-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen
fermentativen Herstellung von Erythropoietin (EPO). Das Verfahren
zeichnet sich dadurch aus, dass es in einem Perfusionsreaktor mit
Zellrückhaltung durchgeführt wird und der Fermentationsprozess
dabei nur durch wenige ausgewählte Mess- und Regelparameter
so gesteuert wird, dass sowohl die Produktivität des gewählten
Wirtsorganismus hinsichtlich EPO als auch die Produktqualität
von EPO vorteilhaft beeinflusst werden.
-
Erythropoietin,
kurz EPO genannt, ist ein Glykoprotein, das die Bildung von Erythrocyten
im Knochenmark anregt. EPO wird hauptsächlich in den Nieren
gebildet und gelangt von dort aus über den Blutkreislauf zu
seinem Zielort. Bei der Niereninsuffizienz produzieren die geschädigten
Nieren zu wenig oder überhaupt kein EPO, was zur Folge
hat, dass aus den Stammzellen des Knochenmarks zu wenige Erythrocyten
hervorgehen. Diese sogenannte renale Anämie kann durch
Verabreichung von EPO in physiologischen Mengen, die die Bildung
von Erythrocyten im Knochenmark stimulieren, behandelt werden. Die
therapeutische Wirkung und Anwendung von EPO ist beispielsweise
in
Eckardt K. U., Macdougall I. C., Lancet 2006, 368, 947–953,
Jelkmann
W.; Physiol. Rev. 1992, 72, 449–489,
Eschbach
J. W. et al., N. Engl. J. Med., 1987, 316, 73–78,
EP-B 0 148 605 ,
EP-B 0 209 539 ,
EP-B 0 205 564 ,
Huang
S. L., PNAS 1984, 2708–2712,
Lai, P. H.
et al., J. Biol. Chem. 1986, 261, 3116–3121, sowie
in
Dietzfelbinger H. et al., Manual Supportive Maßnahmen
und symptomorientierte Therapie, Tumorzentrum München,
2001, 70–77, ausführlich beschrieben.
-
Das
zur Verabreichung verwendete EPO kann entweder aus Humanurin gewonnen
oder durch gentechnologische Methoden her gestellt werden. Da EPO
im menschlichen Körper nur in geringsten Mengen enthalten
ist, ist die Isolierung von EPO aus der natürlichen Quelle
für therapeutische Anwendungen praktisch unmöglich.
Daher bieten gentechnische Methoden die einzige wirtschaftliche
Möglichkeit, diesen Stoff in größeren
Mengen zu produzieren.
-
Die
rekombinante Herstellung von Erythropoietin ist seit der Identifizierung
des humanen Erythropoietin-Gens im Jahr 1984 möglich. Seit
Anfang der 90er Jahre sind verschiedene Arzneimittel entwickelt
worden, die humanes Erythropoietin enthalten, das auf biotechnologischem
Weg in gentechnisch rekombinant veränderten, eukaryontischen
Zellen produziert wurde. Die Herstellung von rekombinantem humanen
Erythropoietin ist u. a. beschrieben in
EP-A-0 148 605 und
EP-A-205 564 .
-
Für
die Wirksamkeit mancher Proteine wie etwa Erythropoietin oder Interferon
ist der sogenannte Sialylierungsgrad, also der Gehalt der mit dem
Protein über Zuckerketten terminal verknüpften
Sialinsäuren, von entscheidender Bedeutung. Dabei weisen
im Allgemeinen die Proteine mit einem höheren Sialylierungsgrad eine
höhere spezifische Aktivität auf. Solche Proteine
wie etwa EPO, t-PA (Gewebsplasminogen-Aktivator) oder der Blutgerinnungsfaktor
VIII, deren Aktivität u. a. von ihrem Sialylierungsgrad
abhängig ist, werden nach Stand der Technik in Kulturen
von Säugetierzellen hergestellt, die zu einer solchen notwendigen,
posttranslationalen Glykosylierung bzw. Sialylierung des Proteins
in der Lage sind. Die rekombinante Herstellung von EPO erfolgt dabei üblicherweise
in Chinese-Hamster-Ovary (CHO)-Wirtszellen. Während diese
früher in Kulturmedien kultiviert wurden, denen fötales
Kälberserum und manchmal auch Rinderinsulin zugesetzt wurden, findet
die Kultivierung heutzutage regelmäßig in serum-
und proteinfreiem Medium statt. Auf diese Weise wird das Risiko
von Kontaminationen mit bovinen Proteinen, bovinen Viren, boviner
DNA oder anderen unerwünschten Substanzen ausgeschlossen.
Die Inhaltsstoffe von solchen serum- und proteinfreien Kulturmedien sind
dem Fachmann bekannt. Sie bestehen aus einer Mischung von Aminosäuren,
Fettsäuren, Vitaminen, anorganischen Salzen und Hormonen
in unterschiedlichen Konzentrationen, wie sie beispielsweise in
EP-B1 481 791 und
WO88/00967 A1 aufgezeigt
sind. Das Kulturmedium hat dabei maßgeblichen Einfluss
auf die Wachstumsrate, Zelldichte, Translation und Transkription
der Wirtszellen und damit u. a. auch auf das Glykosilierungs- und
Sialylierungsmuster des rekombinant hergestellten Proteins. So werden
in der Regel serumfreie Medien verwendet, wie sie von verschiedenen
Herstellern angeboten werden, z. B. das Medium MAM-PF2 (u. a. vertrieben
von Bioconcept, Allschwil, Schweiz) oder die Medien DMEM und DMENU12
(angeboten z. B. von Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Deutschland).
