DE60313188T2

DE60313188T2 - Verfahren und medien zur kontrolle der sialysierung von proteinen, die von säugetierzellen produziert werden

Info

Publication number: DE60313188T2
Application number: DE60313188T
Authority: DE
Inventors: Brian D. Seattle FOLLSTAD
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2023-07-15
Also published as: WO2004008100A3; AU2003249055B2; ATE359358T1; CY1107689T1; US7645609B2; DE60313188D1; CA2492267A1; PL376381A1; ES2285188T3; MXPA05000552A; SI1543106T1; EP1543106A2; EP1543106A4; DK1543106T3; JP2005532813A; AU2003249055A1; WO2004008100A2; JP4510938B2; PT1543106E; CA2492267C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren und Medien zur Kontrolle der Sialylierung eines Proteins, das von kultivierten Zellen produziert wird.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Proteine sind bei einer Vielfalt von diagnostischen, pharmakologischen, landwirtschaftlichen, ernährungswissenschaftlichen und Forschungsanwendungen von Nutzen. Angesichts der hohen Kosten des Produzierens von Proteinen, insbesondere therapeutischen Proteinen, können selbst geringe Steigerungen der Effizienz der Produktion oder der Funktion und Stabilität eines Proteins wertvoll sein. Die Funktion und Stabilität und folglich der Nutzen eines Proteins können von der posttranslationalen Anlagerung von Zuckerresten an das Protein, um ein Glykoprotein zu bilden, beeinträchtigt werden. Zum Beispiel verlängert die Anlagerung von terminalen Sialinsäureresten an Polysaccharide, die an einem Glykoprotein angefügt sind, im Allgemeinen die Lebensdauer des Proteins im Blutstrom und kann in bestimmten Fällen auch die Löslichkeit, Wärmebeständigkeit, Resistenz gegenüber einem Proteaseangriff, Antigenität und spezifische Aktivität einiger Glykoproteine beeinträchtigen. Siehe z. B. Gu und Wang (1998), Biotechnol. und Bioeng. 58(6): 642-648; Morell et al. (1968), J. Biol. Chem. 243(1): 155-159. Es ist daher wünschenswert, den Gehalt an Sialinsäure eines Glykoproteins zu erhöhen, insbesondere eines Glykoproteins, das für pharmakologische Anwendungen eingesetzt werden soll.
ZUSAMMENFASSUNG
Die Erfindung stellt Medien und Verfahren zum Kultivieren von Säugetierzellen bereit, um ein Protein zu produzieren, gegebenenfalls ein sekretiertes rekombinantes Protein, um den Gehalt an Sialinsäure des Proteins zu kontrollieren oder gegebenenfalls zu erhöhen. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Kontrolle des Gehalts an Sialinsäure eines Proteins, produziert durch Säugetierzellen, bereit, umfassend die Kultivierung der Zellen in Suspension in einem Medium, umfassend Galaktose und Fruktose. Das Medium kann serumfrei sein und kann außerdem N-Acetylmannosamin und/oder Mannose umfassen. Die Konzentrationen der Galaktose, Mannose und Fruktose können jeweils bei etwa 0,1 mM bis etwa 40 mM, bei etwa 0,5 mM bis etwa 20 mM, bei etwa 1 mM bis etwa 10 mM oder bei etwa 1 mM bis etwa 5 mM liegen. Die Konzentration des N-Acetylmannosamins kann bei mindestens etwa 0,8 mM, gegebenenfalls mindestens etwa 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM oder 20 mM liegen. Das Protein kann ein sekretiertes, rekombinantes Protein sein und die Säugetierzellen können CHO- (Chinesische Hamster-Ovar-) Zellen sein. Die Zellen können bei einer Temperatur von etwa 29°C bis etwa 36°C kultiviert werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Medium bereit, gegebenenfalls ein serumfreies Medium, zur Kultivierung von Säugetierzellen, umfassend Galaktose, Fruktose und Mannose und gegebenenfalls N-Acetylmannosamin. Galaktose, Mannose und Fruktose können in Konzentrationen von jeweils etwa 0,1 mM bis etwa 40 mM, von jeweils etwa 0,5 mM bis etwa 20 mM, von jeweils etwa 1 mM bis etwa 10 mM oder von jeweils etwa 1 mM bis etwa 5 mM vorliegen. N-Acetylmannosamin kann in einer Konzentration von mindestens etwa 0,8 mM, 1 mM, 10 mM, 15 mM oder 20 mM vorliegen.
In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle des Sialinsäuregehalts eines Proteins, umfassend die Kultivierung einer Säugetierzelle, die das Protein in einem Medium produziert, umfassend N-Acetylmannosamin und Galaktose. Das Medium kann ferner Fruktose und Mannose umfassen. Gegebenenfalls können Fruktose und Mannose in einer Konzentration von etwa 1,5 mM bis etwa 4,5 mM vorliegen. Fruktose und Mannose können die gleiche Konzentration oder unterschiedliche Konzentrationen aufweisen. Die Zelle kann bei einer Temperatur von etwa 29°C bis etwa 37°C, gegebenenfalls bei einer Temperatur von etwa 29°C bis etwa 36°C oder von etwa 30°C bis etwa 35°C kultiviert werden. Die Konzentration von N-Acetylmannosamin im Medium kann bei mindestens etwa 0,8 mM liegen und die Konzentration von Galaktose im Medium kann bei etwa 1,5 mM bis etwa 4,5 mM liegen. Das Protein kann ein sekretiertes Protein und/oder ein rekombinantes Protein sein und kann in einer CHO-Zelle produziert werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Medium zur Kultivierung von Säugetierzellen, in dem Galaktose, Fruktose und N-Acetylmannosamin und gegebenenfalls auch Mannose kombiniert sind. Fruktose kann in einer Konzentration von etwa 1,5 mM bis etwa 4,5 mM vorliegen und Mannose kann in einer Konzentration von etwa 1,5 mM bis etwa 4,5 mM vorliegen. N-Acetylmannosamin kann in einer Konzentration von mindestens etwa 0,8 mM vorliegen und Galaktose kann in einer Konzentration von etwa 1,5 mM bis etwa 4,5 mM vorliegen. Die Säugetierzellen können CHO-Zellen sein und das Medium kann serumfrei sein.
Des Weiteren stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Erhöhen der Produktion eines Proteins durch Kultivierung von Säugetierzellen, die das Protein exprimieren, bereit, das die Kultivierung der Säugetierzellen, gegebenenfalls bei einer Temperatur von etwa 29°C bis etwa 35°C, in einem Medium, umfassend Fruktose, Mannose und Galaktose, umfasst. Das Medium kann außerdem N-Acetylmannosamin umfassen. Die Konzentration der Galaktose, Mannose und Fruktose kann jeweils bei etwa 1,5 mM bis etwa 4,5 mM liegen. Die Konzentrationen der Galaktose, Mannose und Fruktose können gleich sein oder sich voneinander unterscheiden. Die Konzentration des N-Acetylmannosamins kann bei mindestens etwa 0,8 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM oder 20 mM liegen und das Medium kann serumfrei sein. Die Säugetierzellen können CHO-Zellen sein und das Protein kann ein sekretiertes, rekombinantes Protein sein.
Schließlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle des Sialinsäuregehalts eines rekombinanten Proteins bereit, umfassend die Kultivierung von Säugetierzellen, die das rekombinante Protein exprimieren, bei einer Temperatur von etwa 29°C bis etwa 36°C oder von etwa 29°C bis etwa 35°C in einem Medium, umfassend Fruktose, Galaktose, Mannose und N-Acetylmannosamin, worin die Konzentrationen der Fruktose, Galaktose und Mannose im Medium bei jeweils etwa 1,0 mM bis etwa 5,0 mM oder bei jeweils etwa 1,5 mM bis etwa 4,5 mM liegen und worin die Konzentration des N-Acetylmannosamins im Medium bei mindestens 0,8 mM liegt. Die Konzentrationen der Fruktose, Mannose und Galaktose können gleich sein oder sich voneinander unterscheiden.
Die Erfindung stellt außerdem eine Verwendung eines Mediums, umfassend N-Acetylmannosamin und Galaktose, zur Kontrolle des Sialinsäuregehalts eines Proteins, das durch eine Säugetierzelle produziert wird, bereit.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt ein Netz von Stoffwechselwegen, die zur Sialylierung von Glykoproteinen führen. Corfield und Schauer (1979), Biol. Cellulaire 35: 213-226; Gu und Wang (1998), Biotechnol. and Bioeng. 58(6): 642-648. In der Erfindung verwendete Moleküle sind von Kästchen umgeben. Negative Rückführung ist durch ein Minuszeichen neben einem Pfeil, eine gestrichelte Linie aufweisend, gezeigt.
2 vergleicht die bei hohem Salzgehalt eluierende Fraktion der extrazellulären Region des Tumornekrosefaktorrezeptors, der an die Fc-Region eines Antikörpers fusioniert ist (TNFR:Fc, die in der US-Patentschrift Nr. 5,395,760 beschrieben ist), auf einer Anionenaustauschersäule, wobei TNFR:Fc von Kulturen produziert wird, die in Medien mit den angegebenen Zusatzstoffen gezüchtet wurden. Alle Proben, einschließlich der von einer Kultur ohne Zusatzstoffe produzierten (als „Kontrolle" bezeichnet), werden mit einem einzigen Batch von TNFR:Fc verglichen, das in einem separaten Versuch von Kulturen produziert wurde, die ohne Medienzusatzstoffe gezüchtet wurden.
