DE69929198T2

DE69929198T2 - Zellkulturverfahren für die produktion von glycoproteinen

Info

Publication number: DE69929198T2
Application number: DE1999629198
Authority: DE
Inventors: Thomas Ryll
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2019-05-27
Also published as: ATE314485T1; EP1092037B1; WO1999061650A1; DE69929198D1; AU4314299A; ES2255765T3; EP1092037A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Glykoproteinen in eukaryotischer Zellkultur. Die Erfindung stellt Zellkulturverfahren bereit, welche die Oligosaccharidstrukturen von naszierenden Glykoproteinen beibehalten und die Gewinnung von Glykoproteinen, die mit einem oder mehreren Sialsäureresten endende Oligosaccharide enthalten, aus der Zellkultur stark vereinfachen.
Hintergrund
Zahlreiche Oberflächen- und sekretierte Proteine eukaryotischer Zellen werden posttranslationalem Processing unterzogen, damit die N-gebundene und O-gebundene Kohlenhydrate enthalten (Kornfeld und Kornfeld, Annu. Rev. Biochem. 54, 631–64 (1985); Rademacher et al., Annu. Rev. Biochem. 57, 785–838 (1988)). Es wird angenommen, dass sich die Proteinglykosylierung auf verschiedene Funktionen auswirkt, einschließlich Verstärkung der Proteinfaltung, Hemmung der Proteinaggregation, Regulierung des intrazellulären Transports zu Organellen, Erhöhung der Resistenz gegen Proteolyse, Modulierung der Proteinantigenität und Vermittlung interzellulärer Haftung (Fieldler und Simons, Cell 81, 309–312 (1995); Helenius, Mol. Biol. of the Cell 5, 253–265 (1994); Olden et al., Cell 13, 461–473 (1978); Caton et al., Cell 37, 417–427 (1982); Alexander und Elder, Science 226, 1328–1330 (1984); Flack et al., J. Biol. Chem. 269, 14015–14020 (1994)). In höheren Organismen kann sich die Art und das Ausmaß der Glykosylierung stark auf die Kreislaufhalbwertszeit und die Bioverfügbarkeit von sekretierten Proteinen auswirken, und zwar durch Mechanismen, die eine rezeptorvermittelte Aufnahme und Clearance involvieren (Ashwell und Morrell, Adv. Enzymol. 41, 99–128 (1974); Ashwell und Harford, Ann. Rev. Biochem. 51, 531–54 (1982)). Es wurden Rezeptorsysteme identifiziert, von denen angenommen wird, dass sie eine wichtige Rolle in der Clearance von Serumproteinen durch Erkennung von verschiedenen Zuckerkomponenten des Oligosaccharids auf den Glykoproteinen spielen (Stockert, Physiol. Rev. 75, 591–609 (1995); Kery et al., Arch. Biochem. Biophys. 298, 49–55 (1992)). Da sich die terminale Sialsäurekomponente auf die Absorption, die Serumhalbwertszeit und die Clearance aus dem Serum sowie auf die physikalischen, chemischen und immunogenen Eigenschaften des Glykoproteins auswirkt (R. B. Praekh, w.o.; A. Varki, Glycobiology 3, 97–100 (1993); J. Paulson, TIBS 14, 272–276 (1989); Goochee et al., Biotechnology 9, 1347–1355 (1991); A. Kobata, Eur. J. Biochem. 209, 483–501 (1992)), können Produktionsstrategien, welche die terminale Sialsäurekomponente beibehalten, die Bioverfügbarkeit und Serumhalbwertszeit eines Proteins vorteilhafterweise verlängern.
Viel Aufmerksamkeit wurden auf Faktoren gerichtet, die sich bei rekombinanter Produktion von Proteinen auf die Glykosylierung auswirken, wie z.B. Wachstumsmodus (anhaftend oder Suspension), fötales Rinderserum in der Medienformulierung, Kulturdichte, Oxygenierung, pH, Ammoniumkonzentration, Reinigungsschemata und dergleichen (R. Werner und W. Noe, Drug Res. 43, 1134–1249 (1993); Hayter et al., Biotech. und Bioeng. 39, 327–335 (1992); Borys et al., Biotech. and Bioeng. 43, 505–514 (1994); Borys et al., Bio/Technology 11, 720–724 (1993); Hearing et al., J. Cell Biol. 108, 339–353 (1989); Goochee et al., in: Frontiers in Bioprocessing II, Todd et al. (Hrsg.) (1992), American Chemical Society, 199–240; US-Patent Nr. 5.096.816; W. Chotigeat, Cytotech. 15, 217–221 (1994); Gawlitzek et al., Biotech. Bioeng. 57, 518–528 (1998)). Verschiedene Gruppen haben die Prozessparameter in Zusammenhang mit rekombinanter Proteinproduktion untersucht, vor allem die Auswirkung der Medienzusammensetzung in verschiedenen Produktionsstadien (Park et al., Biotech. Bioeng. 40, 686–696 (1992); Cox und McClure, In Vitro 19, 1–6 (1983); Mizutani et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, 664–669 (1992); Le Gros et al., Lymph. Res. 4(3), 221–227 (1985)). Das US-Patent Nr. 5.705.964 offenbart Verfahren zur Änderung des Sialsäuregehalts eines Glykoproteins durch Regelung von Faktoren, die sich auf Zellproduktivität auswirken, beispielsweise durch Zusatz einer Alkansäure zum Kulturmedium, Regelung der Osmolalität des Kulturmediums und Regelung der Wachstumstemperatur.
Ein weiteres Mittel zur Beeinflussung des Sialsäuregehalts eines Glykoproteins ist die Regelung der Aktivität von zellulären Neuraminidasen (US-Patent Nr. 5.510.261). Neuraminidasen sind cytosolische und membranassoziierte Enzyme, die Sialsäure von einer Glykosylgruppierung eines Glykoproteins abspalten. Die Aktivität von synaptosomaler membranassoziierter Neuraminidase von Rinderhirn wurde durch hohe Konzentrationen an Kupferionen, nach Vorsättigung in situ, gehemmt (H. C. Yohe und A. Rosenberg, Neurochemical Research 3, 101–113 (1978)). Es wurde nachgewiesen, dass cytosolische und membranassozüerte Neuraminidase I durch Kupferionen in einer Konzentration von etwa 1 mM in teilweise gereinigten Extrakten von Rattenleber oder Rattenskelettmuskel gehemmt wird (T. Miyagi et al., Glycoconjugates Journal 10, 45–49 (1993)).
Kulturmedien und Additive enthalten oft Spurenelemente und Metallionen, wie z.B. Kupfer, um optimales Zellwachstum zu ermöglichen (z.B. "Protease Peptone 2 und 3", "Primatone RL" und "Primatone HS", die im Handel erhältlich sind (Sheffield, England; Difco, USA); japanisches Patent Nr. 93JP-0171420; internationale Veröffentlichung Nr. WO 90/03430; für die Zusammensetzung verschiedener Medien, z.B. DMEM- und HAM-F12-Medium, siehe Kulturmedienformulierungen im American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, sechste Auflage, S. 346–349 (1988)). Ein serumfreies Medium, das Zn (5–100 μM) oder Cu (0,1–50 μM) enthält, wurde im japanischen Patent Nr. 247618 zur Züchtung von Vaskularendothelzellen vorgeschlagen. Lanier und Volkman berichteten über eine Steigerung der Ausbeute an Baculovirus-Expressionsvektoren von rekombinanten Baculoviren, die in Insekten- (Schmetterlings-) Gewebekulturen in einem Medium mit 2 mM CuSO₄ gebildet wurden (L. M. Lanier, und L. M. Volkman, In Vitro 32(3) Pt. 2: 8A (1996)). Hultberg et al. fanden heraus, dass Metalle die Menge an in HeLa-Zellkulturmedien reduziertem Glutathion erhöhte und dass Kupferionen auch die Menge an in dem Medium reduziertem Homocystein erhöhten, und zwar in Kupferionenkonzentrationen, die sich nicht auf das Zellwachstum auswirkten (1-100 μm) (B. Hultberg et al., Toxicology 117, 89–97 (1997). Zweiwertige Metallionen, wie z.B. Cu²⁺ und Zn²⁺, wurden in löslicher Form in einer Konzentration von 70–120 mg/l zum Serum zugesetzt, und das Serum wurde zu einem Zellkulturmedium zugesetzt, um das Zellwachstum zu fördern (deutsches Patent Nr. 155 328).