-
Grundsätzlich
lassen sich drei verschiedene Verfahrensweisen für die
Kultivierung von Wirtszellen zur Produktion von rekombinanten Proteinen
wie z. B. EPO unterscheiden:
Bei einem Batch-Prozess werden
Medium und Zellen zu Beginn der Kultivierung in den Bioreaktor eingebracht. Bis
zum Ende der Kultivierung werden weder Nährstoffe zugefügt
noch Zellen aus dem Fermenter entfernt, lediglich Sauerstoff wird
zugeführt. Wenn eines oder mehrere Substrate verbraucht
sind, wird der Prozess beendet und die Produkte werden aus dem Fermentationsüberstand
geerntet. Eine Variation dieses Batch-Prozesses ist der sogenannte
Repeated Batch-Prozess, bei dem am Ende der Fermentation ein Teil
des Kulturvolumens als Inokulum im Bioreaktor belassen, der Reaktor
mit neuem Medium aufgefüllt und der Fermentationsprozess
erneut gestartet wird.
-
Ein
Vorteil des Batch-Prozesses liegt in seiner einfachen technischen
Umsetzbarkeit. Nachteilig ist jedoch, dass im Allgemeinen die Kapazität
der Zellen zur Herstellung der rekombinanten Proteine wegen selektiver
Nährstoffverarmung im Kulturmedium sowie wegen der Anreicherung
an für die Zellen toxischer Stoffwechselprodukte wie z.
B. Ammonium und Lactat nicht vollständig ausgeschöpft
wird. Nachteilig ist ebenfalls, dass sich das im Batch-Fermenter
anreichernde Produkt ständig den sich ebenfalls anreichernden
metabolischen Enzymen ausgesetzt ist, wodurch die Produktqualität
und/oder -ausbeute negativ beeinflusst werden können. Wie
in Gramer M. J. et al, Biotechnology 1995, 13, 692–698 beschrieben,
gilt dies insbesondere für die sogenannte Sialidasen, die
die terminalen Sialinsäuren von bereits gebildeten Glycoproteinen
abzuspalten vermögen und damit die Ausbeute an gewünschtem
hochgradig silalylierten Glycoprotein senken. Ein weiterer Nachteil
des Batch-Prozesses liegt im ungünstigen Verhältnis
zwischen der wegen des begrenzten Nährstoffangebots für
die Zellkultur zeitlich limitierten Produktionszeit (typischerweise
im Bereich von 5 bis 10 Tagen) und der Gesamtzykluszeit, die zusätzlich
die Zeit für den Aufbau, die Reinigung und die Sterilisation
des Bioreaktors einbezieht (typischerweise im Bereich von bis zu
4 Tagen).
-
Das
zweite bekannte Kultivierungsverfahren ist das kontinuierliche Verfahren,
bei dem ständig frisches Medium zugeführt und
im gleichen Maße Fermenterinhalt entnommen wird. So kommt
es zu einer ständigen Zufuhr von Nährstoffen,
wobei gleichzeitig unerwünschte Stoffwechselprodukte wie
die wachstumshemmenden Substanzen Ammonium und Lactat entfernt bzw.
verdünnt werden. Daher können mit diesem Verfahren höhere
Zelldichten erreicht und über einen vergleichsweise langen
Zeitraum aufrechterhalten werden. Einen Spezialfall der kontinuierlichen
Prozessführung stellen sogenannte Dialysereaktoren dar,
bei denen hochmolekulare Substanzen wie Proteine im Fermenter zurückgehalten
werden, während niedermolekulare Substanzen wie Substrate
zugefügt oder die Hauptabfallprodukte Ammonium und Lactat
aus dem System entfernt werden können. Neben diesen Vorteilen
des kontinuierlichen Verfahrens ergeben sich Nachteile insbesondere
hinsichtlich der vergleichsweise erhöhten Gefahr der Kontamination
durch Verunreinigungen der Zellrückhaltesysteme (typischerweise
schwer zu reinigende Membranfilter) und der Ablagerung von Zellmaterial
auf der Filteroberfläche im Prozessverlauf, die zu einer
Verringerung des Durchflusses bis hin zu einem vollständigen Verstopfen
der Membran führen kann. Eine Alternative bieten Ultraschall-gestützte
Rückhaltesysteme, in denen die Zellen durch eine stehende
Ultraschallwelle am Austreten aus dem Fermentationsreaktor gehindert werden
und keine Membranfilter mehr verwendet werden müssen.
-
Der
Einsatz von Perfusionsreaktoren in der mikrobiellen Herstellung
von chemischen Verbindungen und Proteinen mit verschiedenen Zellrückaltesystemen
ist allgemein bekannt und auch für EPO beschrieben (
BioProcess
International 2004, 46;
Gorenflo et al., Biotech.
Bioeng. 2002, 80, 438;
www.sonosep.com/biosep.htm;
WO 95/01214 ).