3 ist ein Konturdiagramm, das unter Anwendung der JMP-Computersoftware (im Folgenden beschrieben) erstellt wurde und die Mol von N-Acetylneuraminsäure (NANA) pro Mol TNFR:Fc zeigt (fettgedruckt und neben jedem Datenpunkt, der in diesem Versuch erfasst wurde, von einem Kästchen umgeben und als Teil jeder Konturlinie beschriftet), das von kultivierten Zellen produziert wurde, die in Medien mit den angegebenen Konzentrationen von N-Acetylmannosamin und Zuckern (Fruktose, Galaktose und Mannose) gezüchtet wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
DEFINITIONEN
Ein Antikörper, wie hierin verwendet, ist ein Protein oder ein Komplex aus Proteinen, von denen jedes mindestens eine oder gegebenenfalls mindestens zwei variable Antikörper-Immunglobulindomänen umfasst. Antikörper können einkettige Antikörper, dimere Antikörper oder ein beliebiger Komplex aus Proteinen höherer Ordnung sein, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, heterodimere Antikörper und tetramere Antikörper.
Eine konstante Antikörper-Immunglobulindomäne ist eine Immunglobulindomäne, die mit einer C_L-, C_H1-, C_H2-, C_H3- oder C_H4-Domäne menschlichen oder tierischen Ursprungs identisch ist oder dieser im Wesentlichen ähnlich ist. Siehe z. B. Hasemann und Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, in William E. Paul, Hrsg., Fundamental Immunology, Zweite Ausgabe, 209, 210-218 (1989). Eine Antikörper-Immunglobulindomäne ist mindestens 10 Aminosäuren lang, gegebenenfalls mindestens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Aminosäuren lang.
Ein F_C-Teil eines Antikörpers beinhaltet die menschlichen oder tierischen Immunglobulindomänen C_H2 und C_H3 oder Immunglobulindomänen, die diesen im Wesentlichen ähnlich sind. Zwecks einer Erörterung, siehe Hasemann und Capra, oben, auf 212-213.
Ein Glykoprotein, wie hierin verwendet, ist ein Protein, das mittels der Anlagerung eines oder mehrerer Kohlenhydrate, einschließlich insbesondere der Anlagerung eines oder mehrerer Zuckerreste, modifiziert wurde.
Ein Oligosaccharid oder Polysaccharid ist eine Kette aus zwei oder mehr Zuckerresten, die mittels kovalenter chemischer Bindungen verknüpft sind.
Sialylierung, wie hierin verwendet, ist die Anlagerung eines Sialinsäurerests an ein Protein, bei dem es sich um ein Glykoprotein handeln kann.
Der Ausdruck Sialinsäure, wie hierin verwendet, umfasst eine Familie von Zuckern, die 9 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten, einschließlich einer Carboxylgruppe. Eine generische Struktur, die alle bekannten natürlichen Formen von Sialinsäure umfasst, ist unten gezeigt.
R1-Gruppen an verschiedenen Stellungen an einem einzigen Molekül können gleich sein oder sich voneinander unterscheiden. R1 kann ein Wasserstoff oder eine Acetyl-, Lactyl-, Methyl-, Sulfat-, Phosphat-, Anhydro-, Sialinsäure-, Fukose-, Glukose- oder Galaktosegruppe sein. R2 kann eine N-Acetyl-, N-Glykolyl-, Amino-, Hydroxyl-, N-Glykolyl-O-acetyl- oder N-Glykolyl-O-methylgruppe sein. R3 steht für den vorangehenden Zuckerrest in einem Oligosaccharid, an das Sialinsäure im Zusammenhang eines Glykoproteins angefügt ist. R3 kann Galaktose (an deren 3-, 4- oder 5-Stellung angebunden), N-Acetylgalaktose (an deren 6-Stellung angebunden), N-Acetylglukose (an deren 4- oder 6-Stellung angebunden), Sialinsäure (an deren 8- oder 9-Stellung angebunden) oder 5-N-Glykolylneuraminsäure sein. Essentials of Glycobiology, Kap. 15, Varki et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999). In der Natur wurden mehr als 40 Formen von Sialinsäure gefunden. Essentials of Glycobiology, Kap. 15, Varki et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999). Eine gewöhnliche Form von Sialinsäure ist N-Acetylneuraminsäure (NANA), in der R1 ein Wasserstoff an allen Stellungen ist und R2 eine N-Acetylgruppe ist.
Im Wesentlichen ähnliche Proteine sind in Bezug auf die Aminosäuresequenz zu mindestens 80 %, gegebenenfalls mindestens 90 % zueinander identisch und bewahren die biologische Aktivität des unveränderten Proteins oder verändern dies in wünschenswerter Weise. Die prozentuale Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nukleinsäuresequenzen kann mittels Sichtprüfung und mathematischer Berechnung ermittelt werden oder der Vergleich kann mehr bevorzugt mittels Vergleichens von Sequenzinformationen unter Anwendung eines Computerprogramms vorgenommen werden. Ein beispielhaftes Computerprogramm ist das Programm Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI, USA) Wisconsin-Paket, Version 10.0, „GAP" (Devereux et al. (1984), Nucl. Acids Res. 12: 387). Die bevorzugten Standardparameter für das „GAP"-Programm beinhalten: (1) Die GCG-Implementierung einer monadischen Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Ungleichheiten enthält) für Nukleotide und die gewichtete Aminosäurenvergleichsmatrix von Gribskov und Burgess (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrsg., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353-358 (1979), beschrieben; oder andere vergleichbarer Vergleichsmatrizen; (2) eine Penalty (Minuspunkte) von 30 für jedes Gap (Lücke) und eine zusätzliche Penalty von 1 für jedes Symbol in jedem Gap für Aminosäuresequenzen oder eine Penalty von 50 für jedes Gap und eine weitere Penalty von 3 für jedes Symbol in jedem Gap für Nukleotidsequenzen; (3) keine Penalty für End-Gaps und (4) keine maximale Penalty für lange Gaps. Die Regionen der zwei Proteine, die mittels GAP zum Vergleich angeglichen (Alignment) werden, sind mindestens 10 Aminosäuren lang, gegebenenfalls 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250 oder 300 Aminosäuren lang. Andere Programme, die von Fachmännern der Technik des Sequenzvergleichs verwendet werden, können ebenfalls eingesetzt werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass die gewählten Parameter sich auf die prozentuale Identität auswirken können und dies noch mehr tun, wenn die Sequenzen unähnlich sind.
Eine variable Antikörper-Immunglobulindomäne ist eine Immunglobulindomäne, die mit einer V_L-Domäne oder einer V_H-Domäne menschlichen oder tierischen Ursprungs identisch ist oder dieser im Wesentlichen ähnlich ist. Eine variable Antikörper-Immunglobulindomäne ist mindestens 10 Aminosäuren lang, gegebenenfalls mindestens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Aminosäuren lang.
BESCHREIBUNG
Die Anlagerung von Kohlenhydraten an Proteine (hier als die Glykosylierung von Proteinen bezeichnet) und die anschließende Verarbeitung dieser Kohlenhydrate können sich auf das Falten, die Stabilität und die Funktionseigenschaften eines Proteins auswirken. Lodish et al., Molecular Cell Biology, Kapitel 17, W.H. Freeman, New York (2000). Zum Beispiel misslingt es dem Hämagglutinin-Vorläuferprotein, in Gegenwart von Tunicamycin, einem Antibiotikum, das die Produktion eines Oligosaccharid-Vorläufers stört, der für die N-Glykosylierung erforderlich ist (im Folgenden beschrieben), korrekt zu falten. Id. Darüber hinaus wird eine unglykosylierte Form von Fibronectin normalerweise von Fibroblasten sekretiert, wird jedoch schneller als glykosyliertes Fibronectin abgebaut. Lodish et al., oben.
Die meisten sekretierten Proteine und Zelloberflächenproteine enthalten mindestens eine Kohlenhydratkette; darüber hinaus werden zahlreiche zytoplasmatische und nukleäre Proteine ebenfalls glykosyliert. Lodish et al., oben; Essentials of Glycobiology, Kap. 13, Varki et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999). Eine Menge von Enzymen, die Proteine glykosylieren können, befinden sich in dem endoplasmatischem Retikulum und dem Golgi-Apparat, Organellen, die sekretiert wurden, und Zelloberflächenproteine durchqueren ihren Weg zur Zellmembran und darüber hinaus. Die Identifizierung von nukleären und/oder zytoplasmatischen Enzymen, die ähnliche Funktionen ausführen können, bleibt ungewiss. Essentials of Glycobiology, Kap. 13, Varki et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999).
Obwohl es sich bei Proteinglykosylierung um einen komplexen und veränderlichen Vorgang handelt, können Kohlenhydratmodifikationen von Proteinen grob in zwei Klassen eingeteilt werden, O-Glykosylierung und N-Glykosylierung. Beide beinhalten die Anlagerung von Oligosacchariden an spezifische Aminosäuren in einem Protein. O-verknüpfte Polysaccharide werden mit einer Hydroxylgruppe verknüpft, für gewöhnlich der Hydroxylgruppe von entweder einem Serinrest oder einem Threoninrest. O-Glykane werden nicht an jeden Serin- oder Threoninrest angelagert und die Kriterien zur Bestimmung, welche Serine und Threonine glykosyliert werden, sind nicht vollständig aufgeklärt. O-Glykane umfassen für gewöhnlich eine oder mehrere Verzweigungen und umfassen eine bis vier unterschiedliche Arten von Zuckerresten, die nacheinander angelagert werden. Oftmals ist der terminale Rest eine Sialinsäure. Im Gegensatz dazu werden N-verknüpfte Polysaccharide an den Amidstickstoff eines Asparagins angelagert. Nur Asparagine, die Teil einer von zwei Tripeptidsequenzen sind, entweder Asparagin-X-Serin oder Asparagin-X-Threonin (wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist), sind Glykosylierungsziele. Der erste Schritt bei der N-Glykosylierung beinhaltet die Anlagerung eines komplexen, im Voraus gebildeten, verzweigten Oligosaccharids, das aus drei Glukoseresten, neun Mannoseresten und zwei N-Acetylglukosaminresten besteht. Dieses Oligosaccharid wird mittels einer komplexen und veränderlichen Reihe von Schritten weiter verarbeitet, was in der Entfernung und der Anlagerung von verschiedenen Zuckerresten resultiert. Im Endprodukt kann der terminale Rest an jeder Verzweigung des Polysaccharids eine Sialinsäure sein, ist dies jedoch nicht immer. Lodish et al., oben. N-Glykane können eine bis fünf Verzweigungen aufweisen. Varki et al., oben.