Es zeigte sich, dass der Zusatz von Cu⁺⁺ zu einem Chinahamster-Eierstockzellkulturüberstand Neuraminidaseaktivität hemmt (Gramer et al., Biotechnol. 13, 692–698).
Eukaryotische Zellen, insbesondere Säugetierzellen, wie z.B. Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen), erwiesen sich jedoch als empfindlich gegenüber Cu²⁺-Konzentrationen in einem Kulturmedium (Camakaris et al., Human Molecular Genetics 4, 2117–2123 (1995); Steinebach & Wolterbeek, J. Inorganic Biochemistry 53, 27–48 (1994); deutsches Patent Nr. 155 328; Y. Sakai et al., Cytotechnology 14 (Suppl. 1), 7–36 (1994)). Es wurde herausgefunden, dass CHO-K1-Zellen eine LD₅₀ von 125 μM Cu²⁺ in einem mit Kupfer ergänzten Medium aufweisen (J. Camakaris et al., Human Molecular Genetics 4, 2117–2123 (1995)).
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von Glykoproteinen durch Säugetierzellkultur bereit, welche die Sialsäurekomponente von Oligosacchariden der produzierten Glykoproteine beibehält.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von Glykoproteinen durch eukaryotische Zellkultur bereit, die ein Glykoproteinprodukt ergeben, das mit einem oder mehreren Sialsäureresten endende Oligosaccharide enthält. Vorteilhafterweise ermöglicht das Zellkulturverfahren der vorliegenden Erfindung die Gewinnung eines Glykoproteinprodukts, dessen Oligosaccharide nicht durch Abbauvorgänge, wie sie bei herkömmlichen Zellkulturverfahren vorkommen, beeinträchtigt sind. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung überwinden die Probleme der Desialylierung der Oligosaccharid-Seitenketten eines Glykoproteins, die bei herkömmlichen Glykoprotein-Herstellungsverfahren auftreten. Vorteilhafterweise bringt die Erfindung durch die Gewinnung größerer nützlicher Mengen an Glykoproteinprodukt wirtschaftliche und kommerzielle Vorteile mit sich.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Glykoproteinen durch eukaryotische, insbesondere Säugetier-Zellkultur bereit, die das Kultivieren einer Wirtszelle, die ein Glykoprotein exprimiert, in Gegenwart von Kupferionen in einem Zellkulturmedium in einer Konzentration, die wirksam den Verlust an Sialsäure minimiert, umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt somit verschiede Zellkulturverfahren bereit, die bestimmte Glykoformen von Glykoproteinen, die in Säugetierzellkultur erzeugt werden, beibehalten.
In einer speziellen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Produktion eines Glykoproteins in Säugetierzellkultur bereit, indem einem Kulturmedium, in dem das Glykoprotein produzierende Zeilen gezüchtet werden, eine wirksame Menge Cu²⁺ zugesetzt wird. Gemäß einem Aspekt der Erfindung liegt die Konzentration von Cu²⁺ zwischen etwa 50 μM und 5 mM. Vorzugsweise liegt die Cu²⁺-Konzentration im Medium zwischen etwa 0,1 mM und etwa 2,0 mM, noch bevorzugter beträgt sie zumindest etwa 250 μM. Noch bevorzugter liegt die Kupferionenkonzentration im Bereich von etwa 0,1 mM bis etwa 1 mM, insbesondere im Bereich von etwa 0,1 mM und etwa 0,5 mM, noch bevorzugter beträgt sie zumindest etwa 350 μM, und zumindest etwa 380 μM. Der obige Parameter wird gesteuert, um den Sialsäuregehalt des reifen Glykoproteins zu beeinflussen.
In einem speziellen Aspekt der Erfindung werden die das Glykoprotein produzierenden Zellen in einem serumfreien Medium gezüchtet. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Säugetier-Wirtszelle, vorzugsweise eine Chinahamster-Eierstockzelle (CHO-Zelle), einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf CHO-K1-, CHO-pro3^–-, CHO-DG44-, CHO-DUXB11- und CHO DP12-Zellen. Andere für das Verfahren der Erfindung geeignete Wirtszellen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Mausmyelomzellen, NS0, und Hybridomzellen, wie z.B. Maushybridomzellen, Babyhamster-Nierenzellen (BHK-Zellen), COS-Zellen, HeLa-Zellen, C127-Zellen, Maus-L-Zellen und Ltk^–-Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Sialsäuregehalts des reifen Glykoproteins bereit, das aus einer Säugetier-Wirtszellkultur gewonnen wird, umfassend das Kontaktieren der das Glykoprotein exprimierenden Zellen mit Cu²⁺ im Kulturmedium in einer Konzentration, die Desialylierung im Zellkulturmedium hemmt oder verhindert. Vorzugsweise beträgt die Cu²⁺-Konzentration zumindest etwa 150 μM, noch bevorzugter zumindest etwa 380 μM. Vorzugsweise sind die Wirtszellen CHO-Zellen. Gemäß diesem Aspekt der Erfin dung ermöglicht die Kultivierung einer Wirtszelle in einer Konzentration von etwa 380 μM die Gewinnung eines Glykoproteins mit einem erhöhten Sialsäuregehalt.
Die Erfindung stellt ferner in einer speziellen Ausführungsform ein Zellkulturverfahren mit zwei oder drei Zellkulturphasen bereit. Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Regelung des Sialsäuregehalts eines Glykoproteins bereit, das mithilfe einer Säugetier-Wirtszellkultur hergestellt wurde, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Wirtszelle, die das Glykoprotein exprimiert, in einer Wachstumsphase über einen Zeitraum und unter Bedingungen, um das Zellwachstum zu maximieren. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung folgt auf die Wachstumsphase gegebenenfalls eine Übergangsphase folgt, in der die Zellkulturparameter im Hinblick auf den gewünschten Sialsäuregehalt des reifen Glykoproteins selektiert und eingesetzt werden. Auf die Wachstumsphase oder die Übergangsphase folgt eine Produktionsphase der Zellkultur, in der Produktionsparameter, die gegebenenfalls in der Übergangsphase selektiert und eingesetzt wurden, beibehalten werden und ein Glykoproteinprodukt produziert und gewonnen wird. Der Zusatz von Cu²⁺ zum Zellkulturmedium nach der Wachstumsphase, während der Übergangsphase oder vorteilhafterweise zu Beginn der Produktionsphase, die auf die Übergangsphase folgt, liefert ein Protein mit einer erhöhten Menge an Sialsäure, die beibehalten wird.
Beschreibung der Zeichnungen
1: 1 zeigt die Akkumulation eines Glykoproteins (TNFR1-IgG1) in einer Zellkulturflüssigkeit (☐) und den Sialsäure- (SA-) Gehalt
von TNFR1-IgG1 in einer repräsentativen Kultur ohne Kupfer. CHO-Zellen, die TNFR1-IgG1 exprimieren, wurden unter optimalen Wachstumsbedingungen 2 Tage lang gezüchtet. Am zweiten Tag wurden die Temperatur auf 33°C gesenkt, und ein komplexes Feed-Gemisch, das aus konzentrierten Medienkomponenten und Pepton bestand, wurde zur Kultur zugesetzt. Wie ersichtlich ist, nimmt der Sialsäuregehalt des produzierten Glykoproteins nach etwa sechs Tagen in der Kultur stetig ab, während die Kultur bis zu 13 Tage lang produktiv ist.
