CN102057053A - 用于促红细胞生成素发酵生产的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于促红细胞生成素的发酵连续生产的方法，其中在保留细胞的同时在灌注反应器中培养真核产促红细胞生成素细胞，通过灌注比率来调节培养物上清中的葡萄糖浓度以及通过细胞保留比率和/或从生物反应器中在预设区域内转移出给定量的含细胞培养基来调节细胞数量。

Description

用于促红细胞生成素发酵生产的方法

本发明涉及用于促红细胞生成素(EPO)连续发酵生产的方法。该方法特征在于其在具有细胞保留的灌注反应器中进行，其发酵方法仅由几个经选择的量度和控制参数来控制以在有利的方式下影响所选宿主生物体对EPO的生产力以及影响EPO产物的质量。

促红细胞生成素，简称EPO，是在骨髓中刺激红细胞形成的糖蛋白。EPO主要在肾中产生并由该处通过循环到达其靶标。在肾衰竭中，受损的肾产生太少EPO或根本不产生EPO，导致由骨髓的干细胞产生太少的红细胞。此“肾贫血(renal anemia)”可通过施用生理量的EPO刺激骨髓中红细胞的形成来治疗。该EPO的治疗作用和用途在如下文献中有详细描述，例如，Eckardt K.U.，Macdougall I.C.，Lancet 2006，368，947-953，Jelkmann W.；Physiol.Rev.1992，72，449-489，Eschbach J.W.等，N.Engl.J.Med.，1987，316，73-78，EP-B 0148605，EP-B-0209539，EP-B-0205564，Huang S.L.，PNAS 1984，2708-2712，Lai，P.H.，等，J.Biol.Chem.1986，261，3116-3121，and inDietzfelbinger H.等，以及Manual Supportive Maβnahmen undsymptomorientierte Therapie，Tumorzentrum Munich，Germany，2001，70-77。

用于施用的EPO可从人尿液中获得或者通过基因工程方法来产生。由于人体中仅含有非常少量的EPO，从天然来源分离EPO用于治疗用途实质上是不可能的。因此，基因工程方法提供了对于大量产生该物质唯一的经济可行途径。

自从1984年鉴定出人促红细胞生成素基因，促红细胞生成素可重组产生。从九十年代初开始已经开发了各种药物，所述药物含有在经基因重组修饰的真核细胞中通过生物技术所生产的人促红细胞生成素。其中特别是EP-A-0148605和EP-A-205564描述了重组人促红细胞生成素的生产。

“唾液酸化程度(degree of sialylation)”，即经糖链末端连接到蛋白的唾液酸的含量，对某些蛋白如例如促红细胞生成素或者干扰素的效力非常重要。具有较高唾液酸化程度的蛋白通常具有较高的比活性。根据现有技术，那些活性特别依赖于其唾液酸化程度的蛋白如例如EPO，t-PA(组织血纤维蛋白溶酶原激活剂)或者凝血因子VIII产生于哺乳动物细胞的培养，其能够在比如必要时对蛋白进行翻译后糖基化或者唾液酸化。通常，EPO在中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞中重组产生。而后者从前在补加了胎牛血清以及有时也补加了牛胰岛素的培养基中培养，如今其常规地在无血清和无蛋白的培养基中培养。这消除了牛蛋白、牛病毒、牛DNA或其它不希望物质的污染风险。本领域技术人员熟悉这些无血清和无蛋白培养基的成分。它们由不同浓度的氨基酸、脂肪酸、维生素、无机盐和激素的混合物组成，如例如在EP-B1 481791和WO88/00967A1中所详述的。此处的培养基对宿主细胞的生长率、细胞密度、翻译和转录有相当的影响，并且因此也特别对重组产生的蛋白的糖基化和唾液酸化模式有重要的影响。因此，通常使用各厂商提供的无血清培养基，例如MAM-PF2培养基(特别是由Bioconcept，Allschwil，Swizerland出售的)或者DMEM和DMEMU12培养基(例如由Invitrogen/Gibco，Eggenstein，Germany所提供的)。