Vorherige Arbeiten haben ein Netz biosynthetischer Wege erörtert, die zu der Anlagerung von Sialinsäure an Proteine führen, wie in 1 dargestellt. Gu und Wang, oben; Corfield und Schauer, oben. Eine große Vielfalt von Molekülen ist an verschiedenen Stufen der Synthese von Sialinsäure und deren Anfügung an Glykoproteine beteiligt, einschließlich Zuckern wie Glukose, Mannose, Fruktose und Galaktose, Nukleotiden wie ATP und CTP und eine Menge von Enzymen, die zum Katalysieren der zahlreichen involvierten biosynthetischen Schritte erforderlich sind, um nur einige wenige der zahlreichen involvierten Moleküle zu nennen. 1 stellt auch zwei Punkte in diesem Netz von Wegen da, von denen bekannt ist, dass eine Inhibition durch negative Rückführung auftritt (gestrichelte Linien mit Pfeilspitzen). Des Weiteren haben Gu und Wang (oben) berichtet, dass das Zusetzen von N-Acetylmannosamin zu Kulturmedium in einer gesteigerten Sialylierung eines Proteins resultiert, das von den kultivierten Zellen produziert wird. Der gewerbliche Nutzen von N-Acetylmannosamin ist jedoch gegenwärtig durch dessen Kosten beschränkt und daher werden Kulturbedingungen oder andere Medienzusatzstoffe mit ähnlichen oder besseren Wirkungen benötigt.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Sialylierung eines Glykoproteins, das von einer Zellkultur produziert wird, bereit, das das Zugeben von N-Acetylmannosamin und Galaktose zu der Zellkultur umfasst. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Sialylierung eines Glykoproteins, das von einer Zellkultur produziert wird, bereit, das das Kultivieren von Zellen in Medium umfasst, das N-Acetylmannosamin Galaktose, Fruktose und Mannose umfasst. Alternativ kann die Sialylierung mittels Kultivierens der Zellen in einem Medium erhöht werden, das Galaktose und Fruktose und gegebenenfalls außerdem N-Acetylmannosamin und/oder Mannose umfasst. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Verbesserung eines Verfahrens zum Produzieren eines Proteins, das das Kultivieren von Säugetierzellen umfasst, die das Protein exprimieren, bei einer Temperatur unterhalb von 37°C, gegebenenfalls von etwa 29°C bis etwa 36°C oder von etwa 29°C bis etwa 35°C oder von etwa 30°C bis etwa 33°C in einem Medium, das N-Acetylmannosamin umfasst. In einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Kulturmedium für Säugetierzellen bereit, das N-Acetylmannosamin, Galaktose und gegebenenfalls außerdem Fruktose und/oder Mannose umfasst. Die Konzentration von N-Acetylmannosamin kann bei mindestens etwa 0,8 Millimol (mM), gegebenenfalls mindestens etwa 2 mM, mindestens etwa 3 mM, mindestens etwa 4 mM, mindestens etwa 5 mM, mindestens etwa 10 mM oder mindestens etwa 20 mM liegen und die Konzentration von Galaktose kann bei etwa 1 mM bis etwa 5 mM, gegebenenfalls bei etwa 2 mM bis etwa 4 mM oder bei etwa 2,5 mM bis etwa 3,5 mM liegen. Die Konzentrationen von Fruktose und Mannose, falls vorhanden, können gleich sein oder sich voneinander und denen von Galaktose und N-Acetylmannosamin unterscheiden. Die Konzentrationen von Fruktose und Mannose können bei jeweils etwa 1 mM bis etwa 5 mM, gegebenenfalls bei jeweils etwa 2 mM bis etwa 4 mM oder bei jeweils etwa 2,5 mM bis etwa 3,5 mM liegen.
Alternativ stellt die Erfindung ein Kulturmedium für Säugetierzellen bereit, das Fruktose und Galaktose und außerdem Mannose und/oder N-Acetylmannosamin umfasst. Fruktose, Galaktose und Mannose können jeweils in Konzentrationen von jeweils etwa 0,1 mM bis jeweils etwa 40 mM, gegebenenfalls von jeweils etwa 0,5 mM bis jeweils etwa 20 mM, von jeweils etwa 1,0 mM bis jeweils etwa 10 mM oder von jeweils etwa 1,0 mM bis jeweils etwa 5 mM vorliegen. Fruktose, Galaktose und Mannose können in gleichen oder unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen. N-Acetylmannosamin kann in einer Konzentration von mindestens 0,8 Millimol (mM), gegebenenfalls mindestens etwa 2 mM, mindestens etwa 3 mM, mindestens etwa 4 mM, mindestens etwa 5 mM, mindestens etwa 10 mM oder mindestens etwa 20 mM vorliegen.
Des Weiteren umfasst die Erfindung ein Kulturmedium für Säugetierzellen, das Fruktose, Galaktose und Mannose umfasst, die in Konzentrationen von jeweils etwa 0,1 mM bis jeweils etwa 40 mM, gegebenenfalls von jeweils etwa 0,5 mM bis jeweils etwa 20 mM, von jeweils etwa 1,0 mM bis jeweils etwa 10 mM oder von jeweils etwa 1,0 mM bis jeweils etwa 5 mM vorliegen können. Fruktose, Galaktose und Mannose können in gleichen oder unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen.
In einem Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren von Säugetierzellen bereit, das das Züchten einer Säugetierzelle, die gentechnisch verändert wurde, um ein Protein zu produzieren, in Kultur und das Zugeben von N-Acetylmannosamin, Galaktose und gegebenenfalls außerdem Fruktose und/oder Mannose umfasst. In einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren einer Säugetierzelle, die gentechnisch verändert wurde, um ein Protein zu produzieren, in einem Medium, das N-Acetylmannosamin umfasst, bei einer Temperatur unterhalb 37°C bereit. Eine Art von gentechnisch veränderter Zelle ist eine Zelle, die mit einem rekombinanten Vektor, der das Protein kodiert, transformiert wurde. Das Protein kann unter der Kontrolle eines starken viralen Promotors (z. B. entweder ein CMV-Promotor (CMV = cytomegalovirus, Zytomegalievirus) oder ein SV40-Virus-Promoter (SV40 = Simianvirus 40) oder eines induzierbaren Promotors (z. B. eines Metallothionein-Promotors oder eines auf Tetracyclin reagierenden Promotors, wie in zum Beispiel Gossen und Bujard (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551) exprimiert werden. In der Regel exprimiert die Zelle naturgemäß das Protein nicht oder exprimiert das Protein nur in sehr niedrigen Niveaus (bei Fehlen von gentechnischer Veränderung).
Ein Protein wird im Allgemeinen als ein Polypeptid verstanden, das mindestens 10 Aminosäuren lang, gegebenenfalls mindestens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 oder 200 Aminosäuren lang ist. Die unter Verwendung der Verfahren und Medien der Erfindung produzierten Proteine können sekretierte Proteine sein.
Die Verfahren und Medien der Erfindung können verwendet werden, um die Sialylierung von ziemlich jedem beliebigen Protein zu erhöhen, und sind besonders vorteilhaft für Polypeptide, deren Expression unter der Kontrolle eines starken Promotors, wie beispielsweise eines viralen Promotors, liegt, und/oder Polypeptide, die auf einer Message kodiert wird, die ein dreigeteiltes Adenovirus-Leader-Element aufweist. Beispiele geeigneter Expressionsvektoren, die zum Produzieren von Proteinen verwendet werden können, sind in der internationalen Anmeldung WO 01/27299 und in McMahan et al. (1991), EMBO J. 10: 2281, das den pDC409-Vektor beschreibt, offenbart.
