, die auf dem
retroviralen Vektor liegen. Der Schaukelklonierungsvektor umfasst
auch zumindest ein gewünschtes
Gen, das zur Überführung vom
Schaukelklonierungsvektor in den Retrovirusvektor fähig ist.
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Der
Schaukelklonierungsvektor kann aus einem "Rückgrad"-Grundvektor oder
einem Fragment hergestellt werden, woran einer oder mehrere Linker
ligiert werden, die Klonierungs- oder Restriktionsenzymschnittstellen
umfassen. In den Klonierungsstellen enthalten sind die kompatiblen
oder komlementären
Klonierungsstellen, die hierin oben beschrieben sind. Gene und/oder
Promotoren mit Enden, die den Restriktionsstellen des Schaukelvektors
entsprechen, können
in den Schaukelvektor durch in der Technik bekannte Verfahren ligiert
werden.
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Der
Schaukelklonierungsvektor kann zur Amplizierung von DNA Sequenzen
in prokaryontischen Systemen verwendet werden. Der Schaukelklonierungsvektor
kann aus Plasmiden hergestellt werden, die in prokaryontischen Systemen
und insbesondere in Bakterien verwendet werden. Daher kann der Schaukelklonierungsvektor
von Plasmiden abgeleitet werden, wie pBR322, pUC18 usw.
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Der
Vektor umfasst einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren,
die verwendet werden können,
umfassen unter anderem den retroviralen LTR, den SV40 Promotor und
den Promotor des humanen Cytomegalievirus (CMV), wie er in Miller
et al., Biotechniques, Band 7, Nr. 9, Seiten 980-990 (1989) beschrieben
ist oder jeden anderen Promotor (beispielsweise zelluläre Promotoren,
wie zelluläre
eukaryontische Promotoren, einschließlich unter anderem die Histon,
Pol III und β-Actin
Promotoren). Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen
unter anderem Adenoviruspromotoren, Thymindinkinase (TK) Promotoren
und B19 Parvovirus-Promotoren. Die Auswahl eines geeigneten Promotors
ist für
den Fachmann aus den hierin enthaltenen Beschreibungen naheliegend.
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Die
retroviralen Plasmidvektoren der vorliegenden Erfindung können ferner
zumindest eine Nukleinsäuresequenz
umfassen, die für
ein therapeutisches Mittel kodiert. Der Ausdruck "therapeutisch" wird in einem allgemeinen
Sinn verwendet und umfasst Behandlungsmittel, prophylaktische Mittel
und Ersatzmittel.
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Der
Ausdruck "Nukleinsäuresequenz" meint, wie er hierin
verwendet wird, ein DNA oder RNA Molekül und insbesondere eine lineare
Reihe von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, die miteinander
durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'- und 5'-Kohlenstoffen der benachbarten Pentosen
verbunden sind. In Abhängigkeit
der Verwendung hierin umfasst der Ausdruck vollständige und
partielle Gensequenzen und auch Polynukleotide.
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Nukleinsäuresequenzen,
die für
therapeutische Mittel kodieren, umfassen unter anderem Nukleinsäuresequenzen,
die für
Tumornekrosefaktorgene (TNF) kodieren, wie TNFα, Gene, die für Interterone
kodieren, wie Interteron-α,
Interferon-β und
Interferon-γ,
Gene, die für
Interleukine kodieren, wie IL-1,
IL-1β und
Interleukine 2 bis 15, Gene, die für G-CSF, M-CSF und GM-CSF kodieren,
Gene, die für
Adenosindesaminase oder ADA kodieren, das ZAP70 Kinasegen, Gene,
die für
zelluläre
Wachstumsfaktoren kodieren, wie Lymphokine, die Wachstumsfaktoren
für Lymphocyten
sind, das Glucocerebrosidasegen, Gene, die für den epidermalen Wachstumsfaktor
(EGF) und den Keratinocytenwachstumsfaktor (KGF) kodieren, Gene,
die für
lösliches
CD4 kodieren, das β-Globingen,
Faktor VIII, Faktor IX, T-Zellrezeptoren,
das α-Iduronidasegen,
den LDL Rezeptor, ApoE, ApoC, ApoAI und andere Gene, die beim Cholesterintransport
und Metabolismus beteiligt sind, das alpha-1 Antitrypsingen (α1AT), das
Ornithintranscarbamylasegen (OTC), das CFTR Gen, das Insulingen,
Suicidgene, wie beispielsweise virale Thymidinkinasegene, wie das
Thymidinkinasegen des Herpes Simplex Virus, das Thymidinkinasegen
des Cytomegalievirus und das Thymidinkinasegen des Varicella Zoster
Virus, Fc Rezeptoren für
Antigenbindungsdomänen
von Antikörpern,
Antisensesequenzen, die die virale Replikation hemmen, wie Anti sensesequenzen,
die die Replikation des Hepatitis B oder Hepatitis non-A non-B Virus
hemmen, Antisense c-myb Oligonukleotide, Multiarzneimittelresistenzgene,
wie das MDR-1 Gen und Antioxidationsmittel, wie unter anderem Mangansuperoxiddismutase
(Mn-SOD), Katalase, Kupfer-Zink-Superoxiddismutase (CuZn-SOD),
extrazelluläre
Superoxiddismutase (EC-SOD) und Glutathionreduktase und Selektionsmarker, wie
das Neomycinresistenzgen (neoR), das β-Galactosidasegen
(lacZ), das Chloramphenicoltransferasegen (CAT) und das NGF-R Gen.
