JPH05503852A - 新規なレトロウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 なレトロウィルスベクター この発明はレトロウィルスベクターに関し、特に多重クローニングまたは制限酵 素認識部位を有するレトロウィルスベクター、および両立性または相補性多重ク ローニング部位を有する遺伝子配列を交換するための系に関する。

レトロウィルスベクターは、レトロウィルスで中介された遺伝子の真核細胞への 移転を司る要素として有効である。これらのベクターは、ウィルスの構造遺伝子 に対して遺伝暗号付けする配列の大部分が、問題となる遺伝子によって欠失ある いは置換されたものである。

これらの新しい遺伝子は、種々の方法でプロウィルスの配列主幹に組込まれる。

最も基本的な構造は、レトロウィルスの構成遺伝子が、長末端反復（以下ＬＴＲ とする）内のウィルス調節配列の制御下において転写された単一の遺伝子によっ て置換されたものである。またレトロウィルスベクターは、標的細胞内へ１個以 上の遺伝子を導入できるようにも構築される。通常これらのベクター内において は、１個の遺伝子はウィルスＬＴＲの調節制御下にあり、第２の遺伝子は切除メ ツセージから発現されるか、または遺伝子自身の内部プロモータの調節制御下に ある。

ウィルス配列主幹のウィルス成分を減少させること、特に、ベクターとパッケー ジ欠損介助ウィルスとの間の再結合の機会を少なくするための努力が払われてき ている。パッケージ欠損介助ウィルスは、ベクターそれ自身から欠除されたレト ロウィルスの構成遺伝子を提供するために必要である。

Ｒｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　６１：１６３９−１６４９（１ ９８７）　（註＝　「ジャーナル、オブ、ヴアイロロジ（ウィルス学）」の１９ ８７年第６１巻、第１６３９−１６４９ページのベンダーその他による論文、以 下引用文献の表示の意味は、これに準するものとする）には、文献Ａｒｗｅｎｔ ａｎｏ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６１：１６４７−１６５０　（前記 「ウィルス学」の第６１巻のＰ、１６４７−１６５０のアルメンターノ他の論文 ）に記載のＮ２ベクターに基づいた一連のベクターが記載されており、このＮ２ ベクターは、ベクターとパッケージ系との開の相同を極度に低減させるものであ る。この変化は同時に、ウィルスタン白質が発現される傾向を抑制するものであ る。その第１のベクターＬＮＧ−ＸＨＣ内では、部位指向性の変異誘発要素によ って、開口用の自然ＡＴＧスタートコドンがＴＡＧに変換されることによって、 不要なタン白質の合成が排除されている。モロニーねすみ白血病ウィルス（略し てＭ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ　）内では、真性開口スタートへの５′末端に、開放 読取りフレームが存在し、他のグリコジル化タン白質（ｐＰｒ８０”’）の発現 を可能ならしめる。モロニーねずみ肉腫ウィルス（ＭｏＭｕＳＶ）は、前記５′ 末端領域内に、１個のフレームシフトとグリコジル化部位の欠如より成る改変部 位を有し、これによってｐＰｒ８００ｇのアミン末端の潜在的な発現が抑制され る。

ベクターのＬＮ系列は、若干の安全特性と関連するベクター主配列を発生するが 、このＬＮベクターは、さらに幾つかの遺伝子をベクター内に挿入するための、 きわめて限定された数の潜在的クローン化部位を有する。

遺伝子転移による遺伝子療法または薬剤投与は、特定の病患のみに適用できるよ うな特殊なベクターを必要とする。かくしてベクタークローン化系は、必要な安 全性が維持され、しかもベクター設計上の最大の融通性を可能にするように配慮 されることが望まれる。遺伝子位置、あるいは所要の遺伝子との調節配列を合理 的に変更することにより、ベクター力価の多様性を得ること、あるいは転移遺伝 子を標的細胞内で有効に機能させることができるようになる。現用のベクター設 計によれば、遺伝子とプロモータとのすべての組合せに対して、全体のベクター が再構成されることが必要となるが、しかも、種々のベクター間の比較は、それ らの詳細構造が相互に矛盾するために、困難である。ベクター構造上の相互不一 致のために、ベクター安全性の問題は個々のケース毎に解決されることが必要と なる。

この発明の第１の目的は、合理的なベクター構造、すなわち、遺伝子、プロモー タ、あるいはそれらの組合せが急速に変換され、かつ最適に選択されたベクター により所要の組織が形成されるようなベクター構造を可能ならしめるようなレト ロウィルスベクターを構成することにある。

この発明の一見地においては、少な（とも４個のクローン化部位、すなわち制限 酵素認識部位を有するレトロウィルスベクターが提供される。この際少なくとも ２個の部位の真核細胞内における平均出現頻度が、１万ベース対中に１回より少 ない程度であり、制限生成物の平均ＤＮＡ寸法が、少なくとも１万ベース対とす る。好適なりローン化部位は、ＮｏｔＩ。

５ｎａＢＩ、５ａｌＩおよびＸｈｏＩより成る群から選択された制限酵素より成 るものとする。

これらの各ベクターは、公知の遺伝子工学技術により現存のレトロウィルスベク ターから生成され、生成されたベクターは少なくとも４個のクローン化部位を有 し、その少な（とも２個のクローン化部位はＮｏｔｌ、５ｎａＢＩ、５ａｌＩお よびＸｈｏ　Ｉによりクローン化された部位から選択されたものである。好まし い実例においては、レトロウィルスベクターが、ＮｏｔＩ、５ｎａＢＩ、５ａｌ ＩおよびＸｈｏ　Ｉの各クローン化部位の各々を有するものである。