Im Allgemeinen sind die Verfahren der Erfindung zum Induzieren der Produktion von rekombinanten Polypeptiden geeignet. Zu Proteinen, die mit den Verfahren und Medien der Erfindung produziert werden können, zählen jene, die Aminosäuresequenzen umfassen, die mit dem gesamten oder einem Teil eines der folgenden Proteine identisch sind oder diesen im Wesentlichen ähnlich sind: ein Flt3-Ligand (wie in WO 94/28391 beschrieben), ein CD40-Ligand (wie in der US-Patentschrift Nr. 6,087,329 beschrieben), Erythropoetin, Thrombopoetin, Calcitonin, Leptin, IL-2, Angiopoetin-2 (wie von Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322):55-60, beschrieben), Fas-Ligand, Ligand für den Rezeptoraktivator von NF-Kappa B (RANKL, wie in WO 01/36637 beschrieben), mit Tumornekrosefaktor (TNF) verwandter, Apoptose induzierender Ligand (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL, wie in WO 97/01633 beschrieben), von Thymusstroma abgeleitetes Lymphopoetin, Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor, Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF, wie in der österreichischen Patentschrift Nr. 588819 beschrieben), Mastzellwachstumsfaktor, Stammzellwachstumsfaktor (beschrieben in z. B. US-Patentschrift Nr. 6,204,363), epidermaler Wachstumsfaktor, Keratinozytenwachstumsfaktor, Megakaryontenwachstums- und -entwicklungsfaktor, RANTES, Wachstumshormon, Insulin, Insulinotropin, insulinähnliche Wachstumsfaktoren, Parathormon, Interferone, einschließlich α-Interferone, γ-Interferon und Konsensus-Interferone (wie die in den US-Patentschriften Nr. 4,695,623 und 4,897,471 beschriebenen), Nervenwachstumsfaktor, vom Hirn abgeleiteter neurotropher Faktor, synaptotagminähnliche Proteine (SLP 1–5), Neurotrophin-3, Glucagon, Interleukine 1 bis 18, koloniestimulierende Faktoren, Lymphotoxin-β, Tumornekrosefaktor (TNF), Leukämie inhibierender Faktor, Oncostatin-M und verschiedene Liganden für die Zelloberflächenmoleküle ELK und Hek (wie die Liganden für mit eph verwandte Kinasen oder LERKS). Beschreibungen von Proteinen, die gemäß der erfinderischen Verfahren produziert werden können, lassen sich in zum Beispiel Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, Bd. II (Aggarwal und Gutterman, Hrsg., Blackwell Sciences, Cambridge, MA, USA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay und Leigh, Hrsg., Oxford University Press Inc., New York, 1993) und The Cytokine Handbook (A.W. Thompson, Hrsg., Academic Press, San Diego, CA, USA, 1991) finden.
Zu weiteren Proteinen, die unter Verwendung der Verfahren und Medien der Erfindung produziert werden können, zählen Proteine, die die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines Rezeptors für ein beliebiges der oben erwähnten Proteine, einen Antagonist zu einem solchen Rezeptor eines beliebigen der oben erwähnten Proteine umfassen, und/oder Proteine, die solchen Rezeptoren oder Antagonisten im Wesentlichen ähnlich sind. Zu diesen Rezeptoren und Antagonisten zählen: beide Formen von Tumornekrosefaktorrezeptor (TNFR, als p55 und p75 bezeichnet, wie in der US-Patentschrift Nr. 5,395,760 und der US-Patentschrift Nr. 5,610,279 beschrieben), Interleukin-1-Rezeptoren (IL-1-Rezeptoren) (Typ I und II; in der EP-Patentschrift Nr. 0 460 846, der US-Patentschrift Nr. 4,968,607 und der US-Patentschrift Nr. 5,767,064 beschrieben), IL-1-Rezeptor-Antagonisten (wie die in der US-Patentschrift Nr. 6,337,072 beschriebenen), IL-1-Antagonisten oder -Inhibitoren (wie die in den US-Patentschriften Nr. 5,981,713, 6,096,728 und 5,075,222, 5,767,064 beschriebenen), IL-2-Rezeptoren, IL-4-Rezeptoren (wie in der EP-Patentschrift Nr. 0 367 566 und der US-Patentschrift Nr. 5,856,296 beschrieben), IL-15-Rezeptoren, IL-17-Rezeptoren, IL-18-Rezeptoren, Rezeptor von Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierendem Faktor, Rezeptor von Granulozytenkolonie-stimulierendem Faktor, Rezeptoren für Oncostatin-M und Leukämie inhibierenden Faktor, Rezeptoraktivator von NF-Kappa B (RANK, in WO 01/36637 und der US-Patentschrift Nr. 6,271,349 beschrieben), Osteoprotegerin (beschrieben in z. B. US-Patentschrift 6,015,938), Rezeptoren für TRAIL (einschließlich der TRAIL-Rezeptoren 1, 2, 3 und 4) und Rezeptoren, die Todesdomänen umfassen, wie Fas oder Apoptose induzierender Rezeptor (AIR).
Mehr Proteine, die unter Verwendung der Verfahren und Medien der Erfindung produziert werden können, beinhalten Proteine, die die gesamten oder einen Teil der Aminosäuresequenzen von Differenzierungsantigenen (als CD-Proteine bezeichnet) oder deren Liganden umfassen, oder Proteine, die einem dieser im Wesentlichen ähnlich sind. Solche Antigene sind in Leukocyte Typing VI (Proceedings of the YIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., Hrsg., Kobe, Japan, 1996). Ähnliche CD-Proteine sind in folgenden Workshops offenbart. Zu Beispielen solcher Antigene zählen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 und Liganden davon (CD27-Ligand, CD30-Ligand usw.). Mehrere der CD-Antigene sind Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie, die außerdem 41BB und OX40 beinhaltet. Die Liganden sind oftmals Mitglieder der TNF-Familie, wie dies beim 41BB-Liganden und OX4-Liganden der Fall ist. Demgemäß können Mitglieder der TNF- und TNFR-Familien ebenfalls unter Anwendung der vorliegenden Erfindung produziert werden.
Enzymatisch aktive Proteine oder deren Liganden können ebenfalls unter Verwendung der Verfahren und Medien der Erfindung produziert werden. Zu Beispielen zählen Proteine, die das gesamte oder einen Teil eines der folgenden Proteine oder deren Liganden umfassen, oder Proteine, die einem dieser im Wesentlichen ähnlich sind: Metalloproteinase-Disintegrin-Familienmitglieder, verschiedene Kinasen, Glucocerebrosidase, Superoxiddismutase, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor VIII, Faktor IX, Apolipoprotein E, Apolipoprotein A-I, Globine, ein IL-2-Antagonist, alpha-1-Antitrypsin, TNF-alpha-Converting-Enzyme, Liganden für ein beliebiges der oben erwähnten Enzyme und zahlreiche andere Enzyme und deren Liganden.
Die Verfahren und Medien der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um chimäre Proteine zu produzieren, die in vitro ausgewählt werden, um ein spezifisches Zielprotein zu binden und dessen Aktivität zu modifizieren, wie die in den internationalen Anmeldungen WO 01/83525 und WO 00/24782 beschriebenen und Antikörper oder Teile davon und chimäre Antikörper, d. h. Antikörper mit menschlichen konstanten Antikörper-Immunglobulindomänen, die an eine oder mehrere variable Maus-Antikörper-Immunglobulindomänen gebunden sind, Fragmente davon oder im Wesentlichen ähnliche Proteine. Das Verfahren der Erfindung kann auch dazu verwendet werden, Konjugate zu produzieren, die einen Antikörper und eine zytotoxische oder lumineszierende Substanz umfassen. Zu solchen Substanzen zählen: Maytansin-Derivate (wie DM1); Enterotoxine (wie ein Staphylococcus-Enterotoxin); Iodisotope (wie Iod-125); Technetiumisotope (wie Tc-99m); Cyaninfluoreszenzfarbstoffe (wie Cy5.5.18) und ribosomeninaktivierende Proteine (wie Bouganin, Gelonin oder Saporin-S6). Zu Beispielen von Antikörpern, in vitro ausgewählten chimären Proteinen oder Antikörper/Zytotoxin- oder Antikörper/Luminophor-Konjugaten, die unter Verwendung der Verfahren und Medien der Erfindung produziert werden können, zählen jene, die ein beliebiges oder eine Kombination von Proteinen erkennen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, einem beliebigen der oben erwähnten Proteine und/oder der folgenden Antigene: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2-Rezeptor-, IL-4-Rezeptor-, IL-6-Rezeptor-, IL-13-Rezeptor-, IL-18-Rezeptoruntereinheiten, PDGF-β und Analoga davon (wie die in den US-Patentschriften Nr. 5,272,064 und 5,149,792 beschriebenen), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, EGF-Rezeptor (einschließlich der in der US-Patentschrift Nr. 6,235,883 B1 beschriebenen), VEGF-Rezeptor, Hepatozytenwachstumsfaktor, Osteoprotegerin-Ligand, Interferon-gamma, B-Lymphozytenstimulator (BlyS, auch als BAFF, THANK, TALL-1 und zTNF4 bekannt; siehe Do und Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1):19-25), CS-Komplement, IgE, Tumorantigen CA125, Tumorantigen MUC1, PEM-Antigen, LCG (bei dem es sich um ein Genprodukt handelt, das in Verbindung mit Lungenkrebs exprimiert wird), HER-2, ein tumorassoziiertes Glykoprotein TAG-72, das SK-1-Antigen, tumorassoziierte Epitope, die in erhöhten Spiegeln in den Seren von Patienten mit Dickdarm- und/oder Bauchspeicheldrüsenkrebs vorliegt, krebsassoziierte Epitope oder Proteine, die an Brust-, Dickdarm-, Plattenepithel-, Prostata-, Bauchspeicheldrüsen-, Lungen- und/oder Nierenkrebszellen und/oder an Melanom-, Gliom- oder Neuroblastomzellen exprimiert werden, der nekrotische Kern eines Tumors, Integrin-alpha-4-beta-7, das Integrin VLA-4, B2-Integrine, TRAIL-Rezeptoren 1, 2, 3 und 4, RANK, RANK-Ligand, TNF-α, das Adhäsionsmolekül VAP-1, Epithelzell-Adhäsionsmolekül (EpCAM), interzelluläres Adhäsionsmolekül-3 (ICAM-3), Leukointegrin-Adhäsin, das Plättchenglykoprotein gp IIb/IIIa, schwere Kette des kardialen Myosins, Parathormon, rNAPc2 (bei dem es sich um einen Inhibitor des Faktor-VIIa-Gewebefaktors handelt), MHC 1, karzinoembryonales Antigen (carcinuembryonic antigen, CEA), alpha-Fetoprotein (AFP), Tumornekrosefaktor (TNF), CTLA-4 (bei dem es sich um ein zytotoxisches, mit T-Lymphozyten assoziiertes Antigen handelt), Fc-γ-1-Rezeptor, HLA-DR 10-beta, HLA-DR-Antigen, L-Selectin, IFN-γ, Respiratory-Syncytial-Virus, humanes Immundefizienzvirus (HIV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Streptococcus mutans und Staphylococcus aureus.