-
In
diesem Zusammenhang werden z. B. von Wang M. D. et al.,
Biotechnology and Bioengineering 2002, 77 (2), 194–203 verschiedene
Systeme diskutiert, bei denen die Zellen auf makroporösen
Beads gebunden werden und durch die Poren große Oberflächen
besiedeln können, was zu hohen Zelldichten führt.
Die Nährstoffversorgung erfolgt durch kontinuierliches
Zuführen frischen Mediums, wobei gleichzeitig die mit Zellen
bewachsenen Beads nach oben geflutet werden. Anstelle von Beads
lassen sich auch Polyesterscheibchen (ca. 1 cm im Durchmesser) in
einen Rührreaktor packen und kontinuierlich mit frischem
Medium durchströmen (Jixian D. et al., Chinese
Journal of Biotechnology 1998, 13 (4), 247–252).
-
Voraussetzung
dafür ist allerdings, dass die Zellen adhärent
wachsen. Die Besiedelung von Trägern, unabhängig
welcher Art und chemischer Zusammensetzung, haben den Nachteil,
dass die Zellen so dicht einwachsen können, dass die inneren
Lagen nicht mehr richtig versorgt werden und die dort angesiedelten
Zellen die Produktion einstellen bzw. auch ungewünschte
Metabolite in so hohem Maße freisetzen, dass sie nicht
genügend abgeführt werden und damit die Produktqualität
negativ beeinflussen können.
-
Das
dritte mögliche Verfahren ist schließlich die
Fed-Batch-Fermentation, bei der die Kultivierung in einem nur zu
einem Bruchteil mit Kulturmedium gefüllten Fermenter gestartet
wird und nach kurzer Anwachsphase nach und nach frisches Medium
zugegeben wird. Dadurch werden höhere Zelldichten und längere
Prozesszeiten als im Batch-Verfahren ermöglicht. Ein weiterer
Vorteil dieses Verfahrens ist, dass sich der Stoffwechsel der Zellen über
das Maß der Zufütterung beeinflussen lässt,
was zu einer geringeren Produktion von Abfallsubstanzen führen
kann. Gegenüber dem kontinuierlichen Verfahren wird hier
das Produkt der Zellen über einen längeren Zeitraum
im Fermenter akkumuliert und somit höhere Produktkonzentrationen
erreicht, wodurch die anschließende Aufarbeitung erleichtert
wird. Allerdings setzt dies voraus, dass das Produkt der Zellen
stabil genug ist, um bei mehrtägiger Verweilzeit im Fermenter
nicht enzymatisch abgebaut oder anderweitig zersetzt zu werden.
Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist, dass sich die physiologischen
Verhältnisse im Bioreaktor durch die Zufütterung
konzentrierter Substratlösungen nachteilig verändern
können.
-
Ein
Hauptproblem bei der Kultivierung von Säugetier-Zellen
ist, die Zellen mit genügend Nährstoffen zu versorgen,
ohne dass sich die Abbauprodukte der Nährstoffe über
ein für die Zellphysiologie kritische Grenze hinaus anreichern.
Als Hauptenergiequellen von tierischen Zellen dienen Glucose und
Glutamin, deren Hauptabbauprodukte, Lactat bzw. Ammonium, in höheren
Konzentrationen das Wachstum und den Stoffwechsel der Zellen hemmen
und zum Absterben der Zellen führen (Hassell et
al., Applied Biochemistry and Biotechnology 1991, 30, 29–41).
Daher ist es bei der Kultivierung tierischer Zellen vorteilhaft,
bei ausreichender Nährstoffzufuhr die Akkumulation von
Lactat und Ammonium zu verringern, um somit höhere Zelldichten
und eine höhere Produktausbeute zu erreichen.
-
Eine
Möglichkeit, die Produktion von Abfallprodukten zu reduzieren,
besteht in der kontrollierten Substratzugabe, die auch als „Catabolic
Control” bezeichnet wird. Dabei wird die Abhängigkeit
des Zellmetabolismus von den im Fermentationsmedium angebotenen
Konzentrationen der Nährstoffe ausgenutzt. Es konnte gezeigt
werden, dass eine limitierende Zufütterung von Glutamin
und/oder Glucose zu einer deutlich verminderten Produktion von Ammonium
und Lactat bei Hybridoma-Zellen führt (Ljunggren & Häggström,
Biotechnology and Bioengineering 1994, 44, 808–818).
-
In
Fed-Batch-Kulturen, in denen die Glucosekonzentration durch kontrollierte
Zugabe von konzentriertem Medium angepasst wurde, konnte nach einiger
Zeit eine Veränderung des Zellstoffwechsels beobachtet werden,
die auch als „Metabolic Shift” bezeichnet wird.
Dieser „Metabolic Shift” wird ausgelöst
durch die Limitierung der Glucose- und Glutaminkonzentration im
Medium über mehrere Tage hinweg und führt dazu,
dass weniger Nährstoffe von den Zellen aufgenommen und
verstoffwechselt werden. In der Folge steigt der Gehalt von Glucose
und Glutamin im Kulturmedium an, während die Produktion
der Abfallstoffe Lactat und Ammonium wegen des verminderten Verbrauchs
deutlich zurückgeht (Zhou et al., Biotechnology
and Bioengineering 1995, 46, 579–587). Der „Metabolic
Shift” wurde nicht nur bei Hybridoma-Zellen, sondern auch
bei Zelllinien wie SPO, HEK-293, BHK und CHO beobachtet.
