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TECHNISCHER BEREICH
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Diese
Erfindung betrifft ein Züchtungsmedium
für die
Züchtung
einer Tierzelle und ein Verfahren zum Produzieren eines Proteins
unter dessen Verwendung. Genauer betrifft die Erfindung ein Züchtungsmedium
für das
Züchten
einer Tierzelle, wobei das Züchtungsmedium
einen Fischfleischextrakt oder eine enzymatisches Abbauprodukt von
Fischfleisch enthält,
aber keinen von Säugern
abstammenden Bestandteil wie ein Protein oder sein Abbauprodukt
enthält;
und ein Verfahren zum Produzieren eines Proteins unter Verwendung
des Züchtungsmediums.
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HINTERGRUNDGEBIET
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Beim
Züchten
einer Tierzelle, um ein natürliches
Protein zu erhalten, das durch die Tierzelle produziert wird, oder
beim Züchten
einer Tierzelle, die ein Gen eingebaut hat, das ein erwünschtes
Protein codiert, um das erwünschte
Protein zu produzieren, usw., werden wesentliche Nährstoffe
wie Basen, Zucker, Aminosäuren
und Vitamine zu einem Züchtungsmedium
zugefügt.
Darüber
hinaus wird normalerweise ein Säuger-abstammender
Extrakt, konkret Serum wie fötales
Rinderserum in einem Bereich von 5 bis 20% für die Proliferation der Tierzelle
zugefügt. Solch
ein Säuger-abstammendes
Serum hat jedoch eine Reihe von Nachteilen. Es macht 75 bis 95%
der Kosten für
das Züchtungsmedium
aus, und aufgrund der Unterschiede zwischen den Chargen, die in
der Qualität
bestehen, wird keine stabile Proliferation erreicht. Darüber hinaus
kann das Säuger-abstammende
Serum nicht in einem Autoklaven oder dergleichen sterilisiert werden
und kann daher mit Viren oder Mykoplasmen kontaminiert sein. Obwohl
die meisten dieser Viren oder Mykoplasmen nicht pathogen sind, können sie
zusätzliche
unbekannte Faktoren aus der Sicht einer stabilen Herstellung werden.
Darüber
hinaus enthält
das Serum mehr als 500 Typen von Proteinen, was so die Isolierung
und Reinigung des erwünschten
Proteins, des Zellprodukts, aus dem Züchtungsmedium verkompliziert.
Um solche Probleme bei einer stabilen Herstellung zu lösen, werden Verfahren
unter Verwendung eines Serum-abstammenden, gereinigten Proteins
wie Fetuin, Insulin oder Transferrin anstelle von Serum durchgeführt. Verfahren,
die Züchtungsmedium-Bestandteile verwenden, die
von Säugern
extrahiert werden, werden auch aus der Sicht der Produktionskosten
versucht.
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In
den vergangenen Jahren sind Bedenken bezüglich der Beziehung von Säuger-abstammenden
Bestandteilen mit dem Rinderwahnsinn, der spongiformen Encephalopathie
bei Rindern (BSE), der übertragbaren
spongiformen Encephalopathie (TSE) und der Creutzfeld-Jakob-Krankheit
(CJD) geäußert worden.
Die Entwicklung eines Züchtungsmediums
für die
Züchtung
einer Tierzelle, wobei das Züchtungsmedium
frei von diesen Säuger-abstammenden
Bestandteilen ist, ist vom Standpunkt der Sicherheit aus gefordert
worden.
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Beim
Züchten
einer Tierzelle verursacht das Unterlassen, die oben beschriebenen,
Säuger-abstammenden
Bestandteile in das Züchtungsmedium zuzufügen, ein
markantes Absinken in der Überlebensrate
von Zellen und ein Absinken der Zahl der lebensfähigen Zellen in der Züchtungsbrühe zu einem frühen Stadium
des Züchtens.
Diese Vorgänge
machen ein Langzeit-Züchten
oder ein Züchten
im großen
Rahmen unmöglich.