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Die
Nukleinsäuresequenz,
die zumindest ein therapeutisches Mittel kodiert, befindet sich
unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren,
die verwendet werden können,
sind unter anderem Adenoviruspromotoren, wie der späte Hauptpromotor
des Adenovirus oder heterologe Promotoren, wie der Promotor des
Cytomegalievirus (CMV), der Promotor des Respiratory Syncytial Virus
(RSV), induzierbare Promotoren, wie der MMT Promotor, der Metallothioninpromotor,
Hitzeschockpromotoren, der Albuminpromotor, der ApoAI Promotor,
humane Globinpromotoren, virale Thymidinkinasepromotoren, wie der
Thymidinkinasepromotor des Herpes Simplex Virus, retrovirale LTRs
(einschließlich
der hierin oben beschriebenen modifizierten, retroviralen LTRs),
der β-Actinpromotor
und humane Wachstumshormonpromotoren. Der Promotor kann der native
Promotor sein, der das für
das therapeutische Mittel kodierende Gen kontrolliert. Es ist verständlich,
dass der Umfang der Erfindung jedoch nicht auf spezifische Fremdgene
oder Promotoren beschränkt
ist.
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Der
retrovirale Plasmidvektor wird verwendet, um die Verpackungszelllinien
unter Bildung von Produktionszelllinien zu transduzieren. Beispiele
für Verpackungszelllinien,
die transfiziert werden können,
umfassen unter anderem die Zelllinien PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12,
T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86,
GP+envAm12 und DAN, wie sie in Miller, Human Gene, Therapy, Band
1, Seiten 5-14 (1990) beschrieben sind, was hiermit in seiner Gesamtheit
eingeführt
ist. Der Vektor kann die Verpackungszellen durch alle in der Technik
bekannten Verfahren transduzieren. Solche Verfahren umfassen unter
anderem Elektroporation, die Verwendung von Liposomen, wie sie hierin
vorher beschrieben sind und CaPO4 Fällung. In
einer Alternative kann der retrovirale Plasmidvektor in ein Liposom
verkapselt werden oder an ein Lipid gekuppelt werden, wie dies hierin
vorher beschrieben ist, und dann einem Wirt verabreicht werden,
wie dies vorher beschrieben ist.
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Die
Produktionszelllinie erzeugt infektiöse Retroviruspartikel, die
die Nukleinsäuresequenzen
enthalten, die für
die therapeutischen Mittel kodieren. Solche Retroviruspartikel können dann
verwendet werden, um eukaryontische Zellen, die keine humanen embryonalen
Zellen sind, entweder in vitro oder in vivo zu transduzieren. Die
transduzierten eukaryontischen Zellen, die keine humanen embryonalen
Zellen sind, exprimieren die Nukleinsäuresequenzen, die für das therapeutische
Mittel kodieren. Eukaryontische Zellen, die keine humanen embryonalen
Zellen sind, welche transduziert werden können, sind unter anderem nicht-humane
embryonale Stammzellen, nicht-humane embryonale Carzinomzellen,
wie auch hämatopoetische
Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten,
Endothelzellen und bronchiale Epithelzellen.
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Wenn
solche retroviralen Vektorpartikel verwendet werden, um eukaryontische
Zellen, die keine humanen embryonalen Zellen sind, in vitro zu transduzieren,
können
die Retrovirusvektorpartikel die eukaryontischen Zellen mit einer
Infektionsmultiplizität
(mol) von etwa 0,001 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10
transduzieren. Die transduzierten eukaryontischen Zellen, die keine
humanen embryonalen Zellen sind, können dann einem Wirt als Teil
eines Gentherapieverfahrens verabreicht werden. Solche Zellen können einem
Wirt, der ein Säugerwirt,
ein nicht-humaner Primatenwirt oder ein humaner Wirt ist, in einer
Menge von etwa 1 × 102 bis etwa 1 × 1011 Zellen,
vorzugsweise etwa 5 × 104 bis etwa 5 × 108 Zellen,
bevorzugter etwa 5 × 106 bis etwa 5 × 108 Zellen
verabreicht werden. Die exakte Dosis der eukaryontischen Zellen
hängt von
einer Vielzahl an Faktoren ab, einschließlich dem Alter, dem Gewicht,
dem Geschlecht und dem Typ der zu transduzierenden Zellen und der
zu behandelnden Erkrankung oder Störung.
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Bei
einer Verabreichung in vivo werden die retroviralen Vektorpartikel
einem Wirt in einer Menge verabreicht, die zur Bildung eines therapeutischen
Effekts bei einem Wirt wirksam ist. Im allgemeinen werden die Retroviruspartikel
in einer Menge von 1 bis etwa 10 Partikel pro Zelle verabreicht.
Die exakte Dosis an Partikeln, die verabreicht wird, hängt von
den hierin vorher beschriebenen Faktoren ab.