前記の各クローン化部位を有するように転移されたレトロウィルスベクターとし ては、七口二一ねずみ白血病ウィルス、膵臓壊死ウィルス、およびラウス肉腫ウ ィルスおよびハーヴエイ肉腫ウィルス等のレトロウィルスから採出されたベクタ ーがその実例である。この発明に関連して構成される特徴的な種々のベクターは 、後記の実例中で説明する。

このようなレトロウィルスベクターは、遺伝子をレトロウィルスベクターに変換 するためのクローン化系の一部分としての役目を果たすことができる。よってこ の発明の他の見地においては、前記の多重クローン化部位を有するレトロウィル スベクター内での遺伝子操作用のクローン化系を提供すると共に、レトロウィル スベクター上に位置するＮｏｔ　Ｉ、５ｎａＢ　Ｉ。

５ａｌＩ、およびＸｈｏＩの何れか１つまたは２つ以上に対して和合性のある少 なくとも２個のクローン化部位を有するシャトルクローン化ベクターをも提供す る。このシャトルクローン化ベクターも、シャトルクローン化ベクターから前記 レトロウィルスベクターへ転移可能な少なくとも１個の所望の遺伝子を有するも のである。

このシャトルクローン化ベクターは、クローン化酵素または制限酵素の認識部位 を有する１個または２個以上のリンカ−ＤＮＡが連結された基本「バックボーン 」　（基幹配列）または断片から構成することができる。そのクローン化部位に は、前記の和合性または相補性クローン化部位が含まれる。

このシャトルベクターの制限酵素に対応する末端を有する遺伝子またはプロモー タは、既知の方法によりシャトルベクター内へ連結させることができる。

シャトルクローン化ベクターは、原核細胞内におけるＤＮＡ配列を増殖させるこ とができ、原核細胞組織および特にバクテリア内で一般に使用されるｐＢｒ３３ ２、ｐＵｃ　１８等のプラスミドから調製することができる。

この発明によれば、クローン化部位の選択範囲が広いリトロウィルスベクターが 提供され、また、シャトルベクターからレトロウィルスベクターへの遺伝子また はプロモータの交換が急速にできる相補性クローン化部位を有するシャトルベク ターの選択の範囲も広（なる、クローン化部位の数が増せば、それによってベク ター構造の自由選択性も高（なる。

さらに、ＮｏｔＩ、５ｎａＢＩ、５ａｌＩｊｌ；よびＸｈｏ　Ｉのクローン化部 位は、真核遺伝子内においてきわめて希有な部位であり、この「希有性」部位を 利用することにより、レトロウィルスベクターから第１の遺伝子を抽出して第２ の遺伝子と置換させることを、レトロウィルスベクターの基幹配列を改変しない で実行することができる。つまり、全体のレトロウィルスベクターを再構成する 必要がない。レトロウィルスベクターとシャトルベクターとの間で、遺伝子ある いはプロモータの有効な転移を助長するには、レトロウィルスベクターとシャト ルベクター内のクローン化部位の順序が相補性であることが好ましい。このよう に遺伝子とプロモータの交換を行うことにより、ベクターは、所要の組織内にお いて最適の効果を果すように効率よく機能する構成が得られる。

この発明の他の見地においては、５′末端ＬＴＲ（長末端反復）および３′ＬＴ Ｒを有するレトロウィルスベクターが提供される。少なくとも３′末端ＬＴＲの プロモータ配列は、プロモータ配列が不機能となるように変異または改変される 。

ただし、このような突然変異によっては、ＬＴＲの全体構造が改変されるわけで はない、好適な実施例においては、３′末端ＬＴＲのエンハンサ配列も突然変更 を受けて不機能となってもよい。ただしインテグレータ遺伝子配列は不変とする 。１つのベクターが１つの標的細胞内に導入された場合は、ウィルス複製が３′ 　ＬＴＲの部分を、プロウィルスインチグランドの５′および３′末端に転写す る。よって突然変異がベクターの「フリッピング」を生起させ、この５’　ＬＴ Ｒは調節配列が欠除し、導入された遺伝子は、完全にそれら自身のプロモータの 調節機能下にある。前記のとおり、３’　ＬＴＲの変異内で、原始３’　ＬＴＲ の大凡の塩基対数が変異３’　ＬＴＲ内に維持されると共に、原始３’　ＬＴＲ の塩基対とほぼ同一の方式が、変移された３’　ＬＴＲ内でも維持されることが 望ましい。

この発明は必ずしも理論的な理由付けのみに限定されないが、３′末端ＬＴＲの プロモータまたはエンハンサの配列のみを改変または変異させても、３′　ＬＴ Ｒの大部分を欠失させてプロモータあるいはエンハンサの機能を消去させる必要 はない。ＬＴＲ構造は、ベクターをゲノムに効率よく組込めるように精細に構成 されるので、レトロウィルスベクターを高い力価に維持することができる。よっ てベクターは臨床応用において有用であり、ベクターを高い力価に維持すること は不可欠である。かかるレトロウィルスベクターは、少なくとも４個のクローン 化部位を有し、その少なくとも２個は、Ｎｏｔ４゜５ｎａＢＩ、ＸｈｏＩの何れ かによって成る。但し、この発明は、必ずしもかかるベクターあるいは多重クロ ーン化部位を有するベクターに限定されない、ＬＴＲのプロモータ配列が突然変 位され得るようなベクターの実例は、モニローねずみ白血病ウィルス、膵臓壊死 ウィルス、およびラウス肉腫ウィルスやハーヴエイ肉腫ウィルス等のレトロウィ ルスから導出されたウィルスである。このように３′　ＬＴＲのプロモータまた はエンハンサ−の改変による突然変異は、通常の技術によって可能である。