Die vorliegende Erfindung zielt das Bereitstellen eines Züchtungsmediums
für das
Züchten
einer Tierzelle, wobei das Züchtungsmedium
keine Säuger-abstammenden
Bestandteile enthält
und von den obigen Problemen befreit ist, und eines Verfahrens zum
Produzieren eines Proteins unter der Verwendung des Züchtungsmediums
an.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Um
die vorhergehende Aufgabe zu lösen, entfernten
die Erfinder der vorliegenden Erfindung Säuger-abstammende Bestandteile
aus konventionellen Züchtungsmedien
für das
Züchten
von Tierzellen. Sie fügten
verschiedene Substanzen zu den resultierenden Züchtungsmedien zu und führten eine ausführliche
Untersuchung unter Verwendung einer CHO-Zelle durch, die mit einem
Gen transformiert wurde, das ein Antikörper-Protein codiert. Das Ziel der
Untersuchung war es, eine Substanz zu erhalten, die die Proliferation
der CHO-Zelle stimulieren würde, wodurch
sie eine hohe Konzentration des Antikörper-Proteins produziert. Die
Untersuchung führte
zu dem Ergebnis, dass das Ziel durch das Zugeben eines Fischfleischextrakts
oder eines enzymatischen Abbauprodukts von Fischfleisch erzielt
werden konnte, und basierend auf diesem Ergebnis wurde die vorliegende
Erfindung vollendet.
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Das
heißt,
die Erfindung betrifft ein Züchtungsmedium
für das
Züchten
einer Tierzelle, wobei das Züchtungsmedium
einen Fischfleischextrakt oder ein enzymatisches Abbauprodukt von
Fischfleisch enthält,
und ein Verfahren zum Produzieren eines Proteins unter der Verwendung
des Züchtungsmediums.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Graphik, die die Dichte von lebensfähigen CHO-Zellen zeigt, die
in Züchtungsmedien
gezüchtet
wurden, die Brix 1% und Brix 2% eines enzymatischen Fischfleisch-Abbauprodukts
beziehungsweise 10 g/l eines Rindfleisch-Hydrolysats enthielten.
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2 ist
eine Graphik, die die Überlebensrate
(%) von CHO-Zellen zeigt, die in Züchtungsmedien gezüchtet wurden,
die Brix 1% und Brix 2% eines enzymatischen Fischfleisch-Abbauprodukts
beziehungsweise 10 g/l eines Rindfleisch-Hydrolysats enthielten.
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3 ist
eine Graphik, die die Konzentrationen (mg/l) eines Antikörperproteins
zeigt, das in Züchtungsmedien
durch CHO-Zellen produziert wurde, die in den Züchtungsmedien gezüchtet wurden, die
Brix 1% und Brix 2% eines enzymatischen Fischfleisch-Abbauprodukts
beziehungsweise 10 g/l eines Rindfleisch-Hydrolysats enthielten.
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4 zeigt
die Ergebnisse der Zellkultur unter Verwendung eines Schüttelflaschentyp-Zellkulturvorrichtung
in Beispiel 5. Die vertikalen Achsen in den Feldern von 4 repräsentieren
die Dichte der lebensfähigen
Zellen, die Zell-Überlebensrate
beziehungsweise die Menge eines produzierten Antikörper-Proteins.
Die horizontalen Achsen repräsentieren
jeweils die Zahl der Tage des Züchtens
nach dem Start des Züchtens
unter Verwendung des Züchtungsmediums
B.
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BESTE ART UND WEISE FÜR DAS DURCHFÜHREN DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wird unten im Detail beschrieben. Alle hierin
beschriebenen Dokumente werden hierin durch Bezugnahme zitiert.
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Das
Züchtungsmedium
der Erfindung ist ein Züchtungsmedium
für das
Züchten
einer Tierzelle, wobei das Züchtungsmedium
einen Fischfleischextrakt oder ein enzymatisches Abbauprodukt von Fischfleisch
enthält.
Gemäß der Erfindung
kann eine Tierzelle zufriedenstellend ohne die Zugabe von Säuger-abstammenden Bestandteilen
in einem Züchtungsmedium
gezüchtet
werden, das normalerweise als ein Züchtungsmedium für das Züchten einer
Tierzelle verwendet worden ist.
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Beispiele
des in der Erfindung verwendeten Fischfleischs sind das Fischfleisch
von rot-fleischigen Fischen wie Blaufisch („bonito"), Fregattmakrele, Thunfisch, Makrele,
Pazifik-Sauri, Sardine, Pferdemakrele und Lachs und das Fischfleisch
von weiß-fleischigen
Fischen wie Kabeljau, japanischem Wolfsbarsch, rechts-augiger Flunder,
links-augiger Flunder und Seebrasse. Die bevorzugten Beispiele sind
Thunfisch, Fregattmakrele, Kabeljau, Makrele, Lachs und Sardine.