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Die
Retrovirusvektoren der vorliegenden Erfindung sind insbesondere
bei der Transduktion von nicht-humanen Embryonalzellen, und insbesondere
nicht-humanen embryonalen Stammzellen anwendbar. Beispielsweise
können
die retroviralen Vektoren zum Transfer von Genen in nicht-humane
embryonale Stammzellen zur Erzeugung von nicht-humanen transgenen
Tieren, nicht-humanen embryonalen Stammzellchimären verwendet werden oder können bei
Zellmarkierungsstudien während
einer nicht-humanen
embryonalen Entwicklung verwendet werden. Zusätzlich zeigen auch retrovirale
Vektoren, die in nicht-humanen embryonalen Zellen exprimieren, eine
erhöhte
Expression in hämatopoetischen
Stammzellen (anderen als denen des humanen Embryos) und daher können solche
Retrovirusvektoren zur Gentherapie über Knochenmarkzellen (anderen
als die des humanen Embryos) brauchbar sein.
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Die
Retrovirusvektoren der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung einer Vielzahl
von Erkrankungen und Störungen
verwendet werden. Solche Erkrankungen und Störungen umfassen unter anderem
genetische Erkrankungen, wie Hämoglobinopathien,
lysosomale Lagerungserkrankungen, metabolische Störungen,
Immundefizienzen, Leukämiekrebs
und AIDS.
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Zusätzlich können die
retroviralen Vektorpartikel in Tiermodellen verwendet werden, um
die Wirksamkeit einer Gentherapiebehandlung zu bestimmen. Bei einem
solchen Tiermodell werden die retroviralen Vektorpartikel, einschließlich eines
Gens, das für
ein therapeutisches Mittel kodiert, oder eukaryontische Zellen (andere
als die des humanen Embryos), welche in vitro mit solchen retroviralen
Vektorpartikeln transduziert wurden, einem Tier verabreicht. Anschließend an
eine solche Verabreichung wird das Tier auf die Expression des für das therapeutische
Mittel im Tier kodierenden Gens getestet. Für einen solchen Test kann man
die Menge an retroviralen Partikeln oder mit solchen Retroviruspartikeln
transduzierten eukaryontischen Zellen bestimmen, die einem humanen
Patienten verabreicht wird.
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Ebenfalls
können
die retroviralen Vektorpartikel verwendet werden, um eukaryontische
Zellen (andere als die vom humanen Embryo), wie die oben beschriebenen,
in vitro zur in vitro Produktion des therapeutischen Mittels zu
transduzieren, das aus der Kultur der transduzierten eukaryontischen
Zellen durch dem Fachmann bekannte Verfahren erhalten werden kann.
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Beispiele
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Die
Erfindung wird nun in Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben,
wobei der Umfang der Erfindung hierdurch nicht beschränkt werden
soll.
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Beispiel 1
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Konstruktion von Vektoren
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A. Konstruktion von pG1Na
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Das
Plasmid pG1 wird aus pLNSX (Palmer et al., Blood, Band 73, Seiten
438-445) konstruiert und hiermit eingeführt. Die Konstruktionsstrategie
für das
Plasmid pG1 ist in 1 gezeigt. Das 1,6 kb EcoRI
Fragment, das die 5' LTR
des Moloney Maussarcomavirus (MoMuSV) und das 3,0 kb EcoRI/ClaI
Fragment, das die 3' LTR,
den bakteriellen Replikationsursprung und das Ampicillinresistenzgen
enthält,
werden getrennt isoliert. Es wird dann ein Linker, der 7 Einzelschnittstellen
enthält,
verwendet, um das EcoRI/ClaI Fragment mit sich selbst zu schließen, wobei
das Plasmid pGO erzeugt wird. Das Plasmid pGO wird zur Erzeugung
des Vektorplasmids pG1 (3) durch die Insertion des 1,6
kb EcoRI Fragments verwendet, das die 5' LTR in der EcoRI Einzelschnittstelle
von pGO enthält.
Daher besteht pG1 (3) aus einem retroviralen Vektorrückgrad,
das sich zusammensetzt aus einem 5' Teil, der von Mo-MuSV abgeleitet ist, einem kurzen Teil
von gag, worin das authentische ATG Startcodon zu TAG mutiert wurde
(Bender et al., 1987), einer 54 Basenpaare langen multiplen Klonierungsstelle
(MCS), die 5' nach
3' die Schnittstellen
EcoRI, NotI, SnaBI, SalI, BamHI, XhoI, HindII, ApaI und ClaI und
einen 3' Teil von
MoMuLV von den Basenpaaren 7764 bis 7813 enthält (nummeriert wie dies beschrieben
ist in (Van Beveren, et al., Cold Spring Harbor, Band 2, Seiten
567, 1985) und hiermit eingeführt ist
(2)). Die MCS wird so entworfen, um eine maximale
Anzahl an Einzelschnittstellen zu erzeugen, wobei dies auf einem
Screening von nicht-schneidenden Restriktionsenzymen im pG1 Plasmid,
dem neoR Gen, dem β-Galactosidasegen, dem HygromycinR Gen und dem SV40 Promotor basiert.
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Der "Rückgrad"-Vektor pG1Na wird aus pG1 und pN2 konstruiert
(Armentano et al., J. Virology, Band 61, Seiten 1647-1650 (1987)).
pG1Na wird durch Schneiden von pN2 (4) mit EcoRI
und AsuII, Auffüllen der
Enden des EcoRI/AsuII Fragments, das das neoR Gen
enthält,
und der Ligation des Fragments in das mit SnaBI verdaute pG1 unter
Bildung von pG1Na (5) konstruiert.