-
Durch
den „Metabolic Shift” können hohe Zelldichten
von über 107 Zellen pro Milliliter
bei zugleich vergleichsweise langen Prozesszeiten erreicht werden,
da die Abfallprodukte Lactat und Ammonium nicht in Konzentrationen
akkumulieren, die das Zellwachstum negativ regulieren. Wichtig ist
dabei, dass die Zufütterungslösung an den Bedarf
der Zellen angepasst ist, um das Erreichen des „Metabolic
Shift” zu gewährleisten und sowohl Erschöpfung
als auch übermäßige Akkumulation bestimmter
Nährstoffe und damit ein starkes Ansteigen der Osmolalität
zu vermeiden (Xie und Wang, Biotechnology and Bioengineering
1994, 43, 1175–1189 und Biotechnology and Bioengineering
1996, 51, 725–729). Weiterhin ist es von Bedeutung,
den Zellen dennoch genügend Glucose als Substrat für
die Glykosylierung der rekombinanten Proteine zur Verfügung
zu stellen.
-
Damit
die Konzentrationen der zugeführten Nährstoffe
an den Verbrauch der Zellen angepasst werden können, werden
in der Regel komplizierte Verfahren eingesetzt, um den momentanen
Verbrauch der Zellen zu bestimmen und in der Folge die Zufütterungsgeschwindigkeit
bedarfsgerecht anzupassen. Dazu gehören unter anderem die
Messung der Glucosekonzentration durch z. B. Fließinjektionsanalyse
oder die Messung des Sauerstoffverbrauchs der Zellen.
-
So
offenbart etwa
US 6,180,401 ein
Fed-Batch-Zellkulturverfahren, bei dem die Glucosekonzentration kontinuierlich
gemessen und im Kulturmedium durch Anpassung der Zufütterung
abhängig von den Messwerten innerhalb eines bestimmten
Bereichs gehalten wird. Auch gemäß der Lehre der
US 2002/0099183 wird
die Zufütterungsrate von Glucose über die Glucosekonzentration
bestimmt, wodurch die Glucosekon zentration im Kulturmedium in einem
bestimmten Bereich gehalten wird.
-
Eine
bedarfsgerechte Nährstoffzugabe, abhängig von
der Glutaminkonzentration im Kulturmedium, ist in
EP-A-1 036 179 auf Basis
eines Fed-Batch-Verfahrens beschrieben.
-
WO 97/33973 offenbart ein
Kultivierungsverfahren, bei dem die Produktion eines elektrisch
geladenen Stoffwechselprodukts anhand der Leitfähigkeit
des Mediums gemessen und die Zufütterungsrate entsprechend
angepasst wird.
-
US 5,912,113 beschreibt
ein Fermentationsverfahren für Mikroorganismen, bei dem
immer dann zugefüttert wird, wenn die Kohlenstoffquelle
im Medium verbraucht ist und dadurch ein erhöhter pH-Wert
oder eine erhöhte Gelöstsauerstoffkonzentration
im Medium gemessen wird.
-
Neben
technischen Prozessparametern wie dem zuvor diskutierten Nährstoffangebot
in Form der Medienzusammensetzung spielen auch zelllinienspezifische
Eigenschaften, die sich in unterschiedlichen Wachstumsraten, Produktionskinetik,
Zellvitalität, posttranslationaler Prozessierung zur Glykosilierung
und Sialylierung äußern können, eine
zentrale Rolle für die Produktqualität des erhaltenen
EPO sowie die Gesamtproduktivität des Fermentationsprozesses.
Wie in Lloyd D. R. et al., Cytotechnology 1999, 30, 49–57 beschrieben
ist beispielsweise bekannt, dass je nach der Phase des Lebenszyklus,
in der sich die produzierende Wirtzelle befindet, der Zellmetabolismus
erhebliche Unterschiede aufweisen und somit im vorliegenden Fall
EPO unterschiedlicher Mengen und Qualität insbesondere
im Hinblick auf den Glykolisierungs- und Sialylierungsgrad gebildet
werden kann.
-
Da
die fermentative Herstellung von EPO in eukaryontischen Zellen wegen
der geschilderten aufwendigen Verfahren, den typischerweise vergleichsweise
geringen Produktkonzentrationen im Fermentationsüberstand
sowie der Verwendung von protein- und serumfreien Kulturmedien mit
hochpreisigen Bestandteilen sehr kostspielig ist, besitzt die Entwicklung
effizienterer Produktionsverfahren eine erhebliche Bedeutung.
-
Die
technische Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Entwicklung
eines Verfahrens zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin,
das sowohl hinsichtlich der Einfachheit der Prozessführung
als auch hinsichtlich der Ausbeute an hochwertigem Erythropoietin
gegenüber den Verfahren des Standes der Technik Vorteile
aufweist. Das erhaltene EPO sollte dabei allen Anforderungen des
offiziellen Standards und insbesondere allen Anforderungen hinsichtlich
der Isoformen-Zusammensetzung und des Glykosilierungs- bzw. Sialylierungsmusters
entsprechen (Ph. Eur. 04/2002: 1316).