以下、この発明の実施例について説明する。ただし、この発明はこれらに限定さ れない。

実施例１ 第１図は、プラスミドｐ　Ｌ　Ｎ　Ｓ　Ｘ　（Ｐａｌｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、 Ｂｌｏｏｄ、７３：４３８−４４３．１９８９１　からプラスミドＰＣＩを生成 する過程を示す。

５′マロニー肉腫ウイルスを含有する長さ１．６キロベース（以下ｋｂと略記す る）のＥｃｏＲＩ断片と、３′ＬＴＲを包含する３、ＯｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｃ１ ａＩ断片と、複製バクテリア原体と、アンピシリン耐性遺伝子とが分離して採取 された。

７個のユニークＤＮＡクローン化部位を包含するリンカ−ＤＮＡを使用してＥｃ ｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片をそれ自身上に閉鎖し、プラスミドｐＧｏを生成した。こ のｐＧｏを使用して、５’　ＬＴＲを有する１、６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ユ ニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することによりベクタープラスミドｐＧＩを生成し た。かくしてｐＧｒは、Ｍ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｓ　Ｖから得られた５′末端部よりな るレトロウィルスベクター主幹と、真性ＡＴＧスタートコドンがＴＡＧに突然変 異した短小開口部（Ｒｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、１９８７１　と、５′末端から ３′末端までの間にＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、５ｎａＢＩ、５ａＬＩ、ＢａｍＨＩ 。

ＸｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｐａＩおよびＣ１ａＩを含む５４塩基対の多重ク ローン化部位（ＭＣ３）、および（Ｖａｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎｅｔ　ａｌ、、ｃｏ ｌｄ　５ｏｒｉｎ　Ｈａｒｂｅｒ、Ｖｏｌ、２．ｐｇ、５６７．１９８５ｉ中に ある塩基対７７６４−７８１３のＭｏＭｕＬＶの３′末端部とを成分とするもの である。多重クローン化部位（ＭＣ３）は、最大数のユニーク挿入部位を生成す るように設計され、これは、ｐＧＩプラスミドの非切断制限酵素と１　ｎｅｏ” 遺伝子と、ベータガラクトシダーゼ遺伝子と、ハイグロマイシン３遺伝子と、Ｓ Ｖ４０プロモータとのスクリーンに基づいたものである。

ｐ−遺伝子プラスミド（第３図）は独立の分子としては存在しないが、ｐｃｉへ の挿入のクローン化過程への中間的な構成と考えられ、その基本構造はｐ　Ｂ　 Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｇｅｎｅ２：９５１９７７１と同一である。アンピシリン耐性遺伝子と複製のバ クテリア起点を含む２．１ｋｂのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｎ　ｄ　ｅ　Ｉ断片に 対し、２個のリンカ−が連結される。これらのリンカ−ＤＮＡは、オリゴヌクレ オチドを使用して合成され、１４個のユニーク制限酵素認識部位のすべてと、真 核細胞内におけるｍＲＮＡの安定性と翻訳可能性を増強する配列とを備える。

その制限部位は、プラスミド骨格の非切断制限酵素と、ネ第１遺伝子と、ベータ ガラクトシダーゼ遺伝子と、ハイグロマイシン“遺伝子と、ＳＶ４０プロモータ とのスクリーン（ふるい分け）に基づいて選択され、遺伝子は、Ｎｃｏ　ｒとＸ ｈｏＩとを使用して前記骨格内に連結することができる。生成された主幹骨格は 挿入された遺伝子よりは少なく、大きさは約２．ｌｋｂで、５′から３′末端ま でに、次の制限酵素認識部位を有する９９塩基対の多重クローン化部位を有し、 認識部位は、５ｐｈＩ、ＮｏｔＩ、５ｎａＢＩ、Ｓａｌ　Ｉ、５ａｃＩＩ。

Ａｃｃｌ、Ｎｒｕｌ、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ。

Ｈｆｎｄｌ、ＡｐａＩおよびＳｍａ　ｒである（第４図）。

ＢｇｌｌＩからＮｃｏＩ部位までの部位に、Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ　ｅｔを有 する２７塩基対の領域が存在する。１８５個のりボゾームＲＮＡの３′末端配列 は、真核細胞内において十分に保存されることが判明し、１８５個のＲＮＡとｍ ＲＮＡとの間に相補性配列が、３０５個のりボゾーム上にスタートコドン（ＡＵ Ｇ）を置くことに関与することが示唆される。アデノウィルス２の後期タン白質 、特にポリペプチドＩＸは、この法ＩＩ／　（Ｌａｗｒｅｎｃｅａｎｄ　Ｊａｃ ｈｓｏｎ、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ　Ｂｉｏｉｏ　、１６２：３１７−３３４（１９８２ ）　に従うと想定される。このリボゾームの結合信号に続いて、Ｋｏｚａｋの法 則（Ｋｏｚａｋ、Ｎｔ＋ｃ１．Ａｅｉｄ　Ｒｅｓ、１２：１１５７−８７２（１ ９８４）参照）に基づいて翻訳開始の信号も挿入された。このＡＴＧ信号のゆら ぎを利用して、Ｎｃｏ　Ｉ制限酵素部位の使用が可能となった。