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B. Konstruktion von MPneo,
MPncrneo, MPdlneo, LNncrneo, MPthyneo, MPthydlneo und MPncrdlneo
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Die
LTR des myeloproliferativen Sarcomvirus (MPSV) (bereitgestellt von
W. Ostertag, Heinrich-Pette Institut,
Hamburg, Germany) wird verwendet, um die 3' LTR des Moloney Mausleukämievirus
von pG1Na unter Bildung von MPneo auszutauschen. pG1Na wird an der
ClaI Schnittstelle (bp 2366) und der AccI Schnittstelle (bp 3248)
unter Freisetzung der 3' LTR
des Moloney Mausleukämievirus
geschnitten. Die 3' LTR
von MPSV wird in die ClaI-AccI Schnittstelle von pG1Na unter Bildung
von MP-neo kloniert (6). Die Negativkontrollregion
(ncr) wird von der MPSV LTR als NheI (bei Nukleotid 33 in der LTR)
bis Sau3a (bei Nukleotid 97 in der LTR) Fragment entfernt. Die Schnittenden
der LTR werden nach dem Auffüllen
der Enden durch Klenow DNA Polymerase unter Bildung der MPncr 3' LTR zusammenligiert,
die dann in die ClaI/AccI Schnittstelle von pG1Na unter Bildung
von MPcrneo (7) kloniert wird. Das Thy-1
Fragment im Plasmid Bluescript (Stragene) (bereitgestellt von M.
Szyf, McGill University, Montreal, Canada) wird dann an der SmaI
Schnittstelle unmittelbar 3' des
Inserts geöffnet
und eine synthetische XbaI Schnittstelle 5'-CTCTAGA-3' (New England Biolabs, Beverley, Massachusetts)
wird an diese Stelle ligiert. Das Thy-1 Fragment wird dann als XbaI/XbaI
Fragment isoliert und in die NheI Schnittstelle der MPSV LTR in
Bluescript kloniert. Die Thy-1 substituierte MPSV LTR (MPthy) wird
in die ClaI/AccI Schnittstelle von pG1Na unter Bildung von MPthyneo
(8) ligiert.
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pG1Na
wird mit EcoRI geschnitten, das bei 1460 bp und 5375 bp schneidet,
um ein Fragment zu erhalten, das die 5' LTR, die pbs und die Leaderregion (Psi)
enthält.
Dieses Fragment wird in pGEM11 (Promega) subkloniert (9).
Die pbs wird aus diesem von pG1-Na stammenden Fragment als KpnI/SpeI
Fragment entfernt und mit dem KpnI/SpeI pbs Fragment von dl587rev
ersetzt. Die 5' LTR
und die Leaderregion (Psi) werden dann aus Mp-neo mit dem Enzym
EcoRI entfernt und mit dem EcoRI/EcoRI Fragment der 5' LTR Leaderregion ersetzt,
die das KpnI-SpeI Fragment von dl587 rev enthält. Dies liefert das Plasmid
MP-dl-neo (10). Dasselbe EcoRI/EcoRI Fragment
mit der 5' LTR,
dl587 rev pbs und der Leaderregion wird in die EcoRI/EcoRI Schnittstellen
von MP-ncr-neo und Mp-Thy-neo unter Bildung von jeweils MP-ncr-dl-neo
(11) und MP-Thy-neo (12) eingesetzt.
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Zur
Herstellung von LNncrneo wird die ncr Region (NheI an der Position
33 bis Sau3a an der Position 97, 13) von
der 3' LTR von pG1Na
deletiert. Genauer gesagt wird ein Teil der 3' LTR von pG1Na in Bluescript als ClaI/SstI
Fragment subkloniert. Dann wird eine PCR mittels Primern ausgeführt, die
mit der Sau3a Schnittstelle (bp 97), 5'-GACCGCTAGCAGATCTAGGTCAGG-3' (Sense) und der
SstI Schnittstelle (bp 413), 5'-CTGGAGCTCGGGGAGCAGA-3' (Antisense) überlappt.
Die Sequenz des Senseprimers umfasst einen 5' Überhang,
der die Erkennungsschnittstelle für NheI (fettgedruckt in Primersequenz)
gefolgt von Sequenzen, die die Sau3a Schnittstelle überlappen,
in eine BglII Schnittstelle umwandelt (in Primersequenz unterstrichen). Das
320 bp PCR Produkt, dem die ncr Region fehlt, wird mit NheI und
SstI verdaut und zur Replizierung des 380 bp NheI bis SstI Fragments
der 3' LTR verwendet,
wobei die ncr entfernt wird und eine neue BglII Schittstelle angeführt wird.
Das ClaI/SbaI Fragment, das die ncr Deletion in Bluescript enthält, wird
für den
Ersatz des ClaI/SbaI Teils der 3' LTR
im Plasmid pG1Na unter Bildung von LNncrneo (14) verwendet.