Die Verfahren und Medien der Erfindung können auch dazu verwendet werden, das gesamte oder einen Teil eines Proteins, bei dem es sich um einen antiidiotypischen Antikörper handelt, oder ein im Wesentlichen ähnliches Protein zu produzieren, einschließlich antiidiotypischer Antikörper gegen: einen Antikörper, der auf das Tumorantigen gp72 gerichtet ist; einen Antikörper gegen das Gangliosid GD3; einen Antikörper gegen das Gangliosid GD2 oder Antikörper, die diesen im Wesentlichen ähnlich sind.
Die Verfahren und Medien der Erfindung können auch dazu verwendet werden, rekombinante Fusionsproteine zu produzieren, die ein beliebiges der oben erwähnten Proteine oder im Wesentlichen ähnliche Proteine umfasst. Zum Beispiel können rekombinante Fusionsproteine, die eines der oben erwähnten Proteine plus einer Multimerisierungsdomäne, wie einem Leucin-Zipper, einer superspiralisierten α-Helix, einem Fc-Teil eines Antikörpers, oder ein im Wesentlichen ähnliches Protein umfassen, unter Verwendung der Verfahren und Medien der Erfindung produziert werden. Siehe z. B. WO 94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259: 1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262: 1401-1405; Harbury et al. (1994), Nature 371: 80-83; Håkansson et al. (1999), Structure 7: 255-264. Spezifisch zählen zu solchen rekombinanten Fusionsproteinen Proteine, in denen mindestens ein TNFR- oder RANK-Teil an einen Fc-Teil eines Antikörpers fusioniert ist (TNFR:Fc oder RANK:Fc). TNFR:Fc umfasst den Fc-Teil eines Antikörpers, der an eine extrazelluläre Domäne von TNFR fusioniert ist, die Aminosäuresequenzen enthält, die den Aminosäuren 1-163, 1-185 oder 1-235 von 2A der US-Patentschrift Nr. 5,395,760 im Wesentlichen ähnlich sind. RANK:Fc ist in WO 01/36637 beschrieben.
Zu geeigneten Zellen zum Ausüben der vorliegenden Erfindung zählt jede Zelllinie, die Proteine glykosylieren kann, vorzugsweise eine Säugetierzelllinie, die gentechnisch verändert wurde, um ein Protein zu exprimieren, obwohl die Erfindung auch zum Produzieren nicht rekombinanter Proteine verwendet werden kann. Vorzugsweise sind die Zellen homogene Zelllinien. Zahlreiche geeignete Zelllinien sind in der Technik bekannt. Zum Beispiel können chinesische Hamster-Ovar- (CHO-), HeLa-, VERO-, BHK-, Cos-, MDCK-, 293-, 3T3-, Myelom- (z. B. NSO, NSI) oder WI38-Zellen verwendet werden. Hybridomzelllinien, die einen Antikörper produzieren, können ebenfalls zum Ausüben der Erfindung verwendet werden. Von den oben erwähnten Zellen abgeleitete Zelllinien sind ebenfalls zum Ausüben der Erfindung geeignet.
Besonders bevorzugte Zellen sind CHO-Zellen, die allgemein zur Produktion von rekombinanten Proteinen verwendet werden, z. B. Cytokine, Gerinnungsfaktoren und Antikörper (Brasel et al. (1996), Blood 88: 2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol. Chem. 263: 6352-6362; McKinnon et al. (1991), J. Mol. Endocrinol. 6: 231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol. 145: 3011-3016). Eine DHFR-defiziente (DHFR = Dihydrofolatreduktase) Mutantenzelllinie (Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220), wie DXB11 oder DG-44, ist nützlich, da das effiziente selektierbare und amplifizierbare DHFR-Genexpressionssystem eine Expression von rekombinantem Protein in hohem Ausmaß in diesen Zellen ermöglicht (Kaufman (1990), Meth. Enzymol. 185: 527-566). Darüber hinaus sind diese Zellen leicht als adhärente oder Supensionskulturen zu manipulieren und zeigen eine verhältnismäßig gute Genstabilität. CHO-Zellen und rekombinante Proteine, die in diesen exprimiert werden, sind weitgehend charakterisiert worden und sind von den Aufsichtsbehörden zur Verwendung bei der klinischen gewerblichen Herstellung zugelassen worden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Säugetierwirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die die Produktion des Proteins von Interesse fördern, bei dem es sich um einen Antikörper oder ein rekombinantes Protein handeln kann. Basalzelkulturmedienformulierungen zum Kultivieren von Säugetierzellen sind in der Technik wohl bekannt. Siehe z. B. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, S. 69-84, Wiley-Liss (1987). Der Fachmann wird diesen Basalzellkulturmedienformulierungen Komponenten wie Aminosäuren, Salze, Zucker, Vitamine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Puffer, Antibiotika, Lipide, Spurenelemente und dergleichen zusetzen, je nach den Anforderungen der zu kultivierenden Wirtszellen. Der Fachmann kann auch wählen, eine der vielen individualisierten Medienformulierungen zu verwenden, die entwickelt wurden, um das Zellwachstum, die Lebensfähigkeit der Zelle und/oder die Produktion von rekombinantem Protein in einer bestimmten kultivierten Zelle zu maximieren. Die Verfahren gemäß der aktuellen Erfindung können in Kombination mit im Handel erhältlichen Zellkulturmedien oder mit einem Zellkulturmedium, das individuell zur Verwendung mit einer bestimmten Zelllinie formuliert wurde, verwendet werden. Das Kulturmedium kann Serum und/oder Protein enthalten oder auch nicht. Zu geeigneten kommerziellen Medien zählen unter anderem RPMI 1641-Medium, Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium, minimales essentielles Eagle-Medium, F-12K- und F12-Medium, McCoy's 5A-Medium, Leibovitz's L-15-Medium und serumfreie Medien wie die EX-CELL^TM 300-Serie (erhältlich von JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, USA), die von der American Type Culture Collection oder JRH Biosciences sowie anderen Händlern bezogen werden können.
Der Fachmann kann auch wählen, eine der vielen individualisierten Medienformulierungen zu verwenden, die entwickelt wurden, um das Zellwachstum, die Lebensfähigkeit der Zelle und/oder die Produktion von rekombinantem Polypeptid in einer bestimmten kultivierten Zelle zu maximieren. Die Verfahren gemäß der aktuellen Erfindung können in Kombination mit im Handel erhältlichen Zellkulturmedien oder mit einem Zellkulturmedium, das individuell zur Verwendung mit einer bestimmten Zelllinie formuliert wurde, verwendet werden. Zum Beispiel kann ein angereichertes Medium, das eine gesteigerte Polypeptidproduktion unterstützen könnte, eine Mischung aus zwei oder mehr kommerziellen Medien, wie beispielsweise DMEM und Ham's F 12-Medium, umfassen, die in Verhältnissen wie beispielsweise 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8 oder sogar bis zu 1:15 oder höher kombiniert sind. Alternativ oder zusätzlich dazu kann ein Medium durch Zugabe von Nährsubstanzen, wie Aminosäuren oder Pepton, angereichert werden, und/oder ein Medium (oder der Großteil seiner Bestandteile mit den im Folgenden angegebenen Ausnahmen) kann bei einer höheren als seiner gewöhnlichen, empfohlenen Konzentration verwendet werden, beispielsweise bei 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X oder sogar höheren Konzentrationen. Wie hierin verwendet, steht „1X" für die Standardkonzentration, „2X" steht für das Doppelte der Standardkonzentration usw. In einer beliebigen dieser Ausführungsformen kann die Konzentration von Medienbestandteilen, die sich erheblich auf die Osmolarität auswirken, wie Salzen, nicht derart erhöht werden, dass die Osmolarität des Mediums außerhalb eines annehmbaren Bereichs fällt. Folglich kann ein Medium beispielsweise 8X sein in Bezug auf alle Bestandteile außer Salzen, die in nur 1X vorliegen können. Ein angereichertes Medium kann serumfrei und/oder proteinfrei sein. In diesem Zusammenhang bedeutet „proteinfrei" frei von Proteinen mit mindestens 15 Aminosäuren, wie Insulin oder insulinähnlicher Wachstumsfaktor. „Proteinfreies" Medium kann hydrolysierte Proteine enthalten, wie sie in Peptonen (aus Hefe, Soja oder anderen Quellen) vorgefunden werden, bei denen es sich um allgemein verwendete Medienzusatzstoffe handelt. Des Weiteren kann ein Medium während des Zeitraums, in dem eine Kultur erhalten wird, periodisch supplementiert werden, um Medienbestandteile wiederaufzufüllen, die abgereichert werden können, wie beispielsweise Vitamine, Aminosäuren und Stoffwechselvorläufer. Wie in der Technik bekannt ist, können unterschiedliche Medien und Temperaturen leicht unterschiedliche Wirkungen auf unterschiedliche Zelllinien haben und dasselbe Medium und dieselbe Temperatur sind möglicherweise nicht für alle Zelllinien geeignet.