一般に遺伝子は、Ｎｃｏ　ＩとＸｈｏＩとの間に挿入され、ついで挿入された遺 伝子の制限酵素マツプがＮｒｕ１部位をユニーク部位として残した場合は、プロ モータは挿入によりＮｒｕＩ部位へ付加される。ただし、遺伝子が挿入された後 には、いくつかの部位がユニーク部位として残らない場合であっても、多重クロ ーン化部位の構造は、Ｂｇｌ　ｎ部の５′部位はそのままプロモータの挿入部位 として維持されるという傾向が存在する。プロモータと遺伝子との組合せが完成 した以上は、全体の組合せを除去してｐＧｌへの挿入を容易ならしめる。一般に 、これはｐ−遺伝子骨格とｐＧｌの両者の相補性の５ａｌＩとＸｈｏ　Ｉ部位を 使用することによって完成されるが、十分な部位が多重クローン化部位内に含ま れているので、簡単な方向性クローン操作により、プロモータ＋遺伝子の組合せ が容易にｐＧｌの骨格に挿入される。

このｐ＝遺伝子＋ｐＧｌ系の応用例として、いくつがのベクターの生成ができ、 その第１例はｐＧＩＮ２５ｖＢｇと称し、選択マーカーとして細菌ネオマイシン 耐性（ｎｅｏｌｌン遺伝子を使用したベクターで、さらにＳＶ４０早期プロモー タの調節下の、細菌ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を含有する。

まず、ｎｅｏ”遺伝子の５′末端部を除いたすべてを有する７６９塩基対のＥ　 ａ　ｇ　Ｉ　／　Ｈｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ断片を、プラスミドｐ　Ｍ　ＣＩ　Ｎ　ｅ 　ｏ　（Ｔｈｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃａ１１５１：５０３−５ １２ｆ１９８７）ｌ　カら分離させ、コノ断片に、３０塩基対（７）ＳｐｈＩ／ Ｅａｇ　Ｉリンカ−を連結させた。このリンカ−は、ｎｅｏ”遺伝子の５′末端 の主要コドンのすべてを再生させ、真性ＡＴＧスタートコドンに応じてＮｅｏ　 Ｉ部位を生成させた。さらにこの断片をフレノウ・ポリメラーゼを使用して平滑 末端連結させ、ユニーク５ｎａＢ　Ｉ部位においてｐＧｌ内に連結させることに より、ｐＧＩＮ２が生成された。ｐＧＩＮ２５ｖＢｇベクターを生成する第２の ステップはｐＢｇの構成、すなわちｐ−遺伝子とβ−ｇａｌ遺伝子が多重クロー ン化部位に挿入される工程であった。β−ガラクトシダーゼをコード表示する１ 、　ａ　ｃ　Ｚ遺伝子の３．０ｋｂのＢ　ａ　ｎ　ｈ　Ｉ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ Ｉ断片が分離され、２ｆｔＭのリンカ−が付加された。５′末端へは、ＮｃｏＩ までの多重クローン化部位の５′末端部を含むＮｄｅ　ｒ−ＢａｍＨＩリンカ− およびｌ　ａｃＺ遺伝子の最初の２１塩基対を連結した。３′端末へは、Ｘｈａ Ｉ。

Ｈｉｎｄｍ、ＡｐａＩおよびＳｍａＩ部位を暗号化する配列に応じてｌ　ａｃＺ の３′配列を完成するところの、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩリンカ−を連結した。

５′末端のＥｃｏＲＩ部位の配列を突然変異させ、これによってアミノ酸コード 化忠実度を維持するが、内部ＥｃｏＲＩ部位を消去することにより、ｐＢＲ３２ ２の２．１ｋｂのＮ　ｄ、　ｅ　Ｉ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ内へのリンカ−１， ａ　ｃ　Ｚ断片の全体の方向性クローン化とスクリーニングとを可能ならしめた 。つぎにｐＩ１ｇプラスミドを使用して、ＳＶ４０プロモータ化β−ｇａｌ遺伝 子が形成された。ついで３３９塩基対のＰ　ｖ　ｕ　ＴＩ　／　Ｈｉ、　ｎ　ｄ 　ＩＩＩ　Ｓ　Ｖ　４０早期プロモータ断片が、ユニークＮｒｕＩ部位内のｐＥ １ｇ内に挿入されて、プラスミドｐＳｖＢｇが生成された。一旦このｐＳｖＢｇ が得られると、ＳＶ４０ブロモ−）・化１ａｃＺ遺伝子を含むＳａ１丁／Ｘｈ、 ｏＩ断片を得ることは単純なことであり、それを５ａｌＩ／ＸｈｏＩで消化され たｐＧＩＮ２内に挿入することができ、かくしてｐＧＩＮ２５ｖＢｇが生成され る。

ベクター生成細胞ラインは、確立された規定によって調製された。パッケージ細 胞ラインＰ　Ｅ　５０１　（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　ＲｏＳｍａｎ。

し！臘」巳却且凹７　：　９８０−９９０　ｆ１９８９１　）が、１ｏＯｗＩｌ プレート当り５Ｘ１０’個細胞の密度で載置され、翌日、標１ＩＣａＰＯ４沈澱 法（Ｉｌｉｇｎｅｒ　ｅｔ　ａＬ、Ｃｅ１１１４７２５−７３１．ｆｉ９７８） ｌにより、精製ベクターＤＮＡが導入された。導入されるべき細胞の各プレート 毎に、０．２５ＭのＣａＣｌｘ　／１ｍＭＨｅｐｅｓ　（ヘーペス）および１４ ０ｍＭのＮａＣ１と、０．７５ｍＭＮａ、ＨＰＯ。

と、２３ｍＭのＨｅｐｅｓ　（ｐＨ７，２）とからなる共沈法により、２２０− ４０ｕのベクターＤＮＡが生成された。このＤ　Ｎ　Ａ、　／沈澱は、常温で約 ３０分間放置されたのち、組織培養媒剤、ＤＭＥＭ＋１０％胎児仔牛血清中の細 胞に添加して、−夜熟成させる。この媒剤は翌朝新鮮なりＭＥＭ＋血清と交換さ れる。導入されたこの細胞は、次の４８時間密度成長に近づくように成長させ、 この時点でウィルス上ずみ液を収集して、ＰＡ３１７ベクターパツケージ細胞ラ インの分離集団を１００プレート当り１ｘｔｏ′″細胞数の濃度で感染させた。