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Der
in der Erfindung verwendete Fischfleischextrakt kann durch Schneiden
des Fischfleischs in geeignete Stücke oder durch Zerkleinern des
Fischfleischs in eine pastöse
Form und Extrahieren der löslichen
Bestandteile der Stücke
oder der Paste mit heißem
Wasser, zum Beispiel heißem Wasser
bei 90 bis 95°C,
für einige
zehn Minuten bis einige zehn Stunden erhalten werden. Konkrete Beispiele
sind eine Brühe,
die aus gekochtem Blaufisch für
die Produktion von getrocknetem Blaufisch gemacht wird, und ein
Koch-Abfluß während der
Produktion von Dosen-Nahrungsmitteln.
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Das
Enzym-Abbauprodukt von Fischfleisch kann zum Beispiel durch Zugeben
einer geeigneten Menge von Wasser zu gekochtem Fischfleisch als solchem
oder Fischfleisch, das zu einer Paste zerkleinert wurde, oder dem
obigen Fischfleischextrakt, wenn nötig gefolgt von Erhitzen für eine Protein-Denaturierung,
dann Behandeln des Materials mit einer Protease und Zentrifugieren
oder Filtern des behandelten Materials, wie gewünscht, um Öle und unlösliche Stoffe zu entfernen,
erhalten werden. Der resultierende Fischfleischextrakt oder das
enzymatische Abbauprodukt von Fischfleisch wird wünschenswerterweise
für die
Verwendung auf einen pH-Wert von 7 bis 7,4 eingestellt.
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Die
in der Erfindung verwendete Protease ist zum Beispiel eine Proteinase
und/oder eine Peptidase. In der Erfindung bezeichnet der Begriff
Proteinase ein Enzym, das ein Protein als ein Substrat hydrolysiert,
während
der Begriff Peptidase eine Peptidbindungs-Hydrolase für ein Peptid
als ein Substrat bezeichnet. Das heißt, die Aktivität der Protease
auf das Protein-Substrat kann als eine Proteinase-Aktivität angesehen
werden, während
die Aktivität
der Protease auf das Peptid-Substrat als Peptidase-Aktivität angesehen
werden kann. Wenn die Spaltung einer Kette aus Peptidbindungen an
ihrer Zwischenstelle durch die Aktivität der Protease auf das Protein-Substrat
katalysiert wird, wird der Begriff Proteinase verwendet. Daher wird
Endopeptidase hierin als eine der Proteinasen verwendet.
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Beispiele
von Enzymen, die verwendet werden sollen, sind Enzyme von Pflanzen-Ursprung
wie Papain, Chymopapain, Bromelain und Ficin und Enzyme von Mikroorganismen
wie Schimmelpilz, Bakterien und Hefe. Sie schließen Endopeptidase, Exopeptidase,
Aminopeptidase, Carboxypeptidase und Dipeptidase ein. Diese Enzyme
können
alleine oder in Kombination verwendet werden. Wenn sie kombiniert
werden, können
sie zur selben Zeit oder fortschreitend zugefügt werden.
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Das
enzymatische Abbauprodukt von Fischfleisch in der vorliegenden Erfindung
ist vorzugsweise ein enzymatisches Abbauprodukt von Fischfleisch,
das durch die Behandlung mit der Proteinase, gefolgt von der Behandlung
mit der Peptidase erhalten wird.
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Die
Bedingungen für
die Behandlung mit dem Enzym unterscheiden sich gemäß dem Typ
des verwendeten Enzyms. Normalerweise wird die Enzymbehandlung für 30 Minuten
bis 72 Stunden, vorzugsweise 3 bis 24 Stunden, bei einem pH-Wert
von 2 bis 12, vorzugsweise pH-Wert von 4 bis 8, bei 30 bis 90°C, vorzugsweise
40 bis 65°C,
durchgeführt. Das
Enzym wird in einem Anteil von etwa 0,01 bis 10%, vorzugsweise 0,5
bis 5%, mehr bevorzugt 1 bis 3%, basierend auf dem Protein als das
Substrat verwendet.
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Das
Enzym im resultierenden Abbauprodukt von Fischfleisch wird durch
Erhitzen oder dergleichen und Durchführen einer Zentrifugation oder
Filtration, wie erwünscht,
um Öle
und unlösliche
Stoffe zu entfernen, inaktiviert, wodurch das enzymatische Abbauprodukt
hergestellt werden kann.