-
Die
technische Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur
kontinuierlichen fermentativen Herstellung von Erythropoietin, in
dem eukaryontische EPO-produzierende Zellen in einem Perfusionsreaktor
unter Rückhaltung der Zellen kultiviert werden. wobei die
Glucosekonzentration im Reaktor über die Perfusionsrate
des Kulturmediums und die Zellzahl im Reaktor über die
Zellrückhalterate innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt
werden.
-
Vorteilhafterweise
wird in dem erfindungsgemäßen kontinuierlichen
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin
- a) zum einen die Perfusionsrate des Kulturmediums
(als Regelparameter) in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration
im Fermentationsreaktor (als Messparameter) und
- b) zum anderen die Zellrückhalterate der Zellrückhaltevorrichtung
(als Regelparameter) in Abhängigkeit von der Zelldichte
im Fermentationsreaktor (als Messparameter)
in geeigneter
Weise innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt.
-
Alternativ
zu oder in Kombination mit b) können auch in zeitlichen
Abständen bedarfsweise definierte Mengen zellhaltigen Kulturmediums
aus dem Bioreaktor ausgeschleust und auf diese Weise eine bestimmte Zelldichte
im Reaktor erreicht werden.
-
Die übrigen
relevanten Prozessparameter wie z. B. pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffpartialdruck, Rührgeschwindigkeit
sowie die Zusammensetzung des zugeführten Mediums werden über
den gesamten Zeitraum der Fermentation vorzugsweise konstant gehalten.
-
Das
geschilderte Verfahren kombiniert in neuartiger Weise verschiedene
Maßnahmen zur Steigerung sowohl der Produktausbeute als
auch der Produktqualität von Erythropoietin:
- (1) Durch die Perfusion wird sichergestellt, dass ständig
sowohl zelltoxische Stoffwechselprodukte ausgeschleust als auch
frische Nährstoffe zugeführt werden, so dass im
Bioreaktor sehr hohe Zelldichten erreicht werden und die Zellen über
einen sehr langen Zeitraum produktiv sind.
- (2) Um den bei Perfusionsprozessen typischerweise sehr hohen
Verbrauch an kostspieligem Kulturmedium zu reduzieren und einen ökonomisch
verbesserten Produktionsprozess zu ermöglichen, wird des
weiteren die Perfusionsrate so gewählt, dass der Glucosegehalt
im Kulturüberstand zwar einerseits eine für ein
effizientes Zellwachstum notwendige Untergrenze nicht unterschreitet,
andererseits jedoch in einer solchen Weise limitiert ist, dass im
Zellstoffwechsel der „Metabolic Shift” eintritt
und die toxischen Metabolite Lactat und Ammonium nur noch in reduziertem
Umfang produziert werden und damit bei der Perfusion mit nur noch
geringeren Mengen frischen Mediums ausgeschleust werden müssen.
- (3) Durch geeignete Einstellung der Zellrückhalterate
des regelbaren Zellrückhaltesystems bzw. durch das wiederholte
Ausschleusen definierter Mengen an zellhaltigem Medium lässt
sich zudem in der Fermentationslösung ein Zellkollektiv
mit einem erhöhten relativen Anteil an solchen Zellen erzeugen,
die noch nicht das Wachstumsplateau erreicht haben, sondern sich
noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden und in besonderer
Weise zur Produktion eines hochwertigen, dem offiziellen Standard
entsprechenden EPO befähigt sind.
-
Die
genannten Maßnahmen, Einstellen einer geeigneten Zellrückhalterate
bzw. regelmäßiges Ausschleusen definierter Mengen
zellhaltigen Kulturmediums bei gleichzeitigem Einstellen einer geeigneten
Perfusionsrate, wirken synergistisch, so dass in einem für
ein kontinuierliches Verfahren sehr einfachen und technisch leicht
durchführbaren Prozess in sehr hohen Ausbeuten über
einen extrem langen Zeitraum überraschenderweise ein Erythropoietin
gewonnen werden kann, welches zu einen extrem hohen Anteil solches
EPO aufweist, das den arzneimittelrechtlichen Anforderungen, insbesondere
hinsichtlich seines Glykosilierungs- und Sialylierungsgrads sowie
der Isoformenverteilung, gerecht wird.
-
Gemäß der
Erfindung kann die Messung bzw. Überwachung der Glucosekonzentration
und der Zellzahl kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten erfolgen.
Vorzugsweise erfolgt die Einstellung der Glucosekonzentration und
der Zellzahl kontinuierlich. Die Einstellung der Glucosekonzentration
erfolgt über die Perfusionsrate, d. h. indem frisches Kulturmedium
enthaltend Glucose in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration
im Fermentationsreaktor zugegeben wird.
-
In
einem bevorzugten Verfahren gemäß Anspruch 1 werden
die Glucosekonzen-tration im Kulturüberstand innerhalb
eines Bereiches von 0,05 bis 1,5 g/L und die Zellzahl innerhalb
eines Bereiches von 0,5 × 107 bis
5,0 × 107 Zellen/mL eingestellt.
-
Weiterhin
ist bevorzugt, dass die eukaryontischen Erythropoietin-produzierenden
Zellen Säugetier-Zellen, bevorzugt menschliche Zellen und
besonders bevorzugt Chinese-Hamster-Ovary-Zellen (CHO) sind.
