AT413700B

AT413700B - Mediumzusätze für zellkultur enthaltend aceton

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Publication number: AT413700B
Application number: AT3832004A
Authority: AT
Original assignee: Igeneon Krebs Immuntherapie
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2006-05-15
Also published as: WO2005095582A3; ATA3832004A; WO2005095582A2

Description

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Die Erfindung betrifft einen neuen Tierzellkulturmediumzusatz bzw. einen neuen Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen, der die Wachstumsrate und Ausbeute von in vitro kultivierten tierischen bzw. menschlichen Zellen erhöhen kann. Weiters betrifft die Erfindung die Verwendung des Kulturmediumzusatzes zur Kultivierung von tierischen bzw. menschlichen Zellen und 5 zur Steigerung der Produktion von durch die Zellen exprimierten Proteinen.

Die Anforderungen an Medien zur Herstellung von Proteinen mit Säugerzellen sind mannigfaltig. Zellkulturmedien müssen die Nährstoffe zur Verfügung stellen, die zur Aufrechterhaltung und Züchtung der Zellen in einer kontrollierten, künstlichen und in-vitro-Umgebung notwendig io sind. Merkmale und Zusammensetzungen der Zellkulturmedien können entsprechend den jeweiligen Zellanforderungen variieren. Nährstoffformulierungen werden zur Kultivierung einer Reihe von Zelltypen einschließlich tierischen, pflanzlichen und Bakterienzellen verwendet. In Kulturmedien kultivierte Zellen katabolisieren vorhandene Nährstoffe und erzeugen nützliche biologische Substanzen wie monoklonale Antikörper, Hormone, Wachstumsfaktoren, Viren und 15 dgl. Derartige Produkte finden in der Therapie Anwendung, und auf Basis der rekombinanten DNA-Technologie können Zellen zur Lieferung von großen Mengen dieser Produkte technisch hergestellt werden. Die Möglichkeit der in-vitro-Kultivierung von Zellen ist somit nicht nur von Bedeutung für zellphysiologische Studien, sondern auch notwendig zur Erzeugung von nützlichen Substanzen, die andernfalls unmöglich oder nur mit Kostenaufwand erzielbar wären. 20

Es gibt verschiedene Medien und Zellkultursysteme, die zur Verfügung stehen. Kulturmedien können als flüssige Lösungen, aber auch als trockene, pulverförmige Medien bereitgestellt werden. 25 Die WO 98/36051 beschreibt beispielsweise trockene, pulverförmige Zellen sowie Nährstoffpulver. Diese pulverförmigen Medien können durch Zugabe von bestimmten und kontrollierten Lösungsmitteln in feuchte Pulver übergeführt werden. Mögliche Lösungsmittel sind Wasser, Serum oder organische Lösungsmittel. 30 Die US 5,328,844 beschreibt eine streng definierte Mediumzusammensetzühg, COF T769rziir Kultivierung von Säugerzellen, die eine bestimmte Aminosäurezusammensetzung, Antioxidantien und Schutzstoffe enthalten.

Die WO 89/01028 beschreibt serumfreie Medien zur Züchtung von Insektenzellen, bestehend 35 aus einem Basismedium, Lipid-, Peptonkomponenten und Schutzstoffen zur Stabilisierung der Zellen gegen Schäden und Tod in gerührtem und durchgastem Insektenmedium.

Viele verschiedene Mittel wie Aminosäuren, Spurenelemente, Serum, Vitamine, Lipide und Hydrolysate (z.B. Sojahydrolysat) werden in Medien zur Zellkultivierung verwendet. Die Ener-40 giequelle von in vitro kultivierten Zellen besteht in erster Linie aus Glucose und L-Glutamin. Glucose wird durch Glycolyse abgebaut, was zu Pyruvat und NADH führt. Pyruvat wird normalerweise in den Tricarbonsäurezyklus (TCC) übergeführt und entweder als Energiequelle für die ATP-Produktion (katabolische Reaktionen) oder als C2-Fragment für die Produktion von Aminosäure auf anaplerotischem Weg verwendet. Die Elektronen von NADH + H+ werden über aktive 45 Shuttlesysteme zur Rezyklierung und ATP-Produktion in Mitochondrien übergeführt.

Der Metabolismus bei in vitro kultivierten Zellen unterscheidet sich geringfügig. Die Pyruvatde-carboxylase arbeitet nicht effizient genug, somit kann Acetyl-CoA nicht ausreichend produziert werden, um den TCC mit C2-Körpern zu versorgen (Elias C.B. et al., 2003, Biotechnol. Progess so 19:90-97). Zweitens wird das Shuttlesystem zur Übertragung der Elektronen des produzierten NADHs in die Mitochondrien gehemmt, weshalb die Zelle NADH zu NAD zurückführen muss, indem sie es an der großen Menge von Pyruvat-produzierendem Lactat reduziert. Das stellt die Zelle vor einige Probleme. Der Abbau von Glucose zu Lactat senkt nämlich den pH-Wert und erhöht die Osmolalität des Kulturmediums, was die Zelle belastet. Die Effizienz des Glucose-55 Verbrauchs variiert je nach Zelllinie und Kulturbedingungen zwischen 30 und 80 %. Da es nicht 3

AT 413 700 B genügend C2-Körper zur Aufrechterhaltung des TCC gibt, muss ein anderes Mittel zum Medium gegeben werden, um den Katabolismus zu unterstützen. Als weiterer Zusatz wird L-Glutamin in Konzentrationen von 2 bis 10 mM verwendet. Glutamin wird in den TCC übertragen und für anaplerotische und katabolische Wege verwendet. Glutamin wird zu Glutamat abgebaut und 5 produziert dabei Ammoniak, das toxisch ist. Die Abbaugeschwindigkeit kann durch den pH-Wert und ionische Bedingungen beeinflusst werden, doch die Bildung solcher Abbauprodukte lässt sich oft nicht in allen Zellkulturmedien vermeiden (Tritsch et al., 1962, Exp. Cell Res. 28:360-364). io Teile von Ammoniak können jedoch über eine Transaminierung von Pyruvat unter Erzeugung von L-Alanin gebunden werden, wodurch sich die Osmolalität weiter erhöht und die Menge an C2-Körpern für den TCC weiter sinkt. Es werden daher verschiedene Substanzen wie Glutamat oder Aspartat anstelle von L-Glutamin und Mannose, Galactose oder andere Kohlenhydrate zur Überwindung dieser Probleme verwendet. Dennoch erwiesen sich Methoden zur Verhinderung 15 der Anhäufung von Ammoniak bzw. zur gezielten Entfernung von Ammoniak bisher als relativ wenig erfolgreich (Newland M. et al., 1990, Cytotechnology 3:215-229).

Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an Zellen, die in vitro mit Zusätzen zur Erhöhung der Zellwachstumsrate und zur Lieferung von durch diese Zellen exprimierten Proteinen kultiviert 20 werden. Weiters besteht ein Bedarf an Zellkulturzusätzen, die eine Anhäufung von Abbauprodukten, welche negative Wirkungen auf das Zellwachstum, die Zellproduktivität und die Produktqualität haben, verhindern (Elias C.B., 2003, Biotechnol. Progress, 19, 90-97).

Bennet J.W. et al. (Mycopathologia 58:9-12 (1976)) offenbart die Züchtung von Aspergillus 25 parasiticus in einem Medium, welches unterschiedliche Konzentrationen an Glucose und Aceton umfasst, wobei der Einfluss von Aceton auf die Produktion von Aflatoxin und dem Aspergillus-Pigment Versicolorin untersucht wurde. Dabei wurde festgestellt, dass bei einer hohen Konzentration von Aceton die Produktion von Sekundär-Metaboliten unterbunden jjnd beLnie-_ deren Aceton-Konzentrationen gesteigert werden konnte.----------------------- 30___________________________________________

In Platen H. et al. (FEMS Microbiology Leiters 122:27-32 (1994)) wird ein Fermentationsverfahren für Aceton durch ein Aceton-verwertendes Bakterium beschrieben, wobei das dabei entstehende Acetat durch einen Methanosaeta-Stamm abgebaut wird. 35 Mizrahi A. et al. (Developments in Biological Standardization 55:93-102 (1985)) offenbart die Verwendung von synthetischen Polymeren, wie Carboxymethyl-Zellulose, Hydroxyethyl-Stärke und Polyolen in einem Zellkulturmedium, um die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in diesem Medium zu steuern. 40 W091/00341 offenbart ein Verfahren zur Kultivierung von Insektenzellen in einem stark durch lüfteten Fermentor mit einem Medium, welches unter anderem Hydroxylethylstärke enthalten kann. Dabei dient Hydroxylethylstärke als Schutzmittel, um unter anderem das Auflösen und das Verklumpen der Zellen zu unterbinden und das unerwünschte Haftenbleiben derselbigen an den Behälter zu verhindern. 45

Kurze Zusammenfassung der Erfindung:

Ein Ziel der Erfindung bestand in der Schaffung von Tierzellkulturmediumzusätzen bzw. Zellkulturmediumzusätzen für menschliche Zellen, mit denen Zellkulturmedien versetzt werden kön-50 nen, damit die tierischen bzw. menschlichen Zellen mit Energiequellen versorgt werden können, welche von den Zellen genutzt werden können und dabei zu erhöhten Ausbeuten führen.

Das Ziel der Erfindung wird durch die Schaffung eines Tierzellkulturzusatzes bzw. eines Zellkulturzusatzes für menschliche Zellen und dessen Verwendung erreicht, wie in den Ansprüchen 55 geoffenbart. 4

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Erfindungsgemäß werden neue Tierzellkulturzusätze bzw. Zellkulturzusätze für menschliche Zellen vorgesehen, die entweder allein oder in Kombination verwendet werden können. Es wurde überraschend gefunden, dass die Zugabe von Aceton, vorzugsweise in Kombination mit ß-Hydroxyethylstärke (HES), tierische bzw. menschliche Zellen aktivieren kann, was zu höheren 5 Wachstumsraten und/oder einer gesteigerten spezifischen Produktivität führt. Die Wachstumsraten und/oder spezifische Produktivität der Zellen kann gesteigert werden, was zu höheren Ausbeuten an rekombinanten Proteinen führt, die durch die Zellen exprimiert werden. Die Potenz der exprimierten Proteine ist identisch, vorzugsweise besser, im Vergleich zu Proteinen, die durch tierische bzw. menschliche Zellen exprimiert werden, welche in Standardmedien io kultiviert werden. Je nach Zelllinie und vorgeschlagenem Fermentationsprozess stieg die Ausbeute um mindestens 20 % im Vergleich zu Zellen, die in Medien ohne erfindungsgemäßem Zusatz kultiviert wurden. In vitro kultivierte tierische bzw. menschliche Zellen können Aceton metabolisieren und ihre Ausbeute an exprimierten Proteinen je nach Fermentationsart und verwendeter Zelllinie um mindestens bis zu 20 %, vorzugsweise mindestens 50 %, vorzugswei-15 se mindestens 100 %, vorzugsweise mindestens 150 %, vorzugsweise mindestens 250 %, erhöhen. HES kann je nach Fermentationsart und verwendeter Zelllinie die Ausbeute eines Bioprozesses um bis zu 20 %, vorzugsweise bis zu 50 %, vorzugsweise bis zu 100 %, vorzugsweise mindes-20 tens 150 %,. vorzugsweise mindestens 250 %, erhöhen.

Eine Mischung von HES und Aceton kann Säugerzellen aktivieren, um die spezifische Produktivität um das Doppelte zu steigern. 25 Beide Substanzen können entweder allein oder in Mischung, gegebenenfalls über eine Reduktion des osmotischen Drucks, die Qualität der gebildeten Proteine positiv beeinflussen und den Metabolismus von Säugerzellen verbessern.