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Als
andere Bestandteile des Züchtungsmediums
der Erfindung können
verschiedene Bestandteile, die normalerweise in Tierzell-Züchtungsmedien verwendet
werden, wie gewünscht
verwendet werden. Sie schließen
Aminosäuren,
Vitamine, Lipidfaktoren, Energiequellen, osmotische Regulatoren,
Eisenquellen und pH-Regulatoren ein. Zusätzlich zu diesen Bestandteilen
können
Spurenmetall-Elemente,
grenzflächenaktive
Substanzen, Wachstums-Cofaktoren und Nucleoside zugefügt werden.
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Beispiele
sind Aminosäuren
wie L-Alanin, L-Arginin, L-Aspargin, L-Asparginsäure, L-Cystein, L-Cystin, L-Glutamin,
L-Glutaminsäure,
Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Ornithin,
L-Phenylalanin, L-Prolin, L- Serin,
L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin, vorzugsweise L-Alanin,
L-Arginin, L-Aspargin,
L-Asparginsäure,
L-Cystin, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin,
L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin,
L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin; Vitamine wie i-Inosit, Biotin,
Folsäure,
Liponsäure,
Nicotinamid, Nikotinsäure,
p-Aminobenzoesäure,
Calciumpantothenat, Pyridoxalhydrochlorid, Pyridoxinhydrochlorid,
Riboflavin, Thiaminhydrochlorid, Vitamin B12 und
Ascorbinsäure,
vorzugsweise Biotin, Folsäure, Liponsäure, Nicotinamid,
Calciumpantothenat, Pyridoxalhydrochlorid, Riboflavin, Thiaminhydrochlorid, Vitamin
B12 und Ascorbinsäure; Lipidfaktoren wie Cholinchlorid,
Cholintartrat, Linolsäure, Ölsäure und Cholesterin,
vorzugsweise Cholinchlorid; Energiequellen wie Glucose, Galactose,
Mannit und Fructose, vorzugsweise Glucose; osmotische Regulatoren wie
Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Kaliumnitrat, vorzugsweise Natriumchlorid;
Eisenquellen wie Eisen-EDTA, Eisen(III)-Citrat, Eisen(II)-Chlorid, Eisen(III)-Chlorid,
Eisen(II)-Sulfat, Eisen(III)-Sulfat und Eisen(III)-Nitrat, vorzugsweise
Eisen(III)-Chlorid, Eisen-EDTA und Eisen(III)-Citrat; und pH-Regulatoren wie
Natriumbicarbonat, Calciumchlorid, monobasisches Natriumphosphat,
HEPES und MOPS, vorzugsweise Natriumbicarbonat. Züchtungsmedien, die
irgendeinen dieser Bestandteile enthalten, können als Beispiele zitiert
werden.
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Neben
den obigen Bestandteilen können auch
Spurenmetall-Elemente wie Kupfersulfat, Mangansulfat, Zinksulfat,
Magnesiumsulfat, Nickelchlorid, Zinnchlorid, Magnesiumchlorid und
Natriumsubsilikat, vorzugsweise Kupfersulfat, Zinksulfat und Magnesiumsulfat;
grenzflächenaktive
Substanzen wie Tween 80 und Pluronic F68; Wachstumsfaktoren wie rekombinantes
Insulin, rekombinanter IGF, rekombinanter EGF, rekombinanter FGF,
rekombinanter PDGF, rekombinanter TGF-α, Ethanolaminhydrochlorid, Natriumselenit,
Retinsäure
und Putrescin-Dihydrochlorid, vorzugsweise Natriumselenit, Ethanolaminhydrochlorid,
rekombinanter IGF und Putrescin-Dihydrochlorid; und Nucleoside wie
Desoxyadenosin, Desoxycytidin, Desoxyguanosin, Adenosin, Cytidin,
Guanosin und Uridin zugefügt
werden. In bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
Antibiotika wie Streptomycin, Kalium-Penicillin-G und Gentamycin
und pH-Indikatoren wie Phenolrot enthalten sein.
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Um
das Züchtungsmedium
der Erfindung konkret herzustellen, können der Fischfleischextrakt oder
das enzymatische Abbauprodukt von Fischfleisch anstelle von Säuger-abstammenden
Bestandteilen zu einem kommerziell erhältlichen Züchtungsmedium für die Züchtung einer
Tierzelle, zum Beispiel BME-Medium, MEM-Medium, DMEM-Medium, F10-Medium
oder F12-Medium, zugefügt
werden.