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C. Transduktion des Plasmidvektors
in Zelllinien
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Die
Plasmidvektoren MPneo, MPdlneo, MPncrdlneo, LNncrneo, MPthyneo und
MPthydlneo werden in die ekotrope Verpackungszellline GP+E-86 (erhalten
von A. Bank, Columbia University, New York) mittels Transfektionsreagenz
(DOTAP, Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) transfiziert
und die Selektion erfolgt in 0,5 mg/ml aktivem G418 (Geneticin,
GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Die GP+E-86 Zellen werden unter Selektionsdruck
in DMEM angezogen, das mit 10% Serum von neugeborenen Kälbern, Hypoxanthin
(15 μg/ml),
Xanthin (250 μg/ml)
(Markowitz et al., J. Virol., Band 62, Seiten 1120-1124 (1988))
supplementiert ist. Die Kulturüberstände werden
gewonnen und zur Transduktion der amphotrophen PA317 Verpackungszelllinie (ATCC
Nr. CRL 9078) verwendet. Die PA317 Zellen werden in DMEM angezogen,
worin 10% FCS enthalten sind. Die PA317 Zellen werden dann in G418
selektiert und die Zellklone werden isoliert. Die Überstände der Klone
werden dann durch serielle Verdünnung
auf NIH3T3 Fibroblasten (ATCC Nr. 6473) austitriert, die in DMEM
angezogen werden, das mit 10% Kälberserum
supplementiert ist. Klone mit hohem Titer stammen von den PA317
Pools von MPneo, MPdlneo und MPncrdlneo, während Pools mit hohem Titer
von MPthyneo, MPthydlneo und LNcrneo in der anschließenden Analyse
verwendet werden.
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Beispiel 2
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Die
viralen Überstände in DMEM,
worin 10% FCS enthalten sind, werden aus konfluenten 100 mm Gewebekulturschalen
von Vektor-bildenden PA317 Fibroblasten geerntet und durch 0,45 μm Filter
gegeben. Sie werden seriell zehnfach in einem Gesamtvolumen von
5 ml verdünnt.
Die Verdünnungen
sind folgendermaßen:
unverdünnt,
1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 und ohne Virus. 2 ml jeder Verdünnung werden
zur Überschichtung
von F9 Zellen und 3T3 Zellen verwendet, die 24 Stunden vorher mit
2,5 × 10
4 Zellen in Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen
plattiert wurden. Die Transduktion wird in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren
für 2 Stunden ausgeführt. Dann
werden die Zellen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
gewaschen und in ihren entsprechenden Medien kultiviert. 24 Stunden
später
wird G418 (Gibco-BRL) mit 0,5 μg/ml
zugegeben. Es wird eine Selektion für 12-14 Tage ausgeführt, bis
keine Zellen mehr in den nicht-transduzierten Vertiefungen sichtbar
sind und sich sichtbare Kolonien in den tranduzierten Vertiefungen
gebildet haben. Dann werden die Zellen in PBS gewaschen und mit
0,5% Kristallviolett in Methanol gefärbt. G418 resistente Kolonien
werden gezählt und
die Kolonie-bildenden Einheiten pro Milliliter (G418
R CFU/ml)
der viralen Suspension werden berechnet. Die relative Fähigkeit
der unterschiedlichen Vektoren zur Expression in F9 Zellen wird
durch Teilen des effektiven Titers (G418
R CFU/ml)
auf F9 Zellen durch den Titer (G418
R CFU/ml)
auf 3T3 Zellen quantifiziert und steht daher für die Unterschiede der Anzahl
an infektiösen
Viruspartikeln zwischen den Präparationen.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I gezeigt.
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Wie
in Tabelle I gezeigt, zeigt der auf den Moloney Mausleukämievirus
basierende Standardvektor LN eine begrenzte Aktivität auf embryonalen
F9 Carzinomzellen, die nur 1/120 (oder 0,0082) der Effizienz im
Vergleich mit NIH 3T3 Zellen beträgt. Das Vorkommen des Enhancers
des myeloproliferativen Sarcomavirus anstelle des Enhancers vom
Moloney Mausleukämievirus
führt zu
einer leichten Erhöhung
der relativen Anzahl an G418 resistenten CFU/ml, die auf F9 Zellen
gebildet werden (0,0352). Die Substitution der Primerbindungsstelle
des Moloney Mausleukämievirus
durch die Primerbindungsstelle von dl587rev erhöht den effektiven Titer auf
F9 Zellen nicht weiter (0,0245). Der Vektor, der den MPSV Enhancer
und eine Deletion der ncr Region zusätzlich zur dl587rev Primerbindungsstelle
enthält
(MPncrdlneo) ist dazu fähig,
eine G418 Resistenz gegenüber
F9 Zellen mit fast der halben Effizienz zu verleihen, wie bei NIH3T3
Fibroblasten. Das Vorkommen eines Thy-1 Fragments, das für eine Demethylierung
kodiert, zusätzlich
zur dl587rev Primerbindungsstelle führt zu einem Vektor (MPthydlneo),
der die G418 Resistenz auf F9 Zellen mit einem Fünftel der Effizienz von der
mit NIH 3T3 Fibroblasten transferiert.
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Beispiel 3
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F9
und 3T3 Zellen werden parallel mit Viruspartikeln transduziert,
die aus den hiervon vorher beschriebenen retroviralen Plasmidvektoren
erzeugt wurden, wobei vier Expositionsrunden gegenüber einem
viralen Überstand
für jeweils
3 Stunden in den Platten mit 6 Vertiefungen verwendet werden. Die
Zellen werden dann für
2 Wochen kultiviert und die Zellpellets werden für DNA und RNA Extraktionen
präpariert.