Die Erfindung sieht die Verwendung von Aceton, _vorzugsweise-in-Kombination mit HES, als _ 30___Tierzellkulturzusatz bzw. ZellKülturzusatz für menschliche Zellen zur Kultivierung von tierischen bzw. menschlichen Zellen vor.

Die erfindungsgemäßen Zusätze können durch irgendein dem Fachmann bekanntes Reinigungsmittel leicht von den Zellen oder den exprimierten Proteinen entfernt werden. Glückli-35 cherweise sind diese Zusätze bei Zugabe zu den Kulturmedien für die Zellen nicht toxisch, die Zellen können daher sogar hohe Konzentrationen von Zusätzen vertragen.

Die Erfindung sieht auch Verfahren zur Kultivierung von tierischen bzw. menschlichen Zellen entweder durch Haftung oder in Suspension unter Verwendung eines den erfindungsgemäßen 40 Medienzusatz enthaltenden Mediums vor. Die Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch Kultivierung von Wirtszellen in einem den Zusatz enthaltenden Medium vor. Insbesondere ist die Produktion von Antikörpern, Derivaten oder Fragmenten derselben vorgesehen. 45 Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Gewinnung eines Antikörpers oder Antikörperderivats oder Fragments desselben mit Hilfe einer tierischen bzw. menschlichen Zellkultur, die in einem einen erfindungsgemäßen Tierzellkulturzusatz bzw. Zellkulturzusatz für menschliche Zellen enthaltenden Medium kultiviert wird, umfassend die Schritte des:

Kultivierens von Antikörper oder Derivate oder Fragmente davon erzeugenden tierischen bzw. so menschlichen Zellen in ständiger Anwesenheit des erfindungsgemäßen Zusatzes, des Fortführens der Kultur bis zur Anhäufung der Antikörper oder Derivate oder Fragmente davon und des Isolierens der Antikörper oder Derivate oder Fragmente davon.

Darüber hinaus sieht die Erfindung eine Kultur von tierischen bzw. menschlichen Zellen vor, die 55 in einem mit Aceton in einer Konzentration von 1 μΜ bis 20 mM, vorzugsweise 5 μΜ bis 10 mM, 5

AT 413 700 B vorzugsweise 10 μΜ bis 1 mM, vorzugsweise 10 μΜ bis 100 μΜ, und/oder HES in einer Konzentration von 0,01 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 5 Gew.%, vorzugsweise 0,2 bis 2 Gew.%, versetzten Tierzellkulturmedium bzw. Zellkulturmedium für menschliche Zellen kultiviert werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Der Ausdruck "Kulturmedium", das mit Aceton, vorzugsweise in Kombination mit HES versetzt werden kann, kann jedes aus dem Stand der Technik bekannte Medium umfassen. Das Basismedium kann ein synthetisches Medium wie DMEM/HAM's F12, Medium 199, Hybridoma Express oder RPMI, IMDM, JRH SP2/0, Ex-Cell 325-PF oder Kombinationen davon sowie ein anderes aus der Literatur bekanntes oder handelsübliches Medium sein. Das Basismedium kann eine Reihe von Inhaltsstoffen einschließlich Aminosäuren, Vitaminen, organischen oder anorganischen Salzen und Kohlehydratquellen umfassen, wobei jeder Inhaltsstoff in einer Menge anwesend ist, die die Kultivierung einer tierischen bzw. menschlichen Zelle in vitro unterstützt. Es kann sich sowohl um ein serumfreies als auch ein serumhaltiges Medium handeln.

Erforderlichenfalls kann dem Medium ein nichtionisches Tensid wie Polyethylenglycol oder Polypropylenglycol (PLURONIC F-61; PLURONIC F-68; SYNPERONIC F-68; PLURONIC F-71 oder PLURONIC F-108) als Entschäumungsmittel zugesetzt werden. Diese Mittel sind als Schutz der Zellen vor einer negativen Auswirkung von Luftzufuhr gut bekannt.

Der Ausdruck "Zellkultur" bezieht sich auf tierische bzw. menschliche Zellen, die in Suspension in Zylinderflaschen, Kolben, Zentrifugen etc. gezüchtet werden. Großtechnische Ansätze wie Bioreaktoren, einschließlich Zellen, die an Mikroträgern haftend in gerührten Bioreaktoren, Fließbettreaktoren oder Druckluftreaktoren gezüchtet werden, sind ebenfalls mit eingeschlossen.

Der Ausdruck "Ausbeute" kann als Gesamtproduktivität eines Bioprozesses definiert werden.

Der Ausdruck "Bioprozess" kann als Verfahren zur Herstellung eines biologisch abgeleiteten Produkts definiert werden.

Der Ausdruck "Kultivierung" bezieht sich auf die Aufrechterhaltung von tierischen bzw. menschlichen Zellen in vitro unter Bedingungen, die ein Wachstum und eine fortgesetzte Lebensfähigkeit zulassen. Säugerzellen werden typischerweise in einem Zellinkubator bei etwa 37°C kultiviert. Der optimale pH-Bereich liegt bei etwa 6,8 bis 7,6, vorzugsweise zwischen 7,0 bis 7,3.

Das als Mediumzusatz verwendete Aceton kann Aceton jeglicher Qualität sein, dennoch wird "pro analysi"-Qualität bevorzugt. Aceton kann in einer Konzentration von 1 μΜ bis 20 mM, vorzugsweise 5 μΜ bis 10 mM, vorzugsweise 10 μΜ bis 1 mM, vorzugsweise 10 μΜ bis 100 μΜ, zum Tierzellkulturmedium bzw. Zellkulturmedium für menschliche Zellen gegeben werden. Der Einsatz des Tierzellkulturmediumzusatzes bzw. Zellkulturmedium für menschliche Zellen in diesen Konzentrationen führte zu erhöhtem Zellwachstum und/oder hoher Ausbeute.