その標準感染条件は、希釈しないウィルス上ずみ液が８μｇ／ｍｌのポリブレン を添加した際に、０．２μＭ膜で濾過される程度とした。つぎに形質導入された 細胞は、β−ｇａ１発現に基づいて直接に分析でき、あるいはネオマイシン同族 体の６４１８サルフエイトによって選択されて、ｎｅｏ’遺伝子を発現できるよ うに濃縮することができた。

Ｇ４１８耐性転移感染されたクローンは、それが出現した場合には、一連の組織 培養管を通過して拡大することによって成長させ、十分に大きな集団（１ｘ　１ ６　ｓ細胞数以上）が生成されて力価が判定できる状態なった＠　１０ないし２ ０のクローンは、それらが生成した（即ち「力価増大Ｊ）Ｇ４１８耐性付与粒子 の数に応じて評価された。６４１８耐性による力価は、標準力価法ｆＥｇｌｊ、 ｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３９５−１３９８（１９８ ５１１を使用してめられた。要するに、Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３細胞は、３５■■ディ ツシュ１個当り２Ｘ１０４細胞数の濃度で平板培養され、翌日、８ＬＬｇ／ｍｌ のポリブレンを含む種々の希釈液で２ないし４時間感染させ、それに続いて２４ ないし４８時間自由に成長させたのち、メチレンブルーで呈色する前に１０−１ ２日間、Ｇ４１８　（８００ｕｇ／ｍｌ）を含有する選択媒剤内で成長させ１個 々の６４１８耐性コロニーの数を計数した。生成コロニーは、１ｍ１当りの５Ｘ １０’から５ＸＩＯ５までのＧ４１８耐性コロニ一形成単位で発生した。

ＧＩＮ２ＳｖＢｇベクターが、機能的細菌１　ａｃＺ遺伝子によって細胞を変換 する能力は、発色性基板４−Ｃ１，−３−Ｂｒ−３インデシル−β−ガラクトシ ド（Ｘ−ｇａＬと略す）による反応ののちに、β−ｇａｌ活性を検出することに よって確定される。この）Ｃ−ｇａｌ呈色方法は、すでに文献“５ｅｎｅｓ　ｅ ｔ、　ａｌｌ、ＥＭＢｏ　５＋３１３３−３１４２（１９８６１”に記述されて いる。Ｍ］：Ｈ３Ｔ３標的細胞を平板培養し、前記ウィルス−Ｆずみ液で感染さ せる。感染細胞は１：２０の希釈液を４８時間通過させ、融合溶菌させる。溶菌 する際は、平板培養体をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２％フォルムアルデヒドと ０１２％ゲルタールアルデヒドで固定し、１ｍｇ／ｍｌＸ−ｇａｌを含む反応混 合液で一夜３７℃で熟成させる。ベクターが活性β−ｇａｌ酵素の発現に関与し た場合は個々の感染細胞からクローン化されて発生した青色細胞の明瞭なコロニ ーが見られる。

ｐ−遺伝子／　ｐ　Ｇ　１系の他の実例において、２種のベクターを生成する構 想について説明する。その第１は細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を選択可能マ ーカーとし、で使用するｐＧＩＢｇｓｖｃｂで、ＳＶ４０初期プロモータの調節 下にある標識切頭型ＣＤ４遺伝子を有する。第２は、第１のベクターと類似する が、固有の可溶性ＣＤ４を遺伝暗号付与するものである。これらのベクターの生 成の第１ステツプは、前記９８ｇベクターから得たＬａｃＺ遺伝子を含む３．０ ｋｂのＮｅｅＩ／　Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉ断片の挿入で、それを平滑連結法によりｐ、 Ｇｌの５ｎａＢ　Ｉ部位内へ挿入することにより、ｐＧＩＢｇを生成する。

ｐＢｇプラスミドもＳＶ４０でプロモートされた切頭型ＣＤ４遺伝子を使用して 構築される。まずＣＤ４レセプターのアミノ末端１７９アミノ酸に対して遺伝暗 号付与するＣＤ４遺伝子の５３４塩基対Ｈａ　ｅ　Ｉ［／　Ｎ　ｈ　ｅ　Ｉ断片 によって開始される。

この断片の５′末端に対して、ＣＤ４の２３アミノ酸リーダー配列を暗号付けす る１個のＮｃｏＩ／ＨａｅｌＩリンカ−が連結される。３′末端へは、アセチル コリン・レセプター（Ｂｔｘ）のパンガロトキシン結合領域に対してエンコード する４５塩基対のＮ　ｈ　ｅ　Ｉ　／　Ｘ、　ｈ　ｏ　Ｉリンカ−が連結される 。

この結合領域により、分泌されたＣＤ４タン白質の存在に対してきわめて敏感な 放射性同位元素分析（放射分析）が可能となる。生成された６０１塩基対のＮｃ ｏＩ／ＸｈｏＩとＣＤ　４　／　Ｂ　ｔ　ｘの断片が９８ｇ内の１ａｃＺ遺伝子 のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ断片の位置に挿入され、プラスミドｐＣｂが生成される。