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Die
genomische DNA und die gesamte zelluläre RNA werden aus den retroviral
transduzierten F9 und 3T3 Zellpellets für eine Southern Blot und Northern
Blot Analyse extrahiert. Die DNA wird durch SDS/Proteinase K und
RNase Verdau bei 55°C
für 3 bis
4 Stunden isoliert. Die verdauten Proben werden mit Phenol-Chloroform
extrahiert, die DNA wird in Ethanol gefällt und in TE Puffer resuspendiert.
(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Es wird ein quantitativer
Southern Blot ausgeführt,
um die provirale Kopienzahl zu messen. Die DNA (10 μg) einer
Kontrolle und der Probe wird mit dem Restriktionsenzym SstI (Gibco-BRL)
verdaut, das einmal in jeder LTR schneidet und hierbei die provirale
Vollängensequenz
freisetzt. Um eine Standardkurve zu erhalten, wird DNA aus einem PA317
Klon, der eine einzelne Kopie des neo Gens enthält, mit DNA aus den parenteralen
PA317 Zellen verdünnt.
Die Verdünnungen
betragen 100%, 50%, 10%, 5% und 0%. Die verdauten DNA Proben werden
auf einem 1,3% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, denaturiert
und auf eine Nylonmembran geblottet. Das Filter wird dann mit 32P-markierter
neo DNA (Feinberg et al., Anal. Biochem., Band 137, Seiten 266 (1984)) sondiert
und für
eine Exposition gegenüber
Kodak X-OMAT Filmen (Eastman-Kodak, Rochester, NY) bei –70°C verwendet.
Nachdem man zufrieden stellende Expositionen erhalten hat, wird
die Membran gesäubert und
mit einer humanen 1,6 kb Glucocerebrosidase cDNA Sonde rehybridisiert,
um eine Quantifizierung der Unterschiede in der DNA Beladung zu
erlauben. Das Filter wird erneut durch Autoradiographie analysiert.
Es wird eine densitometrische Analyse mit dem Southern Blot (15)
unter Verwendung des US Biochemical Sci Scan 5000 (Cleveland, Ohio)
ausgeführt.
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Der
Southern Blot umfasst eine Standardkurve für die Kopiezahl, die durch
serielle Verdünnung
der genomischen DNA erstellt wird, welche aus der PA317 Zelllinie
extrahiert wurde, die eine Kopie pro Zelle des LN Provirus enthält (15,
Spuren 1-5). Es wird eine Kopiezahlstandardkurve durch Messen der
Intensität des
Provirus neo Signals durch Densitometrie und Normalisierung der
Ergebnisse gegenüber
dem endogenen Glucocerebrosidasemarker aufgetragen, wobei die Unterschiede
der Beladung zwischen den DNA Proben mitberücksichtigt werden. Die Proviruskopiezahl
in den transduzierten NIH 3T3 Zellen (15, Spuren
6-12) und F9 Zellen (15, Spuren 13-19) wird aus der
Standardkurve abgeleitet. Ähnlich
werden Transduktionseffizienzen durch die unterschiedlichen Vektoren
in den F9 Zellen und in den NIH 3T3 Zellen durch limitierte Experimentalvariationen
erreicht.
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Für den Northern
Blot wird die RNA durch das saure Guanidiniumthiocyanat – Phenolchloroform-Verfahren isoliert,
das in Chomczynski et al., Anal. Biochem., Band 163, Seiten 156-159
(1987) beschrieben ist. 15 μg
RNA werden auf einem 1,2% Formaldehydgel einer Elektrophorese unterzogen,
denaturiert, neutralisiert und auf eine Nylonmembran durch Kapillarblot überführt. Das
Filter wird mit 32P-markierter neo DNA hybridisiert und
zur Exposition gegenüber
Röntgenfilmen
bei –70°C verwendet.
Das Filter wird mittels des Betascope 603 Blot Analyzer (Betagen,
Waltham, Massachussetts) zur Quantifizierung der DNA Menge analysiert.
Das Filter wird dann gereinigt, mit einer Maus-β-Actin DNA Sonde rehybridisiert
und erneut durch Autoradiographie analysiert. Der Northern Blot
ist in 16 gezeigt.
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Alle
7 Vektoren werden in ähnlichen
Mengen in den NIH 3T3 Fibroblasten exprimiert (16,
Spuren 1-8). Es wird jedoch keine RNA Transkription in den F9 Zellen
der LN, MPneo, MPdlneo, LNncrneo und MPthyneo Vektoren detektiert
(16, Spuren 10-13 und 15). Die zwei Vektoren, die
drei Modifikationen aufweisen, nämlich
MPncrdlneo und MPthydlneo, zeigen detektierbare RNA Transkriptionsmengen
in F9 Zellen (16, Spuren 14 und 16).