Das als Mediumzusatz verwendete HES ist vorzugsweise von hoher Reinheit. HES kann dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von 0,01 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 5 Gew.%, vorzugsweise 0,2 bis 2 Gew.%, zugegeben werden. Der Einsatz des Tierzellkulturmediumzusatzes bzw. Zellkulturmediumzusatzes für menschliche Zellen in diesen Konzentrationen führte zu erhöhtem Zellwachstum und/oder hoher Ausbeute.

Werden Aceton und HES als Kombinationszusätze verwendet, sind die Mengen von Aceton und HES identisch mit den oben beschriebenen Mengen.

Der bzw. die erfindungsgemäße(n) Zellkulturzusatz/zusätze für tierische bzw. menschliche j 6

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Zellen können zu jedem beliebigen Zeitpunkt während der Kultivierung zugesetzt werden. Die Zugabe zum Medium kann vor der Inokulation der tierischen bzw. menschlichen Zellen oder während des Kultivierungsprozesses erfolgen. Der Zusatz kann auch kontinuierlich zugegeben werden, um eine konstante Konzentration an Zusatz im Medium aufrecht zu erhalten. 5

Die in einem mit Aceton und/oder HES versetzten Medium kultivierten tierischen bzw. menschlichen Zellen können irgendwelche Zellen sein, die in vitro in synthetischen Medien wachsen können. Im Rahmen der Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Zellen" auf die Kultivierung von einzelnen Zellen, Geweben, Organen, Insektenzellen, Vogelzellen, Säugerzellen, Hybridomzel-io len, Primärzellen, kontinuierlichen Zelllinien, Stammzellen und/oder gentechnisch hergestellten tierischen bzw. menschlichen Zellen wie rekombinanten tierischen bzw. menschlichen Zellen, die ein heterologes Protein oder Polypeptid exprimieren.

Die erfindungsgemäß verwendeten tierischen Zellen sind vorzugsweise Säugerzellen. Diese 15 können beispielsweise BSC-1 -Zellen, LLC-MK-Zellen, CV-1-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen, Mäusezellen, VERO-Zellen, MDBK-Zellen, MDCK-Zellen, MDOK-Zellen, CRFK-Zellen, RAF-Zellen, TCMK-Zellen, LLC-PK-Zellen, PK15-Zellen, WI-38-Zellen, MRC-5-Zellen, T-FLY-Zellen, BHK-Zellen, SP2/0-Zellen oder Derivate davon sein. Die erfindungsgemäß verwendeten menschlichen Zellen sind vorzugsweise HeLa-Zellen, 293-Zellen oder Derivate davon. 20

Die durch diese Zellen exprimierten Proteine können jegliche im Stand der Technik bekannte Proteine sein. Vorzugsweise sind die Proteine rekombinante Proteine, Antikörper oder Derivate oder Fragmente davon oder von Hybridomen stammende Proteine. Erythropoietin, Insulin oder Koagulationsfaktoren können als Beispiele für solche Proteine angeführt werden. 25

Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf Antikörper aller möglichen Arten, insbesondere auf polyklonale und monoklonale Antikörper oder Antikörper, die durch chemische, biochemische oder gentechnologische Verfahren erzeugt werden. Verfahren zur Herstellung solcher Moleküle sind dem Fachmann bekannt. Die Antikörper können auch als_Trägermoleküle für Antigenstruk-3'o turen" verwendet werden.

Antikörperderivate und -fragmente können einkettige Antikörper und Fragmente davon sowie Miniantikörper, bispezifische Antikörper, Diakörper, Triakörper oder Di-, Oligo- oder Multimere davon sein. Mit eingeschlossen sind auch Peptidomimetika oder Peptide, die von Antikörpern 35 stammen, z.B. enthalten sie einen oder mehrere CDR-Bereich(e). Weiters eingeschlossen sind humane monoklonale Antikörper und Peptidsequenzen, die, basierend auf einer Strukturaktivitätsverbindung, durch einen künstlichen Modellprozess hergestellt werden (Greer J. et al., J.Med.Chem. 1994, 37:1035-1054). 40 Der Ausdruck "Epitop" definiert irgendeinen Bereich eines Moleküls, der von einem spezifischen Antikörper erkannt werden kann oder die Bildung dieser spezifischer Antikörper bewirkt. Epitope können entweder Konformationsepitope oder lineare Epitope sein.

Bevorzugte Epitope oder Antigenstrukturen werden von Antigenen abgeleitet, die spezifisch für 45 Epitheltumore sind und vorzugsweise häufig bei Brustkrebs, Magen-Darm-, Dickdarm-Mastdarm-, Prostata-, Pankreas- und Eierstock- sowie Lungenkarzinomen exprimiert werden, u.zw. entweder kleinzelligem Lungenkarzinom (SCLC) oder nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC). Die bevorzugten Epitope induzieren insbesondere humorale Immunantworten und die Bildung von spezifischen Antikörpern in vivo. Die Antikörper induzieren vorzugsweise auch so T-Zellen-spezifische Antworten.

Zu den bevorzugten Epitopen gehören Proteinepitope, die an malignen Zellen von soliden Tumoren exprimiert werden, z.B. TAG-72, MUC1, Folat-bindendes Protein A-33, CA125, HER-2/neu, EGF-Rezeptoren, PSA, MART etc. Darüber hinaus können T-Zellen-Epitoppeptide oder 55 Mimotope solcher T-Zellen-Epitope vom erfindungsgemäßen Antikörper präsentiert werden. 7

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Bevorzugte Kohlehydrat-Epitope oder Antigenstrukturen werden von tumorassoziierten aberran-ten Kohlehydratstrukturen wie Lewis-Antigenen abgeleitet, z.B. Lewis-x-, Lewis-b- und Lewis-y-Strukturen, auch sialylierten Lewis-x-Strukturen, BloboH-Strukturen, KH1, Tn-Antigen, TF-Antigen und Alpha-1-3-Galactosylepitop. 5

Die bevorzugten TAA-Ziele oder Epitope sind ausgewählt aus der Gruppe von Determinanten, die von der Gruppe von Antigenen bestehend aus Peptiden oder Proteinen wie EpCAM, NCAM, CEA und T-Zellen-Peptiden, Kohlehydraten wie aberranten Glycosylierungsmustern, Lewis Y, Sialyl-Tn, Globo H und Glycolipiden wie GD2, GD3 und GM2 abgeleitet sind. Diese Antikörper io können beispielsweise Antikörper gemäß WO 93/24647, EP 0 285 059, EP 0 528 767, WO 04/005359, WO 03/097663 oder A599/2003 sein.