第２の場合は、３′末端に連結されるのは、６個の天然ＣＤ４アミノ酸に対して コー［・付与する３０塩基対のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩ！Ｉリンカ−であった。そ れに続いて反復停止信号が生成された。この５８６塩基対（以下ｂｐとする）の ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄｌＩＩの天然ＣＤ４断片も、ｐ１３ｇ内においで、その１ａ ｅＺ遺伝子のＮｃｏＩ／ＨＬｎｄＩ［Ｉ断片の位置に挿入された。つぎに３３９ 　ｂ　ｐ、のＰｖｕ［Ｉ／ＨｉｎｄｌＩＩＳ　Ｖ　４．　Ｏ早期プロモータ断片 が、ユニークＮｒｕ　ｒ部位内のｐＣｂ内とｐＣｄ内との両者に挿入され、その 結果、プラスミドｐＳｖＣｂとｐＳｖＣｄとが生成された。最終的にベクターｐ ＧＩＢｇｓｖｃｂとｐＧＩＢｇｓｖｃｄとを生成するには、ＳＶ４０でプロモー トされたＣ　Ｄ　４　／　Ｂ　ｔ　ｘ遺伝子を含むｐＳｖＣｂの５ａｌＩ／Ｘｈ ｏＩ断片、あるいはｐＳｖＣｄの類似の５ａｌＩ／ＸｈｏｌＩＩ断片が、それぞ れ独立に、ｐＧＩＢｇの５ａｌＩ／ＸｈｏＩの大形の断片に対して連結される。

レトロウィルスベクターｐＧＩＢｇｓｖｃｂを生成するためのフローチャートは 第５図のとおりである。

他の３種のベクター、ｐＧＩＮ２ｓｖＩ２、ｐＧＩＮ２ｓｖ工１１．およびｐＧ ＩＮ２ｓｖＴ１１に対してクローン化する構想は、さらにｐ遺伝子／ｐＧ１組合 せ系の利用のさらに多くの実施を可能にすることにある。これらのベクターは、 すべて、インターロイキン−２（ＩＬ−２）　、インターロイキン−１β（ＩＬ −１１３）、あるいは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のいずれかの１つに対 して置換されたβ−ｇａｌに対する遺伝子を使用することにより、前記のｐＧＩ Ｎ２ｓｖＢｇから直接に容易に生成することができる。

このＩＬ−２遺伝子は、プラスミドＨＴ−５，１（ＡＴＣＣφ５９３９６）から 得られる。長さ１、ＯｋｂのＢａｍＨＩ断片は５この断片から分離されたのち、 ４４５ｂｐのＨｇ１ＡＩ／　Ｄ　ｒ　ａ　Ｉ断片に組込まれる。５′末端のコー ド化配列を再現するには、１ｏｏｂｐのリンカ−が、ＥＬ−２のアミン末端の２ ０個のアミノ酸コード付与領域の全体を含んで構築されたのち、ＢｇＬＩＩとＮ ｃｏＩ部位の間にあるｐ−遺伝子の伸長部と同一の配列を有する４０ｂｐの伸長 部が、５′末端リーダーとして付加される。Ｂｇｌｎ部位の５′末端に対して５ ｎａＢＩ部位が付加されると、前記再構成ＩＬ−２断片を、５ｎａＧＩと）ｆＬ ｎｄＩ［Ｉとによって消化されている（このＨｉｎｄＩＩｌは、フレノウ・ポリ メラーゼによって平滑末端連結されたものである）ｐＢｇ内へ直接に挿入するこ とができるようになるやかくして得られたｐＩ２プラスミドから、５５０ｂｐの Ｂｇｌｎ／Ｃ１ａＩ断片が分離され、これが、１ａｃＺ遺伝子の位置にあってＢ ｇｌＩＩ／Ｃ１ａＩによって消化されたｐＧＩＮ２ｓｖＢｇ内に挿入される。

ベクターｐＧＩＮ２ｓｖＩ　１１は、ベックマン（カタログ番号２６７４０ｇ） 社製の商品化されたＩＬ−１１１３遺伝子を使用して構築される。この遺伝子は 、４９９ｂｐのＮｃｏＩ／ＥｃｏＲ断片として分離されて、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲ Ｉで消化されたｐＢＧ内のｌ　ａｃＺ遺伝子の位置へ挿入される。ついで、ねず み成長ホルモン分泌信号を含む８７ｂｐのオリゴマーが、Ｎｃｏ　Ｉ部位へ挿入 される。ついで生成遺伝子は、５８６ｂｐのＢｇｌｌｌ／ＢａｍＨＩ断片として 除去され、フレノウ・ポリメラーゼを使用して充填され、ｐＧＩＮ２ｓｖＧｇ内 に挿入される。ｐ　Ｇ　１．　Ｎ　２　Ｓ　ｖ　Ｂ　Ｇのｌ　ａｃＺ遺伝子は、 ＢｇｌＩＩとＸｈｏ　Ｉによって消化されることによって除去され、フレノウ・ ポリメラーゼによって充填される。これらの少数の簡単なステップを経て最終の ｐＧＩＮ２ｓｖＩ　ｌ　ｌベクターが生成される。

最後の実例としては、ｐＧＩＮ２ｓｖＴ１１も同様に生成される。市販で入手で きるプラスミド（ベックマンのカタログ番号２６７４３０）を使用して出発し、 ＴＮＦ遺伝子は５２１Ｎｃｏ　Ｉ／ＥｃｏＲＩ断片として分離され、ＮｃｏＩ／ ＥｃｏＲＩで消化されたｐＢＧ内の１ａｃＺ遺伝子の位置に挿入され、前記と同 一のねずみ成長ホルモン分泌信号が付加されている。つぎに、生成された遺伝子 は、６０８ｂｐのＢｇｌＩＩ／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片として除去され、前記同 様に、Ｂ　ｇ　１．　ＩＮとＸｈｏ　Ｉによって消化されたｐＧＩＮ２ｓｖＢｇ 内へ挿入される。これは、ｐ、ＢＧを中間的な多種の遺伝子として使用すること により、急速かつ特定的に同一のベクター主配列内へ挿入できることを強調する ものであり、この場合はベクターｐＧＩＮ２ＳｖＴ１１が生成される。