2: Sialsäure- (SA-) Gehalt von TNFR1-IgG1 nach der Inkubation einer Zellkultursuspension aus einer Perfusionskultur mit hoher Zellkonzentration (6% gepacktes Zellvolumen, 77% Lebensfähigkeit zu Beginn der Inkubation) im Vergleich zu dem Ausgangssialsäuregehalt vor der Inkubation. Es wurde eine Probe der Perfusionskultur gezogen und in einer Spinnerflasche mit 0,1 mM und 5 mM CuCl₂ 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Alle Kulturen starben aufgrund von Sauerstoffmangel während der Inkubationsperiode ab, aber das Kupfer stabilisierte wirksam den SA-Gehalt in dosisabhängiger Weise.
3: 3 zeigt die Auswirkungen von CuCl₂ auf das Wachstum von CHO-Zellen, die TNFR1-IgG1 produzieren. CuCl₂ wurde vor der Inokulation mit Zellen in Konzentrationen von 0–3,2 mM zum Kulturmedium zugesetzt. Wachstumshemmung konnte oberhalb von 0,2 mM detektiert werden.
4: 4 zeigt die Auswirkungen von CuCl₂ auf die Lebensfähigkeit von CHO-Zellen, die TNFR1-IgG1 produzieren, unter Wachstumsbedingungen. CuCl₂ wurde vor der Inokulation mit Zellen in Konzentrationen von 0–3,2 mM zum Kulturmedium zugesetzt. Toxische Wirkung wurde bei Konzentrationen oberhalb von 0,2 mM beobachtet. Konzentrationen oberhalb von 0,4 mM führten zu raschem Zelltod.
5: 5 zeigt die Auswirkungen von 0–5 mM CuCl₂ auf die Lebensfähigkeit von CHO-Zellen, die TNFR1-IgG1 produzieren, bei Inkubation bei 37 und 33°C. Die toxische Wirkung von CuCl₂ war bei 37 und 33°C ähnlich.
6: 6 zeigt Lebensfähigkeitsprofile von Produktionskulturen mit 0 mM, 0,5 mM und 1,0 mM CuCl₂, das an Tag 6 oder 8 zu den Kulturen zugesetzt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass Kupfer nach einer Wachstumsphase und während einer Übergangsphase oder vor oder während einer Produktionsphase zu Produktionskulturen zugesetzt werden kann, ohne sich schädlich auf die Lebensfähigkeit der Kultur auszuwirken.
7: 7 zeigt Lebensfähigkeitsprofile von Produktionskulturen mit 0 mM, 0,38 mM und 0,5 mM CuCl₂, das an Tag 6 zu den Kulturen zugesetzt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Kupferkonzentration von 0,38 mM in Bezug auf die Lebensfähigkeit keine großen Unterschiede zu 0 und 0,5 mM aufweist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Die Kohlenhydratgruppierungen der vorliegenden Erfindung werden unter Verwendung herkömmlicher Nomenklatur zur Beschreibung von Oligosacchariden beschrieben. Ein Überblick über Kohlenhydratgruppierungen, bei dem diese Nomenklatur verwendet wurde, findet sich bei Hubbard und Ivatt, Ann. Rev. Biochem. 50, 555–583 (1981). Diese Nomenklatur umfasst beispielsweise Man, das für Mannose steht; GIcNAc, das für 2-N-Acetylglucosamin steht; Gal, das für Galactose steht; und Glc, das für Glucose steht. Sialsäuren (SAs) werden mit der Abkürzung NeuNAc für 5-N-Acetylneuraminsäure und NeuNGc für 5-Glykolylneuraminsäure beschrieben (J. Biol. Chem., 257, 3347 (1982); J. Biol. Chem. 257, 3352 (1982)).
"Glykoprotein" bezieht sich hierin im Allgemeinen auf Peptide und Proteine mit mehr als etwa zehn Aminosäuren und zumindest einer Oligosaccharid-Seitenkette. Die Glykoproteine können homolog zur Wirtszelle sein, vorzugsweise sind sie aber heterolog, d.h. fremd, zur verwendeten Wirtszelle, wie z.B. ein Humanprotein, das von einer Chinahamster-Eierstockzelle produziert wird. Vorzugsweise werden Säugetier-Glykoproteine (Glykoproteine, die ursprünglich von einem Säugetierorganismus stammen) verwendet, noch bevorzugter solche, die direkt in das Medium sekretiert werden. Beispiele für Säugetier-Glykoproteine umfassen Moleküle, wie z.B. Zytokine und ihre Rezeptoren, sowie chimäre Proteine, die Zytokine oder ihre Rezeptoren umfassen, einschließlich beispielsweise den Tumor-Nekrose-Faktor-α und -β, ihre Rezeptoren (TNFR-1; EP 417.563 , veröffentlicht am 20. März 1991; und TNFR-2; EP 417.014 , veröffentlicht am 20. März 1991) und Derivate davon; Renin; Wachstums hormone, einschließlich menschlicher Wachstumshormone und Rinderwachstumshormone; Somatotropin freisetzendes Hormon; Parathormon; thyreoidstimulierendes Hormon; Lipoproteine; α-1-Antitrypsin; die Insulin-A-Kette; die Insulin-B-Kette; Proinsulin; follikelstimulierendes Hormon; Calcitonin; luteinisierendes Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren, wie z.B. Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und von-Willebrand-Faktor; Antigerinnungsfaktoren, wie z.B. Protein C; atrialer natriuretischer Faktor; Lungentenside; Plasminogenaktivator, wie z.B. Urokinase oder menschliches Urin oder Plasminogenaktivatoren vom Gewebetyp (t-PA); Bombesin; Thrombin; hämatopoetischen Wachstumsfaktor; Enkephalinase; RANTES ("regulated on activation normally T-cell expressed and secreted"); von aktivierten Humanmakrophagen gebildete Zytokine (MIP-1-α); Serumalbumine, wie z.B. Humanserumalbumin; Müllerschen Hemmstoff; die Relaxin-A-Kette; die Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Mikrobenproteine, wie z.B. β-Lactamase; DNase; Inhibin; Activin; Vaskulärendothelwachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; neurotrophe Faktoren, wie z.B. neurotrophen Knochenfaktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6) oder Nervenwachstumsfaktoren, wie z.B. NGF-β, Blutplättchenaktivierungsfaktor (PDGF); Fibroblastenwachstumsfaktoren, wie z.B. aFGF und bFGF; Epidermiswachstumsfaktor (EGF); transformierende Wachstumsfaktoren (TGF), wie z.B. TGF-α und TGF-β, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5; insulinähnlichen Wachstumsfaktor I und II (IGF-I und IGF-II); Des(1-3)-IGF-I (Hirn-IGF-I), insulinähnliche Wachstumsfaktoren bindende Proteine; CD-Proteine, wie z.B. CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immuntoxine; morphogenetisches Knochenprotein (BMP); Interferon, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; Koloniewachstum stimulierende Faktoren (CSFs), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (IIs), z.B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zell-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; Zerfall beschleunigenden Faktor; virale Antigene, wie z.B. Abschnitte der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing-Rezeptoren; Adressine; Regulatorproteine; Antikörper; chimäre Proteine, wie z.B. Immunadhäsine (Immunadhäsine werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.116.964, 5.714.147 und 5.336.603 beschrieben, deren Offenbarungen durch Ver weis hierin aufgenommen sind; Immunadhäsine umfassen CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin oder den homing-Rezeptor (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); und Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4 (Linsley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144); den TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–19539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); und Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); den Interferon-γ-Rezeptor (Kurschner et al., J. Biol. Chem. 267, 9354–9360 (1992)); 4-IBB (Chalupny et al., PNAS USA 89, 10360–10364 (1992)) und den IgE-Rezeptor-α (Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol. 115, Zusammenfassung Nr. 1448 (1991)) sowie Fragmente der oben angeführten Polypeptide.