Es wurde gezeigt, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusätze zu gesteigerten Produktionsraten und hohen Ausbeuten des exprimierten Proteins im Vergleich zu Proteinen 15 führte, welche durch Zellen exprimiert werden, die in Standardmedien ohne erfindungsgemäßen Zusatz kultiviert werden. Insbesondere die Expression von Antikörpern, Derivaten oder Fragmenten davon führte bei Verwendung der erfindungsgemäßen Zusätze zu stark erhöhten Ausbeuten. 20 Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Figur 1 zeigt als Kontrolle die Kurve der lebensfähigen Population, die Lebensfähigkeitskurve und die volumetrische monoklonale Antikörpertiterkurve für eine Zylinderkolben-Batch-Kultur. E4-Zellen wurden als freie Suspension in 850-cm3-Zylinderflaschen, gerührt mit 2 Upm in 25 450 ml Arbeitsvolumen, reproduziert. Der Test wurde als Doppelversuch durchgeführt; Proben wurden auf einer Ein- bis Dreitagesbasis entnommen. Das verwendete Medium war Hybridoma Express, versetzt mit 4 mM L-Glutamin und 0,1 % Pluronic F68. Die spezifische Wachstumsrate in der exponentiellen Phase betrug 0,20 d'1 (R2 = 0,99). Die spezifische Produktivität betrug qMAb = 13,5 pg-Zelltag'1, R2 = 0,99.

Figur 2: Kurve der lebensfähigen Population, Lebensfähigkeitskurve und volumetrische monoklonale Antikörpertiterkurve für Zylinderkolben-Batch-Kultur. E4-Zellen wurden als freie Suspension in 850-cm3-Zylinderflaschen, gerührt mit 2 Upm in 450 ml Arbeitsvolumen, reproduziert. Der Test wurde als Doppelversuch durchgeführt; Proben wurden auf einer Ein- bis Dreitagesba-35 sis entnommen. Das verwendete Medium war Hybridoma Express, versetzt mit 4 mM L-Glutamin, 0,1 % Pluronic F68 und 0,2 % HES. Die spezifische Wachstumsrate in der exponentiellen Phase betrug 0,29 d'1 (R2 = 0,97). Die spezifische Produktivität betrug qMAb = 8,5 pg-Zelltag'1, R2 = 0, 99. 40 Figur 3: Gezeigt sind die Kurve der lebensfähigen Population, die Lebensfähigkeitskurve und die volumetrische monoklonale Antikörpertiterkurve für eine Zylinderkolben-Batch-Kultur. E4-Zellen wurden als freie Suspension in 850-cm3-Zylinderflaschen, gerührt mit 2 Upm in 450 ml Arbeitsvolumen, reproduziert. Der Test wurde als Doppelversuch durchgeführt; Proben wurden auf einer Ein- bis Dreitagesbasis entnommen. Das verwendete Medium war Hybridoma Ex-45 press, versetzt mit 4 mM L-Glutamin, 0,1 % Pluronic F68 und 10 μΜ Aceton. Die spezifische Wachstumsrate in der exponentiellen Phase betrug 0,24 d'1 (R2 = 0,97). Die spezifische Produktivität betrug qMAb = 10,8 pg-Zelltag"1, R2 = 0,99.

Figur 4: Kurve der lebensfähigen Population, Lebensfähigkeitskurve und volumetrische mo-50 noklonale Antikörpertiterkurve für Zylinderkolben-Batch-Kultur. E4-Zellen wurden als freie Suspension in 850-cm3-Zylinderflaschen, gerührt mit 2 Upm in 450 ml Arbeitsvolumen, reproduziert. Der Test wurde als Doppelversuch durchgeführt; Proben wurden auf einer Ein- bis Dreitagesbasis entnommen. Das verwendete Medium war Hybridoma Express, versetzt mit 4 mM L-Glutamin, 0,1 % Pluronic F68 und 10 μΜ Aceton. Die spezifische Wachstumsrate in der ex-55 ponentiellen Phase betrug 0,19 d'1 (R2 = 0,97). Die spezifische Produktivität betrug δ ΑΤ 413 700 Β qMAb = 10,0 pg-Zelltag \ R2 = 0,99.

Figur 5: Kumulative Zellzahlen der lebenden E4-Hybridomzellen in serumfreiem Medium pro Tag. Der Test wurde wiederholt durchgeführt. Die Linie zeigt die lineare Regression aller ge-5 messenen Zeitpunkte. Die höchsten kumulative Zellzahlen wurden in HES-haltigem Medium nach 10 Tagen Kultivierung erreicht. In Aceton-Medium und HES+Aceton-Medium kultivierte Zellen zeigten eine annähernd gleiche Leistung, während beim Standard-Medium nur 75 % der Menge erzielt wurden. Die Steigung beim Standardmedium ist geringer als die Steigung bei den anderen Testmedien. Das weist auf eine niedrigere Gesamtwachstumsrate der Zellen hin. 10

Figur 6: Kumulative Zellzahlen von lebenden SP2/0-311-Hybridomzellen in Serum enthaltendem Medium pro Tag. Was die Gesamtwachstumsrate (Steigung) betrifft, so konnten keine signifikanten Unterschiede bemerkt werden. 15 Figur 7: Spezifische Produktivität von monoklonalen Antikörpern bei rekombinanter SP2/0-Zelllinie, ermittelt aus der linearen Beziehung zwischen Produkttiter und kumulativen Zelltagen. Zellen, die in Medium kultiviert wurden, das beide neuen Zusätze enthielt, erreichten den höchsten Titer. Die Steigungen der beiden HES enthaltenden Medien sind am steilsten, woraus gefolgert werden kann, dass HES der beste Mediumzusatz für diese Zelllinie ist. 20

