EP2283147A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von erythropoietin - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von erythropoietin

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Publication number
EP2283147A1
EP2283147A1 EP09757556A EP09757556A EP2283147A1 EP 2283147 A1 EP2283147 A1 EP 2283147A1 EP 09757556 A EP09757556 A EP 09757556A EP 09757556 A EP09757556 A EP 09757556A EP 2283147 A1 EP2283147 A1 EP 2283147A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
cell
erythropoietin
reactor
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09757556A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Wienand
Franz-Rudolf Kunz
Dietmar Reichert
Wilfried Eul
Rudolf Hanko
Christian Birr
Monika Singhofer-Wowra
Dagmar SCHOPOHL_KÖNIG
Lars Faber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Degussa GmbH filed Critical Evonik Degussa GmbH
Publication of EP2283147A1 publication Critical patent/EP2283147A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Definitions

  • the present invention relates to a process for the continuous fermentative production of erythropoietin (EPO).
  • EPO erythropoietin
  • the method is characterized in that it is carried out in a perfusion reactor with cell pressure maintenance and the fermentation process is controlled only by a few selected measurement and control parameters so that both the productivity of the selected host organism with respect to EPO and the product quality of EPO advantageous to be influenced.
  • Erythropoietin is a glycoprotein that stimulates the formation of erythrocytes in the bone marrow.
  • EPO is primarily produced in the kidneys and from there via the bloodstream to its destination. In kidney failure, the damaged kidneys produce too little or no EPO at all, with the result that too few erythrocytes emerge from the stem cells of the bone marrow. This so-called renal anemia can be treated by administering EPO in physiological amounts that stimulate the growth of erythrocytes in the bone marrow.
  • EPO The therapeutic effect and application of EPO is described, for example, in Eckardt K.U., Macdougall I.C, Lancet 2006, 368, 947-953, Jelkmann W .; Physiol. Rev. 1992, 72, 449-489, Eschbach J.W. et al. , N. Engl. J. Med., 1987, 316, 73-78, EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539, EP-B 0 205 564, Huang SL, PNAS 1984, 2708-2712 , Lai, PH et al. , J. Biol. Chem. 1986, 261, 3116-3121, as well as in Dietzfelbinger H. et al. , Manual Supportive measures and symptom-oriented therapy, Tumor Center Munich, 2001, 70-77, described in detail.
  • the EPO used for administration can either be obtained from human urine or prepared by genetic engineering methods. be put. Since EPO is present in the human body only in the smallest amounts, the isolation of EPO from the natural source for therapeutic applications is virtually impossible. Therefore, genetic engineering methods 5 offer the only economic possibility to produce this substance in larger quantities.
  • the proteins with a higher degree of sialylation have a higher specific activity.
  • Such proteins as EPO, t-PA (tissue plasminogen activator) or coagulation factor VIII, whose activity i.a. depends on their degree of sialylation
  • the prior art has produced cultures of mammalian cells capable of such necessary posttranslational glycosylation or sialylation of the protein.
  • the recombinant production of EPO is usually done in Chinese hamster ovary (CHO) -
  • the culture medium has a significant influence on the growth rate, cell density, translation and transcription of the host cells and thus also on the glycosylation and sialylation pattern of the recombinantly produced protein.
  • serum-free media are used, as are offered by various manufacturers, for example the medium MAM-PF2 (distributed by Bioconcept, Allschwil, Switzerland) or the media DMEM and DMENU12 (offered for example by Invitrogen / Gibco, Eggenstein, Germany ).
  • Another disadvantage of the batch process is the unfavorable relationship between the time limited production time (typically in the range of 5 to 10 days) due to the limited supply of nutrients for the cell culture and the total cycle time, which additionally includes the time for assembly, cleaning and sterilization of the bioreactor (typically in the range of up to 4 days).
  • the second known cultivation method is the continuous method in which fresh medium is constantly supplied and taken out to the same extent fermenter contents.
  • This method can achieve higher cell densities and maintain them over a relatively long period of time.
  • a special case of continuous process management is represented by so-called dialysis reactors in which high-molecular substances such as Proteins are retained in the fermenter, while low molecular weight substances such as substrates can be added or the main waste products ammonium and lactate can be removed from the system.
  • the third possible method is the fed-batch fermentation, in which the culture is started in a fermenter filled only to a fraction with culture medium and, after a short growth phase, fresh medium is added little by little.
  • This enables higher cell densities and longer process times than in the batch process.
  • Another advantage of this method is that the metabolism of the cells can be influenced by the extent of the feed, which can lead to a lower production of waste substances.
  • the product of the cells is accumulated here in the fermenter over a relatively long period of time and thus higher product concentrations are achieved, which facilitates the subsequent work-up.
  • a major problem in the cultivation of mammalian cells is to provide the cells with sufficient nutrients without increasing the breakdown of the nutrients beyond a critical limit for cell physiology.
  • the main energy sources of animal cells are glucose and glutamine, whose major degradation products, lactate or ammonium, in higher concentrations inhibit the growth and metabolism of cells and lead to cell death (Hasseil et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 1991, 30, 29-41). Therefore, it is advantageous in the cultivation of animal cells to reduce the accumulation of lactate and ammonium with sufficient nutrient supply, thus achieving higher cell densities and a higher product yield.
  • US Pat. No. 6,180,401 discloses a fed-batch cell culture method in which the glucose concentration is continuously measured and kept in the culture medium within a certain range by adapting the feed depending on the measured values. Also according to the teaching of US 2002/0099183, the feeding rate of glucose is determined via the glucose concentration, whereby the glucose concentration concentration in the culture medium in a certain range.
  • EP-A-036 179 A need-based nutrient addition, depending on the glutamate concentration in the culture medium, is described in EP-A-036 179 based on a fed-batch process.
  • WO 97/33973 discloses a culture method in which the production of an electrically charged metabolite is measured by the conductivity of the medium and the feed rate is adjusted accordingly.
  • No. 5,912,113 describes a fermentation process for microorganisms in which feed is always carried out when the carbon source in the medium has been consumed and an increased pH or increased dissolved oxygen concentration in the medium is thereby measured.
  • cell line-specific properties which can be expressed in different growth rates, production kinetics, cell vitality, post-translational processing for glycosylation and sialylation, play a central role in the product quality of the obtained EPO and overall productivity of the fermentation process.
  • the cell metabolism has significant differences and thus in the present case EPO of different quantities and quality, in particular with respect to the Glycolization and sialylation can be formed.
  • the technical problem addressed by the present invention was therefore to develop a process for the fermentative production of erythropoietin, which has advantages over both the simplicity of the process and the yield of high-quality erythropoietin over the processes of the prior art.
  • the EPO obtained should meet all the requirements of the official EPO
  • the technical problem is solved by a process for the continuous fermentative production of erythropoietin, in which eukaryotic EPO-producing cells are cultured in a perfusion reactor with retention of the cells, the glucose concentration in the reactor via the perfusion rate of the culture medium and the cell count in the reactor via the cell pressure retention rate be set within predetermined ranges.
  • the perfusion rate of the culture medium (as a control parameter) as a function of the glucose concentration in the fermentation reactor (as a measurement parameter) and b) secondly, the cell pressure retention rate of the cell pressure maintenance device (as a control parameter) as a function of the cell density in the fermentation reactor (as measurement parameter)
  • defined amounts of cell-containing culture medium can also be discharged from the bioreactor at intervals as required and in this way a specific cell density in the reactor can be achieved.