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Beispiel 4
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Methylierungsanalyse
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Es
wird eine genomische DNA (15 μg)
aus F9 Zellen, die mit den hierin vorher beschriebenen Retrovirusvektoren
transduziert sind, mit dem Restriktionsenzym BamHI (New England
Biolabs, Beverly, MD) unter Verringerung der Größe der hochmolekularen DNA
verdaut, wonach ein Verdau mit EcoRV (Gibco-BRL) erfolgt. Dann wird
jeweils die Hälfte
jeder DNA Probe mit dem Methylierungs-empfindlichen Restriktionsenzym SmaI
(New England Biolabs) verdaut. Um die Vollständigkeit der Enzymverdaus zu
verfolgen, wird eine 20 μl Probe
des Verdaugemisches mit Lambda DNA (Gibco-BRL) für einen EcoRV Verdau und Adenovirus
Typ 2 DNA (Gibco-BRL) für
einen SmaI Verdau gemischt. Die Gemische werden parallel mit den
Hauptproben bei 37°C
inkubiert und anschließend
auf einem Agaroseüberprüfungsgel
gefahren. Die mit EcoRV und EcoRV/SmaI verdaute genomische DNA wird
auf einem 1,5% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, denaturiert
und auf eine Nylonmembran geblottet. Die Blots werden mit einer
285 bp Sonde vom 5' Ende
des neo Gens an der NotI Schnittstelle bis zur PvuII Schnittstelle
im Plasmid pG1Na hybridisiert. Man erhält mehrere Expositionen des
Blots auf Röntgenfilmen.
Die Autoradiogramme werden auf einem US Biochmical Sci. Scan 5000
analysiert, wobei die relativen Intensitäten der SmaI-sensitiven und
SmaI-resistenten Banden gemessen werden. Ein Schema der modifizierten
Retrovirusvektoren, die die Lage der EcoRV und SmaI Restriktionsenzymschnittstellen
und die zur Methylierungsanalyse verwendete Sonde zeigt, wie auch
die 2,0 kb und 1,7 kb Banden, die nach dem SmaI Verdau erzeugt werden,
ist in 17A gezeigt. Der Blot ist in 17B gezeigt. Die Spuren 1-9 sind Blots
der genomischen DNA aus stabil transduzierten F9 Zellen, die mit
BamHI und EcoRV alleine verdaut wurden, und die Spuren 10-18 sind
Blots der genomischen DNA aus stabil transduzierten F9 Zellen, die
mit BamHI, EcoRV und SamI verdaut wurden. Die Figur zeigt auch die
Werte der prozentualen SmaI Resistenz der Proviren als relative
Intensitäten
der nach dem SmaI Verdau erzeugten 2,0 kb und 1,7 kb Banden. Die
Werte stellen das Mittel dar, das aus der Analyse der zwei unterschiedlichen
Expositionen desselben Blots erhalten wird.
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Die
SmaI Schnittstelle wird in der LTR des Moloney Mausleukämievirus
des LN Vektors in F9 Zellen stark methyliert, was eine SmaI Resistenz
von 98,3% zeigt (17B, Spur 12). Die
Vektoren MPneo, MPdlneo, LNncrneo und MPthyneo zeigen keine signifikante
Abnahme der Methylierung mit den jeweiligen aufgezeichneten Werten
für die
SmaI Resistenz von 95,0%, 97,8%, 94,3% und 97,4% (17B,
Spuren 13, 14, 16 und 17). Die Vektoren MPncrdlneo und MPthydlneo
sind mit jeweils 52,7% und 54,6% signifikant weniger methyliert
als die Ausgangsvektoren (17B, Spuren
15 und 18). Der gleichzeitige Einbau dieser 3 Modifikationen in
den auf den Moloney Mausleukämievirus
basierenden Vektor verringert das Ausmaß der Methylierung des Provirus
in embryonalen F9 Carcinomzellen parallel zu einer Erhöhung der
RNA Transkription.
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Beispiel 5
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Sequenzierung der 5' LTR
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In
den obigen Beispielen werden die 5' LTR und die Leaderregionen der Proviren
sequenziert, zuerst in den PA317 Zellen und dann in den F9 Zellen,
um eine korrekte Duplizierung und Aufrechterhaltung aller Modifikationen
nach der Verpackung und der seriellen Transduktion sicherzustellen.
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Die
proviralen Sequenzen werden durch PCR der genomischen DNA mittels
Primer am 5' Ende
der LTR (5'-GACCCCACCTGTACGTATGGCAA.3', Sense) und am 5' Ende des neo Gens
(5'-GCTGGCCAGGTTAACTCCC-3', Antisense) amplifiziert.
Die 1,7-1,9 kb PCR Produkte werden durch Elektrophorese auf einem
1,2% Agarosegel gereinigt und mittels des Qiaex Gel Extraction Kits
(Qiagen Inc., Chatsworth, CA) extrahiert. Dann wird eine Sequenzierung
unter Verwendung des Circumvent Thermal Cycle Sequencing Kits (New
England Biolabs) durch eine interne Markierung mit 35S-dATP
und eine Zyklussequenzierung ausgeführt. Zur Sequenzierung der
Enhancerregion wird der Primer am 5' Ende der LTR (oben beschrieben) verwendet, für die PBS
Region werden Oligonukleotide aus der Spleissdonorstelle (5'-GCTGGCCAGGTTAACTCCC-3', Antisense) und
der R/U5 Region (5'-TGCATCCGAATCGTGGTCTC-3', Sense) verwendet.
Ein Primer von der Thy-1 Sequenz (5'-TCGGGGTGGAGCAGTCTTCT-3', Sense) erlaubt
die Sequenzierung der Enhancerregion der zwei Vektoren, die das
Thy-1 Fragment enthalten.