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In
der Erfindung wird der Fischfleischextrakt oder das enzymatische
Abbauprodukt von Fischfleisch zum Züchtungsmedium zu einer Konzentration
von ungefähr
Brix 5% oder weniger, vorzugsweise Brix 0,5 bis 3%, besonders bevorzugt
Brix 1 bis 2% im Züchtungsmedium
zugefügt.
Diese Konzentration ist eine Konzentration, die durch die löslichen
Feststoffe als ein Index bestimmt wird und mit einem Refraktometer
für den
Zuckergehalt gemessen wird.
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Die
Mengen der anderen Bestandteile im Züchtungsmedium sind 0,05 bis
1500 mg/l für
Aminosäuren,
0,001 bis 10 mg/l für
Vitamine, 0 bis 200 mg/l für
Lipidfaktoren, 1 bis 20 g/l für
Energiequellen, 0,1 bis 10000 mg/l für osmotische Regulatoren, 0,1
bis 500 mg/l für
Eisenquellen, 1 bis 10000 mg/l für pH-Puffer,
0,00001 bis 200 mg/l für
Spurenmetall-Elemente, 0 bis 5000 mg/l für grenzflächenaktive Substanzen, 0,05
bis 10000 μg/l
für Wachstums-Cofaktoren
und 0,001 bis 50 mg/l für
Nucleoside. Ihre Mengen können,
wie benötigt,
gemäß dem Typ
der Tierzelle, die gezüchtet
werden soll, und dem Typ des erwünschten
Proteins bestimmt werden.
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Der
pH-Wert des Züchtungsmediums
unterscheidet sich gemäß der zu
züchtenden
Zelle, ist aber im Allgemeinen pH 6,8 bis 7,6 oder in vielen Fällen pH
7,2 bis 7,4.
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Das
Züchtungsmedium
der Erfindung kann ohne jegliche Einschränkung vorzugsweise für das Züchten von
verschiedenen Tierzellen verwendet werden. Zum Beispiel kann eine
COS-Zelle oder eine CHO-Zelle, die ein Gen für den erwünschten Antikörper oder
eine physiologisch aktive Substanz durch eine Gentechnik-Vorgehensweise eingebaut
hat, oder eine Antikörper-produzierende
fusionierte Zelle, die durch ein Hybridom wie Maus-Mensch, Maus-Maus
oder Maus-Ratte verkörpert
wird, gezüchtet
werden. Das Züchtungsmedium
wird besonders für
die Züchtung
einer CHO-Zelle bevorzugt. Natürlich
kann das Züchtungsmedium
für die
Züchtung
einer Tierzelle gemäß der Erfindung
verwendet werden, wenn eine Tierzelle gezüchtet wird, um ein natürliches
Protein zu erhalten, das durch die Tierzelle produziert wird. Das
Züchtungsmedium
kann für das
Züchten
einer BHK-Zelle und einer HeLa-Zelle sowie der oben erwähnten Zellen
verwendet werden.
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Die
Züchtungsbedingungen
unterscheiden sich gemäß dem Typ
der verwendeten Zelle, und die bevorzugten Bedingungen können, wie
gewünscht, bestimmt
werden. Die CHO-Zelle wird zum Beispiel normalerweise für 1 bis
14 Tage in einer Atmosphäre mit
einer CO2-Konzentration in einer Gasphase
von 0 bis 40%, vorzugsweise 2 bis 10%, bei 30 bis 39°C, vorzugsweise
etwa 37°C,
gezüchtet.
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Das
Züchten
kann unter Verwendung von verschiedenen Züchtungsvorrichtungen für die Tierzell-Züchtung,
zum Beispiel einer Tankzüchtungsvorrichtung
vom Fermenter-Typ, einer Züchtungsvorrichtung
vom Drucklufthebe-Typ, einer Züchtungsvorrichtung
vom Kulturflaschen-Typ, einer Züchtungsvorrichtung
vom Spinnerflaschen-Typ, einer Züchtungsvorrichtung
vom Mikroträger-Typ,
einer Züchtungsvorrichtung
vom Fließbett-Typ,
einer Züchtungsvorrichtung
vom Hohlfaser-Typ, einer Züchtungsvorrichtung
vom Rollflaschen-Typ und einer Züchtungsvorrichtung
vom Füllkörperbett-Typ
durchgeführt
werden.
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Durch
das Durchführen
der Züchtung
in dem Züchtungsmedium
für das
Züchten
einer Tierzelle gemäß der Erfindung
kann ein Protein, das durch die Tierzelle produziert wird, im Züchtungsmedium
erhalten werden. Um das Protein von der Tierzelle zu produzieren,
kann eine gewöhnliche
Züchtung
ausreichen, oder eine spezielle Vorgehensweise kann benötigt werden.