原则上，培养用于生产重组蛋白如例如EPO的宿主细胞的过程可区分为三种：

在分批方法(batch process)中，在培养的开始将培养基和细胞引入到生物反应器中。直到培养结束，既未添加营养物也未从发酵器中移除细胞，且仅加入氧气。一旦一种或多种底物(substrate)耗尽，将该过程停止并从发酵上清中收集产物。该分批方法的变种是“重复分批方法”，其涉及在发酵结束时保留部分的培养物体积用于在生物反应器中接种、用新培养基充满反应器以及重新开始发酵过程。

所述分批方法的优点是其技术执行简单。然而缺点是用于产生重组蛋白的细胞的能力一般未充分利用，这是由于培养基中营养物的选择性耗竭(selective depletion)以及由于对细胞有毒的代谢产物的积聚，如例如铵盐和乳酸盐。另一个缺点是分批发酵器中积聚的产物始终暴露于同样也积聚的代谢酶，而这可对产品质量和/或产量有不利的影响。如在Gramer M.J.等，Biotechnology 1995，13，692-698中所述，这特别适用于“唾液酸酶”，其能够从已经形成的糖蛋白中移除末端唾液酸，并且作为结果使所需高度唾液酸化的糖蛋白产率降低。所述分批方法的另一个缺点是生产时间和循环总时间之间不佳的比率，所述生产时间由于用于细胞培养的有限营养物供应而受到限制(通常大约5至10天)，而所述循环总时间额外还包括对生物反应器进行装配、清洗和消毒的时间(通常大约达4天)。

第二个已知的培养方法是连续方法，其中连续加入新鲜培养基并且以同种程度移除发酵灌含量(fermenter content)。这导致了营养物的连续供应，并且同时移除或稀释乐不希望的代谢产物如生长抑制物质铵盐和乳酸盐。因此，通过这种方法可获得并且在相对长的时间段保持较高的细胞密度。所述连续方法类型的特别例子包含“透析反应器”，通过其将高分子量物质例如蛋白保留在发酵器中，同时可加入低分子量物质如底物或者可将主要废产物铵盐和乳酸盐从系统中移除。在连续方法的这些优点之外，也存在缺点，特别是对于被细胞保留体系(通常难以清洗的膜过滤器)的污染物污染的风险相对增加，以及在该过程中细胞物质在过滤器表面的沉积可降低流动直至膜被完全阻断。超声支持的保留体系提供了替代方法，其中通过超声驻波(ultrasonic standing wave)来阻止细胞脱离发酵反应器而不再需要使用膜过滤器。

灌注反应器用各种细胞保留系统在化合物和蛋白的细菌生产中的用途是众所周知的且也已经被描述用于EPO(BioProcess International 2004，46；Gorenflo等，Biotech.Bioeng.2002，80，438；www.sonosep.com/biosep.htm；WO 95/01214)。

对于此背景，例如Wang M.D.等，Biotechnoligy and Bioengineering 2002，77(2)，194-203探讨了各种体系，其中将细胞结合于大孔珠上，且由于孔而能够拓展出大的表面，导致高的细胞密度。通过连续加料新鲜培养基来供应营养物，同时将细胞覆盖的珠子洗至顶部。也可以包装具有小的聚酯盘(直径大约1cm)而不是珠的搅拌槽，并使新鲜培养基连续地通过它们(Jixian D.等，Chinese Journal of Biotechnology 1998，13(4)，247-252)。然而这需要细胞以粘附方式生长。不考虑拓殖支持物(colonizing support)的类型和化学组成，其缺点在于细胞能够在其中密集生长以致于里层不能够再被适当供给而在那儿拓殖的细胞停止生产和/或也释放出不希望的代谢物以至于达到不能将其充分地移除的程度，并因此可不利地影响产物质量。