Der Begriff "Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst spezifisch einzelne monoklonale Antikörper (einschließlich Agonisten- und Antagonisten-Antikörper) sowie Antikörperzusammensetzungen mit Polyepitop-Spezifität. Der Begriff "Antikörper" umfasst spezifisch monoklonale Antikörper (einschließlich monoklonale Antikörper voller Länge), polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper) und Antikörperfragmente. Beispiele für Antikörper, die im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Anti-IL-8, St. John et al., Chest 103, 932 (1993) und internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/23865; Anti-CD11a, Filcher et al., Blood 77, 249–256, Steppe et al., Transplant Intl. 4, 3–7 (1991) und Hourmant et al., Transplantation 58, 377–380 (1994); Anti-IgE, Presta et al., J. lmmunol. 151, 2623–2632 (1993) und internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/19181; Anti-HER2, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285–4289 (1992) und internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/20798; Anti-VEGF, Jin Kim et al., Growth Factors 7, 53–64 (1992) und internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/30046; und Anti-CD20, Maloney et al., Blood 84, 2457–2466 (1994) und Liu et al., J. lmmunol. 130, 3521–3526 (1987).
Die Begriffe "Zellkulturmedium" und "Kulturmedium" sowie "Fermentationsmedium" beziehen sich auf eine Nährlösung zur Züchtung von Säugetierzellen, die typischerweise zumindest eine Komponente aus einer oder mehreren der folgenden Kategorien bereitstellt:

1) eine Energiequelle, üblicherweise in Form eines Kohlenhydrats, wie z.B. Glucose;
2) alle essenziellen Aminosäuren und normalerweise den grundlegenden Satz aus zwanzig Aminosäuren plus Cystein;
3) Vitamine und/oder organische Verbindungen, die in niedrigen Konzentrationen erforderlich sind;
4) freie Fettsäuren; und
5) Spurenelemente, worin Spurenelemente als anorganische Verbindungen oder natürlich vorkommende Elemente definiert sind, die typischerweise in sehr geringen Konzentrationen erforderlich sind, üblicherweise im mikromolaren Bereich.

Die Nährlösung kann gegebenenfalls mit einer oder mehreren Komponenten aus einer oder mehreren der folgenden Kategorien ergänzt sein:

1) Hormone und andere Wachstumsfaktoren, wie z.B. Insulin, Transferring und Epidermis-Wachstumsfaktor;
2) Salze und Puffer, wie z.B. Calcium, Magnesium und Phosphat;
3) Nucleoside und Basen, wie z.B. Adenosin, Thymidin und Hypoxanthin; und
4) Protein- und Gewebehydrolysate.

Das Zellkulturmedium wird ist normalerweise "serumfrei", wenn das Medium im Wesentlichen frei von Seren aus Säugetierquellen (z.B. fötalem Rinderserum [FBS]) ist. Mit "im Wesentlichen frei" ist gemeint, dass das Zellkulturmedium zwischen etwa 0 und 5% Serum, vorzugsweise zwischen etwa 0 und 1 %, insbesondere zwischen etwa 0 und 0,1% Serum, enthält.
Die Begriffe "Säugetier-Wirtszelle", "Wirtszelle", "Säugetierzelle und dergleichen beziehen sich auf Zelllinien, die von Säugetieren stammen und in der Lage sind, zu wachsen und zu überleben, wenn sie in entweder eine Monoschichtkultur oder Sus pensionskultur in einem Medium mit den geeigneten Nährstoffen oder Wachstumsfaktoren gegeben werden. Die für eine bestimmte Zelllinie erforderlichen Wachstumsfaktoren können leicht ohne übermäßiges Experimentieren empirisch bestimmt werden, wie beispielsweise in Mammalian Cell Culture, J. P. Mather (Hrsg.), Plenum Press, N. Y., USA (1984) und Barnes und Sato, Cell 22, 649 (1980) beschrieben. Typischerweise sind die Zellen in der Lage, große Mengen eines bestimmten Glykoproteins von Interesse zu exprimieren und in das Kulturmedium zu sekretieren. Beispiele für geeignete Säugetier-Wirtszellen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können Chinahamster-Eierstockzellen, CHO/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); dp12.CHO-Zellen ( EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562; ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; und FS4-Zellen umfassen.
Bevorzugte Wirtszellen umfassen Chinahamster-Eierstockzellen CHO/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)) und dp12.CHO-(CHO-DP12-) Zellen ( EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989); sowie Subklone von CHO-Zellen, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf CNO-K1-, CHO-pro3-CHO-DUXB11- und CHO-DG44-Zellen (Urlaub et al., Som. Cell Molec. Genet. 12, 555–556 (1986)).
Der Begriff "Pepton" bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf einen Medienzusatz, der im Wesentlichen aus einem hydrolysierten Protein besteht. Die Quelle dieses Proteins können tierische Nebenprodukte aus Schlachthäusern, gereinigte Gelatine oder Pflanzenmaterial sein. Das Protein wird typischerweise unter Verwendung von Säure, Hitze oder unterschiedlichen Enzympräparaten hydrolysiert. Bevorzugte Peptongemische sind beispielsweise "Protease Peptone 2 und 3", "Primatone RL" und "Primatone HS", die beide im Handel erhältlich sind (Difco, USA; Sheffield, England).
Die "Wachstumsphase" der Zellkultur bezieht sich auf den Zeitraum exponentiellen Zellwachstums (log-Phase), in dem sich Zellen im Allgemeinen rasch teilen. Während dieser Phase werden Zellen für eine Zeitspanne, üblicherweise 1–4 Tage lang, und unter solchen Bedingungen kultiviert, dass das Zellwachstum maximiert wird. Die Bestimmung des Wachstumszyklus der Wirtszelle kann ohne übermäßiges Experimentieren für die jeweilige Wirtszelle erfolgen. "Für eine Zeitspanne und unter solchen Bedingungen, dass das Zellwachstum maximiert wird" und dergleichen bezieht sich auf Kulturbedingungen, die sich für eine bestimmte Zelllinie als optimal für Zellvermehrung und Zellteilung erwiesen. Während der Wachstumsphase werden Zellen in einem Nährmedium mit den erforderlichen Additiven bei im Allgemeinen etwa 30–40°C, vorzugsweise etwa 37°C, in einer befeuchteten, kontrollierten Atmosphäre kultiviert, sodass optimales Wachstum für die jeweilige Zelllinie erreicht wird. Zellen werden für eine Zeitspanne von zwischen etwa einem und vier Tagen, üblicherweise zwischen zwei und drei Tagen, in der Wachstumsphase gehalten.
Die "Übergangsphase" der Zellkultur bezieht sich auf die Zeitspanne, während derer die Kulturbedingungen für die Produktionsphase hergestellt werden. Während der Übergangsphase werden Umweltfaktoren, wie z.B. die Kupferionenkonzentration und Temperatur, von den Wachstumsbedingungen zu den Produktionsbedingungen übergeführt.
Die "Produktionsphase" der Zellkultur bezieht sich auf den Zeitraum, in der das Zellwachstum ein Plateau erreicht hat oder auf einem nahen konstanten Wert gehalten wird. In der Produktionsphase ist das logarithmische Zellwachstum beendet, und die Proteinproduktion beginnt. Während dieses Zeitraums wird das Medium im Allgemeinen ergänzt, um eine andauernde Proteinproduktion zu unterstützen und das gewünschte Glykoproteinprodukt zu erhalten.
Die Begriff "Expression" oder "exprimieren" beziehen sich hierin auf eine Transkription und Translation innerhalb einer Wirtszelle. Der Expressionswert eines Produktgens in einer Wirtszelle kann entweder aufgrund der Menge and entsprechender mRNA, die in der Zelle vorhanden ist, oder aufgrund der Menge an Protein, für wel ches das Produktgen kodiert, das von der Zelle produziert wird, bestimmt. Von einem Produktgen transkribierte mRNA wird beispielsweise vorzugsweise durch Northern-Hybridisierung quantifiziert. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 7.3–7.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Ein Protein, für das ein Produktgen kodiert, kann entweder durch Testen der biologischen Aktivität des Proteins oder durch Tests, die von solcher Aktivität unabhängig sind, wie z.B. Western-Blotting oder Radioimmuntests unter Verwendung von Antikörpern, die mit dem Protein reagieren können, quantifiziert werden. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 18.1–18.88, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Die Begriffe "Protein", "Peptid" und "Polypeptid" werden hierin austauschbar verwendet, um ein Aminosäurepolymer oder eine Gruppe aus zwei oder mehr wechselwirkenden oder gebundenen Aminosäurepolymeren zu bezeichnen.