  • the other relevant process parameters such as pH, temperature, oxygen partial pressure, Ruhr speed and the composition of the supplied medium are preferably kept constant over the entire period of the fermentation.
  • the described method combines in a novel manner various measures to increase both the product yield and the product quality of erythropoietin:
  • Perfusion ensures that both cell-toxic metabolic products are constantly removed and fresh nutrients are supplied, so that very high cell densities are achieved in the bioreactor and the cells are productive over a very long period of time.
  • the perfusion rate is further selected so that the glucose content in the culture supernatant on the one hand on the other hand, however, is limited in such a way that in the cell metabolism of the "Metabolism Shift" occurs and the toxic metabolites lactate and ammonium are produced only in a reduced extent and thus in the perfusion with only smaller amounts of fresh medium must be discharged.
  • the said measures setting a suitable Zellruckhalterate or regular discharging defined amounts of cell-containing culture medium while setting a suitable perfusion rate, act synergistically, so that in a very simple and technically easy Anlagenbaren process for a continuous process over a extremely Surprisingly, an erythropoietin can be obtained over a long period of time, which has an extremely high proportion of such EPO, which meets the requirements of pharmaceutical law, in particular with regard to its degree of glycosylation and sialylation and the distribution of isoforms.
  • the measurement or monitoring of the glucose concentration and the cell number can take place continuously or at specific times.
  • the adjustment of the glucose concentration and the cell number continuously.
  • the adjustment of the glucose concentration is carried out via the perfusion rate, ie by adding fresh culture medium containing glucose as a function of the glucose concentration in the fermentation reactor.
  • the glucose concentration in the culture supernatant within a range of 0.05 to 1.5 g / L and the cell count within a range of 0.5xl0 7 to 5, set OxIO 7 cells / mL.
  • the eukaryotic erythropoietin-producing cells are mammalian cells, preferably human cells, and more preferably Chinese hamster ovary cells (CHO).
  • the cells are retained using an ultrasound cell pressure retention system, which is preferably infinitely variable.
  • process parameters pH value, temperature, oxygen partial pressure, rate of rotation and composition of the medium are kept constant over the entire period of the fermentation in the range of technical deviations.
  • the productivity is at least 10, preferably at least 20, more preferably at least 25 and most preferably at least 30 mg erythropoietin / L fermentation supernatant.
  • the mean productivity is at least 10, preferably at least 15 mg erythropoietin / L fermentation supernatant.
  • the average specific productivity per cell and day amounts to at least 0.5 ⁇ g, more preferably at least 1.0 ⁇ g and more preferably at least 1.2 ⁇ g and very particularly preferably at least 1.4 ⁇ g of erythropoietin.
  • the mean vitality of the cells is at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 90% and most preferably at least 95%.
  • the process according to the invention is preferably carried out at a perfusion rate of between 0.5 and 3 during the fermentation, preferably between 1 and 2.5 and particularly preferably between 1.5 and 2.0.
  • the process according to the present invention is carried out over a period of at least 10, preferably of at least 20, more preferably of at least 30 days and most preferably of at least 40 days.
  • the glucose concentration in the culture supernatant is preferably set within a range of from 0.25 to 1.25 g / L and particularly preferably from 0.5 to 1.0 g / L.
  • the cell number in the bioreactor is preferably set within a range of 1, 0x10 7 to 4.0 x 10 7 cells / ml and particularly preferably in a range of 1.5xl0 7 to 3.0 x 10 7 cells / ml of fermentation medium.
  • the present invention relates to a process for the continuous fermentative production of erythropoietin, wherein eukaryotic EPO-producing cells are cultured in a perfusion reactor with retention of the cells, wherein the glucose concentration in the culture supernatant via the perfusion rate and the cell count on the Zellruckhalte- rate of a cell pressure maintenance device and / or regular discharge of defined amounts of cell-containing culture medium can be set within predetermined ranges.
  • a glucose content in the culture supernatant of 0.05 to 1.5 g / L, preferably from 0.25 to 1.25 g / L and particularly preferably from 0.5 to 1, has been determined for the present CHO cell line. 0 g / L proved to be advantageous.
  • the control of the perfusion rate is carried out according to the glucose content measurements in the reactor.
  • the cell density in the reactor is maintained in the range from 0.5 ⁇ 10 7 to 5.0 ⁇ 10 7 cells / mL by appropriate adjustment of the ultrasonic cell pressure maintenance or regular discharge of defined amounts of cell-containing culture medium.
  • the control of this parameter setting is accomplished by cell density measurements in the reactor.
  • Cultivation preferably takes place in serum- and protein-free medium.
  • the ingredients of such serum and protein-free culture media are known to those skilled in the art. They consist of a mixture of amino acids, fatty acids, vitamins, inorganic salts and hormones in various concentrations, as shown for example in EP-Bl 481 791 and WO88 / 00967 Al.
  • the culture medium has a decisive influence on the growth rate, cell density, translation and transcription of the host cells 5 and thus also on the glycosylation and sialylation pattern of the recombinantly produced protein.
  • serum-free media were used, as offered by various manufacturers, for example, the medium MAM-PF2 (distributed by Bioconcept, lo Allschwil, Switzerland), the media DMEM and DMENU12 (offered for example by Invitrogen / Gibco, Eggenstein, Germany) or the medium HyQPF CHO Liquid Soy (sold by HyCione / Perbio, Bonn, Germany, among others).
  • the EPO prepared according to the invention is preferably recombinant human erythropoietin produced in eukaryotic cells.
  • the recombinant EPO is produced in mammalian cells, more preferably in human cells and most preferably in CHO cells, e.g. generally described in EP-A-0 205 564 and EP-A-0 148 20 605.
  • EPO erythropoietin
  • the EPO may be the wild-type human erythropoietin or a variant thereof with one or more amino acids.
  • this variant is only in 1 to 20, preferably in only 1 to 15, more preferably in only 1 to 10, and most preferably in only 1 to 5 amino acid positions of human wild-type erythropoietin by amino acid substitutions, deletions or additions.
  • a CHO cell culture solution of 0.44 ⁇ 10 6 cells / mL was inoculated into a 10 L perfusion reactor (Applikon) equipped with a Biosep 50 (Applikon) in a volume of 10 L and kept for 3 days while maintaining the cultivation parameters held. On the 4th day, a 0.25-fold perfusion was started. The perfusion rate was successively in each 0.25 steps to max. increased to 2.5 times and then adjusted according to the glucose concentrations measured in the target range of glucose concentration (0.5 - 1.2 g / L). The target range for the cell number was adjusted by adjusting the cell retention rate of the ultrasound device and by discharging appropriate amounts of cell-containing culture medium.
  • the other fermentation conditions were:
  • Inoculum 0.44 x 10 6 cells / mL
  • HyQPF CHO Liquid Soy from Hyclone / Perbio
  • the base culture medium used was enriched with protein hydrolysates (Yeastolate from Becton Dickinson, HyPEP SR3 from Kerry Bio Science) and trace elements (CHO 4A TE Sock from Lonza).
  • the crops were filtered cell-free and subjected to a known to the expert processing and purification, consisting of 3 to 4 chromatography steps subjected.