最后，第三种可能的方法是加料分批发酵，其包含在仅部分充满培养基的发酵器中开始培养，以及在短的生长期后，一点一点地加入新鲜培养基。这使得比在分批方法中具有较高的细胞密度和较长的过程时间成为可能。此方法的另一个优势是可以通过加料程度来影响细胞代谢，其可导致产生较少的废物。与连续方法相比，此处细胞的产物在较长的时间段内于发酵器中积聚，由此达到较高的产物浓度，且这有助于后续操作。然而，这需要当在发酵器中若干天时，细胞产品足够稳定而使其不被酶降解或者以另一种方式分解。此方法的另一个缺陷是生物反应器中的生理条件会由于所加料的浓缩底物溶液而产生不利的变化。

培养哺乳动物细胞的主要问题在于向细胞供应充足的营养物，且所述营养物质的降解产物不积聚超过细胞生理的临界极限。动物细胞使用的主要能量来源是葡萄糖和谷氨酰胺，其主要降解产物分别为乳酸和铵盐，在相对高的浓度下，抑制细胞的生长和代谢并导致细胞死亡(Hassell等，Applied Biochemistry and Biotechnology 1991，30，29-41)。因此当培养动物细胞时，为了达到较高的细胞密度和较高的产量，当供给细胞充足量的营养物时减少乳酸和铵盐的积聚是有利的。

减少废产物产生的可能的途径是以控制的方式加入底物，其也称作“分解代谢控制”。这利用了细胞代谢对发酵培养基中所提供的营养物质浓度的依赖。已显示出谷氨酰胺和/或葡萄糖的限制性加料导致杂交瘤细胞中铵盐和乳酸盐的产生显著地减少(Ljunggren &，Biotechnology andBioengineering 1994，44，808-818)。

在其中已经通过以控制方式加入浓缩培养基而调节了葡萄糖浓度的加料分批培养中，在一段时间后观察细胞代谢的变化，其也称作代谢转换(metabolic shift)。此代谢转换通过在若干天内限制培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度来诱导，且导致较少营养物被细胞摄取和代谢。随后，培养基中葡萄糖和谷氨酰胺含量增加，而废物乳酸盐和铵盐的产生由于经减少的消耗而显著地降低(Zhou等，Biotechnology and Bioengineering 1995，46，579-587)。所述的代谢转换不仅在杂交瘤细胞中观察到，也在细胞系如SPO、HEK-293、BHK和CHO中观察到。

代谢转换可达到超过10⁷细胞每毫升的细胞密度，同时伴随相对较长的方法时间，因为废产物乳酸盐和铵盐未积聚至不利地调节细胞生长的浓度。此处重要的是使加料溶液与细胞的需要相适应以保证达到代谢转换并阻止特定营养物的耗尽和过量积聚以及随之发生的渗透度的强烈增加(Xie和Wang，Biotechnology and Bioengineering，1994，43，1175-1189，以及Biotechnology and Bioengineering，1996，51，725-729)。进一步重要的是仍然向细胞提供足够的葡萄糖作为重组蛋白糖基化的底物。

为使所供应的营养物浓度能被调节为适应细胞消耗，通常使用复杂的方法以决定细胞的当前消耗并随后根据需要调节加料比例。这特别包括测量葡萄糖浓度，例如通过流动注射分析(flow injection analysis)，或者测量细胞的氧气消耗。

因此，例如，US6180401公开了加料分批细胞培养方法，其中连续测量葡萄糖浓度并通过将加料作为所测数据的函数进行调节，来使培养基中葡萄糖浓度保持在一定范围内。也根据US 2002/0099183的教导，葡萄糖加料的比率根据葡萄糖浓度来确定，由此使培养基中所述葡萄糖浓度保持在一个特定范围内。

EP-A-1036179在加料分批方法的基础上描述了根据需要作为培养基中葡萄糖浓度的函数来添加营养物。

WO 97/33973公开了培养方法，其涉及在培养基导电性的基础上检测带电代谢产物的产生，并相应调节加料比率。

US 5912113描述了微生物的发酵方法，其涉及每次在培养基中碳源耗尽时就进行加料，并且作为结果在培养基中测量到增加了的pH或增加了的溶解氧浓度。

除了技术过程参数例如如上所讨论的营养物供应(以培养基组成的方式)之外，可以表示为不同生长速率、生产动力学、细胞活力、糖基化和唾液酸化的翻译后处理的细胞系特异性质，在获得的EPO产物质量和发酵方法的总生产力方面也发挥了重要作用。例如，如在Lloyd D.R.等，Cytotechnology 1999，30，49-57中描述的，已知根据生产宿主细胞所处的生命周期阶段，细胞代谢可有本质不同，且作为本方法中的结果，可以不同的量和质量产生EPO，特别是对于糖基化和唾液酸化的度而言。