Die Vorgehensweise, Bedingungen usw. können, wie benötigt, gemäß der zu
züchtenden Tierzelle
bestimmt werden. Im Fall einer CHO-Zelle, die durch Anwendung der
Gentechnik mit einem Vektor transformiert ist, der ein Gen enthält, das
einen chimären
Maus-Mensch-Antikörper
codiert, wird die Züchtung
zum Beispiel unter den vorher erwähnten Bedingungen durchgeführt, wobei
das erwünschte Protein
im Züchtungsmedium
in etwa 1 bis 14 Tagen, vorzugsweise in etwa 7 bis 10 Tagen erhalten
werden kann. Dann wird das Züchtungsmedium
einer Isolierung und Reinigung durch gebräuchliche Verfahren (siehe zum
Beispiel Introduction to Antibody Engineering, Chijin Sho Kan Publishing
Company, S. 102-104; Affinity Chromatography Principles & Methods, Amersham
Pharmacia Bitech, S. 56-60) unterzogen, wodurch das erwünschte Protein
erhalten werden kann.
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Die
vorhergehenden Verfahren für
die Produktion können
Proteine von rekombinanten Genen wie rekombinante Antikörper wie
den anti-Mensch-IL6-Rezeptor-Antikörper (einschließlich chimärer Antikörper, humanisierter
Antikörper, menschlicher
Antikörper),
den Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), den Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierenden
Faktor (GM-CSF), Erythropoietin, Interferon, Interleukine (z.B.
IL-1 und IL-6), t-PA, Urokinase, Serumalbumin und den Blutgerinnungsfaktor
VIII produzieren.
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INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Das
Züchtungsmedium
für das
Züchten
einer Tierzelle gemäß der vorliegenden
Erfindung enthält
einen Fischfleischextrakt oder ein enzymatisches Abbauprodukt von
Fischfleisch, was es daher möglich
macht, eine Tierzelle stabil ohne die Verwendung von einem teuren
Protein, das hinsichtlich der Qualität stark variiert, wie fötalem Rinderserum,
zu züchten.
Darüber
hinaus kann durch das Züchten
einer Tierzelle in dem Züchtungsmedium
für das
Züchten
einer Tierzelle gemäß der Erfindung,
d.h. dem Kulturmedium, das einen Fischfleischextrakt oder ein enzymatisches
Abbauprodukt von Fischfleisch enthält, das Risiko einer Kontamination
durch ein abnormales Prion oder Viren, ein Problem, das in vergangenen
Jahren entstanden ist, eliminiert werden, und sichere biotechnologische
Produkte können
produziert und bereitgestellt werden.
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Beispiele
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Die
Beispiele für
das Beschreiben der vorliegenden Erfindung in weiterem Detail werden
unten gezeigt werden, aber die Erfindung ist in keiner Weise auf
diese Beispiele beschränkt.
Verschiedene Änderungen
und Modifikationen können
durch Fachleute gemacht werden, und sie sind auch im Rahmen der
Erfindung eingeschlossen.
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Beispiel 1: Herstellung von Fischfleisch
(Sardinen)-Extrakt
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Eine
kommerziell erhältliche
Sardine wurde als Fischfleisch verwendet. 2500 g Wasser wurden zu
500 g zerkleinertem Fischfleisch zugegeben, und das Fleisch wurde
für 90
Minuten bei einer Temperatur von 95°C extrahiert.
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Dann
wurde der Extrakt zentrifugiert und gefiltert, um unlösliche Stoffe
und Öle
zu entfernen. Der Rest wurde konzentriert, um 64 g eines Fischfleisch (Sardinen)-Extrakts
zu erhalten.
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Beispiel 2: Herstellung eines enzymatischen
Abbauprodukts von Fischfleisch (Blaufisch)
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Ein
kommerziell erhältlicher
Blaufisch wurde als Fischfleisch verwendet. 1500 g Wasser wurden zu
1000 g eines zerkleinerten Blaufischs zugefügt. Das Gemisch wurde für 1 Stunde
zusammen mit 4 g Pflanzen-abstammendem Papain bei einem pH-Wert von
6,0 und 50°C
für den
enzymatischen Abbau inkubiert. Dann wurde der enzymatische Abbau
weiter mit 4 g Schimmelpilz-abstammender Exopeptidase für 20 Stunden
unter den obigen Bedingungen durchgeführt, wonach das System auf
95°C erhitzt
wurde, um die Enzyme zu inaktivieren. Dann wurde das System zentrifugiert
und gefiltert, um unlösliche
Stoffe und Öle
zu entfernen. Der Rest wurde konzentriert, um 500 g eines enzymatischen
Abbauprodukts von Fischfleisch (Blaufisch) gemäß der Erfindung zu erhalten.