  • FIG. 1 shows the time course of the glucose concentration or the EPO productivity ( ⁇ g EPO / ml) in the culture supernatant obtained by the process according to the invention.
  • FIG. 2 shows the time course of the vital cell number (vit. ZZ) and the EPO productivity in the culture supernatant as well as the perfusion according to the method according to the invention.
  • FIG. 3 shows the time profile of the percentage of vital cells in the totality of the cells in the culture supernatant and of the percentage of cell pressure retention according to the method according to the invention.
  • FIG. 4 shows the time course of the lactate or glutamate concentration in the culture supernatant, which is obtained by the method according to the invention.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen kontinuierlichen Herstellung von Erythropoietin, wobei eukaryontische Erythropoietin-produzierende Zellen in einem Perfusionsreaktor unter Rückhaltung der Zellen kultiviert werden, wobei die Glucosekonzentration im Kulturüberstand über die Perfusionsrate und die Zellzahl über die Zellrückhalterate und/oder das Ausschleusen definierter Mengen an zellhaltigem Kulturmedium aus dem Bioreaktor innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt werden.

Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen fermentativen Herstellung von Erythropoietin (EPO) . Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass es in einem Perfusionsreaktor mit Zellruckhaltung durchgeführt wird und der Fermentationsprozess dabei nur durch wenige ausgewählte Mess- und Regelparameter so gesteuert wird, dass sowohl die Produktivität des gewählten Wirtsorganismus hinsichtlich EPO als auch die Produktqualitat von EPO vor- teilhaft beeinflusst werden.
Erythropoietin, kurz EPO genannt, ist ein Glykoprotein, das die Bildung von Erythrocyten im Knochenmark anregt. EPO wird hauptsachlich in den Nieren gebildet und gelangt von dort aus über den Blutkreislauf zu seinem Zielort. Bei der Niereninsuffizienz produzieren die geschadigten Nieren zu wenig oder überhaupt kein EPO, was zur Folge hat, dass aus den Stammzellen des Knochenmarks zu wenige Erythrocyten hervorgehen. Diese sogenannte renale Anämie kann durch Verabreichung von EPO in physiologischen Mengen, die die BiI- düng von Erythrocyten im Knochenmark stimulieren, behandelt werden. Die therapeutische Wirkung und Anwendung von EPO ist beispielsweise in Eckardt K. U., Macdougall I. C, Lancet 2006, 368, 947-953, Jelkmann W.; Physiol. Rev. 1992, 72, 449-489, Eschbach J.W. et al . , N. Engl. J. Med., 1987, 316, 73-78, EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539, EP-B 0 205 564, Hu- ang S. L., PNAS 1984, 2708-2712, Lai, P. H. et al . , J. Biol. Chem. 1986, 261, 3116-3121, sowie in Dietzfelbinger H. et al . , Manual Supportive Maßnahmen und symptomorientierte Therapie, Tumorzentrum München, 2001, 70-77, ausfuhrlich beschrieben.
Das zur Verabreichung verwendete EPO kann entweder aus Humanurin gewonnen oder durch gentechnologische Methoden her- gestellt werden. Da EPO im menschlichen Korper nur in geringsten Mengen enthalten ist, ist die Isolierung von EPO aus der naturlichen Quelle für therapeutische Anwendungen praktisch unmöglich. Daher bieten gentechnische Methoden 5 die einzige wirtschaftliche Möglichkeit, diesen Stoff in größeren Mengen zu produzieren.
Die rekombinante Herstellung von Erythropoietin ist seit der Identifizierung des humanen Erythropoietin-Gens im Jahr 1984 möglich. Seit Anfang der 90er Jahre sind verschiedene lo Arzneimittel entwickelt worden, die humanes Erythropoietin enthalten, das auf biotechnologischem Weg in gentechnisch rekombinant veränderten, eukaryontischen Zellen produziert wurde. Die Herstellung von rekombinantem humanen Erythropoietin ist u.a. beschrieben in EP-A-O 148 605 und EP-A-205
15 564.
Für die Wirksamkeit mancher Proteine wie etwa Erythropoietin oder Interferon ist der sogenannte Sialylierungsgrad, also der Gehalt der mit dem Protein über Zuckerketten terminal verknüpften Sialinsauren, von entscheidender Bedeu-
20 tung. Dabei weisen im Allgemeinen die Proteine mit einem höheren Sialylierungsgrad eine höhere spezifische Aktivität auf. Solche Proteine wie etwa EPO, t-PA (Gewebsplasminogen- Aktivator) oder der Blutgerinnungsfaktor VIII, deren Aktivität u.a. von ihrem Sialylierungsgrad abhangig ist, werden
25 nach Stand der Technik in Kulturen von Saugetierzellen hergestellt, die zu einer solchen notwendigen, posttranslatio- nalen Glykosylierung bzw. Sialylierung des Proteins in der Lage sind. Die rekombinante Herstellung von EPO erfolgt dabei üblicherweise in Chinese-Hamster-Ovary (CHO) -
30 Wirtszellen. Wahrend diese früher in Kulturmedien kultiviert wurden, denen fötales Kalberserum und manchmal auch Rinderinsulin zugesetzt wurden, findet die Kultivierung heutzutage regelmäßig in serum- und proteinfreiem Medium statt. Auf diese Weise wird das Risiko von Kontaminationen mit bovinen Proteinen, bovinen Viren, boviner DNA oder anderen unerwünschten Substanzen ausgeschlossen. Die Inhaltsstoffe von solchen serum- und proteinfreien Kulturmedien sind dem Fachmann bekannt. Sie bestehen aus einer Mischung von Aminosäuren, Fettsauren, Vitaminen, anorganischen Salzen und Hormonen in unterschiedlichen Konzentrationen, wie sie beispielsweise in EP-Bl 481 791 und WO88/00967 Al aufgezeigt sind. Das Kulturmedium hat dabei maßgeblichen Ein- fluss auf die Wachstumsrate, Zelldichte, Translation und Transkription der Wirtszellen und damit u.a. auch auf das Glykosilierungs- und Sialylierungsmuster des rekombinant hergestellten Proteins. So werden in der Regel serumfreie Medien verwendet, wie sie von verschiedenen Herstellern angeboten werden, z.B. das Medium MAM-PF2 (u.a. vertrieben von Bioconcept, Allschwil, Schweiz) oder die Medien DMEM und DMENU12 (angeboten z.B. von Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Deutschland) .