由于在真核细胞中EPO的发酵生产因所述复杂方法、通常发酵上清中比较低的产物浓度、以及具有高价格组分的无蛋白和无血清培养基的使用而很昂贵，因此对更有效生产方法的开发具有相当的重要性。

因此本发明解决的技术问题是开发用于促红细胞生成素发酵生产的方法，与现有技术的方法相比，该方法在过程管理的简单性方面和高质量促红细胞生成素的产量方面均具有优势。所获得的EPO应该满足所有的官方标准的要求以及特别要满足同种型组成和糖基化及唾液酸化模式的所有需要(Ph.Eur.04/2002：1316)。

该技术问题由用于促红细胞生成素连续发酵生产的方法来解决，该方法包含在具有细胞保留的灌注反应器中培养真核产EPO细胞，其中反应器中的葡萄糖浓度通过培养基的灌注比率来调节，以及反应器中的细胞数量通过细胞保留的比率来调节，在每种情况其均在预设范围内。

在有利的情况下，用于促红细胞生成素发酵生产的该创造性连续方法包含以合适的方式在预设范围内调节

a)作为发酵反应器中葡萄糖浓度(作为测量参数)函数的培养基灌注比率(作为控制参数)，和

b)作为发酵反应器中细胞密度(作为测量参数)函数的细胞保留装置的细胞保留比率(作为控制参数)。

作为b)的替代或与b)相结合，也可能根据需要间歇式地将给定量的含细胞的培养基的从生物反应器中输出并且以方式在反应器中达到特定的细胞密度。

其他相关过程参数例如例如pH、温度、氧分压(oxygen partial pressure)、搅拌速度和供应的培养基的组成优选在整个发酵期间保持恒定。

所述方法将增加促红细胞生成素的产量和产物质量的各种措施以新的方式结合：

(1)灌注确保细胞毒性代谢产物均被持续输出且新鲜营养物被持续供应，从而在生物反应器中达到非常高的细胞密度以及使细胞在非常长的时间段内有生产力。

(2)为减少通常在灌注方法中非常高的昂贵培养基的消耗，以及为使在经济改善的生产方法成为可能，进一步选择灌注的比率以使培养物上清中的葡萄糖含量首先不下降到低于有效细胞生长所需的下限，而其次以此方式限制葡萄糖含量使代谢转换在细胞代谢中发生，且毒性代谢物乳酸盐和铵盐仅以减少的量产生并因而在灌注期间需要用仅仅小量的新鲜培养基来输出。

(3)通过适当调节可控制细胞保留系统的细胞保留比率和/或通过重复输出给定量的含细胞培养基，进而可以在发酵溶液中产生一组细胞，所述一组细胞具有比例增加了的那些生长还未稳定但仍在指数生长期并且能够以特定方式产生符合官方标准的高质量EPO的细胞。

所提到的措施，设定了合适的细胞保留比率并规律地输出给定量的含细胞培养基以及同时设定了合适的灌注比率，协同发挥作用，并因此可令人惊奇地通过方法在极其长的时间段内以很高的产量获得促红细胞生成素，所述方法对于一个连续过程来说，是非常简单且在技术上能容易实现，其促红细胞生成素具有极高比例满足药物法律要求的EPO，特别是对于其糖基化和唾液酸化的程度以及同种型的分布而言。

根据本发明，葡萄糖浓度和细胞数量可连续地或者在特定时间点测量和/或监测。优选是连续调节葡萄糖浓度和细胞数量。葡萄糖浓度通过灌注比率来调节，即通过添加作为发酵反应器中葡萄糖浓度函数的含葡萄糖的新鲜培养基来进行调节。