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Beispiel 6
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Die
Vektoren MP-neo, MP-ncr-neo, MP-Thy-neo, MP-dl-neo, MP-ncr-dl-neo
und MP-Thy-dl-neo werden in primäre
embryonale Mausstammzellen der CCE Linie transduziert (Bradley et
al., Nature, Band 309, Seiten 255-256 (1984)). Die transduzierten
Zellen werden für
2 Wochen in Kultur ohne G418 Selektion vermehrt und für eine Nukleinsäureanalyse
geerntet. Die Ergebnisse sind zu denen ähnlich, die man in F9 Zellen sieht.
Die 5' LTR der Vektoren
zeigt eine vollständige
Methylierung, außer
für die
von MP- ncr-dl-neo
und MP-Thy-dl-neo. Diese 2 Vektoren zeigen, dass etwa 50% der LTR
mit SmaI geschnitten werden können,
was zeigt, das eine signifikant verringerte Methylierung in diesen
Vektoren vorliegt. Eine Northern Blot Analyse zeigt, dass diese
2 Vektoren auch detektierbare Mengen der Vektor-abgeleiteten Transkripte
ergeben, während
alle anderen keine detektierbaren RNA Mengen bilden. Daher sind
diese Vektoren transkriptionell in primären, embryonalen Stammzellen
aktiv. Die Einführung
von exogenen Genen in embryonale Stammzellen mittels dieser Vektoren
kann zur Erzeugung von transgenen Mäusen verwendet werden, die
das inserierte Gen exprimieren, wie beispielsweise ein Interleukin,
einschließlich
der Interleukine 1 bis 15, einen Transkriptionsfaktor, ein Homeobox-Gen
oder ein Oberflächenantigengen.
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Die
Aktivität
dieser neuen Vektoren hat eine wichtige Relevanz für eine humane
Gentherapie. Eine technische Schlüsselvoraussetzung für eine wirksame
Gentherapie ist die persistente Expression des inserierten Gens
in den Zellen des Patienten. Studien bei Mäusen und Ratten haben gezeigt,
dass Gene, die in primären
Zellen inseriert werden, einschließlich Knochenmarkstammzellen,
Hepatozyten und Muskelzellen, nach der Rückkehr der Zellen in das lebende
Tier "abgeschalten" werden können. Es
wurde gezeigt, dass im Gentransfer/Knochenmarktransplantationsmodell
der Maus die LTR des Moloney Mausleukämievirus des Vektors im Zusammenhang
mit der Methylierung der Cytosine der LTR abgeschaltet wird. Daher
können
Vektoren, die einer Methylierung widerstehen und aktiv bleiben,
wirksam in der Gentherapie verwendet werden.
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Beispiel 7
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Es
wird Knochenmark aus C57b1/6 Mäusen
gewonnen und die Knochenmarkszellen werden entweder mit MP-ncr-dl-neo,
MP-Thy-dl-neo oder dem Kontrollvektor LN transduziert. Die Transduktion
wird gemäß dem in
Challita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Band 91, Seiten 2567-2571
(1994) und Kra et al., Blood, Band 83, Seiten 2373-2378 (1994) beschriebenen
Verfahren ausgeführt.
6 bis 8 Wochen alte C57B1/6 Mäuse
werden dann mit 950 Rad bestrahlt und das transduzierte Knochenmark
aus jeder Gruppe wird in die Mäuse
injiziert. Das Knochenmark kann in den Mäusen für 3 bis 4 Monate wachsen und
dann werden die Mäuse
getötet.
Das Knochenmark wird gewonnen und in sekundär bestrahlte Mäuse transplantiert.
12 Tage später
werden die sekundären
Mäuse getötet und
die Kolonien, die sich aus dem transplantierten Knochenmark in der
Milz gebildet haben (sek. CFU-S) werden isoliert. Das Vorkommen
der Vektoren in den sek. CFU-S wird durch einen PCR Test für das neoR Gen bestätigt. Die sek. CFU-S, die die
auf der DNA PCR basierenden Vektoren enthalten, werden analysiert,
um die Vektorexpression durch Northern Blot Analyse zu bestätigen. Die
Ergebnisse der Northern Blot Analyse sind in der folgenden Tabelle
II aufgeführt.
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Tabelle
II Analyse
der Retrovirusvektorexpression in sek. CFU-S
-
Fast
die gesamte Expression des LN Vektors wird in den sek. CFU-S beobachtet,
die von einem primären
Donor hergestellt wurden, was die Insertion des LN Vektors in eine
chromosomale Stelle widerspiegelt, die zur Expression ungewöhnlich permissiv
ist.
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Trotz
der hohen Grundspiegelexpression vom LN Vektor zeigen beide modifizierte
Vektoren höhere Frequenzen
der Expression der sek. CFU-S, wobei die, welche den MP-Thy-dl-neo
Vektor enthalten mit 59% eine Expression zeigen und die, welche
den MP-ncr-dl-neo Vektor enthalten, mit 69% eine Expression zeigen. Daher
zeigen die modifizierten Vektoren, die eine erhöhte Expression in den F9 Zellen
zeigen, auch höhere Expressionsfrequenzen
im obigen Maustransfer/Knochenmarkstransplantationsmodell.
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Es
ist verständlich,
dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die spezifischen
oben beschriebenen Ausführungsformen
beschränkt
ist. Die Erfindung kann auch anders als im Detail beschrieben, aber
immer noch innerhalb des Schutzumfangs der Patentansprüche ausgeführt werden.