-
In
einem weiteren bevorzugten Verfahren erfolgt die Rückhaltung
der Zellen unter Verwendung eines Ultraschall-Zellrückhaltesystems,
das vorzugsweise stufenlos regelbar ist.
-
Weiterhin
ist bevorzugt, dass die Prozessparameter pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffpartialdruck, Rührgeschwindigkeit
und Medienzusammensetzung über den gesamten Zeitraum der
Fermentation im Bereich technisch bedingter Abweichungen konstant
gehalten werden.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens beträgt die Produktivität mindestens
10, vorzugsweise mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 25 und
ganz besonders bevorzugt mindestens 30 mg Erythropoietin/L Fermentationsüberstand.
Vorzugsweise beträgt die mittlere Produktivität
mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15 mg Erythropoietin/L Fermentationsüberstand.
-
Bevorzugt
ist weiterhin, dass die mittlere spezifische Produktivität
pro Zelle und Tag mindestens 0,5 pg, weiter bevorzugt mindestens
1,0 pg und besonders bevorzugt mindestens 1,2 pg und ganz besonders
bevorzugt mindestens 1,4 pg Erythropoietin beträgt.
-
Bei
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt
die mittlere Vitalität der Zellen mindestens 70%, vorzugsweise
mindestens 75%, besonders bevorzugt mindestens 80%, weiterhin bevorzugt
mindestens 90% und ganz besonders bevorzugt mindestens 95%.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise mit
einer Perfusionsrate während der Fermentation zwischen
0,5 und 3, bevorzugt zwischen 1 und 2,5 und besonders bevorzugt
zwischen 1,5 und 2,0 durchgeführt.
-
Vorteilhafterweise
wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung über
einen Zeitraum von mindestens 10, vorzugsweise von mindestens 20,
besonders bevorzugt von mindestens 30 Tagen und ganz besonders bevorzugt
von mindestens 40 Tagen durchgeführt.
-
In
einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird die
Glucosekonzentration im Kulturüberstand bevorzugt innerhalb
eines Bereiches von von 0,25 bis 1,25 g/L und besonders bevorzugt
von 0,5 bis 1,0 g/L eingestellt.
-
Die
Zellzahl im Bioreaktor wird bevorzugt innerhalb eines Bereiches
von 1,0 × 107 bis 4,0 × 107 Zellen/mL und besonders bevorzugt in einem
Bereich von 1,5 × 107 bis 3,0 × 107 Zellen/mL Fermentationsmedium eingestellt.
-
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
(beste Ausführungsform)
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen
fermentativen Herstellung von Erythropoietin, wobei eukaryontische
EPO-produzierende Zellen in einem Perfusionsreaktor unter Rückhaltung der
Zellen kultiviert werden, wobei die Glucosekonzentration im Kulturüberstand über
die Perfusionsrate und die Zellzahl über die Zellrückhalterate
einer Zellrückhaltevorrichtung und/oder regelmäßiges
Ausschleusen definierter Mengen zellhaltigen Kulturmediums innerhalb
vorbestimmter Bereiche eingestellt werden.
-
Dadurch,
dass gemäß der Erfindung in einem kontinuierlichen
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin, vorzugsweise
mittels CHO-Zellen, in einem Perfusionsreaktor mit einem stufenlos
regelbaren Ultraschall-Zellrückhaltesystem
- a) zum einen die Perfusionsrate des Kulturmediums (als Regelparameter)
in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration im Fermentationsreaktor
(als Messparameter) und
- b) zum anderen die Zellrückhalterate der Zellrückhaltevorrichung
(als Regelparameter) in Abhängigkeit von der Zelldichte
im Fermentationsreaktor (als Messparameter) in geeigneter Weise
zueinander innerhalb vorbestimmter Bereiche einstellt werden, wird
in der Fermentationslösung ein Zellkollektiv mit einem
erhöhten relativen Anteil an Zellen erhalten, die noch
nicht das Wachstumsplateau erreicht haben, sondern sich noch in
der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Solche Zellen sind in
besonderer Weise zur Produktion eines hochwertigen, dem offiziellen
Standard entsprechenden EPO befähigt.
-
Beide
Maßnahmen, das Einstellen einer geeigneten Zellrückhalterate
bei gleichzeitigem Einstellen einer geeigneten Perfusionsrate, wirken
synergistisch, so dass in einem für ein kontinuierliches
Verfahren überraschend einfachen und technisch leicht durchführbaren
Prozess in überraschend hohen Ausbeuten von bis zu 30 mg/L
Fermentationsüberstand ein EPO gewonnen werden kann, welches
zu einen extrem hohen Anteil solches EPO aufweist, das den arzneimittelrechtlichen
Anforderungen, insbesondere hinsichtlich seines Glykosilierungs-
und Sialylierungsgrads sowie der Isoformenverteilung, gerecht wird.