II. Zellkulturverfahren
Die Erfinder haben entdeckt, dass Kupferionen (zwischen etwa 50 μM und 5 mM Cu²⁺) in einem glykoproteinproduzierenden eukaryotischen Wirtszellkulturmedium zu einem Glykoproteinprodukt mit erhöhtem Sialsäuregehalt in der Oligosaccharid-Seitenkette führt. Da Proteine, die einen oder mehrere Sialsäurereste pro komplexer Oligosaccharidstruktur exprimieren, in vivo geringere Clearanceraten aufweisen, kann die Clearancerate des produzierten Glykoproteins in einem breiten Rahmen durch den allgemeinen Sialylierungsgrad des Präparats manipuliert werden. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Steigerung der Sialylierung eines Glykoproteins beriet, das aus einer eukaryotischen und insbesondere Säugetier-Zellkultur gewonnen werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden eukaryotische Zellen, insbesondere Säugetierzellen, kultiviert, um ein gewünschtes Glykoproteinprodukt herzustellen. Bei der Auswahl einer Wirtszelle zur Produktion des Glykoproteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist es wichtig zu erkennen, dass unterschiedliche Wirtszellen charakteristi sche und spezifische Mechanismen zur translationalen und posttranslationalen Reifung und Modifikation (z.B. Glykosylierung, Spaltung) der exprimierten Proteine aufweisen. Es sollten geeignete Zelllinien ausgewählt werden, um sicherzustellen, dass die gewünschten posttranslationalen Modifikationen möglich sind. Alternativ dazu können Wirtszellen so modifiziert werden, dass sie ein gewünschtes Genprodukt exprimieren, das für die spezifische posttranslationale Modifikation erforderlich ist.
Genauer gesagt sollten die Säugetierzellen, die das gewünschte Protein exprimieren, bestimmte Enzyme exprimieren oder so manipuliert werden, dass sie diese exprimieren, sodass unter hierin beschriebenen geeigneten Bedingungen die geeignete posttranslationale Modifikation in vivo erfolgt. Die Enzyme umfassen jene Enzyme, die für die Addition und Fertigstellung von N- und O-gebundenen Kohlenhydraten erforderlich sind. Die Enzyme umfassen gegebenenfalls Oligosaccharyltransferase, α-Glucosidase I, α-Glucosidase II, ER-α(1,2)mannosidase, Golgi-α-mannodase I, N-Acetylglucosaminyltransferase I, Golgi-α-mannodase II, N-Acetylgluocosaminyltransferase II, α(1,6)Fucosyltransferase und β(1,4)Galactosyltransferase. Außerdem exprimiert die Wirtszelle die geeignete Sialyltransferase, von der erwartet werden kann, dass sie die endständige Sialsäure an eine geeignete Position und durch eine geeignete Bindung als Teil des Wirtszellgenoms bindet. Gegebenenfalls kann die Wirtszelle dazu gebracht werden, die geeigneten Sialyltransferasen zu exprimieren, beispielsweise durch Transfektion der Wirtszelle mit für die Sialyltransferase kodierender DNA.
Es ist zu erwarten, dass die oben beschriebenen Sialyltransferasen den endständigen Sialsäurerest an die geeignete Oligosaccharid-Kernstruktur, wie z.B. Galβ1-4GIcNAc, hinzufügen. Geeignete Sialyltransferasen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf jene Sialyltransferasen, welche die komplexe Sialylierung und Verzweigung der N- und O-gebundenen Oligosaccharide katalysieren.
Der Gesamtgehalt an Sialsäure im Glykoprotein kann durch Regelung der Zellkulturparameter beeinflusst werden, die sich auf die zellspezifische Produktivität auswirken (sieh z.B. US-Patent 5.705.364). Faktoren, die sich auf die zellspezifische Produktivität auswirken, sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Faktoren, die sich auf die DNA/RNA-Kopienzahl auswirken, Faktoren, die sich auf die RNA auswirken, wie z.B. RNA stabilisierende Faktoren, Mediennährstoffe und andere Zusätze, die Konzentration der Transkriptionsenhancer, die Osmolalität der Kulturumgebung, die Temperatur und den pH der Zellkultur und dergleichen.
Zur Kultivierung der Säugetierzellen, die das gewünschte Protein exprimieren und in der Lage sind, die gewünschten Kohlenhydrate an spezifischen Positionen und durch spezifischen Bindungen hinzuzufügen, können zahlreiche Kulturbedingungen eingesetzt werden, wobei besonderes Augenmerk auf die zu kultivierende Wirtszelle gelegt wird. Geeignete Kulturbedingungen für Säugetierzellen sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt (J. Immunol. Methods, 56, 221–234 (1983)) oder können von Fachleuten leicht bestimmt werden (siehe z.B. Animal Cell Culture: A Practical Approach, 2. Aufl., D. Rickwood und B. D. Hames, Hrsg., Oxford University Press, New York, USA (1992)) und variieren je nach gewählter Wirtszelle.
Die Säugetierzellkultur der vorliegenden Erfindung wird in einem Medium angelegt, die für die jeweils kultivierte Zelle geeignet ist. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Nam's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) sind Beispiele für Nährlösungen. Außerdem kann jedes der in Ham und Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); US-Patente Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 5.122.469 oder 4.560.655; internationale Veröffentlichungen Nr. WO 90/03430 und WO 87/00195; deren Offenbarungen alle durch Verweise hierin aufgenommen sind, als Kulturmedien verwendet werden. Jedes dieser Medien kann je nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferring oder Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. dem Arzneimittel Gentamycin^TM), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind), Lipiden (wie z.B. Linol- oder anderen Fettsäuren) und geeigneten Trägern sowie Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Jeder andere erforderliche Zusatz kann ebenfalls in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
In eine speziellen Ausführungsform ist die Säugetier-Wirtszelle eine CHO-Zelle, vorzugsweise eine CHO-CUX(DHFR-) oder ein Subklon davon, wie z.B. eine CHO-K1-, CHO-pro3^–-, CHO-DG44-, CHO-DP12-Zelle, und ein geeignetes Medium umfasst eine Grundmedienkomponente, wie z.B. eine auf DMEM/HAM-F12 basierende Formulierung (für eine Zusammensetzung aus DMEM- und HAM-F12-Medien und insbesondere serumfreie Medien siehe die Kulturmedienformulierungen im American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 6. Aufl., S. 346–349 (1988)) (die Formulierungen des im US-Patent 5.122.469 beschriebenen Mediums sind insbesondere geeignet) mit modifizierten Konzentrationen einiger Komponenten, wie z.B. Aminosäuren, Salzen, Zucker und Vitaminen, und gegebenenfalls Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; rekombinantem menschlichem Insulin, hydrolysiertem Pepton, wie z.B. Protease Peptone 2 und 3, Primatone HS oder Primatone RL (Difco, USA; Sheffield, England) oder einem Äquivalent; einem Zellschutzmittel, wie z.B. Pluronic F68 oder dem äquivalenten Pluronic-Polyol; Gentamycin; und Spurenelementen. Vorzugsweise ist das Zellkulturmedium serumfrei.