Grundsatzlich lassen sich drei verschiedene Verfahrensweisen für die Kultivierung von Wirtszellen zur Produktion von rekombinanten Proteinen wie z.B. EPO unterscheiden:
Bei einem Batch-Prozess werden Medium und Zellen zu Beginn der Kultivierung in den Bioreaktor eingebracht. Bis zum Ende der Kultivierung werden weder Nährstoffe zugefugt noch Zellen aus dem Fermenter entfernt, lediglich Sauerstoff wird zugeführt. Wenn eines oder mehrere Substrate verbraucht sind, wird der Prozess beendet und die Produkte werden aus dem Fermentationsuberstand geerntet. Eine Variation dieses Batch-Prozesses ist der sogenannte Repeated Batch-Prozess, bei dem am Ende der Fermentation ein Teil des Kulturvolumens als Inokulum im Bioreaktor belassen, der Reaktor mit neuem Medium aufgefüllt und der Fermentations- prozess erneut gestartet wird. Ein Vorteil des Batch-Prozesses liegt in seiner einfachen technischen Umsetzbarkeit . Nachteilig ist jedoch, dass im Allgemeinen die Kapazität der Zellen zur Herstellung der rekombinanten Proteine wegen selektiver Nahrstoffverarmung im Kulturmedium sowie wegen der Anreicherung an für die
Zellen toxischer Stoffwechselprodukte wie z.B. Ammonium und Lactat nicht vollständig ausgeschöpft wird. Nachteilig ist ebenfalls, dass sich das im Batch-Fermenter anreichernde Produkt standig den sich ebenfalls anreichernden metaboli- sehen Enzymen ausgesetzt ist, wodurch die Produktqualitat und/oder -ausbeute negativ beeinflusst werden können. Wie in Gramer M. J. et al, Biotechnology 1995, 13, 692-698 beschrieben, gilt dies insbesondere für die sogenannte Siali- dasen, die die terminalen Sialinsauren von bereits gebilde- ten Glycoproteinen abzuspalten vermögen und damit die Ausbeute an gewünschtem hochgradig silalylierten Glycoprotein senken. Ein weiterer Nachteil des Batch-Prozesses liegt im ungunstigen Verhältnis zwischen der wegen des begrenzten Nahrstoffangebots für die Zellkultur zeitlich limitierten Produktionszeit (typischerweise im Bereich von 5 bis 10 Tagen) und der Gesamtzykluszeit, die zusatzlich die Zeit für den Aufbau, die Reinigung und die Sterilisation des Bioreaktors einbezieht (typischerweise im Bereich von bis zu 4 Tagen) .
Das zweite bekannte Kultivierungsverfahren ist das kontinuierliche Verfahren, bei dem standig frisches Medium zugeführt und im gleichen Maße Fermenterinhalt entnommen wird. So kommt es zu einer standigen Zufuhr von Nährstoffen, wobei gleichzeitig unerwünschte Stoffwechselprodukte wie die wachstumshemmenden Substanzen Ammonium und Lactat entfernt bzw. verdünnt werden. Daher können mit diesem Verfahren höhere Zelldichten erreicht und über einen vergleichsweise langen Zeitraum aufrechterhalten werden. Einen Spezialfall der kontinuierlichen Prozessfuhrung stellen sogenannte Dia- lysereaktoren dar, bei denen hochmolekulare Substanzen wie Proteine im Fermenter zurückgehalten werden, wahrend niedermolekulare Substanzen wie Substrate zugefugt oder die Hauptabfallprodukte Ammonium und Lactat aus dem System entfernt werden können. Neben diesen Vorteilen des kontinuier- liehen Verfahrens ergeben sich Nachteile insbesondere hinsichtlich der vergleichsweise erhöhten Gefahr der Kontamination durch Verunreinigungen der Zellruckhaltesysteme (typischerweise schwer zu reinigende Membranfilter) und der Ablagerung von Zellmaterial auf der Filteroberflache im Prozessverlauf, die zu einer Verringerung des Durchflusses bis hin zu einem vollständigen Verstopfen der Membran fuhren kann. Eine Alternative bieten Ultraschall-gestutzte Ruckhaltesysteme, in denen die Zellen durch eine stehende Ultraschallwelle am Austreten aus dem Fermentationsreaktor gehindert werden und keine Membranfilter mehr verwendet werden müssen.
Der Einsatz von Perfusionsreaktoren in der mikrobiellen Herstellung von chemischen Verbindungen und Proteinen mit verschiedenen Zeilruckaltesystemen ist allgemein bekannt und auch für EPO beschrieben (BioProcess International
2004, 46; Gorenflo et al . , Biotech. Bioeng. 2002, 80, 438; www.sonosep.com/biosep.htm; WO 95/01214) .
In diesem Zusammenhang werden z. B. von Wang M. D. et al . , Biotechnology and Bioengineering 2002, 77 (2), 194-203 ver- schiedene Systeme diskutiert, bei denen die Zellen auf mak- roporosen Beads gebunden werden und durch die Poren große Oberflachen besiedeln können, was zu hohen Zelldichten fuhrt. Die Nahrstoffversorgung erfolgt durch kontinuierliches Zufuhren frischen Mediums, wobei gleichzeitig die mit Zellen bewachsenen Beads nach oben geflutet werden. Anstelle von Beads lassen sich auch Polyesterscheibchen (ca. 1 cm im Durchmesser) in einen Ruhrreaktor packen und kontinuierlich mit frischem Medium durchströmen (Jixian D. et al . , Chinese Journal of Biotechnology 1998, 13 (4), 247-252) . Voraussetzung dafür ist allerdings, dass die Zellen adha- rent wachsen. Die Besiedelung von Tragern, unabhängig welcher Art und chemischer Zusammensetzung, haben den Nachteil, dass die Zellen so dicht einwachsen können, dass die inneren Lagen nicht mehr richtig versorgt werden und die dort angesiedelten Zellen die Produktion einstellen bzw. auch ungewunschte Metabolite in so hohem Maße freisetzen, dass sie nicht genügend abgeführt werden und damit die Pro- duktqualitat negativ beeinflussen können.
Das dritte mögliche Verfahren ist schließlich die Fed- Batch-Fermentation, bei der die Kultivierung in einem nur zu einem Bruchteil mit Kulturmedium gefüllten Fermenter gestartet wird und nach kurzer Anwachsphase nach und nach frisches Medium zugegeben wird. Dadurch werden höhere ZeIl- dichten und längere Prozesszeiten als im Batch-Verfahren ermöglicht. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass sich der Stoffwechsel der Zellen über das Maß der Zu- futterung beeinflussen lasst, was zu einer geringeren Produktion von Abfallsubstanzen fuhren kann. Gegenüber dem kontinuierlichen Verfahren wird hier das Produkt der Zellen über einen längeren Zeitraum im Fermenter akkumuliert und somit höhere Produktkonzentrationen erreicht, wodurch die anschließende Aufarbeitung erleichtert wird. Allerdings setzt dies voraus, dass das Produkt der Zellen stabil genug ist, um bei mehrtägiger Verweilzeit im Fermenter nicht en- zymatisch abgebaut oder anderweitig zersetzt zu werden. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist, dass sich die physiologischen Verhaltnisse im Bioreaktor durch die Zufutte- rung konzentrierter Substratlosungen nachteilig verandern können.
Ein Hauptproblem bei der Kultivierung von Saugetier-Zellen ist, die Zellen mit genügend Nährstoffen zu versorgen, ohne dass sich die Abbauprodukte der Nährstoffe über ein für die Zellphysiologie kritische Grenze hinaus anreichern. Als Hauptenergiequellen von tierischen Zellen dienen Glucose und Glutamin, deren Hauptabbauprodukte, Lactat bzw. Ammonium, in höheren Konzentrationen das Wachstum und den Stoffwechsel der Zellen hemmen und zum Absterben der Zellen fuh- ren (Hasseil et al . , Applied Biochemistry and Biotechnology 1991, 30, 29-41) . Daher ist es bei der Kultivierung tierischer Zellen vorteilhaft, bei ausreichender Nährstoffzufuhr die Akkumulation von Lactat und Ammonium zu verringern, um somit höhere Zelldichten und eine höhere Produktausbeute zu erreichen.