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Beispiel 3: Herstellung von Züchtungsmedium
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Von
einem kommerziell erhältlichen DMEM/F12-Medium
(GIBCO BRL Products and Reference Guide, S. 357-358) wurden Thymidin
und Hypoxanthin entfernt. Zum resultierenden Medium wurden die folgenden
Bestandteile zugefügt
(das Gemisch wird hierin nachstehend als Züchtungsmedium A beschrieben),
und das Gemisch wurde als ein Basismedium für das Züchten einer Tierzelle verwendet.
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<Züchtungsmedium
A>
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Von
einem kommerziell erhältlichen DMEM/F12-Medium
wurden Thymidin und Hypoxanthin entfernt, und die folgenden Bestandteile
wurden zugefügt:
30
mg/l Ascorbinsäure
10
mg/l Desoxyadenosin (1H2O)
10 mg/l
Desoxycytidin
10 mg/l Desoxyguanosin
5 mg/l Adenosin
5
mg/l Cytidin
5 mg/l Guanosin
5 mg/l Uridin
4 mg/l
Ethanolamin (HCl)
1000 mg/l Pluronic F-68
18,9 mg/l Eisen(III)-Chlorid
(6H2O)
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Zum
obigen Züchtungsmedium
A wurde das enzymatische Abbauprodukt, das in Beispiel 2 hergestellt
wurde, in einer Endkonzentration von Brix 1% oder Brix 2% zugefügt, und
das Gemisch wurde durch Filtration sterilisiert.
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Beispiel 4: Effekt auf die Menge des produzierten
Antikörpers
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Ein
Test wurde unter Verwendung eines CHO-Zellstamms durchgeführt, der
den humanisierten PM-1-Antikörper
produziert (anti-Mensch-IL-6-Rezeptor-Antikörper), der gemäß dem Verfahren,
das im Bezugsbeispiel 2 der Ungeprüften
Japanischen Patent-Veröffentlichung Nr. 99902/1996 beschieben
ist, durch die Verwendung des menschlichen Elongationsfaktor Iα-Promotors, der
im Beispiel 10 der internationalen Patentanmeldung-Veröffentlichungs-Nr.
WO 92/19759 beschrieben
ist, hergestellt wurde.
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Die
obigen CHO-Zellen (1,5 × 105 Zellen/ml) wurden zum Züchtungsmedium A, enthaltend
das enzymatische Abbauprodukt von Fischfleisch, das hierin in Beispiel
2 hergestellt worden war, in einer Endkonzentration von Brix 1%
oder Brix 2% zugefügt.
Das System wurde für
10 Tage unter den Brutschrankbedingungen von 37°C, 5% CO2 mittels
einer Schüttelflaschentyp-Zellkulturvorrichtung
gezüchtet.
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Dann
wurden die Dichte der lebensfähigen Zellen,
die Zell-Überlebensrate
und die Menge der Produktion eines Antikörperproteins, das aus dem Züchtungsmedium
erhalten wurde, gemessen. Die Menge der Produktion wurde unter Verwendung
einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen.
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Als
eine Kontrolle wurde ein Züchtungsmedium,
enthaltend 10 g/l eines Rindfleisch-Hydrolysats (PrimatoneTM: Quest, Vereinigte Staaten) anstelle des
Enzym-Abbauprodukts von Beispiel 2, hergestellt, und die CHO-Zellen
wurden auf dieselbe Weise gezüchtet.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Im Vergleich zur Kontrolle zeigten die CHO-Zellen, die im Züchtungsmedium,
das Brix 1% des enzymatischen Abbauprodukts von Blaufisch enthielt,
ein Zellwachstum, das zu jenem der Kontrolle vergleichbar war. Die
CHO-Zellen, die im Züchtungsmedium, das
Brix 2% des enzymatischen Abbauprodukts von Blaufisch enthielt,
gezüchtet
wurden, erzielten ein größeres Ausmaß an Antikörperprotein-Produktion als
die Kontrolle.