在如权利要求1所要求保护的的优选的方法中，将培养物上清中的葡萄糖浓度调节为在0.05至1.5g/l的范围内，并将细胞数量调节为在0.5×10⁷至5.0×10⁷细胞/ml的范围内。

进一步优选真核产促红细胞生成素细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞和特别优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在进一步优选的方法中，使用可优选由连续调节控制的超声细胞保留系统来保留细胞。

进一步优选过程参数pH、温度、氧分压、搅拌速度和培养基组成在整个发酵期间恒定保持在技术偏差范围内。

在本发明方法特别优选的实施方案中，生产力至少是10、优选至少是20、更优选至少是25、和非常特别优选至少是30mg促细胞生成素/l发酵上清。平均生产能力优选至少是10、优选至少是15mg促细胞生成素/l发酵上清。

进一步优选每细胞和每天的平均比生产力是至少0.5pg、更优选至少1.0pg、和特别优选至少1.2pg、和非常特别优选至少1.4pg的促红细胞生成素。

本发明的方法使用的细胞的平均活力是至少70％、优选至少75％、特别优选至少80％、进一步优选至少90％、和非常特别优选至少95％。

进行本发明方法优选在发酵期间灌注的比例在0.5和3之间、优选在1和2.5之间和特别优选在1.5和2.0之间。

根据本发明方法有利的是在至少10、优选至少20、特别优选至少30天、和非常特别优选至少40天的期间进行。

在本方法进一步的实施方案中，优选将培养物上清中的葡萄糖浓度调节为在0.25至1.25g/l、和特别优选在0.5至1.0g/l的范围内。

生物反应器中的细胞数量优选被调节为在1.0×10⁷至4.0×10⁷细胞/ml，和特别优选在1.5×10⁷至3.0×10⁷细胞/ml发酵培养基的范围内。

本发明的详细描述(最优实施方案)

本发明涉及用于促红细胞生成素连续发酵生产的方法，其中将真核的产EPO细胞在具有细胞保留的灌注反应器中培养，其中通过灌注比率来调节培养物上清中的葡萄糖浓度以及通过细胞保留装置的细胞保留比率和/或有规律地输出给定量的含细胞培养基来调节细胞数量，在每种情况中均在预设范围内。

在用于促红细胞生成素发酵生产的连续方法中，优选用CHO细胞的手段，在具有连续可调的超声细胞保留系统的灌注反应器中，通过以适宜的方式根据本发明将下述参数调节至在预设范围内另外的值：

a)作为发酵反应器中葡萄糖浓度函数(作为测量参数)的培养基的灌注比率(作为控制参数)，和

b)作为发酵反应器中细胞密度(作为测量参数)的函数的细胞保留装置的细胞保留比率(作为控制参数)

以在发酵溶液中获得一组细胞，所述一组细胞具有比例增加了的那些生长还未稳定但仍在指数生长期的细胞。这些细胞以特定方式而能够产生符合官方标准的高质量EPO。

设定了单一的细胞保留比率同时设定了适宜的灌注比率的两种措施协同作用，并且作为结果在过程中可令人惊奇地获得高达到30g/l发酵上清的EPO产量，所述过程对于一个连续方法来说是令人惊奇地简单并且在技术上容易实现，其中EPO具有极其高比例的满足药物的法律要求的EPO，特别是对于其糖基化和唾液酸化程度和同种型的分布而言。

通过调节灌注比率，已经证明培养物上清中在0.05至1.5g/l、优选在0.25至1.25g/l、和特别优选在0.5至1.0g/l的葡萄糖含量有利于本CHO细胞系。根据反应器中葡萄糖含量的测量来控制灌注比率。与此相结合，通过适当调节超声细胞保留和有规律地输出给定量的含细胞培养基来将反应器中的细胞密度维持在0.5×10⁷至5.0×10⁷细胞/ml的范围内。进一步优选的是细胞密度在1.0×10⁷至4.0×10⁷细胞/ml以及特别优选细胞密度在1.5×10⁷至3.0×10⁷细胞/ml。通过反应器中的细胞密度测量来控制这些参数调节。