Die Verfahren der Erfindung sind zum Induzieren der Produktion von rekombinanten Proteinen von Nutzen. Bei rekombinanten Proteinen handelt es sich um Proteine, die mittels des Vorgangs der gentechnischen Veränderung (Gentechnik) produziert werden. Der Ausdruck „gentechnische Veränderung" bezieht sich auf das Infizieren, Transfizieren, Transformieren oder Transduzieren einer Zelle mit einem rekombinanten Polynukleotidmolekül, um zu bewirken, dass die Zelle die Expression eines gewünschten Proteins verändert. In einigen Ausführungsformen umfasst ein solches rekombinantes Polynukleotidmolekül Nukleinsäuren, die das Protein von Interesse, das operativ mit geeigneten Regulationssequenzen verknüpft ist, kodieren und Teil eines „Expressionsvektors" sind, in den die Nukleinsäuren, die das Protein von Interesse kodieren, inseriert werden.
Verfahren und Vektoren zur gentechnischen Veränderung von Zellen und/oder Zelllinien, um ein Protein von Interesse zu exprimieren, sind Fachmännern wohl bekannt; zum Beispiel sind verschiedene Techniken in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg. (Wiley & Sons, New York, 1988, und vierteljährliche Aktualisierungen); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); und R.J. Kaufman, Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, S. 15-69, dargestellt. Weitere Protokolle, die im Handel erhältliche Reagenzien verwenden, wie die kationischen Lipid-Reagenzien LIPOFECTAMINE^TM, LIPOFECTAMINE^TM-2000 oder LIPOFECTAMINE^TM-PLUS (die von Invitrogen erworben werden können), können zum Transfizieren von Zellen verwendet werden. Felgner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417. Darüber hinaus kann Elektroporation oder Bombardierung mit Mikroprojektilen, die mit Nukleinsäuren beschichtet sind, eingesetzt werden, um Zellen unter Anwendung von Vorgehensweisen zu transfizieren, wie denen in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Bd. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, und Fitzpatrick-McElligott (1992), Biotechnology (NY) 10(9):1036-1040. Techniken der gentechnischen Veränderung beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Transformation von Zellen mit Expressionsvektoren, gezielte homologe Rekombination und Genaktivierung (siehe z. B. die US-Patentschrift Nr. 5,272,071 an Chappel) und Transaktivierung mittels konstruierter Transkriptionsfaktoren (siehe z. B. Segal et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(6):2758-63).
Ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert, wird oftmals verwendet, um die Identifizierung von rekombinanten Zellen zu erleichtern, und ist daher häufig in Expressionsvektoren eingebunden. Die Auswahl von Transformanten kann unter Anwendung von Verfahren wie beispielsweise dem DHFR-Auswahlschema (DHFR = Dihydrofolatreduktase) oder der Resistenz gegenüber zytotoxischen Arzneimitteln durchgeführt werden. Kaufman et al. (1990), Meth. in Enzymology 185: 487-511. Ein geeigneter Wirtsstamm zur DHFR-Auswahl kann beispielsweise der CHO-Stamm DX-B11 sein, der in DHFR fehlt. Urlaub und Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220. Zu anderen Beispielen von selektierbaren Markern zählen jene, die Resistenz gegenüber Antikörpern verleihen, wie G418 und Hygromycin B.
Die Regulationssequenzen werden in der Regel von Säugetier-, Mikroben-, Virus- und/oder Insektengenen abgeleitet. Zu Beispielen von Regulationssequenzen zählen Transkriptionspromotoren, -operatoren und -Enhancer, Ribosomen-Bindungsstellen (siehe z. B. Kozak (1991), J. Biol. Chem. 266: 19867-19870), Sequenzen, die die Transkriptions- und Translationstermination steuern, Polyadenylierungssignale (siehe z. B. McLauchlan et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16: 5323-5333) und Matrix- und Scaffold-Anheftungsstellen (siehe Phi-Van et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 10: 2302-2307; Stief et al. (1989), Nature 341:342-335; Bonifer et al. (1990), EMBO J. 9: 2843-2838). Nukleotidsequenzen werden operativ verknüpft, wenn die Regulationssequenz funktionsfähig in Beziehung zu der proteinkodierenden Sequenz steht. Solche Sequenzen können in cis oder in trans vorliegen, solange sie funktionsfähig in Beziehung zu der proteinkodierenden Sequenz stehen. Somit wird eine Promotor-Nukleotidsequenz operativ mit einer proteinkodierenden Sequenz verknüpft, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der kodierenden Sequenz steuert. Obwohl viele Sequenzen, die die Expression regulieren können, wie Promotoren, ihre Wirkungen ausüben, wenn sie in cis vorliegen, muss dies nicht immer der Fall sein. Zum Beispiel können nicht kodierende RNAs, die in trans vorliegen, die Genexpression herunterregulieren oder verstärken. Siehe z. B. Storz (2002), Science 296: 1260-1263.
Allgemein verwendete Promotor- und Enhancer-Sequenzen werden von Polyomavirus, Adenovirus 2, Simianvirus 40 (SV40) und humanem Zytomegalievirus (cytomegalovirus, CMV) abgeleitet. Zum Beispiel kann der humane CMV-Promotor/Enhancer vom Immediately-Early-Gen 1 verwendet werden. Siehe z. B. Patterson et al. (1994), Applied Microbiol. Biotechnol. 40: 691-698. DNA-Sequenzen, die vom SV40-Virusgenom abgeleitet sind, beispielsweise SV40-Startpunkt-, Early- und Late-Promotor-, Enhancer-, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen, können verwendet werden, um andere genetische Elemente zur Expression einer Strukturgensequenz in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen. Virale Early- und Late-Promotoren sind besonders nützlich, da beide leicht aus einem Virusgenom als ein Fragment erhalten werden, das auch einen viralen Replikationsstartpunkt enthalten kann (Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Kaufman (1990), Meth. in Enzymol. 185: 487-511). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp lange Sequenz, die sich von der Hind-III-Stelle in Richtung der Bgl-I-Stelle erstreckt, die sich in der viralen SV40-Replikationsstartpunktstelle befindet, enthalten ist.
Eine Sequenz, die ein adäquates natives oder heterologes Signalpeptid (Leader-Sequenz) kodiert, kann in einen Expressionsvektor integriert werden, um die extrazelluläre Sekretion des rekombinanten Proteins zu fördern. Die Wahl des Signalpeptids oder Leaders hängt von der Art der Wirtszellen ab, in denen das rekombinante Protein produziert werden soll. Zu Beispielen von Signalpeptiden, die in Säugetierwirtszellen funktionsfähig sind, zählen die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), die in der US-Patentschrift Nr. 4,965,195 beschrieben wird, die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor, die in Cosman et al., Nature 312:768, 1984, beschrieben wird; das Interleukin-4-Rezeptor-Signalpeptid, das in der EP-Patentschrift Nr. 367,566 beschrieben wird; das Typ-I-Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid, das in der US-Patentschrift Nr. 4,968,607 beschrieben wird; und das Typ-II-Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid, das in der EP-Patentschrift Nr. 460,846 beschrieben wird.
Zu weiteren Kontrollsequenzen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Expression von heterologen Genen aus Säugetier-Expressionsvektoren verbessern, zählen solche Elemente wie das die Expression verstärkende Sequenzelement (expression augmenting sequence element, EASE), das von CHO-Zellen abgeleitet wurde (Morris et al. in Animal Cell Technology, S. 529-534 (1997); US-Patentschrift Nr. 6,312,951 B1; US-Patentschrift Nr. 6,027,915; US-Patentschrift Nr. 6,309,841 B1), und die dreigeteilten Leader- (tripartite leader, TPL) und VA-Gen-RNAs von Adenovirus 2 (Gingeras et al. (1982), J. Biol. Chem. 257:13475-13491). IRES-Sequenzen (IRES = internal ribosome entry site, Eintrittsstelle für Ribosome innerhalb der mRNA) viralen Ursprungs ermöglichen, dass dicistronische mRNAs effizient translatiert werden (Oh und Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3: 295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2697-2700). Von der Expression einer heterologen cDNA als Teil einer dicistronischen mRNA, auf die das Gen für einen selektierbaren Marker (z. B. DHFR) folgt, wurde gezeigt, dass sie die Transfizierbarkeit des Wirts und die Expression der heterologen cDNA verbessert (Kaufman et al. (1990), Methods in Enzymol. 185: 487-511). Beispielhafte Expressionsvektoren, die dicistronische mRNAs einsetzen, sind pTR-DC/GFP, das von Mosser et al., Biotechniques 22:150-161 (1997), beschrieben wird, und p2A5I, das von Morris et al. in Animal Cell Technology, S. 529-534 (1997), beschrieben wird.
Beispiele von geeigneten Expressionsvektoren, die zum Produzieren von Proteinen verwendet werden können, sind jene, die in WO 01/27299 offenbart sind, und der pDC409-Vektor, der in McMahan et al. (1991), EMBO J. 10: 2821, beschrieben wird. Ein weiterer nützlicher starker Expressionsvektor, pCAVNOT, wurde von Mosley et al. (1989), Cell 59: 335-348, beschrieben. Weitere Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugetierwirtszellen können wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983)) offenbart konstruiert werden. Ein geeignetes System zur stabilen Expression von Säugetier-cDNAs in hohem Ausmaß in Maus-C127-Mammaepithelzellen kann im Wesentlichen wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935 (1986)) beschrieben konstruiert werden. Ein nützlicher starker Expressionsvektor, PMLSV N1/N4, von Cosman et al. (1984), Nature 312: 768, beschrieben, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Weitere geeignete Säugetier-Expressionsvektoren sind in der EP-Patentschrift Nr. A 0 367 566 und WO 01/27299 beschrieben. Die Vektoren können von Retroviren abgeleitet werden. Anstelle der nativen Signalsequenz kann eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, wie die Signalsequenz für IL-7, die in der US-Patentschrift Nr. 4,965,195 beschrieben wird; die Signalsequenz für den IL-2-Rezeptor, die in Cosman et al. (Nature 312:768, 1984)) beschrieben wird; das IL-4-Signalpeptid, das in der EP-Patentschrift Nr. 367,566 beschrieben wird; das Typ-I-IL-1-Rezeptor-Signalpeptid, das in der US-Patentschrift Nr. 4,968,607 beschrieben wird; und das Typ-II-IL-1-Rezeptor-Signalpeptid, das in der EP-Patentschrift Nr. 460,846 beschrieben wird.