Figur 8: Kumulative Zellzahlen von lebenden CHO-E5-Zellen in serumfreiem Medium pro Tag. Hinsichtlich der Gesamtwachstumsrate (Steigung) wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet. 25 Figur 9: Spezifische Produktivität von durch CHO-E5-Zellen produziertem monoklonalem Antikörper, ermittelt aus der linearen Beziehung zwischen Produkttiter und kumulativen Zelltagen. Das mit HES versetzte Medium zeigte die stärkste Steigung, gefolgt vom acetonhaltigen Medium. Die Steigungen der Kontrolle und des Mediums mit der Mischung von b^en neuen Zusät-.... zen waren signifikant geringer.___________________________________________ - -30-----------------

Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird diese nunmehr anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, die zu Illustrationszwecken angegeben und keinesfalls als einschränkend zu betrachten sind. 35 Verfahren und Materialien

Beispiele 1-3:

Zellkultur 40

Die verwendeten Zelllinien waren E4, ein Mäusehybridom, das einen Anti-Idiotyp-Antikörper als Surrogat des Lewis-Y-Kohlehydrat-Antigens erzeugt, und 311, rekombinante SP2/0, die einen humanisierten anti-Lewis-Y-Antikörper erzeugt, und rekombinante SP2/0, die einen anti-Lewis-Y-Antikörper erzeugt, und rekombinante CHO-E5, die rmAB17-1A erzeugt. Das serumfreie 45 Basismedium für E4 war Hybridoma Express (PAA, Linz), versetzt mit 4 mM L-Glutamin (Sigma Aldrich Corp., St. Louis MO, USA) und 0,1 % Pluronic F68 (Sigma, St. Louis MO). Zur Kultivierung der SP2/0-Zelllinie 311 wurde RPM11640 (Gibco), versetzt mit 10 % fötalem Kälberserum (Gibco) und 2 mM L-Glutamin, verwendet. Das serumfreie Medium für die SP2/0-311-Zellen war eine Mischung von Hybridoma Express (75 %) und RPMI 1640 (25 %), versetzt mit 6 mM so L-Glutamin. Die CHO-Zellen wurden in proteinfreiem EX-Cell-325-PF-CHO-Medium (JRH Biosciences, UK) kultiviert.

Die verschiedenen Medien wurden entweder mit 10 μΜ oder mit 100 μΜ Aceton (Merck, Deutschland), 0,2 % Hydroxyethylstärke (Fresenius Kabi, Austria) oder mit beiden Additiven in Konzentrationen von 10 pM Aceton und 0,2 Gew.% HES versetzt. 55 9

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Die Zellkultur erfolgte bei 37° C in Zellkulturkolben aus Polystyrol in Standardqualität (Nunc, Roskilde, Dänemark) in einem Inkubator mit 7 % C02.

Alle serumfreien Kultivierversuche wurden parallel und doppelt durchgeführt und sind in den 5 Fig. 1 bis 4 als "Zelle Nr. 1" und "Zelle Nr. 2" angeführt.

Zellzählung

Mit dem Trypanblau-Farbausschlussverfahren wurde unter Verwendung eines Hämozytometers io gemäß dem Standardprotokoll (0,2 % Trypanblau) die Anzahl der Zellen im Überstand ermittelt. Die spezifische Produktivität wurde berechnet, wie anderswo beschrieben (Dutton R.L. et al., 1998, Cytotechnology, 26: 139-152). Die Wachstumsrate wurde mittels linearer Regression des Logarithmus der Zelldichten gegen die Zeit der logarithmischen Phase der Kultur berechnet. 15 Batch-Kultur

Es wurden Versuche in 850-cm3-Standardzylinderflaschen (Corning, Wiesbaden, Deutschland) mit 450 ml Medium durchgeführt. Die Inokulationsdichte betrug 1,5-105 Zellen ml'1. Proben wurden auf einer Ein- bis Dreitagesbasis gezogen. Zur Verringerung des Proteingehalts der 20 Wirtszellen im Überstand wurden die Versuche bei einer Lebensfähigkeitszahl von unter 40 % beendet. HPLC-SEC-Analyse 25 Die Antikörperkonzentration des serumfreien Zellkulturüberstands wurde mittels HPLC-Analyse unter Verwendung einer ZORBAX-G-250-Säule (Agilent-technologies) in einem Dionex-HPLC-System analysiert. Um potentielle Anhäufungen aufzulösen, wurden 220 mM NaH2P04 mit 10 % CH3CN als Fließpuffer verwendet. Das Effluent wurde online bei 214 nm überwacht. Die Produktkonzentration wurde durch Integration-der_Maxima_und_Njmrialisiemngaji einer standardi-30 sierten IgG-Lösung berechnet. - ELISA-Analyse

Der Titer des serumhaltigen Zellkulturüberstands wurde mittels ELISA gemäß Standardverfah-35 ren gemessen. Die fotometrische Extinktion der entwickelten Farbreaktion wurde bei 492 nm gemessen (Referenz-Wellenlänge 620 nm). Sämtliche Tests wurden zweifach ausgeführt. lEF-Analyse 40 Zellkulturüberstände und ein lEF-Marker (SERVA Liquid Mix 3-10) wurden unter Verwendung von Filterpapierstückchen anodisch auf SERVALYT Precotes IEF Flachbettgel (15-20 pl) geladen. Die Trennung von Isoformen nach ihren isoelektrischen Punkten erfolgte mittels Elektrophorese bei 4°C unter Verwendung einer Elektrophoresekammer Pharmacia Multiphor II und einer Energieversorgung Pharmacia EPS 3501 XL. Die Elektrophorese-Bedingungen wa-45 ren 2000 V, 6 mA und 12 W über einen Zeitraum von 2,5 Stunden. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit einer TCA enthaltenden Fixierlösung fixiert und einer Färbung mit Comassie-Blau unterzogen.