Die Glykoproteine der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem Zellen gezüchtet werden, die das gewünschte Protein unter verschiedenen Zellkulturbedingungen exprimieren. Zellkulturverfahren zur Produktion von Proteinen in großem oder kleinem Umfang sind beispielsweise im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung von Nutzen. Verfahren, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf einen Fließbett-Bioreaktor, einen Holfaser-Bioreaktor, Drehflaschen-Kulturen oder Rührkessel-Bioreaktorsysteme können verwendet werden, die beiden Letzteren, mit oder ohne Mikroträger, und alternativ im Batch-, Fed-Batch- oder kontinuierlichen Modus betrieben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellkultivierung der vorliegenden Erfindung in einem Rührkessel-Bioreaktorsystem durchgeführt, und ein Fed-Batch-Kulturverfahren wird eingesetzt. In der bevorzugten Fed-Batch-Kultur werden die Säugetier-Wirtszellen und das Kulturmedium anfangs in ein Kulturgefäß gefüllt, und weitere Kulturnährstoffe werden während der Kultivierung kontinuierlich oder in separaten Einheiten zur Kultur zugeführt, mit oder ohne periodische Zell- und/oder Produkternte vor Beendigung der Kultur. Die Fed-Batch-Kultur kann beispielsweise eine semikontinuierliche Fed-Batch-Kultur umfassen, worin regelmäßig die gesamte Kultur (einschließlich Zellen und Medium) entfernt und durch ein frisches Medium ersetzt wird. Eine Fed-Batch-Kultur unterscheidet sich von einer normalen Batch-Kultur, bei der alle Komponente für die Zellkultivierung (einschließlich Zellen und alle Kulturnährstoffe) zu Beginn der Kultivierung zum Kulturgefäß zugesetzt werden. Eine Fed-Batch-Kultur kann ferner von einer Perfusionskultur unterschieden werden, insofern der Überstand während des Verfahrens nicht aus dem Kulturgefäß entfernt wird (bei der Perfusionskultur werden die Zellen in der Kultur zurückgehalten, z.B. durch Filtration, Einkapselung, Verankerung auf Mikroträgern, Sedimentation usw., und das Kulturmedium wird kontinuierlich oder periodisch zugeführt und wieder aus dem Kulturgefäß entfernt).
Ferner können die Zellen der Kultur gemäß jedem beliebigen Schema oder Routineverfahren vermehrt werden, die für die jeweilige Wirtszelle und den jeweiligen Produktionsplan geeignet sind. Somit umfasst die vorliegende Erfindung ein Einschritt- oder Mehrschritt-Kulturverfahren. Bei einer Einschrittkultur werden die Wirtszellen in eine Kulturumgebung inokuliert, und die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden in einer einzigen Produktionsphase der Zellkultur eingesetzt. Alternativ dazu wird eine Mehrschrittkultur bereitgestellt. Bei der Mehrschrittkultur können die Zellen in einer Reihe von Schritten oder Phasen kultiviert werden. Die Zellen können beispielsweise in einem ersten Schritt oder einer Wachstumsphasenkultur gezüchtet werden, in der Zellen, die möglicherweise vorher gelagert waren, in ein Medium inokuliert werden, das zur Förderung des Wachstums und einer hohen Lebensfähigkeit geeignet ist. Die Zellen können für eine geeigneten Zeitspanne in der Wachstumsphase gehalten werden, indem frisches Medium zur Wirtszellenkultur zugesetzt wird.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Fed-Batch- oder kontinuierliche Zellkulturbedingungen bereitgestellt, um das Wachstum der Säugetierzellen während der Wachstumsphase der Zellkultur zu fördern. In der Wachstumsphase werden die Zellen unter Bedingungen und für eine Zeitspanne kultiviert, um das maximale Zellwachstum zu erreichen. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH, gelöster Sauerstoff (dO₂) und dergleichen, werden an den jeweiligen Wirt angepasst und sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen wird der pH unter Verwendung entweder einer Säure (z.B. CO₂) oder einer Base (z.B. Na₂CO₃ oder NaOH) auf einen Wert zwischen etwa 6,5 und 7,5 eingestellt. Ein geeigneter Temperaturbereich zur Kultivierung von Säugetierzellen, wie z.B. CNO-Zellen, liegt zwischen etwa 30 und 38°C, vorzugsweise beträgt die Temperatur aber 37°C, und ein geeigneter dO₂ liegt zwischen 5 und 90% Luftsättigung.
In einem bestimmten Stadium können die Zellen inokuliert werden, um eine Produktionsphase oder einen Produktionsschritt der Zellkultur zu starten. Alternativ dazu kann, wie oben beschrieben, die Produktionsphase oder der Produktionsschritt kontinuierlich mit der Inokulation oder mit der Wachstumsphase oder dem Wachstumsschritt erfolgen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Zellkulturumgebung während der Produktionsphase der Zellkultur kontrolliert. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Kupferionenkonzentration im Kulturmedium so manipuliert, dass der gewünschte Sialsäuregehalt erreicht wird und im resultierenden Glykoprotein erhalten bleibt. In einem bevorzugten Aspekt geht der Produktionsphase des Zellkulturverfahrens eine Übergangsphase der Zellkultur voraus, in der Parameter (wie z.B. Zusatz von Kupferionen) für die Produktionsphase der Zellkultur geschaffen werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration an Kupferionen geregelt, um die Desialylierung zu regeln, was zu einer Erhöhung der Sialsäure in dem durch das Verfahren der Erfindung erhaltenen Glykoprotein führt. Eine Konzentration an Kupferionen von zumindest 50 μM wird verwendet und je nach kultivierter Wirtszelle modifiziert, und der gewünschte Sialsäuregehalt des Glykoproteins wird hergestellt. Bei der Bestimmung der geeigneten Konzentration an Kupferionen kann auf 2–7 sowie auf die in den nachstehenden Beispielen beschriebene Zellkulturphase und Lebensfähigkeit Bezug genommen werden. Gemäß der Erfindung werden die Kupferionenkonzentrationen unter Berücksichtigung anderer Prozessparameter, wie z.B. der Osmolalität der Produktionsphase, die die zellspezifische Produktivität und den Sialsäuregehalt des produzierten Glykoproteins beeinflussen kann, bestimmt.
In einer speziellen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Glykoproteins in Säugetierzellkultur durch Zusatz einer wirksamen Menge an Cu²⁺ zu einem Kulturmedium bereit, in dem das Glykoprotein produzierende Zellen gehalten werden. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Glykoprotein-Produktionsphase, gefolgt von einer Wachstums- und gegebenenfalls Übergangsphase eingesetzt, und die Konzentration von Cu²⁺ liegt zwischen etwa 50 μM und 5 mM. Vorzugsweise liegt die Cu²⁺-Konzentration im Medium zwischen etwa 0,1 mM und etwa 2 mM, vorzugsweise beträgt sie zumindest etwa 250 μM. Noch bevorzugter liegt die Kupferionenkonzentration im Bereich von etwa 0,1 mM bis etwa 1 mM, insbesondere im Bereich von etwa 0,1 mM bis etwa 0,5 mM, noch bevorzugter beträgt sie zumindest etwa 350 μM, zumindest aber etwa 380 μM.
Alternativ dazu können für andere Säugetier-Wirtszellen und andere Glykoproteine kleine Testkulturen hergestellt werden, und der Sialsäuregehalt des Glykoproteins bei verschiedenen Kupferionenkonzentrationen für die jeweilige kultivierte Wirtszelle und für die jeweilige Phase der Kultur kann bestimmt werden. Vorzugsweise werden die Kupferionen zu dem oder ungefähr zu dem Zeitpunkt zugesetzt, an dem die Produktionsphase der Zellkultur initiiert wird. Am besten wird während des Zellkulturverfahrens vor der Produktionsphase eine Übergangsphase eingeführt, in der die Zellkulturbedingungen wie hierin erläutert hergestellt werden, um die gewünschte Stei gerung des Sialsäuregehalts und somit das gewünschte Glykoformprofil zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt kann auch die Temperatur der Kultur geändert werden. Vorzugsweise auf zwischen etwa 30°C und 36°C, noch bevorzugter auf etwa 33°C.
Die Kupferionen können auf jede auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Art zugesetzt werden, wie z.B. durch Zusatz von CuCl₂. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kupfer in einer Charge zum Fed-Batch-Kultursystem zugesetzt, mit oder ohne geeignete Nährstoffe, wie dies hierin beschrieben oder Fachleuten auf dem Gebiet der Kultivierung von Säugetierzellen bekannt ist.
Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ist offensichtlich, dass die Zellkulturverfahren der vorliegenden Erfindung so gewählt wurden, um den gewünschten Sialylierungswerte des produzierten Proteins zu erhalten. Weitere Prozessparameter neben den hierin beschriebenen, die sich auf den Sialylierungsgrad auswirken, umfassen den Sauerstoffgehalt, den Ammoniumwert, den pH und den Hexosewert. Die Kulturdichte, die Dauer und die Lagerbedingungen, wie z.B. Temperatur, beeinflussen ebenfalls die Silylierung. Die vorliegende Erfindung umfasst auch jene Prozessparameter, die außerdem für eine gesteigerte Silylierung am besten geeignet sind.
III. Gewinnung des Glykoproteins
Nach der Polypeptid-Produktionsphase wird das Polypeptid von Interesse unter Anwendung geeigneter Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, aus dem Kulturmedium gewonnen.
Das Polypeptid von Interesse wird vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen. Als erster Schritt wird beispielsweise das Kulturmedium oder ein Lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen. Dann wird das Polypeptid von verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren sind: Fraktionierung auf Immunaffinität- oder lonenaustauschsäulen; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Silica oder einem Kationenaustauschharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von z.B. Sephadex G-75; und Protein-A-Sepharosesäulen zur Entfernung von Kontaminanten, wie z.B. IgG.
IV. Analyse des Glykoproteins
Der komplexe Kohlenhydratabschitt des durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierten Glykoproteins können, falls erwünscht, leicht mithilfe herkömmlicher Kohlenhydratanalyseverfahren analysiert werden. So können beispielsweise Verfahren, wie z.B. Lectin-Blotting, das auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist, Anteile von terminaler Mannose oder anderen Zuckern, wie z.B. Galactose, aufzeigen. Die Termination von Oligosacchariden mit einer, zwei, drei oder vier "Antennen" mit Sialsäure kann durch die Abgabe von Zuckern vom Protein unter Verwendung von wasserfreiem Hydrazin oder enzymatischen Verfahren und Fraktionierung von Oligosacchariden durch lonenaustausch- oder Größenausschlusschromatographie oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren bestätigt werden. Der pl des Glykoproteins kann ebenfalls gemessen werden, und zwar vor und nach einer Behandlung mit Neuraminidase zur Entfernung von Sialsäure. Eine Erhöhung des pl nach der Neuraminidasebehandlung weist auf die Gegenwart von Sialsäuren auf dem Glykoprotein hin.
Die resultierenden Kohlenhydrat können durch ein beliebiges auf dem Gebiet der Erfindung bekanntes Verfahren analysiert werden, einschließlich der hierin beschriebenen Verfahren. Auf dem Gebiet der Erfindung sind mehrere Verfahren zur Glykosylierungsanalyse bekannt und im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung von Nutzen. Solche Verfahren stellen Informationen über die Identität und die Zusammensetzung des an das Peptid gebundenen Oligosaccharids bereit. Verfahren zur Kohlenhydratanalyse, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Lectinchromatographie: HPAEC-PAD, wobei Anionenaustauschchromatographie bei hohem pH zur Trennung von Oligosacchariden aufgrund der Ladung verwendet wird; NMR; Massenspektrometrie; HPLC; GPC; Monosaccharid-Zusammensetzungsanalyse; sequentieller enzymatischer Verdau.
Sialsäure kann eigens durch das direkte kolorimetrische Verfahren nach Yan et al. (Anal. Biochem. 179, 332–335 (1989)) in Dreifachproben bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Thiobarbitursäure (TBA) nach L. Warren, J. Biol. Chem. 238(8) (1959) oder das Verfahren nach K. R. Anumula, Anal. Biochem. 230, 24–30 (1995) eingesetzt.
Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben wurde, werden zum besseren Verständnis nachstehend Beispiele angeführt, die der Veranschaulichung, nicht aber, sofern nicht anders angegeben, als Einschränkung der vorliegenden Erfindung dienen.
BEISPIELE Allgemeine Verfahren
A. Zelllinie
Die als Säugetier-Wirtszellenlinie verwendete Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinie stammte von CHO-DG44-Zellen.
B. Konstruktion von löslichen TNFR-IgG₁-Chimären vom Typ I
Eine TNFR-IgGI-Chimäre vom Typ I wurde durch Genfusion der extrazellulären Domäne von menschlichem Typ-1-TNFR mit der Hinge-Region und den C_H2- und C_H3-Domänen einer IgG₁-Schwerkette (im Folgenden als TNFR1-IgG₁ bezeichnet) wie in Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991) beschrieben hergestellt.
C. Zellkultur
Das für den das lösliche Typ-I-TNFR-IgG₁ kodierende Gen wurde durch Transfektion in CHO-DG44-Zellen eingeführt. Dies wurde unter ANwendung des Calciumphosphatverfahrens zur Einführung von DNA in Säugetierzellen erreicht. TNFR-IgG₁ ex primierende Klone wurden in Methotrexat amplifiziert, was stark exprimierende Klone ergab, und danach an ein serumfreies Medium angepasst. Diese Zellen standen unter kontinuierlichem Selektionsdruck, bis sie zur Vermehrung und zur Expansion des Inokulums in ein nichtselektives Medium transferiert wurden.
Um Zellen für TNFR-IgG₁-Produktionskulturen bereitzustellen, wurde die oben beschriebene Zellkultur durch Reihenverdünnungen in Gefäßen mit steigenden Volumina aus dem Methotrexat enthaltenden Medium in ein Wachstumsmedium ohne Methotrexat expandiert. Für diese Schritte des Verfahrens war das nichtselektive Wachstumsmedium eine auf DMEM/HAM F12 basierende Formulierung (siehe z.B. US-Patent 5.122.469) mit modifizierten Konzentrationen einiger Komponenten, wie z.B. Glucose, Aminosäuren, Salzen, Zucker, Vitamine, Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; rekombinantes menschliches Insulin, hydrolysiertes Pepton (Protease Pepton 2 oder 3, Primaton HS oder Primaton RL), ein Zellschutzmittel, wie z.B. Pluronic F68 (Pluronic-Polyol) oder ein Äquivalent; Gentamycin und Spurenelemente.
Die Kulturen wurden unter Verwendung von CO₂-Gas (Säure) und/oder Na₂CO₃ (Base) bei einem pH von 7,2 +/– 0,4 gehalten. Die Temperatur wurde während der Wachstumsphase nahe 37°C gehalten. Gelöster Sauerstoff wurde durch direktes Anschwänzen mit Luft und/oder Sauerstoffgas über 5% Luftsättigung gehalten.
Auf die Wachstumsphase jeder Kultur folgte eine zweite Phase oder Übergangsphase, in der die Kulturparameter von den Wachstums- zu den Produktionsbedingungen geändert wurden. Während dieser Übergangsphase wurde die Temperatur des Kultursystems gesenkt, im Allgemeinen auf zwischen etwa 30 und 35°C, üblicherweise auf etwa 33°C. Kupferchlorid wurde zum Kulturmedium zugesetzt. Das während der Produktionsphase akkumulierte Produkt wurde auf seinen Sialsäuregehalt analysiert.
D. Gewinnung des TNFR-IgG₁
Die TNFR1-IgG₁-Chimäre wurde wie in Capon et al., w.o. beschrieben durch Chromatographie auf immobilisiertem Staphylococcus-aureus-Protein-A auf mehr als 95% Homogenität gereinigt.
E. Kohlenhydratanalyse
Der Sialsäuregehalt wurde gemäß dem Verfahren nach L. Warren, J. Biol. Chem. 234, 1971–1975 (1959) oder dem Verfahren nach K. R. Anumula, Anal. Biochem. 230, 24–30 (1995) analysiert.