Geeignete Kulturbedingungen für Säugetierzellen sind in der Technik bekannt. Siehe z. B. Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, Hrsg., Oxford University Press, New York (1992). Säugetierzellen können in Suspension kultiviert werden oder während sie an einem festen Substrat haften. Des Weiteren können Säugetierzellen beispielsweise in Fließbettbioreaktoren, Hohlfaserbioreaktoren, Festbettbioreaktoren, Faserbettbioreaktoren, Rollerflaschen, Schüttelflaschen oder Rührtankbioreaktoren mit oder ohne Mikroträgerstoffe und in einem Batch-, Fed-batch-, kontinuierlichen, halbkontinuierlichen oder Perfusionsmodus kultiviert werden.
Die Verfahren und Medien der Erfindung können mit anderen Verfahren oder Medienzusatzstoffen kombiniert werden, insbesondere denen, die die Produktion oder Sialylierung eines Proteins steigern. Zum Beispiel können Zellen bei Temperaturen von etwa 29°C bis etwa 40°C, gegebenenfalls von etwa 29°C bis etwa 37°C, von etwa 29°C bis etwa 36°C, von etwa 29°C bis etwa 35°C oder von etwa 30°C bis etwa 33°C gezüchtet werden. Darüber hinaus können andere Substanzen als N-Acetylmannosamin, Galaktose, Fruktose und Mannose dem Medium zugesetzt werden. Solche Substanzen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Histondeacetylase-Inhibitoren, Butyrat, Trichostatin, Koffein und Hexamethylenbisacetamid.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, den Titer und/oder die Sialylierung von Proteinen in Kulturvorgängen sowohl mit einer einzigen Phase als auch mehreren Phasen zu erhöhen. In einem Vorgang mit einer einzigen Phase werden die Zellen in einer Kulturumgebung inokuliert und die offenbarten Verfahren und Medien werden während der einzigen Produktionsphase eingesetzt. In einem Vorgang mit mehreren Stufen werden die Zellen in zwei oder mehreren separaten Phasen kultiviert.
Zum Beispiel können die Zellen zunächst in einer Wachstumsphase unter Umweltbedingungen, die die Zellvermehrung und die Lebensfähigkeit der Zellen maximieren, kultiviert, dann in eine Produktionsphase unter Bedingungen, die die Produktion und/oder die Sialylierung eines Proteins steigern, überführt. In Vorgängen mit mehreren Phasen werden die Verfahren und Medien gemäß der vorliegenden Erfindung zumindest während der Produktionsphase eingesetzt.
Die im Folgenden dargelegten Beispiele sollen nicht vollständig sein oder den Schutzumfang der Erfindung einschränken. Der Fachmann wird verstehen, dass Modifizierungen und Variationen angesichts der obigen Lehren möglich sind.
BEISPIEL 1
VERGLEICH DER FÄHIGKEIT VERSCHIEDENER ZUCKER UND KOMBINATIONEN DIESER, DIE SIALYLIERUNG VON TNFR:F_C ZU INDUZIEREN
Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um zu ermitteln, welches Kohlenhydrat oder welche Kombination von Kohlenhydraten, das bzw. die dem Zellkulturmedium zugesetzt wurde, die höchste Sialylierung von TNFR:Fc, das von den Zellen produziert wird, induzieren kann. Der verhältnismäßige Sialylierungsgrad wurde mittels Messens der TNFR:Fc-Fraktion bestimmt, die von einer Zellkultur produziert wird, die aus einer Anionenaustauschersäule nur bei einer hohen Salzkonzentration eluiert. Dies liefert eine grobe Messung des Sialylierungsgrads, da Proteine mit mehr Sialinsäure zur Elution aus einer Anionenaustauschersäule eine höhere Salzkonzentration erfordern.
Etwa 2,0 × 10⁶ Zellen einer CHO-Zelllinie, die gentechnisch verändert wurde, um TNFR:Fc zu produzieren, wurden in jeden von 12 Kolben inokuliert, die 30 ml serumfreies Medium mit INTRALIPIDS^TM (eine sterile Emulsion aus fraktioniertem Sojaöl und fraktionierten Eiphospholipiden in Wasser), insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I und Butyrat enthielten und ohne jegliche zugesetzte Kohlenhydrate (mit „Kontrolle" bezeichnet) oder mit den Kohlenhydratzusatzstoffen, die in 2 angegeben sind, in einer Konzentration von jeweils 4 mM. Die Kulturen wurden 7 Tage bei 30°C unter Schütteln mit 150 Umdrehungen pro Minute inkubiert. TNFR:Fc wurde nach sieben Tagen Wachstum aus dem Medium geerntet und mittels Protein-A-Affinitätschromatographie vorgereinigt. Danach wurde die Konzentration des gereinigten TNFR:Fc-Proteins mittels Messens der Extinktion bei 280 Nanometer bestimmt. Die Konzentration des TNFR:Fc-Proteins wurde mittels Verdünnung in 20 mM Imidazol, pH 6,2, auf etwa 0,25 mg/ml eingestellt.
Eine Anionenaustauschersäule (mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Höhe von 50 mm) wurde wie folgt laufen gelassen. Die Säule wurde sowohl vor als auch nach dem Laufenlassen von Versuchsproben unter Verwendung einer Mischung aus zwei Kontrollproteinen, die 0,25 mg/ml Soja-Trypsin-Inhibitor und 0,5 mg/ml Lactalbumin (beide von der Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA, bezogen) enthielt, kalibriert. Eine Probe von bis zu 200 μl dieser Mischung wurde auf die Säule aufgebracht und ein linearer Gradient zwischen 20 mM Imidazol, pH 6,2 (Puffer A), und 20 mM Imidazol, 0,7 M NaCl, pH 6,2 (Puffer B), wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,8 ml/min durch die Säule laufengelassen. Der Gradient war nach 22,1 Minuten abgeschlossen und die Säule enthielt 100 % Puffer B. Die Elution des Proteins wurde mittels Überwachens der Extinktion bei 280 Nanometer bestimmt und ein Graph dieser Messungen im Vergleich zur Zeit (im Verhältnis zur Ladezeit) wurde automatisch aufgezeichnet, während das Protein aus der Säule eluierte. Lactalbumin eluierte vor Soja-Trypsin-Inhibitor (etwa 11,2 Minuten im Vergleich zu 15,4 Minuten). Zwischen den Durchläufen wurde die Säule mittels Injizierens von 0,2 ml 2M-NaCl gereinigt, worauf zwei Sätze abwechselnder Waschvorgänge mit den Puffern A und B folgte, auf die ein abschließender Waschvorgang mit Puffer A folgte.
Ein Volumen von bis zu 200 μl (bei etwa 0,25 mg/ml) TNFR:Fc wurde auf die Anionenaustauschersäule geladen und ein linearer Gradient wurde wie oben erläutert durch die Säule laufengelassen. Der Teil des TNFR:Fc-Peaks, der nach Soja-Trypsin-Inhibitor eluierte, wurde als bei hohem Salzgehalt eluierend betrachtet. Die Fraktion von TNFR:Fc, die bei hohem Salzgehalt eluierte, wurde mittels Vergleichens der Fläche unter der Kurve, die nach dem Soja-Trypsin-Inhibitor eluierte, mit der Gesamtfläche unter der Kurve bestimmt. Diese Zahl wurde in jedem Fall mit einer ähnlichen Fraktion von einem TNFR:Fc-Batch verglichen, die in einem separaten Versuch von einer Zellkultur produziert wurde, die ohne Mannose, Fruktose, Galaktose oder N-Acetylmannosamin gezüchtet wurde.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die Tatsache, dass die Kontrollkultur aus dem vorliegenden Versuch ohne zugesetzte Zucker nur sehr geringfügig über 100 % liegt, deutet darauf hin, dass die Sialylierung von TNFR:Fc von Batch zu Batch nahezu konstant sein kann. Diese Daten weisen zudem darauf hin, dass Kulturen, die in N-Acetylmannosamin, Fruktose, Mannose und Galaktose (in Konzentrationen von jeweils 4 mM) gezüchtet wurden, die höchsten Niveaus der Sialylierung von TNFR:Fc aller der geprüften Kombinationen hervorbrachten. Des Weiteren zeigte TNFR:Fc aus Kulturen, die mit den folgenden Kombinationen von Zuckern gezüchtet wurden, ebenfalls Anstiege bei der Sialylierung: (1) Galaktose für sich; (2) Fruktose und Galaktose; (3) Fruktose, Galaktose und Mannose und (4) N-Acetylmannosamin und Galaktose.
BEISPIEL 2
ABTASTEN EINER WIRKUNGSFLÄCHE, UM DIE OPTIMALEN KONZENTRATIONEN VON N-ACETYLMANNOSAMIN UND ZUCKERN ZU BESTIMMEN
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um die optimalen Konzentrationen für N-Acetylmannosamin und Fruktose, Mannose und Galaktose in Wachstumsmedium zum Erhöhen der Sialylierung von TNFR:Fc zu bestimmen. Das Bestreben bei dem Versuch ist es zudem, eine Kombination zu ermitteln, die die höchste Sialylierung von TNFR:Fc mit der niedrigsten Konzentration von N-Acetylmannosamin erzielt.