Ergebnisse: 50

Beide neuen Zusätze wurden zuerst in Standard-T-Kolben mit E4-Zellen in serumfreiem Medium untersucht. Der beobachtete Parameter war die volumetrische Produktivität. Die getesteten Konzentrationen an Aceton betrugen 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ und 1 mM. Für HES wurde eine Konzentration von 0,2 % gewählt. In diesem Beispiel zeigten mit Ausnahme des 1 μΜ Aceton 55 enthaltenden Mediums alle anderen Tests eine gewisse positive Wirkung auf die erzeugte 5 5 10

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Antikörpermenge (Daten nicht dargestellt). Im folgenden Schritt wurde auch eine Mischung von beiden Substanzen getestet. Die gewählten Konzentrationen betrugen 10 μΜ Aceton und 0,2 % HES. Auch dieser Test zeigte eine positive Wirkung auf die Zellen (Daten nicht dargestellt).

Der nächste Schritt in der Entwicklung war die Realisierung einer Batch-Kultur in einem Zylinderkolben mit den gleichen Zellen und Zusatzkonzentrationen. 10 15 20 25 —30- 35

Zellen Zusatz Wachstumsrate [er1] Volumetrische Produktivität [mg-r1] Spezifische Produktivität [pg-Zelltag'1] Dauer [d] E4 keiner 0,20 / R2=0,99 23,6 13,5 / R2=0,99 4 E4 HES 0,29 / R2=0,97 44,5 8,5 / R2=0,99 4 E4 Aceton 0,24 / R2=0,97 50,1 10,8 / R2=0,99 4 311/FCS keiner 0,30 / R2=0,99 8,9 2,7 / R2=0,97 6 311/FCS HES 0,29 / R2=0,99 10,4 4,3 / R2=0,99 6 311/FCS Aceton 0,32 / R2=0,96 9,8 3,3 / R2=0,93 6 311/FCS HES+Aceton 0,30 / R2=0,99 14,2 5,7 / R2=0,99 6 311/SF keiner 0,28 / R2=0,96 39 14,5 / Rz=0,97 7 311/SF HES 0,21 / R2=0,95 47,7 17,8 / R2=0,98 7 311/SF Aceton 0,25 / R2=0,95 46,6 14,2 / R2=0,99 8 311/SF HES+Aceton 0,22 / R2=0,95 _________44,5------ 19,6 / R2=0,95 8 CHO-E5 keiner 0,31 / R2=0,97 4 0,30 / R2=0,91 13 CHO-E5 HES 0,33 / R2=0,97 10,8 1,06 / R2=0,99 13 CHO-E5 Aceton 0,35 / R2=0,99 10 0,68 / R2=0,95 13 CHO-E5 HES+Aceton 0,23 / R2=0,97 4,6 0,34 / R2=0,90 13 40

Tabelle 1: Populationswachstums- und Produktivitätsparameter der Batch-Kultur von Zelllinien (SP2/0-Hybridom, rekombinante SP2/0 und CHO). 45

Beide neuen Zusätze steigerten die Wachstumsrate und die maximale Zelldichte von Hybridom-E4-Zellen (Fig. 5) im Vergleich zum Basismedium (Fig. 1). Die Verwendung einer Mischung der neuen Zusätze in den Medien resultierte sowohl in einer leicht reduzierten Wachstumsrate als auch in einer geringeren spezifischen Produktivität.

Die volumetrische Produktivität in einem projektierten Fed-Batch-Bioprozess mit HES enthaltendem Medium steigt um 190 % (Fig. 2) bzw. 210 % bei Aceton (Fig. 3). Eine Kombination beider Zusätze zeigte diese Wirkung nicht (Fig. 4). 50

Die rekombinante Zelllinie SP2/0 311, kultiviert in serumhaltigen Medien, zeigte eine Erhöhung der spezifischen Produktivität für HES um 160 %. Aceton steigerte die spezifische Produktivität um 120 % (Fig. 7). Eine Mischung von beiden Zusätzen lieferte das beste Ergebnis mit einer Steigerung von 210 % (Tabelle 1). Die Wachstumsrate war bei sämtlichen getesteten Medien fast identisch (Fig. 6). 55