-
Für
die vorliegende CHO-Zelllinie hat sich durch Einstellen der Perfusionsrate
ein Glucosegehalt im Kulturüberstand von 0,05 bis 1,5 g/L,
bevorzugt von 0,25 bis 1,25 g/L und besonders bevorzugt von 0,5
bis 1,0 g/L als vorteilhaft erwiesen. Die Regelung der Perfusionsrate
erfolgt entsprechend den Glucosegehaltsmessungen im Reaktor. In
Kombination hiermit wird die Zelldichte im Reaktor durch entsprechende
Einstellung der Ultraschall-Zellrückhaltung bzw. regelmäßiges
Ausschleusen definierter Mengen zellhaltigen Kulturmediums im Bereich
von 0,5 × 107 bis 5,0 × 107 Zellen/mL gehalten. Weiter bevorzugt ist
eine Zelldichte von 1,0 × 107 bis
4,0 × 107 Zellen/mL und ganz bevorzugt
eine Zelldichte von 1,5 × 107 bis
3,0 × 107 Zellen/mL. Die Regelung dieser
Parametereinstellung wird durch Zelldichtemessungen im Reaktor bewerkstelligt.
-
Gemäß der
Erfindung werden alle anderen relevanten Prozessparameter wie z.
B. pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffpartialdruck, Rührgeschwindigkeit
und Medienzusammensetzung über den gesamten Zeitraum der
Fermentation vorzugsweise konstant gehalten.
-
Die
Kultivierung findet vorzugsweise in serum- und proteinfreiem Medium
statt. Die Inhaltsstoffe von solchen serum- und proteinfreien Kulturmedien
sind dem Fachmann bekannt. Sie bestehen aus einer Mischung von Aminosäuren,
Fettsäuren, Vitaminen, anorganischen Salzen und Hormonen
in unter schiedlichen Konzentrationen, wie sie beispielsweise in
EP-B1 481 791 und
WO88/00967 A1 aufgezeigt
sind. Das Kulturmedium hat dabei maßgeblichen Einfluss
auf die Wachstumsrate, Zelldichte, Translation und Transkription
der Wirtszellen und damit u. a. auch auf das Glykosilierungs- und
Sialylierungsmuster des rekombinant hergestellten Proteins. Für
die vorliegende Erfindung wurden serumfreie Medien verwendet, wie
sie von verschiedenen Herstellern angeboten werden, z. B. das Medium
MAM-PF2 (u. a. vertrieben von Bioconcept, Allschwil, Schweiz), die
Medien DMEM und DMENU12 (angeboten z. B. von Invitrogen/Gibco, Eggenstein,
Deutschland) oder das Medium HyQPF CHO Liquid Soy (u. a. angeboten
von HyClone/Perbio, Bonn, Deutschland).
-
Das
erfindungsgemäß hergestellte EPO ist bevorzugt
rekombinantes humanes Erythropoietin, hergestellt in eukaryontischen
Zellen. Bevorzugt wird das rekombinante EPO in Säugtier-Zellen,
besonders bevorzugt in menschlichen Zellen und ganz besonders bevorzugt
in CHO-Zellen hergestellt, wie z. B. allgemein beschrieben in
EP-A-0 205 564 und
EP-A-0 148 605 .
-
Unter
Erythropoietin (EPO) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes
Protein verstanden, das in der Lage ist, die Erythrocyten-Bildung
im Knochenmark zu stimulieren und gemäß dem in
der Europäischen Pharmacopoeia (Ph. Eur. 04/2002:
1316) beschriebenen Assay eindeutig als Erythropoietin
identifiziert werden kann (Bestimmung der Aktivität in
polyzythämischen oder normozythämischen Mäusen).
Bei dem EPO kann es sich um das wildtypische humane Eythropoetin
oder um eine Variante davon mit einem oder mehreren Aminosäureaustauschen,
-deletionen oder -additionen handeln. Wenn es sich um eine Variante
von EPO handelt, dann ist bevorzugt, dass diese Variante sich lediglich
in 1 bis 20, bevorzugt in lediglich 1 bis 15, besonders bevorzugt
in lediglich 1 bis 10, und ganz besonders bevorzugt in lediglich 1
bis 5 Aminosäurepositionen vom humanen Wildtyp-Erythropoietin
durch Aminosäureaustausche, -deletionen oder -additionen
unterscheidet.
-
Beispiel
-
Eine
CHO-Zellkulturlösung mit 0,44 × 10
6 Zellen/mL
wurde in einen 10 L-Perfusionsreaktor (Firma Applikon), ausgestattet
mit einem Biosep 50 (Firma Applikon), in einem Volumen von 10 L
inokuliert und 3 Tage unter Beibehaltung der Kultivierungsparameter
gehalten. Am 4. Tag wurde mit einer 0,25-fachen Perfusion begonnen.
Die Perfusionsrate wurde sukzessive jeweils in 0,25er Schritten
bis max. zum 2,5-fachen gesteigert und dann entsprechend der jeweils
gemessenen Glucosekonzentrationen in den Zielbereich der Glucosekonzentration
(0,5–1.2 g/L) eingeregelt. Der Zielbereich für
die Zellzahl wurde durch Anpassung der Zellrückhalterate
der Ultraschall-Vorrichtung und durch Ausschleusen von entsprechenden
Mengen zellhaltigen Kulturmediums eingestellt. Die weiteren Fermentationsbedingungen
waren:
| Inokulum: | 0,44 × 106 Zellen/mL |
| Basis-Medium: | HyQPF
CHO Liquid Soy von HyC |
| | lone/Perbio |
| Reaktorvolumen: | 10
L |
| pH-Wert: | 7,2 |
| Temperatur: | 37°C |
| Sauerstoffpartialdruck: | 35% |
| Rührgeschwindigkeit: | 200
rpm |
| Zellrückhaltung: | Biosep
50 |
| Fermentationszeit: | 47
Tage |
-
Das
verwendeten Basis-Kulturmedium wurde mit Protein-Hydrolysaten (Yeastolate
von Becton Dickinson, HyPEP SR3 von Kerry Bio Science) und Spurenelementen
(CHO 4A TE Sock von Lonza) angereichert.