Eine Möglichkeit, die Produktion von Abfallprodukten zu reduzieren, besteht in der kontrollierten Substratzugabe, die auch als „Catabolic Control" bezeichnet wird. Dabei wird die Abhängigkeit des Zellmetabolismus von den im Fermentationsmedium angebotenen Konzentrationen der Nährstoffe ausgenutzt. Es konnte gezeigt werden, dass eine limitierende Zufutterung von Glutamin und/oder Glucose zu einer deutlich verminderten Produktion von Ammonium und Lactat bei Hybridoma-Zellen fuhrt (Ljunggren & Haggstrom, Biotechnology and Bioengineering 1994, 44, 808-818) .
In Fed-Batch-Kulturen, in denen die Glucosekonzentration durch kontrollierte Zugabe von konzentriertem Medium ange- passt wurde, konnte nach einiger Zeit eine Veränderung des Zellstoffwechsels beobachtet werden, die auch als „Metabo- lic Shift" bezeichnet wird. Dieser „Metabolie Shift" wird ausgelost durch die Limitierung der Glucose- und Glutamin- konzentration im Medium über mehrere Tage hinweg und fuhrt dazu, dass weniger Nährstoffe von den Zellen aufgenommen und verstoffwechselt werden. In der Folge steigt der Gehalt von Glucose und Glutamin im Kulturmedium an, wahrend die Produktion der Abfallstoffe Lactat und Ammonium wegen des verminderten Verbrauchs deutlich zurückgeht (Zhou et al . , Biotechnology and Bioengineering 1995, 46, 579-587) . Der „Metabolie Shift" wurde nicht nur bei Hybridoma-Zellen, sondern auch bei Zelllinien wie SPO, HEK-293, BHK und CHO beobachtet .
Durch den „Metabolie Shift" können hohe Zelldichten von u- ber 107 Zellen pro Milliliter bei zugleich vergleichsweise langen Prozesszeiten erreicht werden, da die Abfallprodukte Lactat und Ammonium nicht in Konzentrationen akkumulieren, die das Zellwachstum negativ regulieren. Wichtig ist dabei, dass die Zufutterungslosung an den Bedarf der Zellen ange- passt ist, um das Erreichen des „Metabolie Shift" zu ge- wahrleisten und sowohl Erschöpfung als auch übermäßige Akkumulation bestimmter Nährstoffe und damit ein starkes Ansteigen der Osmolalitat zu vermeiden (Xie und Wang, Bio- technology and Bioengineering 1994, 43, 1175-1189 und Bio- technology and Bioengineering 1996, 51, 725-729) . Weiterhin ist es von Bedeutung, den Zellen dennoch genügend Glucose als Substrat für die Glykosylierung der rekombinanten Proteine zur Verfugung zu stellen.
Damit die Konzentrationen der zugefuhrten Nährstoffe an den Verbrauch der Zellen angepasst werden können, werden in der Regel komplizierte Verfahren eingesetzt, um den momentanen Verbrauch der Zellen zu bestimmen und in der Folge die Zu- futterungsgeschwindigkeit bedarfsgerecht anzupassen. Dazu gehören unter anderem die Messung der Glucosekonzentration durch z.B. Fließinjektionsanalyse oder die Messung des Sau- erstoffVerbrauchs der Zellen.
So offenbart etwa US 6,180,401 ein Fed-Batch- Zellkulturverfahren, bei dem die Glucosekonzentration kontinuierlich gemessen und im Kulturmedium durch Anpassung der Zufutterung abhangig von den Messwerten innerhalb eines bestimmten Bereichs gehalten wird. Auch gemäß der Lehre der US 2002/0099183 wird die Zufutterungsrate von Glucose über die Glucosekonzentration bestimmt, wodurch die Glucosekon- zentration im Kulturmedium in einem bestimmten Bereich gehalten wird.
Eine bedarfsgerechte Nährstoffzugäbe, abhangig von der GIu- taminkonzentration im Kulturmedium, ist in EP-A-I 036 179 auf Basis eines Fed-Batch-Verfahrens beschrieben.
WO 97/33973 offenbart ein Kultivierungsverfahren, bei dem die Produktion eines elektrisch geladenen Stoffwechselprodukts anhand der Leitfähigkeit des Mediums gemessen und die Zufutterungsrate entsprechend angepasst wird.
US 5,912,113 beschreibt ein Fermentationsverfahren für Mikroorganismen, bei dem immer dann zugefuttert wird, wenn die Kohlenstoffquelle im Medium verbraucht ist und dadurch ein erhöhter pH-Wert oder eine erhöhte Gelostsauerstoffkon- zentration im Medium gemessen wird.
Neben technischen Prozessparametern wie dem zuvor diskutierten Nährstoffangebot in Form der Medienzusammensetzung spielen auch zelllinienspezifische Eigenschaften, die sich in unterschiedlichen Wachstumsraten, Produktionskinetik, Zellvitalitat, posttranslationaler Prozessierung zur Glyko- silierung und Sialylierung äußern können, eine zentrale Rolle für die Produktqualitat des erhaltenen EPO sowie die Gesamtproduktivitat des Fermentationsprozesses. Wie in Lloyd D. R. et al . , Cytotechnology 1999, 30, 49-57 beschrieben ist beispielsweise bekannt, dass je nach der Phase des Lebenszyklus, in der sich die produzierende Wirtzelle befindet, der Zellmetabolismus erhebliche Unterschiede aufweisen und somit im vorliegenden Fall EPO unterschiedlicher Mengen und Qualität insbesondere im Hinblick auf den Glyko- lisierungs- und Sialylierungsgrad gebildet werden kann. Da die fermentative Herstellung von EPO in eukaryontischen Zellen wegen der geschilderten aufwendigen Verfahren, den typischerweise vergleichsweise geringen Produktkonzentrationen im Fermentationsuberstand sowie der Verwendung von protein- und serumfreien Kulturmedien mit hochpreisigen Bestandteilen sehr kostspielig ist, besitzt die Entwicklung effizienterer Produktionsverfahren eine erhebliche Bedeutung.
Die technische Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Entwicklung eines Verfahrens zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin, das sowohl hinsichtlich der Einfachheit der Prozessfuhrung als auch hinsichtlich der Ausbeute an hochwertigem Erythropoietin gegenüber den Verfahren des Standes der Technik Vorteile aufweist. Das erhalte- ne EPO sollte dabei allen Anforderungen des offiziellen
Standards und insbesondere allen Anforderungen hinsichtlich der Isoformen-Zusammensetzung und des Glykosilierungs- bzw. Sialylierungsmusters entsprechen (Ph. Eur. 04/2002:1316) .
Die technische Aufgabe wird gelost durch ein Verfahren zur kontinuierlichen fermentativen Herstellung von Erythropoietin, in dem eukaryontische EPO-produzierende Zellen in einem Perfusionsreaktor unter Ruckhaltung der Zellen kultiviert werden, wobei die Glucosekonzentration im Reaktor über die Perfusionsrate des Kulturmediums und die Zellzahl im Reaktor über die Zellruckhalterate innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt werden.