BEISPIEL I
Eine Glykoprotein-Produktionskultur wurde bei 0,2% Packed Cell Volume (PCV) inokuliert. Die Zellen wurden etwa 2 Tage lang unter optimalen Wachstumsbedingungen (37°C, niedrige Osmolalität) gezüchtet. Als 1% PCV erreicht war (nach etwa 2 Tagen), wurden die Kulturbedingungen von den optimalen Wachstums- zu den Produktionsbedingungen geändert. Das bedeutet, dass unter diesen Bedingungen das Wachstum verlangsamt wird. Diese Veränderung umfasst auch eine Temperaturänderung auf 33°C und den Zusatz eines komplexen Feeds (konzentrierte Form von Medienkomponenten).
ERGEBNISSE
Die Zellkultur ist etwa 12 Tage lang produktiv. Eine Ernte am neunten Tag, um einen wünschenswerten Sialsäure- (SA-) Gehalt sicherzustellen, führt zu einem deutlichen Verlust der Produktkonzentration, wie in der nachfolgenden Tabelle I zu sehen ist.
TABELLE 1
Kulturgröße, Produktkonzentrationen und prozentuelle Steigerung der Produktkonzentration von Tag 9 auf Tag 12 für vier repräsentative Produktionskulturen.
Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, kann eine etwa 50%ige Steigerung der Produktivität erzielt werden, wenn die Kultur 12 Tage anstelle von 9 Tagen aufrechterhalten wird, wobei eine vergleichbare Produktqualität gegeben ist, wenn der Sialsäuregehalt in der zweiten Hälfte der Kultur stabilisiert werden kann.
Ein repräsentativer Durchlauf mit 1000 l ist in 1 zu sehen. 1 zeigt die Produktkonzentration sowie den Verlust von Sialsäure im Laufe der Zeit. Wie aus 1 und Tabelle I oben ersichtlich ist besteht eine deutliche Zunahme in der produzierten Glykoproteinmenge nach dem fünften Kulturtag. Die Produktivität in mg/l des produzierten Glykoproteins steigt bis zu zwölften Tag der Kultur weiter an.
Wie aus 1 ersichtlich ist, nimmt der Sialsäuregehalt des produzierten Glykoproteins in der Kultur nach etwa dem sechsten Tag ab.
BEISPIEL II
Um die Wirkung von CuCl₂ auf die Stabilisierung des Sialsäuregehalts zu testen, wurde eine hohe Zellkonzentration aus einer Perfusionskultur über Nacht in Spinnerflaschen inkubiert, denen 0, 1 und 5 mM CuCl₂ zugesetzt wurden. Alle Zellen starben aufgrund von Sauerstoffmangel ab, aber wie aus 2 ersichtlich ist, stabilisierte das Kupfer wirksam den Sialsäuregehalt in dosisabhängiger Weise.
BEISPIEL III
Da Schwermetalle, wie z.B. Kupfer, toxisch sind, wurde die Wirkung von CuCl₂-Konzentrationen von 0–5 mM auf das Wachstum und die Lebensfähigkeit von CHO-Zellen bei 37°C und 33°C Inkubationstemperatur zur Produktion eines Glykoproteins untersucht (3, 4 und 5). Toxische Wirkung und Wachstumshemmung wurden oberhalb von 0,2 mM CuCl₂ detektiert. Die Wirkung bei 37°C und 33°C war sehr ähnlich. Kupferkonzentrationen oberhalb von 0,4 mM führten zu Zelltod unter Bedingungen, unter denen normalerweise Zellwachstum erwartet wird.
BEISPIEL IV
Aufgrund der toxischen Wirkung bei Zusatz von Kupfer oberhalb von 0,2 mM unter Wachstumsbedingungen, wurde der Kupferzusatz während der Produktionsphase der Glykoproteinproduktion untersucht. In dem Verfahren wurden nach fünf Tagen in Kultur die maximale Zellmasse erreicht. Da nach dem fünften Tag in Kultur eine deutliche Desialylierung stattfindet, und um den achten Tag in Kultur eine besonders deutliche Abnahme auftritt (1), wurde Kupferzusatz von 0,5 und 1,0 mM an Tag 6 und Tag 8 der Kultur untersucht (6).
ERGEBNISSE
Im ersten Produktionsexperiment wurden 0,5 und 1,0 mM CuCl₂ zur Kultur zugesetzt. Diese Zusätze (Konzentrationen, die unter Wachstumsbedingungen toxisch sind) führte zu guter Kulturleistung und -produktivität. Der Sialsäuregehalt wurde in diesen Kulturen stabilisiert, wie in der nachstehenden Tabelle II zu sehen ist.
TABELLE II
BEISPIEL V
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um Kupferzusatz in anderen Konzentrationen zu testen. 0,38 mM Kupfer wurden zugesetzt.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse sind in 7 und in der nachstehenden Tabelle III zusammengefasst. TABELLE III
Keine andere Auswirkung auf die Produktqualität als die Stabilisierung des Sialsäuregehalts konnte detektiert werden.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse zeigen ganz klar, dass Kupferionen in einem breiten Konzentrationsbereich zu Zellkultur-Produktionsverfahren zugesetzt werden können, um das Oligosaccharid eines Glykoproteins zu erhalten.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Glykoproteins durch Säugetierzellkultur, umfassend: das Kultivieren einer Säugetierwirtszelle in einem serumfreien Medium in einer Produktionsphase, die durch den Zusatz einer wirksamen Menge an Kupferion (Cu⁺⁺) zur Zellkultur, um den Verlust an Sialsäure zu minimieren, gekennzeichnet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kupferion zur Zellkultur in einer Konzentration von etwa 0,1 mM bis etwa 2,0 mM zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kupferion zur Zellkultur in einer Konzentration von etwa 0,1 mM bis etwa 1,0 mM zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kupferion zur Zellkultur in einer Konzentration von etwa 0,1 mM bis etwa 0,5 mM zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kupferion zur Zellkultur in einer Konzentration von etwa 0,3 mM zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Produktionsphase eine Wachstumsphase vorangeht, worin die Wirtszelle unter solchen Bedingungen und für solch eine Zeitspanne kultiviert wird, dass das maximale Zellwachstum erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Kultur etwa 9 bis etwa 12 Tage andauert.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Wachstumsphase etwa zwischen 2 und 5 Tagen andauert.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Wachstumsphase etwa 3 Tage andauert.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der Wachstumsphase eine Übergangsphase folgt, während derer die Kulturtemperatur auf zwischen etwa 30°C und 35°C gesenkt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Temperatur auf etwa 33°C gesenkt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Kupferion am sechsten Tag der Kultur zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Kupferion am achten Tag der Kultur zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Kultur etwa 12 Tage andauert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirtszelle eine Chinahamster-Eierstockzelle (CHO-Zelle) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kupferion in Form von Kupferchlorid zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das produzierte Glykoprotein ein Säugetier-Glykoprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Glykoprotein eine Tumornekrosefaktorrezeptor-Immunglobulin-Chimäre ist.
Verfahren zur Herstellung eines Glykoproteins durch Säugetier-Zellkultur, die folgenden Schritte umfassend: (a) das Kultivieren einer Säugetier-Wirtszelle, die ein heterologes Glykoprotein exprimiert, in einer Wachstumsphase unter solchen Bedingungen und für solch eine Zeitspanne, dass maximales Wachstum erreicht wird; (b) das Kultivieren der Wirtszelle in einer Produktionsphase in einem serumfreien Medium, die der Wachstumsphase folgt, worin die Zellen in Gegenwart von Kupferion (Cu⁺⁺) in einer Konzentration von etwa 50 μM bis etwa 5 mM kultiviert werden; und (c) das Gewinnen des so hergestellten Glykoproteins.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Säugetierwirtszelle eine CHO-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin der Wachstumsphase eine Übergangsphase folgt, während derer die Temperatur auf zwischen etwa 30°C und 35°C gesenkt wird.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das Kupferion in Form von Kupferchlorid zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, worin das produzierte Glykoprotein ein Säugetier-Glykoprotein ist.