Etwa 2,0 × 10⁶ Zellen derselben CHO-Zelllinie, die in Beispiel 1 verwendet wurde, wurden in jeden von 13 Kolben inokuliert, die 30 ml serumfreies Medium mit INTRALIPIDS^TM (eine sterile Emulsion aus fraktioniertem Sojaöl und fraktionierten Eiphospholipiden in Wasser), insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I und Butyrat enthielten mit den in 3 angegebenen Medienzusatzstoffen, das heißt, variierenden Konzentrationen von N-Acetylmannosamin und/oder ein Zuckercocktail, der äquimolare Mengen von Fruktose, Galaktose und Mannose enthielt.
Kombinationen von Konzentrationen von Medienzusatzstoffen wurden gewählt, um eine Wirkungsfläche abzutasten. Siehe z. B. Öberg und Deming, Chemical Eng. Process, April 2000: 53-59. Fünf Parallelkulturen wurden verwendet, um die Daten für den Mittelpunkt von 3 zu produzieren, und acht andere Kulturen produzierten jeweils die Daten für einen der acht Achspunkte von 3. TNFR:Fc wurde nach 7 Tagen Wachstum bei 30°C unter Schütteln mit 150 Umdrehungen pro Minute geerntet und mittels Protein-A-Affinitätschromatographie vorgereinigt. Die Mol N-Acetylneuraminsäure (NANA) pro Mol rekombinantem Protein wurden wie folgt bestimmt. Nach der Protein-A-Affinitätschromatographie wurde die Konzentration von TNFR:Fc mittels Ablesens der Extinktion bei 280 Nanometer bestimmt und die Proteinkonzentration wurde mittels Verdünnung in phosphatgepufferte Kochsalzlösung auf 1 mg/ml eingestellt. Sialidase (von Glyko, Inc. in Novato, Kalifornien, USA, bezogen) wurde in 2X Inkubationspuffer (200 mM Natriumacetat, pH 5,0) auf 1 mE/μl (wobei 1 Einheit die Enzymmenge ist, die erforderlich ist, um 1 μmol NANA pro Minute bei pH 5 und 37°C zu spalten) verdünnt. TNFR:Fc und Sialidase (jeweils 10 μl) wurden gemischt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Mischung mittels Zugebens von 30 μl Wasser auf 0,2 mg/ml TNFR:Fc verdünnt. Die freigesetzte Sialinsäure wurde erfasst und unter Anwendung von Hochleistungsanionen-austauschchromatographie quantifiziert, bei der der Ablauf unter Anwendung von gepulster amperometrischer Detektion überwacht wurde. Gepulste amperometrische Detektion setzt Elektroden ein, die Reinigungsimpulse (um Analyten zu entfernen, die die Elektrode verschmutzen und präzise Ablesungen verhindern) mit Detektionsimpulsen bei einem Potential, das zum Nachweisen von NANA geeignet ist, vermischen. Das System wurde sowohl vor als auch nach dem Laufenlassen von Versuchsproben unter Verwendung bekannter NANA-Mengen kalibriert, die von einem Vertriebshändler, wie beispielsweise der Sigma-Aldrich Corporation in St. Louis, Missouri, USA, bezogen wurden. Das System zum Durchführen von Hochleistungsanionenaustauschchromatographie und gepulster amperometrischer Detektion wurden von der Dionex Corporation in Sunnyvale, Kalifornien, USA, bezogen.
Die Ergebnisse, die in 3 gezeigt sind, wurden unter Verwendung einer Computersoftware für statistische Analyse und grafische Datendarstellung (JMP^®, erhältlich vom SAS Institute, Cary, North Carolina, USA) aufgetragen. Die höchsten Niveaus der Sialylierung von TNFR:Fc wurden bei jeweils 3mM Fruktose, Galaktose und Mannose und geringfügig mehr als 5 mM N-Acetylmannosamin beobachtet. Wenn jedoch 3 mM Fruktose, Galaktose und Mannose Kulturen zugesetzt werden, die geringfügig weniger als 3 mM N-Acetylmannosamin enthalten, waren die Sialylierungsniveaus nahezu denen gleich, die unter Verwendung von etwa 5 mM N-Acetylmannosamin erkannt wurden.

Claims

Ein Verfahren zur Kontrolle des Gehalts an Sialinsäure eines Proteins, produziert durch Säugetierzellen, umfassend die Kultivierung der Zellen in Suspension in einem Medium, umfassend Galaktose und Fruktose.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Medium ferner Mannose umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Medium ferner N-Acetylmannosamin umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das Medium serumfrei ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3, oder 4, worin die Konzentrationen der Galaktose, Mannose, und Fruktose jeweils bei 1 mM bis 10 mM liegen.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 5, worin die Konzentration des N-Acetylmannosamins im Medium bei mindestens 0.8 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM oder 20 mM liegt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Protein ein sekretiertes, rekombinantes Protein ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Säugetierzellen CHO (Chinesische Hamster Ovar) Zellen sind.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Zellen bei einer Temperatur von 29°C bis 36°C kultiviert werden.
Ein Medium zur Kultivierung von Säugetierzellen, umfassend Galaktose, Fruktose und Mannose.
Das Medium nach Anspruch 10, ferner umfassend N-Acetylmannosamin.
Das Medium nach Anspruch 10 oder 11, worin die Konzentration der Galaktose, Mannose, und Fruktose jeweils bei 1 mM bis 10 mM liegen.
Das Medium nach Anspruch 11 oder 12, worin die Konzentration von N-Acetylmannosamin im Medium bei mindestens 0.8 mM liegt.
Das Medium nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin das Medium serumfrei ist.
Ein Verfahren zur Kontrolle des Sialinsäuregehalts eines Proteins, umfassend die Kultivierung einer Säugetierzelle, die das Protein in einem Medium produziert, umfassend N-Acetylmannosamin und Galaktose.
Das Verfahren nach Anspruch 15, worin das Medium ferner Fruktose und Mannose umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 16, worin die Konzentration der Fruktose im Medium bei 1,5 mM bis 4.5 mM liegt und worin die Konzentration der Mannose im Medium bei 1.5 mM bis 4.5 mM liegt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, worin die Zelle bei einer Temperatur von 29°C bis 35°C kultiviert wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, worin die Konzentration von N-Acetylmannosamin im Medium bei mindestens 0.8 mM liegt und worin die Konzentration von Galaktose im Medium bei 1.5 mM bis 4.5 mM liegt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, worin das Protein ein sekretiertes Protein ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, worin das Protein ein rekombinantes Protein ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, worin die Zelle eine CHO (Chinesische Hamster Ovar) Zelle ist.
Ein Medium zur Kultivierung von Säugetierzellen, umfassend Galaktose, Fruktose und N-Acetylmannosamin.
Das Medium nach Anspruch 23, worin das Medium ferner Mannose umfasst.
Das Medium nach Anspruch 24, worin die Konzentration der Fruktose im Medium bei 1.5 mM bis 4.5 mM liegt und worin die Konzentration der Mannose im Medium bei 1.5 mM bis 4.5 mM liegt.
Das Medium nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin die Konzentration von N-Acetylmannosamin im Medium bei mindestens 0.8 mM liegt und worin die Konzentration der Galaktose im Medium bei 1.5 mM bis 4.5 mM liegt.
Das Medium nach einem der Ansprüche 23 bis 26, worin die Säugetierzellen CHO Zellen sind.
Das Medium nach einem der Ansprüche 23 bis 27, worin das Medium serumfrei ist.
Ein Verfahren zum Erhöhen der Produktion eines Proteins durch Kultivierung von Säugetierzellen, die das Protein exprimieren, wobei die Methode die Kultivierung der Säugetierzellen in einem Medium, umfassend Fruktose, Mannose und Galaktose, umfaßt.
Das Verfahren nach Anspruch 29, worin das Medium ferner N-Acetylmannosamin umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 30, worin die Konzentration der Galaktose im Medium bei 1.5 mM bis 4.5 mM liegt, worin die Konzentration der Mannose im Medium bei 1.5 mM bis 4.5 mM liegt und worin die Konzentration der Fruktose im Medium bei 1.5 mM bis 4.5 mM liegt.
Das Verfahren nach Ansprüchen 30 oder 31, worin die Konzentration des N-Acetylmannosamins im Medium bei mindestens 0.8 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, oder 20 mM liegt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32, worin das Medium serumfrei ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 33, worin die Säugetierzellen CHO (Chinesische Hamster Ovar) Zellen sind.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 34, worin das Protein ein sekretiertes, rekombinantes Protein ist.
Ein Verfahren zur Kontrolle des Sialinsäuregehalts eines rekombinanten Proteins, umfassend die Kultivierung der Säugetierzellen, die das rekombinante Protein bei einer Temperatur von etwa 29°C bis etwa 36°C in einem Medium, umfassend Fruktose, Galaktose, Mannose, und N-Acetylmannosamin exprimieren, worin die Konzentration der Fruktose im Medium bei 1.0 mM bis 5.0 mM liegt, worin die Konzentration der Galaktose im Medium bei 1.0 mM bis 5.0 mM liegt, worin die Konzentration der Mannose im Medium bei 1.0 mM bis 5.0 mM liegt, und worin die Konzentration des N-Acetylmannosamins im Medium bei mindestens 0.8 mM liegt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 22 oder 36, worin der Sialinsäuregehalt des Proteins erhöht ist.
Verwendung eines Mediums, umfassend N-Acetylmannosamin und Galaktose zur Kontrolle des Sialinsäuregehalts eines Proteins, das durch Säugetierzellen produziert wird.