かくして、最少のステップよりなる簡単な方法によって、プラスミドの断片が急 速に交換されて、新しいベクターが構成される。異なる１つのプロモータによる 調節が必要な場合は、種々の構想を駆使することができる。ｐＳｖＣｂの例にお いては、ＳＶ４０プロモータを除去して、他の何れかによって置換することがで きる。また、一連のプロモータの全体でも、ｐＣｂの同一のＮｒｕ丁部位内へ挿 入でき、あるいは、ＣＤ　４　／　Ｂ　ｔ　ｘ遺伝子を含むＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ 断片が。

ｐＣｂから除去されて、異なるプロモータを超えた遺伝子の位置へ挿入されるこ とも可能となる（例えば、ＣＤ　４　／　Ｂ　ｔ　ｘをベータ・ガラク）・シダ ーゼに対して交換するところのサイトメガロウィルス・プロモータによって調節 されるベータ・ガラクトシダーゼ）。この最後の方法は、最大の効率を得るため には、異なるプロモータを有する遺伝子がｐ−遺伝子の主骨格内に存在すること を要件とする。

実施例２ 内部遺伝子をさらに正確に調節できるレトロウィルスベクターを生成するために 、ベクターｐＧ１の誘導体であるｐＧ２を構築した。その構築フローチャートを 第６図に示す、ｐＧｌとｐＧ２との相違は、３’　ＬＴＲ内における１連の配列 の改変にあり、これによって、ＬＴＲの全体構造を改変することなく、すべての エンハンサおよびプロモータの機能を消去するものである。１つのベクターが標 的細胞内に導入された際に、ウィルス複製が、３′部位のＬＴＲのＵ３およびＲ 部分を重複し、これをプロウィルス組込み体の５′および３′末端へ重複させる 。このＬＴＲのＵ３部分の長さは４４９ｂｐで、複数個の強力なエンハンサ活性 を有する領域を伴っている。このＵ３領域内には、さらに、いくつかの転写調節 部分を結合させるための配列、ならびに、供給の遠位および近位のプロモータ信 号領域（即ち、ＣＡＴＴおよびＴＡＴＡの転写信号配列）が含まれている。ＬＴ ＲのＲ部分の長さ７０ｂｐ　（塩基対）で、転写されたｍＲＮＡ５のポリアデニ ル化を指示する信号が含まれている。さらにこのＲ部分は、強力なリポソーム結 合の領域で、Ｕ３部分内のプロモータによって調節される転写が開始される領域 である。かくして、Ｒの５′末端は、転写された多くのウィルスＲＮＡに対する 「キャップ部位」を表示する。５′末端のＬＴＲに、それ自身の調節配列が欠除 しているので、導入された遺伝子は、それら自身のプロモータによって完全に制 御された状態にある。これにより、特定の標的細胞形態に適応する遺伝子発現が 可能なベクターを構成することが可能となる。

これは、レトロウィルス調節配列を不作動ならしめるような前述の意図、すなわ ちＬＴＲを長尺にわたって欠失させることによってリトロウィルス・エンハンサ またはプロモータを解消しようとする方法とは完全に異なるものである。ＬＴＲ 構造の大部分を欠除することは、ベクターによって観測されたベクター力価の相 当量の減少に寄与すると考えられる。それは、ＬＴＲ構造が、細胞ゲノム内ヘプ ロウイルスを有効に組込むに際して微妙に影響するからである。配列を欠除する 代りに配列の改変を利用することにより、レトロウィルス調節配列の消去と、Ｌ ＴＲ構造および高い力価の保持とが相伴って、Ｇ２ベクター系列を、高い力価を 必要とするような臨床応用に対しても十分に対応できるものとすることができる 。

以下、構築の詳細ついて説明する。ｐＧｏプラスミドから出発して、これから、 Ｍ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖの塩基対７６７６から８２９３までと、絶膜の３′末端 からＲの丁度内側までをサブクローンした。この断片をさらに５ａｕ３Ａによっ て消化してから、Ｕ３内の１２個の塩基対５′末端から第１長エンハンサ−反復 までの、５′末端の最多部分を表示する２３５ｂｐのＣ１，ａ　Ｉ　／　Ｓ　ａ 　ｕ　３　Ａ断片が分離された。当初のＣ１ａＩ／ＳｍａＩ断片の残部を、１２ 個の重複オリゴヌクレオチド断片の一群によって再構築した。これらの断片は、 当初のＬＴＲの全長を保持するが、エンハンサおよびプロモータを認識する配列 を除去した配列改変を有するものであった。この再構築の総合結果は、天然の断 片と長さと全体構造が同等な新しいＣ１ａＩ／ＳｍａＩ断片を発生するべきもの であった。ただし、エンハンサ、遠位プロモータおよびＴＡＴＡ領域のすべては 非機能に改変されたものである。第７図は、天然のＭ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　ＶのＬ ＴＲと、改変された配列の領域とを示す。

第８図は改変された配列である。ついでこの新しいＣ１ａＩ／ＳｍａＩ断片は、 ｐＧｏからの残余のＳ　ｍ　ａ　Ｉ　／　Ｃ１ａ　Ｉ断片内へ再現された。つぎ にｐＧｌを生成するために使用された同じ５′末端Ｍ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　ＶのＬ ＴＲを含む同じＥｃｏＲＩ断片は、改変されたｐＧｏのユニークＥｃｏＲＩ部位 内へ挿入されて、ベクター主配列ｐＧ２を生成した。この主配列は、ユニークＣ １ａＩ部位の第１の５ａｕ３Ａの３′末端までは、ｐＧｌと同一である。さらに 、改変された３′ＬＴＲの３８４塩基対と、最終的に通常のＬＴＲ配列と、構成 信号とが得られた。