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Beispiel 5: Effekt der Züchtungsmedien
unter Verwendung der enzymatischen Abbauprodukte von verschiedenem
Fischfleisch auf die Menge der Antikörperproduktion
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Enzymatische
Abbauprodukte von Fischfleisch von Blaufisch, Sardine, Lachs, Fregattmakrele,
Kabeljau und Makrele wurde zu einem Züchtungsmedium von nicht-Säugerursprung zugefügt, und
die Menge der Produktion von Antikörperprotein wurde untersucht.
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Herstellung eines enzymatischen Abbauprodukts von
Fischfleisch
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Ein
enzymatisches Abbauprodukt des obigen Fischfleischs wurde durch
das Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben ist, hergestellt. Das
heißt,
das Fischfleisch wurde zerkleinert und mit Papain, einer Pflanzenabstammenden
Endopeptidase, enzymatisch abgebaut. Dann wurde das Material weiter
enzymatisch mit einer Schimmelpilz-abstammenden Exopeptidase abgebaut,
wonach das System erhitzt wurde, um die Enzyme zu inaktivieren.
Dann wurde das System zentrifugiert und gefiltert, um unlösliche Stoffe
und Öle
zu entfernen. Der Rest wurde konzentriert, um ein enzymatisches
Abbauprodukt des Fischfleischs herzustellen.
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Herstellung eines Züchtungsmediums und Testverfahren
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dhrf(-)-CHO-Zellen,
die mit einem Gen transformiert sind, das den humanisierten PM-1-Antikörper (anti-Mensch-IL-6-Rezeptor-Antikörper), der
in Beispiel 4 beschrieben ist, codiert, und ein dhfr-selektives
Markergen wurden zum Züchtungsmedium
B, enthaltend das enzymatische Abbauprodukt von Blaufisch, Sardine,
Lachs, Fregattmakrele, Kabeljau oder Makrele, in einer Endkonzentration
von 10 g/l (Brix 1%) oder 15 g/l (Brix 1,5%) zugefügt. Das
System wurde für
10 Tage unter den Brutschrankbedingungen von 37°C, 5% CO2 mittels
einer Schüttelflaschentyp-Zellkulturvorrichtung
gezüchtet.
Dann wurden die Dichte der lebensfähigen Zellen, die Zell-Überlebensrate
und die Menge der Produktion eines Antikörperproteins gemessen. Die
Bestandteile von Züchtungsmedium
B sind unten gezeigt.
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<Züchtungsmedium
B>
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Thymidin
und Hypoxanthin wurden von einem kommerziell erhältlichen DMEM/F12-Medium entfernt,
und die folgenden Bestandteile wurden zugefügt:
12,5 mg/l Ascorbinsäure
2,5
mg/l Desoxyadenosin (1 H2O)
2,5 mg/l
Desoxycytidin
2,5 mg/l Desoxyguanosin
2,5 mg/l Adenosin
2,5
mg/l Cytidin
2,5 mg/l Guanosin
5,0 mg/l Uridin
0,2
mg/l Putrescin (2HCl)
0,975 mg/l Ethanolamin (HCl)
500
mg/l Pluronic F-68
10 mg/l Eisen(III)-Citrat
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Ergebnisse
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Es gab Unterschiede in der Menge eines Antikörperproteins, das durch das
Fischfleisch-Hydrolysat produziert wurde. Das heißt, wenn
das Enzym-Abbauprodukt von Fischfleisch in einer Endkonzentration
von Brix 1% (10 g/l) zugefügt
wurde, waren die produzierten Mengen in absteigender Reihenfolge
wie folgt: Blaufisch > Fregattmakrele > Kabeljau > Lachs > Makrele > Sardine. Wenn das
Enzym-Abbauprodukt von Fischfleisch in einer Endkonzentration von
Brix 1,5% (15 g/l) zugefügt
wurde, waren die produzierten Mengen in absteigender Reihenfolge wie
folgt: Blaufisch > Fregattmakrele > Kabeljau > Makrele> Lachs > Sardine.
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Die
vorhergehenden Tests zeigen, dass das enzymatische Abbauprodukt
von Fischfleisch unterschiedliche Wirkungen auf die Menge der Antikörperprotein-Produktion gemäß dem Typ
des verwendeten Fischfleischs zeigt, aber wirksam für das Wachstum von
dhfr(-)-CHO-Zellen ist, die mit einem Gen, das ein Antikörperprotein
codiert, und einem dhfr-selektiven Markergen transformiert sind,
und auch wirksam für
die Produktion des Antikörperproteins
ist.