Vorteilhafterweise wird in dem erfindungsgemaßen kontinuierlichen Verfahren zur fermentativen Herstellung von E- rythropoietin
a) zum einen die Perfusionsrate des Kulturmediums (als Regelparameter) in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration im Fermentationsreaktor (als Messparameter) und b) zum anderen die Zellruckhalterate der Zellruckhaltevor- richtung (als Regelparameter) in Abhängigkeit von der Zelldichte im Fermentationsreaktor (als Messparameter)
in geeigneter Weise innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt.
Alternativ zu oder in Kombination mit b) können auch in zeitlichen Abstanden bedarfsweise definierte Mengen zell- haltigen Kulturmediums aus dem Bioreaktor ausgeschleust und auf diese Weise eine bestimmte Zelldichte im Reaktor erreicht werden.
Die übrigen relevanten Prozessparameter wie z. B. pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffpartialdruck, Ruhrgeschwindigkeit sowie die Zusammensetzung des zugefuhrten Mediums werden über den gesamten Zeitraum der Fermentation vorzugsweise konstant gehalten.
Das geschilderte Verfahren kombiniert in neuartiger Weise verschiedene Maßnahmen zur Steigerung sowohl der Produktausbeute als auch der Produktqualitat von Erythropoietin :
(1) Durch die Perfusion wird sichergestellt, dass standig sowohl zelltoxische Stoffwechselprodukte ausgeschleust als auch frische Nährstoffe zugeführt werden, so dass im Bioreaktor sehr hohe Zelldichten erreicht werden und die Zellen über einen sehr langen Zeitraum produktiv sind.
(2) Um den bei Perfusionsprozessen typischerweise sehr hohen Verbrauch an kostspieligem Kulturmedium zu reduzieren und einen ökonomisch verbesserten Produktionsprozess zu ermöglichen, wird des weiteren die Perfusionsrate so gewählt, dass der Glucosegehalt im Kulturuberstand zwar einerseits eine für ein effizientes Zellwachstum notwendige Untergrenze nicht unterschreitet, andererseits jedoch in einer solchen Weise limitiert ist, dass im Zellstoffwechsel der „Metabolie Shift" eintritt und die toxischen Metabolite Lactat und Ammonium nur noch in reduziertem Umfang produziert werden und damit bei der Perfusion mit nur noch geringeren Mengen frischen Mediums ausgeschleust werden müssen.
(3) Durch geeignete Einstellung der Zellruckhalterate des regelbaren Zellruckhaltesystems bzw. durch das wiederholte Ausschleusen definierter Mengen an zellhaltigem Medium lasst sich zudem in der Fermentationslosung ein Zellkollektiv mit einem erhöhten relativen Anteil an solchen Zellen erzeugen, die noch nicht das Wachstumsplateau erreicht haben, sondern sich noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden und in besonderer Weise zur Produktion eines hochwertigen, dem offiziellen Standard entsprechenden EPO befähigt sind.
Die genannten Maßnahmen, Einstellen einer geeigneten Zellruckhalterate bzw. regelmäßiges Ausschleusen definierter Mengen zellhaltigen Kulturmediums bei gleichzeitigem Einstellen einer geeigneten Perfusionsrate, wirken synergistisch, so dass in einem für ein kontinuierliches Verfahren sehr einfachen und technisch leicht durchfuhrbaren Pro- zess in sehr hohen Ausbeuten über einen extrem langen Zeit- räum überraschenderweise ein Erythropoietin gewonnen werden kann, welches zu einen extrem hohen Anteil solches EPO aufweist, das den arzneimittelrechtlichen Anforderungen, insbesondere hinsichtlich seines Glykosilierungs- und Sialy- lierungsgrads sowie der Isoformenverteilung, gerecht wird.
Gemäß der Erfindung kann die Messung bzw. Überwachung der Glucosekonzentration und der Zellzahl kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Einstellung der Glucosekonzentration und der Zellzahl kontinuierlich. Die Einstellung der Glucosekonzentration erfolgt über die Perfusionsrate, d. h. indem frisches Kulturmedium enthaltend Glucose in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration im Fermentationsreaktor zugegeben wird.
In einem bevorzugten Verfahren gemäß Anspruch 1 werden die Glucosekonzen-tration im Kulturuberstand innerhalb eines Bereiches von 0,05 bis 1,5 g/L und die Zellzahl innerhalb eines Bereiches von 0,5xl07 bis 5,OxIO7 Zellen/mL eingestellt.
Weiterhin ist bevorzugt, dass die eukaryontischen Erythro- poietin-produzierenden Zellen Saugetier-Zellen, bevorzugt menschliche Zellen und besonders bevorzugt Chinese-Hamster- Ovary-Zellen (CHO) sind .
In einem weiteren bevorzugten Verfahren erfolgt die Ruck- haltung der Zellen unter Verwendung eines Ultraschall- Zellruckhaltesystems, das vorzugsweise stufenlos regelbar ist.
Weiterhin ist bevorzugt, dass die Prozessparameter pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffpartialdruck, Ruhrgeschwindigkeit und Medienzusammensetzung über den gesamten Zeitraum der Fermentation im Bereich technisch bedingter Abweichungen konstant gehalten werden.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfin- dungsgemaßen Verfahrens betragt die Produktivität mindes- tens 10, vorzugsweise mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 25 und ganz besonders bevorzugt mindestens 30 mg Erythropoietin/L Fermentationsuberstand. Vorzugsweise betragt die mittlere Produktivität mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15 mg Erythropoietin/L Fermentationsuber- stand. Bevorzugt ist weiterhin, dass die mittlere spezifische Produktivität pro Zelle und Tag mindestens 0,5 pg, weiter bevorzugt mindestens 1,0 pg und besonders bevorzugt mindestens 1,2 pg und ganz besonders bevorzugt mindestens 1,4 pg Erythropoietin betragt.
Bei Anwendung des erfindungsgemaßen Verfahrens betragt die mittlere Vitalität der Zellen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, besonders bevorzugt mindestens 80%, weiterhin bevorzugt mindestens 90% und ganz besonders bevorzugt mindestens 95%.
Das erfindungsgemaße Verfahren wird vorzugsweise mit einer Perfusionsrate wahrend der Fermentation zwischen 0,5 und 3, bevorzugt zwischen 1 und 2,5 und besonders bevorzugt zwischen 1,5 und 2,0 durchgeführt.
Vorteilhafterweise wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung über einen Zeitraum von mindestens 10, vorzugsweise von mindestens 20, besonders bevorzugt von mindestens 30 Tagen und ganz besonders bevorzugt von mindestens 40 Tagen durchgeführt.
In einer weiteren Ausfuhrungsform des Verfahrens wird die Glucosekonzentration im Kulturuberstand bevorzugt innerhalb eines Bereiches von von 0,25 bis 1,25 g/L und besonders bevorzugt von 0,5 bis 1,0 g/L eingestellt.
Die Zellzahl im Bioreaktor wird bevorzugt innerhalb eines Bereiches von 1,OxIO7 bis 4,0xl07 Zellen/mL und besonders bevorzugt in einem Bereich von l,5xlθ7 bis 3,0xl07 Zellen/mL Fermentationsmedium eingestellt. Detaillierte Beschreibung der Erfindung (beste Ausführungsform)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen fermentativen Herstellung von Erythropoietin, wobei eukaryontische EPO-produzierende Zellen in einem Perfusionsreaktor unter Ruckhaltung der Zellen kultiviert werden, wobei die Glucosekonzentration im Kulturuberstand über die Perfusionsrate und die Zellzahl über die Zellruckhalte- rate einer Zellruckhaltevorrichtung und/oder regelmäßiges Ausschleusen definierter Mengen zellhaltigen Kulturmediums innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt werden.