根据本发明，所有其他相关过程参数如例如pH、温度、氧分压、搅拌速度和培养基组成，优选在整个发酵期间内保持恒定。

优选在无血清和无蛋白的培养基中进行培养。本领域技术人员熟悉这些无血清和无蛋白的培养基的成分。它们由不同浓度的氨基酸、脂肪酸、维生素、无机盐和激素的混合物组成，如例如在EP-B1 481791和WO88/00967A1中所详述的。此处的培养基对宿主细胞的生长速率、细胞密度、翻译和转录有相当的影响，并因此也特别对重组产生的蛋白的糖基化和唾液酸化模式有相当的影响。本发明使用由各种厂商提供的无血清培养基，例如MAM-PF2培养基(特别是由Bioconcept，Allschwil，Swizerland出售的)、DMEM和DMEMU12培养基(例如由Invitrogen/Gibco，Eggenstein，Germany提供的)或HyQPF CHO Liquid Soy培养基(特别是由HyClone/Perbio，Bonn，Germany提供的)。

根据本发明方法生产的EPO优选是由真核细胞产生的重组人促红细胞生成素。所述的重组EPO优选在哺乳动物细胞中产生，特别优选在人细胞和非常特别优选在CHO细胞中产生，如例如在EP-A-0205564和EP-A-0148605中所一般性地描述的。

对本发明目的的促红细胞生成素(EPO)是指能够刺激骨髓中红细胞产生的以及能通过如European Pharmacopoeia(Ph.Eur.；01/2002：1316)中所述的测定法(在红细胞增多的或正常红细胞的小鼠中确定活性)而毫无疑义地鉴定为促红细胞生成素的任何蛋白。该EPO可以是人野生型促红细胞生成素或其具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的变体。如果其是EPO的变体，则优选由于氨基酸取代、缺失或添加而与人野生型促红细胞生成素仅在1至20、优选仅在1至15、特别优选仅在1至10和非常特别优选仅在1至5个氨基酸位点上不同的所述变体。

实施例

将包含0.44×10⁶细胞/ml的CHO细胞培养溶液以10l的体积通过接种而引入到装备了Biosep 50(Applikon)的10l灌注反应器(Applikon)中并保持3天同时维持培养参数。在第4天，开始0.25倍灌注。在每种情况下以0.25倍至最大2.5倍的步骤顺次提高灌注比率，并随后根据在每种情况下测定的葡萄糖浓度来将葡萄糖浓度设定在目标范围内(0.5-1.2g/l)。通过调适超声装置的细胞保留比率和通过输出相应量的含细胞培养基来设定细胞数量的目标范围。其它发酵条件如下：

接种物：0.44×10⁶细胞/ml

基础培养基：来自HyClone/Perbio的HyQPF CHO Liquid Soy

反应器容积：10l

pH：7.2

温度：37℃

氧分压：35％

搅拌速度：200rpm

细胞保留：Biosep 50

发酵时间：47天

使用的基础培养基富含蛋白水解产物(来自Becton Dickinson的Yeastolate，来自Kerry Bio Science的HyPEP SR3)和痕量元素(来自Lonza的CHO 4A TE Sock)。

该发酵是关于EPO含量分析参数、葡萄糖含量、谷氨酰胺含量、有活力的细胞含量(绝对的和相对的)、细胞保留和灌注而进行记录的。数据在图1至4中总结。

在发酵过程中，收集了包含总量12g粗EPO的776l。平均生产力是15μg/ml其平均细胞数量是1.6×10⁷细胞/ml，以及最大的细胞数量是2.6×10⁷细胞/ml其具有超过30μg/ml的最大生产力。每个细胞每天的比生产力是1.4pg以及平均灌注比率是1.9。细胞的活力在76和98％之间。通过Biosep系统的手段的平均细胞保留是85％(7-97％)。