このベクターは、ｐＧ１ベクターのクローン化の利点をすべて組合せて、多重ク ローン化部位がｐ−遺伝子プラスミドの部位と和合性を有する。さらにｐＧ２ベ クターは、３′末端ＬＴＲの改変には関係するが、欠失は伴っていないので、レ トロウィルス調節配列の不活性化は、構成プロウィルス内には発生するが、構成 効率を減少させることはなく、高い力価も維持される。このｐＧ２ベクターは、 最高精度の調節を必要とする遺伝子の導入および発現に対して有益な遺伝子配列 を与えるもので、きわめて高精度の生理的制御のものにある遺伝子に関連する遺 伝子工学的な欠点を修正することが可能となる。

この発明の範囲は、前記特定の実施例に限定されないことは勿論であり、特定の 記述にも限定されることなく、この発明の請求の範囲内において実施可能である 。

ＲＧ、７ ＰＧＩ＜フター骨１合４＃聚のフロー干ヤート−ＦＩＧ、３ ＲＧ、５ ＦＩＧ　、６ く　イ ＦＩＧ　、ｆ３Ｂ ａ了ＧｒＴＧＴＣＡＧＡＡＣＴＧｒｒＧＧＡＣＡｌｒＧ要　約　書 多重クローニング部位または制限酵素認識部位、あるいは和合性および相補性多 重クローニング部位を有する遺伝子配列を交換するための遺伝子配列系を備え、 遺伝子、プロモータあるいはそれらの組合せが急速に交換され、かつ最適に選択 されたベクターにより所要の組織が形成されるようなベクター構造を可能ならし めるように構成されたレトロウィルスベクターである。

国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも４個の異なる制限酵素部位を備え、前記少なくとも４個のうち の少なくとも２個の部位の、真核遺伝子中における平均出現頻度が、１００００ 塩基対あたり１回よりも少ないことを特徴とするレトロウイルスベクター。
2. （２）前記少なくとも４個の部位のうちの少なくとも２個の部位が、制限酸素Ｎ ｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｅＩよりなる群から選択されることを 特徴とする請求の範囲第１項記載のレトロウイルスベクター。
3. （３）前記ベクターが、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏ Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｐａＩおよびＣｌａＩのクローン化部位を有することを 特徴とする請求の範囲第１項記載のレトロウイルスベクター。
4. （４）前記レトロウイルスベクターがｐＧ１であることを特徴とする請求の範囲 第１項記載のレトロウイルスベクター。
5. （５）少なくとも３′末端の長末端反復のブロモ−タ配列が突然変異されたこと により、前記ブロモ−タ配列が不機能化されることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載のレトロウイルスベクター。
6. （６）少なくとも４個の異なる制限酸素部位を備え、この少なくとも４個の部位 の少なくとも２個が、１００００塩基対中に１回よりも少ない頻度で真核遺伝子 内に出現するレトロウイルスベクターと、前記レトロウイルスベクターのＮｏｔ Ｉ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩよりなる群から選択された少なくとも ２個のクローニング部位に対して和合性の少なくとも２個のクローニング部位を 有し、シャトルクローニングベクターが、このクローニングベクターから前記レ トロウイルスベクターへの変換可能な少なくとも１個の所望の遺伝子配列を備え たシャトルクローニングベクターとからなり、前記レトロウイルスベクター内の 遺伝子を操作するためのクローニング系。
7. （７）前記第１のレトロウイルスベクターが、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ 、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｐａＩおよびＣｌａＩの各クロー ニング部位を備えることを特徴とする請求の範囲第６項記載のクローニング系。
8. （８）前記第２のベクターが、ＳｐｈＩ、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、Ｓ ａｃＩＩ、ＡｃｃＩ、ＮｒｕＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩ ＩＩ、ＡｐａＩおよびＳｍａＩの各クローニング部位を備えることを特徴とする 請求の範囲第７項記載のクローニング系。
9. （９）少なくとも１個の所望の遺伝子を前記シャトルベクターから請求の範囲第 ６項記載のレトロウイルスベクターへ転移させることによって生成されることを 特徴とするレトロウイルスベクター。
10. （１０）少なくとも３′長末端反復のブロモ−タ配列が、このブロモ−タ配列が 不機能となるように突然変異されたことを特徴とするレトロウイルスベクター。
11. （１１）前記ベクターが３′長末端反復のエンハンサ配列に突然変異された部分 を有することにより、エンハンサ配列が不機能となることを特徴とする請求の範 囲第１０項記載のレトロウイルスベクター。
12. （１２）インテグレータ配列が維持されることを特徴とする請求の範囲第１０項 記載のレトロウイルスベクター。
13. （１３）レトロウイルスベクターが異型の遺伝子を有し、レトロウイルスベクタ ーが請求の範囲第１項記載のベクターから調製されることを特徴とするレトロウ イルスベクター。
14. （１４）請求の範囲第１３項記載のレトロウイルスベクターによって導入される ことを特徴とするパッケージ細胞。
15. （１５）請求の範囲第１３項記載のレトロウイルスベクターから生成されること を特徴とする感染性ウイルス粒子。
16. （１６）請求の範囲第１３項記載の感染性ウイルス粒子が導入されることを特徴 とする請求の範囲第１５項記載の真核細胞。