Dadurch, dass gemäß der Erfindung in einem kontinuierlichen Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin, vorzugsweise mittels CHO-Zellen, in einem Perfusionsreaktor mit einem stufenlos regelbaren Ultraschall- Zellruckhaltesystem a) zum einen die Perfusionsrate des Kulturmediums (als Regelparameter) in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration im Fermentationsreaktor (als Messparameter) und b) zum anderen die Zellruckhalterate der Zellruckhaltevor- richung (als Regelparameter) in Abhängigkeit von der Zelldichte im Fermentationsreaktor (als Messparameter) in geeigneter Weise zueinander innerhalb vorbestimmter Bereiche einstellt werden, wird in der Fermentationslosung ein Zellkollektiv mit einem erhöhten relativen Anteil an Zellen erhalten, die noch nicht das Wachstumsplateau erreicht haben, sondern sich noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Solche Zellen sind in besonderer Weise zur Produktion eines hochwertigen, dem offiziellen Standard entsprechenden EPO befähigt.
Beide Maßnahmen, das Einstellen einer geeigneten Zellruckhalterate bei gleichzeitigem Einstellen einer geeigneten Perfusionsrate, wirken synergistisch, so dass in einem für ein kontinuierliches Verfahren überraschend einfachen und technisch leicht durchfuhrbaren Prozess in überraschend hohen Ausbeuten von bis zu 30 mg/L Fermentationsuberstand ein EPO gewonnen werden kann, welches zu einen extrem hohen An- teil solches EPO aufweist, das den arzneimittelrechtlichen Anforderungen, insbesondere hinsichtlich seines Glykosilie- rungs- und Sialylierungsgrads sowie der Isoformenverteilung, gerecht wird.
Für die vorliegende CHO-Zelllinie hat sich durch Einstellen der Perfusionsrate ein Glucosegehalt im Kulturuberstand von 0,05 bis 1,5 g/L, bevorzugt von 0,25 bis 1,25 g/L und besonders bevorzugt von 0,5 bis 1,0 g/L als vorteilhaft erwiesen. Die Regelung der Perfusionsrate erfolgt entsprechend den Glucosegehaltsmessungen im Reaktor. In Kombinati- on hiermit wird die Zelldichte im Reaktor durch entsprechende Einstellung der Ultraschall-Zellruckhaltung bzw. regelmäßiges Ausschleusen definierter Mengen zellhaltigen Kulturmediums im Bereich von 0,5xl07 bis 5,0xl07 Zellen/mL gehalten. Weiter bevorzugt ist eine Zelldichte von 1,OxIO7 bis 4,0xl07 Zellen/mL und ganz bevorzugt eine Zelldichte von l,5xlθ7 bis 3,0xl07 Zellen/mL. Die Regelung dieser Parametereinstellung wird durch Zelldichtemessungen im Reaktor bewerkstelligt.
Gemäß der Erfindung werden alle anderen relevanten Prozess- parameter wie z. B. pH-Wert, Temperatur, Sauerstoffpartial- druck, Ruhrgeschwindigkeit und Medienzusammensetzung über den gesamten Zeitraum der Fermentation vorzugsweise konstant gehalten.
Die Kultivierung findet vorzugsweise in serum- und protein- freiem Medium statt. Die Inhaltsstoffe von solchen serum- und proteinfreien Kulturmedien sind dem Fachmann bekannt. Sie bestehen aus einer Mischung von Aminosäuren, Fettsauren, Vitaminen, anorganischen Salzen und Hormonen in unter- schiedlichen Konzentrationen, wie sie beispielsweise in EP- Bl 481 791 und WO88/00967 Al aufgezeigt sind. Das Kulturmedium hat dabei maßgeblichen Einfluss auf die Wachstumsrate, Zelldichte, Translation und Transkription der Wirtszellen 5 und damit u.a. auch auf das Glykosilierungs- und Sialylie- rungsmuster des rekombinant hergestellten Proteins. Für die vorliegende Erfindung wurden serumfreie Medien verwendet, wie sie von verschiedenen Herstellern angeboten werden, z.B. das Medium MAM-PF2 (u.a. vertrieben von Bioconcept, lo Allschwil, Schweiz), die Medien DMEM und DMENU12 (angeboten z.B. von Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Deutschland) oder das Medium HyQPF CHO Liquid Soy (u.a. angeboten von HyCIo- ne/Perbio, Bonn, Deutschland) .
Das erfindungsgemaß hergestellte EPO ist bevorzugt rekombi- 15 nantes humanes Erythropoietin, hergestellt in eukaryonti- schen Zellen. Bevorzugt wird das rekombinante EPO in Saugtier-Zellen, besonders bevorzugt in menschlichen Zellen und ganz besonders bevorzugt in CHO-Zellen hergestellt, wie z.B. allgemein beschrieben in EP-A-O 205 564 und EP-A-O 148 20 605.
Unter Erythropoietin (EPO) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes Protein verstanden, das in der Lage ist, die Erythrocyten-Bildung im Knochenmark zu stimulieren und gemäß dem in der Europaischen Pharmacopoeia (Ph. Eur.
25 04/2002:1316) beschriebenen Assay eindeutig als Erythropoietin identifiziert werden kann (Bestimmung der Aktivität in polyzythämischen oder normozythamischen Mausen) . Bei dem EPO kann es sich um das wildtypische humane Eythropoetin oder um eine Variante davon mit einem oder mehreren Amino-
30 saureaustauschen, -deletionen oder -additionen handeln.
Wenn es sich um eine Variante von EPO handelt, dann ist bevorzugt, dass diese Variante sich lediglich in 1 bis 20, bevorzugt in lediglich 1 bis 15, besonders bevorzugt in lediglich 1 bis 10, und ganz besonders bevorzugt in lediglich 1 bis 5 Aminosaurepositionen vom humanen Wildtyp- Erythropoietin durch Aminosaureaustausche, -deletionen oder -additionen unterscheidet.
Beispiel
Eine CHO-Zellkulturlosung mit 0,44 x 106 Zellen/mL wurde in einen 10 L-Perfusionsreaktor (Firma Applikon) , ausgestattet mit einem Biosep 50 (Firma Applikon) , in einem Volumen von 10 L inokuliert und 3 Tage unter Beibehaltung der Kultivierungsparameter gehalten. Am 4. Tag wurde mit einer 0,25- fachen Perfusion begonnen. Die Perfusionsrate wurde sukzessive jeweils in 0,25er Schritten bis max . zum 2,5-fachen gesteigert und dann entsprechend der jeweils gemessenen Glucosekonzentrationen in den Zielbereich der Glucosekon- zentration (0,5 - 1.2 g/L) eingeregelt. Der Zielbereich für die Zellzahl wurde durch Anpassung der Zellruckhalterate der Ultraschall-Vorrichtung und durch Ausschleusen von entsprechenden Mengen zellhaltigen Kulturmediums eingestellt. Die weiteren Fermentationsbedingungen waren:
Inokulum: 0,44 x 106 Zellen/mL
Basis-Medium: HyQPF CHO Liquid Soy von HyC- lone/Perbio
Reaktorvolumen : 10 L
pH-Wert: 7,2
Temperatur : 37°C Sauerstoffpartialdruck: 35%
Ruhrgeschwindigkeit 200 rpm
Zellruckhaltung : Biosep 50 Fermentationszeit: 47 Tage
Das verwendeten Basis-Kulturmedium wurde mit Protein- Hydrolysaten (Yeastolate von Becton Dickinson, HyPEP SR3 von Kerry Bio Science) und Spurenelementen (CHO 4A TE Sock von Lonza) angereichert.