-
Die
Fermentation wurde hinsichtlich der analytischen Parameter EPO-Gehalt,
Glucose-Gehalt, Glutamin-Gehalt, Gehalt an vitalen Zellen (absolut
und relativ), Zellrückhaltung und Perfusions dokumentiert.
Die Daten sind in den 1 bis 4 zusammengefasst.
-
Während
des Fermentationslaufes wurden 776 L geerntet mit einer gesamten
Menge von 12 g Roh-EPO. Die Produktivität lag im Mittel
bei 15 μg/mL bei einer mittleren Zellzahl von 1,6 × 107 Zellen/mL, die maximale Zellzahl betrug
2,6 × 107 Zellen/mL bei einer maximalen
Produktivität von über 30 μg/mL. Die
spezifische Produktivität pro Zelle und Tag lag bei 1,4
pg, die mittlere Perfusionsrate bei 1,9. Die Vitalität
der Zellen lag zwischen 76 und 98%. Der mittlere Zellrückhalt
mittels Biosee-System lag bei 85% (7–97%).
-
Die
angefallenen Ernten wurden zellfrei filtriert und einer dem Fachmann
bekannten Aufarbeitung und Reinigung, bestehend aus 3 bis 4 Chromatographieschritten,
unterzogen.
-
Als
Ergebnis zeigte sich, dass mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren in überraschend hohen Ausbeuten ein Erythropoietin
gewonnen werden kann, welches zu einen extrem hohen Anteil solches
EPO aufweist, das den arzneimittelrechtlichen Anforderungen, insbesondere
hinsichtlich seines Glykosilierungs- und Sialylierungsgrads sowie
der Isoformenverteilung, gerecht wird.
-
Beschreibung der Figuren
-
1 zeigt
den zeitlichen Verlauf der Glucosekonzentration bzw. der EPO-Produktivität
(μg EPO/mL) im Kulturüberstand, der nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren erhalten wird.
-
2 zeigt
den zeitlichen Verlauf der vitalen Zellzahl (vit. ZZ) und der EPO-Produktivität
im Kulturüberstand sowie der Perfusion nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren.
-
3 zeigt
den zeitlichen Verlauf des prozentualen Anteils vitaler Zellen an
der Gesamtheit der Zellen im Kulturüberstand und des prozentualen
Zellrückhaltes nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren.
-
4 zeigt
den zeitlichen Verlauf der Lactat- bzw. der Glutamatkonzentration
im Kulturüberstand, der nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren erhalten wird.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 0148605
B [0002]
- - EP 0209539 B [0002]
- - EP 0205564 B [0002]
- - EP 0148605 A [0004, 0049]
- - EP 205564 A [0004]
- - EP 481791 B1 [0005, 0048]
- - WO 88/00967 A1 [0005, 0048]
- - WO 95/01214 [0009]
- - US 6180401 [0018]
- - US 2002/0099183 [0018]
- - EP 1036179 A [0019]
- - WO 97/33973 [0020]
- - US 5912113 [0021]
- - EP 0205564 A [0049]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Eckardt K.
U., Macdougall I. C., Lancet 2006, 368, 947–953 [0002]
- - Jelkmann W.; Physiol. Rev. 1992, 72, 449–489 [0002]
- - Eschbach J. W. et al., N. Engl. J. Med., 1987, 316, 73–78 [0002]
- - Huang S. L., PNAS 1984, 2708–2712 [0002]
- - Lai, P. H. et al., J. Biol. Chem. 1986, 261, 3116–3121 [0002]
- - Dietzfelbinger H. et al., Manual Supportive Maßnahmen
und symptomorientierte Therapie, Tumorzentrum München,
2001, 70–77 [0002]
- - Gramer M. J. et al, Biotechnology 1995, 13, 692–698 [0007]
- - BioProcess International 2004, 46 [0009]
- - Gorenflo et al., Biotech. Bioeng. 2002, 80, 438 [0009]
- - www.sonosep.com/biosep.htm [0009]
- - Wang M. D. et al., Biotechnology and Bioengineering 2002,
77 (2), 194–203 [0010]
- - Jixian D. et al., Chinese Journal of Biotechnology 1998, 13
(4), 247–252 [0010]
- - Hassell et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 1991,
30, 29–41 [0013]
- - Ljunggren & Häggström,
Biotechnology and Bioengineering 1994, 44, 808–818 [0014]
- - Zhou et al., Biotechnology and Bioengineering 1995, 46, 579–587 [0015]
- - Xie und Wang, Biotechnology and Bioengineering 1994, 43, 1175–1189
und Biotechnology and Bioengineering 1996, 51, 725–729 [0016]
- - Lloyd D. R. et al., Cytotechnology 1999, 30, 49–57 [0022]
- - Ph. Eur. 04/2002: 1316 [0024]
- - Ph. Eur. 04/2002: 1316 [0050]