Claims

1 1 AT 413 700 B Im vorliegenden Fall ist der beste Bioprozess zur Optimierung der Produktivität ein Perfusionsprozess. Aufgrund der gesteigerten spezifischen Produktivität konnte die Ausbeute verdoppelt werden. 5 In serumfreien Medien zeigten die Zusätze keine so gewaltige Wirkung auf die Zelllinie, es konnte aber eine Erhöhung der spezifischen Produktivität beobachtet werden (Tabelle 1). Die rekombinante Zelllinie CHO-E5, kultiviert in die neuen Zusätze enthaltenden Medien, zeigte eine gesteigerte spezifische Produktivität von 350 % für HES (Fig. 9) und 220 % für Aceton, io Eine Kombination beider Zusätze zeigt diese Wirkung nicht. Die Wachstumsraten der kultivierten Zellen waren in allen getesteten Medien ähnlich (Fig. 8). Es konnte somit eine Steigerung der volumetrischen Produktivität für HES (270 %) und Aceton (250 %) nachgewiesen werden. Die Qualität des produzierten monoklonalen Antikörpers beider Zelllinien, analysiert mittels 15 ELISA und IEF, wurde durch die gesteigerten Produktivitäten nicht beeinträchtigt (Suriyasatha-porn, W., A.J. et al., 1999. Vet Immunol. Immunopathol. 68:177-186). Die Messung der CDC (Komplement-abhängigen Zytotoxizität) des in HES-haltigem Medium erzeugten monoklonalen Antikörpers 311 zeigte eine leicht positive Beeinflussung der Kulturbedingungen auf die Potenz des Antikörpers in diesem Test (Daten nicht dargestellt). 20 Osmotischer Stress, insbesondere hyperosmotischer Stress, wirkt sich negativ auf die Glycosy-lierung von rekombinanten Proteinen aus (Schmelzer, A.E. und W.M. Miller, 2002, Biotechnology Progress 18:346-353). Die neuen Medienzusätze sind in der Lage, die Osmolalität eines gegebenenfalls serumhaltigen Mediums zu reduzieren, wodurch das Glycosylierungsmuster 25 durch gleichzeitige Erhöhung der verfügbaren Menge an Energiequellen positiv beeinflusst werden kann. Hydroxyethylstärke kann als Glucosespeicher verwendet werden. Die Zellen können das Poly-hier nach Bedarf abbauenrum die nötige Menge derprimären Energiequelle-Glueose zu erhal-— 30 ten. Die anfängliche Glucosemenge kann reduziert werden, und das hohe Molekulargewicht des Biopolymers hilft bei der Senkung der Osmolalität im Medium unter Aufrechterhaltung hoher Glucosegehalte. Aceton eröffnet andererseits eine dritte Energiequelle. Die Aufnahme von Aceton durch die 35 Zellen ist nicht bekannt, da es sich aber in Fettsäuren leicht auflöst, könnte es die Zellen frei erreichen. Dort werden NADPH und Aceton durch Aceton-Monooxygenase gleichzeitig oxidiert, wodurch NADP und Acetol entsteht. Acetol kann entweder über Essigsäure oder über Pyruvin-säure zu Acetyl-CoA metabolisiert werden. Acetyl-CoA kann dann im TCC unter Bildung von ATP zu C02 abgebaut werden, oder es kann nötigenfalls zur Herstellung anderer Metaboliten 40 herangezogen werden. Erste Messungen der Acetonkonzentration in den Medien mit GC-MS zeigten einen Verbrauch des Zusatzes während der Batch-Kultur. Patentansprüche: 45 1. Tierzellkulturmediumzusatz bzw. Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen zur Kultivierung von tierischen bzw. menschlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass der Medi-umzusatz Aceton enthält. so

2. Tierzellkulturmediumzusatz bzw. Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Zusatz Hydroxyethylenstärke (HES) enthalten ist.

3. Tierzellkulturmediumzusatz bzw. Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Aceton in einer Konzentration von 1 μΜ 55 1 2 AT 413 700 B bis 20 mM, vorzugsweise 5 μΜ bis 10 mM, vorzugsweise 10 μΜ bis 1 mM, vorzugsweise 10 bis 100 μΜ, vorliegt.

4. Tierzellkulturmediumzusatz bzw. Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen nach 5 einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass HES in einer Konzentration von 0,01 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 5 Gew.%, vorzugsweise 0,2 bis 2 Gew.%, vorliegt.

5. Tierzellkulturmediumzusatz bzw. Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen nach io einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die tierischen Zellen Säuger zellen sind.

6. Tierzellkulturmediumzusatz bzw. Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Säugerzellen Hybridomzellen sind. 15

7. Tierzellkulturmediumzusatz bzw. Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Säugerzellen CHO-Zellen, COS-Zellen, Mäusezellen, VERO-Zellen, MDCK-Zellen, T-FLY-Zellen, BHK-Zellen, SP2/0-Zellen oder Derivate davon sind. 20

8. Tierzellkulturmediumzusatz bzw. Zellkulturmediumzusatz für menschliche Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die menschlichen Zellen HeLa-Zellen, 293-Zellen oder Derivate davon sind.

9. Verwendung eines Tierzellkulturzusatzes bzw. Zellkulturmediumzusatzes für menschliche Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von Proteinen.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine zur Herstellung --von Hybridom=abgeleiteten Proteinen dienen:-------- 30

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine Antikörper oder Derivate oder Fragmente davon sind.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper oder Deriva- 35 te oder Fragmente davon gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichtet sind.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper oder Derivate oder Fragmente davon gegen EpCAM, NCAM, CEA, ein T-Zellen-Peptid, Lewis Y, Sia-lyl-Tn, Globo H, GD2, GD3 oder GM2 gerichtet sind. 40

14. Verfahren zur Kultivierung von tierischen bzw. menschlichen Zellen, umfassend die Schritte des a) Kontaktierens dieser Zellen mit einem Tierzellkulturmedium, das einen Zusatz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst, und 45 b) Kultivierens dieser Zellen unter Bedingungen, die zur Unterstützung der Kultivierung dieser Zellen und Herstellung eines Proteins geeignet sind.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in Suspension kultiviert werden. 50

16. Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in einem Tierzellkulturmedium bzw. Zellkulturmedium für menschliche Zellen umfassend einen Zusatz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kultiviert werden.

17. Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die 13 AT 413 700 B Zellen in einem Tierzellkulturmedium bzw. Zellkulturmedium für menschliche Zellen umfassend einen Zusatz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kultiviert werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbeute um bis zu min- 5 destens 20 %, vorzugsweise mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 100 %, vorzugs weise mindestens 150 %, vorzugsweise mindestens 250 %, erhöht wird.

19. Verfahren zur Gewinnung eines Antikörpers oder Antikörperderivats oder Fragments desselben mit Hilfe einer tierischen Zellkultur, die in einem einen Tierzellkulturzusatz bzw. io Zellkulturzusatz für menschliche Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfassenden Medium kultiviert wird, umfassend die Schritte des: (a) Kultivierens der Antikörper oder Derivate oder Fragmente davon erzeugenden Zellen in ständiger Anwesenheit des Zusatzes nach einem der Ansprüche 1 bis 8, (b) Fortführens dieser Kultur bis zur Anhäufung der Antikörper oder Derivate oder Frag- 15 mente derselben; und (c) Isolierens der Antikörper oder Derivate oder Fragmente derselben. Hiezu 9 Blatt Zeichnungen 20 25 30 35 40 45 50 55