Die Fermentation wurde hinsichtlich der analytischen Parameter EPO-Gehalt, Glucose-Gehalt, Glutamin-Gehalt, Gehalt an vitalen Zellen (absolut und relativ) , Zellruckhaltung und Perfusions dokumentiert. Die Daten sind in den Figuren 1 bis 4 zusammengefasst .
Wahrend des Fermentationslaufes wurden 776 L geerntet mit einer gesamten Menge von 12 g Roh-EPO. Die Produktivität lag im Mittel bei 15 μg/mL bei einer mittleren Zellzahl von l,6xlθ7 Zellen/mL, die maximale Zellzahl betrug 2,6xlO7 Zellen/mL bei einer maximalen Produktivität von über 30 μg/mL. Die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag lag bei 1,4 pg, die mittlere Perfusionsrate bei 1,9. Die Vitalität der Zellen lag zwischen 76 und 98%. Der mittlere Zellruckhalt mittels Biosep-System lag bei 85% (7-97%) .
Die angefallenen Ernten wurden zellfrei filtriert und einer dem Fachmann bekannten Aufarbeitung und Reinigung, bestehend aus 3 bis 4 Chromatographieschritten, unterzogen.
Als Ergebnis zeigte sich, dass mit dem erfindungsgemaßen Verfahren in überraschend hohen Ausbeuten ein Erythropoie- tin gewonnen werden kann, welches zu einen extrem hohen Anteil solches EPO aufweist, das den arzneimittelrechtlichen Anforderungen, insbesondere hinsichtlich seines Glykosilie- rungs- und Sialylierungsgrads sowie der Isoformenverteilung, gerecht wird. Beschreibung der Figuren
Figur 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Glucosekonzentra- tion bzw. der EPO-Produktivitat (μg EPO/mL) im Kulturuber- stand, der nach dem erfindungsgemaßen Verfahren erhalten wird.
Figur 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der vitalen Zellzahl (vit. ZZ) und der EPO-Produktivitat im Kulturuberstand sowie der Perfusion nach dem erfindungsgemaßen Verfahren.
Figur 3 zeigt den zeitlichen Verlauf des prozentualen An- teils vitaler Zellen an der Gesamtheit der Zellen im Kulturuberstand und des prozentualen Zellruckhaltes nach dem erfindungsgemaßen Verfahren.
Figur 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Lactat- bzw. der Glutamatkonzentration im Kulturuberstand, der nach dem er- findungsgemaßen Verfahren erhalten wird.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur kontinuierlichen fermentativen Herstellung von Erythropoietin, wobei eukaryontische Erythro- poietin-produzierende Zellen in einem Perfusionsreak- tor unter Ruckhaltung der Zellen kultiviert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucosekonzentration im Reaktor über die Perfusionsrate des Kulturmediums und die Zellzahl im Reaktor über die Zellruckhalterate innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
a) die Perfusionsrate des Kulturmediums in Abhängig¬ keit von der Glucosekonzentration im Reaktor innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt wird, und
b) die Zellruckhalterate der Zellruckhaltevorrich- tung in Abhängigkeit von der Zelldichte im Reak¬ tor innerhalb vorbestimmter Bereiche eingestellt wird und/oder zur Einstellung einer bestimmten Zelldichte im Reaktor in zeitlichen Abstanden definierte Mengen zellhaltigen Kulturmediums aus dem Reaktor ausgeschleust werden.
3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der kontinuierlichen fermentativen Herstellung unter Einsatz eukaryontischer Erythropoie- tin-produzierender Zellen ein Erythropoietin erhalten wird, das bevorzugt eine Variante des wildtypischen humanen Eythropoietins mit höchstens 10, besonders bevorzugt mit höchstens 5 Aminosaureaustauschen, - deletionen oder -additionen und ganz besonders bevorzugt eine Variante mit höchstens einem (r) Aminosaure- austausch, -deletion oder -addition ist.
4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Glucosekonzentration im Kulturuber- stand innerhalb eines Bereiches von 0,05 bis 1,5 g/L und die Zellzahl innerhalb eines Bereiches von 0,5xl07 bis 5,OxIO7 Zellen/mL eingestellt werden.
5. Das Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekenn- zeichnet, dass die eukaryontischen Erythropoietin- produzierenden Zellen Saugetier-Zellen, bevorzugt menschliche Zellen und besonders bevorzugt Chinese- Hamster-Ovary-Zellen sind.
6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da- durch gekennzeichnet, dass die Ruckhaltung der Zellen unter Verwendung eines Ultraschall- Zellruckhaltesystems erfolgt.
7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationslosung ei- ne Zellpopulation mit einem erhöhten relativen Anteil an Zellen enthalt, die sich noch in ihrer exponentiel- len Wachstumsphase befinden.
8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessparameter pH- Wert, Temperatur, Sauerstoffpartialdruck, Ruhrgeschwindigkeit und Zusammensetzung des zugefuhrten Kulturmediums über den gesamten Zeitraum der Fermentation konstant gehalten werden.
9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, da- durch gekennzeichnet, dass die Produktivität mindes- tens 10, bevorzugt mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 25 und ganz besonders bevorzugt mindestens 30 mg Erythropoietin/L Fermentationsuberstand betragt.
10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, da- durch gekennzeichnet, dass die mittlere spezifische
Produktivität pro Zelle und Tag mindestens 0,5 pg, bevorzugt mindestens 1,0 pg, besonders bevorzugt mindestens 1,2 pg und ganz besonders bevorzugt mindestens 1,4 pg Erythropoietin betragt.
11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Vitalität der Zellen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, besonders bevorzugt mindestens 80%, weiterhin bevorzugt mindestens 90% und ganz besonders bevorzugt min- destens 95% betragt.
12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusionsrate wahrend der Fermentation zwischen 0,5 und 3, bevorzugt zwischen 1 und 2,5 und besonders bevorzugt zwischen 1,5 und 2,0 betragt.
13. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es über einen Zeitraum von mindestens 10, bevorzugt von mindestens 20, besonders bevorzugt von mindestens 30 Tagen und ganz besonders bevorzugt von mindestens 40 Tagen durchgeführt wird.
14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucosekonzentration im Kulturuberstand innerhalb eines Bereiches von 0,25 bis 1,25 g/L, bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 1,0 g/L eingestellt wird.
15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellzahl innerhalb des Fermentationsreaktors in einem Bereich von 1,OxIO7 bis 4,OxIO7 Zellen/mL, bevorzugt von l,5xlθ7 bis 3,0xl07 Zellen/mL Fermentationsmedium eingestellt wird.
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