通过过滤将产生的收获物制备为无细胞并对其进行本领域技术人员已知的处理和纯化方法，其由3至4个色谱步骤组成。

结果表明本发明方法能够产生令人惊奇地高产量的促红细胞生成素，其具有极高比例满足药物法律要求的EPO，特别是对于其糖基化和唾液酸化的程度和同种型的分布而言。

附图说明

图1分别描述了通过本发明方法获得的培养物上清中葡萄糖浓度和EPO生产力(μg EPO/ml)的时间进程。

图2描述了根据本发明的有活力细胞数量(vit.zz)的时间进程和培养物上清中EPO生产力的时间进程以及灌注的时间进程。

图3描述了培养物上清中有活力的细胞相对于总细胞的百分比的时间进程和通过本发明的方法所保留细胞的百分比的时间进程。

图4分别描述了通过本方面的方法获得的培养物上清中乳酸盐浓度和谷氨酸盐浓度的时间进程。

Claims (15)

1.一种用于连续发酵生产促红细胞生成素的方法，其中真核产促红细胞生成素细胞在被保留的同时在灌注反应器中进行培养，特征在于通过培养基的灌注比率来调节反应器中的葡萄糖浓度以及通过细胞保留比率来调节反应器中的细胞数量，每种情况下均在预设区域内。

2.如权利要求1所述的方法，特征在于

a)培养基的灌注比率作为反应器中葡萄糖浓度的函数在预设的范围内进行调节，和

b)细胞保留装置的细胞保留比率作为反应器中细胞密度的函数在预设的范围内进行调节，和/或间歇式地通过输出给定量的含细胞培养基到反应器外而调节反应器中特定的细胞密度。

3.如权利要求1或2所述的方法，特征在于使用真核产促红细胞生成素细胞的连续发酵方法产生优选为野生型人促红细胞生成素变体的促红细胞生成素，所述变体优选具有不超过10个、特别优选不超过5个氨基酸取代、缺失或添加，以及非常特别优选具有不超过1个氨基酸取代、缺失或添加的变体。

4.如权利要求1至3所述的方法，特征在于将培养物上清中的葡萄糖浓度调节为在0.05至1.5g/l的范围内，以及将细胞数量调节为在0.5×10⁷至5.0×10⁷细胞/ml的范围内。

5.如权利要求1至4所述的方法，特征在于所述真核产促红细胞生成素细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞，和特别优选中国仓鼠卵巢细胞。

6.如权利要求1至5任一项所述的方法，特征在于用超声细胞保留系统来保留细胞。

7.如权利要求1至6任一项所述的方法，特征在于发酵溶液包含细胞群，该细胞群具有相对比例增加了的仍在指数生长期的细胞。

8.如权利要求1至7任一项所述的方法，特征在于过程参数pH、温度、氧分压、搅拌速度和加料的培养基组成在整个发酵期间保持恒定。

9.如权利要求1至8任一项所述的方法，特征在于生产力至少是10，优选至少是20，更优选至少是25，和非常特别优选至少是30mg促细胞生成素/l发酵上清。

10.如权利要求1至9任一项所述的方法，特征在于每细胞和每天的平均比生产力是至少0.5pg，优选至少1.0pg，特别优选至少1.2pg，和非常特别优选至少1.4pg的促红细胞生成素。

11.如权利要求1至10任一项所述的方法，特征在于细胞平均活力是至少70％，优选至少75％，特别优选至少80％，进一步优选至少90％，和非常特别优选至少95％。

12.如权利要求1至11任一项所述的方法，特征在于在发酵期间的灌注比率在0.5至3之间，优选在1至2.5之间和特别优选在1.5至2.0之间。

13.如权利要求1至12任一项所述的方法，特征在于其在至少10天，优选至少20天，特别优选至少30天，和非常特别优选至少40天的期间进行。

14.如权利要求1至13任一项所述的方法，特征在于培养物上清中的葡萄糖浓度被调节为在0.25至1.25g/l的范围内，优选在0.5至1.0g/l的范围内。

15.如权利要求1至14任一项所述的方法，特征在于发酵反应器中的细胞数量被调节为在1.0×10⁷至4.0×10⁷细胞/ml发酵培养基的范围内，优选被调节为在1.5×10⁷至3.0×10⁷细胞/ml发酵培养基的范围内。

Images